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CN110684730B - 一种利用滋养细胞高效扩增nk细胞的制备方法 - Google Patents

一种利用滋养细胞高效扩增nk细胞的制备方法 Download PDF

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CN110684730B CN201910979773.1A CN201910979773A CN110684730B CN 110684730 B CN110684730 B CN 110684730B CN 201910979773 A CN201910979773 A CN 201910979773A CN 110684730 B CN110684730 B CN 110684730B
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Abstract

本发明涉及基因工程和细胞生物学领域，具体涉及一种利用滋养细胞高效扩增NK细胞的制备方法，包括1)pHR‑mbIL‑21、pHR‑4‑1BBL和pHR‑MICA质粒载体构建，2)分别用pHR‑mbIL‑21、pHR‑4‑1BBL和pHR‑MICA质粒载体制备重组慢病毒，3)K562‑mbIL‑21‑4‑1BBL‑MICA滋养细胞的制备，4)PBMC细胞的提取，5)NK细胞的体外扩增；本发明提供一种NK细胞的制备方法，采用单独构建表达mbIL‑21、4‑1BBL、MICA三种分子的质粒载体，重组慢病毒感染K562的方法，制备NK细胞，制备方法解决现有技术的缺点，利用IL‑21、4‑1BBL、MICA分子同时表达的K562细胞然后作为滋养细胞用于扩增培养NK细胞，其NK细胞扩增倍数高达890倍，制得NK细胞的纯度到达92.2％，并且不同的PBMC细胞间的扩增倍数重复性好。

Description

一种利用滋养细胞高效扩增NK细胞的制备方法
技术领域
本发明涉及基因工程和细胞生物学领域，具体涉及一种利用滋养细胞高效扩增NK细胞的制备方法。
背景技术
目前，全球肿瘤的发生率呈发展迅猛的趋势，然而，传统的治疗手段，如手术，放疗和化疗不能取得良好的效果。肿瘤免疫治疗，是目前医学界公认的第四种肿瘤治疗方法。自然杀伤细胞(naturalkillercell，NK)，是人体固有免疫的主要效应细胞，能无需预先刺激，通过使用穿孔素和颗粒酶以及其他机制，无MHC限制性的杀伤肿瘤细胞。近年来，NK免疫治疗技术由于其无组织相容性复合体(majorhistocompatibilitycomplex，MHC)限制性，副作用小，抗肿瘤活性强，正在成为一种广谱的治疗恶性肿瘤的方法。
NK细胞主要分布于外周血中，占外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell，PBMC)的5～10％，淋巴结和骨髓中也有NK活性，但水平较外周血低。而且，NK细胞回输到体内后不会增值，因此在肿瘤免疫治疗中通常需要比较大的细胞数量，才能达到相对较好的治疗效果。因此，如何在体外将NK细胞大量扩增是NK应用于肿瘤免疫治疗的关键之一。
目前NK的扩增主要通过2种方式进行，一种是通过IL-2、IL-15、IL-18和IL-21等细胞因子对NK细胞进行刺激扩增，这种方法能将NK细胞在体外扩增几十到100多倍，且纯度低，不同的PBMC之间的扩增倍数重复性差等缺点。第二种是通过滋养细胞刺激NK细胞扩增的方法。目前最常用的滋养细胞是经过辐照的表达IL-21和4-1BBL的K562细胞，对于NK细胞来说，IL-21能增强IFN-γ的分泌、上调NK细胞穿孔素的分泌和表达、增强细胞毒活性，同时加速NK细胞成熟和NK细胞受体表达。4-1BBL也能调节NK细胞的激活和信号转导。但是这种方法仅仅能将细胞扩增到100多倍，也存在不同的PBMC之间的扩增倍数重复性差等缺点。因此，亟需一种高效的扩增高纯度NK细胞的方式。
目前，已知MICA是NK细胞激活性受体NKG2D的天然配体，NKG2D为NK细胞激活提供主要信号，并能够覆盖别的NK受体接收到的抑制性信号；然而，K562细胞在稳定表达IL-21和4-1BBL分子同时能否进一步表达MICA分子有待研究，利用这三种分子同时表达的K562细胞然后作为滋养细胞培养NK，从而提高NK的扩增倍数和纯度是本发明探讨的问题之一。
发明内容
本发明针对背景技术中提出的针对目前NK细胞扩增倍数低、纯度低、重复性差等问题，同时在本发明中利用IL-21、4-1BBL、MICA分子同时表达的K562细胞然后作为滋养细胞培养NK细胞，用来提高NK细胞的扩增倍数和纯度也是本发明探讨的问题之一。
因此，本发明提供一种利用滋养细胞高效扩增NK细胞的制备方法，利用K562细胞在稳定表达mbIL-21和4-1BBL分子的同时进一步表达MICA分子，制得工程细胞株，然后以钴-60辐照灭菌法对该工程细胞株进行灭菌，得到滋养细胞，命名为K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞，再以K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞扩增NK细胞，制得NK细胞。
针对上述问题，一种利用滋养细胞高效扩增NK细胞的制备方法，所述的制备方法包括以下步骤：
1)pHR-mbIL-21、pHR-4-1BBL和pHR-MICA质粒载体构建；
2)分别用pHR-mbIL-21、pHR-4-1BBL和pHR-MICA质粒载体制备重组慢病毒；
3)K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞的制备；
4)PBMC细胞的提取；
5)NK细胞的体外扩增；
进一步，所述制备方法具体包括：
1)pHR-mbIL-21、pHR-4-1BBL和pHR-MICA质粒载体构建：
(1)利用基因合成方法，获得mbIL-21、4-1BBL、MICA基因的全长编码区序列；
(2)分别构建质粒载体pHR-mbIL-21、质粒载体pHR-4-1BBL和质粒载体pHR-MICA；
2)分别用质粒载体pHR-mbIL-21、质粒载体pHR-4-1BBL和质粒载体pHR-MICA制备重组慢病毒：
(1)重组慢病毒的制备；
(2)重组慢病毒的浓缩；
(3)重组慢病毒的滴度检测
3)K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞的制备；
4)PBMC细胞的提取；
5)NK细胞的体外扩增。
进一步，所述步骤2)重组慢病毒的制备方法为：
293FT细胞的制备：
1)取对数生长期的293FT细胞传入6孔板中，每孔含有0.6x106个细胞和2ml的DMEM完全培养液，混合均匀，置于37℃培养箱中培养过夜，同时准备20mlDMEM完全培养液置于同样条件培养过夜，备用。
2)当在显微镜下观察293FT细胞的汇合度达到50％-60％时，弃掉6孔板中的培养液，然后在6孔板上加入DMEM完全培养液，加入量为2ml/孔，备用；
重组慢病毒的制备：
以制备pHR-mbIL-21重组慢病毒为例：按质粒载体质量比计，分别取3ug步骤1)中构建得到的pHR-mbIL-21质粒载体、2.66ugpCMV载体和0.34ugpMD.2G载体，将pHR-mbIL-21质粒载体、pCMV载体和pMD.2G载体混合均匀，室温放置10-15min，形成混合液Ⅰ，将混合液Ⅰ滴加到含有293FT细胞的6孔板中，然后将含有混合液Ⅰ的6孔板置于5％二氧化碳培养箱中，温度为37℃，转染6～8小时，再弃掉含有混合液Ⅰ的6孔板中的培养液，按2ml/孔的加入量在6孔板上加入DMEM完全培养液，培养48小时，收集病毒上清，转速为3000转/分钟，离心5分钟，收集上清液Ⅰ，将上清Ⅰ液通过0.45μm滤膜过滤，得到滤液，即得到pHR-mbIL-21重组慢病毒；
根据制备pHR-mbIL-21重组慢病毒的方法依次制备pHR-4-1BBL重组慢病毒、pHR-MICA重组慢病毒。
进一步，所述步骤2)中重组慢病毒的滴度检测，利用流式检测感染法对K562细胞进行1)在24孔板中的每个孔内加入细胞个数为1x105的k562细胞，然后在每个孔内加入500ul的1640完全培养液；
2)分别取1ul、3ul、10ul、30ul的pHR-mbIL-21重组慢病毒原液，依次将各体积的pHR-mbIL-21重组慢病毒原液加入到步骤1)中含有k562细胞的24孔板内，每个体积的pHR-mbIL-21重组慢病毒原液重复6个对照，置于5％二氧化碳培养箱中，温度为37℃，培养48小时，然后分别收集细胞，以转速为500转/分钟，离心3分钟，弃上清，后用200ul的PBS缓冲液重悬，继续加入200ul的抗体，温度为4℃孵育1小时，再以转速为500转/分钟，离心3分钟，弃上清，用200ul的PBS缓冲液重悬，最后经过流式细胞仪，检测K562细胞的感染效率。
进一步，检测K562细胞的感染效率小于10％时认为被感染的阳性的K562细胞数等于病毒的颗粒数。
进一步，所述步骤步骤3)K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞的制备方法为：
(1)根据复合重组慢病毒的终MOI值为5，依次加入pHR-mbIL-21重组慢病毒、pHR-4-1BBL重组慢病毒、pHR-MICA重组慢病毒，混合均匀，形成复合重组慢病毒；
(2)利用复合重组慢病毒对K562细胞进行感染，感染72小时，克隆，得到K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA工程细胞株；
(3)将K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA工程细胞株进行钴-60照射灭菌，制得K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞，-20℃，冻存。
进一步，所述步骤4)PBMC细胞的提取，
(1)在50ml离心管Ⅰ加入45ml样本血样，转速为2000转/分钟，离心10分钟，将血浆移至50ml离心管Ⅱ，灭活，得到灭活血浆、血细胞，备用；
(2)按体积比，生理盐水：血细胞的比例为1:1，将血细胞移至含有生理盐水的50ml离心管Ⅲ内，稀释，制得稀释血细胞，备用；
(3)在50ml离心管Ⅳ内加入15ml人淋巴细胞分离液，然后加入30ml稀释血细胞，转速为1600转/分钟，离心20分钟，弃掉上清液，得到白膜层细胞；
(4)将白膜层细胞移至50ml离心管Ⅴ中，加入生理盐水直至50ml离心管Ⅴ中的溶液体积为45ml时止，混合均匀，转速为1500转/分钟，离心10分钟，弃掉上清液，得到沉淀物A；
(5)在含有沉淀物A的50ml离心管Ⅴ中再次加入生理盐水直至50ml离心管Ⅳ中溶液的含量为45ml时止，混合均匀，转速为1500转/分钟，离心10分钟，弃掉上清液，得到沉淀物B、即PBMC细胞，4℃，存贮。
进一步，所述步骤5)NK细胞的体外扩增，
K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞在37℃条件下水浴复苏；
(1)取PBS缓冲液将复苏后的K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞清洗一次，转速为1500转/分钟，离心5分钟，弃上清，形成洗涤后K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞，备用；
(2)按体积份数计，在含有1份NK细胞完全培养基的培养瓶中加入1份PBMC细胞，重悬，然后加入1份洗涤后K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞，混合均匀，形成培养细胞液Ⅰ，将培养细胞Ⅰ液置于5％二氧化碳培养箱中，温度为37℃，进行培养，在培养至第3天时，将培养细胞液Ⅰ在转速为2000转/分钟，离心5分钟，弃掉上清液，再加入与上清液相同体积的NK细胞完全培养基，混合均匀，形成形成培养细胞液Ⅱ，将培养细胞Ⅱ液置于5％二氧化碳培养箱中，温度为37℃，继续培养；
(3)将培养细胞液Ⅱ培养至第7天时，在含有培养细胞液Ⅱ的培养瓶内加入NK细胞完全培养基使培养细胞液Ⅱ中PBMC细胞的细胞密度为2x106个/ml，按细胞密度比，PBMC细胞：K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞的比例＝1：1，在培养细胞液Ⅱ中加入步骤①中洗涤后K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞，混合均匀，形成培养细胞液Ⅲ，将培养细胞液Ⅲ置于5％二氧化碳培养箱中，温度为37℃，再次培养7天，制得NK细胞。
进一步，所述K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞的制备方法中，钴-60照射灭菌中钴的剂量为100Gy。
进一步，所述NK细胞的体外扩增中，所使用的NK细胞完全培养基，包括以下组分，灭活自体血浆、庆大霉素、GTT551H3培养液，IL-2白介素；
其中IL-2白介素的加入量，按每毫升GTT551H3培养液中含有200-300IU的IL-2白介素；
庆大霉素的加入量，按每毫升GTT551H3培养液中含有50-100IU的庆大霉素；
NK细胞完全培养基的制备方法：按体积百分比，在95％的GTT551H3培养液中加入5％的灭活自体血浆，混合均匀，然后加入IL-2白介素、庆大霉素，混合均匀，形成NK细胞完全培养基。
进一步，所述的NK细胞的阳性率大于92.2％。
本发明的有益效果为：
1.本发明提供的一种利用滋养细胞高效扩增NK细胞的制备方法，与现有制备NK细胞技术相比，在本发明中，在K562细胞滋养细胞表面稳定表达mbIL-21和4-1BBL分子的同时又可以表达MICA分子，MICA分子作为NK细胞激活性受体NKG2D的天然配体，能够促进NK细胞的激活，其中NKG2D为NK细胞激活提供主要信号，并能够覆盖别的NK受体接收到的抑制性信号。
2.本发明提供的一种利用滋养细胞高效扩增NK细胞的制备方法，采用单独构建表达mbIL-21、4-1BBL、MICA三种分子的质粒载体，然后重新组建为三种慢病毒，用三种慢病毒同时感染K562的方法，避免了将mbIL-21、4-1BBL、MICA三种分子构建在同一质粒载体上时目的片段过大，三种分子的表达量不一致等问题缺陷。可以有效提高K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA工程细胞的构建成功率，降低了构建难度。
3.本发明提供的一种NK细胞，利用IL-21、4-1BBL、MICA分子同时表达的K562细胞然后作为滋养细胞用于扩增培养NK细胞，其NK细胞扩增倍数高达890倍，制得NK细胞的纯度到达92.2％，并且不同的PBMC间的扩增倍数重复性好。
4.本发明中制备方法可以为获得高纯度、高扩增倍数的NK细胞奠定实践基础。
附图说明
图1为pHR-mbIL-21的质粒载体图谱；
图2为pHR-4-1BBL的质粒载体图谱；
图3为pHR-MICA的质粒载体图谱；
图4为K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA工程细胞对mbIL-21、4-1BBL、MICA的表达检测；
图5为NK细胞增值曲线图；
图6为NK细胞表型检测流式图；
具体实施方式：
为了更好地理解本发明，下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案，但是本发明并不局限于此。
DMEM完全培养液购自TAKARA公司；
所述的Lenti-XTMConcentrator试剂盒购自TAKARA公司；
质粒纯化试剂盒购自Qiagen公司；
Fluorescein(FITC)-AffiniPureGoatAnti-MouseIgG,F(ab')2FragmentSpecific抗体购自JacksonImmunoResearch公司；
酶切试剂盒购自NEB公司；
GTT551H3培养液购自TAKARA公司；
本发明中所用限制性内切酶均为常用选择；
NK细胞完全培养基包括，灭活自体血浆、庆大霉素、GTT551H3培养液，IL-2白介素，IL-2白介素的加入量，按每毫升GTT551H3培养液中含有200-300IU的IL-2白介素，庆大霉素的加入量，按每毫升GTT551H3培养液中含有50-100IU的庆大霉素；
NK细胞完全培养基的制备方法：按体积百分比，在95％的GTT551H3培养液中加入5％的灭活自体血浆，混合均匀，然后加入IL-2白介素、庆大霉素，混合均匀，形成NK细胞完全培养基；
实施例1
pHR-mbIL-21、pHR-4-1BBL和pHR-MICA质粒载体构建
1、获得mbIL-21、4-1BBL、MICA的全基因编码区序列
1)分别在NCBI网站查询人mbIL-21基因序列、人4-1BBL基因序列、人MICA基因序列；
2)利用PCR扩增法将mbIL-21基因序列中的信号肽区序列、人IL-21序列、铰链区序列、人Fc片段序列、人CD8跨膜区序列进行连接，然后在mbIL-21基因序列中首部引入限制性内切酶BamHI、尾部位引入限制性内切酶NotI，制得mbIL21全基因编码区序列，备用；
3)利用PCR扩增法将4-1BBL基因序列中的信号肽区序列、人IL-21序列、铰链区序列、人Fc片段序列、人CD8跨膜区序列进行连接，然后在4-1BBL基因序列中首部引入限制性内切酶BamHI、位部位引入限制性内切酶NotI，制得4-1BBL全基因编码区序列，备用；
4)利用PCR扩增法将MICA基因序列中的信号肽区序列、人IL-21序列、铰链区序列、人Fc片段序列、人CD8跨膜区序列进行连接，然后在MICA基因序列中首部引入限制性内切酶BamHI、位部位引入限制性内切酶NotI，制得MICA全基因编码区序列，备用；
2、分别构建质粒载体pHR-mbIL-21、质粒载体pHR-4-1BBL和质粒载体pHR-MICA；
1)通过酶切试剂盒将mbIL21全基因编码区序列进行BamHI、NotI双酶切；
2)将酶切后的mbIL21全基因编码区序列通过T4DNA连接酶连接到慢病毒pHR载体上，然后将其转化到感受态E.coli(DH5α)细胞上，制得质粒，将质粒送至金唯智测序公司进行测序，经过测序得到需要的的质粒，然后用质粒纯化试剂盒对质粒进行纯化，制得质粒载体pHR-mbIL-21；
3)依照质粒载体pHR-mbIL-21的制备方法，依次制备质粒载体pHR-4-1BBL和质粒载体pHR-MICA。
实施例2
制备pHR-mbIL-21重组慢病毒、pHR-4-1BBL重组慢病毒和pHR-MICA重组慢病毒
1、293FT细胞的制备：
1)取对数生长期的293FT细胞传入6孔板中，每孔含有0.6x106个细胞和2ml的DMEM完全培养液，混合均匀，置于37℃培养箱中培养过夜，同时准备20mlDMEM完全培养液置于同样条件培养过夜，备用。
2)当在显微镜下观察293FT细胞的汇合度达到50％-60％时，弃掉6孔板中的培养液，然后在6孔板上加入预热的DMEM完全培养液，加入量为2ml/孔，用以除去未贴壁的细胞，备用；
2、重组慢病毒的制备
pHR-mbIL-21重组慢病毒的制备：
1)按质量比取3ug的pHR-mbIL-21质粒载体、2.66ug的pCMV载体和0.34ug的pMD.2G载体，混合均匀，形成混合DNA载体；
2)在0.5ml离心管内Ⅰ加入步骤1)中的混合DNA载体，再加入90ul去离子水、10ulCaCl2，混合均匀，然后以速度为15s/100ul将其加入到含有100ul的2XHBS(HEPES-buffersaline)的0.5ml离心管Ⅱ内，反复吹打8-10次，室温放置10-15min，混合液Ⅰ；
3)将混合液Ⅰ缓慢滴加到含有293FT细胞的6孔板中，避免将293FT细胞吹起，混匀，静置后可见细小颗粒沉淀，然后将含有混合液Ⅰ的6孔板置于5％二氧化碳培养箱中，温度为37℃，转染6～8小时，再弃掉含有混合液Ⅰ的6孔板中的培养液，按2ml/孔的加入量在6孔板上加入预热的DMEM完全培养液，培养48小时，收集病毒上清，转速为3000转/分钟，离心5分钟，收集上清液Ⅰ，将上清Ⅰ液通过0.45μm滤膜过滤，得到滤液，即得到pHR-mbIL-21重组慢病毒；
重组慢病毒的制备：
pHR-4-1BBL重组慢病毒、pHR-MICA重组慢病毒
根据制备pHR-mbIL-21重组慢病毒的方法依次制备pHR-4-1BBL重组慢病毒、pHR-MICA重组慢病毒；
3、pHR-mbIL-21重组慢病毒的浓缩
1)利用Lenti-XTMConcentrator试剂盒对pHR-mbIL-21重组慢病毒
①按体积份数计，在3份pHR-mbIL-21重组慢病毒中加入1份Lenti-XTMConcentrator，混合均匀，形成混合液Ⅱ，4℃条件下静置0.5-24小时，然后将混合液Ⅱ取出，在温度为4℃、转速为1500转/分钟条件下，离心45分钟，得到沉淀物；
②按稀释倍数为10-100倍进行稀释，在沉淀物中加入GT-T551H3培养液，重悬，得到浓缩后的pHR-mbIL-21重组慢病毒。
2)根据pHR-mbIL-21重组慢病毒的浓缩方法依次对pHR-4-1BBL重组慢病毒、pHR-MICA重组慢病毒进行浓缩，制得浓缩后的pHR-4-1BBL重组慢病毒、浓缩后的pHR-MICA重组慢病毒；
4、重组慢病毒的滴度检测
分别用浓缩后的pHR-mbIL-21重组慢病毒、浓缩后的pHR-4-1BBL重组慢病毒、浓缩后的pHR-MICA重组慢病毒感染K562细胞，采用流式细胞仪检测法，检测重组慢病毒的滴度，即病毒的颗粒数，以此判定重组慢病毒的滴度，以浓缩后的pHR-mbIL-21重组慢病毒为例，具体步骤为：
1)在CountStar计数仪上的计数孔内加入k562细胞，k562细胞的加入量为1x105，备用；
2)用1640完全培养液将pHR-mbIL-21重组慢病毒按10倍-100倍进行稀释，形成稀释病毒液，然后分别将稀释病毒液分别加入到步骤1)含有k562细胞的CountStar计数仪的计数孔内，稀释病毒液的加入量分别为1ul、3ul、10ul、30ul，最后将CountStar计数仪置于5％二氧化钛培养箱中，37℃，培养48小时；
3)在1ml离心管中加入20ul(即含有1x106个细胞)步骤2)中经过培养的细胞，200ul的PBS缓冲液，重悬，在0℃条件下，在加入Fluorescein(FITC)AffiniPureGoatAnti-MouseIgG,F(ab')2fragmentspecific抗体1ul，孵育15分钟，然后以转速为1000转/分钟，离心5分钟，在加入200ul的PBS缓冲液，重悬，进行流式细胞仪检测，浓缩后的pHR-mbIL-21重组慢病毒感染K562细胞，其K562细胞的感染效率小于10％时认为被感染的阳性的K562细胞数等于病毒的颗粒数；
依照浓缩后的pHR-mbIL-21重组慢病毒感染K562细胞的方法，依次对浓缩后的pHR-4-1BBL重组慢病毒、浓缩后的pHR-MICA重组慢病毒进行感染K562细胞，同样，感染K562细胞的感染效率均小于10％时认为被感染的阳性的K562细胞数等于病毒的颗粒数。
实施例3
K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞的制备
1、K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞的制备方法包括：
1)根据复合重组慢病毒的终MOI值为5依次加入pHR-mbIL-21重组慢病毒、pHR-4-1BBL重组慢病毒、pHR-MICA重组慢病毒，混合均匀，形成复合重组慢病毒；
2)利用复合重组慢病毒对K562细胞进行感染，感染72小时，通过流式细胞术和有限稀释法进行克隆，得到K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA工程细胞株；
3)将K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA工程细胞株进行钴-60照射灭菌，将K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA工程细胞株进行钴-60照射灭菌，钴-60照射灭菌中钴的剂量为100Gy，制得K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞，其K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞的细胞密度为1x107个/ml，-20℃条件下冻存；
实施例4
PBMC细胞的提取
1)在50ml离心管Ⅰ加入45ml样本血样，转速为2000转/分钟，离心10分钟，将血浆移至50ml离心管Ⅱ，灭活，得到灭活血浆、血细胞，备用；
2)按体积比，生理盐水：血细胞的比例为1:1，将血细胞移至含有生理盐水的50ml离心管Ⅲ内，稀释，制得稀释血细胞，备用；
3)在50ml离心管Ⅳ内加入15ml人淋巴细胞分离液，然后加入30ml稀释血细胞，转速为1600转/分钟，离心20分钟，弃掉上清液，得到白膜层细胞；
4)将白膜层细胞移至50ml离心管Ⅴ中，加入生理盐水直至50ml离心管Ⅴ中的溶液体积为45ml时止，混合均匀，转速为1500转/分钟，离心10分钟，弃掉上清液，得到沉淀物A；
5)在含有沉淀物A的50ml离心管Ⅴ中再次加入生理盐水直至50ml离心管Ⅳ中溶液的含量为45ml时止，混合均匀，转速为1500转/分钟，离心10分钟，弃掉上清液，得到沉淀物B、即外周血单个核细胞(PBMC细胞)，4℃，存贮。
实施例5
NK细胞的体外扩增
1)取PBS缓冲液将复苏后的K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞清洗一次，转速为1500转/分钟，离心5分钟，弃上清，形成洗涤后K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞，备用；
2)按体积份数计，在含有1份NK细胞完全培养基的培养瓶中加入1份PBMC细胞，重悬，然后加入1份洗涤后K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞，混合均匀，形成培养细胞液Ⅰ，将培养细胞Ⅰ液置于5％二氧化碳培养箱中，温度为37℃，进行培养，在培养至第3天时，将培养细胞液Ⅰ在转速为2000转/分钟，离心5分钟，弃掉上清液，再加入与上清液相同体积的NK细胞完全培养基，混合均匀，形成形成培养细胞液Ⅱ，将培养细胞Ⅱ液置于5％二氧化碳培养箱中，温度为37℃，继续培养；
3)将培养细胞液Ⅱ培养至第7天时，在含有培养细胞液Ⅱ的培养瓶内加入NK细胞完全培养基使培养细胞液Ⅱ中PBMC细胞的细胞密度为2x106个/ml，按细胞密度比，PBMC细胞：K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞的比例＝1：1，在培养细胞液Ⅱ中加入步骤①中洗涤后K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞，混合均匀，形成培养细胞液Ⅲ，将培养细胞液Ⅲ置于5％二氧化碳培养箱中，温度为37℃，再次培养7天，制得NK细胞。
检测NK细胞培养14天时的增值数
取培养14天时的NK细胞，计数制作NK细胞增值曲线图，见图3，可知，NK细胞增值了890倍。
检测NK细胞增值的阳性率
取培养14天时的NK细胞，稀释细胞密度为1.0×106个/ml，用CD3-FITC、CD56CD16-PE抗体染色，然后经过流式细胞仪检测，结果显示，NK细胞的阳性率为92.2％；本发明中采用K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞培养NK细胞，大大提高了NK细胞的阳性率。
以上为本领域技术人员提供的实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。

Claims (7)

1.一种利用滋养细胞高效扩增NK细胞的制备方法，其特征在于：所述的制备方法包括以下步骤：
1）pHR-mbIL-21、pHR-4-1BBL和pHR-MICA质粒载体构建；
2）分别用pHR-mbIL-21、pHR-4-1BBL和pHR-MICA质粒载体制备重组慢病毒；
3）K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞的制备；
4）PBMC细胞的提取；
5）NK细胞的体外扩增；
所述制备方法具体包括：
1）pHR-mbIL-21、pHR-4-1BBL和pHR-MICA质粒载体构建：
（1）利用基因合成方法，获得mbIL-21、4-1BBL、MICA基因的全长编码区序列；
（2）分别构建质粒载体pHR-mbIL-21、质粒载体pHR-4-1BBL和质粒载体pHR-MICA；
2）分别用质粒载体pHR-mbIL-21、质粒载体pHR-4-1BBL和质粒载体pHR-MICA制备重组慢病毒：
（1）重组慢病毒的制备；
（2）重组慢病毒的浓缩；
（3）重组慢病毒的滴度检测；
3）K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞的制备；
4）PBMC细胞的提取；
5）NK细胞的体外扩增；
所述步骤5）NK细胞的体外扩增:
（1）K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞在37℃条件下水浴复苏：取PBS缓冲液将复苏后的K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞清洗一次，转速为1500转/分钟，离心5分钟，弃上清，形成洗涤后K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞，备用；
（2）按体积份数计，在含有1份NK细胞完全培养基的培养瓶中加入1份PBMC细胞，重悬，然后加入1份洗涤后K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞，混合均匀，形成培养细胞液Ⅰ，将培养细胞Ⅰ液置于5%二氧化碳培养箱中，温度为37℃，进行培养，在培养至第3天时，将培养细胞液Ⅰ在转速为2000转/分钟，离心5分钟，弃掉上清液，再加入与上清液相同体积的NK细胞完全培养基，混合均匀，形成形成培养细胞液Ⅱ，将培养细胞Ⅱ液置于5%二氧化碳培养箱中，温度为37℃，继续培养；
（3）将培养细胞液Ⅱ培养至第7天时，在含有培养细胞液Ⅱ的培养瓶内加入NK细胞完全培养基使培养细胞液Ⅱ中PBMC细胞的细胞密度为2x106个/ml，按细胞密度比，PBMC细胞：K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞的比例=1：1，在培养细胞液Ⅱ中加入步骤（ 1 ） 中洗涤后K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞，混合均匀，形成培养细胞液Ⅲ，将培养细胞液Ⅲ置于5%二氧化碳培养箱中，温度为37℃，再次培养7天，制得NK细胞。
2.根据权利要求1所述的一种利用滋养细胞高效扩增NK细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤2）重组慢病毒的制备方法为：
293FT细胞的制备：
1）取对数生长期的293FT细胞传入6孔板中，每孔含有0.6x106个细胞和2ml的DMEM完全培养液，混合均匀，置于37℃培养箱中培养过夜，同时准备20mlDMEM完全培养液置于同样条件培养过夜，备用；
2）当在显微镜下观察293FT细胞的汇合度达到50%-60%时，弃掉6孔板中的培养液，然后在6孔板上加入DMEM完全培养液，加入量为2ml/孔，备用；
重组慢病毒的制备：
以制备pHR-mbIL-21重组慢病毒为例：按质粒载体质量比计，分别取3ug步骤1）中构建得到的pHR-mbIL-21质粒载体、2.66ugpCMV载体和0.34ugpMD.2G载体，将pHR-mbIL-21质粒载体、pCMV载体和pMD.2G载体混合均匀，室温放置10-15min，形成混合液Ⅰ，将混合液Ⅰ滴加到含有293FT细胞的6孔板中，然后将含有混合液Ⅰ的6孔板置于5%二氧化碳培养箱中，温度为37℃，转染6～8小时，再弃掉含有混合液Ⅰ的6孔板中的培养液，按2ml/孔的加入量在6孔板上加入DMEM完全培养液，培养48小时，收集病毒上清，转速为3000转/分钟，离心5分钟，收集上清液Ⅰ，将上清Ⅰ液通过0.45μm滤膜过滤，得到滤液，即得到pHR-mbIL-21重组慢病毒；
根据制备pHR-mbIL-21重组慢病毒的方法依次制备pHR-4-1BBL重组慢病毒、pHR-MICA重组慢病毒。
3.根据权利要求1所述的一种利用滋养细胞高效扩增NK细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤2）中重组慢病毒的滴度检测，利用流式检测感染法对K562细胞进行感染，测定效率，以此判定重组慢病毒的滴度，具体步骤为：
（1）在24孔板中的每个孔内加入细胞个数为1x105的k562细胞，然后在每个孔内加入500ul的1640完全培养液；
（2）分别取1ul、3ul、10ul、30ul的pHR-mbIL-21重组慢病毒原液，依次将各体积的pHR-mbIL-21重组慢病毒原液加入到步骤1）中含有k562细胞的24孔板内，每个体积的pHR-mbIL-21重组慢病毒原液重复6个对照，置于5%二氧化碳培养箱中，温度为37℃，培养48小时，然后分别收集细胞，以转速为500转/分钟，离心3分钟，弃上清，后用200ul的PBS缓冲液重悬，继续加入200ul的抗体，温度为4℃孵育1小时，再以转速为500转/分钟，离心3分钟，弃上清，用200ul的PBS缓冲液重悬，最后经过流式细胞仪，检测K562细胞的感染效率；
其中，检测K562细胞的感染效率小于10%时认为被感染的阳性的K562细胞数等于病毒的颗粒数。
4.根据权利要求1所述的一种利用滋养细胞高效扩增NK细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤3）K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞的制备方法为：
（1）根据复合重组慢病毒的终MOI值为5，依次加入pHR-mbIL-21重组慢病毒、pHR-4-1BBL重组慢病毒、pHR-MICA重组慢病毒，混合均匀，形成复合重组慢病毒；
（2）利用复合重组慢病毒对K562细胞进行感染，感染72小时，克隆，得到K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA工程细胞株；
（3）将K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA工程细胞株进行钴-60照射灭菌，制得K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞，-20℃，冻存。
5.根据权利要求1所述的一种利用滋养细胞高效扩增NK细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤4）PBMC细胞的提取：
（1）在50ml离心管Ⅰ加入45ml样本血样，转速为2000转/分钟，离心10分钟，将血浆移至50ml离心管Ⅱ，灭活，得到灭活血浆、血细胞，备用；
（2）按体积比，生理盐水：血细胞的比例为1:1，将血细胞移至含有生理盐水的50ml离心管Ⅲ内，稀释，制得稀释血细胞，备用；
（3）在50ml离心管Ⅳ内加入15ml人淋巴细胞分离液，然后加入30ml稀释血细胞，转速为1600转/分钟，离心20分钟，弃掉上清液，得到白膜层细胞；
（4）将白膜层细胞移至50ml离心管Ⅴ中，加入生理盐水直至50ml离心管Ⅴ中的溶液体积为45ml时止，混合均匀，转速为1500转/分钟，离心10分钟，弃掉上清液，得到沉淀物A；
（5）在含有沉淀物A的50ml离心管Ⅴ中再次加入生理盐水直至50ml离心管Ⅳ中溶液的含量为45ml时止，混合均匀，转速为1500转/分钟，离心10分钟，弃掉上清液，得到沉淀物B、即PBMC细胞，4℃，存贮。
6.根据权利要求4所述的一种利用滋养细胞高效扩增NK细胞的制备方法，其特征在于：所述K562-mbIL-21-4-1BBL-MICA滋养细胞的制备方法中，钴-60照射灭菌中钴的剂量为100Gy。
7.根据权利要求1所述的一种利用滋养细胞高效扩增NK细胞的制备方法，其特征在于：所述NK细胞的体外扩增中，所使用的NK细胞完全培养基，包括以下组分，灭活自体血浆、庆大霉素、GTT551H3培养液，IL-2白介素；
其中IL-2白介素的加入量，按每毫升GTT551H3培养液中含有200-300IU的IL-2白介素；
庆大霉素的加入量，按每毫升GTT551H3培养液中含有50-100IU的庆大霉素；
NK细胞完全培养基的制备方法：按体积百分比，在95%的GTT551H3培养液中加入5%的灭活自体血浆，混合均匀，然后加入IL-2白介素、庆大霉素，混合均匀，形成NK细胞完全培养基。
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