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CN111041048B - 一种有限代数的滋养细胞的制备方法和snk细胞的培养方法 - Google Patents

一种有限代数的滋养细胞的制备方法和snk细胞的培养方法 Download PDF

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CN111041048B
CN111041048B CN201911401406.XA CN201911401406A CN111041048B CN 111041048 B CN111041048 B CN 111041048B CN 201911401406 A CN201911401406 A CN 201911401406A CN 111041048 B CN111041048 B CN 111041048B
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Beijing Dingcheng Taiyuan Biotechnology Co ltd
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Abstract

本发明提供了一种有限代数的滋养细胞的制备方法和SNK细胞的培养方法，属于医学、免疫学、细胞生物学和分子生物学技术领域，包括：将TAX2基因连接到慢病毒表达载体上，转入感受态细胞，将含有TAX2基因的慢病毒感染外周血单核细胞后培养，收集CD3‑细胞；将41BBL‑MICA融合基因连接到慢病毒表达载体上，转入感受态细胞，将CD3‑细胞与含有41BBL‑MICA融合基因的慢病毒混合后进行培养，得到有限代数的滋养细胞。采用本发明提供的培养方法培养得到的滋养细胞为有限代数，既可以异体使用，又无致瘤风险，保证安全性的同时，可以高效的刺激CD56+CD16+NK细胞的扩增。

Description

一种有限代数的滋养细胞的制备方法和SNK细胞的培养方法
技术领域
本发明属于医学、免疫学、细胞生物学和分子生物学技术领域，尤其涉及一种有限代数的滋养细胞的制备方法和SNK细胞的培养方法。
背景技术
常见的NK细胞培养方法有一下几种：1.从自体的PBMC中，分离NK细胞，进行培养，缺点，扩增数量少，CD56+CD16+比例不高，NK活性不高；2.异体干细胞来源，诱导培养NK细胞，缺点，异体来源风险，CD56+CD16+比例不高，NK活性不高；3.使用的滋养细胞为K562，由于K562为肿瘤细胞系，在应用时，存在一定风险，且必须经过辐照方能使用，增加使用难度，且，CD56+CD16+比例不高，NK仅对B细胞或淋巴瘤有一定杀伤活性，对实体瘤的杀伤活性不高。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种有限代数的滋养细胞的制备方法和SNK细胞的培养方法，采用本发明提供的培养方法培养得到的滋养细胞为有限代数扩增，无体内的致瘤风险，并且可刺激不同来源的PBMC(外周血单核细胞)中的CD56+CD16+NK细胞扩增，得到的NK细胞对多种实体瘤均有较强的杀伤作用。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种有限代数的滋养细胞的制备方法，包括以下步骤：
1)将TAX2基因连接到慢病毒表达载体上，转入感受态细胞，得到含有TAX2基因的慢病毒；
2)将所述步骤1)得到的含有TAX2基因的慢病毒感染外周血单核细胞后培养，收集CD3-细胞；
3)将41BBL-MICA融合基因连接到慢病毒表达载体上，转入感受态细胞，得到含有41BBL-MICA融合基因的慢病毒；
4)将所述步骤2)得到的CD3-细胞与步骤3)得到的含有41BBL-MICA融合基因的慢病毒混合后进行培养，得到有限代数的滋养细胞；
所述步骤1)和3)之间没有时间顺序限定。
优选的，所述步骤1)TAX2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
优选的，所述步骤3)41BBL-MICA融合基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
优选的，所述步骤1)和3)慢病毒表达载体独立的包括pCDH载体。
优选的，所述步骤1)和3)感受态细胞独立的包括大肠杆菌感受态细胞。
优选的，所述步骤2)和4)培养的时间独立的在14d以上。
优选的，所述步骤2)和4)培养使用的培养基独立的以1640培养基为基础培养基，包括质量百分含量为8～12％的胎牛血清和浓度为180～220IU/mL的IL-2。
本发明还提供了一种SNK细胞的培养方法，采用上述技术方案所述的制备方法得到滋养细胞，将所述滋养细胞与外周血单核细胞混合后培养14～28d，得到SNK细胞。
优选的，所述滋养细胞与外周血单核细胞的数量比为1～500:1～10。
优选的，所述培养的温度为35～42℃，所述培养的CO2体积浓度为5％。
本发明提供了一种有限代数的滋养细胞的制备方法，包括以下步骤：1)将TAX2基因连接到慢病毒表达载体上，转入感受态细胞，得到含有TAX2基因的慢病毒；2)将所述步骤1)得到的含有TAX2基因的慢病毒感染外周血单核细胞后培养，收集CD3-细胞；3)将41BBL-MICA融合基因连接到慢病毒表达载体上，转入感受态细胞，得到含有41BBL-MICA融合基因的慢病毒；4)将所述步骤2)得到的CD3-细胞与步骤3)得到的含有41BBL-MICA融合基因的慢病毒混合后进行培养，得到滋养细胞；所述步骤1)和3)之间没有时间顺序限定。采用本发明提供的制备方法得到的滋养细胞为自体来源，保证安全性，无需经过照射，操作方便。
本发明还提供了一种SNK细胞的培养方法，采用上述技术方案所述的培养方法得到滋养细胞，将所述滋养细胞与外周血单核细胞混合后培养14～28d，得到SNK细胞。得到的滋养细胞可刺激PBMC(人外周血单核细胞)中的CD56+CD16+NK细胞扩增，得到的NK细胞对多种实体瘤均有较强的杀伤作用。
附图说明
图1为流式检测MICA的表达情况；
图2为流式检测41BBL的表达情况；
图3为流式检测CD3的表达情况；
图4为滋养细胞的扩增情况；
图5为流式分析SNK的细胞表型；
图6为SNK对不同肿瘤细胞系的杀伤效率；
图7不同肿瘤模型中肿瘤体积的变化情况。
具体实施方式
本发明提供了一种有限代数的滋养细胞的制备方法，包括以下步骤：
1)将TAX2基因连接到慢病毒表达载体上，转入感受态细胞，得到含有TAX2基因的慢病毒；
2)将所述步骤1)得到的含有TAX2基因的慢病毒感染外周血单核细胞后培养，收集CD3-细胞；
3)将41BBL-MICA融合基因连接到慢病毒表达载体上，转入感受态细胞，得到含有41BBL-MICA融合基因的慢病毒；
4)将所述步骤2)得到的CD3-细胞与步骤3)得到的含有41BBL-MICA融合基因的慢病毒混合后进行培养，得到有限代数的滋养细胞；
所述步骤1)和3)之间没有时间顺序限定。
本发明将TAX2基因连接到慢病毒表达载体上，转入感受态细胞，得到含有TAX2基因的慢病毒。
在本发明中，所述TAX2基因，用于构建有限代数扩增(非永生)的滋养细胞，所述TAX2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，具体如下所示：
gcccatttcccaggatttggacagagcctcctatatggataccccgtctacgtgtttggcgattgtgtacaggccgattggtgtcccgtctcaggtggtctatgttccacccgcctacatcgacatgccctcctggccacctgtccagagcaccaactcacctgggaccccatcgatggacgcgttgtcagctctcctctccaataccttatccctcgcctcccctccttccccacccagagaacctcaaggaccctcaaggtccttacccctcccaccactcctgtctcccccaaggttccacctgccttctttcaatcaatgcgaaagcacaccccctaccgaaatggatgcctggaaccaaccctcggggatcagctcccctccctcgccttccccgaacctggcctccgtccccaaaacatctacaccacctggggaaaaaccgtagtatgcctatacctataccagctttccccacccatgacatggccacttataccccatgtcatattctgccaccccagacaattaggagccttcctcaccaaggtgcctctaaaacgattagaagaacttctatacaaaatgttcctacacacagggacagtcatagtcctcccggaggacgacctacccaccacaatgttccaacccgtgagggct。
本发明对将TAX2基因连接到慢病毒表达载体上的方法没有特殊限定，采用常规基因连接到慢病毒表达载体上即可。在本发明中，所述慢病毒表达载体优选包括pCDH载体。本发明对连接有基因的慢病毒表达载体转入感受态细胞的方法没有特殊限定，采用常规方法即可。在本发明中，所述感受态细胞优选包括大肠杆菌感受态细胞。
本发明将得到的含有TAX2基因的慢病毒感染外周血单核细胞后培养，收集CD3-细胞。在本发明中，所述培养的时间优选在14d以上，所述培养使用的培养基优选以1640培养基为基础培养基，包括质量百分含量为8～12％的胎牛血清和浓度为180～220IU/mL的IL-2，更优选包括质量百分含量为10％的胎牛血清和浓度为200IU/mL的IL-2。本发明对上述试剂的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。本发明优选使用CD3磁珠对培养后的细胞进行分选，收集CD3-细胞，本发明对所述使用CD3磁珠分选CD3-细胞的方法没有特殊限定，采用常规方法即可。
本发明将41BBL-MICA融合基因连接到慢病毒表达载体上，转入感受态细胞，得到含有41BBL-MICA融合基因的慢病毒。在本发明中，所述41BBL-MICA融合基因具有激活NK并刺激NK扩增的作用，在本发明中，所述41BBL-MICA融合基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，具体如下：
atggaatacgcctctgacgcttcactggaccccgaagccccgtggcctcccgcgccccgcgctcgcgcctgccgcgtactgccttgggccctggtcgcggggctgctgctgctgctgctgctcgctgccgcctgcgccgtcttcctcgcctgcccctgggccgtgtccggggctcgcgcctcgcccggctccgcggccagcccgagactccgcgagggtcccgagctttcgcccgacgatcccgccggcctcttggacctgcggcagggcatgtttgcgcagctggtggcccaaaatgttctgctgatcgatgggcccctgagctggtacagtgacccaggcctggcaggcgtgtccctgacggggggcctgagctacaaagaggacacgaaggagctggtggtggccaaggctggagtctactatgtcttctttcaactagagctgcggcgcgtggtggccggcgagggctcaggctccgtttcacttgcgctgcacctgcagccactgcgctctgctgctggggccgccgccctggctttgaccgtggacctgccacccgcctcctccgaggctcggaactcggccttcggtttccagggccgcttgctgcacctgagtgccggccagcgcctgggcgtccatcttcacactgaggccagggcacgccatgcctggcagcttacccagggcgccacagtcttgggactcttccgggtgacccccgaaatcccagccggactcccttcaccgaggtcggaagccacgaacttctctctgttaaagcaagcaggagatgttgaagaaaaccccgggcctatggggctgggcccggtcttcctgcttctggctggcatcttcccttttgcacctccgggagctgctgctgagccccacagtcttcgttataacctcacggtgctgtcctgggatggatctgtgcagtcagggtttcttgctgaggtacatctggatggtcagcccttcctgcgctatgacaggcagaaatgcagggcaaagccccagggacagtgggcagaagatgtcctgggaaataagacatgggacagagagaccagggacttgacagggaacggaaaggacctcaggatgaccctggctcatatcaaggaccagaaagaaggcttgcattccctccaggagattagggtctgtgagatccatgaagacaacagcaccaggagctcccagcatttctactacgatggggagctcttcctctcccaaaacctggagactgaggaatggacagtgccccagtcctccagagctcagaccttggccatgaacgtcaggaatttcttgaaggaagatgccatgaagaccaagacacactatcacgctatgcatgcagactgcctgcaggaactacggcgatatctagaatccggcgtagtcctgaggagaacagtgccccccatggtgaatgtcacccgcagcgaggcctcagagggcaacatcaccgtgacatgcagggcttccagcttctatccccggaatatcatactgacctggcgtcaggatggggtatctttgagccacgacacccagcagtggggggatgtcctgcctgatgggaatggaacctaccagacctgggtggccaccaggatttgccgaggagaggagcagaggttcacctgctacatggaacacagcgggaatcacagcactcaccctgtgccctctgggaaagtgctggtgcttcagagtcattggcagacattccatgtttctgctgttgctgctggctgctgctatttttgttattattattttctatgtccgttgttgtaa。
在本发明中，所述41BBL基因激活NK并刺激NK扩增，核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，具体如下：
atggaatacgcctctgacgcttcactggaccccgaagccccgtggcctcccgcgccccgcgctcgcgcctgccgcgtactgccttgggccctggtcgcggggctgctgctgctgctgctgctcgctgccgcctgcgccgtcttcctcgcctgcccctgggccgtgtccggggctcgcgcctcgcccggctccgcggccagcccgagactccgcgagggtcccgagctttcgcccgacgatcccgccggcctcttggacctgcggcagggcatgtttgcgcagctggtggcccaaaatgttctgctgatcgatgggcccctgagctggtacagtgacccaggcctggcaggcgtgtccctgacggggggcctgagctacaaagaggacacgaaggagctggtggtggccaaggctggagtctactatgtcttctttcaactagagctgcggcgcgtggtggccggcgagggctcaggctccgtttcacttgcgctgcacctgcagccactgcgctctgctgctggggccgccgccctggctttgaccgtggacctgccacccgcctcctccgaggctcggaactcggccttcggtttccagggccgcttgctgcacctgagtgccggccagcgcctgggcgtccatcttcacactgaggccagggcacgccatgcctggcagcttacccagggcgccacagtcttgggactcttccgggtgacccccgaaatcccagccggactcccttcaccgaggtcggaa。
在本发明中，所述gccacgaacttctctctgttaaagcaagcaggagatgttgaagaaaaccccgg gcct为连接基因。
在本发明中，所述MICA基因激活NK并刺激NK扩增，核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，具体如下：
atggggctgggcccggtcttcctgcttctggctggcatcttcccttttgcacctccgggagctgctgctgagccccacagtcttcgttataacctcacggtgctgtcctgggatggatctgtgcagtcagggtttcttgctgaggtacatctggatggtcagcccttcctgcgctatgacaggcagaaatgcagggcaaagccccagggacagtgggcagaagatgtcctgggaaataagacatgggacagagagaccagggacttgacagggaacggaaaggacctcaggatgaccctggctcatatcaaggaccagaaagaaggcttgcattccctccaggagattagggtctgtgagatccatgaagacaacagcaccaggagctcccagcatttctactacgatggggagctcttcctctcccaaaacctggagactgaggaatggacagtgccccagtcctccagagctcagaccttggccatgaacgtcaggaatttcttgaaggaagatgccatgaagaccaagacacactatcacgctatgcatgcagactgcctgcaggaactacggcgatatctagaatccggcgtagtcctgaggagaacagtgccccccatggtgaatgtcacccgcagcgaggcctcagagggcaacatcaccgtgacatgcagggcttccagcttctatccccggaatatcatactgacctggcgtcaggatggggtatctttgagccacgacacccagcagtggggggatgtcctgcctgatgggaatggaacctaccagacctgggtggccaccaggatttgccgaggagaggagcagaggttcacctgctacatggaacacagcgggaatcacagcactcaccctgtgccctctgggaaagtgctggtgcttcagagtcattggcagacattccatgtttctgctgttgctgctggctgctgctatttttgttattattattttctatgtccgttgttgtaa。
本发明对将41BBL-MICA融合基因连接到慢病毒表达载体上的方法没有特殊限定，采用常规基因连接到慢病毒表达载体上即可。在本发明中，所述慢病毒表达载体优选包括pCDH载体。本发明对连接有基因的慢病毒表达载体转入感受态细胞的方法没有特殊限定，采用常规方法即可。在本发明中，所述感受态细胞优选包括大肠杆菌感受态细胞。
本发明将得到的CD3-细胞与得到的含有41BBL-MICA融合基因的慢病毒混合后进行培养，得到滋养细胞。在本发明中，所述培养的时间优选在14d以上，所述培养使用的培养基优选以1640培养基为基础培养基，包括质量百分含量为8％～12％的胎牛血清和浓度为180～220IU/mL的IL-2，更优选包括质量百分含量为10％的胎牛血清和浓度为200IU/mL的IL-2。本发明对上述试剂的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。本发明优选使用流式分选仪对培养后的细胞进行分选，得到CD3-41BBL+MICA+即为滋养细胞，本发明对使用流式分选仪分选的方法没有特殊限定，采用常规即可。
本发明还提供了一种SNK细胞的培养方法，采用上述技术方案所述的培养方法得到滋养细胞，将所述滋养细胞与外周血单核细胞混合后培养14～28d，得到SNK细胞。
在本发明中，所述滋养细胞与外周血单核细胞的数量比优选为1～500:1～10，更优选为200：1。在本发明中，所述培养的温度优选为35～42℃，更优选为37℃；所述培养的CO2体积浓度为5％；所述培养使用的培养基优选以1640培养基为基础培养基，包括质量百分含量为8％～12％的胎牛血清和浓度为180～220IU/mL的IL-2，更优选包括质量百分含量为10％的胎牛血清和浓度为200IU/mL的IL-2。本发明优选在培养的过程中每天补加50～500IU/mL的IL-2，当在培养的过程中培养基变黄时，优选进行半量换培养基。
在本发明中，所述SNK细胞为Super-NK细胞，简称SNK细胞，对多种实体瘤均有较强的杀伤作用。在本发明中，所述实体瘤优选包括肺癌、胃癌、乳腺癌、肝癌、结直肠癌和脑胶质瘤。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
有限扩增代数滋养细胞的培养：
1、有限扩增代数细胞
基因合成：TAX2(SEQ ID No.1)、41BBL-MICA融合基因(SEQ ID No.2)由金唯智公司进行合成，连接到慢病毒表达载体pCDH上，通过慢病毒包装收获病毒上清，浓缩后转染PBMC，具体操作流程为：
转入大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性克隆，测序正确后备用；
a)接种3瓶293T细胞，细胞密度大约3×106cell/10ml/T75，摇匀置37℃，CO2培养箱过夜培养：次日，待细胞密度长到80％进行慢病毒包装；
b)取AB两支15ml离心管，分别加入1.5ml opti-MEM,A管加入60μg质粒，混匀，B管加入300ng脂质体3000，混匀，室温静置5min；
c)5min后将B管液体加入A管，混匀(力度较第一次要轻)，室温静置30min；
d)将密度为80％的293T细胞弃去上清，加入5ml opti-MEM清洗一遍后再加入4mlopti-MEM；
e)30min后将AB混合液轻轻滴加到293T细胞中，平均每瓶1ml，轻轻摇匀置37℃，CO2培养箱孵育4h；
f)孵育完成后，更换10ml新鲜的opti-MEM培养基，轻轻摇匀置37℃，CO2培养箱过夜培养；
g)培养48h后收获病毒上清置4℃冰箱保存，293T细胞继续加入10mlopti-MEM培养基培养；
h)培养72h后收获病毒上清，与48h收获的病毒上清合并，经2000rmp，4℃离心10min，上清液经0.45μm针头滤器过滤后经病毒浓缩柱离心浓缩(60ml病毒上清)，3000rmp离心30min，最终用300μl无菌PBS重悬，获得的病毒上清冻-80℃备用。
3、外周血单个核细胞的分离
a)抗凝采血管抽取三位健康志愿者外周血50ml，分别命名为A、B、C；
b)将三份外周血分别转移到250ml离心管中，向管中加入等体积PBS(50ml)，轻轻吹打成细胞悬液；
c)另新取50ml离心管，各加入20ml淋巴细胞分离液(GE)，细胞分离液与细胞悬液的比例为1：1；用移液管吸取细胞悬液，在离心管上方将细胞悬液小心而缓慢的加入，使细胞悬液重叠于淋巴细胞分离液上，2000rpm，离心20min；
d)取出离心管，移液管吸去最上层的血浆，移液枪吸取中间白膜层的单个核细胞置入新离心管中，加入10mlRPMI-1640培养基，轻轻吹打均匀后再次离心，2000rpm，离心5min，去掉上清液，共洗涤2次；
e)洗涤最后一次计数，将细胞密度调整到1×106cell/ml的密度接种细胞培养6孔板，8ml/孔，每组PBMC接种3个孔，细胞培养基均为RPMI-1640+10％FBS，细胞标记为D0。
4、有限扩增代数的滋养细胞的培养
a)慢病毒感染PBMC：将冻存的300μl TAX2的慢病毒浓缩液解冻后，加入到分离得到的1×106cell PBMC中，以1640+10％FBS+200IU/mL IL-2培养14天；
b)以CD3磁珠，进行分选，收集CD3-的细胞，此时细胞为有限扩增代数的细胞；
c)取1×106有限扩增代数的细胞，加入300μl 41BBL-MICA融合基因的慢病毒浓缩液解冻后，以1640+10％FBS+200IU/mL IL-2培养14天；
以流式分选仪对CD3-41BBL+MICA+的细胞，进行分离；得到细胞即为有限扩增代数的滋养细胞，以1640+10％FBS+200IU/mLIL-2进行培养。
对得到的有限扩增代数滋养细胞HLA分型鉴定，HLA测序由北京旌准医疗公司进行测定，结果为：HLA-A1101，HLA-A2402，HLA-B1511，HLA-B1505，HLA-C0303，HLA-C0401。
流式分选CD3-41BBL+MICA+的细胞，以索尼流式细胞分选仪，对CD3-41BBL+MICA+的细胞进行分选，分选后的细胞，经流式检测，CD3、41BBL、MICA的表达情况如图1-3所示，滋养细胞为CD3-MICA+41BBL+。
有限扩增代数滋养细胞的扩增情况，在滋养细胞的培养过程中，每隔一天，进行一次离心换液，标记为1代，以下一代的细胞数/上一代的细胞数，即为扩增倍数，对得到的滋养细胞进行扩增情况的统计，结果如图4所示，在50代以前，基本保持2倍的扩增倍数，50代之后，扩增能力逐渐下降，60代时，基本不扩增，60代之后，滋养细胞进行陆续死亡的过程，细胞数逐渐减少，因此，称为有限扩增代数的滋养细胞。
实施例2
1、SNK细胞的培养：
a)分离人外周血单核细胞，离心计数，以1640+10％FBS+200IU/mLIL-2重悬；
b)按照200：1的比例，加入实施例1得到的有限扩增代数的滋养细胞；37℃，CO2培养箱培养；
c)按照实际的体积，每天补加50IU/mL～500IU/mL的IL-2，根据细胞生长情况，在培养基变黄时，进行半量换液；
d)培养到14～28天时，即得到SNK细胞；
2、流式检测SNK的表型
细胞培养至14d做流式检测CD3、CD4、CD8、CD56、CD16的表达，分析SNK的表型。具体步骤如下：
a)取培养14d的SNK细胞，1000rpm，5min离心后弃上清，加入10ml PBS洗涤一遍，弃洗液。
b)细胞分别用6mlPBS重悬，各分装5个流式管内，每管1ml，1000rpm，5min离心后弃上清，然后每管细胞用50μlPBS重悬。
c)孵育抗体：每组细胞各6管，分别为阴性对照组不加抗体，单染管分别加10μlCD3、CD4、CD8、CD56、CD16样品管各加抗体，室温避光孵育30min。
d)抗体孵育后，每管加2mlPBS洗涤，1000rpm，5min离心后弃上清，然后分别加1mlPBS重悬，流式仪上样检测。
3、NK与靶细胞共培养检测杀伤
细胞培养至14d时，分别对肺癌细胞NCI-H358、结直肠癌细胞SW48、脑胶质瘤细胞U87、肝癌细胞HepG2、乳腺癌细胞MCF7、胃癌NCI-N87细胞进行杀伤效率的检测，具体操作步骤如下：
a)取不同的靶细胞，用细胞刮刀轻轻将细胞刮下，10mlPBS洗涤，收集到离心管中，1000rpm，5min离心后弃上清，10mlRPMI-1640+2％FBS重悬，取样计数后按照细胞数量将细胞密度调整到8×104cells/ml；
b)接种靶细胞：将调整密度后的靶细胞分别用排枪接种到96孔细胞培养板中，每孔50μl，同时设不加靶细胞的对照组，每孔加50μl RPMI-1640+2％FBS；
c)取培养14d的SNK细胞，离心，30mlPBS重悬，取样计数后离心洗涤，弃上清，根据计数结果用RPMI-1640+2％FBS重悬，将细胞密度调整到3.2×106cells/ml，然后依次倍比稀释成1.6×106cells/ml、0.8×106cells/ml、0.4×106cells/ml、0.2×106cells/ml、0.1×106cells/ml六个密度；
d)接种SNK：将稀释好的不同密度的SNK按照顺序加入含有靶细胞的对应的96孔板中，50μl/孔，使效靶比分别为40:1、20:1、10:1、5:1、2.5:1、1.25:1，同时设T高和T低组，各加50μl RPMI-1640+2％FBS；
e)细胞接种完毕后置37℃，CO2培养箱共培养4h；
f)细胞共培养4h后将T高组每孔加10μl细胞裂解液，置37℃，CO2培养箱充分裂解1h；
g)细胞裂解后，取出细胞，每孔加入100μlWorkingSolution，室温避光30min；
h)每孔加入50μlStopSolution后，立刻用酶标仪测定490nm的吸光度，根据公式计算细胞杀伤效率。
4、SNK的体内药效实验-免疫缺陷小鼠模型
分别以肺癌H358、胃癌N87、结直肠癌SW48、肝癌HepG2、脑胶质瘤U87、乳腺癌MCF7建立小鼠荷瘤模型。
选取5周龄的雌性小鼠，每组6只；当肿瘤长至200mm3-300mm3之间时，回输5×107个SNK细胞，给药间隔每周一次，每次回输5×107个SNK细胞，回输前对肿瘤进行测量。
结果如下：
流式检测SNK细胞表型：
SNK培养至14d后，进行流式检测，结果如图5所示，83.8％为CD56+CD3-的NK细胞，5.07％为CD56+CD3+的NKT细胞，其中CD56+CD3-的NK细胞中，90.9％的细胞为CD16+。
SNK细胞对多种实体瘤的杀伤效果：
以LDH方法检测SNK细胞对不同肿瘤细胞：以肺癌H358、胃癌N87、结直肠癌SW48、肝癌HepG2、脑胶质瘤U87、乳腺癌MCF7的杀伤效率，结果如图6所示，SNK对不同肿瘤细胞的杀伤效率随着效靶比的升高而升高，在16:1时，杀伤效率均超过60％。
SNK的体内药效实验：
分别以肺癌H358、胃癌N87、结直肠癌SW48、肝癌HepG2、脑胶质瘤U87、乳腺癌MCF7建立小鼠荷瘤模型，当瘤体积达到200mm3时，进行第一次SNK细胞回输，剂量为5×107SNK细胞/只，每周回输一次，对照小鼠，回输PBS，肿瘤体积情况如图7所示，不同的细胞系，肿瘤体积变化略有不同，但回输PBS的小鼠，肿瘤体积有不同程度的增加，回输SNK细胞的小鼠，肿瘤体积呈下降趋势，说明，SNK细胞对肺癌、胃癌、乳腺癌、肝癌、结直肠癌、脑胶质瘤均有明显的清除肿瘤的作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 北京鼎成肽源生物技术有限公司
<120> 一种有限代数的滋养细胞的制备方法和SNK细胞的培养方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 666
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcccatttcc caggatttgg acagagcctc ctatatggat accccgtcta cgtgtttggc 60
gattgtgtac aggccgattg gtgtcccgtc tcaggtggtc tatgttccac ccgcctacat 120
cgacatgccc tcctggccac ctgtccagag caccaactca cctgggaccc catcgatgga 180
cgcgttgtca gctctcctct ccaatacctt atccctcgcc tcccctcctt ccccacccag 240
agaacctcaa ggaccctcaa ggtccttacc cctcccacca ctcctgtctc ccccaaggtt 300
ccacctgcct tctttcaatc aatgcgaaag cacaccccct accgaaatgg atgcctggaa 360
ccaaccctcg gggatcagct cccctccctc gccttccccg aacctggcct ccgtccccaa 420
aacatctaca ccacctgggg aaaaaccgta gtatgcctat acctatacca gctttcccca 480
cccatgacat ggccacttat accccatgtc atattctgcc accccagaca attaggagcc 540
ttcctcacca aggtgcctct aaaacgatta gaagaacttc tatacaaaat gttcctacac 600
acagggacag tcatagtcct cccggaggac gacctaccca ccacaatgtt ccaacccgtg 660
agggct 666
<210> 2
<211> 1818
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggaatacg cctctgacgc ttcactggac cccgaagccc cgtggcctcc cgcgccccgc 60
gctcgcgcct gccgcgtact gccttgggcc ctggtcgcgg ggctgctgct gctgctgctg 120
ctcgctgccg cctgcgccgt cttcctcgcc tgcccctggg ccgtgtccgg ggctcgcgcc 180
tcgcccggct ccgcggccag cccgagactc cgcgagggtc ccgagctttc gcccgacgat 240
cccgccggcc tcttggacct gcggcagggc atgtttgcgc agctggtggc ccaaaatgtt 300
ctgctgatcg atgggcccct gagctggtac agtgacccag gcctggcagg cgtgtccctg 360
acggggggcc tgagctacaa agaggacacg aaggagctgg tggtggccaa ggctggagtc 420
tactatgtct tctttcaact agagctgcgg cgcgtggtgg ccggcgaggg ctcaggctcc 480
gtttcacttg cgctgcacct gcagccactg cgctctgctg ctggggccgc cgccctggct 540
ttgaccgtgg acctgccacc cgcctcctcc gaggctcgga actcggcctt cggtttccag 600
ggccgcttgc tgcacctgag tgccggccag cgcctgggcg tccatcttca cactgaggcc 660
agggcacgcc atgcctggca gcttacccag ggcgccacag tcttgggact cttccgggtg 720
acccccgaaa tcccagccgg actcccttca ccgaggtcgg aagccacgaa cttctctctg 780
ttaaagcaag caggagatgt tgaagaaaac cccgggccta tggggctggg cccggtcttc 840
ctgcttctgg ctggcatctt cccttttgca cctccgggag ctgctgctga gccccacagt 900
cttcgttata acctcacggt gctgtcctgg gatggatctg tgcagtcagg gtttcttgct 960
gaggtacatc tggatggtca gcccttcctg cgctatgaca ggcagaaatg cagggcaaag 1020
ccccagggac agtgggcaga agatgtcctg ggaaataaga catgggacag agagaccagg 1080
gacttgacag ggaacggaaa ggacctcagg atgaccctgg ctcatatcaa ggaccagaaa 1140
gaaggcttgc attccctcca ggagattagg gtctgtgaga tccatgaaga caacagcacc 1200
aggagctccc agcatttcta ctacgatggg gagctcttcc tctcccaaaa cctggagact 1260
gaggaatgga cagtgcccca gtcctccaga gctcagacct tggccatgaa cgtcaggaat 1320
ttcttgaagg aagatgccat gaagaccaag acacactatc acgctatgca tgcagactgc 1380
ctgcaggaac tacggcgata tctagaatcc ggcgtagtcc tgaggagaac agtgcccccc 1440
atggtgaatg tcacccgcag cgaggcctca gagggcaaca tcaccgtgac atgcagggct 1500
tccagcttct atccccggaa tatcatactg acctggcgtc aggatggggt atctttgagc 1560
cacgacaccc agcagtgggg ggatgtcctg cctgatggga atggaaccta ccagacctgg 1620
gtggccacca ggatttgccg aggagaggag cagaggttca cctgctacat ggaacacagc 1680
gggaatcaca gcactcaccc tgtgccctct gggaaagtgc tggtgcttca gagtcattgg 1740
cagacattcc atgtttctgc tgttgctgct ggctgctgct atttttgtta ttattatttt 1800
ctatgtccgt tgttgtaa 1818
<210> 3
<211> 762
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggaatacg cctctgacgc ttcactggac cccgaagccc cgtggcctcc cgcgccccgc 60
gctcgcgcct gccgcgtact gccttgggcc ctggtcgcgg ggctgctgct gctgctgctg 120
ctcgctgccg cctgcgccgt cttcctcgcc tgcccctggg ccgtgtccgg ggctcgcgcc 180
tcgcccggct ccgcggccag cccgagactc cgcgagggtc ccgagctttc gcccgacgat 240
cccgccggcc tcttggacct gcggcagggc atgtttgcgc agctggtggc ccaaaatgtt 300
ctgctgatcg atgggcccct gagctggtac agtgacccag gcctggcagg cgtgtccctg 360
acggggggcc tgagctacaa agaggacacg aaggagctgg tggtggccaa ggctggagtc 420
tactatgtct tctttcaact agagctgcgg cgcgtggtgg ccggcgaggg ctcaggctcc 480
gtttcacttg cgctgcacct gcagccactg cgctctgctg ctggggccgc cgccctggct 540
ttgaccgtgg acctgccacc cgcctcctcc gaggctcgga actcggcctt cggtttccag 600
ggccgcttgc tgcacctgag tgccggccag cgcctgggcg tccatcttca cactgaggcc 660
agggcacgcc atgcctggca gcttacccag ggcgccacag tcttgggact cttccgggtg 720
acccccgaaa tcccagccgg actcccttca ccgaggtcgg aa 762
<210> 4
<211> 999
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atggggctgg gcccggtctt cctgcttctg gctggcatct tcccttttgc acctccggga 60
gctgctgctg agccccacag tcttcgttat aacctcacgg tgctgtcctg ggatggatct 120
gtgcagtcag ggtttcttgc tgaggtacat ctggatggtc agcccttcct gcgctatgac 180
aggcagaaat gcagggcaaa gccccaggga cagtgggcag aagatgtcct gggaaataag 240
acatgggaca gagagaccag ggacttgaca gggaacggaa aggacctcag gatgaccctg 300
gctcatatca aggaccagaa agaaggcttg cattccctcc aggagattag ggtctgtgag 360
atccatgaag acaacagcac caggagctcc cagcatttct actacgatgg ggagctcttc 420
ctctcccaaa acctggagac tgaggaatgg acagtgcccc agtcctccag agctcagacc 480
ttggccatga acgtcaggaa tttcttgaag gaagatgcca tgaagaccaa gacacactat 540
cacgctatgc atgcagactg cctgcaggaa ctacggcgat atctagaatc cggcgtagtc 600
ctgaggagaa cagtgccccc catggtgaat gtcacccgca gcgaggcctc agagggcaac 660
atcaccgtga catgcagggc ttccagcttc tatccccgga atatcatact gacctggcgt 720
caggatgggg tatctttgag ccacgacacc cagcagtggg gggatgtcct gcctgatggg 780
aatggaacct accagacctg ggtggccacc aggatttgcc gaggagagga gcagaggttc 840
acctgctaca tggaacacag cgggaatcac agcactcacc ctgtgccctc tgggaaagtg 900
ctggtgcttc agagtcattg gcagacattc catgtttctg ctgttgctgc tggctgctgc 960
tatttttgtt attattattt tctatgtccg ttgttgtaa 999

Claims (1)

1.一种SNK细胞的培养方法，其特征在于，将有限代数的滋养细胞与外周血单核细胞混合后培养14~28d，得到SNK细胞；
所述有限代数的滋养细胞与外周血单核细胞的数量比为1~500:1~10；
所述培养的温度为35~42℃，所述培养的CO2体积浓度为5%；
所述有限代数的滋养细胞的制备方法，包括以下步骤：
1）将TAX2基因连接到慢病毒表达载体上，转入感受态细胞，得到含有TAX2基因的慢病毒；
2）将所述步骤1）得到的含有TAX2基因的慢病毒感染外周血单核细胞后培养，收集CD3-细胞；
3）将41BBL-MICA融合基因连接到慢病毒表达载体上，转入感受态细胞，得到含有41BBL-MICA融合基因的慢病毒；
4）将所述步骤2）得到的CD3-细胞与步骤3）得到的含有41BBL-MICA融合基因的慢病毒混合后进行培养，得到有限代数的滋养细胞；
所述步骤1）和3）之间没有时间顺序限定；
所述步骤1）TAX2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
所述步骤3）41BBL-MICA融合基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
所述步骤1）和3）慢病毒表达载体独立的包括pCDH载体；
所述步骤1）和3）感受态细胞独立的包括大肠杆菌感受态细胞；
所述步骤2）和4）培养的时间独立的在14 d以上；
所述步骤2）和4）培养使用的培养基独立的以1640培养基为基础培养基，包括质量百分含量为8~12%的胎牛血清和浓度为180~220IU/mL的IL-2；
所述SNK细胞杀伤肺癌细胞、胃癌细胞、乳腺癌细胞和肝癌细胞；
所述SNK细胞与靶细胞的效靶比例为16:1。
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