CN114381427B - 一种nk细胞的体外扩增的方法及其在体外adcc实验中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种NK细胞的体外扩增的方法及其在体外ADCC实验中的应用，所述方法包括以下步骤：1.构建滋养层细胞；2.使用滋养层细胞扩增NK细胞。本发明找到了一种成本低廉、操作简便、高效稳定的NK细胞体外扩增方法，同时为运用扩增后的NK细胞于抗体ADCC的药效评价提拱了结实的数据依据，缓解了因NK细胞来源不足对NK相关的药物研发的限制。
Description
技术领域
本发明涉及一种细胞的扩增方法及其应用，具体涉及一种NK细胞的体外扩增的方法及其应用。
背景技术
自然杀伤(Natural killer,NK)细胞作为机体固有免疫系统中的重要组成部分，是机体抵抗肿瘤、病毒感染的第一道防线，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生发展。NK细胞可以识别自身正常细胞和异常组织细胞，但仅杀伤异常细胞而对宿主正常组织细胞没有细胞毒性作用。此外，NK细胞通过分泌多种细胞因子，在免疫调节和某些免疫细胞分化中发挥重要作用。NK细胞主要以组织相容性复合物(MHC)非限制性方式识别靶细胞，通过颗粒酶B和穿孔素等途径来杀伤靶细胞。同时，NK细胞还能与其他固有免疫细胞和适应性免疫细胞互相作用，协同发挥抗肿瘤和抗感染的重要作用。
目前，NK细胞已经成为肿瘤患者过继免疫治疗的重要效应细胞，同时国内外多家公司都在积极布局NK细胞上的相关靶点。然而，NK细胞在正常人外周血中的NK细胞数量较少，仅占外周血淋巴细胞的5％-15％，直接从人外周血中分离NK受到成本、人类遗传资源管理条例、不同供体个体差异性等诸多因素的限制。NK细胞的来源不足极大限制了NK细胞相关的药物研发。目前NK细胞的扩增方法主要有以下三种：1.细胞因子法(如SCF、Flt3-L、OKT-3、IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、4-1BB等)，该方法虽然简单易行，但是其扩增倍数以及纯度低；2.包被法(如OKT3、Herceptin和免疫球蛋白等)，该方法虽然技术简单，但同样扩增的倍数以及纯度一般；3.滋养层细胞法(Feeder cells，如K562、PBMC(外周血单核细胞，Peripheral Blood Mononuclear Cell)、U977、CEM等)，该方法最显著的优点是扩增倍数及纯度都很高，缺点是需要构建稳定过表达某些基因的滋养层细胞。修饰的K562是扩增NK常用的滋养层细胞，其修饰包括在K562细胞中单独或者组合过表达IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、4-1BBL、CD86等基因。
发明内容
本发明的目的在于，通过对比不同滋养层细胞、优化刺激的次数、比较扩增起始细胞类型等对NK细胞的体外扩增方案进行优化迭代；同时深入研究了在体外ADCC(抗体依赖性的细胞介导的细胞毒作用，Antibody Dependent Cell-mediated cytotoxicity)实验中，用扩增后的NK细胞代替新鲜NK细胞的可行性，研究了扩增时间对于ADCC实验窗口的影响，对比了扩增后和新鲜的NK细胞在ADCC实验中的一致性，为运用扩增后的NK细胞于抗体ADCC的药效评价提供了结实的数据依据，缓解了因NK细胞来源不足对NK相关的药物研发的限制。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种NK细胞的体外扩增的方法，包括以下步骤：
步骤1.滋养层细胞的构建及验证：
将人膜结合的IL-15(膜结合的白细胞介素15，Membrane Bound Interleukin 15，mbIL15)质粒和人4-1BBL质粒通过电转染的方式转入K562细胞，加入抗生素来维持目的基因的稳定过表达，得到人mbIL15以及人4-1BBL过表达的K562细胞池K562-mbIL15-4-1BBL；
较佳的，所述抗生素为0.5mg/mL潮霉素B(Hygromicin B)和/或10ug/mL杀稻瘟菌素(Blasticidin)。
通过流式细胞术方法检测目的基因的过表达情况：
K562-mbIL15-4-1BBL细胞悬液中加入Fc阻断剂(Fc blocker)，室温充分反应，然后加入抗IL-15抗体和抗4-1BBL抗体，在4℃孵育。洗涤细胞后加入对应的荧光二抗，检测抗IL-15抗体和抗4-1BBL抗体与K562-mbIL15-4-1BBL细胞的结合；
细胞的平均荧光强度用流式细胞仪检测，并用FlowJo软件进行分析。
较佳的，Fc阻断剂加入量为5uL，室温反应10分钟，然后加入1ug/mL抗IL-15抗体和1ug/mL抗4-1BBL抗体，在4℃孵育1小时。
步骤2.滋养层细胞扩增NK细胞
取对数生长期的K562-mbIL15-4-1BBL细胞，离心后调整细胞密度，加入丝裂霉素C，并置于37℃、5％CO2培养箱中培养1小时，后用PBS清洗该细胞以去除残留的丝裂霉素C，调整滋养层细胞密度和新鲜的PBMC的密度，处理后的K562-mbIL15-4-1BBL滋养层细胞与PBMC各取1mL混合培养于六孔板的一个孔中(命名为
NK-K562-IL15-4-1BBL)，添加rhIL-2，并置于37℃、5％CO2培养箱中正常培养。
较佳的，离心后调整细胞密度为2×106个细胞/mL，加入50ug/mL丝裂霉素C，并置于37℃、5％CO2培养箱中培养1小时，用RPMI-1640完全培养基调整滋养层细胞密度为5×106个细胞/mL，用RPMI-1640完全培养基调整新鲜的PBMC的密度为5×106个细胞/mL，所述rhIL-2的添加量为200IU/mL。
第二天开始，利用细胞计数仪统计细胞的活率及数量，同时观察细胞的状态、培养基颜色。当细胞密度达到1×107个细胞/mL的时候，离心细胞后按照2×106个细胞/mL的细胞密度来传代(培养基为RPMI-1640完全培养基，200IU/mL的rhIL-2)。当培养基颜色变黄后，离心细胞后更换新鲜培养基，后置于37℃、5％CO2培养箱中正常培养。
扩增到第七天时，取一半的NK细胞继续扩增培养，命名为NK-K562-IL15-4-1BBL-1；另一半的NK细胞与上述丝裂霉素C处理过的滋养层细胞按细胞数1︰1比例混合培养命名为NK-K562-IL15-4-1BBL-2。
每天观察细胞状态、培养基颜色，同时利用细胞计数仪检测细胞的活率及数量。NK细胞扩增到第15天左右时，细胞的状态、活率以及数量达到最佳，可冻存保种，供后续需要时再复苏使用，也可继续培养用于体外实验检测。
通过流式细胞术方法检测扩增NK中的NK细胞比例。分别取扩增第二周的细胞悬液，加入Fc阻断剂，室温反应，然后加入FTIC标记的抗人CD3的直标抗体和PE标记的抗人CD56的直标抗体，在4℃孵育1小时。洗涤细胞后，通过流式细胞仪检测，利用FlowJo软件分析扩增后NK细胞的纯度(CD3-CD56+)。
较佳的，所述Fc阻断剂的加入量为5ul，FTIC标记的抗人CD3的直标抗体加入量为2uL，PE标记的抗人CD56的直标抗体加入量为2uL。
步骤3.扩增起始细胞类型的对比
取丝裂霉素C处理后的滋养层细胞K562-mbIL15-4-1BBL，与人外周血单个核细胞(简称PBMC)或从PBMC中分离纯化的NK细胞，分别按照细胞数1：1(滋养层细胞：PBMC)和10:1(滋养层细胞：NK)混合培养于六孔板的一个孔中，同时添加200IU/mL的rhIL-2，并置于37℃、5％CO2培养箱中正常培养。
第二天开始，利用细胞计数仪统计细胞的活率及数量，同时观察细胞的状态、培养基颜色。当细胞密度达到1×107个细胞l/mL的时候，离心细胞后按照2×106个细胞/mL的细胞密度来传代(培养基为RPMI-1640完全培养基，200IU/mL的rhIL-2)。当培养基颜色变黄后，离心细胞后更换新鲜的RPMI-1640完全培养基，同时添加200IU/mL的rhIL-2。后置于37℃、5％CO2培养箱中正常培养。
步骤4.扩增后的NK细胞在ADCC实验中的应用
实验用抗体的获得：抗人CD20抗体利妥昔单抗(Rituximab)、抗人Her2抗体曲妥珠单抗(Trastuzumab)购买自Roche公司，不同Fc改造的抗人Her2抗体均由生物新药研发服务业务部蛋白工程部构建、表达并纯化。人IgG1同型对照抗体的可变区序列由生物新药研发服务业务部杂交瘤技术部发现，全长抗体由蛋白工程部进行构建、表达并纯化。
为了探索上述方法扩增的NK细胞是否可以在ADCC实验中替代新鲜NK细胞，我们将同一供体来源的新鲜NK细胞(直接从PBMC分选得到)、从分选的NK起始扩增的NK细胞和从PBMC起始扩增的NK细胞，按照细胞数5:1的效靶比(E:T)分别与Raji细胞(靶向CD20抗原)、SK-BR3细胞(靶向Her2抗原)及其对应的不同浓度的抗体(抗人CD20抗体和抗人Her2抗体)混合，置于37℃、5％CO2培养箱中培养4小时，取培养后的上清利用LDH试剂盒检测NK细胞对靶细胞的杀伤。另外，为了比较不同扩增时间对ADCC实验窗口的影响，我们在扩增第15天和第18天分别取同一供体扩增的NK细胞，按照细胞数10:1、5:1和2.5:1的效靶比与Raji细胞和5nM的抗人CD20的抗体混合，置于37℃、5％CO2培养箱中培养4小时，取培养后的上清利用LDH试剂盒检测不同扩增时间的NK细胞对靶细胞的杀伤。
本发明的优点是：找到了一种成本低廉、操作简便、高效稳定的NK细胞体外扩增方法，同时为运用扩增后的NK细胞于抗体ADCC的药效评价提拱了结实的数据依据，缓解了因NK细胞来源不足对NK相关的药物研发的限制。
附图说明：
图1是K562-mbIL15-4-1BBL细胞表达4-1BBL的检测；a为空白细胞，b为抗4-1BBL抗体的信号。
图2是K562-mbIL15-4-1BBL细胞表达IL-15的检测；a为空白细胞，b为抗IL-15抗体的信号。
图3是使用K562-mbIL15-4-1BBL经过1次刺激获得的NK细胞的纯度检测，PE：CD56直标抗体，FITC：CD3直标抗体。
图4是使用K562-mbIL15-4-1BBL经过2次刺激获得的NK细胞的纯度检测，PE：CD56直标抗体，FITC：CD3直标抗体。
图5是使用K562-mbIL21-4-1BBL经过1次刺激获得的NK细胞的纯度检测，PE：CD56直标抗体，FITC：CD3直标抗体。
图6是使用K562-mbIL21-4-1BBL经过2次刺激获得的NK细胞的纯度检测，PE：CD56直标抗体，FITC：CD3直标抗体。
图7是四种方法扩增NK细胞的细胞增值数量，IL-21-1代表用K562-mbIL21-4-1BBL作为滋养层细胞刺激1次，以此类推。
图8是NK细胞扩增的倍数，一个实心圆点代表一个供体。
图9是扩增起始细胞类型的对比。
图10是扩增前、后的NK细胞在抗人CD20抗体对Raji细胞的ADCC实验中的应用对比。其中图10a是未经扩增的原代NK，图10b是从NK细胞起始扩增的NK，图10c是从PBMC起始扩增的NK。
图11是扩增前、后的NK细胞在抗人Her2抗体对SK-BR3细胞的ADCC实验中的应用对比。其中图11a是未经扩增的原代NK，图11b是从NK细胞起始扩增的NK，图11c是从PBMC起始扩增的NK。
图12是扩增前后的NK细胞(从NK起始扩增)在抗人CD20抗体对Raji细胞的ADCC实验中不同效靶比的杀伤活性对比。
图13是扩增前后的NK细胞(从PBMC起始扩增)在抗人CD20抗体对Raji的ADCC实验中不同效靶比的杀伤活性对比。
图14是用扩增后的NK细胞检测不同抗人Her2抗体对SK-BR3细胞的ADCC效应。
图15a是从PBMC起始扩增，在不同时间段的扩增倍数；图15b分别取第15和第18天扩增的NK细胞(从PBMC起始)，对比其在抗人CD20抗体介导的对Raji细胞的特异性杀伤情况。
图16a是从NK起始扩增，在不同时间段的扩增倍数；图16b分别取第15和第18天扩增的NK细胞(从NK起始)，对比其在抗人CD20抗体介导的对Raji细胞的特异性杀伤情况。。
具体实施方式
实施例1：
1.滋养层细胞的构建及验证：
将人膜结合的IL-15(mbIL15)质粒和人4-1BBL质粒通过电转染的方式转入K562细胞，并分别加入0.5mg/mL潮霉素B以及10ug/mL杀稻瘟菌素抗生素来维持目的基因的稳定过表达，得到人mbIL15以及人4-1BBL过表达的K562细胞池K562-mbIL15-4-1BBL；同样的，将人膜结合的IL-21(mbIL21)质粒和人4-1BBL质粒通过电转染的方式转入K562细胞，并分别加入0.5mg/mL潮霉素B以及10ug/mL杀稻瘟菌素抗生素来维持目的基因的稳定过表达，得到人mbIL21以及人4-1BBL过表达的K562细胞池K562-mbIL21-4-1BBL。
通过流式细胞术方法检测目的基因的过表达情况：
在每孔100000个K562-mbIL15-4-1BBL细胞的悬液中加入5uL的Fc阻断剂，室温反应10分钟，然后加入1ug/mL抗IL-15抗体和1ug/mL抗4-1BBL抗体，在4℃孵育1小时。洗涤细胞后加入对应的荧光二抗，检测抗IL-15抗体和抗4-1BBL抗体与K562-mbIL15-4-1BBL细胞的结合；
在每孔100000个K562-mbIL21-4-1BBL细胞的悬液中加入5uL的Fc阻断剂，室温反应10分钟，然后加入1ug/mL抗IL-21抗体和1ug/mL抗4-1BBL抗体，在4℃孵育1小时。洗涤细胞后加入对应的荧光二抗，检测抗IL-21抗体和抗4-1BBL抗体与K562-mbIL21-4-1BBL细胞的结合。
细胞的平均荧光强度用流式细胞仪检测，并用FlowJo软件进行分析。
2.不同滋养层细胞扩增NK细胞的对比与优化
取对数生长期的K562-mbIL15-4-1BBL和K562-mbIL21-4-1BBL细胞，离心后调整细胞密度为2×106个细胞/mL，加入50ug/mL丝裂霉素C，并置于37℃、5％CO2培养箱中培养1小时。后用10mLPBS清洗该细胞4次，以去除残留的丝裂霉素C，最后用RPMI-1640完全培养基调整滋养层细胞密度为5×106个细胞/mL。同时用RPMI-1640完全培养基调整新鲜的PBMC的密度为5×106个细胞/mL，处理后的K562-mbIL15-4-1BBL滋养层细胞与PBMC各取1mL混合培养于六孔板的一个孔中(命名为NK-K562-IL15-4-1BBL)，处理后的K562-mbIL21-4-1BBL滋养层细胞与PBMC各取1mL混合培养于六孔板的另一个孔中(命名为NK-K562-IL21-4-1BBL)，同时添加200IU/mL的rhIL-2，并置于37℃、5％CO2培养箱中正常培养。
第二天开始，利用细胞计数仪统计细胞的活率及数量，同时观察细胞的状态、培养基颜色。当细胞密度达到1×107个细胞/mL的时候，离心细胞后按照2×106个细胞/mL的细胞密度来传代(培养基为RPMI-1640完全培养基，200IU/mL的rhIL-2)。当培养基颜色变黄后，离心细胞后更换新鲜培养基，后置于37℃、5％CO2培养箱中正常培养。
扩增到第七天时，取一半的NK细胞继续扩增培养，分别命名为NK-K562-IL15-4-1BBL-1和NK-K562-IL21-4-1BBL-1；另一半的NK细胞与上述丝裂霉素C处理过的滋养层细胞按细胞数1︰1的比例混合培养分别命名为NK-K562-IL15-4-1BBL-2和NK-K562-IL21-4-1BBL-2。
每天观察细胞状态、培养基颜色，同时利用细胞计数仪检测细胞的活率及数量。NK细胞扩增到第15天左右时，细胞的状态、活率以及数量达到最佳，可冻存保种，供后续需要时再复苏使用，也可继续培养用于体外实验检测。
通过流式细胞术方法检测扩增NK中的NK细胞比例。分别取扩增第二周的细胞悬液(100000/孔)，加入5ul的Fc阻断剂，室温反应10分钟，然后加入2uL的FTIC标记的抗人CD3的直标抗体和2ul的PE标记的抗人CD56的直标抗体，在4℃孵育1小时。洗涤细胞后，通过流式细胞仪检测，利用FlowJo软件分析扩增后NK细胞的纯度(CD3-CD56+)。
3.扩增起始细胞类型的对比
取丝裂霉素C处理后的滋养层细胞K562-mbIL15-4-1BBL，与人外周血单个核细胞(简称PBMC)或从PBMC中分离纯化的NK细胞，分别按照细胞数1：1(滋养层细胞：PBMC)和10:1(滋养层细胞：NK)的比例混合培养于六孔板的一个孔中，同时添加200IU/mL的rhIL-2，并置于37℃、5％CO2培养箱中正常培养。
第二天开始，利用细胞计数仪统计细胞的活率及数量，同时观察细胞的状态、培养基颜色。当细胞密度达到1×107cell/mL的时候，离心细胞后按照2×106cell/mL的细胞密度来传代(培养基为RPMI-1640完全培养基，200IU/mL的rhIL-2)。当培养基颜色变黄后，离心细胞后更换新鲜的RPMI-1640完全培养基，同时添加200IU/mL的rhIL-2。后置于37℃、5％CO2培养箱中正常培养。
4.扩增后的NK细胞在ADCC实验中的应用
实验用抗体的获得：抗人CD20抗体利妥昔单抗(Rituximab)、抗人Her2抗体曲妥珠单抗(Trastuzumab)购买自Roche公司，不同Fc改造的抗人Her2抗体均由生物新药研发服务业务部蛋白工程部构建、表达并纯化。人IgG1同型对照抗体的可变区序列由生物新药研发服务业务部杂交瘤技术部发现，全长抗体由蛋白工程部进行构建、表达并纯化。
为了探索上述方法扩增的NK细胞是否可以在ADCC实验中替代新鲜NK细胞，我们将同一供体来源的新鲜NK细胞(直接从PBMC分选得到)、从分选的NK起始扩增的NK细胞和从PBMC起始扩增的NK细胞，按照5:1的效靶比(E:T)分别与Raji细胞(靶向CD20抗原)、SK-BR3细胞(靶向Her2抗原)及其对应的不同浓度的抗体(抗人CD20抗体和抗人Her2抗体)混合，置于37℃、5％CO2培养箱中培养4小时，取培养后的上清利用LDH试剂盒检测NK细胞对靶细胞的杀伤。另外，为了比较不同扩增时间对ADCC实验窗口的影响，我们在扩增第15天和第18天分别取同一供体扩增的NK细胞，按照细胞数10:1、5:1和2.5:1的效靶比与Raji细胞和5nM的抗人CD20的抗体混合，置于37℃、5％CO2培养箱中培养4小时，取培养后的上清利用LDH试剂盒检测不同扩增时间的NK细胞对靶细胞的杀伤。
实施例2：
1.滋养层细胞的构建及验证
K562-mbIL15-4-1BBL细胞池表达4-1BBL的情况如图1所示，IL-15的表达如图2所示。K562-mbIL21-4-1BBL细胞池与K562-mbIL15-4-1BBL有类似的表达。
2.不同滋养层细胞扩增NK细胞的对比与优化
我们采用加K562-mbIL15-4-1BBL或K562-mbIL21-4-1BBL滋养层细胞刺激PBMC一次，或者两次的方法来扩增NK细胞，在第14天时通过FACS检测CD3、CD56的表达来判断扩增细胞中NK的纯度。结果如图3-图6所示，使用这四种方法扩增的NK细胞纯度(CD3-CD56+)都均达到90％以上。
另外，我们统计了用这4种方法扩增NK细胞得数量变化。结果表明，用K562-mbIL15-4-1BBL滋养层细胞刺激两次扩增NK细胞的扩增效果更好(如图7所示)。我们最终确定了用K562-mbIL15-4-1BBL作为滋养层细胞，两次扩增的方式进行NK细胞的扩增。我们以NK细胞在扩增前PBMC中占比10％为基础，统计了在此种扩增方案下，不同供体来源的PBMC扩增NK细胞的倍数，我们发现NK细胞的扩增能力在不同供体之间具差异，但多数在两周后能扩增超过200倍(如图8所示)。
3.扩增起始细胞类型的对比
用K562-mbIL15-4-1BBL细胞刺激PBMC或者NK细胞两次，我们对NK细胞的扩增倍数进行了统计分析，结果表明从PBMC直接扩增比从分选的NK细胞扩增的倍数更高(如图9所示)。
4.扩增后的NK细胞在ADCC实验中的应用
我们分别在抗人CD20抗体对Raji细胞和抗人Her2抗体对SK-BR3细胞的两种体外ADCC实验体系中，对比了同一供体来源的扩增前和扩增后的NK细胞(分别从NK细胞和PBMC起始扩增)，结果如图10和11所示。此外，我们还在抗人CD20抗体对Raji细胞的ADCC实验体系中对比了扩增前后(分别从NK细胞和PBMC起始扩增)不同效靶比的杀伤活性(如图12-13所示)。相比扩增前的NK细胞，扩增后的NK对肿瘤细胞的自然杀伤活性增强，这与之前报道一致，但是加入抗体之后仍然可以引起ADCC来进一步提高NK细胞杀伤肿瘤细胞的活性。因此，虽然NK细胞扩增之后的本底杀伤活性增强，但是仍然具备与扩增前的NK细胞类似的ADCC实验窗口。
同时，我们用扩增后的NK细胞来检测不同Fc抗人Her2的抗体的ADCC效果，结果表明扩增后的NK细胞能够区分不同ADCC效应的抗体(如图14所示)。
除此之外，我们还检测了扩增时间对于ADCC窗口的影响。我们用上述K562-mbIL15-4-1BBL细胞刺激PBMC或NK细胞来扩增NK细胞，分别在扩增的第15天和18天取扩增后的NK细胞进行ADCC实验。以抗人CD20抗体对Raji细胞的ADCC实验为例，适当延长扩增天数会提高NK细胞的数量和活率，但会减弱NK细胞在ADCC实验中的窗口(如表1，2，图15和16所示)。因此，在ADCC实验的应用中，应尽量避免使用超过3周扩增时间的NK细胞。
表1：由PBMC起始扩增NK第15天和第18天的细胞活率。
| 扩增天数 | 第15天 | 第18天 |
| NK细胞活率 | 94.8％ | 98.5％ |
表1
表2：由NK起始扩增NK第15天和第18天的细胞活率。
| 扩增天数 | 第15天 | 第18天 |
| NK细胞活率 | 91.2％ | 95.3％ |
表2
实施例3：实验总结与讨论
本发明构建了K562-mbIL15-4-1BBL和K562-mbIL21-4-1BBL两种滋养层细胞，通过对比这两种滋养层细胞、优化刺激的次数、比较扩增起始细胞类型等对NK细胞的体外扩增方案进行优化迭代，发现用K562-mbIL15-4-1BB滋养层细胞两轮刺激PBMC的方案更高效、稳定；同时，深入研究了在体外ADCC实验中，用扩增后的NK细胞代替新鲜NK细胞的可行性，研究了不同效靶比、扩增时间对于ADCC实验窗口的影响，对比了扩增后和新鲜的NK细胞在ADCC实验中的一致性，我们发现从NK起始和从PBMC起始扩增的NK细胞(推荐扩增两周)均可以替代新鲜的NK细胞，用于体外ADCC的实验。
Claims (8)
1.一种NK细胞的体外扩增的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)滋养层细胞的构建和验证：
将人膜结合的IL-15质粒和人4-1BBL质粒通过电转染的方式转入K562细胞，加入抗生素来维持目的基因的稳定过表达，得到人mbIL15和人4-1BBL过表达的K562细胞池K562-mbIL15-4-1BBL；检测目的基因的过表达情况；
2)滋养层细胞扩增NK细胞
取对数生长期的K562-mbIL15-4-1BBL细胞，离心后调整细胞密度，加入丝裂霉素C，并置于37℃、5％CO2培养箱中培养1小时，后用PBS清洗该细胞以去除残留的丝裂霉素C，调整滋养层细胞密度和新鲜的PBMC的密度，处理后的K562-mbIL15-4-1BBL滋养层细胞与PBMC各取1mL混合培养于六孔板的一个孔中，命名为NK-K562-IL15-4-1BBL，添加rhIL-2，并置于37℃、5％CO2培养箱中正常培养；
第二天开始，利用细胞计数仪统计细胞的活率及数量，同时观察细胞的状态、培养基颜色，当细胞密度达到1×107个细胞/mL的时候，离心细胞后按照2×106个细胞/mL的细胞密度来传代，培养基为RPMI-1640完全培养基且含有200IU/mL的rhIL-2，当培养基颜色变黄后，离心细胞后更换新鲜上述培养基，后置于37℃、5％CO2培养箱中正常培养；
扩增到第七天时，取一半的NK细胞继续扩增培养，命名为NK-K562-IL15-4-1BBL-1；另一半的NK细胞与上述丝裂霉素C处理过的滋养层细胞按细胞数1︰1的比例混合培养，命名为NK-K562-IL15-4-1BBL-2；
每天观察细胞状态、培养基颜色，同时利用细胞计数仪检测细胞的活率及数量，NK细胞扩增到第15天左右时，细胞的状态、活率以及数量达到最佳。
2.如权利要求1所述的一种NK细胞的体外扩增的方法，其特征在于，步骤1)中，所述抗生素为0.5mg/mL潮霉素B和/或10ug/mL杀稻瘟菌素。
3.如权利要求1或2所述的一种NK细胞的体外扩增的方法，其特征在于，步骤1)中，使用流式细胞术检测目的基因的过表达情况:K562-mbIL15-4-1BBL细胞悬液中加入Fc阻断剂，室温充分反应，然后加入抗IL-15抗体和抗4-1BBL抗体，在4℃孵育,洗涤细胞后加入对应的荧光二抗，检测抗IL-15抗体和抗4-1BBL抗体与K562-mbIL15-4-1BBL细胞的结合；细胞的平均荧光强度用流式细胞仪检测，并用FlowJo软件进行分析。
4.如权利要求3所述的一种NK细胞的体外扩增的方法，其特征在于，Fc阻断剂加入量为5uL，室温反应10分钟，然后加入1ug/mL抗IL-15抗体和1ug/mL抗4-1BBL抗体，在4℃孵育1小时。
5.如权利要求1或2所述的一种NK细胞的体外扩增的方法，其特征在于，步骤2)中，离心后调整细胞密度为2×106个细胞/mL，加入50ug/mL丝裂霉素C，并置于37℃、5％CO2培养箱中培养1小时，后用PBS清洗该细胞以去除残留的丝裂霉素C，用RPMI-1640完全培养基重悬，调整滋养层细胞密度为5×106个细胞/mL，用RPMI-1640完全培养基调整新鲜的PBMC的密度为5×106个细胞/mL，所述rhIL-2的添加量为200IU/mL。
6.如权利要求1或2所述的一种NK细胞的体外扩增的方法，其特征在于，步骤2)中，通过流式细胞术方法检测扩增NK中的NK细胞比例：分别取扩增第二周的细胞悬液，加入Fc阻断剂，室温反应，然后加入FTIC标记的抗人CD3的直标抗体和PE标记的抗人CD56的直标抗体，在4℃孵育1小时，洗涤细胞后，通过流式细胞仪检测，利用FlowJo软件分析扩增后NK细胞的纯度。
7.如权利要求6所述的一种NK细胞的体外扩增的方法，其特征在于，所述Fc阻断剂的加入量为5ul，FTIC标记的抗人CD3的直标抗体加入量为2uL，PE标记的抗人CD56的直标抗体加入量为2uL。
8.权利要求1所述的一种NK细胞的体外扩增的方法在体外ADCC实验中的应用。
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