CN115521914B - 一种人原代自然杀伤细胞体外扩增体系及方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种人原代自然杀伤细胞体外扩增体系及方法，属于生物化学技术领域，该体系包括1640细胞培养基、90‑110U/mL IL‑2、180‑220ng/mL NK细胞源性外泌体、重组表达蛋白混合冻干粉和基质胶。该原代自然杀伤细胞体外扩增方法能够解决现目前NK细胞体外扩增方法容易引入具有生物安全风险的异体细胞，容易引起过度炎症反应等安全问题以及成本较高、操作复杂及扩增效率较差等技术问题。

Description

一种人原代自然杀伤细胞体外扩增体系及方法

技术领域

本发明属于生物化学技术领域，具体公开了一种人原代自然杀伤细胞体外扩增体系及方法。

背景技术

自然杀伤(Natural killer cell,NK)细胞是一类不同于T细胞和B细胞的固有免疫细胞，存在于淋巴结、脾脏、肝脏、肺、骨髓和外周血中，作为天然免疫系统的核心细胞，NK细胞在维护人体健康、抗癌抗感染中发挥至关重要的作用。与T细胞、B细胞不同，NK细胞集免疫监视、免疫应答和免疫记忆三大功能于一身，其天然杀伤活性既不需要抗原预先致敏，也不依赖抗体，无MHC限制，能在第一时间参与免疫反应。

NK细胞主要通过下面四种途径杀伤靶细胞并发挥其天然杀伤功能：(1)产生一系列细胞因子(IFN-γ、TNF-α、IL-10)、生长因子(GM-CSF)、趋化因子(CCL3、CCL4、CCL5、XCL1)，通过调节NK细胞与树突状细胞、巨噬细胞和T细胞之间的相互作用来形成免疫应答。(2)抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(Antibody dependent cell-mediatedcytotoxicity,ADCC)：NK细胞表面CD16的IgG抗体Fab段与靶细胞的抗原表位特异性结合，介导NK细胞特异性识别并杀伤靶细胞。(3)穿孔素(Perforin,PRF)/颗粒酶(Granzyme,GZM)途径：NK细胞产生含穿孔素、颗粒酶等的裂解颗粒，诱导靶细胞凋亡或直接破坏靶细胞膜，造成靶细胞破裂。(4)Fas/FasL途径与TRAILR/TRAIL途径：活化的NK细胞表面可表达多种肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF)超家族成员，如FASL和TRAIL，通过与靶细胞表面相应受体(FAS或TRAILR)结合，诱导靶细胞细胞凋亡。

NK细胞作为维护人体健康的第一道防线，在清除细菌、抵御病毒、延缓衰老和抗击癌症等领域发挥极其重要的作用。基于NK细胞的广谱细胞毒作用，近年来应用NK细胞来治疗各种疾病的研究呈现井喷式发展。

研究证实NK细胞低细胞毒活性与患癌风险增加相关，而良好的NK细胞活性与更好的癌症治疗效果和更低的癌症复发风险密切相关。迄今为止，基于NK细胞的免疫疗法已逐渐成为继放疗、化疗、手术治疗后的第四种肿瘤治疗方法，其中NK细胞过继性免疫疗法通过向患者回输经体外诱导培养的NK细胞，直接或间接杀伤肿瘤细胞，达到治疗肿瘤的效果。对于血液系统肿瘤而言，NK细胞对急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病和淋巴瘤等的治疗具有令人惊喜的效果。在实体瘤方面，虽然不如血液肿瘤的治疗效果理想，但是研究人员发现，NK细胞对神经母细胞瘤、肺癌、乳腺癌、前列腺癌和胃癌等仍有积极影响，应用前景光明。

在抵御病毒入侵方面，NK细胞也占据重要地位。在临床研究证明，NK细胞对能产生免疫逃逸的病毒，如乙肝病毒、巨细胞病毒和艾滋病毒等等，具有良好抗击效果，同时对肆虐全球的新冠病毒(SARS-CoV-2)也同样奏效，2020年Sorrento制药公司与Celularity细胞治疗公司联合宣布启动临床合作，计划将NK细胞应用于治疗和预防SARS-CoV-2感染。

除抗病毒抗肿瘤之外，NK细胞在机体对抗细菌、真菌和寄生虫感染的过程中同样扮演重要角色。且NK细胞在自身免疫病治疗(糖尿病、类风湿性关节炎和多发性硬化症)和抗衰保健等方面，有巨大应用潜力。此外，NK细胞还被证实在神经系统疾病(脑卒中、阿尔兹海默症、帕金森症、脑肿瘤等)病理过程中扮演重要角色，同时也发挥着增强免疫力、参与神经保护的作用，对亚健康人群的疲劳和睡眠质量也有明显改善作用。

综上所述，NK细胞对人体健康意义重大，基于NK细胞的细胞治疗手段具有极其广阔光明的前景，为提高人类生活质量带来了新希望。

目前，主流的NK细胞体外扩增方法有：1、滋养层细胞培养方式。即：获得具有不分裂不增殖但仍保持代谢活性的滋养层细胞刺激NK细胞增殖。滋养细胞一般通过基因工程技术进行改造，再经过钴60辐照，细胞膜表面稳定表达多种细胞因子，在多种细胞因子协同作用下，外周血单个核细胞中的NK细胞得到定向激活和扩增。2、纯因子细胞培养方式。即使用相应的细胞因子来诱导外周血单核细胞向NK细胞方向分化，并配合相应的细胞培养基，使NK细胞大量增殖。

然而以上培养方式仍具有一定的缺陷，如滋养细胞一般由肿瘤细胞系制成，如灭活不彻底，扩增的NK细胞中就有可能含有具有增殖活性的肿瘤细胞，如使用于人体将带来生物安全风险；而细胞因子培养法由于细胞因子单一，无法达到最佳的刺激效果，也容易引发NK细胞的过度激活，造成炎症反应；同时对于一些免疫力低下的个体，由于其NK细胞本身功能受损严重，在正常的刺激环境下也难以达到有效的扩增效果。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种人原代自然杀伤细胞体外扩增体系，其解决了现目前NK细胞扩增中容易引起炎症等安全问题以及扩增效果较差的技术问题。

本发明的第二目的在于提供一种原代自然杀伤细胞体外扩增方法，其操作方法简单，且不需要用到复杂仪器，操作成本较低。

本发明是通过如下技术方案实现的：

首先，本发明提供了一种人原代自然杀伤细胞体外扩增体系，包括1640细胞培养基、终浓度为90-110U/mL IL-2、终浓度为180-220ng/mL NK细胞源性外泌体、重组表达蛋白冻干粉和基质胶，重组表达蛋白冻干粉与基质胶的重量比为1:(9-11)。其中1640细胞培养基用于提供NK细胞体外扩增培养的基础营养物质；而IL-2能够维持NK细胞生长，是维持NK细胞生长必须的细胞因子；NK细胞源性外泌体携带多种核酸与蛋白等调控因子，可对NK细胞的体外生长提供必要的调控信号；基质胶可对NK细胞提供必要骨架支持，模拟体内组织环境中NK细胞受到的生物力学刺激；同时重组表达蛋白冻干粉可有效刺激NK细胞的激活。

其次，本发明还提供了一种原代自然杀伤细胞体外扩增方法，包括如下步骤：从外周血中分离得到外周血单核细胞；将基质胶、重组表达蛋白冻干粉和1640细胞培养基混合后铺于六孔板上后于36-38℃放置28-32min，得到培养板；将外周血单核细胞、NK细胞培养基和NK细胞源性外泌体依次加入培养板内于36-38℃培养并观察。该方法操作简单方便，能够大大降低操作人员的操作难度，从而提高操作效率，且该方法不需要用到特别复杂的仪器以及试剂等，降低了操作成本。

与现有技术相比，本发明至少具有如下的优点与积极效果：

本发明提供了一种人原代自然杀伤细胞体外扩增体系及方法，具有如下优点：1、使用方便，扩增效率好；2、制备方便、成本较低；3、无引起过敏、严重炎症和肿瘤等生物安全风险；4、对本身活性较差的NK细胞也能达到较好的扩增激活效果；5、具有十分良好的生物安全性，极具产业化潜力和应用价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明中NK细胞体外扩增培养情况图(A为刚分离的培养情况图，B为分离一周后的培养情况图，C为分离两周后的培养情况图)；

图2为本发明中扩增后NK细胞纯度分析图(A为扩增前的NK细胞纯度，B为扩增后的NK细胞纯度)；

图3为本发明中扩增前后细胞计数及扩增效率图(其中A为扩增前后的NK细胞计数，B为扩增效率图)；

图4为本发明中扩增前后细胞的杀伤活性(效靶比为5:1)(n＝5)。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考具体实施例来详细说明本发明。

首先，本发明提供了一种人原代自然杀伤细胞体外扩增体系，包括1640细胞培养基、终浓度为90-110U/mL IL-2、终浓度为180-220ng/mL NK细胞源性外泌体、重组表达蛋白冻干粉和基质胶，重组表达蛋白冻干粉与基质胶的重量比为1:(9-11)。其中1640细胞培养基用于提供NK细胞体外扩增培养的基础营养物质；而IL-2能够维持NK细胞生长，是维持NK细胞生长必须的细胞因子；NK细胞源性外泌体携带多种核酸与蛋白等调控因子，可对NK细胞的体外生长提供必要的调控信号；基质胶可对NK细胞提供必要骨架支持，模拟体内组织环境中NK细胞受到的生物力学刺激；同时重组表达蛋白冻干粉可有效刺激NK细胞的激活。该比例区间能够使重组表达蛋白与基质胶充分连接，从而保证重组表达蛋白能够有效刺激NK细胞激活，而当重组表达蛋白含量过高时，可能会导致过刺激，从而影响安全性，导致安全系数降低，而重组表达含量过低时，可能导致刺激效果变差，从而导致NK细胞的扩增效率变低。

上述体外扩增体系包括1640细胞培养基、终浓度为100U/mL IL-2、终浓度为200ng/mL NK细胞源性外泌体、重组表达蛋白冻干粉和基质胶。该浓度为上述扩增体系的优选浓度，选用该浓度能够更进一步提高NK细胞体外扩增的效果并防止了NK细胞的过度激活，从而提高了安全性。

上述1640细胞培养基包括终浓度为90-110μg/mL青霉素、终浓度为90-110μg/mL链霉素、1640基础培养基和终浓度为9-11％wt胎牛血清。通过加入青霉素和链霉素以抵抗杂菌，而该浓度区间的青霉素和链霉素能够保证培养基内的NK细胞不被杂菌污染的同时，还能够避免对NK细胞产生影响。

上述重组表达蛋白冻干粉包括IL-5、IL-18和4-1BBL，IL-5、IL-18和4-1BBL的重量比为1:(1.5-2.5):1。

上述重组表达蛋白冻干粉与基质胶的混合物与1640细胞培养基的重量比为1:(4.5-5.5)。

其次，本发明还提供了一种原代自然杀伤细胞体外扩增方法，包括如下步骤：从外周血中分离得到外周血单核细胞；将基质胶、重组表达蛋白冻干粉和1640细胞培养基混合后铺于多孔板上后于36-38℃放置28-32min，得到培养板；将外周血单核细胞、NK细胞培养基和NK细胞源性外泌体依次加入培养板内于36-38℃培养并观察。该方法操作简单方便，能够大大降低操作人员的操作难度，从而提高操作效率，且该方法不需要用到特别复杂的仪器以及试剂等，降低了操作成本。

上述培养板的每孔包括1.5-2.5mL扩增体系。

将上述外周血单核细胞、NK细胞培养基和NK细胞外泌体依次加入培养板内后，每2-3天更换一次NK细胞培养基和NK细胞外泌体。

上述NK细胞培养基包括1640基础培养基、终浓度为90-110U/mL IL-2、9-11％wt胎牛血清、80-120μg/mL青霉素和80-120μg/mL链霉素。

实施例1

1.获取健康志愿者外周血10mL，利用淋巴细胞分离液分离其中的外周血单核细胞：a.往无菌离心管内加入与血液样本等量的分离液，用吸管小心吸取新鲜抗凝血样本于分离液的液面之上。b.860g，离心30min。c.离心结束后，离心管从上至下依次为血浆层、环状乳白色淋巴细胞层、透明分离液层和红细胞层。小心吸取环状乳白色淋巴细胞层于另一无菌离心管内，并加入3倍体积的生理盐水，吹打混匀。d.250g，离心15min，吸弃上清。e.加入5mL生理盐水重悬细胞。250g，离心10min，吸弃上清。f.加入1mL NK细胞培养液重悬外周血单个核细胞，吸取10μL细胞悬液，进行细胞计数，置于37℃，5％ CO₂的恒温培养箱中培养过夜。

2.将Corning Matrigel基质胶与重组表达蛋白冻干粉(IL-15:IL-18:4-1BBL＝1:2:1(重量比))以10:1(v/w)比例混合，按照体积比为5:1的比例用无血清1640培养基(1640基础培养基，100μg/mL的青霉素和链霉素)稀释基质胶和重组表达蛋白冻干粉，取混合均匀的基质胶铺于6孔板中(0.5mL/孔)，所有操作在冰上进行。与培养箱中37℃条件放置30分钟后可进行后续使用。

3.将经过计数的PBMC加入铺有基质胶的六孔板中，每孔2mL NK细胞培养基(1640培养基，100U/mL IL-2，10％胎牛血清；100μg/mL的青霉素和链霉素)，按照200ng/mL浓度加入NK细胞外泌体，置于培养箱中37℃条件培养。

4.每2天对六孔板中的细胞进行半换液(每次换液约1mL NK细胞培养基)，同时补加NK细胞外泌体(200ng)。

5.每7天对培养的细胞进行观察，记录观察结果。

实施例2

1.获取健康志愿者外周血10mL，利用淋巴细胞分离液分离其中的外周血单核细胞：a.往无菌离心管内加入与血液样本等量的分离液，用吸管小心吸取新鲜抗凝血样本于分离液的液面之上。b.860g，离心30min。c.离心结束后，离心管从上至下依次为血浆层、环状乳白色淋巴细胞层、透明分离液层和红细胞层。小心吸取环状乳白色淋巴细胞层于另一无菌离心管内，并加入3倍体积的生理盐水，吹打混匀。d.250g，离心15min，吸弃上清。e.加入5mL生理盐水重悬细胞。250g，离心10min，吸弃上清。f.加入1mL NK细胞培养液重悬外周血单个核细胞，吸取10μL细胞悬液，进行细胞计数，置于37℃，5％ CO₂的恒温培养箱中培养过夜。

2.将Corning Matrigel基质胶与重组表达蛋白冻干粉(IL-15:IL-18:4-1BBL＝1:1.5:1(重量比))以9:1(v/w)比例混合，按照体积比为4.5:1的比例用无血清1640培养基(1640基础培养基，100μg/mL的青霉素和链霉素)稀释基质胶和重组表达蛋白冻干粉，取混合均匀的基质胶铺于6孔板中(0.5mL/孔)，所有操作在冰上进行。与培养箱中37℃条件放置30分钟后可进行后续使用。

3.将经过计数的PBMC加入铺有基质胶的六孔板中，每孔1.5mL NK细胞培养基(1640培养基，90U/mL IL-2，9％胎牛血清；80μg/mL的青霉素和链霉素)，按照180ng/mL浓度加入NK细胞外泌体，置于培养箱中37℃条件培养。

4.每2天对六孔板中的细胞进行半换液(每次换液约1mL NK细胞培养基)，同时补加NK细胞外泌体(180ng)。

5.每7天对培养的细胞进行观察，记录观察结果。

实施例3

1.获取健康志愿者外周血10mL，利用淋巴细胞分离液分离其中的外周血单核细胞：a.往无菌离心管内加入与血液样本等量的分离液，用吸管小心吸取新鲜抗凝血样本于分离液的液面之上。b.860g，离心30min。c.离心结束后，离心管从上至下依次为血浆层、环状乳白色淋巴细胞层、透明分离液层和红细胞层。小心吸取环状乳白色淋巴细胞层于另一无菌离心管内，并加入3倍体积的生理盐水，吹打混匀。d.250g，离心15min，吸弃上清。e.加入5mL生理盐水重悬细胞。250g，离心10min，吸弃上清。f.加入1mL NK细胞培养液重悬外周血单个核细胞，吸取10μL细胞悬液，进行细胞计数，置于37℃，5％ CO₂的恒温培养箱中培养过夜。

2.将Corning Matrigel基质胶与重组表达蛋白冻干粉(IL-15:IL-18:4-1BBL＝1:2.5:1(重量比))以11:1(v/w)比例混合，按照体积比为5.5:1的比例用无血清1640培养基(1640基础培养基，120μg/mL的青霉素和链霉素)稀释基质胶和重组表达蛋白冻干粉，取混合均匀的基质胶铺于6孔板中(0.5mL/孔)，所有操作在冰上进行。与培养箱中37℃条件放置30分钟后可进行后续使用。

3.将经过计数的PBMC加入铺有基质胶的六孔板中，每孔2mL NK细胞培养基(1640培养基，110U/mL IL-2，11％胎牛血清；120μg/mL的青霉素和链霉素)，按照200ng/mL浓度加入NK细胞外泌体，置于培养箱中37℃条件培养。

4.每2天对六孔板中的细胞进行半换液(每次换液约1mL NK细胞培养基)，同时补加NK细胞外泌体(220ng)。

5.每7天对培养的细胞进行观察，记录观察结果。

对比例

将肿瘤组织分离后通过反复贴壁法获得具有不分裂不增殖但仍保持代谢活性的滋养层细胞，将滋养层细胞经过定向改造后用钴60辐照，细胞膜表面稳定表达多种细胞因子，在多种细胞因子协同作用下，外周血单个核细胞中的自然杀伤细胞得到定向激活和扩增，得到扩增后的NK细胞，检测其阳性率为85.4％，明显低于本发明所扩增得到的NK细胞的阳性率。

试验例1

观察实施例中NK细胞的体外扩增效果，其观察情况如图1所示，其中A为从外周血中分离的PBMC；B为培养7天时的情况；C为培养14天时的情况；因此可得知，本扩增体系可对分离的PBMC进行有效扩增，并在14天时达到最佳扩增效果。

试验例2

采用流式细胞术，利用CD56-FITC，CD3-PE单克隆荧光抗体标记细胞，利用流式细胞仪对实施例中NK细胞进行NK细胞(CD56⁺CD3^-)纯度分析，所得结果如图2所示，如图2可知，扩增前，人外周血单核细胞中的NK细胞(CD56⁺CD3^-)比例约为4.74％，经本方法扩增14天后，NK细胞比例可达到90.68％，扩增效率优异。

试验例3

对同培养的细胞进行培养前、后(14天)细胞计数(n＝10)。所得结果如图3所示，根据图3结果所示，扩增前，样本中获取的PBMC数量约1.8×10⁶-4.5×10⁶个，扩增后，NK细胞数量约178.1×10⁶-263×10⁶个，扩增倍数从43.17倍到93.9倍，平均扩增效率为72.22±16.15倍。

试验例4

将培养前的PBMC与培养后的NK细胞进行细胞计数，按照效应细胞(PBMC/NK细胞)比肿瘤细胞(K562细胞)(效靶比)为5:2的比例，在96孔板中加入效应细胞与靶细胞，同时设置单独杀伤细胞与单独靶细胞孔对照，杀伤4h后利用CCK-8试剂检测各孔450nm处的吸光度(OD₄₅₀),根据公式：

杀伤率＝[1-(OD₁-OD₂)/OD₃]×100％，其中OD₁：效应细胞度数+肿瘤细胞读数；OD₂：效应细胞读数；OD₃：肿瘤细胞读数。

计算NK细胞杀伤率，结果发现扩增前，PBMC对K562靶细胞的杀伤率(效靶比为5:2时)约18.69％-37.50％，平均杀伤率为26.44％±7.64％；经14天扩增后，杀伤效率达到70.66％-93.77％，平均杀伤率为79.37％±9.28％(图4，n＝5)。

由此可知本方法具有较佳的NK细胞体外扩增效果，所获得NK细胞数量多、纯度高、细胞毒活性强，可满足下游科研与临床应用的需要。

综上所述：

本发明提供了一种人原代自然杀伤细胞体外扩增体系及方法，具有如下优点：1、使用方便，扩增效率好；2、制备方便、成本较低；3、无引起过敏、严重炎症和肿瘤等生物安全风险；4、对本身活性较差的NK细胞也能达到较好的扩增激活效果；5、具有十分良好的生物安全性，极具产业化潜力和应用价值。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (7)

1.一种人原代自然杀伤细胞体外扩增方法，其特征在于，包括如下步骤：从外周血中分离得到外周血单核细胞；

将基质胶、重组表达蛋白冻干粉和1640细胞培养基混合后铺于多孔板上后于36-38℃放置28-32 min，得到培养板；其中，所述重组表达蛋白冻干粉包括IL-5、IL-18和4-1BBL，所述IL-5、IL-18和4-1BBL的重量比为1:（1.5-2.5）:1；

将所述外周血单核细胞、NK细胞培养基和NK细胞源性外泌体依次加入所述培养板内，于36-38℃培养并观察，每2-3天更换一次所述NK细胞培养基和所述NK细胞源性外泌体；所述NK细胞源性外泌体的终浓度为180-220 ng/mL。

2.根据权利要求1所述的人原代自然杀伤细胞体外扩增方法，其特征在于，所述NK细胞源性外泌体的终浓度为200 ng/mL。

3.根据权利要求1所述的人原代自然杀伤细胞体外扩增方法，其特征在于，所述1640细胞培养基包括终浓度为90-110 g/mL青霉素、终浓度为90-110 g/mL链霉素、1640基础培养基和终浓度为9-11% wt胎牛血清。

4.根据权利要求1所述的人原代自然杀伤细胞体外扩增方法，其特征在于，所述重组表达蛋白冻干粉与所述基质胶的重量比为1:（9-11）。

5.根据权利要求1所述的人原代自然杀伤细胞体外扩增方法，其特征在于，所述重组表达蛋白冻干粉与所述基质胶的混合物与所述1640细胞培养基的重量比为1:（4.5-5.5）。

6.根据权利要求1所述的人原代自然杀伤细胞体外扩增方法，其特征在于，所述培养板的每孔包括1.5-2.5 mL扩增体系。

7.根据权利要求1所述的人原代自然杀伤细胞体外扩增方法，其特征在于，所述NK细胞培养基包括1640基础培养基、终浓度为90-110 U/mL IL-2、9-11% wt胎牛血清、80-120 μg/mL青霉素和80-120 μg/mL链霉素。