CN111116728B - 肿瘤特异性抗原ctl表位肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种多肽，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明还提供了含所述多肽的药物组合物、食品或保健品及多肽的对应用途。本发明筛选获得表位肽，通过体内外胞内因子染色和细胞杀伤实验等对表位肽进行鉴定，为后续研制基于肿瘤突变抗原的疫苗以及诊断制剂提供了理论基础，并为设计基于该表位的TCR‑T(T细胞受体‑T淋巴细胞)及混合T细胞表位的肿瘤多表位疫苗提供更多的选择。

Description

肿瘤特异性抗原CTL表位肽及其应用

技术领域

本发明具体涉及肿瘤特异性抗原CTL表位肽及其应用。

背景技术

肿瘤免疫治疗凭借卓越的临床疗效和创新性位居Science杂志2013评选的十大科学突破之首。2018年度诺贝尔生理学或医学奖授予在免疫检查点阻断疗法领域具有突出贡献的James Allison教授与Tasuku Honjo教授。自2011年至今，FDA已批准多款靶向免疫检查点CTLA-4(Ipilimumab)、PD-1(Nivolumab、Pembrolizumab、Cemiplimab)等单抗药物用于治疗肿瘤患者。高通量测序技术不断发展，大量研究显示免疫检查点阻断疗法的效果与肿瘤突变负荷正相关。肿瘤突变负荷(tumor mutation burden，TMB)为基于全基因组测序、全外显子或target pannel测序，肿瘤基因组去除胚系突变(germline mutation)后的体细胞突变数量(somatic mutation)。肿瘤突变负荷越高其可能产生的突变抗原数量越多，而免疫疗法依赖于患者体内免疫细胞对肿瘤特异性抗原表位的识别，所以肿瘤突变负荷越高患者越可能从免疫疗法中获益。2016年，在《Science》杂志中发表的研究表明肿瘤中突变抗原(mutant antigen)丰富的晚期黑色素瘤、非小细胞肺癌患者对CTLA-4、PD-1单抗药物的敏感性增强。在后续的大量研究中发现，无论癌症的组织起源是什么，大量的突变抗原会使其对免疫检查点阻断疗法更敏感。所以在肿瘤免疫治疗策略中，突变抗原的表达和识别已成为决定癌症免疫疗法临床疗效的主要因素之一。

突变抗原为肿瘤特异性抗原(tumor specific antigen，TSA)，区别于肿瘤相关抗原(tumor associated antigen，TAA)。肿瘤突变抗原是指那些可以被免疫细胞识别并能够激活免疫系统、由癌细胞基因突变所产生的异常蛋白质。因突变抗原为肿瘤组织特异，相较于肿瘤相关抗原具有多靶点、广谱、安全的特点。基于肿瘤突变抗原表位的研究已经取得诸多研究成果。

食管鳞癌高发于中国，河南北部林县、安阳、辉县所处的太行山地带为中国食管鳞癌发病率及死亡率最高的地区。目前仍然未有针对食管鳞癌的免疫治疗药物获批上市。高通量测序技术证明食管鳞癌中存在大量基因突变，具有较高的TMB值，有很大的可能产生突变抗原。在我国人群中HLA-A2亚型频率超过50％，因此鉴定该亚型限制性表位更具有实际治疗意义。随着肿瘤免疫治疗及二代测序技术的发展，对大量的食管鳞癌患者进行全外显子测序的结果显示食管鳞癌中存在大量突变抗原，提示这些突变抗原可能成为食管鳞癌免疫治疗的新靶点。

发明内容

第一方面，本发明提供一种肿瘤特异性突变抗原PCLO-E4090Q来源的抗肿瘤CTL表位肽，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

所述表位肽可通过固相合成制得，如采用标准Fmoc方案制备。

第二方面，本发明提供了含所述表位肽的食品、保健品或药物组合物，药物组合物可包括多肽、融合蛋白、DNA、TCR-T构建及其药学上可接受的载体或赋形剂等形式，其药用形式可为疫苗。

第三方面，本发明提供了所述表位肽在制备所述食品、保健品或药物组合物中的用途。

第四方面，本发明提供编码所述表位肽的DNA分子，或由含有编码所述表位肽的DNA分子编码的重组蛋白。

本发明的优点在于，本发明筛选获得表位肽，通过体外体内胞内因子染色和细胞杀伤实验等对表位肽进行鉴定，为后续研制基于肿瘤特异性抗原的疫苗以及诊断制剂提供了理论基础，并为设计基于该表位的TCR-T以及混合T细胞表位的肿瘤多表位疫苗提供更多的选择。

附图说明

图1为本发明表位肽PCLO-E4090Q体外诱导的特异性CTL与荷载表位肽的T2A2细胞相互作用后分泌IFN-γ(干扰素-γ)能力的实验结果图；

图2为本发明表位肽PCLO-E4090Q体外诱导的特异性CTL对荷载表位肽的T2A2细胞的杀伤作用及交叉反应实验结果图；

图3为本发明表位肽PCLO-E4090Q体外诱导的特异性CTL与不同肿瘤细胞系相互作用后分泌IFN-γ(干扰素-γ)能力的实验结果图；

图4为本发明表位肽PCLO-E4090Q体外诱导的特异性CTL对不同肿瘤细胞系的杀伤作用及交叉反应实验结果图。

图5为本发明表位肽PCLO-E4090Q体内诱导的特异性CTL与不同肿瘤细胞系相互作用后分泌IFN-γ(干扰素-γ)能力的实验结果图；

图6为本发明表位肽PCLO-E4090Q体内诱导的特异性CTL对不同肿瘤细胞系的杀伤作用及交叉反应实验结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请做进一步介绍说明，如无特别说明，本发明中所涉及实验试剂、实验设备、实验材料均为本领域常用或市售产品，所涉名词、缩写均为本领域常规含义，如PBS(磷酸盐缓冲液)。

本发明的肿瘤特异性突变抗原CTL表位肽PCLO-E4090Q，其氨基酸序列为SEQ IDNo.1所示。本发明所述CTL表位肽利用标准的Fmoc固相合成技术合成，质谱分析并证实其分子量符合理论值。

实施例1结合力及稳定性实验

结合力实验方案如下；

(1)将所制备的候选肽溶解于灭过菌的PBS(pH 7.2)中，配制成1mg/mL分装备用；

(2)获取生长状态良好的T2A2细胞，4℃2000rpm离心5min，用无血清IMDM培养基洗涤2次。调密度至1×10⁶个/mL，铺于24孔板中，500μL/孔。

(3)拿出溶解分装好的肽放入4℃冰箱。细胞铺好板后，先加入人β₂微球蛋白(β₂-M)(0.5μg/mL)，再加入溶解好的抗原肽(50μg/mL)。根据实验安排，设置：实验组(表位肽)、阴性对照组(PBS)、阳性对照组(COX-2_321-329)和背景组(T2A2细胞)。扣板混匀细胞悬液，放于37℃细胞培养箱，孵育18h。

(4)收集孵育18h后的细胞于1.5mL EP管内，4℃离心机，2000rpm离心5min，加入预冷后的PBA缓冲液(含2％小牛血清和适量NaN₃)洗涤两次，离心设置不变。

(5)弃上清后，吹洗混匀，4℃避光孵育HLA-A2抗体，30min。

(6)避光孵育后，直接加入1mLPBA缓冲液洗涤，4℃离心，2000rpm，5min。弃去上清，补加300μL预冷的PBA缓冲液上流式机检测。

(7)荧光指数FI计算公式如下：FI＝(实验组MFI-背景组MFI)/背景组MFI。FI的值表示了表位肽与HLA-A2分子的结合能力。

稳定性实验方案如下：

(1)收集T2A2细胞：2000rpm，5min，4℃，弃上清。用无血清的IMDM洗2遍，调整细胞浓度1×10⁶个/mL，铺板500μL/孔。

荷肽：实验组：50μg/mL的表位肽。

阳性组：50μg/mL的COX-2_321-329。

阴性组：PBS。

背景组：T2A2细胞。

与培养箱(37℃，5％CO₂)中共孵育18h。

2、孵育过程中，按照时间点，用无血清IMDM洗1遍，随后加BFA(BrefeldinA)1.5μL(10μg/mL)，37℃孵育1h。孵育结束后用无血清IMDM再洗1遍。

3、以0h、2h、4h、6h时间点37℃培养箱孵育。

4、孵育结束后，预冷的缓冲液洗2遍，用0.3μL BB7.2抗体4度孵育30min。

5、预冷的缓冲液洗2遍，加300μL，上机。

结果如表1所示：

表1

a突变位点.

b FI＝[肽组平均荧光指数-背景对照组平均荧光指数]/[背景对照组平均荧光指数].

c DC₅₀代表肽/HLA-A*0201复合物半量降解的时间.

e阳性对照

实施例2人外周血单个核细胞(PBMCs)分离与诱导

(1)按30U肝素钠/mL外周血的量，根据抽取的外周血量加入一定量的肝素钠于40mL离心管中备用。首先招募的志愿者进行外周血HLA型别测定。对筛选获得的每个志愿者抽取外周血40mL。注射器中的血液在转移入50mL离心管中时应贴壁注入，置于冰上。

(2)取回的抗凝外周血与pH7.2的PBS按1:1的比例进行稀释，混匀。取10支15mL离心管，超净工作台内开启人外周血淋巴细胞分离液，一次性移液管向每支15mL离心管加入4mL分离液。向盛有20mL外周血的50mL离心管中加入等量的PBS(pH 7.2)，用一次性移液管混匀。之后移液管每次取8mL外周血/PBS混合液加入盛有分离液的15mL离心管。将盛有分离体系的离心管转移至外周血分离专用离心机，2000rpm，30min。

(3)另外准备10支15mL离心管，每管中加入10mL PBS(pH 7.2)。取离心后的离心管可见整个体系自上而下分为四层：血浆层，淋巴细胞层，分离液层，红细胞层。用灭菌的尖嘴弯玻璃管吸取“云雾层”单个核细胞于盛有PBS(pH 7.2)的离心管中。水平离心机离心洗涤一次：2000rpm，20min。

(4)PBMCs培养和CTL诱导：弃去离心后的上清，10％FBS的IMDM培养基重悬细胞后调整密度为1～1.5×10⁶个/mL。按照1mL/孔的量铺入24孔板。放于37℃，5％CO₂细胞培养箱。第二天进行荷肽操作，加入表位肽：50μg/mL；人β₂-M：3μg/mL。第三天加入人IL-2，50U/mL。其后隔天加入IL-2进行刺激，到第7天结束为一轮刺激周期。第8天开始第二轮诱导刺激，当天加入表位肽，人β₂-M，人IL-2，加入的量与首轮相同。第15天开始进行第三轮诱导刺激。操作同前两轮。诱导刺激共持续21天。其间观察细胞的状态，培养基的颜色进行必要的半量换液。

实施例3构建表达突变或野生表位肽食管癌细胞系

(1)合成包含对应野生型表位肽和突变表位肽的基因序列，构建包含各突变表位的串联微基因，通过5'EcoRI和3'BamHI克隆至载体pLVX-IRES-ZsGreen1(Ampicillin⁺)，制备重组质粒DNA(pLVX-IRES-ZsGreen1-WT、pLVX-IRES-ZsGreen1-MUT)和含有该重组质粒的穿刺菌。穿刺菌经LB培养基扩培后提取质粒，将质粒稀释至500ng/μL并过滤除菌备用。

(2)使用HEK-293T细胞进行慢病毒的包装。将HEK-293T细胞以1×10⁶cells/孔的数量铺于6孔板中。在37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养过夜。保证转染时细胞生长至85-95％汇合度。

(3)将病毒骨架质粒pLVX-IRES-ZsGreen1-WT、pLVX-IRES-ZsGreen1-MUT、pLVX-IRES-ZsGreen1及辅助质粒按照比例制备脂质体-DNA复合物，同时加入PT293用于增强转染效率。

(4)在脂质体-DNA复合物静置结束前将HEK-293T细胞更换新鲜无双抗DMEM培养基。静置时间结束后，将脂质体-DNA复合物加入到HEK-293T培养体系中。晃动混匀培养基，37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养。将孔板内含脂质体-DNA复合物的培养基更换为新鲜无双抗DMEM培养基。包装病毒后，收集孔板内的含病毒颗粒的培养基上清液。离心并用无菌0.45μm孔径过滤器过滤残留的HEK-293T细胞碎片，收集滤液感染目的细胞。

(5)感染病毒前一天，将目的细胞KYSE140、KYSE150铺于6孔板中。37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养过夜。保证细胞在感染时汇合度达到30％左右。为提高慢病毒对目的细胞的感染效率，在收集获得病毒上清中加入Polybrene。转移含pLVX-IRES-ZsGreen1-WT、pLVX-IRES-ZsGreen1-MUT、pLVX-IRES-ZsGreen1的病毒上清至KYSE140、KYSE150细胞培养孔内构建KYSE140-WT(HLA-A2⁺,MUT peptide^-)、KYSE140-MUT(HLA-A2⁺,MUT peptide⁺)、KYSE150-WT(HLA-A2^-,MUT peptide^-),MUT peptide^-)和KYSE150-MUT(HLA-A2^-,MUTpeptide⁺)细胞系。25℃、2000rpm、30min、将6孔板水平离心后置于培养箱继续培养。根据细胞生长状态及培养基消耗情况24h内补加或更换新鲜培养基。感染48h后可以通过倒置荧光显微镜观察转染情况。

实施例4胞内因子染色实验

(1)靶细胞准备：收集靶细胞密度调整为2×10⁶个/mL，铺入24孔板。以3μg/mL加入β₂-M，以50μg/mL加入抗原肽，37℃5％CO₂的条件下孵育4h。

(2)共孵育：分别将500μL的荷肽T2A2或者靶细胞与CTL加入到同一1.5mL EP管中，37℃5％CO₂的条件下共孵育7h。设置以下对照组，PBS组：荷载PBS的T2A2或者靶细胞+PBS诱导的CTL。CD3单阳组；CD8单阳组；同型对照组；阳性对照PHA组和各肽实验组

(3)阻断：在共孵育4h后加入阻断剂BFA抑制CTLs胞内因子向外分泌。继续孵育3h。

(4)孵育表面分子抗体：1500rpm 3min离心收集细胞，FACS buffer重复离心洗涤两次。之后分别加入CD3和CD8抗体，混匀后于4℃避光孵育30min。

(5)固定：1500rpm 3min离心。之后加入FACS buffer重复离心洗涤两次。加入200μL fixation buffer重悬细胞，室温避光静置30min。

(6)破膜：1500rpm，3min。加入200μL 1×破膜剂。1500rpm 3min。之后重复操作一次。

(7)孵育胞内因子抗体：加入100μL 1×破膜剂重悬细胞和适量的PE Mouse Anti-Human IFN-γ抗体。4℃避光孵育30min。

(8)上机检测：抗体孵育结束后加入FACS buffer 1500rpm 3min洗涤一次，之后再加入FACS buffer重悬细胞，流式细胞仪检测。

图1T2A2荷肽胞内因子染色结果显示在5名志愿者中突变表位肽PCLO-E4090Q诱导产生的T淋巴细胞中具有更多的分泌IFN-γ的CD8⁺T淋巴细胞。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001代表与T2A2负载突变肽组的统计学差异。

图3构建的不同肿瘤细胞系胞内因子染色结果显示在5名志愿者中突变表位肽PCLO-E4090Q诱导产生的T淋巴细胞中具有更多的分泌IFN-γ的CD8⁺T淋巴细胞。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001代表与KYSE140-MUT组的统计学差异。

实施例5靶细胞染色检测体外诱导获得CTLs细胞毒活性实验

(1)4℃、1800rpm、5min离心收集生长状态良好的T2A2细胞或构建获得的稳定细胞系。PBS清洗后，3mL无血清IMDM重悬细胞。计数后调整细胞密度至2×10⁶cells/mL。

染色方案如下：

致敏靶细胞：每1mL细胞悬液加入1μL 1mM的CellTrace Far Red

对照靶细胞：每1mL细胞悬液加入1μL 50μM的CellTrace Far Red

37℃水浴孵育20min后加入五倍体积的含10％胎牛血清的IMDM培养基室温终止染色10min。4℃、1800rpm、5min离心收集细胞，用含10％胎牛血清的IMDM培养基清洗一遍，离心弃上清。用无血清IMDM培养基重悬细胞后重新调整细胞密度至2×10⁶cells/mL。

设置突变表位肽及其野生表位肽组，加入相应表位肽(50μg/mL)、人源β2微球蛋白(0.5μg/mL)，37℃、5％CO₂培养箱内孵育4h。

(2)效应细胞的准备：移液器将孔板中的效应CTL吹吸均匀，转移至离心管中，4℃离心机离心，1800rpm，5min。弃上清，加入无血清培养基，相同条件洗涤一次。调整密度至5×10⁶个/mL。

(3)铺板：

分别将不同效靶比的效应细胞和致敏靶细胞混合，混合细胞终体积为500μL。同时，分别将不同效靶比的效应细胞和对照靶细胞混合(对照靶细胞数量为2×10⁴个)，混合细胞终体积为500μL。混匀细胞悬液后，37℃、5％CO₂培养箱孵育4h。

(4)孵育结束后，将同一条表位肽对应的同一个效靶比的致敏靶细胞组与其对照靶细胞组混合。4℃、1800rpm、5min离心收集细胞，PBS7.2清洗两遍。

(5)加入100μLPBS重悬细胞，流式细胞仪检测分析。

图2T2A2荷肽杀伤实验结果显示在5名志愿者中突变表位肽PCLO-E4090Q诱导产生的T淋巴细胞具有更好的杀伤靶细胞的能力。^#p<0.05,^##p<0.01,^###p<0.001代表与T2A2细胞组的统计学差异,*p<0.05,***p<0.001代表与T2A2荷载野生肽组的统计学差异。

图4对不同肿瘤细胞系的杀伤结果显示在5名志愿者中突变表位肽PCLO-E4090Q诱导产生的T淋巴细胞具有更好的杀伤靶细胞的能力。^#p<0.05,^##p<0.01,^###p<0.001代表与KYSE140-Vector组的统计学差异，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001代表与KYSE140-WT组的统计学差异。

实施例6表位肽体内免疫活性检测

(1)选取6～8周龄的小鼠，称量并记录体重后进行分组，每组3雌2雄，且尽量使得每组小鼠的平均体重基本一致。小鼠分组为NS(CpG-ODN 1826及生理盐水)组、NFE2L2-D13N组，各组表位肽使用生理盐水溶解(0.5mg/mL)过滤除菌后保存于-80℃，使用时在4℃自然融化。

(2)免疫方式采用尾基根部皮下多点注射。200μL CpG-ODN 1826及200μL生理盐水免疫NS组小鼠。其余六组实验组小鼠分别免疫200μL CpG-ODN 1826及200μL(0.5mg/mL)对应的表位肽。共免疫三次，第一次免疫记为第0天，第0天、第7天、第14天进行注射免疫。从第0天开始，隔天称量小鼠体重，并观察小鼠状态进行详细记录。

(3)在免疫的第19天处死小鼠。酒精消毒后放入生物安全柜中进行解剖。取小鼠脾脏进行研磨至单细胞状态，用无菌PBS润洗玻片。通过已灭菌的滤网过滤细胞悬液至无菌50mL离心管中。4℃、1800rpm、5min离心收集细胞。弃上清后，加入5mL无菌红细胞裂解液。室温裂解红细胞8min，观察裂解状态。裂解结束后4℃、1800rpm、5min离心收集细胞。无菌PBS清洗一次。3mL含10％胎牛血清的1640培养基重悬细胞。计数后调整细胞密度为5×10⁶cells/ml，铺入6孔板中培养。第2天加入突变表位肽(10μg/mL)、mIL-2(50U/mL)、人β₂微球蛋白(0.5μg/mL)。之后隔天补加同样量的mIL-2，诱导7天收集诱导的细胞进行后续实验。

(4)靶细胞为食管癌KYSE140-WT、KYSE140-MUT、KYSE140-Vector、KYSE 150-WT、KYSE150-MUT。效应细胞为小鼠脾脏来源诱导的CTLs。收集细胞处理过程、实验分组设置、实验过程与以肿瘤细胞系为靶细胞体外免疫活性实验中的胞内因子染色实验相同。

(5)靶细胞染色检测体内诱导获得CTLs细胞毒活性实验：靶细胞及效应细胞的收集处理与以食管癌细胞系为靶细胞体外免疫活性实验中的活细胞染色检测诱导获得CTLs细胞毒性实验相同。效应细胞与靶细胞比为：20:1、40:1、80:1。后续实验过程与以肿瘤细胞系为靶细胞体外免疫活性实验中的活细胞染色检测诱导获得CTLs细胞毒活性实验相同。

图5体内免疫胞内因子染色结果显示突变表位肽PCLO-E4090Q诱导产生的T淋巴细胞中具有更多的分泌IFN-γ的CD8⁺T淋巴细胞。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001代表与KYSE140-MUT组的统计学差异。

图6对不同肿瘤细胞系的杀伤结果显示在小鼠体内突变表位肽PCLO-E4090Q诱导产生的T淋巴细胞具有更好的杀伤靶细胞的能力。^#p<0.05,^##p<0.01,^###p<0.001代表与KYSE140-Vector组的统计学差异，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001代表与KYSE140-WT组的统计学差异。

序列表

<110> 郑州大学

<120> 肿瘤特异性抗原CTL表位肽及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gln Val Thr Asp Phe Leu Ala Pro Leu

1 5

Claims (6)

1.多肽，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.含权利要求1所述的多肽的药物组合物。

3.如权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，其为疫苗。

4.如权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，其包括药学上可接受的载体或赋形剂。

5.编码权利要求1所述多肽的DNA分子。

6.含权利要求1所述的多肽的食品或保健品。

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