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CN116286666B - 滋养层细胞及其制备方法、应用和扩增nk细胞的方法 - Google Patents

滋养层细胞及其制备方法、应用和扩增nk细胞的方法 Download PDF

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CN116286666B CN202310539122.7A CN202310539122A CN116286666B CN 116286666 B CN116286666 B CN 116286666B CN 202310539122 A CN202310539122 A CN 202310539122A CN 116286666 B CN116286666 B CN 116286666B
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Abstract

本发明涉及一种滋养层细胞及其制备方法、应用和扩增NK细胞的方法，为生物医药技术领域，具体涉及一种滋养层细胞及其制备方法。本发明提供一种高效扩增NK细胞的滋养层细胞及其制备方法，所述细胞同时表达4种分子，分别是CD137L、CD48、mIL‑15和mIL‑21。制备方法包括：构建慢病毒重组质粒；制备对应的慢病毒；慢病毒侵染K562细胞或HuT78细胞；流式分选得到目标蛋白高表达的滋养层细胞；灭活处理获得滋养层细胞，用于NK细胞的激活扩增培养。本发明所制得的滋养层细胞，相比于商业化的滋养层细胞，能够极大地提高NK细胞的扩增数目和纯度，并且扩增得到的NK细胞具有较强的细胞毒作用。

Description

滋养层细胞及其制备方法、应用和扩增NK细胞的方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种滋养层细胞及其制备方法和扩增NK细胞的方法。
背景技术
自然杀伤细胞(Natural killer cell，NK细胞) 是人体内抗感染和抑制肿瘤细胞生长的重要的固有免疫细胞，NK细胞主要从CD34+造血干细胞分化而来。NK细胞无需抗原预先致敏就能破坏靶细胞，如病毒感染的细胞，某些肿瘤细胞和受损伤的细胞，其杀伤无MHC限制性，应答速度快，在免疫应答的早期即可发挥作用。随着NK细胞的功能被不断发掘，NK细胞在临床中的应用也越来越广泛。
当前大多数临床前以及临床研究中所使用的NK细胞来源于外周血，也有部分来源于脐带血。由于NK细胞在外周血中仅占5％-20％，且NK细胞在体外的增殖能力又远远低于T细胞，极大的限制了NK细胞在临床上的应用。为了获得充足的NK细胞，人们通过将外周血或者脐带血中分离得到的单核细胞在体外进行扩增以期获得足够数量的NK细胞。
当前常见的NK细胞体外扩增方式主要包括通过添加细胞因子对NK细胞刺激进行扩增。该方法需要额外添加各种细胞因子，体外扩增NK细胞的倍数为几十到几百倍，扩增得到的NK细胞纯度低，并且扩增不同批次单核细胞之间重复性差。另外一种是通过添加滋养层细胞刺激单核细胞来促进NK细胞增殖。后者由于生产成本相对较低，且能够避免由于过量的细胞因子的直接使用导致NK细胞出现耗竭，扩增NK的效率高而得到广泛的应用。然而，当前已有的滋养层细胞仍存在扩增的倍数有限，细胞数量不足，NK细胞纯度偏低，补充添加滋养层细胞的操作繁琐，获得的不同批次细胞的重复性差等缺点。
因此，亟需开发一种扩增效率高、能够获得高纯度和高活率NK细胞的滋养层细胞用于NK细胞的制备和研究。
发明内容
针对现有技术的不足和缺陷，本发明提供一种同时表达多种效应因子用于扩增NK细胞的滋养层细胞的制备方法和应用。
所述滋养层细胞同时表达CD48、CD137L、mIL-21和mIL-15，四种效应分子协同刺激NK细胞的增殖和分化。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
第一方面，本发明提供一种滋养层细胞。所述滋养层细胞为K562细胞或者HuT78细胞，同时表达4种效应分子，分别为CD48、CD137L、mIL-21和mIL-15。
第二方面，本发明提供一种用于扩增NK细胞的滋养层细胞的制备方法，采用如下的制备方法。
S1.将CD48和CD137L通过剪切肽连接得到嵌合序列；将IL-15与 IL-15RA连接得到嵌合基因mIL-15，将IL-21与CD8a跨膜区连接得到嵌合基因mIL-21；将mIL-15和mIL-21通过剪切肽连接得到嵌合序列；将共表达CD48和CD137L的嵌合基因构建到同一个慢病毒载体中，此外，将共表达mIL-15和mIL-21的嵌合基因构建到另一个慢病毒载体中；
S2.将步骤S1制备的两种慢病毒重组载体与辅助质粒共转染293T细胞，包装获得相应的慢病毒；
S3.将步骤S2制备的慢病毒侵染K562细胞或HuT78细胞，侵染后的第1-4天显微镜下观察细胞状态，第4~6天离心收集细胞用于表型分析；
S4.取步骤S3中富集的侵染后的K562细胞或HuT78细胞，进行流式检测并分选，分选得到同时高表达CD48、CD137L、mIL-21和mIL-15的K562细胞或HuT78细胞；
S5.将步骤S4中分选后的细胞进行灭活处理，得到用于扩增NK细胞的滋养层细胞。
作为优选，步骤S1表达CD48和CD137L的重组序列构建到慢病毒表达载体pLVX-EF1a-IRES-NeoR/KanR中，将表达mIL-15和mIL-21的重组序列构建到慢病毒表达载体pLVX-EF1a-IRES-Puro中。
作为优选，步骤S1中剪切肽为P2A。
作为优选，所述步骤S2慢病毒的制备方法为，复苏293T细胞并传代，使细胞生长汇合度达到80%-90%，将步骤S1制备的两种慢病毒载体与慢病毒包装辅助质粒以及PEI混合，制成PEI-质粒混合物，将上述PEI-质粒混合物转染293T细胞，分别收取36~48h和60~84h病毒上清。
优选地，所述灭活处理为辐照照射或使用丝裂霉素C预处理。
作为优选，本发明所述IL-21的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，CD8a跨膜区的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述IL15的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述IL15RA的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述剪切肽P2A的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述CD137L的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述CD48的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。连接可采用连接肽，所述连接肽为(G4S)5 linker，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。核苷酸序列信息具体如下表所示。
序列编号 名称 核苷酸
1 IL-21 atgtggctgc agagcctgctcctgctcggc accgtggcctgcagcatcag ccaaggccaagacagacaca tgatcagaatgagacagctg atcgacatcgtggatcagct gaagaactacgtgaacgacc tggtgcccgagttcctgccc gctcccgaggacgtggagac caactgcgagtggagcgcct tcagctgctttcagaaggct cagctgaagagcgccaacac cggcaacaacgagagaatca tcaacgtgagcatcaagaag ctgaagagaaagcctcctag caccaacgccggcagaagac agaagcacagactgacctgc cctagctgcgacagctacga gaagaagccccccaaagagt tcctggagagattcaagagc ctgctgcagaaaatgatcca tcagcacctgagcagcagaa cccacgggagcgaggacagc
2 CD8a accacgacgc cagcgccgcgaccaccaaca ccggcgcccaccatcgcgtc gcagcccctgtccctgcgcc cagaggcgtgccggccagcg gcggggggcgcagtgcacac gagggggctggacttcgcct gtgatatctacatctgggcg cccctggccgggacttgtgg ggtccttctcctgtcactgg ttatcacc
3 IL-15 atggactgga cctggattctgttcctggtg gccgctgccacaagagtgca cagcggcatccacgtgttca tcctgggctgcttcagcgcc ggcctgcccaagaccgaggc caactgggtgaacgtgatca gcgacctgaagaagatcgag gacctgattcagagcatgca catcgacgccaccctgtaca ccgagagcgacgtgcaccct agctgcaaggtgaccgccat gaagtgcttcctgctggagc tgcaagtgatcagcctggag agcggcgacgctagcatcca cgacaccgtggagaacctga tcatcctggccaacaacagc ctgagcagcaacggcaacgt gaccgagagcggctgcaagg agtgcgaggagctggaggag aagaacatcaaggagttcct gcagagcttcgtgcacatcg tgcagatgttcattaataca agcagcgggggcggcagc
4 (G4S)5 linker gggggcgggg gcagcgggggcggcgggtcc ggggggggcggcagcggcgg gggcagc
5 IL-15RA caaatcacct gcccccctcccatgtccgtg gagcacgccgacatctgggt gaagagctacagcctgtaca gcagagagagatacatctgc aacagcggcttcaagagaaa ggccggcacaagctccctga ccgagtgcgtgctgaacaag gccaccaacgtggcccactg gaccacccctagcctgaagt gcatcagagaccccgctctc gtccatcaaagacccgcccc cccctccacagtgacaaccg ctggggtgacccctcagccc gagtccctgagcccttccgg caaggagcccgccgctagca gccctagcagcaacaacacc gctgccacaaccgccgccat cgtgcccggcagccaactga tgcctagcaagagccctagc accggcaccaccgagatcag cagccacgagagcagccacg gcacccctagccaaaccacc gccaagaactgggagctcac agctagcgcctcccatcagc ctcccggcgtctacccccaa ggccacagcgacaccaccgt ggccatcagcacaagcaccg tgctgctgtgcggcctgagc gccgtgagcctgctggcctg ctacctgaagagcagacaga cccctcccctggctagcgtg gagatggaggccatggaggc cctgcccgtgacctggggca caagcagccgggacgaggac ctggagaactgcagccacca cctgggcagcggc
6 P2A gccacaaact tcagcctgctgaagcaagcc ggcgacgtggaggagaaccc cggcccc
7 CD137L atggagtacg ctagcgatgctagcctcgac cccgaggccccctggccccc cgcccctagagctagagctt gtagagtcctgccttgggcc ctcgtggccggcctgctcct gctcctgctgctcgctgccg cctgtgccgtgttcctcgcc tgcccctgggccgtgagcgg ggcccgggctagccccggga gcgccgctagccctagactg agagagggccccgaactctc ccccgacgaccccgccgggc tgctggacctgagacaaggc atgttcgctcagctggtggc tcagaacgtgctcctgatcg acggccccctgtcctggtat tccgaccccggcctggctgg ggtcagcctgaccggcggcc tgagctacaaggaggacacc aaggagctggtggtggccaa ggccggcgtgtactacgtgt tctttcagctggagctgaga cgggtggtggctggggaagg cagcggcagcgtgagcctcg ccctgcatctgcaacctctg agatccgctgccggcgccgc tgccctggccctgaccgtcg acctgccccccgctagcagc gaggctagaaacagcgcctt cggcttccaaggcagactgc tgcacctgagcgccgggcag agactgggcgtgcacctgca cacagaggctagagctagac acgcttggcagctcacccaa ggcgccacagtcctcgggct cttccgggtcacccctgaga ttcccgccggcctgcctagc cctagaagcgag
8 CD48 atgtgcagca gaggctgggacagctgcctg gccctggagctgctcctgct gcccctgagcctgctggtga caagcatccaaggccacctg gtgcacatgaccgtggtgag cggcagcaacgtgaccctga acatcagcgagagcctgccc gagaactacaagcagctgac ctggttctacaccttcgatc agaagatcgtggagtgggac agcagaaagagcaagtactt cgagagcaagttcaagggca gagtgagactggaccctcag agcggcgccctgtacatcag caaggtgcagaaggaggaca acagcacctacatcatgaga gtgctgaagaagaccggcaa cgagcaagagtggaagatca agctgcaagtgctggacccc gtgcccaagcccgtgatcaa gatcgagaagatcgaggaca tggacgacaactgctacctg aagctgagctgcgtgatccc cggcgagagcgtgaactaca cctggtacggcgacaagaga cccttccccaaggagctgca gaacagcgtgctggagacca ccctgatgccccacaactac agcagatgctacacctgcca agtgagcaacagcgtgagca gcaagaacggcaccgtgtgc ctgagccccccctgcaccct ggctagaagcttcggcgtgg agtggatcgctagctggctg gtggtgaccgtgcccaccat cctgggcctcctcctgacat ga
本发明提供所述制备方法得到的滋养层细胞。所述滋养层细胞为K562细胞或者HuT78细胞，共表达的效应分子为CD48、CD137L、mIL-21和mIL-15。或者所述滋养层细胞为前述制备方法制备得到的滋养层细胞。
第三方面，本发明提供一种扩增NK细胞的方法，通过所述制备方法得到的滋养层细胞进行扩增。
所述扩增NK细胞的步骤为：
a.分离单核细胞；
b. 复苏所述灭活后的滋养层细胞；
c.按照单核细胞：滋养层细胞=1:2的比例，单核细胞的数量0.5×106~2×106cells/T25 瓶，所述的滋养层细胞的数量为 1×106~4×106cells/T25 瓶，将单核细胞与b步骤所述的滋养层细胞混合培养9天以上。
第四方面，本发明提供所述的一种用于扩增NK细胞的滋养层细胞的制备方法、所述的滋养层细胞或所述的一种扩增NK细胞的方法在扩增NK细胞中的应用。
相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：
（1）制备能同时表达mIL-21、mIL-15、CD48和CD137L蛋白的K562滋养层细胞YC-FC-01，对4种膜蛋白的表达效率高达98%~99%，可以高效诱导单核细胞在体外增殖、分化为成熟的NK细胞。YC-FC-01滋养层细胞使获得的NK细胞扩增倍数高达250倍，而仅表达mIL-21、mIL-15和CD137L分子的K562滋养层细胞对NK细胞扩增倍数仅有约200倍。并且使用YC-FC-01滋养层细胞扩增得到的NK细胞纯度高，其中CD56和CD16双阳的细胞比例高达95.7%，杀伤肿瘤细胞所分泌的细胞因子水平以及NK细胞激活受体的比例也显著高于对照组，同时，NK细胞对肿瘤细胞的杀伤效率也显著高于对照组制备的NK细胞。
（2）本发明所述的滋养层细胞的制备方法简单，容易操作，生产条件稳定，制备成本低，可以实现批量化生产，为该产品的推广和应用奠定了基础。
附图说明
图1为构建的YC-FC-01滋养层细胞表达CD48、CD137L、mIL-15和mIL-21的流式检测图；
图2为YC-FC-01滋养层细胞对NK细胞的扩增曲线图；
图3为YC-FC-01滋养层细胞与对照细胞扩增的NK细胞纯度的流式检测图；
图4为YC-FC-01与HuT78滋养层细胞扩增的NK细胞靶向人B淋巴白血病细胞系的杀伤流式检测图；
图5为YC-FC-01滋养层细胞扩增的NK细胞杀伤肿瘤细胞时释放的IFN-γ的流式检测图；
图6为YC-FC-01滋养层细胞扩增得到的NK细胞表达NKG2A、NKG2C的流式检测图；
图7为YC-FC-01滋养层细胞扩增得到的NK细胞表达NKp30、NKp44的流式检测图；
图8为YC-FC-01滋养层细胞扩增得到的NK细胞表达NKp46的流式检测图；
图9为YC-FC-01滋养层细胞扩增得到的NK细胞表达NKG2D的流式检测图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1 一种扩增NK细胞的滋养层细胞的制备方法
包括以下步骤
（1）载体质粒的构建
本发明采用的基因核苷酸序列信息如下，IL-21的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，CD8a跨膜区的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，IL15的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，IL15RA的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，剪切肽P2A的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，CD137L的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，CD48的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，连接肽为(G4S)5 linker，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
将CD48和CD137L用P2A剪切肽连接后命名为YC005，将IL-15通过(G4S)5 linker与IL5RA跨膜区连接得到重组序列mIL-15，IL-21通过(G4S)5 linker与CD8a跨膜区连接得到重组序列mIL-21，然后将两段重组序列mIL-15和mIL-21通过P2A连接，拼接完成的基因命名为YC007。
随后在YC005和YC007两段嵌合基因的5’端和3’分别添加EcoR I和BamH I酶切位点，之后把嵌合基因送上海生工生物股份有限公司进行密码子优化并合成基因。将合成后的基因YC007通过酶切连接的方式构建到pLVX-EF1a-IRES-Puro慢病毒载体中，与此同时，将YC005基因构建至pLVX-EF1a-IRES-NeoR/KanR慢病毒载体中。使用天根无内毒素大提质粒试剂盒（DP117）提取质粒，冻存于-20℃冰箱备用。
（2）重组慢病毒的制备
复苏P8代的293T细胞，扩增培养293T细胞至P10代，使培养细胞生长汇合度达到90%。将提前准备包含YC007与YC005基因的慢病毒质粒，以及慢病毒包装辅助质粒pSPAX2，pMD2.G，按照pLVX：pSPAX2：pMD2.G 等于8μg：10μg：5μg的比例与2.5倍体积的PEI混合，制备PEI-质粒混合物。将上述PEI-质粒混合物加入293T细胞中，6h后换液。分别收取48h和72h病毒上清，用0.45μm 微孔滤膜过滤后分装并冻存于-80℃冰箱备用。
（3）重组慢病毒侵染K562细胞或HuT78细胞，并分选得到目的细胞
预热离心机至32℃，收集K562细胞或HuT78细胞到15ml离心管中，300g离心3min，弃上清，加入适量体积的1640完全培养基重悬并计数，细胞悬液密度2×106 cells/ml。将上述细胞接种于12孔板的2个孔中，500ul/孔（1×106 cells/孔）。向12孔板的一个孔中补加完全培养基至1ml，向另一个孔中加入200ul的YC005病毒原液和Polybrene并补加完全培养基至1ml， Polybrene终浓度8ug/ml。使用封口膜将12孔板封口，然后32℃，800g离心90min，离心结束后去掉封口膜并观察细胞状态，然后将细胞置于37℃细胞培养箱中过夜培养。第4天上午，显微镜下观察细胞状态，300g，5min收集细胞到离心管中。弃上清，加入完全培养基重悬后将细胞转移至6孔板中培养，培养基中加入G418进行筛选，此步可取出部分细胞使用流式细胞仪检测CD48及CD137L的表达量。
在细胞培养基中加入嘌呤霉素和G418进行筛选培养，随后使用流式分选获得CD48、CD137L、mIL-21和mIL-15高表达的滋养层细胞。以制备K562-YC005-YC007滋养层细胞（命名为YC-FC-01滋养层细胞）为例，流式细胞仪检测YC-FC-01滋养层细胞表达CD48、CD137L、mIL-21和mIL-15的表达，结果如图1所示，四种效应蛋白均能够高水平表达在细胞膜表面。
（4）分选后的滋养层细胞灭活
K562 -YC005-YC007细胞或HuT78-YC005-YC007细胞可采用丝裂霉素C灭活，也可采用辐照灭活。
K562 -YC005-YC007细胞或HuT78-YC005-YC007细胞用丝裂霉素C预处理的方法如下
取1×106 的K562-YC005-YC007细胞或HuT78-YC005-YC007细胞，加入mitomycinC，终浓度为10μg/ml，37℃，5%CO2培养箱中孵育3h。3h后用DPBS将K562-YC005-YC007细胞或HuT78-YC005-YC007细胞清洗3次。300g，5min离心后用1640完全培养基重悬。
K562或HuT78-YC005-YC007细胞辐照处理
辐照剂量：25Gy，辐照时间25分钟。
实施例2 滋养层细胞扩增NK细胞
1）第0天，分离脐带血单个核细胞，取部分细胞用于NK纯度检测，剩下的细胞加入NK细胞完全培养基置于37℃培养箱中培养。2）NK 纯度检测：使用CD56-CD16抗体检测NK细胞比例。3）第1天，取2× 106 cells的K562滋养层细胞于6孔板中，终体积为2ml，加入 1ul20mg/mL的mitomycin C，摇匀，mitomycin C使用浓度为 10ug/mL，37℃，5%CO2培养箱中孵育3h。4）孵育结束后，使用生理盐水洗涤细胞2次，300g，5min。5）复苏滋养层细胞，按脐带血单个核细胞：滋养层细胞=1：2的比例，脐带血单个核细胞和实施例1制备的YC-FC-01滋养层细胞混合培养作为实验组，设置脐带血单个核细胞和K562野生型滋养层细胞混合培养作为对照组。培养瓶中培养基终体积为3ml。接种单个核细胞数量：1× 106cells/T25瓶，接种滋养层细胞数量：2× 106cells/T25瓶。6）分别在刺激培养的第3天、5天、7天、9天、11天、13天、15天重悬细胞计数，并使用流式检测CD3-CD56+CD16+的细胞比例。
绘制NK增殖的曲线，如图2所示，随着滋养层细胞和单核细胞共培养时间的增加，在YC-FC-01滋养层细胞存在的培养体系中，NK细胞的数量相比于对照组细胞增殖迅速，在培养第15天时检测NK细胞的数量表明NK细胞总量已扩增250倍，与对照组细胞相比，本发明所构建的滋养层细胞YC-FC-01能够高效地、显著地刺激NK细胞的增殖。
细胞纯度流式检测
取5× 105个细胞，PBS漂洗一次，用100μl含有2% FBS的PBS重悬细胞；向细胞悬液中分别加入抗人CD16，CD56的流式抗体，4℃孵育25min；使用1mlPBS漂洗细胞一次，加入200μl PBS重悬细胞。上机检测CD3-CD56+CD16+的细胞比例。
实验结果如图3所示，由图可知由野生型细胞扩增得到的NK细胞，CD3-CD56+CD16+NK细胞的比例为35.8%，而通过实施例1构建的YC-FC-01滋养层细胞扩增得到的CD3-CD56+CD16+NK细胞比例高达95.7%。
细胞杀伤检测
增殖得到的NK细胞的杀伤研究使用Bio-LiteTM Luciferase Assay System(Vazyme)检测。将增殖得到的NK细胞使用PBS漂洗两次，计数；使用的靶细胞为人急性B淋巴白血病细胞系，同样将使用PBS漂洗两次计数；分别按照NK细胞比：靶细胞等于10:1，5:1，2.5:1，1:1的效靶比进行铺板；将Bio-Lite Luciferase Assay Buffe置于室温条件下融化；将融化后的检测试剂加入到底物中，轻柔颠倒混匀3-5次使底物充分溶解；从培养箱中取出待检测细胞培养板，室温放置30min，使培养板温度平衡至室温；加入与待测培养物等体积并平衡至室温的Bio-LiteTM检测试剂；室温放置至少5min使细胞充分裂解，上机检测。
杀伤结果如图4所示，由对照组细胞刺激得到的NK细胞毒作用相对较差。由本发明实施例1构建的滋养层细胞扩增得到的NK细胞对靶细胞的细胞毒作用明显高于对照组。YC-FC-01组在效靶比为1:1时，对靶细胞的杀伤率达到45%，在效靶比为2:1和4:1时，对靶细胞的杀伤率达到67%和89%。HuT78-YC005-YC007滋养层细胞组（对应图中H uT78组）对靶细胞杀伤力接近YC-FC-01组，在效靶比为4:1时，对靶细胞的杀伤率达到85%。
细胞因子检测
使用Biolegend的细胞因子检测NK细胞释放的细胞因子（IFN-γ）水平，将Beads超声1min，使Beads充分混匀，取25μl Beads，25μl检测样品，将样品和Beads充分混匀，室温避光孵育2h；孵育完成后使用Wash Buffer漂洗一次，然后加入检测抗体，室温避光孵育1h；孵育完成后不洗，直接加入25μl SA-PE，室温孵育30min，加入Wash Buffer，漂洗一次；加入200μl Wash Buffer重悬，上机检测。
IFN-γ是NK细胞发挥细胞毒作用的关键细胞效应因子之一。如图5所示， YC-FC-01滋养层细胞扩增得到的NK细胞释放的IFN-γ显著高于对照组，结果具有统计学差异。
NCR（自然细胞毒性受体）激活检测
采用流式细胞仪检测NKG2A、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46的表达情况，图6-7为对照组和YC-FC-01滋养层细胞扩增得到的NK细胞表达NKG2A、NKG2C、NKp30、NKp44的检测结果，图8和图9分别为对照组和YC-FC-01滋养层细胞扩增得到的NK细胞表达NKp46、NKG2D的检测结果，由图6-9可知，由YC-FC-01滋养层细胞扩增得到的NK细胞其激活受体的表达水平均明显高于对照组。
对比例1
本对比例与实施例的区别在于对比例重组载体中不含有CD48的基因序列，仅含有CD137L、mIL-21和mIL-15 的基因序列，其余实验方法和步骤与实施例1一致，对比例细胞仅表达CD137L、mIL-21和mIL-15三种效应蛋白，由此制备得到的K562- CD137L-mIL-21-mIL-15滋养层细胞。同实施例2扩增NK细胞的方法，对NK细胞进行扩增，在第15天时，NK细胞的增殖倍数约200倍，增殖得到的NK纯度检测结果如图3所示，CD3-CD56+CD16+NK细胞的比例约83.8%，其纯度明显低于实施例1制备的YC-FC-01细胞增殖的NK细胞纯度。
以上所述仅为本发明的优选实施方式，并不用以限制本发明，凡在本发明的技术方法前提下所作的若干补充、改进，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种滋养层细胞，其特征在于，所述滋养层细胞同时表达4种效应分子，分别是CD137L、CD48、mIL-15和mIL-21，其中mIL-15由IL-15与IL-15RA连接得到，mIL-21由IL-21与CD8a跨膜区连接得到。
2.一种用于扩增NK细胞的滋养层细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1 .将CD48和CD137L通过剪切肽连接得到嵌合序列；将IL-15与 IL-15RA连接得到嵌合基因mIL-15，将IL-21与CD8a跨膜区连接得到嵌合基因mIL-21；将mIL-15和mIL-21通过剪切肽连接得到嵌合序列；将共表达CD48和CD137L的嵌合基因构建到同一个慢病毒载体中，与此同时，将共表达mIL-15和mIL-21的嵌合基因构建到另一个慢病毒载体中；
S2 .将步骤S1制备的两种慢病毒重组载体与辅助质粒共转染293T细胞，包装获得相应的慢病毒；
S3 .将步骤S2制备的慢病毒侵染K562细胞或HuT78细胞，侵染后的第1-4天显微镜下观察细胞状态，第4~6天离心收集细胞；
S4 .取步骤S3中富集的侵染后的K562细胞或HuT78细胞，进行流式检测并分选，分选得到同时高表达CD48、CD137L、mIL-21和mIL-15的K562细胞或HuT78细胞；
S5.将步骤S4中分选后细胞进行灭活处理，得到用于扩增NK细胞的滋养层细胞。
3.根据权利要求2所述的一种用于扩增NK细胞的滋养层细胞的制备方法，其特征在于，步骤S2慢病毒的制备方法为，复苏293T细胞并传代，使细胞生长汇合度达到80%-90%，将权利要求2中步骤S1制备的两种慢病毒载体与慢病毒包装辅助质粒以及PEI混合，制成PEI-质粒混合物，将上述PEI-质粒混合物转染293T细胞，分别收取36~48h和60~84h病毒上清。
4.根据权利要求2所述的一种用于扩增NK细胞的滋养层细胞的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述剪切肽为P2A，共表达CD48和CD137L的嵌合基因构建到pLVX-EF1a-IRES-NeoR/KanR慢病毒载体中，共表达mIL-15和mIL-21的嵌合基因构建到pLVX-EF1a-IRES-Puro慢病毒载体中。
5.根据权利要求2所述的一种用于扩增NK细胞的滋养层细胞的制备方法，其特征在于，步骤S5所述灭活处理为辐照照射或使用丝裂霉素C处理。
6.一种扩增NK细胞的方法，其特征在于，使用权利要求1所述的滋养层细胞或权利要求2-5中任一项所述的制备方法制备的滋养层细胞进行扩增。
7.根据权利要求6所述的一种扩增NK细胞的方法，其特征在于，扩增NK细胞的步骤为，
a .分离单核细胞；
b .复苏权利要求1所述的滋养层细胞或权利要求2-5中任一项所述的制备方法制备的滋养层细胞；
c .按照单核细胞：滋养层细胞=1:2的比例， 将单核细胞与b步骤所述的滋养层细胞混合培养。
8.根据权利要求7所述的一种扩增NK细胞的方法，其特征在于，所述单核细胞的数量为0.5×106~2×106cells/T25 瓶，所述的滋养层细胞的数量为1×106 ~4×106cells/T25瓶。
9.根据权利要求7所述的一种扩增NK细胞的方法，其特征在于，单核细胞与b步骤所述的滋养层细胞混合培养的时间是9天以上。
10.权利要求1所述的滋养层细胞或权利要求2-5中任一项所述的制备方法制备的滋养层细胞在扩增NK细胞中的应用。
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