CN113881631B

CN113881631B - 一种扁桃体来源的Tγδ细胞及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN113881631B
Application number: CN202111182222.6A
Authority: CN
Inventors: 张欢; 于洋; 程铧
Original assignee: Beijing Yibo Puhui Biotechnology Development Co ltd
Current assignee: Beijing Yibo Puhui Biotechnology Development Co ltd
Priority date: 2021-10-11
Filing date: 2021-10-11
Publication date: 2022-08-02
Anticipated expiration: 2041-10-11
Also published as: CN113881631A

Abstract

本申请涉及T_γδ细胞制备的技术领域，具体公开了一种扁桃体来源的T_γδ细胞及其制备方法和应用。T_γδ细胞的制备方法，包括以下步骤：S1、自扁桃体中分离免疫细胞；S2、取免疫细胞和STLV4病毒的Tax蛋白接触，细胞培养后制备得到树突状细胞；S3、取新的步骤S1制备得到的免疫细胞和所述树突状细胞混合培养，制备得到存在于细胞培养物内的T_γδ细胞。本申请的T_γδ细胞可用于制备抗肿瘤或抗病毒的细胞产品；本申请的T_γδ细胞在体外培养3周后，仍然具有优异的抗肿瘤作用。

Description

一种扁桃体来源的Tγδ细胞及其制备方法和应用

技术领域

本申请涉及T_γδ细胞制备的技术领域，更具体地说，它涉及一种扁桃体来源的T_γδ细胞及其制备方法和应用。

背景技术

扁桃体是具有免疫活性的器官，是免疫系统抵御摄入或吸入的外来病原体的第一道防线，因此扁桃体经常充血，以帮助对呼吸道病毒感染等常见疾病做出免疫反应。但反复发作的扁桃体炎，严重影响了生活质量，因此扁桃体摘除术成为耳鼻咽喉科最常开展的手术，以治疗反复发生的慢性扁桃体炎。已知扁桃体粘膜内含有大量淋巴组织，是各种免疫细胞的聚集地。充分利用切除的扁桃体内的免疫细胞，培养并激活后可用于自体或异体的癌症、或病毒感染性疾病的治疗，还可以用于免疫功能失衡后的重建治疗。

扁桃体内有定居的树突状细胞，它是一种特殊的抗原递呈细胞，可以吸收病原体产生的抗原。随后，这类负载抗原的树突状细胞可进一步激活扁桃体中潜在的T细胞和B淋巴细胞，从而产生对病原体的免疫应答。根据T细胞受体(TCR）的不同，可将T细胞分为两类：T_αβ细胞和T_γδ细胞。已知T_γδ细胞是一类不依赖MHC分子即可发挥抗病原体或癌细胞作用的T细胞，可以应用于自体或异体，高活性T_γδ细胞具有极大的临床应用价值。

目前，T_γδ细胞的常规制备方法是，采集外周血中的单核细胞（PBMCs），将其与IL2和磷酸盐类小分子化合物（如唑来膦酸等）进行培养后获得。但是，据报道，该方法扩增周期短（一般为14天左右，扩增数量受限制），得到的T_γδ细胞的存活时间较短（扩增出的细胞能继续存活7天左右），细胞抗凋亡能力差，对肿瘤细胞的杀伤能力差等情况。

发明内容

为了进一步提高制备得到的T_γδ细胞的肿瘤细胞杀伤能力并延长T_γδ细胞的存活时间，本申请提供一种扁桃体来源的T_γδ细胞及其制备方法和应用。

第一方面，本申请提供一种扁桃体来源的T_γδ细胞的制备方法，采用如下的技术方案：

一种扁桃体来源的T_γδ细胞的制备方法，包括以下步骤：

S1、自扁桃体中分离免疫细胞；

S2、取免疫细胞和STLV4病毒的Tax蛋白接触，细胞培养后制备得到树突状细胞；

S3、取新的步骤S1制备得到的免疫细胞和所述树突状细胞混合培养，制备得到存在于细胞培养物内的T_γδ细胞。

通过采用上述技术方案，本申请自扁桃体中分离得到免疫细胞，并选用STLV4病毒的Tax蛋白和制备得到的免疫细胞接触，以该方式制备得到的组织定居的树突状细胞（即DC细胞），大部分为CD141+亚型。选用该DC细胞制备T_γδ细胞时，经测试，该T_γδ细胞体外培养3周后，仍然具有强大的抗肿瘤作用。

优选的，编码所述Tax蛋白的基因序列如SEQ ID NO.1所示，所述Tax蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

优选的，STLV4病毒的Tax蛋白的制备方法包括将STLV4病毒的Tax蛋白的编码基因插入慢病毒载体后，和混合包装质粒转染至宿主细胞，培养宿主细胞并分离得到STLV4病毒的Tax蛋白。

优选的，步骤S2中，在将STLV4病毒的Tax蛋白和免疫细胞接触时，还添加有5~15µg/mL的葡聚糖。

通过采用上述技术方案，能够有效提高STLV4病毒的Tax蛋白感染免疫细胞的效率。

优选的，步骤S2中，在进行细胞培养时，还添加有30~80unit/mL的IL2，并且每2~4天更换新的培养基并添加30~80unit/mL的IL2。

通过采用上述技术方案，高剂量IL2倾向于诱导T细胞扩增，而在制备DC细胞的过程中，T细胞增殖过快将会抢占培养基内的营养物质，减缓DC细胞的生长，最终导致DC细胞制备失败。因此选用上述用量的IL2能够有效促进DC细胞的生长，利于获得更多的DC细胞。此外，每2~4天更换新的培养基并添加30~80unit/mL的IL2，也具有延缓T细胞生长的作用。

优选的，步骤S1中自扁桃体中分离免疫细胞时，包括将扁桃体切块后在外力作用下经175~225目筛网后得到分散细胞，将所述分散细胞用Ficoll-Hypaque液进行离心的步骤。

优选的，进行Ficoll-Hypaque离心时，包括以下步骤：

I、将分散细胞轻置于Ficoll-Hypaque液面上并在800~1000g的条件下离心；

II、收集白膜层细胞后，补充生理盐水后在800~1000g的条件下离心；弃上清后再次补充生理盐水后在800~1000g的条件下离心即可。

优选的，步骤I中离心时，升速为3，降速为0；步骤II中离心时，升速为9，降速为6。

优选的，步骤S2制备得到的树突状细胞中80%~95%的为CD141+亚型。

通过采用上述技术方案，CD141+细胞亚型被报道有更强的交叉递呈可溶性抗原的作用，这种亚型的细胞在血液种非常稀少但被认为是激活CD8+T细胞发挥抗肿瘤抗病毒作用的最重要的一类DC细胞。

第二方面，本申请提供一种扁桃体来源的T_γδ细胞，采用如下的技术方案：

一种扁桃体来源的T_γδ细胞，所述T_γδ细胞采用上述的制备方法制备得到。

优选的，所述T_γδ细胞表达的标记物包括包括通常出现在抗原呈递细胞内的标记物如CD80和CD86、NK细胞活化受体NKG2D和细胞毒性T细胞标记物TRAIL。

第三方面，本申请提供一种扁桃体来源的T_γδ细胞在制备抗肿瘤或抗病毒的细胞产品中的应用，采用如下的技术方案：

一种扁桃体来源的T_γδ细胞在制备抗肿瘤或抗病毒的细胞产品中的应用，所述T_γδ细胞采用上述的制备方法制备得到。

综上所述，本申请具有以下有益效果：

1、扁桃体内含有大量的免疫细胞，本申请充分利用扁桃体，以扁桃体来源的免疫细胞制备树突状细胞（即DC细胞），本申请制备得到的免疫细胞来源于髓系（CD11c+）并显示其成熟（CD83+）和活化表型（HLA-DR+/CCR7+/CD80+/CD86+），此外，大多数细胞呈现CD141+亚型；再将该DC细胞和免疫细胞共培养，最终制备得到T_γδ细胞在体外培养3周后，仍然具有优异的抗肿瘤作用。

2、本申请在将免疫细胞和STLV4病毒的Tax蛋白接触后进行细胞培养时，优选采用30~80unit/mL的IL2促进DC细胞的增殖，以获得更多的DC细胞。

3、将本申请的T_γδ细胞用于抗肿瘤或抗病毒时，具有优异的抗肿瘤或者病毒的效果。

附图说明

图1是本申请一实施例的DC细胞的流式细胞分析结果；

图2是本申请一实施例DC细胞介导扁桃体内T_γδ细胞的流式细胞分析结果；

图3是实施例1的T_γδ细胞作用于宫颈癌细胞HeLa的结果；其中，图3-1是显微镜观察结果图，图3-2是在T_γδ细胞作用下宫颈癌细胞HeLa的细胞生存率。

图4是实施例1的T_γδ细胞作用于黑色素瘤细胞A375的结果；其中，图4-1是显微镜观察结果图，图4-2是在T_γδ细胞作用下黑色素瘤细胞A375的细胞生存率。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本申请作进一步详细说明。

慢病毒制备例

慢病毒质粒载体构建及慢病毒制备方法，包括以下步骤：

（1）编码STLV4病毒的Tax蛋白的基因片段插入慢病毒载体，并将重组质粒载体转化到E.coli，经测序正确后并摇菌后，提取重组质粒载体后备用。

（2）将获得的STLV4病毒的慢病毒质粒载体与混合包装质粒（混合包装质粒包括VSV-G、Gag-Pol和Rev的表达质粒）混合，并添加转染试剂；转染试剂可以是，磷酸钙转染试剂、脂质体转染试剂或高分子聚合物转染试剂。随后将STLV4病毒的慢病毒质粒载体与混合包装质粒共转染至宿主细胞共培养，宿主细胞可以是293细胞、293T细胞或293FT细胞。

（3）浓缩

浓缩的方法可以采用下述的方法1或方法2，进一步可以为：

方法1：收集病毒上清液，具体可以在23000~28000rpm的转速下在0~4℃条件下离心1.5~2.5h。

方法2：于共培养后获得的病毒上清液中加入PEG8000及适当浓度的NaCl溶液，在常温或0~4℃条件下，在1400~1800g或2500~3500rpm的转速下离心30~60min。

（4）随后弃上清，将获得的病毒沉淀用RPMI1640培养基重悬后冻存即可。

在一种实施方式中，慢病毒质粒载体构建及慢病毒制备方法，包括以下步骤：

（1）编码STLV4病毒的Tax蛋白的基因序列如SEQ ID NO. 1所示，委托金唯智公司进行密码子优化后合成，然后插入慢病毒载体EcoRI-BamHI位点，并将重组质粒载体转化到E.coli，并经测序正确后，摇菌后，以质粒提取试剂盒提取质粒后备用。

（2）将获得的STLV4病毒的慢病毒质粒载体与混合包装质粒（购自Invitrogen，混合包装质粒包括VSV-G、Gag-Pol和Rev的表达质粒）混合，并添加polyfect试剂（购自Qiagen）后，共转染293细胞（购自ATCC）。

（3）浓缩：收集病毒上清液，用PEG8000沉淀过夜，次日在1600g转速下、4℃离心1h。

（4）弃上清，得到的病毒沉淀（即STLV4 Tax慢病毒）用RPMI1640培养基重悬后冻存于-80℃冰箱。

实施例

实施例1

一种扁桃体来源的T_γδ细胞的制备方法，包括以下步骤：

S1、自扁桃体中分离免疫细胞

自扁桃体分离免疫细胞的方法，包括以下步骤：

S11、样品运输及预处理：从接受常规扁桃体切除术的个体中提取新鲜扁桃体，将新鲜扁桃体放入含有青链霉素的RPMI1640培养基内，在冷链2~8℃条件下运输至实验室，并在1~3h内完成提取工作。

在生物安全柜内，使用无菌镊子，将新鲜扁桃体的标本放在无菌的10cm的第一细胞培养皿上，并用2mL含抗生素的HANK’S缓冲液保持组织湿润；随后用剪刀将新鲜扁桃体的标本切成3~5mm的组织小块。

S12、制备免疫细胞悬浮液：

S121、将灭菌后的不锈钢筛网（200目）放入无菌的10cm的第二细胞培养皿内；

S122、在该无菌的第二细胞培养皿内加入2mL HANK’S缓冲液；并用无菌镊子将一个组织小块放入不锈钢筛网上；使用5mL塑料注射器的活塞部分挤压组织小块，将组织小块中存在的淋巴细胞推过筛网；随后用HANK’S缓冲液冲洗剩余的组织两到三次，直到将组织上的分离细胞冲洗干净即可，最终在第二细胞培养皿得到细胞悬浮液；用移液管将所有细胞悬浮液从第二细胞培养皿中转移至50mL的离心管中。

S123、重复步骤S122以将第一细胞培养皿内剩余的组织小块内的免疫细胞洗脱出来。

S13、离心

将洗脱后的细胞悬浮液全部转移至无菌离心管内，反复轻柔吹打细胞以分散细胞团块。

随后，在干净的50mL离心管内加入15mlFicoll-Hypaque 溶液，将细胞悬液轻轻地加到Ficoll-Hypaque液面上后，在1000g、室温条件下离心20min，升速为3、降速为0；随后收集白膜层细胞，并用生理盐水补足至40mL，然后在1000g、室温条件下离心10min，升速为9、降速为6；弃上清，用40mL生理盐水重悬细胞，在1000g、室温条件下离心10min。

用10mL RPMI1640培养基重悬细胞，计数，取4×10⁶个免疫细胞用于树突状细胞（DC细胞）的制备；剩余的免疫细胞悬浮液经离心后收集免疫细胞，冻存备用。

S2、制备得到树突状细胞（即DC细胞）

取免疫细胞和STLV4病毒的Tax蛋白接触，细胞培养后制备得到树突状细胞。该制备方法包括以下步骤：

S21、转移4×10⁶个新鲜的在S1中制备得到的免疫细胞至6孔板的一个孔内，培养基为10wt%FBS+RPMI1640，并加入5μg/mL PHA+100unit/mL IL2刺激并培养细胞；刺激3天后，将孔内悬浮的单个细胞连同培养基吸出并丢弃，保留成团的细胞。

S22、将成团的细胞转移至无菌的离心管内，加入RPMI1640培养基重悬细胞并计数，以2×10⁶个细胞的量将细胞接种于新的6孔板内，向孔内加入MOI为20的STLV4 Tax慢病毒和10µg/mL葡聚糖，共培养6h；收集细胞，离心，弃上清。其中，STLV4 Tax慢病毒由慢病毒制备例1制备得到。

S23、用含10wt%血清的RPMI1640培养基重悬细胞，加入50unit/mL IL2继续培养细胞；并且每3天更换新鲜培养基和50unit/mL IL2继续培养。

S24、在慢病毒转导后15天，细胞计数，并在1500rpm条件下离心5min，弃上清。随后用5mL PBS缓冲液洗涤一次，在1500rpm条件下离心5min，弃上清；加入500μL RPMI1640培养基以及对应细胞量的抗CD3的磁珠，在室温孵育15min。

S25、向S24中的得到的细胞培养液内补加5mL PBS缓冲液，上下颠倒混匀后置于磁力架上静置2min，转移在磁力作用下未连接到磁珠上的细胞，放入6孔板内，在含有50unit/mL IL2和RPMI1640培养基中继续培养至获得足够的贴壁生长的细胞类群。

S26、于培养获得的细胞中加入胰酶消化细胞，收集消化后的细胞用于流式细胞术分析，检测CD83、CD80、CD86、CD70、CCR7、4-1BBL和HLA-DR等分子的表达，证实贴壁细胞的表型。具体检测结果如图1所示：在获得的4份tDC中，其中三个tDC细胞在培养基中以相对较慢的中等生长速率生长，而其中一个tDC细胞以中等较快的生长速率生长。tDC细胞的典型免疫表型如下所示，表明这些细胞来源于髓系（CD11c+）并显示其成熟（CD83+）和活化表型（HLA-DR+/CCR7+/CD80+/CD86+）。此外，80%以上的DC细胞显示CD141阳性，据报道此类DC细胞有较强的交叉递呈可溶性抗原的潜力，是人体内介导CD8+T细胞抗肿瘤及抗病毒作用的最重要的一类DC细胞。

S3、取新的步骤S1制备得到的免疫细胞和所述树突状细胞混合培养，制备得到存在于细胞培养物内的T_γδ细胞，该制备过程包括以下步骤：

S31、将S2制备得到的树突状细胞继续扩增，用于冻存保种及扩增T_γδ细胞；

将S1冻存的免疫细胞复苏后，计数，按照2×10⁶/mL接种于6孔板内，加入培养基5wt%人血清+RPMI1640；

S32、按照树突状细胞：免疫细胞=1:300的数量比例向免疫细胞内加入树突状细胞，混匀后置于培养箱内培养过夜；次日，向孔内加入800unit/mL IL2，混匀培养；并根据细胞生长速度补充含人血清的培养基以及IL2；在第18~21天时收获细胞，经流式分析各细胞占比。

具体结果见图2：结果发现制备得到的树突状细胞内95%以上的细胞是T细胞，其中约80%是T_γδ细胞（即TCRγδ+）。这些T_γδ细胞表达抗原呈递细胞中典型的标记物，如CD80、CD86等共刺激分子；还表达NK细胞活化受体NKG2D；以及细胞毒性T细胞标记物TRAIL。

实施例2

本实施例和实施例1的区别在于，步骤S23的操作为：用含10wt%血清的RPMI1640培养基重悬细胞，加入200unit/mL IL2继续培养细胞并在前2周每天换液。其它同实施例1。

实验结果为：与实施例1相比，培养基更容易变黄，提示细胞生长旺盛。但在2周后细胞增速显著降低，出现大量死亡细胞，细胞整体状态较实施例1差，导致最终制备此类DC细胞的成功率低于实施例1。

实施例3

本实施例和实施例1的区别在于，步骤S22中，以等重量的聚凝胺替换葡聚糖；具体为：

S22、将成团的细胞转移至无菌的离心管内，加入RPMI1640培养基重悬细胞并计数，以2×10⁶个细胞的量将细胞接种于新的6孔板内，向孔内加入MOI为20的STLV4 Tax慢病毒和10µg/mL聚凝胺，共培养6h；收集细胞，离心，弃上清。其中，STLV4 Tax慢病毒由慢病毒制备例1制备得到。

其它同实施例1。

实验结果为：在慢病毒转染后，与实施例1相比，细胞状态并无明显差异。但在制备可扩增树突状细胞的整体成功率方面，实施例1的方法较实施例3高出约10%。

应用例

应用例1

将本申请实施例1制备得到的T_γδ细胞用于抑制宫颈癌细胞HeLa时，包括以下步骤：

（1）将宫颈癌细胞HeLa，按1~2×10⁵个/孔接种于6孔板内，加入含10%FBS的RPMI1640培养基，静置培养3h；

（2）将实施例1制备得到的T_γδ细胞（即效应细胞）按照效靶比为0:1、2.5:1、5:1、10:1的比例加入到靶细胞孔内，继续培养16h；

（3）吸弃培养基上清，然后用2mL磷酸盐缓冲液(即PBS缓冲液)洗涤孔内细胞一次后，弃PBS缓冲液；

（4）重复步骤（3）；

（5）取样并通过显微镜观察杀伤活性并拍照，显微镜观察结果图见图3-1。裂解细胞后检测活细胞内luciferase酶活性以及计算细胞存活率，细胞存活率的结果图见图3-2。图3说明，效靶比为10:1时，实施例1制备得到的T_γδ细胞对宫颈癌细胞HeLa具有优异的杀伤作用，其细胞存活率低于5%。

应用例2

和应用例1不同的是，将本申请制备得到的T_γδ细胞用于杀伤黑色素瘤细胞A375，其他同应用例1。

其显微镜观察结果图见图4-1。裂解细胞后检测活细胞内luciferase酶活性以及计算细胞存活率，细胞存活率的结果图见图4-2。图4说明，效靶比为10:1时，实施例1制备得到的T_γδ细胞对黑色素瘤细胞A375具有优异的杀伤作用，其细胞存活率低于5%。

本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。

序列表

<110> 北京翊博普惠生物科技发展有限公司

<120> 一种扁桃体来源的Tγδ细胞及其制备方法和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1035

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

atggcacatt tccccggttt cggacagagt ctcctgtacg gatatcctgt ttatgtgttc 60

ggcgactgtg tacaggccga ttggtgtcca atcagtgggg gactttgtag tcccagactg 120

caccggcatg cactcctcgc gacatgcccc gaacaccaga tcacgtggga ccctatcgac 180

ggtcgggtgg ttgggtctcc actgcagtat ttgataccca ggttgccttc atttccgaca 240

cagaggacaa gcaagaccct caaagtgctt acccctccaa ctactccagt cacgcctaag 300

gtgcctccaa gctttttcca atctgttcgc cgacatagcc cgtaccgcaa tggctgcctc 360

gagactacgt tgggggagca gctgccatct ttggccttcc cggaacccgg cctcaggccc 420

caaaatgttt acaccatttg gggtaagaca atcgtctgcc tgtacatata tcagctgagt 480

ccccctatga catggccact gatcccacac gtaatcttct gcaaccccag acaactcggg 540

gcattcctct ccaacgtgcc acctaagagg ctggaagagc tcctttataa actctacctg 600

cacacaggtg ccattattat cctccccgaa gacgcactgc cgacgacttt gttccaacct 660

gtgcgagccc catgcgtcca gaccacatgg aacacaggtc tgctccccta ccagcccaac 720

ctgacaaccc caggcctcat ttggacattt aacgatggct cccccatgat atccggtcct 780

tgtcctaagg caggtcagcc cagcctggtt gtgcagagct ccctcctgat cttcgagaga 840

ttccagacta aagcatatca tccatcatac ctgctctccc accaactcat ccagtattca 900

agtttccatc acctctatct gctctttgac gaatacacca ccattccctt tagtctcctc 960

ttcaaggaaa aagagggaga cgacagggat aatgatccac tgccaggagc aacagcgagc 1020

ccccagggcc aaaac 1035

<210> 2

<211> 345

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 2

Met Ala His Phe Pro Gly Phe Gly Gln Ser Leu Leu Tyr Gly Tyr Pro

1 5 10 15

Val Tyr Val Phe Gly Asp Cys Val Gln Ala Asp Trp Cys Pro Ile Ser

20 25 30

Gly Gly Leu Cys Ser Pro Arg Leu His Arg His Ala Leu Leu Ala Thr

35 40 45

Cys Pro Glu His Gln Ile Thr Trp Asp Pro Ile Asp Gly Arg Val Val

50 55 60

Gly Ser Pro Leu Gln Tyr Leu Ile Pro Arg Leu Pro Ser Phe Pro Thr

65 70 75 80

Gln Arg Thr Ser Lys Thr Leu Lys Val Leu Thr Pro Pro Thr Thr Pro

85 90 95

Val Thr Pro Lys Val Pro Pro Ser Phe Phe Gln Ser Val Arg Arg His

100 105 110

Ser Pro Tyr Arg Asn Gly Cys Leu Glu Thr Thr Leu Gly Glu Gln Leu

115 120 125

Pro Ser Leu Ala Phe Pro Glu Pro Gly Leu Arg Pro Gln Asn Val Tyr

130 135 140

Thr Ile Trp Gly Lys Thr Ile Val Cys Leu Tyr Ile Tyr Gln Leu Ser

145 150 155 160

Pro Pro Met Thr Trp Pro Leu Ile Pro His Val Ile Phe Cys Asn Pro

165 170 175

Arg Gln Leu Gly Ala Phe Leu Ser Asn Val Pro Pro Lys Arg Leu Glu

180 185 190

Glu Leu Leu Tyr Lys Leu Tyr Leu His Thr Gly Ala Ile Ile Ile Leu

195 200 205

Pro Glu Asp Ala Leu Pro Thr Thr Leu Phe Gln Pro Val Arg Ala Pro

210 215 220

Cys Val Gln Thr Thr Trp Asn Thr Gly Leu Leu Pro Tyr Gln Pro Asn

225 230 235 240

Leu Thr Thr Pro Gly Leu Ile Trp Thr Phe Asn Asp Gly Ser Pro Met

245 250 255

Ile Ser Gly Pro Cys Pro Lys Ala Gly Gln Pro Ser Leu Val Val Gln

260 265 270

Ser Ser Leu Leu Ile Phe Glu Arg Phe Gln Thr Lys Ala Tyr His Pro

275 280 285

Ser Tyr Leu Leu Ser His Gln Leu Ile Gln Tyr Ser Ser Phe His His

290 295 300

Leu Tyr Leu Leu Phe Asp Glu Tyr Thr Thr Ile Pro Phe Ser Leu Leu

305 310 315 320

Phe Lys Glu Lys Glu Gly Asp Asp Arg Asp Asn Asp Pro Leu Pro Gly

325 330 335

Ala Thr Ala Ser Pro Gln Gly Gln Asn

340 345

Claims

1.一种扁桃体来源的T_γδ细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、自扁桃体中分离免疫细胞；

S3、取新的步骤S1制备得到的免疫细胞和所述树突状细胞混合培养，制备得到存在于细胞培养物内的T_γδ细胞；

步骤S2中，在将STLV4病毒的Tax蛋白和免疫细胞接触时，还添加有5~15µg/mL的葡聚糖；

步骤S2制备得到的树突状细胞中80%~95%的为CD141+亚型。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，编码所述Tax蛋白的基因序列如SEQID NO. 1所示，所述Tax蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中，在进行细胞培养时，还添加有30~80unit/mL的IL2，并且每2~4天更换新的培养基并添加30~80unit/mL的IL2。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中自扁桃体中分离免疫细胞时，包括将扁桃体切块后在外力作用下经175~225目筛网后得到分散细胞，将所述分散细胞用Ficoll-Hypaque液进行离心的步骤。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，进行Ficoll-Hypaque离心时，包括以下步骤：

6.一种扁桃体来源的T_γδ细胞，其特征在于，所述T_γδ细胞采用权利要求1~5任一所述的制备方法制备得到。

7.根据权利要求6所述的T_γδ细胞，其特征在于，所述T_γδ细胞表达的标记物包括通常出现在抗原呈递细胞内的标记物如CD80和CD86、NK细胞活化受体NKG2D和细胞毒性T细胞标记物TRAIL。

8.一种扁桃体来源的T_γδ细胞在制备抗肿瘤或抗病毒的细胞产品中的应用，其特征在于，所述T_γδ细胞采用权利要求1~5任一所述的制备方法制备得到。