CN113234676A - 一种促进鸭t细胞增殖的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种促进鸭T细胞增殖的方法及其应用，其中促进鸭T细胞增殖的方法包含以下步骤：H5N1HPAIV体内接种鸭后由外周血分离得到鸭记忆性PBMC；将H5N1HPAIV体外感染鸭记忆性PBMC与未感染的记忆性PBMC混合培养。本发明利用H5N1HPAIV刺激CFSE标记的鸭记忆性PBMC，从T细胞形态、数量和CFSE标记变化三个方面检测T细胞的增殖，同时利用qPCR检测T细胞增殖后细胞因子表达变化情况。建立了一种促进鸭T细胞增殖的制备方法，为研究鸭T细胞对H5N1HPAIV免疫应答机制提供材料。
Description
技术领域
本发明属于医药生物技术领域，具体涉及一种促进鸭T细胞增殖的方法及其应用。
背景技术
甲型流感病毒属于正粘病毒科流感病毒属，病毒的核酸结构为分节段的单股负链RNA，主要通过呼吸道和粪口途径传播，在流感爆发期，H5N1亚型高致病性禽流感病毒(H5N1HPAIV)可通过水禽接触到人或者其他的哺乳动物(Tian et al.,2015)，H5N1 HPAIV自从1997年被首次发现以来，人感染后死亡的病例已高达50％以上，在跨种传播的同时给养殖业带来严重的经济损失，对人和动物的健康造成极大的威胁(Evseev et al.,2019；EntersFor Disease C,1997)。目前对H5N1 HPAIV研究主要集中于天然免疫，而在适应性免疫方面研究较少，研究鸭记忆性T细胞功能对流感疫苗评估和新型药物的制备必不可少。目前T细胞研究主要集中于哺乳动物，而没有报道鸭T细胞增殖方法。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种鸭T细胞的制备方法。
一种鸭T细胞的制备方法，包含以下步骤：
S1：H5N1 HPAIV接种麻鸭后由外周血分离得到鸭记忆性PBMC；
S2：H5N1 HPAIV体外感染步骤S1中的鸭记忆性PBMC，与未感染的记忆性PBMC混合培养。
其中感染鸭记忆性PBMC作为APC(抗原递呈细胞)递呈病毒抗原多肽，未感染的记忆性PBMC作为受体细胞接受刺激产生应答。
在本发明的一些实施方式中，所述鸭记忆性PBMC为H5N1 HPAIV体内接种麻鸭后25～30天由外周血分离得到。
在本发明的一些优选实施方式中，所述鸭记忆性PBMC为H5N1 HPAIV感染麻鸭后28天由外周血分离得到。
在本发明的一些实施方式中，所述H5N1 HPAIV接种麻鸭具体为采用点眼滴鼻的方法，每只鸭接种106EID50/200μL。
在本发明的一些实施方式中，步骤S2中以MOI＝2～5感染细胞。
在本发明的一些优选实施方式中，步骤S2中以MOI＝5感染细胞。
在本发明的一些实施方式中，步骤S2中于感染6～12h后收集细胞。
在本发明的一些优选实施方式中，步骤S2中于感染6h后收集细胞。
本发明还提供一种鸭T细胞，由上述方法制备。
本发明还提供上述鸭T细胞在制备疫苗或药物中的应用。
本发明的有益效果：本发明建立了一种鸭T细胞的制备方法，利用H5N1 HPAIV刺激CFSE标记的鸭记忆性PBMC(外周血单个核细胞)，从T细胞形态、数量和CFSE标记变化三个方面检测T细胞的增殖，确立了最佳接种时间点与最佳MOI，同时利用qPCR检测T细胞增殖后细胞因子表达变化情况。为研究鸭T细胞对H5N1 HPAIV免疫应答机制提供材料。
附图说明
图1为H5N1 HPAIV感染后不同时间细胞活率。
图2为流式分析圈门NP-FITC。
图3为流式细胞仪分析H5N1 HPAIV感染不同时间NP阳性率。
图4为感染后不同时间NP阳性率。
图5为H5N1 HPAIV以不同MOI接种麻鸭PBMC后细胞活率。
图6为流式分析圈门NP FITC-A。
图7为流式细胞仪检测H5N1 HPAIV以不同MOI感染PBMC后NP阳性率。
图8为H5N1 HPAIV以不同MOI接种麻鸭PBMC NP阳性率。
图9为NP基因PCR扩增结果。
图10为NP基因测序后比对结果。
图11为流式检测H5N1 HPAIV刺激CFSE标记鸭记忆性PBMC增殖实验。其中DuckCFSE PBMC：CFSE标记后的样本；7D H5N1 CFSE PBMC：H5N1接种CFSE标记T细胞7天的样本；8D H5N1 CFSE PBMC：H5N1接种CFSE标记T细胞8天的样本；14D H5N1 CFSE PBMC：H5N1接种CFSE标记T细胞14天的样本。
图12为流式检测ConA刺激CFSE标记鸭记忆性PBMC增殖实验。其中Duck CFSEPBMC：CFSE标记后的样本；3D ConA CFSE PBMC：ConA CFSE标记T细胞3天的样本；4D ConACFSE PBMC：ConA CFSE标记T细胞4天的样本；5D ConA CFSE PBMC：ConA CFSE标记T细胞5天的样本。
图13为H5N1 HPAIV刺激记忆性PBMC后增殖T细胞的细胞形态。
图14为用ConA作为阳性对照刺激T细胞增殖后T细胞的细胞形态。
图15为鸭T细胞增殖数量变化。
图16为流式分析圈门CD4。
图17为流式分析圈门CD8α。
图18为流式细胞仪检测H5N1 HPAIV刺激后CD4+T细胞比例变化。
图19为流式细胞仪检测H5N1 HPAIV刺激后CD8α+T细胞比例变化。
图20为流式细胞仪检测H5N1 HPAIV刺激后T细胞比例变化。
图21为H5N1 HPAIV刺激后T细胞绝对数量变化。
图22为qPCR检测增殖鸭T细胞细胞因子变化情况。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
本试验所用的鸭记忆性PBMC是由接种H5N1 HPAIV 4W(4周龄)后的鸭外周血分离得到；其中采用点眼滴鼻的方法，每只鸭接种106EID50/200μL。H5N1 HPAIV是A/Duck/Guangdong/383/2008(H5N1)。
RPMI-1640培养基、FBS澳洲胎牛血清、2-巯基乙醇(2-ME)、L-谷氨酰胺(100X)、二巯基乙醇(1000X)、HEPES(100X)购自美国GIBCO公司；二甲基亚砜(DMSO)、皂苷(saponin)、布雷菲德菌素A(BFA)、刀豆素蛋白(ConA)购自美国Sigma公司。
试验中的流式抗体Anti-chicken NP antibody、Anti-Duck CD8 antibody和CFSE-labeling kit购自abcam公司，Anti-Duck CD4 antibody购自SouthernBiotech公司，Goat Anti-Mouse IgG-FITC购自abbkine生物公司。
实施例1 H5N1 HPAIV体外感染麻鸭PBMC模型建立
1)H5N1 HPAIV感染麻鸭PBMC最佳时间点筛选
从液氮中选取三只不同编号麻鸭记忆性PBMC，放入37℃恒温水浴锅中快速复苏麻鸭PBMC，用0.08％台盼蓝计数，每个样品分别取106个细胞至15mL反应管中，400g离心5min，用RPMI-1640培养基重悬细胞。将H5N1 HPAIV从-80℃冰箱中取出，放置于4℃冰箱中融化，以MOI＝5接种细胞，实验时设置未接毒的阴性对照组，放置于37℃接毒细胞培养箱中培养，每隔15min取出轻轻震荡，避免细胞沉淀。1h后用PBS清洗两遍，加入2mL含10％FBS的RPMI-1640培养基，放置于37℃接毒细胞培养箱中继续孵育。分别于接毒后6h、12h、24h和36h收集细胞，用0.08％台盼蓝统计细胞数量和活率，并且进行NP染色。
细胞计数结果见图1，从图1可以看出，从12h开始，相比对照组，感染组细胞活率降低，差异极显著(P＜0.01)。而6h时的感染组和对照组细胞活率没有差异，从细胞活率角度考虑，在确保实验结果可行的情况下，6h时的细胞状态是适合后续实验的。
流式细胞仪检测结果见图2和图3，其中图2为流式分析圈门NP-FITC。图3为流式细胞仪分析H5N1 HPAIV感染不同时间NP效率。可以看出，H5N1 HPAIV感染6h后NP阳性率达30.7％，12h后阳性率为25.1％，24h后NP阳性率46.6％，感染后NP阳性率最高的时间点是24h。统计学分析结果见图4，从图4可以看出，6h和12h的NP阳性率差异不显著(P＞0.05)，6h和24h的NP阳性率差异显著(P＜0.05)，结合感染后细胞活率分析，H5N1 HPAIV感染鸭PBMC的最佳时间是6h。
2)H5N1 HPAIV体外感染麻鸭PBMC最佳MOI筛选
复苏麻鸭PBMC后，用0.08％台盼蓝计数，H5N1 HPAIV分别以MOI＝2、5和10感染106个细胞，细胞放置于37℃接毒细胞培养箱中孵育1h。向反应管中加入2mL PBS，400g离心5min，清洗细胞两遍，弃掉PBS，加入2mL含10％FBS的RPMI-1640培养基，放置于37℃接毒细胞培养箱中孵育。于接毒后6h收集细胞，用0.08％台盼蓝统计细胞数量和活率，然后进行NP蛋白流式检测。
其中，细胞计数结果见图5，从图5可以看出，MOI＝2与MOI＝5相比，细胞活率差异不显著(P＞0.05)，MOI＝2或MOI＝5感染后的细胞活率要高于MOI＝10和MOI＝20感染后的细胞活率，差异显著(P＜0.05)。从细胞活率角度考虑，病毒接种最佳MOI＝2或5。但后续需要结合细胞感染效率综合考虑，选取感染后阳性率高且细胞活率较高的接毒剂量。
流式实验结果如图6和7所示，其中图6为流式分析圈门NP FITC-A。图7为流式细胞仪检测H5N1 HPAIV以不同MOI感染PBMC后NP阳性率。可以看出，同未接毒的阴对照相比，接毒实验组的NP阳性率分别为76.4％、82.5％、83.1％和89.6％。统计学分析显示见图8，可以看出不同MOI之间NP阳性率无统计学差异。因此，H5N1 HPAIV接种麻鸭PBMC最佳MOI＝2或5，病毒接种NP阳性率最高，细胞活率满足实验需要。
3)PCR检测H5N1 HPAIV以不同MOI接种麻鸭PBMC后NP基因
实验中选取106个PBMC，以MOI＝2、5、10和20分别接种H5N1 HPAIV，感染后6h收集细胞，取105个PBMC提取RNA，反转录后用NP基因引物进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳结果见图9，其中条带1-3为H5N1 HPAIV感染组样品，条带4为未感染病毒的阴对照样品，条带5为PCR中以水为模板的阴对照，条带6为PCR中的阳对照。图9显示，条带大小约1500bp，与目的基因大小一致。紫外灯下切胶进行胶回收，送至生工生物工程公司进行测序，鉴定目的基因。图10为NP基因测序后比对结果。
实施例2 H5N1 HPAIV刺激鸭PBMC中T细胞增殖
1)CFSE检测H5N1 HPAIV刺激后外周血淋巴细胞增殖
选取三只不同编号麻鸭的记忆性PBMC，复苏细胞，用台盼蓝计数，吸取107细胞至15mL离心管中。400g离心后用37℃预热过的PBS重悬细胞，同时用预热PBS稀释CFSE，5mLPBS中加入1μL CFSE原液，充分震荡混匀。用移液枪快速将稀释后的CFSE溶液移至细胞悬液中，吹打混匀。37℃水浴10min，400g离心5min，弃掉上清，用PBS清洗两遍，台盼蓝计算细胞数量，用T细胞培养基重悬细胞沉淀，使其浓度为107个/mL，取5х106个细胞，用H5N1 HPAIV以MOI＝2接种细胞。剩余的标记后细胞悬液放置于48孔细胞板中培养中，每孔2х106个细胞，补加含20U/mL IL-2的T细胞培养基至1mL。每天观察细胞，关注细胞集落的形成以及培养基颜色的变化。
CFSE标记鸭PBMC，取106以MOI＝5接种H5N1 HPAIV 6h，与5х106个标记后的未接种病毒的记忆性PBMC共培养，每天观察细胞形态和培养基颜色。共培养6d细胞成聚落生长，培养基颜色呈浅黄色。培养至第七天对细胞进行分板培养，继续观察细胞形态，每隔两天对细胞进行半换液处理。
流式结果如图11-12所示，其中图11为流式检测H5N1 HPAIV刺激CFSE标记鸭PBMC增殖实验。图12为流式检测ConA刺激CFSE标记鸭PBMC增殖实验。从图11可以看出，与初始标记细胞相比，培养从第七天开始细胞有明显的增殖峰；从图12可以看出，用ConA作为实验阳对照，与初始标记细胞相比，从培养第三天开始，细胞有明显的增殖峰。
2)H5N1 HPAIV刺激鸭T细胞增殖形态变化
H5N1 HPAIV刺激鸭记忆性PBMC增殖培养后不同时间，显微镜观察，结果见图13，可以看出与对照组未用病毒刺激的细胞相比，H5N1 HPAIV刺激组细胞培养基呈浅黄色，细胞变大变圆，且出现聚集现象；用ConA作为阳性对照刺激T细胞增殖，在培养第四天开始，细胞呈团状聚集生长，结果见图14，而对照组的细胞呈现单个散落生长，且随着培养时间的增加，死亡细胞数量增多。
3)H5N1 HPAIV刺激鸭T细胞增殖数量变化
H5N1 HPAIV刺激鸭记忆性PBMC增殖培养后不同时间后，显微镜观察细胞形态有明显变化时，取10μL混匀的细胞悬液，与0.08％的台盼蓝溶液混匀进行计数，统计H5N1 HPAIV刺激后在细胞绝对数量上的变化。统计结果见图15，结果显示，相比对照组，H5N1 HPAIV刺激组细胞在绝对数量上呈增长的趋势。
4)流式细胞仪检测T细胞比例变化
T细胞培养7d后，细胞计数取106个细胞用Anti-Duck CD8 antibody和Anti-DuckCD4 antibody进行流式染色，流式细胞仪检测CD4+T细胞和CD8α+T细胞变化情况。
实验中选取2х106个PBMC，以MOI＝5接种H5N1 HPAIV，39℃、5％CO2培养4h后与107个PBMC共培养，培养至14d后，取实验组和对照组细胞进行鸭CD4+T和CD8 α+T细胞染色，其中流式分析圈门CD4见图16，流式分析圈门CD8α见图17，其中流式细胞仪检测H5N1 HPAIV刺激后CD4+T细胞比例变化见图18，流式细胞仪检测H5N1 HPAIV刺激后CD8α+T细胞比例变化见图19。并将结果进行统计学分析，结果见图20和图21，其中图20为H5N1 HPAIV刺激后T细胞比例变化。图21为H5N1 HPAIV刺激后T细胞绝对数量变化。从图20可以看出，与对照组相比，H5N1 HPAIV刺激后CD4+T细胞和CD8α+T细胞比例呈现增加的趋势，且差异显著(P＜0.05)；从图21可以看出，H5N1 HPAIV刺激后CD4+T细胞和CD8α+T细胞的绝对数量相比对照组增加。
5)qPCR检测增殖T细胞内细胞因子表达
(1)细胞RNA的提取
按照Magen公司微量细胞RNA提取试剂盒说明书提取RNA。取含有106个细胞的悬液，400g离心5min后弃掉上清，轻轻涡旋震荡使细胞团块松散开来。加入350μL Bufffer RL裂解细胞，将裂解液吸取至装有2mL收集管的DNA过滤柱，1000g常温离心1min，留下过滤液，加入等体积的70％乙醇，用移液枪轻轻吹打5次混匀，将混合液转移至装有2mL收集管的RNA过滤柱，1000g常温离心1min，弃掉滤液，将过滤柱放回收集管上，加入600μL Bufffer RW1，10000g常温离心1min，弃掉滤液，加入600μL Bufffer RW2，10000g常温离心1min，重复上一步骤，12000rpm常温离心3min，将过滤柱放置于灭菌的1.5mL离心管中，向过滤柱中心加入15μL DEPC水处理的灭菌水，12000r常温离心1min，用分光光度计测定浓度，将提取的RNA放置于-80℃保存。
(2)反转录
按照表1在冰上配制反应体系：
表1反转录体系
| 试剂 | 用量 |
| 5×M-MLV-Mix | 4μL |
| RNA | 6μL |
| 灭菌水 | 10μL |
| 总计 | 20μL |
瞬离混合均匀，在PCR仪器中按照如下程序反应：37℃保温15min，85℃灭活5s，4℃保存。
(3)荧光定量PCR引物设计
利用Oligo引物设计软件设计合成荧光定量引物，如表2所示。
表2麻鸭基因荧光定量引物
(4)荧光定量PCR
用分光光度计测定RNA浓度，按照TaKaRa反转录试剂说明书(Cat：RR036A)对提取的RNA进行反转录。按照表2中的荧光定量引物，以GAPDH为内参，对结果进行统计和分析。具体反应体系如下表3所示：
表3荧光定量反应体系
| 试剂 | 用量 |
| 2*SYBR qPCR Master | 10μL |
| FP | 0.5μL |
| RP | 0.5μL |
| ddH<sub>2</sub>O | 7μL |
| cDNA | 10ng |
| 总计 | 20μL |
细胞毒性相关基因GranzymeA，IL-2，Granzyme K，TNF，IFN-r，Th2细胞因子IL-10以及干扰素基因IFN－α和IFN－β的表达变化见图22，可看出细胞毒性相关基因GranzymeA，IL-2，Granzyme K，TNF，IFN-r的表达显著性上调，Th2细胞因子IL-10以及干扰素基因IFN－α和IFN－β也显著上调，结合上述结果中CD4+T细胞和CD8α+T细胞比例和数量增加，说明H5N1HPAIV刺激引起了显著的T细胞免疫应答。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
SEQUENCE LISTING
<110> 华南农业大学
<120> 一种促进鸭T细胞增殖的方法及其应用
<130>
<160> 30
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
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<213> 人工序列
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<400> 30
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Claims (10)
1.一种促进鸭T细胞增殖的方法，包含以下步骤：
S1：H5N1 HPAIV接种鸭后由外周血分离得到鸭记忆性PBMC；
S2：H5N1 HPAIV体外感染步骤S1中鸭记忆性PBMC，与未感染的记忆性PBMC混合培养。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述鸭记忆性PBMC为H5N1 HPAIV接种鸭大于25天由外周血分离得到。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2中以MOI＝2～5感染细胞。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S2中以MOI＝5感染细胞。
5.根据权利要求1～4任一项所述的方法，其特征在于，步骤S2中于感染6～12h后收集细胞。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤S2中于感染6h后收集细胞。
7.一种鸭T细胞，其特征在于，由权利要求1～6任一项所述的方法制备。
8.权利要求7所述鸭T细胞在制备疫苗或药物中的应用。
9.权利要求7所述鸭T细胞在研究鸭T细胞对H5N1 HPAIV免疫应答机制的材料中的应用。
10.H5N1 HPAIV在促进鸭T细胞增殖中的应用，通过H5N1 HPAIV接种麻鸭后分离外周血得到鸭记忆性PBMC，将H5N1 HPAIV体外感染鸭记忆性PBMC与未感染的记忆性PBMC混合培养。
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