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CN118308304A - 一种临床级car-nk细胞药物注射液的制备方法与应用 - Google Patents

一种临床级car-nk细胞药物注射液的制备方法与应用 Download PDF

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CN118308304A
CN118308304A CN202410162242.4A CN202410162242A CN118308304A CN 118308304 A CN118308304 A CN 118308304A CN 202410162242 A CN202410162242 A CN 202410162242A CN 118308304 A CN118308304 A CN 118308304A
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car
cell
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王看看
钱浩
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Nanjing Enrui Kainuo Biotechnology Co ltd
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Nanjing Enrui Kainuo Biotechnology Co ltd
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Abstract

本发明属于生物工艺技术，公开了一种临床级CAR‑NK细胞药物注射液的制备方法与应用，包括以下步骤，从外周血单个核细胞中分选出NK细胞；使用滋养细胞激活NK细胞，再使用带有嵌合抗原受体基因的病毒载体感染激活后的NK细胞；然后使用NK细胞扩增培养基进行CAR‑NK细胞的扩增培养，获得大量的CAR‑NK细胞；收集CAR‑NK细胞，制备成CAR‑NK细胞药物注射液。本发明提供方法制备的CAR‑NK细胞，细胞数量多，可达1010以上，纯度高达98%以上，CAR阳性率高，可达85%以上，杀伤活性高，可供临床回输使用。

Description

一种临床级CAR-NK细胞药物注射液的制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物工艺技术，公开了CAR-NK细胞的制备技术，具体为一种临床级CAR-NK细胞的制备方法和应用。
背景技术
NK细胞又称自然杀伤细胞(natural killer cell，NK细胞)，是机体内重要的免疫细胞，NK细胞形态上属于大颗粒淋巴细胞，来源于骨髓，是除T细胞、B细胞之外的第三大类淋巴细胞，约占血液中所有免疫细胞（白细胞数量）的15%，属于天然免疫系统的核心细胞。NK细胞具有广谱的抗肿瘤作用，不需要肿瘤特异性识别，且不会被细胞表面的主要组织相容性复合体(MHC)抑制活性限制。NK细胞对肿瘤细胞具有较强杀伤力，通过NK表面激活型受体和抑制性受体识别肿瘤细胞，释放穿孔素和颗粒酶、表达各种肿瘤坏死因子诱导肿瘤细胞凋亡，同时通过抗体依赖的细胞毒作用杀伤肿瘤。鉴于NK细胞天然抗肿瘤的特性，NK细胞成为了研究人员开发新型免疫疗法的理想选择之一。目前，正在开发的NK细胞治疗产品主要有两类：一类是自体或是异体NK细胞治疗产品，另一类是基因工程化的CAR-NK产品。
CAR-NK细胞是指将NK细胞经过嵌合抗原受体（CAR）基因修饰，赋予NK细胞靶向识别肿瘤细胞的能力。CAR-NK细胞，由识别肿瘤特异抗原的细胞外信号结构域、跨膜区和细胞内结构域组成，它们可以建立新的激活途径，以增强靶细胞的溶解。CAR-NK细胞，不仅通过CAR特异性识别抗原表达肿瘤的能力，而且通过NK细胞受体自身来消除肿瘤。CAR-NK细胞疗法具有巨大的潜力，但临床应用面临着挑战，现有技术在制备过程中，CAR-NK细胞的扩增倍数仅在500倍左右，CAR阳性率甚至不到20%，使用现有技术在体外培养的足够数量和高纯度的CAR-NK细胞成为难点。另外，不同来源、不同供者之间的外周血或脐带血的差异性较大，以及CAR-NK收集时间的不同等因素均会导致不同批次细胞的扩增、CAR阳性率、杀伤功能存在着很大的差异。NK细胞在淋巴细胞中占比较低，NK细胞在外周血单个核细胞中仅占10-15%，在脐带血单个核细胞占比仅为5%左右，获得较多的NK细胞也是一大难点，CAR-NK细胞体外制备遇到的这些问题，对于稳定制备CAR-NK细胞的工艺是一种极大的挑战。
发明内容
CAR-NK细胞疗法具有巨大的潜力，但临床应用面临着挑战，现有技术在制备过程中，CAR-NK细胞的扩增倍数仅在500倍左右，CAR阳性率甚至不到20%，使用现有技术在体外培养的足够数量和高纯度的CAR-NK细胞成为难点。本发明公开了一种临床级CAR-NK细胞或者CAR-NK细胞药物注射液的制备方法与应用，解决了现有技术一直无法解决的CAR-NK细胞临床制备困难的问题。
本发明采用如下技术方案：
一种临床级CAR-NK细胞的制备方法，包括以下步骤：
（1）从单个核细胞中分选出NK细胞；
（2）使用滋养细胞和NK细胞扩增培养基激活NK细胞；
（3）将嵌合抗原受体基因整合至激活后的NK细胞中，然后扩增培养，得到CAR-NK细胞。
一种临床级CAR-NK细胞药物注射液的制备方法，包括以下步骤：
（1）从单个核细胞中分选出NK细胞；
（2）使用滋养细胞和NK细胞扩增培养基激活NK细胞；
（3）将嵌合抗原受体基因整合至激活后的NK细胞中，然后扩增培养，得到CAR-NK细胞；
（4）收集CAR-NK细胞，制备成CAR-NK细胞药物注射液。
本发明中，采用磁珠分选法从单个核细胞中分选出NK细胞；分选时，分选缓冲液为NK无血清培养基。其中，单个核细胞为常规来源。
本发明中，所述滋养细胞为辐照K562细胞，一般的，所述滋养细胞为辐照后的、过表达CD86、mbIL-21以及4-1BBL的K562细胞；滋养细胞与NK细胞的比例为1:1～4:1，激活的时间为3～6天。
本发明中，NK细胞扩增培养基为NK无血清培养基中添加血小板裂解物、血清替代物、IL-2、IL-15、IL-21的一种或多种添加剂；所述血小板裂解物的浓度为1～10%vv，血清替代物的浓度为1～10%vv，IL-2浓度为100～1000IU/ml，IL～15浓度为5～50ng/ml，IL～21的浓度为10～100ng/ml。此不是说明NK细胞扩增培养基含有血小板裂解物、血清替代物、IL-2、IL-15、IL-21中的所有，而是当NK细胞扩增培养基含有血小板裂解物、血清替代物、IL-2、IL-15、IL-21中的一些成份时，该成份的比例。
本发明中，在NK转导培养基、助转导试剂的存在下，使用病毒将嵌合抗原受体基因整合至激活后的NK细胞中，病毒的使用量MOI=0.1～5；NK转导培养基为NK无血清培养基中添加IL-2、IL-15，所述IL-2浓度为100～1000IU/ml，IL-15浓度为5～100ng/ml。
本发明中，病毒感染NK细胞16～24小时后将NK转导培养基更换为上述NK细胞扩增培养基。
本发明中，细胞培养条件为，于37℃、5%CO2环境中；可选择静置培养，也可以选择WAVE生物反应器培养。
本发明公开了上述制备方法制备的CAR-NK细胞或者CAR-NK细胞药物注射液，以及CAR-NK细胞或者CAR-NK细胞药物注射液在制备CAR-NK细胞药物中的应用。
本发明公开了上述制备方法在临床制备CAR-NK细胞药物中的应用。
本发明提供了一种临床级CAR-NK细胞的制备方法，首先从外周血或脐带血单个核细胞中分选出NK细胞，NK回收率80%以上；然后使用滋养细胞和NK细胞扩增培养基激活NK细胞；接着使用病毒载体将CAR分子（嵌合抗原受体基因）整合至激活后的NK细胞中，CAR阳性率达到90%以上；再使用NK细胞扩增培养基进行补液CAR-NK细胞的扩增培养，获得大量的CAR-NK细胞，CAR-NK细胞扩增倍数达到2000倍以上。
最后，收集CAR-NK细胞，根据常规方法制备成CAR-NK细胞药物注射液，进一步制备或者作为CAR-NK细胞药物。
本发明中，CAR-NK细胞的来源为常规技术，比如健康供者的外周血或脐带血；单个核细胞的分离方式为使用Ficoll 密度梯度离心法从血样中获得。
常规的，用于NK细胞分选的单个核细胞是经过筛选的，筛选检测指标包括安全性指标、NK细胞比例以及NK细胞表面受体的检测，所述安全性指标包括无菌检查，病毒五项检查、支原体检测等，NK细胞表面受体包括但不限于NKp44、NKp46、NKG2C、NKG2D、NKG2A、CD94、CD2、CD16等。
本发明中，NK细胞的分选方式为磁珠分选法，使用的试剂为NK isolation Kit(miltenyi，130-092-657)，分选缓冲液为NK细胞无血清培养基（依科赛，NE000-N012）。
本发明中，滋养细胞为辐照后的K562细胞，为过表达膜结合的IL-21、CD86、4-1BBL的单克隆细胞系，该K562细胞过表达外源基因方式为病毒载体整合方式或非病毒基因编辑方式，具体为常规技术。
本发明中，NK激活方式为NK细胞与K562共培养4～5天，NK细胞激活密度为0.5～3.0×106/mL，NK细胞与滋养细胞的比例为1:1～1:4。
本发明中，使用的病毒为逆转录病毒，病毒使用量MOI=0.1~5，病毒感染过程使用的培养基为NK转导培养基，所述NK转导培养基为NK无血清培养基（依科赛，NE000-N012）中添加IL-2，IL-15，所述IL-2浓度为100～1000IU/ml，IL-15浓度为5～100ng/ml。
本发明中，病毒感染NK过程中，使用助转导试剂，所述助转导试剂为Retronectin、Vectorfusion、鱼精蛋白中的一种或多种；其中，Retronectin的使用方式为预包被使用或悬浮添加于转导体系，使用浓度为1～30ul/ml，Vectorfusion使用方式为悬浮添加于转导体系，使用浓度为1～30ul/ml，鱼精蛋白方式为悬浮添加于转导体系，使用浓度为1～30ug/ml。病毒感染NK条件为离心转导，优选的，离心转导的条件为，室温，100～2000g离心，离心时间为15～60分钟。病毒感染NK细胞16～24小时后更换培养基为NK扩增培养基，并优选的，将细胞转移至透气性细胞培养袋中培养。
本方发明中NK扩增培养的方式为：激活阶段在培养瓶中激活，激活3～6天；扩增阶段在透气性细胞培养袋中静置培养或者非透气性细胞培养袋中摇摆培养。定期补加NK扩增培养基，调节细胞密度为0.5～1.5×106/ml，于37℃、5%CO2中扩增培养6～20天。
本发明中使用的NK扩增培养基为NK无血清扩增培养基（依科赛，NE000-N012），外加细胞添加物、细胞因子。细胞添加物包含SR（CTS Immune Cell SR）、血小板裂解物一种或两种，细胞因子包含IL-2，IL-15，IL-21的一种或多种，进一步地，所述SR的浓度为1～10%vv，血小板裂解的浓度为1～10%vv，IL-2的浓度为100～1000IU/ml，IL-15的浓度为5～50ng/ml，IL-21的浓度为10～100ng/ml。
本发明中，收集CAR-NK细胞的时间为Day14～Day20，以滋养细胞和NK细胞混合为Day0；收获时间取决于CAR-NK细胞的活率以及扩增情况。当细胞活率相比于Day14开始下降，细胞开始收获；当细胞扩增达到生产平台期时，细胞开始收获。
本发明中的CAR-NK细胞药物注射液经过冻存，或未经冻存。冻存，指的是CAR-NK细胞使用NK细胞冻存液，程序降温至-85℃以下后，于液氮保存，使用时，需37℃水浴解冻使用；未经冻存，指的是CAR-NK细胞使用生理盐水重悬，可直接回输使用；都为常规技术。
本发明制备CAR-NK细胞过程中的试剂均为GMP级别以及药用级别，可供临床使用。本发明提供的方法可用于CAR-NK细胞治疗药物开发以及临床及商业化规模生产。
附图说明
图1为CBMC经磁珠分选后NK细胞纯度。
图2为大规模生产脐带血来源CAR-NK细胞CAR阳性率。
图3为大规模生产脐带血来源CAR-NK细胞扩增曲线。
图4为大规模生产脐带血来源CAR-NK细胞扩增倍数。
图5为大规模生产外周血来源 CAR-NK细胞扩增曲线以及CAR-NK收获时间点。
图6为PBMC经磁珠分选后NK细胞纯度。
图7为大规模生产外周血来源 CAR-NK细胞纯度以及CAR阳性率。
图8为大规模生产外周血来源 CAR-NK细胞杀伤。
图9为大规模生产外周血来源 CAR-NK细胞扩增曲线。
图10为大规模生产外周血来源 CAR-NK细胞扩增倍数。
图11为CAR-NK 分别在WAVE和透气性培养袋中培养时扩增倍数。
图12为CAR-NK 分别在WAVE和透气性培养袋中培养时扩增倍数细胞杀伤。
图13为K562滋养细胞外源基因表达流式检测结果。
具体实施方式
CAR-NK细胞疗法具有巨大的潜力，但临床应用面临着挑战，现有技术在制备过程中，CAR-NK细胞的最大扩增倍数仅在500倍左右，CAR阳性率甚至不到20%，使用现有技术在体外培养的足够数量和高纯度的CAR-NK细胞成为难点。本发明公开了一种临床级CAR-NK细胞或者CAR-NK细胞药物注射液的制备方法与应用，解决了现有技术一直无法解决的CAR-NK细胞临床制备困难的问题。
本发明提供了一种临床级CAR-NK细胞的制备方法，首先从外周血或脐带血单个核细胞中分选出NK细胞，NK回收率80%以上；然后使用滋养细胞和NK细胞扩增培养基激活NK细胞；接着使用病毒载体将CAR分子（嵌合抗原受体基因）整合至激活后的NK细胞中，CAR阳性率达到90%以上；再使用NK细胞扩增培养基进行补液CAR-NK细胞的扩增培养，获得大量的CAR-NK细胞，CAR-NK细胞扩增倍数达到2000倍以上。
以下通过实验说明本发明的技术进步，具体试剂为常规产品，培养基中的添加物比例，如无特殊说明，都按体积计；具体实验操作以及性能测试为常规技术。本发明制备CAR-NK细胞过程中的试剂均为GMP级别以及药用级别，可供临床使用。本发明提供的方法可用于CAR-NK细胞治疗药物开发以及临床及商业化规模生产。Retronectin包被6孔板时，每6孔板使用30μL/mL。
CD19 CAR逆转录病毒载体构建为常规技术，本发明简述如下：
在北京擎科生物科技有限公司人工合成编码嵌合抗原受体（CAR）的核苷酸序列（DNA片段），核苷酸序列为SEQ ID NO: 1，氨基酸序列为SEQ ID NO: 2。使用重组酶将CD19CAR的DNA片段和pMSCV DNA片段同源重组构建含CD19 CAR的pMSCV逆转录病毒载体质粒，具体为常规技术，不影响本领域技术人员对本发明技术效果的理解。
SEQ ID NO: 1：
atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccggacatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattagtaaatatttaaattggtatcagcagaaaccagatggaactgttaaactcctgatctaccatacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggaacagattattctctcaccattagcaacctggagcaagaagatattgccacttacttttgccaacagggtaatacgcttccgtacacgttcggaggggggactaagttggaaataacaggctccacctctggatccggcaagcccggatctggcgagggatccaccaagggcgaggtgaaactgcaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccgtcacatgcactgtctcaggggtctcattacccgactatggtgtaagctggattcgccagcctccacgaaagggtctggagtggctgggagtaatatggggtagtgaaaccacatactataattcagctctcaaatccagactgaccatcatcaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccatttactactgtgccaaacattattactacggtggtagctatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagcggccgcagcgaagcccaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgcggaagcggagccacgaacttctctctgttaaagcaagcaggagatgttgaagaaaaccccgggcctatgtaccggatgcagctgctgtcttgcattgctctgagccttgccctggtgacaaactctggcatccacgtgttcatcctgggatgcttcagtgccggcctgcctaagactgaagccaattgggtgaacgtgatctccgacctgaagaagatcgaagatctgatccagtcaatgcacatcgacgccaccctgtataccgagagcgacgtgcacccatcttgcaaagtgaccgccatgaagtgttttctgctggagctgcaggtgatcagcctcgagtctggcgacgccagcatccatgacaccgtggagaacctgatcatcctggcaaataactccctgtcttccaacggcaatgtgacggaatccggctgtaaggaatgcgaagagctggaggagaagaacatcaaggagttcctgcagtcttttgtgcacatcgtgcagatgtttattaatacctccagcggaggcggcagtggcggcggcgggtccggcgggggcggcagcggaggagggggcagcggcggcggctccctgcaggctcctaggcgggcccggggatgtcggactctgggcctgcctgccctgctgctgctgctgctgctgaggccccccgcaaccaggggaatcacttgcccaccacctatgtccgtggagcacgccgacatctgggtgaagtcctacagtctgtactccagagagagatacatttgcaactccggattcaagaggaaggccgggacctccagcctgacagagtgcgtgctgaataaggccaccaacgtggcccactggacaacccccagcctgaagtgcatccggtga
SEQ ID NO:2：
MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAAAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMYRMQLLSCIALSLALVTNSGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQAPRRARGCRTLGLPALLLLLLLRPPATRGITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIR
人外周血单个核细胞（PBMC）、人脐带血单个核细胞为常规商业来源，实际临床应用也可从外周血或者脐带血中分离外周血单个核细胞、脐带血单个核细胞。以外周血为例：单采血使用生理盐水1:1稀释，将稀释后的样本加至Ficoll层，每25ml稀释后的血样，使用20ml Ficoll，700g，室温离心20分钟，升速1降速1，吸取白膜层，并使用生理盐水洗涤2次，得到PBMC。
使用时，外周血单个核细胞复苏，使用 NK细胞无血清培养基（依科赛，NE000-N012）清洗，离心。
以下实施例使用的K562滋养细胞构建的方式为常规技术，简述如下：
在北京擎科生物科技有限公司人工合mbIL-21，CD86，4-1BBL的核苷酸序列（DNA片段），核苷酸序列为SEQ ID NO: 3；
使用重组酶将合成的DNA片段和pCDH慢病毒载体质粒中，包装慢病毒感染K562细胞；感染后对细胞进行单克隆挑选以及外源表达鉴定，如图13。过表达膜结合的IL-21、CD86、4-1BBL的K562滋养细胞常规辐照（X射线辐照，辐照剂量100Gy）后用于以下实验。
SEQ ID NO: 3
ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGCAAGGTCAAGATCGCCACATGATTAGAATGCGTCAACTTATAGATATTGTTGATCAGCTGAAAAATTATGTGAATGACTTGGTCCCTGAATTTCTGCCAGCTCCAGAAGATGTAGAGACAAACTGTGAGTGGTCAGCTTTTTCCTGTTTTCAGAAGGCCCAACTAAAGTCAGCAAATACAGGAAACAATGAAAGGATAATCAATGTATCAATTAAAAAGCTGAAGAGGAAACCACCTTCCACAAATGCAGGGAGAAGACAGAAACACAGACTAACATGCCCTTCATGTGATTCTTATGAGAAAAAACCACCCAAAGAATTCCTAGAAAGATTCAAATCACTTCTCCAAAAGATGATTCATCAGCATCTGTCCTCTAGAACACACGGAAGTGAAGATTCCGCGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCGCCACGAACTTCTCTCTGTTAAAGCAAGCAGGAGATGTTGAAGAAAACCCCGGGCCTATGGATCCCCAGTGCACTATGGGACTGAGTAACATTCTCTTTGTGATGGCCTTCCTGCTCTCTGGTGCTGCTCCTCTGAAGATTCAAGCTTATTTCAATGAGACTGCAGACCTGCCATGCCAATTTGCAAACTCTCAAAACCAAAGCCTGAGTGAGCTAGTAGTATTTTGGCAGGACCAGGAAAACTTGGTTCTGAATGAGGTATACTTAGGCAAAGAGAAATTTGACAGTGTTCATTCCAAGTATATGGGCCGCACAAGTTTTGATTCGGACAGTTGGACCCTGAGACTTCACAATCTTCAGATCAAGGACAAGGGCTTGTATCAATGTATCATCCATCACAAAAAGCCCACAGGAATGATTCGCATCCACCAGATGAATTCTGAACTGTCAGTGCTTGCTAACTTCAGTCAACCTGAAATAGTACCAATTTCTAATATAACAGAAAATGTGTACATAAATTTGACCTGCTCATCTATACACGGTTACCCAGAACCTAAGAAGATGAGTGTTTTGCTAAGAACCAAGAATTCAACTATCGAGTATGATGGTATTATGCAGAAATCTCAAGATAATGTCACAGAACTGTACGACGTTTCCATCAGCTTGTCTGTTTCATTCCCTGATGTTACGAGCAATATGACCATCTTCTGTATTCTGGAAACTGACAAGACGCGGCTTTTATCTTCACCTTTCTCTATAGAGCTTGAGGACCCTCAGCCTCCCCCAGACCACATTCCTTGGATTACAGCTGTACTTCCAACAGTTATTATATGTGTGATGGTTTTCTGTCTAATTCTATGGAAATGGAAGAAGAAGAAGCGGCCTCGCAACTCTTATAAATGTGGAACCAACACAATGGAGAGGGAAGAGAGTGAACAGACCAAGAAAAGAGAAAAAATCCATATACCTGAAAGATCTGATGAAACCCAGCGTGTTTTTAAAAGTTCGAAGACATCTTCATGCGACAAAAGTGATACATGTTTTGAGGGCAGAGGAAGTCTTCTAACATGCGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCTATGGAATACGCCTCTGACGCTTCACTGGACCCCGAAGCCCCGTGGCCTCCCGCGCCCCGCGCTCGCGCCTGCCGCGTACTGCCTTGGGCCCTGGTCGCGGGGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTCGCTGCCGCCTGCGCCGTCTTCCTCGCCTGCCCCTGGGCCGTGTCCGGGGCTCGCGCCTCGCCCGGCTCCGCGGCCAGCCCGAGACTCCGCGAGGGTCCCGAGCTTTCGCCCGACGATCCCGCCGGCCTCTTGGACCTGCGGCAGGGCAT
细胞药物冻存时，冻存液中，按体积，CS10细胞冻存液的比例为75%，人血白蛋白的比例为25%。程序降温仪冻存的程序如下：以1℃/min从20℃降温至样本-6℃，再以25℃/min降温至腔体-50℃，再以10℃/min升温至腔体-14℃，然后以1℃/min降温至腔体-45℃，再以25℃/min降温至腔体-90℃，最后液氮保存。
CAR阳性率检测方法：取2~5×105细胞，离心，弃上清，使用1 ml DPBS重悬细胞沉淀，清洗1次，离心，弃掉上清。每个样本使用100ul DPBS 重悬，分别加入1ul PE anti-FMC63 antiboy，于2~8度冰箱，避光孵育30分钟，使用DPBS清洗2次，100ul DPBS重悬后，使用流式细胞仪器检测CAR阳性率。
NK细胞纯度检测方法：取2～5×105细胞，离心，弃上清，使用1 ml DPBS重悬细胞沉淀，清洗1次，离心，弃掉上清。每个样本使用100ul DPBS 重悬，分别加入1ul APC anti-human CD56 antiboy，1ul FITC anti-human CD3 antiboy，于2～8度冰箱，避光孵育30分钟，使用DPBS清洗2次，100ul DPBS重悬后，使用流式细胞仪器检测，检测NK细胞纯度，CD3-CD56+细胞群为NK细胞。
细胞计数：取20ul 细胞悬液，取20ul AO/PI染料，按照1∶1的体积比例混匀，取20ul混合液于细胞计数板中，于细胞计数仪中进行细胞活率与活细胞密度的检测。
NK总分选回收率检测方法：NK总分选回收率=分选前PBMC中NK细胞总数÷（分选后细胞总数×NK细胞纯度）。
实施例一
本实施例提供一种外周血来源的CAR-NK细胞制备方法，步骤如下：
1、分别使用2种不同磁珠进行分选外周血来源的NK细胞。如下：
使用2种NK分选试剂盒从PBMC中分选NK细胞，分别为纳米磁珠分试剂盒NKisolation kit（miltenyi, 130-092-657）、微米磁珠分选NK试剂盒（gibco, 11349D）；分选步骤按照各试剂盒说明书操作，在分选过程中，所用的NK分选缓冲液为NK细胞无血清培养基（依科赛，NE000-N012）。
将分选后的NK细胞取样进行细胞计数，以及流式检测。流式检测过程如下：
取2~5×105细胞，离心，弃上清，使用1 ml DPBS重悬细胞沉淀，清洗1次，离心，弃掉上清。每个样本使用100ul DPBS 重悬，分别加入1ul 抗体，于2~8度冰箱，避光孵育30分钟，使用DPBS清洗2次，100ul DPBS重悬后，使用流式细胞仪器检测分选后的NK细胞纯度，结果如下表1所示，由表1可知，使用纳米磁珠美天旎的NK分选试剂盒分选效果较好，可达到85%以上的回收率。
表1 不同方式从PBMC中分选NK细胞的回收率
2、使用辐照的K562滋养细胞激活NK细胞
将使用NK isolation kit从PBMC中分选后的NK细胞分组，使用NK扩增培养基重悬，滋养细胞进行激活，NK细胞∶滋养细胞比例分别为1∶2，NK细胞接种密度为5×105/mL，此时为Day0；Day3时补加一半体积的NK细胞扩增培养基；其中，NK细胞扩增培养基分别为：
培养基1：NK无血清培养基（依科赛，NE000-N012）+5%SR（CTS Immune Cell SR）+5%血小板裂解物（简称“hPL”）+500IU/ml IL-2+10ng/ml IL-15；
培养基2：NK无血清培养基（依科赛，NE000-N012）+5%hPL+500IU/ml IL-2+10ng/mlIL-15；
培养基3：NK MACS basal Medium（miltenyi，130-112-968）+5%hPL+5%SR+500IU/ml IL-2+10ng/ml IL-15；
培养基4：NK MACS basal Medium（miltenyi，130-112-968）+5%hPL+500IU/ml IL-2+10ng/ml IL-15；
培养基5:CTS NK-Xpander Basal Medium（gibco，A5019001）+5%hPL+5%SR+500IU/ml IL-2+10ng/ml IL-15；
培养基6：CTS NK-Xpander Basal Medium（gibco，A5019001）+5%hPL+500IU/mlIL-2+10ng/ml IL-15。
表2 CAR-NK细胞在不同培养基培养Day14天时各指标情况
实施例二
本实施例参照实施例一分别对NK细胞分选、激活、转导CAR、扩增培养以及检测，与实施例一不同处在于步骤2，如下：
2、使用辐照的K562滋养细胞激活NK细胞
将NK isolation kit分选后的NK细胞进行分组，分别使用滋养细胞进行激活，NK细胞∶滋养细胞比例分别为1∶1、1∶2，NK细胞接种密度分别为5×105/ml、1.0×106/ml，此时为Day0；Day3时补加一半体积的NK细胞扩增培养基，所述NK细胞扩增培养基为实施例一的培养基2。
其余一样。
具体结果如下表3所示，结合表2可知，当NK与滋养细胞1:2时，NK接种密度为5×105/ml时，细胞扩增倍数最高，且其CAR阳性率表达较高，达到95.6%。
表3 NK 激活参数对CAR-NK 扩增倍数以及CAR阳性率的影响
实施例三
本实施例使用脐带血来源大规模制备CAR-NK细胞，细胞最终扩增倍数在2000倍以上，并收获细胞，制备成CAR-NK细胞药物注射液，经冻存复苏后，对细胞检测活率、杀伤、CAR阳性率检测。具体实施方式如下：
1、取5×107个脐带血单个核细胞进行NK细胞的分选，分选方式参照实施例一，对NK isolation kit分选后的NK细胞进行流式检测其纯度，如图1所示。
2、使用NK扩增培养基接种分选后的NK细胞，NK细胞接种密度为5×105/ml，使用辐照后的K562细胞激活NK细胞，NK细胞与K562细胞的比例为1:2，此时为Day0；Day3时，对细胞补液，补加一半体积的NK细胞扩增培养基。其中，NK扩增培养基为实施例一中的培养基2。
3、在Day4时，使用NK细胞转导培养基，用装有CD19 CAR的逆转录病毒感染NK细胞，按照MOI=0.5添加病毒，将细胞与病毒液加入至包被有Retronectin的6孔板中，于室温离心，1000g，30分钟；转导24小时后，对细胞进行换液，更换培养基为实施例一中的培养基2。
NK细胞转导培养基为NK无血清培养基（依科赛，NE000-N012）中添加500IU/ml IL-2和10ng/ml IL-15。
4、CAR-NK细胞扩增培养：在Day5换液后，细胞转入细胞透气性细胞培养袋中37℃，5%CO2，于培养箱中静置培养，调节细胞密度为7×105/ml，在Day7～Day16时，每隔1天对CAR-NK细胞进行补液，补液密度维持在7×105/ml。
5、在Day14～Day16时，每天对细胞进行细胞计数，直至细胞达到足够的数量，开始进行细胞收获。
6、对细胞进行制剂制备：在Day16时，将细胞悬液收集，500g离心15分钟，弃上清，使用生理盐水洗涤2次，将细胞悬液过细胞筛网，去除细胞团块，补加生理盐水，并取样进行细胞计数。将细胞悬液再次离心，弃掉上清，使用CAR-NK细胞冻存液重悬，所述CAR-NK细胞冻存液中含有CS10细胞冻存液和人血白蛋白，将细胞分装，每袋30 ml，于程序降温仪中进行冻存。
在Day16时，取样检测CAR阳性率，如图2所示；CAR-NK细胞扩增曲线如图3所示，扩增倍数如图4所示；可知CAR-NK在体外培养16天，细胞扩增倍数为2185倍，最终收获1.7×1010个细胞，阳性率为86.2%。
对冻存5天后的细胞进行解冻，再次检测细胞活率、CAR阳性率、细胞杀伤。解冻后的细胞检测结果如下表4所示，冻存后的数据略低，但在本领域也被认为冻存后具有好的保持率。
表4 CAR-NK冻存前后活率和CAR阳性率变化
本发明提供的CAR-NK细胞制备方法，可扩增大量脐带血来源的CAR-NK细胞，且CAR-NK细胞高活率、高转效，高杀伤，经冻存后，细胞活率仍在85%以上，CAR阳性率在80%以上。
实施例四
本实施例参照实施例一，使用外周血大规模制备CAR-NK细胞，在CAR-NK细胞收获时间进行调整。具体实施步骤如下：
1、取2×108个PBMC进行NK细胞的NK isolation kit分选，分选方式参照实施例一。
2、使用NK扩增培养基接种分选后的NK细胞，NK细胞接种密度为5×105/ml，使用辐照后的K562细胞激活NK细胞，NK细胞与K562细胞的比例为1:2，此时为Day0；Day3时，对细胞补液，补加一半体积的NK细胞扩增培养基；其中，NK扩增培养基为实施例一中的培养基2。
3、在Day4时，使用NK细胞转导培养基，用装有CD19 CAR的逆转录病毒感染NK细胞，按照MOI=0.5添加病毒，将细胞与病毒液加入至包被有Retronectin的6孔板中，于室温离心，1000g，30分钟，然后转导24小时后，对细胞进行换液，更换培养基为NK扩增培养基（为实施例一中培养基2）；NK细胞转导培养基为NK无血清培养基（依科赛，NE000-N012）中添加500IU/ml IL-2和10ng/ml IL-15。
4、CAR-NK细胞扩增培养：在Day5换液后，细胞转入细胞透气性细胞培养袋中培养，调节细胞密度为7×105/ml，在Day7~Day16时，每隔1天对CAR-NK细胞进行补液，补液密度维持在7×105/ml。细胞于37℃，5%CO2条件下静置培养。
在Day14~Day16时，每天对细胞进行细胞计数，直至细胞扩增进入生长平台期时（相比前一天扩增倍数≤1.2时），细胞开始收获，详细数据如下表5所示。
表5 CAR-NK收获时间细胞计数结果
5、对细胞进行制剂制备：
在Day16时，将细胞悬液收集，500g离心15分钟，弃上清，使用生理盐水洗涤2次，将细胞悬液过细胞筛网，去除细胞团块，补加生理盐水，并取样进行细胞计数。将细胞悬液再次离心，弃掉上清，使用CAR-NK冻存液重悬，所述CAR-NK回输液中含有CS10冻存液和人血白蛋白，将细胞分装,每袋30 ml，程序降温，并于液氮中保存。CAR-NK细胞扩增曲线如图5所示。
对冻存5天后的细胞进行解冻，再次检测细胞活率、CAR阳性率、细胞杀伤。可知CAR-NK在上述时间点收获时，CAR-NK细胞制剂经冻存、解冻后，其CAR阳性率为95.57%，细胞活率为89.26%，与冻存前（活率89.35%）相当。
实施例五
本实施例使用外周血来源大规模制备CAR-NK细胞，细胞最终扩增倍数在2000倍以上，并收获3.6×1010细胞，制备成CAR-NK细胞药物注射液，经冻存复苏后，对细胞检测活率、杀伤、CAR阳性率检测。具体实施步骤如下：
1、取2×108个PBMC进行NK细胞的分选，分选方式参照实施例一，对NK isolationkit分选后的NK细胞进行流式检测其纯度，如图6所示。
2、使用NK细胞扩增培养基接种分选后的NK细胞，NK细胞接种密度为5×105/ml，使用辐照后的K562细胞激活NK细胞，NK细胞与K562细胞的比例为1:2，此时为Day0；Day3时，对细胞补液，补加一半体积的NK细胞扩增培养基；其中，NK细胞扩增培养基为实施例一中的培养基2。
3、在Day4时，使用NK细胞转导培养基，用装有CD19 CAR的逆转录病毒感染NK细胞，按照MOI=0.5添加病毒，将细胞与病毒液加入至包被有Retronectin的6孔板中，于室温离心，800g，40分钟；然后转导20小时后，对细胞进行换液，更换培养基为NK扩增培养基（为实施例一中培养基2）；其中NK细胞转导培养基为NK无血清培养基（依科赛，NE000-N012）中添加500IU/ml IL-2和10ng/ml IL-15。
4、CAR-NK细胞扩增培养：在Day5换液后，细胞转入细胞透气性细胞培养袋中培养，调节细胞密度为7×105/ml，在Day7～Day15时，每隔1天对CAR-NK细胞进行补液，补液密度维持在7×105/ml。细胞于37℃，5%CO2条件下静置培养。
5、在Day14～Day15时，每天对细胞进行细胞计数，直至细胞达到足够的数量，开始进行细胞收获。
6、对细胞进行制剂制备：
在Day15时，将细胞悬液收集，500g离心15分钟，弃上清，使用生理盐水洗涤2次，将细胞悬液过细胞筛网，去除细胞团块，补加生理盐水，并取样进行细胞计数。将细胞悬液再次离心，弃掉上清，使用CAR-NK回输液重悬，其中，CAR-NK回输液中含有90%氯化钠注射液和10%人血白蛋白，将细胞分装，每袋30 ml，于4℃冷藏暂存5小时。临床应用时，可以于2-8度冷藏暂存5-6小时，用于临床回输使用。
在Day15时，取样检测CAR阳性率，如图7所示。在Day15时取样对细胞进杀伤检测，详细步骤参考实施例一，结果如图8所示。CAR-NK细胞扩增曲线如图9所示，扩增倍数如图10所示，可知CAR-NK在体外培养15天，细胞扩增倍数为2000倍，最终收获3.6×1010个细胞，NK细胞纯度为99.7%，CAR阳性率为87.6%。
本发明提供的CAR-NK细胞制备方法，可扩增大量外周血来源的CAR-NK细胞，且CAR-NK细胞高活率、高转效，高杀伤，可用于临床疾病治疗的回输使用。
实施例六
本实施例参照实施例一分别对NK细胞NK isolation kit分选、激活、转导CAR、扩增培养以及检测，与实施例一不同处如下：
3、在Day4，将激活后的NK细胞分组，分别使用不同的助转导试剂对NK细胞转导，转导时所用的培养基为NK转导培养基，所述NK转导培养基为NK无血清培养基（依科赛，NE000-N012）中添加500IU/ml IL-2和10ng/ml IL-15。每组转导1×106个细胞，转导体系1 ml，使用12孔板转导，MOI=0.5，助转导试剂分别为：
条件1：Retronectin 包被12孔板，每12孔板使用14ul/ml；
条件2：Retronectin+Vectorfusion-1，其中，2种试剂均直接在培养基中添加，在每12孔板中，Retronectin使用量为14ul/ml，Vectorfusion-1使用量为10ul/ml；
条件3：Retronectin+鱼精蛋白，其中，2种试剂均直接在培养基中添加，在每12孔板中，Retronectin使用量为14ul/ml，鱼精蛋白的使用量为10ug/ml；
条件4：Retronectin+Vectorfusion-1+鱼精蛋白，其中，3种试剂均直接在培养基中添加，在每12孔板中，Retronectin使用量为14ul/ml，Vectorfusion-1使用量为10ul/ml，鱼精蛋白的使用量为10ug/ml。
将用以上不同助转导试剂转导的细胞，于室温条件下，1000g离心30分钟，置于培养箱中培养过夜进行转导24小时，Day5时，更换培养基为实施例一中培养基2，细胞转入细胞透气性细胞培养袋中37℃，5%CO2静置培养。
在Day10检测CAR阳性率，培养至Day11后统计细胞扩增倍数以及CAR阳性率，结果如下表6，可知，条件2 Retronectin+VF1在悬浮条件使用时，CAR-NK的扩增倍数以及CAR阳性率最佳。进一步的，实验发现单独Retronectin只适合包被的方式，如果采用14ul/ml直接在培养基中添加12孔板，转导效果非常差，劣于条件3。
表6 不同转导条件CAR阳性率
CAR-NK细胞疗法具有巨大的潜力，但临床应用面临着挑战，其中一个技术难点就是转导需要包被多孔板，这显然限制了工作效率且明显提升时间、人力以及试剂成本，本发明出乎意料的设计Retronectin+Vectorfusion-1作为转导助剂，2种试剂均直接在培养基中，再添加孔板，显著扩大了生产规模，而且具有非常好的转导效果，解决了CAR NK细胞药物临床大规模制备的一个难点。
实施例七
本实施例参照实施例六分别对NK细胞NK isolation kit分选、激活、转导CAR、扩增培养以及检测，与实施例六不同处如下：
细胞转导（条件2）换液后，在Day7平均分成2组，实验组使用非透气性培养袋置于波浪式反应器上37℃，5%CO2培养（WAVE组），对照组使用透气性培养袋置于二氧化碳培养箱中37℃，5%CO2静置培养（CultureBag组）。
Day9～Day18:对照组每2天补加NK扩增培养基；实验组在Day9补加NK扩增培养基至1L，Day11~Day18开始启用灌流培养方式；其中，NK扩增培养基为实施例一中培养基2。
实验检测：培养至Day15后统计细胞扩增倍数，结果如图11所示；Day18取样对细胞进行杀伤活性检测，具体实验步骤参照实施例一，设置3个效靶细比，CAR-NK与Raji细胞的比例分别为：9:1、3:1、1:1，实验结果如图12所示，可知在WAVE中扩增的细胞杀伤比静置培养袋中细胞杀伤活性高。
本发明提供的外周血或脐带血来源的CAR-NK的制备方法，扩增倍数在2000倍以上，CAR阳性率在80%以上，细胞活率在85%以上，可应用于临床NK细胞或CAR-NK细胞的疾病治疗。
本发明公开了一种临床级CAR-NK细胞及其注射液的制备方法，包括以下步骤：
（1）从单个核细胞中分选出NK细胞；
（2）使用滋养细胞和NK细胞扩增培养基激活NK细胞；
（3）使用病毒载体将CAR分子（嵌合抗原受体基因）整合至激活后的NK细胞中；
（4）使用NK细胞扩增培养基进行补液CAR-NK细胞的扩增培养，获得大量的CAR-NK细胞；
（5）收集CAR-NK细胞，常规制备成CAR-NK细胞药物注射液。
本发明中，单个核细胞的来源为常规技术，可以从脐带血或外周血分离，也可以从商业途径获取，从而CAR-NK细胞为脐带血或外周血来源。从外周血或脐带血分离得到外周血或脐带血单个核细胞为常规技术，比如单个核细胞通过使用Ficoll-paque密度梯度离心分离脐带血或外周血获得。
本发明中，使用的NK分选方法为磁珠分选法，所述磁珠分选法包纳米磁珠和微米磁珠分选法，纳米磁珠分选法如美天旎NK分选试剂盒，微米磁珠分选法如Thermo NK分选试剂盒；使用的NK分选缓冲液为NK无血清培养基（依科赛，NE000-N012）。
本发明中，所述滋养细胞为辐照后的K562细胞，且过表达CD86，膜结合IL-21（mbIL-21），4-1BBL；K562细胞过表达外源基因方式为病毒载体整合方式或非病毒基因编辑方式，具体选择为常规技术。
本发明中，将分选后的NK细胞进行激活，滋养细胞与NK细胞的比例为1:1~4:1，NK细胞接种细胞密度为：0.5~3×106/ml，激活时间为3~6天。
本发明中，NK细胞扩增培养基为NK无血清培养基（依科赛，NE000-N012）中添加血小板裂解物、血清替代物（SR）、IL-2、IL-15、IL-21的一种或多种；其中，血小板裂解物的浓度为1~10%vv，SR 的浓度为1~10%vv，IL-2浓度为100~1000IU/ml，IL-15浓度为5~50ng/ml，IL-21的浓度为10~100ng/ml。
本发明中，使用的病毒为逆转录病毒，病毒使用量MOI=0.1~5，病毒感染NK的时间为激活后的第3~6天。病毒感染过程使用的培养基为NK转导培养基，具体为NK无血清培养基（依科赛，NE000-N012）中添加IL-2，IL-15，IL-2浓度为100~1000IU/ml，IL-15浓度为5~100ng/ml。
本发明中，病毒感染NK过程中，使用助转导试剂，所述助转导试剂为Retronectin、Vectorfusion、鱼精蛋白中的一种或多种，所述 Retronectin的使用方式为预包被使用或悬浮添加于转导体系，使用浓度为1~30ul/ml, Vectorfusion使用方式为悬浮添加于转导体系，使用浓度为1~30ul/ml,鱼精蛋白方式为悬浮添加于转导体系，使用浓度为1~30ug/ml。
本发明中，病毒感染NK条件为离心转导，室温，离心500~2000g，离心时间为15-60分钟。
本发明中，步骤（2）和步骤（3）的培养容器为培养瓶中培养，培养时间为3~6天；步骤（4）培养容器为细胞透气性细胞培养袋或非透气性培养袋，培养时间为6~22天；细胞培养条件为，静置于37℃、5%CO2培养箱中培养或波浪式反应器（WAVE）中培养。
本发明中，病毒感染NK细胞16-24小时后更换NK转导培养基为上述NK细胞扩增培养基，优选的，将细胞转移至透气性细胞培养袋中培养，每隔1天，按照细胞密度0.5~1.0×106/ml对细胞补加NK细胞扩增培养基。
本发明中，CAR-NK细胞的收集时间，根据CAR-NK细胞的活率与CAR-NK细胞的扩增情况而定，当细胞活率相比前一天下降或细胞扩增至平台期时，开始CAR-NK细胞的收集。
本发明制备的CAR-NK细胞药物注射液经冻存或未冻存，都可有效应用。
总之，临床药物对应的靶点取决于CAR的种类，本发明不受限于CAR的设计，可应用于多个靶点；本发明提供的CAR-NK制备的生产方法应用于大规模CAR-NK的制备，适用于临床及未来商业化。

Claims (10)

1.一种临床级CAR-NK细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）从单个核细胞中分选出NK细胞；
（2）使用滋养细胞和NK细胞扩增培养基激活NK细胞；
（3）将嵌合抗原受体基因整合至激活后的NK细胞中，然后扩增培养，得到CAR-NK细胞。
2.一种临床级CAR-NK细胞药物注射液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）从单个核细胞中分选出NK细胞；
（2）使用滋养细胞和NK细胞扩增培养基激活NK细胞；
（3）将嵌合抗原受体基因整合至激活后的NK细胞中，然后扩增培养，得到CAR-NK细胞；
（4）收集CAR-NK细胞，制备成CAR-NK细胞药物注射液。
3.根据权利要求1或者2所述的制备方法，其特征在于，采用磁珠分选法从单个核细胞中分选出NK细胞；分选时，分选缓冲液为NK无血清培养基。
4.根据权利要求1或者2所述的制备方法，其特征在于，所述滋养细胞为辐照K562细胞；滋养细胞与NK细胞的比例为1:1～4:1，激活的时间为3～6天。
5.根据权利要求1或者2所述的制备方法，其特征在于，NK细胞扩增培养基为NK无血清培养基中添加血小板裂解物、血清替代物、IL-2、IL-15、IL-21的一种或多种添加剂；所述血小板裂解物的浓度为1～10%vv，血清替代物的浓度为1～10%vv，IL-2浓度为100～1000IU/ml，IL～15浓度为5~50ng/ml，IL～21的浓度为10～100ng/ml。
6.根据权利要求1或者2所述的制备方法，其特征在于，在NK转导培养基、助转导试剂的存在下，使用病毒将嵌合抗原受体基因整合至激活后的NK细胞中，病毒的使用量MOI=0.1～5；NK转导培养基为NK无血清培养基中添加IL-2、IL-15，所述IL-2浓度为100～1000IU/ml，IL-15浓度为5～100ng/ml。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，病毒感染NK细胞16～24小时后将NK转导培养基更换为权利要求5中所述NK细胞扩增培养基。
8.根据权利要求1或者2所述的制备方法，其特征在于，细胞培养条件为37℃、5%CO2环境中。
9.根据权利要求1或者2所述的制备方法制备的CAR-NK细胞或者CAR-NK细胞药物注射液。
10.权利要求1或者2所述的制备方法在临床制备CAR-NK细胞药物中的应用。
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CN119082024A (zh) * 2024-11-08 2024-12-06 江苏谱新生物医药有限公司 一种nk细胞的培养基和制备方法

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