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CN105392888A - 使用人源化抗cd19嵌合抗原受体治疗癌症 - Google Patents

使用人源化抗cd19嵌合抗原受体治疗癌症 Download PDF

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CN105392888A
CN105392888A CN201480027401.4A CN201480027401A CN105392888A CN 105392888 A CN105392888 A CN 105392888A CN 201480027401 A CN201480027401 A CN 201480027401A CN 105392888 A CN105392888 A CN 105392888A
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Abstract

本发明提供用于治疗CD19表达相关疾病的组合物和方法。本发明还涉及特异于CD19的嵌合抗原受体(CAR)、编码其的载体、和包含CD19CAR的重组T细胞。本发明还包括施用遗传修饰的T细胞的方法，其中所述T细胞表达包含CD19结合结构域的CAR。

Description

使用人源化抗CD19嵌合抗原受体治疗癌症
本申请要求2013年3月16日递交的美国系列号61/802,629和2013年6月24日递交的美国系列号61/838,537的优先权，这些美国申请的全部内容均并入此处作为参考。
序列表
本申请包含序列表，该序列表已经以ASCII格式电子提交，特此将其全部内容并入作为参考。所述ASCII拷贝创建于2014年3月14日，命名为N2067-7002WO_SL.txt，228,415字节大小。
发明领域
本发明一般地涉及，经工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞在治疗分化群19蛋白(theClusterofDifferentiation19protein,CD19)表达相关疾病中的用途。
背景技术
许多B细胞恶性病患者不能使用标准疗法治愈。此外，传统治疗选项常常有严重副作用。在癌症免疫治疗中已经进行过尝试，但是几种障碍使得十分难于获得临床有效性。尽管已经鉴定了数百种所谓的肿瘤抗原，但是这些抗原通常来源于自身并因此免疫原性弱。此外，肿瘤可以通过几种机制来抵抗免疫攻击的起始和扩大。
在使用嵌合抗原受体(CAR)修饰的自体T细胞(CART)疗法上的近来进展，在利用免疫系统力量治疗B细胞恶性病和其它癌症方面显示出希望，其中所述CART疗法依赖于将T细胞重新定向于癌细胞例如B细胞恶性病上的合适细胞表面分子(参见,例如，Sadelainetal.,CancerDiscovery3:388-398(2013))。鼠源CART19(即“CTL019”)的临床结果已经表现出有希望在罹患CLL的患者和儿童ALL中建立完全缓解(参见例如，Kalosetal.,SciTranslMed3:95ra73(2011),Porteretal.,NEJM365:725-733(2011),Gruppetal.,NEJM368:1509-1518(2013))。除了在遗传修饰T细胞上的嵌合抗原受体能够识别和破坏所靶向的细胞外，成功的治疗性T细胞疗法还需要具有增殖和长时间维持的能力、以及监控白血病细胞逃逸的能力。T细胞的变异性质(无论这是无能(anergy)、抑制或是耗竭的结果)对CAR转化的T细胞的性能产生影响，而对此影响，本领域技术人员在目前可以施予的控制是有限的。为了有效，CAR转化的患者T细胞需要持续存在和维持响应于CAR抗原而增殖的能力。已经证实，使用包含鼠scFv的CART19，ALL患者T细胞可以实现此目的(参见例如，Gruppetal.,NEJM368:1509-1518(2013))。
发明概述
本发明通过提供整合在嵌合抗原受体(CAR)构建体中的、优化的和人源化的抗体片段(例如scFv)在患者中实现了免疫反应控制，其中所述抗体片段结合分化群19蛋白(CD19),其中所述CAR构建体在患者中不引起免疫反应，可以安全地长期使用，并且与治疗B细胞来源癌症的已知CART疗法相比，可以维持或获得更好的临床有效性。本发明还涉及，使用T细胞治疗CD19(OMIMAcc.No.107265,SwissProt.AccNo.P15391)表达相关血液学癌症的用途，其中所述T细胞经工程化表达整合在CAR中的、结合CD19的人源化抗体片段。
因此，一方面，本发明涉及编码嵌合抗原受体(CAR)的分离核酸分子，其中该CRA包含：包括人源化抗CD19结合结构域的抗体或抗体片段、跨膜结构域、和胞内信号传导结构域(例如,包含共刺激结构域和/或第一信号传导结构域(primarysignalingdomain)的胞内信号传导结构域)。在一个实施方案中，CAR包含：包括本文所述人源化抗CD19结合结构域的抗体或抗体片段、本文所述跨膜结构域、和本文所述胞内信号传导结构域(例如，包含共刺激结构域和/或第一信号传导结构域的胞内信号传导结构域)。
在一个实施方案中，编码的人源化抗CD19结合结构域包含本文所述人源化抗CD19结合结构域的轻链互补决定区1(LCCDR1)、轻链互补决定区2(LCCDR2)和轻链互补决定区3(LCCDR3)之一个或多个(例如所有三个)、和/或本文所述人源化抗CD19结合结构域的重链互补决定区1(HCCDR1)、重链互补决定区2(HCCDR2)和重链互补决定区3(HCCDR3)之一个或多个(例如所有三个)，例如，包含一个或多个(如所有三个)LCCDR和一个或多个(如所有三个)HCCDR的人源化抗CD19结合结构域。一个实施方案中，人源化抗CD19结合结构域包含至少HCCDR2。在一个实施方案中，编码的人源化抗CD19结合结构域包含本文所述人源化抗CD19结合结构域的重链互补决定区1(HCCDR1)、重链互补决定区2(HCCDR2)和重链互补决定区3(HCCDR3)之一个或多个(例如所有三个)，例如，编码的人源化抗CD19结合结构域具有两个可变重链区，两个区均包含本文所述HCCDR1,HCCDR2和HCCDR3。一个实施方案中，人源化抗CD19结合结构域包含至少HCCDR2。一个实施方案中，编码的轻链可变区包含VK3_L25种系序列的一、二、三或所有四个构架区。一个实施方案中，编码的轻链可变区具有修饰(例如，替代，例如存在于SEQIDNO:58的轻链可变区的相应位置上的一个或多个氨基酸的替代，例如在位置71和87的一个或多个上的替代)。一个实施方案中，编码的重链可变区包含VH4_4-59种系序列的一、二、三或所有四个构架区。一个实施方案中，编码的重链可变区具有修饰(例如，替代，例如存在于SEQIDNO:58的重链可变区的相应位置上的一个或多个氨基酸的替代，例如位置71、73和78的一个或多个上的替代)。在一个实施方案中，编码的人源化抗CD19结合结构域包含本文(例如表3)所述人源化轻链可变区和/或本文(例如表3)所述人源化重链可变区。在一个实施方案中，编码的人源化抗CD19结合结构域包含本文(例如表3)所述人源化重链可变区，例如至少两个本文(例如表3)所述人源化重链可变区。在一个实施方案中，编码的抗CD19结合结构域是包含表3的氨基酸序列的轻链和重链的scFv。一个实施方案中，抗CD19结合结构域(例如scFv)包含:轻链可变区，其包含在表3所示轻链可变区的氨基酸序列上具有至少一个、两个或三个修饰(例如替代)但不超过30个、20个或10个修饰(例如替代)的氨基酸序列、或与表3的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列；和/或重链可变区，其包含在表3所示重链可变区的氨基酸序列上具有至少一个、两个或三个修饰(例如替代)但不超过30个、20个或10个修饰(例如替代)的氨基酸序列、或与表3的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。一个实施方案中，编码的人源化抗CD19结合结构域包含选自SEQIDNO:1,SEQIDNO:2,SEQIDNO:3,SEQIDNO:4,SEQIDNO:5,SEQIDNO:6,SEQIDNO:7,SEQIDNO:8,SEQIDNO:9,SEQIDNO:10,SEQIDNO:11,和SEQIDNO:12的序列,或与其具有95-99％同一性的序列。一个实施方案中，编码人源化抗CD19结合结构域的核酸序列包含选自SEQIDNO:61,SEQIDNO:62,SEQIDNO:63,SEQIDNO:64,SEQIDNO:65,SEQIDNO:66,SEQIDNO:67,SEQIDNO:68,SEQIDNO:70,SEQIDNO:71,和SEQIDNO:72的序列，或与其具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，编码的人源化抗CD19结合结构域是scFv,且包含本文(例如表3中)所述氨基酸序列的轻链可变区与包含本文(例如表3中)所述氨基酸序列的重链可变区通过接头,例如本文所述接头连接。在一个实施方案中，编码的人源化抗CD19结合结构域包括(Gly4-Ser)n接头,其中n是1,2,3,4,5,或6,优选地3或4(SEQIDNO:53)。scFv的轻链可变区和重链可变区可以为例如以下的任何取向：轻链可变区-接头-重链可变区或重链可变区-接头-轻链可变区。
在一个实施方案中，编码的跨膜结构域是选自以下的蛋白的跨膜结构域：T细胞受体的α,β或ζ链,CD27,CD28,CD3ε,CD45,CD4,CD5,CD8,CD9,CD16,CD22,CD33,CD37,CD64,CD80,CD86,CD134,CD137和CD154。在一个实施方案中，编码的跨膜结构域包含SEQIDNO:15的序列。在一个实施方案中，编码的跨膜结构域包含在SEQIDNO:15的氨基酸序列中具有至少一个、两个或三个修饰(例如替代)但不超过20个、10个或5个修饰(例如替代)的氨基酸序列、或与SEQIDNO：15的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，编码跨膜结构域的核酸序列包含SEQIDNO:56的序列、或与其具有95-99％同一性的序列。
在一个实施方案中，编码的抗CD19结合结构域与跨膜结构域通过铰链区连接，例如本文所述铰链区。在一个实施方案中，编码的铰链区包含SEQIDNO:14或SEQIDNO:45或SEQIDNO:47、或与其具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，编码铰链区的核酸序列包含SEQIDNO:55或SEQIDNO:46或SEQIDNO:48的序列、或与其具有95-99％同一性的序列。
在一个实施方案中，分离的核酸分子还包含编码共刺激结构域的序列。在一个实施方案中，共刺激结构域是获自选自以下的蛋白的功能性信号传导结构域：OX40,CD2,CD27,CD28,CDS,ICAM-1,LFA-1(CD11a/CD18),ICOS(CD278)和4-1BB(CD137)。在一个实施方案中，编码的共刺激结构域包含SEQIDNO:16的序列。在一个实施方案中，编码的共刺激结构域包含在SEQIDNO:16的氨基酸序列中具有至少一个、两个或三个修饰(例如替代)但不超过20个、10个或5个修饰(例如替代)的氨基酸序列、或与SEQIDNO:16的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，编码共刺激结构域的核酸序列包含SEQIDNO:60的序列、或与其具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，分离的核酸分子还包含编码胞内信号传导结构域,例如本文所述胞内信号传导结构域的序列。在一个实施方案中，编码的胞内信号传导结构域包含4-1BB的功能性信号传导结构域和/或CD3ζ的功能性信号传导结构域。在一个实施方案中，编码的胞内信号传导结构域包含CD27的功能性信号传导结构域和/或CD3ζ的功能性信号传导结构域。在一个实施方案中，编码的胞内信号传导结构域包含SEQIDNO:16或SEQIDNO:51的序列和/或SEQIDNO:17或SEQIDNO:43的序列。在一个实施方案中，胞内信号传导结构域包含在SEQIDNO:16或SEQIDNO:51的氨基酸序列和/或SEQIDNO:17或SEQIDNO:43的氨基酸序列上具有至少一个、两个或三个修饰(例如替代)但不超过20个、10个或5个修饰(例如替代)的氨基酸序列、或与SEQIDNO:16或SEQIDNO:51的氨基酸序列和/或SEQIDNO:17或SEQIDNO:43的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，编码的胞内信号传导结构域包含SEQIDNO:16或SEQIDNO:51的序列和SEQIDNO:17或SEQIDNO:43的序列,其中包含胞内信号传导结构域的这些序列在相同读框中作为单一多肽链表达。在一个实施方案中，编码胞内信号传导结构域的核酸序列包含SEQIDNO:60的序列或与其具有95-99％同一性的序列，和/或SEQIDNO:101或SEQIDNO:44的序列或与其具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，编码胞内信号传导结构域的核酸序列包含SEQIDNO:52的序列或与其具有95-99％同一性的序列，和/或SEQIDNO:101或SEQIDNO:44的序列或与其具有95-99％同一性的序列。
另一方面，本发明涉及编码CAR构建体的分离核酸分子，所述CAR构建体包含：前导序列，例如本文所述前导序列，例如SEQIDNO:13的前导序列；本文所述人源化抗CD19结合结构域，例如本文所述包含LCCDR1,LCCDR2,LCCDR3,HCCDR1,HCCDR2和HCCDR3的人源化抗CD19结合结构域，例如表3中所述人源化抗CD19结合结构域、或与其具有95-99％同一性的序列；本文所述铰链区，例如SEQIDNO:14或SEQIDNO:45的铰链区；本文所述跨膜结构域，例如包含SEQIDNO:15的跨膜结构域；和胞内信号传导结构域,例如本文所述胞内信号传导结构域。在一个实施方案中，编码的胞内信号传导结构域包含：共刺激结构域,例如本文所述共刺激结构域,例如具有SEQIDNO:16或SEQIDNO:51的序列的4-1BB共刺激结构域；和/或第一信号传导结构域,例如本文所述第一信号传导结构域,例如具有SEQIDNO:17或SEQIDNO:43的序列的CD3ζ刺激结构域。在一个实施方案中，编码CAR构建体的分离核酸分子包括由SEQIDNO:54的核酸序列或与其具有95-99％同一性的序列编码的前导序列。一个实施方案中，编码CAR构建体的分离核酸分子包括由核酸序列编码的人源化抗CD19结合结构域，所述核酸序列为SEQIDNO:61,SEQIDNO:62,SEQIDNO:63,SEQIDNO:64,SEQIDNO:65,SEQIDNO:66,SEQIDNO:67,SEQIDNO:69,SEQIDNO:70,SEQIDNO:71,或SEQIDNO:72的序列，或与其具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，编码CAR构建体的分离核酸分子包括由SEQIDNO:56的核酸序列或与其具有95-99％同一性的序列编码的跨膜序列。在一个实施方案中，编码CAR构建体的分离核酸分子包括由SEQIDNO:60的核酸序列或与其具有95-99％同一性的序列、和/或SEQIDNO:101或SEQIDNO:44的核酸序列或与其具有95-99％同一性的序列编码的胞内信号传导结构域序列。
在一个实施方案中，分离的核酸分子包含(例如，是)：编码SEQIDNO:31,SEQIDNO:32,SEQIDNO:33,SEQIDNO:34,SEQIDNO:35,SEQIDNO:36,SEQIDNO:37,SEQIDNO:38,SEQIDNO:39,SEQIDNO:40,SEQIDNO:41或SEQIDNO:42的CAR氨基酸序列的核酸，或编码在SEQIDNO:31,SEQIDNO:32,SEQIDNO:33,SEQIDNO:34,SEQIDNO:35,SEQIDNO:36,SEQIDNO:37,SEQIDNO:38,SEQIDNO:39,SEQIDNO:40,SEQIDNO:41或SEQIDNO:42的氨基酸序列上具有至少一个、两个、三个、四个、五个、10个、15个、20个或30个修饰(例如替代)但不超过60、50或40个修饰(例如替代)的氨基酸序列的核酸，或编码与SEQIDNO:31,SEQIDNO:32,SEQIDNO:33,SEQIDNO:34,SEQIDNO:35,SEQIDNO:36,SEQIDNO:37,SEQIDNO:38,SEQIDNO:39,SEQIDNO:40,SEQIDNO:41或SEQIDNO:42的氨基酸序列具有85％,90％,95％,96％,97％,98％或99％同一性的氨基酸序列的核酸。
在一个实施方案中，分离的核酸分子包含(例如，是)：SEQIDNO:85,SEQIDNO:86,SEQIDNO:87,SEQIDNO:88,SEQIDNO:89,SEQIDNO:90,SEQIDNO:91,SEQIDNO:92,SEQIDNO:93,SEQIDNO:94,SEQIDNO:95或SEQIDNO:96的核酸，或与SEQIDNO:85,SEQIDNO:86,SEQIDNO:87,SEQIDNO:88,SEQIDNO:89,SEQIDNO:90,SEQIDNO:91,SEQIDNO:92,SEQIDNO:93,SEQIDNO:94,SEQIDNO:95或SEQIDNO:96的核酸序列具有85％,90％,95％,96％,97％,98％或99％同一性的核酸序列。
一方面，本发明涉及编码人源化抗CD19结合结构域的分离核酸分子，其中该抗CD19结合结构域包含本文所述抗CD19结合结构域的轻链互补决定区1(LCCDR1)、轻链互补决定区2(LCCDR2)和轻链互补决定区3(LCCDR3)之一个或多个(例如所有三个)、以及本文所述抗CD19结合结构域的重链互补决定区1(HCCDR1)、重链互补决定区2(HCCDR2)和重链互补决定区3(HCCDR3)之一个或多个(例如所有三个)，例如，包含一个或多个(如所有三个)LCCDR和一个或多个(如所有三个)HCCDR的人源化抗CD19结合结构域。一个实施方案中，人源化抗CD19结合结构域至少包含HCCDR2。一个实施方案中，轻链可变区包含VK3_L25种系序列的一、二、三或所有四个构架区。一个实施方案中，编码的轻链可变区具有修饰(例如，替代，例如存在于SEQIDNO:58的鼠轻链可变区的相应位置上的一个或多个氨基酸的替代，例如位置71和87的一个或多个上的替代)。一个实施方案中，重链可变区包含VH4_4-59种系序列的一、二、三或所有四个构架区。一个实施方案中，重链可变区具有修饰(例如，替代，例如存在于SEQIDNO:58的鼠重链可变区的相应位置上的一个或多个氨基酸的替代，例如位置71、73和78的一个或多个上的替代)。在一个实施方案中，编码的人源化抗CD19结合结构域包含本文所述(例如SEQIDNO:1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11或12中)轻链可变区和/或本文所述(例如SEQIDNO:1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11或12中)重链可变区。在一个实施方案中，编码的人源化抗CD19结合结构域是包含SEQIDNO:1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11或12中所示氨基酸序列的轻链和重链的scFv。一个实施方案中，人源化抗CD19结合结构域(例如scFv)包含：轻链可变区，其包含在SEQIDNO:1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11或12所示轻链可变区的氨基酸序列中具有至少一个、两个或三个修饰(例如替代)但不超过30、20或10个修饰(例如替代)的氨基酸序列、或与SEQIDNO:1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11或12的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列；和/或重链可变区，其包含在SEQIDNO:1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11或12所示重链可变区的氨基酸序列中具有至少一个、两个或三个修饰(例如替代)但不超过30、20或10个修饰(例如替代)的氨基酸序列、或与SEQIDNO:1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11或12的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，人源化抗CD19结合结构域包含选自SEQIDNO:1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11或12的序列、或与其具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，编码人源化抗CD19结合结构域的核酸序列包含选自SEQIDNO:61,SEQIDNO:62,SEQIDNO:63,SEQIDNO:64,SEQIDNO:65,SEQIDNO:66,SEQIDNO:67,SEQIDNO:68,SEQIDNO:69,SEQIDNO:70,SEQIDNO:71和SEQIDNO:72的序列、或与其具有95-99％同一性的序列。
另一方面，本发明涉及核酸序列编码的分离多肽分子。在一个实施方案中，分离的多肽分子包含选自SEQIDNO:31,SEQIDNO:32,SEQIDNO:33,SEQIDNO:34,SEQIDNO:35,SEQIDNO:36,SEQIDNO:37,SEQIDNO:38,SEQIDNO:39,SEQIDNO:40,SEQIDNO:41,和SEQIDNO:42的序列。在一个实施方案中，分离的多肽包含SEQIDNO：31的序列。在一个实施方案中，分离的多肽包含SEQIDNO：32的序列。在一个实施方案中，分离的多肽分子包含SEQIDNO：35的序列。在一个实施方案中，分离的多肽分子包含SEQIDNO：36的序列。在一个实施方案中，分离的多肽分子包含SEQIDNO：37的序列。
另一方面，本发明涉及分离的嵌合抗原受体(CAR)分子，其包含人源化抗CD19结合结构域(例如特异性结合CD19的人源化抗体或抗体片段)、跨膜结构域和胞内信号传导结构域(例如包含共刺激结构域和/或第一信号传导结构域的胞内信号传导结构域)。在一个实施方案中，CAR包含包括本文所述人源化抗CD19结合结构域的抗体或抗体片段(例如本文所述的特异性结合CD19的人源化抗体或抗体片段)、本文所述跨膜结构域、和本文所述胞内信号传导结构域(例如本文所述包含共刺激结构域和/或第一信号传导结构域的胞内信号传导结构域)。
在一个实施方案中，人源化抗CD19结合结构域包含本文所述人源化抗CD19结合结构域的轻链互补决定区1(LCCDR1)、轻链互补决定区2(LCCDR2)和轻链互补决定区3(LCCDR3)之一个或多个(例如所有三个)、以及本文所述人源化抗CD19结合结构域的重链互补决定区1(HCCDR1)、重链互补决定区2(HCCDR2)和重链互补决定区3(HCCDR3)之一个或多个(例如所有三个)，例如，包含一个或多个(如所有三个)LCCDR和一个或多个(如所有三个)HCCDR的人源化抗CD19结合结构域。一个实施方案中，人源化抗CD19结合结构域至少包含HCCDR2。在一个实施方案中，人源化抗CD19结合结构域包含本文所述人源化抗CD19结合结构域的重链互补决定区1(HCCDR1)、重链互补决定区2(HCCDR2)和重链互补决定区3(HCCDR3)之一个或多个(例如所有三个)，例如，人源化抗CD19结合结构域具有两个可变重链区，各包含本文所述HCCDR1、HCCDR2和HCCDR3。一个实施方案中，人源化抗CD19结合结构域至少包含HCCDR2。一个实施方案中，轻链可变区包含VK3_L25种系序列的一个、两个、三个或所有四个构架区。一个实施方案中，轻链可变区具有修改(例如替代，例如在SEQIDNO:58的鼠轻链可变区的相应位置上的一个或多个氨基酸的替代，例如，位置71和87之一或多个上的替代)。一个实施方案中，重链可变区包含VH4_4-59种系序列的一个、两个、三个或所有四个构架区。一个实施方案中，重链可变区具有修改(例如替代，例如在SEQIDNO:58的鼠重链可变区中相应位置上的一个或多个氨基酸替代，例如，位置71、73和78之一或多个上的替代)。在一个实施方案中，人源化抗CD19结合结构域包含本文(例如表3)所述轻链可变区和/或本文(例如表3)所述重链可变区。在一个实施方案中，人源化抗CD19结合结构域是包含表3的氨基酸序列的轻链和重链的scFv。一个实施方案中，人源化抗CD19结合结构域(例如scFv)包含：轻链可变区，其包含在表3所示轻链可变区的氨基酸序列上具有至少一个、两个或三个修饰(例如替代)但不超过30个、20个或10个修饰(例如替代)的氨基酸序列、或与表3的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列；和/或重链可变区，其包含在表3所示重链可变区的氨基酸序列上具有至少一个、两个或三个修饰(例如替代)但不超过30个、20个或10个修饰(例如替代)的氨基酸序列、或与表3的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，人源化抗CD19结合结构域包含选自SEQIDNO:1,SEQIDNO:2,SEQIDNO:3,SEQIDNO:4,SEQIDNO:5,SEQIDNO:6,SEQIDNO:7,SEQIDNO:8,SEQIDNO:9,SEQIDNO:10,SEQIDNO:11和SEQIDNO:12的序列、或与其具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，人源化抗CD19结合结构域是scFv,且包含本文(例如表3中)所述氨基酸序列的轻链可变区与包含本文(例如表3中)所述氨基酸序列的重链可变区通过接头,例如本文所述接头连接。在一个实施方案中，人源化抗CD19结合结构域包括(Gly4-Ser)n接头,其中n是1,2,3,4,5,或6,优选地3或4(SEQIDNO:53)。scFv的轻链可变区和重链可变区可以为例如以下的任何取向：轻链可变区-接头-重链可变区或重链可变区-接头-轻链可变区。
在一个实施方案中，分离的CAR分子包含选自以下的蛋白的跨膜结构域：T细胞受体的α,β或ζ链,CD28,CD3ε,CD45,CD4,CD5,CD8,CD9,CD16,CD22,CD33,CD37,CD64,CD80,CD86,CD134,CD137和CD154。在一个实施方案中，跨膜结构域包含SEQIDNO：15的序列。在一个实施方案中，跨膜结构域包含在SEQIDNO：15的氨基酸序列中具有至少一个、两个或三个修饰(例如替代)但不超过20个、10个或5个修饰(例如替代)的氨基酸序列、或与SEQIDNO：15的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。
在一个实施方案中，人源化抗CD19结合结构域与跨膜结构域通过铰链区连接，例如本文所述铰链区。在一个实施方案中，编码的铰链区包含SEQIDNO:14或SEQIDNO:45、或与其具有95-99％同一性的序列。
在一个实施方案中，分离的CAR分子还包含编码共刺激结构域，例如本文所述共刺激结构域的序列。在一个实施方案中，共刺激结构域包含选自以下的蛋白的功能性信号传导结构域：OX40,CD2,CD27,CD28,CDS,ICAM-1,LFA-1(CD11a/CD18)和4-1BB(CD137)。在一个实施方案中，共刺激结构域包含SEQIDNO：16的序列。在一个实施方案中，共刺激结构域包含SEQIDNO：51的序列。在一个实施方案中，共刺激结构域包含在SEQIDNO:16或SEQIDNO:51的氨基酸序列中具有至少一个、两个或三个修饰(例如替代)但不超过20个、10个或5个修饰(例如替代)的氨基酸序列、或与SEQIDNO:16或SEQIDNO:51的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。
在一个实施方案中，分离的CAR分子还包含编码胞内信号传导结构域,例如本文所述胞内信号传导结构域的序列。在一个实施方案中，胞内信号传导结构域包含4-1BB的功能性信号传导结构域和/或CD3ζ的功能性信号传导结构域。在一个实施方案中，胞内信号传导结构域包含SEQIDNO:16的序列和/或SEQIDNO:17的序列。在一个实施方案中，胞内信号传导结构域包含SEQIDNO:16的序列和/或SEQIDNO:43的序列。在一个实施方案中，胞内信号传导结构域包含CD27的功能性信号传导结构域和/或CD3ζ的功能性信号传导结构域。在一个实施方案中，胞内信号传导结构域包含SEQIDNO:51的序列和/或SEQIDNO:17的序列。在一个实施方案中，胞内信号传导结构域包含SEQIDNO:51的序列和/或SEQIDNO:43的序列。在一个实施方案中，胞内信号传导结构域包含在SEQIDNO:16或SEQIDNO:51的氨基酸序列和/或SEQIDNO:17或SEQIDNO:43的氨基酸序列上具有至少一个、两个或三个修饰(例如替代)但不超过20个、10个或5个修饰(例如替代)的氨基酸序列、或与SEQIDNO:16或SEQIDNO:51的氨基酸序列和/或SEQIDNO:17或SEQIDNO:43的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，胞内信号传导结构域包含SEQIDNO:16或SEQIDNO:51的序列和SEQIDNO:17或SEQIDNO:43的序列,其中包含胞内信号传导结构域的这些序列在相同读框中作为单一多肽链表达。
在一个实施方案中，分离的CAR分子还包含前导序列，例如本文所述前导序列。在一个实施方案中，前导序列包含SEQIDNO:13的氨基酸序列、或与SEQIDNO:13的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。
另一方面，本发明涉及分离的CAR分子，其包含:前导序列(例如本文所述前导序列，例如SEQIDNO：13的前导序列、或与其具有95-99％同一性的序列)；本文所述人源化抗CD19结合结构域(例如,本文所述包含LCCDR1,LCCDR2,LCCDR3,HCCDR1,HCCDR2和HCCDR3的人源化抗CD19结合结构域，例如表3中所述人源化抗CD19结合结构域、或与其具有95-99％同一性的序列)；铰链区(如本文所述铰链区，例如SEQIDNO：14的铰链区、或与其具有95-99％同一性的序列)；跨膜结构域(如本文所述跨膜结构域，例如具有SEQIDNO:15的序列或与其具有95-99％同一性的序列的跨膜结构域)；和胞内信号传导结构域，例如本文所述胞内信号传导结构域(例如包含共刺激结构域和/或第一信号传导结构域的胞内信号传导结构域)。在一个实施方案中，胞内信号传导结构域包含共刺激结构域,例如本文所述共刺激结构域(例如具有SEQIDNO:16或SEQIDNO:51的序列的4-1BB共刺激结构域、或与其具有95-99％同一性)，和/或第一信号传导结构域,例如本文所述第一信号传导结构域(例如具有SEQIDNO:17或SEQIDNO:43的序列的CD3ζ刺激结构域，或与其具有95-99％同一性)。
一个实施方案中，分离的CAR分子包含(例如，其组成是)：SEQIDNO:31,SEQIDNO:32,SEQIDNO:33,SEQIDNO:34,SEQIDNO:35,SEQIDNO:36,SEQIDNO:37,SEQIDNO:38,SEQIDNO:39,SEQIDNO:40,SEQIDNO:41或SEQIDNO:42的氨基酸序列,或在SEQIDNO:31,SEQIDNO:32,SEQIDNO:33,SEQIDNO:34,SEQIDNO:35,SEQIDNO:36,SEQIDNO:37,SEQIDNO:38,SEQIDNO:39,SEQIDNO:40,SEQIDNO:41或SEQIDNO:42的氨基酸序列中具有至少一个、两个、三个、四个、五个、10个,15个,20个或30个修饰(例如替代)但不超过60个,50个或40个修饰(例如替代)的氨基酸序列,或与SEQIDNO:31,SEQIDNO:32,SEQIDNO:33,SEQIDNO:34,SEQIDNO:35,SEQIDNO:36,SEQIDNO:37,SEQIDNO:38,SEQIDNO:39,SEQIDNO:40,SEQIDNO:41或SEQIDNO:42的氨基酸序列具有85％,90％,95％,96％,97％,98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一方面，本发明涉及人源化抗CD19结合结构域，其包含本文所述抗CD19结合结构域的轻链互补决定区1(LCCDR1)、轻链互补决定区2(LCCDR2)和轻链互补决定区3(LCCDR3)之一个或多个(例如所有三个)、以及本文所述人源化抗CD19结合结构域的重链互补决定区1(HCCDR1)、重链互补决定区2(HCCDR2)和重链互补决定区3(HCCDR3)之一个或多个(例如所有三个)，例如，包含一个或多个(如所有三个)LCCDR和一个或多个(如所有三个)HCCDR的人源化抗CD19结合结构域。一个实施方案中，人源化抗CD19结合结构域至少具有HCCDR2。一个实施方案中，轻链可变区包含VK3_L25种系序列的一个、两个、三个或所有四个构架区。一个实施方案中，轻链可变区具有修改(例如替代，例如在SEQIDNO:58的鼠轻链可变区中相应位置上的一个或多个氨基酸的替代，例如，位置71和87之一或多个上的替代)。一个实施方案中，重链可变区包含VH4_4-59种系序列的一个、两个、三个或所有四个构架区。一个实施方案中，重链可变区具有修改(例如替代，例如在SEQIDNO:58的重链可变区中相应位置上的一个或多个氨基酸的替代，例如，位置71、73和78之一或多个上的替代)。在一个实施方案中，人源化抗CD19结合结构域包含本文(例如SEQIDNO:1,SEQIDNO:2,SEQIDNO:3,SEQIDNO:4,SEQIDNO:5,SEQIDNO:6,SEQIDNO:7,SEQIDNO:8,SEQIDNO:9,SEQIDNO:10,SEQIDNO:11,和SEQIDNO:12中)所述轻链可变区和/或本文(例如SEQIDNO:1,SEQIDNO:2,SEQIDNO:3,SEQIDNO:4,SEQIDNO:5,SEQIDNO:6,SEQIDNO:7,SEQIDNO:8,SEQIDNO:9,SEQIDNO:10,SEQIDNO:11,和SEQIDNO:12中)所述重链可变区。在一个实施方案中，人源化抗CD19结合结构域是scFv，其包含SEQIDNO:1,SEQIDNO:2,SEQIDNO:3,SEQIDNO:4,SEQIDNO:5,SEQIDNO:6,SEQIDNO:7,SEQIDNO:8,SEQIDNO:9,SEQIDNO:10,SEQIDNO:11,和SEQIDNO:12中氨基酸序列的轻链和重链。一个实施方案中，人源化抗CD19结合结构域(例如scFv)包含：轻链可变区，其包含在SEQIDNO:1,SEQIDNO:2,SEQIDNO:3,SEQIDNO:4,SEQIDNO:5,SEQIDNO:6,SEQIDNO:7,SEQIDNO:8,SEQIDNO:9,SEQIDNO:10,SEQIDNO:11,和SEQIDNO:12所示轻链可变区的氨基酸序列中具有至少一个、两个或三个修饰(例如替代)但不超过30、20或10个修饰(例如替代)的氨基酸序列、或与SEQIDNO:1,SEQIDNO:2,SEQIDNO:3,SEQIDNO:4,SEQIDNO:5,SEQIDNO:6,SEQIDNO:7,SEQIDNO:8,SEQIDNO:9,SEQIDNO:10,SEQIDNO:11,和SEQIDNO:12的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列；和/或重链可变区，其包含在SEQIDNO:1,SEQIDNO:2,SEQIDNO:3,SEQIDNO:4,SEQIDNO:5,SEQIDNO:6,SEQIDNO:7,SEQIDNO:8,SEQIDNO:9,SEQIDNO:10,SEQIDNO:11,和SEQIDNO:12所示重链可变区的氨基酸序列中具有至少一个、两个或三个修饰(例如替代)但不超过30、20或10个修饰(例如替代)的氨基酸序列、或与SEQIDNO:1,SEQIDNO:2,SEQIDNO:3,SEQIDNO:4,SEQIDNO:5,SEQIDNO:6,SEQIDNO:7,SEQIDNO:8,SEQIDNO:9,SEQIDNO:10,SEQIDNO:11,和SEQIDNO:12的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。
另一方面，本发明涉及包含编码CAR的核酸序列的载体。一个实施方案中，载体选自：DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、或逆转录病毒载体。
一个实施方案中，载体是慢病毒载体。一个实施方案中，载体还包含启动子。一个实施方案中，启动子是EF-1启动子。在一个实施方案中，EF-1启动子包含SEQIDNO:100的序列。
一个实施方案中，载体是体外转录载体，例如转录本文所述核酸分子的RNA的载体。一个实施方案中，该核酸序列在载体中还包含poly(A)尾，例如本文所述polyA尾，例如包含大约150个腺苷碱基(SEQIDNO:104)。一个实施方案中，该核酸序列在载体中还包含3’UTR,例如本文所述3’UTR，例如包含源自人β球蛋白的3’UTR的至少一个重复。在一个实施方案中，载体中核酸序列还包含启动子，例如T2A启动子。
另一方面，本发明涉及包含载体的细胞。一个实施方案中，细胞是人T细胞。一个实施方案中，细胞是本文所述细胞，例如人T细胞，例如本文所述人T细胞。一个实施方案中，人T细胞是CD8+T细胞。
另一实施方案中，本文所述CAR表达细胞还可以表达另外的活性剂，例如增强CAR表达细胞的活性的活性剂。例如，一个实施方案中，所述活性剂可以是抑制抑制性分子的活性剂。抑制性分子的例子包括PD1,PD-L1,CTLA4,TIM3,LAG3,VISTA,BTLA,TIGIT,LAIR1,CD160,2B4和TGFRβ。一个实施方案中，抑制抑制性分子的活性剂包含第一多肽例如抑制性分子，其中所述第一多肽与向细胞提供阳性信号的第二多肽(例如本文所述胞内信号传导结构域)结合。一个实施方案中，活性剂包含第一多肽和第二多肽，其中所述第一多肽是例如抑制性分子，例如PD1,LAG3,CTLA4,CD160,BTLA,LAIR1,TIM3,2B4和TIGIT，或其任一的片段(例如，其任一的胞外域的至少一部分)，其中所述第二多肽是本文所述胞内信号传导结构域(例如，包含共刺激结构域(例如,41BB,CD27或CD28,例如，如本文所述)和/或第一信号传导结构域(例如本文所述CD3ζ信号传导结构域))。一个实施方案中，活性剂包含第一多肽和第二多肽，其中所述第一多肽是PD1或其片段(例如，PD1的胞外域的至少一部分)，其中所述第二多肽是本文所述胞内信号传导结构域(例如，本文所述CD28信号传导结构域和/或本文所述CD3ζ信号传导结构域)。
另一方面，本发明涉及生产细胞的方法，包括用包含编码CAR例如本文所述CAR的核酸的载体转导T细胞。
本发明还提供产生瞬时地表达外源RNA的RNA工程化细胞，例如本文所述细胞，例如T细胞的群体的方法。该方法包括：将体外转录的RNA或合成的RNA引入细胞，其中该RNA包含编码本文所述CAR分子的核酸。
另一方面，本发明涉及在哺乳动物中提供抗肿瘤免疫的方法，包括向哺乳动物施用有效量的包含CAR分子的细胞，例如表达本文所述CAR分子的细胞。一个实施方案中，细胞是自体T细胞。一个实施方案中，细胞是同种异体T细胞。一个实施方案中，哺乳动物是人。
另一方面，本发明涉及治疗患有CD19表达相关疾病的哺乳动物的方法，包括向哺乳动物施用有效量的包含CAR分子的细胞，例如表达本文所述CAR分子的细胞。
一个实施方案中，CD19表达相关疾病选自增生性疾病，例如癌症或恶性肿瘤或癌前病症，例如骨髓增生异常(myelodysplasia)、骨髓增生异常综合征(myelodysplasticsyndrome)或白血病前期(preleukemia)，或是与CD19表达相关的非癌相关适应症。一个实施方案中，疾病是血液学癌症。一个实施方案中，血液学癌症是白血病。一个实施方案中，癌症选自一种或多种白血病，包括但不限于，B细胞急性淋巴样白血病(“BALL”)、T细胞急性淋巴样白血病(“TALL”)、急性淋巴样白血病(“ALL”)；一或多种慢性白血病，包括但不限于，慢性髓性白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)；其它血液学癌症或血液学病症，包括但不限于B细胞早幼淋巴细胞样白血病、母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤(blasticplasmacytoiddendriticcellneoplasm)、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt'slymphoma)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤(follicularlymphoma)、毛细胞性白血病(hairycellleukemia)、小细胞或大细胞性滤泡性淋巴瘤(smallcell-oralargecell-follicularlymphoma)、恶性淋巴组织增生病症、MALT淋巴瘤、外套细胞淋巴瘤(mantlecelllymphoma)、边缘带淋巴瘤(Marginalzonelymphoma)、多发性骨髓瘤(multiplemyeloma)、骨髓增生异常(myelodysplasia)和骨髓增生异常综合征(myelodysplasticsyndrome)、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’slymphoma)、浆母细胞性淋巴瘤(plasmablasticlymphoma)、浆细胞样树突状细胞肿瘤(plasmacytoiddendriticcellneoplasm)、Waldenstrom巨球蛋白血症(Waldenstrommacroglobulinemia)、和”白血病前期”(通过髓系血液细胞的无效生产(或发育异常)而统一在一起的一系列各种各样的血液学病症)；以及与CD19表达相关的疾病，包括但不限于，表达CD19的非典型和/或非经典的癌症、恶性肿瘤、癌前病症、或增生性疾病；和其任何组合。
一个实施方案中，淋巴细胞输注，例如同种异体淋巴细胞输注，用于癌症治疗中，其中淋巴细胞输注包含至少一种CD19CAR表达细胞。一个实施方案中，自体淋巴细胞输注用于癌症治疗中，其中自体淋巴细胞输注包含至少一种CD19表达细胞。
一个实施方案中，将CD19CAR表达细胞，例如T细胞，施用给已经接受过在先的干细胞移植，例如自体干细胞移植的受试者。
一个实施方案中，将CD19CAR表达细胞，例如T细胞，施用给已经接受过在先美法仑(melphalan)剂量的受试者。
一个实施方案中，表达CAR分子，例如本文所述CAR分子的细胞与增加CAR分子表达细胞的功效的活性剂(例如本文所述活性剂)组合施用。
一个实施方案中，表达CAR分子，例如本文所述CAR分子的细胞，与改善一种或多种副作用的活性剂(例如本文所述活性剂)组合施用，其中所述副作用和施用表达CAR分子的细胞相关。
一个实施方案中，表达CAR分子，例如本文所述CAR分子的细胞，与治疗CD19相关疾病的活性剂，例如本文所述活性剂，组合施用。
一个实施方案中，表达CAR分子，例如本文所述CAR分子的细胞，以本文所述的剂量和/或给药方案施用。
一个实施方案中，例如使用体外转录，将CAR分子引入T细胞中，并且受试者(例如人)接受包含CAR分子的细胞的初始施用、和包含CAR分子的细胞的一个或多个随后施用，其中该一个或多个随后施用在前次施用之后不到15天，例如14,13,12,11,10,9,8,7,6,5,4,3,或2天施用。一个实施方案中，每周向受试者(例如人)施用一次以上的包含CAR分子的细胞，例如每周施用2次、3次或4次包含CAR分子的细胞。一个实施方案中，受试者(例如人受试者)接受每周一次以上的包含CAR分子的细胞施用(例如，每周2、3或4次施用)(在本文中也称作周期)，之后一周不施用包含CAR分子的细胞，然后再向受试者施用一次或多次包含CAR分子的细胞(例如，每周一次以上施用包含CAR分子的细胞)。另一实施方案中，受试者(例如人受试者)接受一个以上周期的包含CAR分子的细胞，每个周期之间的时间少于10,9,8,7,6,5,4,或3天。一个实施方案中，每隔一天施用包含CAR分子的细胞，每周施用3次。一个实施方案中，施用包含CAR分子的细胞至少2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、或更多周。
一个实施方案中，表达CAR分子，例如本文所述CAR分子的细胞，作为一线治疗，施用于疾病，例如癌症，例如本文所述癌症。另一个实施方案中，表达CAR分子，例如本文所述CAR分子的细胞，作为第二、第三、第四线治疗，施用于疾病，例如癌症，例如本文所述癌症。
一个实施方案中，施用本文所述的细胞群体。
另一方面，本发明涉及，将编码本发明CAR的分离核酸分子、本发明的分离CAR多肽分子、包含本发明CAR的载体、和包含本发明CAR的细胞用作药物。
另一方面，本发明涉及，将编码本发明CAR的分离核酸分子、本发明分离的CAR多肽分子、包含本发明CAR的载体、和包含本发明CAR的细胞用于治疗表达CD19的疾病。
一方面，本发明包括自体细胞群，所述细胞转染或转导了包含编码CD19-CAR分子，例如本文所述CD19-CAR分子的核酸分子的载体。一个实施方案中，载体是逆转录病毒载体。一个实施方案中，载体是本文其它地方描述的自失活慢病毒载体。一个实施方案中，向细胞，例如T细胞递送载体(例如通过转染或电穿孔)，其中载体包含编码本文所述CD19CAR分子的核酸分子，其中该核酸分子可以转录为mRNA分子，并且CD19CAR分子可以从该RNA分子翻译并表达在细胞表面上。
另一方面，本发明提供CAR表达细胞例如CART细胞群。一些实施方案中，CAR表达细胞群包含表达不同CAR的细胞的混合物。例如，一个实施方案中，CART细胞群可以包括第一细胞和第二细胞，第一细胞表达具有本文所述抗CD19结合结构域的CAR，第二细胞表达具有不同抗CD19结构域(例如，与第一细胞表达的CAR中的抗CD19结合结构域不同的、本文描述的抗CD19结合结构域)的CAR。另一实例，CAR表达细胞群可以包括第一细胞和第二细胞，第一细胞表达包括(如本文所述的)抗CD19结合结构域的CAR，第二细胞表达包括针对非CD19靶(例如CD123)的抗原结合结构域的CAR。一个实施方案中，CAR表达细胞群包括例如第一细胞和第二细胞，第一细胞表达包括第一胞内信号传导结构域的CAR，第二细胞表达包括第二信号传导结构域的CAR。
另一方面，本发明提供细胞群，其中群体中至少一个细胞表达具有本文所述抗CD19结构域的CAR，第二细胞表达其它活性剂，例如，增强CAR表达细胞的活性的活性剂。例如，一个实施方案中，所述活性剂可以是抑制抑制性分子的活性剂。抑制性分子的例子包括PD1,PD-L1,CTLA4,TIM3,LAG3,VISTA,BTLA,TIGIT,LAIR1,CD160,2B4和TGFRβ。一个实施方案中，抑制抑制性分子的活性剂包含第一多肽例如抑制性分子，其中所述第一多肽与向细胞提供阳性信号的第二多肽(例如本文所述胞内信号传导结构域)结合。一个实施方案中，活性剂包含第一多肽和第二多肽，其中所述第一多肽是例如抑制性分子，例如PD1,LAG3,CTLA4,CD160,BTLA,LAIR1,TIM3,2B4和TIGIT，或其任一的片段(例如，其任一的胞外域的至少一部分)，其中所述第二多肽是本文所述胞内信号传导结构域(例如，包含共刺激结构域(例如,41BB,CD27或CD28,例如，如本文所述)和/或第一信号传导结构域(例如本文所述CD3ζ信号传导结构域))。一个实施方案中，活性剂包含第一多肽和第二多肽，其中所述第一多肽是PD1或其片段(例如，PD1的胞外域的至少一部分)，其中所述第二多肽是本文所述胞内信号传导结构域(例如，本文所述CD28信号传导结构域和/或本文所述CD3ζ信号传导结构域)。
一个实施方案中，编码CD19CAR分子，例如本文所述CD19CAR分子，的核酸分子表达为mRNA分子。一个实施方案中，可以通过将编码期望CAR的RNA分子(例如，无载体序列)转染或电穿孔至细胞中，产生遗传修饰的CD19CAR表达细胞，例如T细胞。一个实施方案中，CD19CAR分子从该RNA分子翻译，并整合和表达在重组细胞表面上。
附图简述
图1A、1B和1C图示在ND317(正常供体)T细胞中测定的细胞毒性，所述ND317细胞转导了小鼠抗CD19CAR或本发明人源化抗CD19CAR，并与不表达CD19的对照K562细胞(K562cc)(如图1A所示)、转化了CD19的K562细胞(K562.CD19)(如图1B所示)、或分离自CLL患者的恶性B细胞(Pt14B细胞分离物)(如图1C所示)一起培养。
图2A和2B图示人源化和小鼠抗CD19CAR表达细胞针对CD19+细胞的增殖反应，其中较高数量的存活CAR+T细胞与针对原代CLL细胞表现出最大CD4+和CD8+T细胞增殖的群体相关。
图3图示本发明scFv的解卷积HPLC质谱，其中上面一行描述未处理的scFv，下面一行描述关连的脱糖基化的scFv。
图4图示通过差示扫描荧光测定法(DifferentialScanningFluorimetry)测量的构象稳定性。小鼠scFv的Tm是57℃(粗线)。与亲本小鼠scFv相比，所有人源化scFv变体显示在大约70℃的更高Tm。通过人源化引入的残基使Tm提高了10℃以上。
图5图示CD19CAR转导的T细胞的增殖，其中该CART19细胞针对(a)CD19表达阴性的慢性髓性白血病(CML)细胞系(由此用作阴性对照)；(b)CD19表达阳性的重组K562细胞(因此用作阳性对照)；或(c)从CLL患者分离的在细胞表面上表达CD19的Pt14B细胞。
图6A和6B示意性表示代表性CARs。
图7描述在以CD19转导的CART细胞治疗后NSG小鼠中HALLX5447原代ALL疾病进程。以特异于CD19的CART细胞治疗后NSG小鼠中原代人ALL细胞的生长显示了对疾病进程的控制。CD19+人ALL细胞的平均百分数指示，到肿瘤植入后第65天，NSG小鼠外周血中的疾病负荷。黑色圆：通过尾静脉以100ulPBS处理的小鼠；红色正方形:用模拟(mock)转导的T细胞处理的小鼠；蓝色三角形:用鼠CD19CAR转导的T细胞处理的小鼠；紫色倒三角:用人源化CD19CAR转导的T细胞处理的小鼠。通过ANOVA计算的显著性；*表示P<0.01。
图8描述在患者肿瘤细胞中CD19的表达。针对CD19(x-轴)和CD38(y-周)，染色CD138+CD45dim肿瘤细胞。
发明详述
定义
除非另有定义，否则本文中所用的所有技术和科学术语均具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。
术语“a”和“an”指一个或一个以上(即至少一个)该冠词的语法对象。例如，“an”元素指一个元素或一个以上元素。
术语“大约”，当用于可测量值例如量、时间持续期等等时，意在涵盖自所述值±20％的变动、或一些情况下±10％、或一些情况下±5％、或一些情况下±1％、或一些情况下±0.1％的变动，因为这些变动均适用于实施本公开的方法。
术语“嵌合抗原受体”或“CAR”指，包含至少胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞质信号传导结构域(在本文中也称为“胞内信号传导结构域”)的重组多肽构建体，其中所述胞质信号传导结构域包含源自下文定义的刺激分子的功能性信号传导结构域。一方面，刺激分子是与T细胞受体复合物相关的ζ链。一方面，胞质信号传导结构域还包含源自至少一个下文定义的共刺激分子的一个或多个功能性信号传导结构域。一方面，共刺激分子选自4-1BB(即CD137)、CD27和/或CD28。一方面，CAR包含嵌合融合蛋白，所述蛋白包含胞外抗原识别结构域、跨膜结构域、和胞内信号传导结构域，所述胞内信号传导结构域含有源自刺激分子的功能性信号传导结构域。一方面，CAR包含嵌合融合蛋白，所述蛋白包含胞外抗原识别结构域、跨膜结构域、和胞内信号传导结构域，所述胞内信号传导结构域含有源自共刺激分子的功能性信号传导结构域和源自刺激分子的功能性信号传导结构域。一方面，CAR包含嵌合融合蛋白，所述蛋白包含胞外抗原识别结构域、跨膜结构域、和胞内信号传导结构域，所述胞内信号传导结构域含有源自一个或多个共刺激分子的两个功能性信号传导结构域和源自刺激分子的功能性信号传导结构域。一方面，CAR包含嵌合融合蛋白，所述蛋白包含胞外抗原识别结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，所述胞内信号传导结构域包含源自一个或多个共刺激分子的至少两个功能性信号传导结构域和源自刺激分子的功能性信号传导结构域。一方面，CAR在CAR融合蛋白的氨基端(N端)包含可选的前导序列。一方面，CAR在胞外抗原识别结构域的N端还包含前导序列，其中前导序列任选地在CAR的细胞加工和定位至细胞膜的过程中从抗原识别结构域(例如scFv)切下。
术语“信号传导结构域”指，通过下述方式发挥作用的蛋白质的功能性部分：经由确定的信号传导途径通过产生第二信使而将信息传递到细胞内以调节细胞活性的蛋白质、或通过响应于此类信使而作为效应子发挥作用的蛋白质。
本文中，术语“CD19”指分化群19蛋白(theClusterofDifferentiation19protein,CD19)，其是在白血病前体细胞上可检测到的抗原决定簇。人和鼠氨基酸和核酸序列可以见于公开数据库，例如GenBank,UniProt和Swiss-Prot。例如，人CD19的氨基酸序列可以见于UniProt/Swiss-Prot登录号P15391，编码人CD19的核苷酸序列可以见于登录号NM_001178098。CD19在大多数B谱系癌，例如急性淋巴母细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病和非霍奇金淋巴瘤上表达。表达CD19的其它细胞在下面的“CD19表达相关疾病”定义中提供。CD19也是B细胞祖先的早期标志物。参见例如Nicholson等Mol.Immun.34(16-17):1157-1165(1997)。一个方面，CART的抗原结合部分在CD19蛋白胞外域中识别并结合抗原。一方面，CD19蛋白在癌细胞上表达。
如本文中所用，术语“抗体”指特异性结合抗原的、源自免疫球蛋白分子的蛋白质或多肽序列。抗体可以是多克隆或单克隆的、多链或单链的、或完整免疫球蛋白，并可以来源于天然来源或来自重组来源。抗体可以是免疫球蛋白分子的四聚体。
术语“抗体片段”指完整抗体的至少一部分或其重组变体，并可以指完整抗体的抗原结合结构域，例如，抗原性决定可变区，其足以赋予抗体片段对靶标例如抗原的识别和特异性结合。抗体片段的例子包括，但不限于，Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段、scFv抗体片段、线性抗体、单结构域抗体如sdAb(VH或VL)、驼样(camelid)VHH结构域、和从抗体片段形成的多特异性抗体。术语“scFv”指，包含至少一个含有轻链可变区的抗体片段和至少一个含有重链可变区的抗体片段的融合蛋白，其中轻链可变区和重链可变区通过短的柔性肽接头连续连接，能够表达为单链多肽，并且其中scFv保持其所源自的完整抗体的特异性。除非特别指出，否则在本文中scFv可以以任何一种顺序具有VL和VH可变区，例如相对于多肽的N端和C端，scFv可以包含VL-接头-VH或可以包含VH-接头-VL。
本发明CAR组合物中包含抗体或其抗体片段的部分可以以各种形式存在，包括例如，单结构域抗体片段(sdAb)、单链抗体(scFv)和人源化抗体(Harlow等,1999,In:UsingAntibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,NY；Harlow等,1989,In:Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarbor,NewYork；Houston等,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883；Bird等,1988,Science242:423-426)，其中抗原结合结构域作为连续多肽链的一部分表达。一方面，本发明CAR组合物的抗原结合结构域包含抗体片段。再一方面，CAR包含含有scFv的抗体片段。
术语“抗体重链”指，天然构象的抗体分子中存在的两类多肽链中的较大者，其通常决定抗体所属的类别。
术语“抗体轻链”指，天然构象的抗体分子中存在的两类多肽链中的较小者。κ和λ轻链指两种主要的抗体轻链同种型。
术语“重组抗体”指，使用重组DNA技术产生的抗体，例如，通过噬菌体或酵母表达系统表达的抗体。该术语也应理解为指，通过如下方式产生的抗体：合成编码该抗体的DNA分子和从该DNA分子表达抗体蛋白；或合成规定该抗体的氨基酸序列，其中该DNA或氨基酸序列通过使用本领域可得和熟知的重组DNA或氨基酸序列技术而获得。
术语“抗原”或“Ag”指可以激起免疫反应的分子。免疫反应可以涉及抗体的产生、或特定的免疫活性细胞的激活、或两者。本领域技术人员明了，任何大分子，包括基本上所有的蛋白或肽，均可以充当抗原。此外，抗原可以源自重组DNA或基因组DNA。本领域技术人员明了，包含编码可以引起免疫反应的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA，因此编码“抗原”(正如该术语在本文所用的)。此外，本领域技术人员明了，抗原不必仅由基因的全长核苷酸序列编码。容易明了的，本发明包括，但不限于，使用一个以上基因的部分核苷酸序列，这些核苷酸序列可以以各种组合方式排列以编码可以引起期望免疫反应的多肽。此外，本领域技术人员明了，抗原无需由“基因”编码。容易明了的，抗原可以合成产生、或可以源自生物样品、或可以是除多肽之外的大分子。所述生物样品可以包括，但不限于，组织样品、肿瘤样品、细胞或液体以及其它生物学成分。
术语“抗肿瘤效应”指生物学效应，其可以表现为多种形式，包括但不限于，例如肿瘤体积的缩小、肿瘤细胞数量的减少、转移瘤数量的减少、寿命的增加、肿瘤细胞增殖的减少、肿瘤细胞存活的减少、或各种与癌性病症相关的生理症状的改善。“抗肿瘤效应”也可以表现为本发明肽、多核苷酸、细胞和抗体从一开始就防止肿瘤发生的能力。
术语“自体”指，从个体获得并之后重新引入该同一个体中的任何物质。
术语“同种异体”指引入个体的任何物质，其中该物质来自与个体相同物种的不同动物。当两个或两个以上个体在一个或多个基因座上的基因不同时，这些个体被称为是同种异基因的(同种异体的)。在一些方面，来自相同物种的个体的同种异体物质可以在遗传上足够不同以发生抗原性上的相互作用。
术语“异种”指源自不同物种的动物的移植物。
术语“癌症”指特征在于快速且不受控的异常细胞生长的疾病。癌症细胞可以局部地或通过血流和淋巴系统而扩散到身体的其它部分。本文描述了各种癌症的例子，包括但不限于，胸腺癌(breastcancer)、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。
短语“CD19表达相关疾病”包括，但不限于，与CD19表达相关的疾病或与表达CD19的细胞相关的病症，包括，例如增生性疾病，例如癌症或恶性肿瘤或癌前病症，例如骨髓增生异常(myelodysplasia)、骨髓增生异常综合征(myelodysplasticsyndrome)或白血病前期(preleukemia)；或与表达CD19的细胞相关的非癌相关适应症。一方面，与CD19表达相关的癌症是血液癌症(hematolicalcancer)。一方面，血液癌症(hematolicalcancer)是白血病或淋巴瘤。一方面，CD19表达相关癌症包括癌症和恶性肿瘤，包括但不限于，例如一种或多种急性白血病，包括但不限于，例如，B细胞急性淋巴样白血病(“BALL”)、T细胞急性淋巴样白血病(“TALL”)、急性淋巴样白血病(“ALL”)；一或多种慢性白血病，包括但不限于，例如，慢性髓性白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)。其它与CD19表达相关的癌症或血液学病症，包括但不限于，例如，B细胞早幼淋巴细胞样白血病(Bcellprolymphocyticleukemia)、母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤(blasticplasmacytoiddendriticcellneoplasm)、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt'slymphoma)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuselargeBcelllymphoma)、滤泡性淋巴瘤(follicularlymphoma)、毛细胞性白血病(hairycellleukemia)、小细胞或大细胞性-滤泡性淋巴瘤(smallcell-oralargecell-follicularlymphoma)、恶性淋巴组织增生病症(malignantlymphoproliferativeconditions)、MALT淋巴瘤、外套细胞淋巴瘤(mantlecelllymphoma)、边缘带淋巴瘤(Marginalzonelymphoma)、多发性骨髓瘤(multiplemyeloma)、骨髓增生异常(myelodysplasia)和骨髓增生异常综合征(myelodysplasticsyndrome)、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’slymphoma)、浆母细胞性淋巴瘤(plasmablasticlymphoma)、浆细胞样树突状细胞肿瘤(plasmacytoiddendriticcellneoplasm)、Waldenstrom巨球蛋白血症(Waldenstrommacroglobulinemia)、和”白血病前期”(通过髓系血液细胞的无效生产(或发育异常)而统一在一起的一系列各种各样血液学病症)，等等。其它与CD19表达相关的疾病，包括但不限于，例如，与CD19表达相关的非典型和/或非经典的癌症、恶性肿瘤、癌前病症、或增生性疾病。与CD19表达相关的非癌相关适应症包括，但不限于，例如，自身免疫病(例如，狼疮)、炎性病症(变态反应和哮喘)和移植。
术语“保守性序列修饰”指，该氨基酸修饰不显著地影响或改变包含该氨基酸序列的抗体或抗体片段的结合特征。保守性修饰包括氨基酸替代、添加和缺失。修饰可以通过本领域已知的标准技术引入本发明抗体或抗体片段，例如定点诱变和PCR介导的诱变。保守氨基酸替代是氨基酸残基被具有相似侧链的另一氨基酸残基替代。具有相似侧链的氨基酸残基家族在本领域中已有定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有β分支侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)、和具有芳香族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，本发明CAR中的一个或多个氨基酸残基可以替换为来自相同侧链家族的其它氨基酸残基，改变的CAR可以使用本文所述的功能性试验加以测试。
术语“刺激”指，由刺激分子(例如TCR/CD3复合物)与其关连配体结合而诱导的初始反应，由此介导信号传导事件，例如，但不限于，经由TCR/CD3复合物的信号传导。刺激可以介导某些分子的改变表达，例如TGF-β的下调、和/或细胞骨架结构的重组织等等。
术语“刺激分子”指T细胞表达的分子，该分子提供第一胞质信号传导序列，其中对于该T细胞信号传导途径的至少一些方面，所述序列以刺激性方式调节TCR复合物的初始活化。一方面，第一信号由例如TCR/CD3复合物与加载了肽的MHC分子的结合而引发，由此介导T细胞反应(包括但不限于，增殖、活化、分化等)。以刺激性方式起作用的第一胞质信号传导序列(也称作“第一信号传导结构域”)可以包含称作免疫受体酪氨酸激活基序或ITAM的信号传导基序。在本发明中尤其有用的包含ITAM的第一胞质信号传导序列的例子包括，但不限于，源自TCRζ、FcRγ,FcRβ,CD3γ,CD3δ,CD3ε,CD5,CD22,CD79a,CD79b,CD278(也称作“ICOS”)和CD66d的序列。在特定的本发明CAR中，在任何一个或多个本发明CAR中胞内信号传导结构域包含胞内信号传导序列，例如CD3-ζ的第一信号传导序列。在特定的本发明CAR中，CD3-ζ的第一信号传导序列是SEQIDNO:17中所示序列、或来自非人物种如小鼠、啮齿类动物、猴、猿等的等价残基。在特定的本发明CAR中，CD3-ζ的第一信号传导序列是SEQIDNO:43中所示序列、或来自非人物种如小鼠、啮齿类动物、猴、猿等的等价残基。
术语“抗原呈递细胞”或“APC”指，可以在其表面展示与主要组织相容性复合物(MHC)复合的外来抗原的免疫系统细胞，例如辅助细胞(例如B细胞、树突细胞等)。T细胞可以使用其T细胞受体(TCR)识别这些复合物。APC加工抗原并将其呈递给T细胞。
在本文中，“胞内信号传导结构域”指分子的胞内部分。胞内信号传导结构域产生可以促进含CAR的细胞(例如CART细胞)的免疫效应子功能的信号。免疫效应子功能的例子，例如在CART细胞中，包括细胞裂解活性和辅助活性，包括细胞因子分泌。
在一个实施方案中，胞内信号传导结构域可以包含第一胞内信号传导结构域。示例性第一胞内信号传导结构域包括源自负责第一刺激或抗原依赖性刺激的分子的那些结构域。一个实施方案中，胞内信号传导结构域可以包含共刺激胞内结构域。示例性共刺激胞内信号传导结构域包括源自负责共刺激信号或抗原非依赖性刺激的分子的那些结构域。例如，在CART的情况下，第一胞内信号传导结构域可以包含T细胞受体的胞质序列，共刺激胞内信号传导结构域可以包含来自共受体或共刺激分子的胞质序列。
第一胞内信号传导结构域可以包含称作免疫受体酪氨酸激活基序或ITAM的信号传导基序。含有ITAM的第一胞质信号传导序列的例子包括但不限于源自CD3ζ、FcRγ,FcRβ,CD3γ,CD3δ,CD3ε,CD5,CD22,CD79a,CD79b,CD66dDAP10和DAP12的那些。
术语“ζ”或“ζ链”、“CD3-ζ”或“TCR-ζ”定义为GenBan登录号BAG36664.1提供的蛋白质、或来自非人物种例如小鼠、啮齿类动物、猴、猿等的等价残基；“ζ刺激结构域”或“CD3-ζ刺激结构域”或“TCR-ζ刺激结构域”定义为来自ζ链的胞质结构域的氨基酸残基，其足以功能性地传递T细胞活化所需的初始信号。一方面，ζ的胞质结构域包含GenBan登录号BAG36664.1的残基52至164、或其功能性直向同源物——来自非人物种例如小鼠、啮齿类动物、猴、猿等的等价残基。一方面，“ζ刺激结构域”或“CD3-ζ刺激结构域”是SEQIDNO:17提供的序列。一方面，“ζ刺激结构域”或“CD3-ζ刺激结构域”是SEQIDNO:43提供的序列。
术语“共刺激分子”指T细胞上的关连结合性配偶体，其特异性结合共刺激配体，由此介导T细胞的共刺激反应，例如，但不限于，增殖。共刺激分子是有效免疫反应所需的、非抗原受体的细胞表面分子或其配体。共刺激分子包括但不限于，MHCI类分子、BTLA和Toll配体受体、以及OX40,CD2,CD27,CD28,CDS,ICAM-1,LFA-1(CD11a/CD18)和4-1BB(CD137)。
共刺激胞内信号传导结构域可以是共刺激分子的胞内部分。共刺激分子可以出现在以下蛋白质家族中：TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、和激活性NK细胞受体。此类分子的例子包括CD27,CD28,4-1BB(CD137),OX40,GITR,CD30,CD40,ICOS,BAFFR,HVEM,淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1),CD2,CD7,LIGHT,NKG2C,SLAMF7,NKp80,CD160,B7-H3,和特异结合CD83的配体等等。
胞内信号传导结构域可以包含其所源自的分子的整个胞内部分、或该分子的整个天然胞内信号传导结构域、或其功能片段。
术语“4-1BB”指TNFR超家族的成员，其具有GenBankAcc.No.AAA62478.2的氨基酸序列、或来自非人物种例如小鼠、啮齿类动物、猴、猿等的等价残基；“4-1BB共刺激结构域”定义为GenBankAcc.No.AAA62478.2的氨基酸残基214-255，或来自非人物种例如小鼠、啮齿类动物、猴、猿等的等价残基。一方面，“4-1BB共刺激结构域”是SEQIDNO:16中提供的序列、或来自非人物种例如小鼠、啮齿类动物、猴、猿等的等价残基。
术语“编码”指多核苷酸例如基因、DNA或mRNA中特定核苷酸序列的固有性质，即所述序列可以充当模板以在生物学过程中合成具有规定的核苷酸序列(例如rRNA、tRNA和mRNA)或规定的氨基酸序列的其它聚合物和大分子以及由此导致的生物学性质。因此，当相应于基因的mRNA在细胞或其它生物学系统中的转录和翻译导致蛋白质产生时，则该基因、cDNA、或RNA编码蛋白。编码链(其核苷酸序列与mRNA序列相同，通常提供在序列表中)和非编码链(用作基因或cDNA转录的模板)两者都可以被称作编码蛋白、或该基因或cDNA的其它产物。
除非另外规定，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此为简并形式的编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。就编码蛋白的核苷酸序列可以在一些形式中含有内含子而言，短语“编码蛋白或RNA的核苷酸序列”也可以包括内含子。
术语“有效量”或“治疗有效量”在本文中可以互换使用，指如本文所述可以有效地实现特定生物学结果的化合物、制剂、物质或组合物的量。
术语“内源”指来自生物体、细胞、组织或系统的任何物质、或在生物体、细胞、组织或系统中产生的任何物质。
术语“外源”指从生物体、细胞、组织或系统引入的、或在生物体、细胞、组织、或系统之外产生的任何物质。
术语“表达”指启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
术语“转移载体”指包含分离的核酸并可以用于将该分离的核酸递送至细胞内部的物质组成。本领域已知许多载体，包括但不限于，线性多核苷酸、与离子或两亲性化合物结合的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“转移载体”包括自主复制质粒或病毒。该术语也应理解为还包括利于核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒的化合物，例如多赖氨酸化合物、脂质体等。病毒转移载体的例子包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体等。
术语“表达载体”指含有重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包含与待表达的核苷酸序列有效连接的表达控制序列。表达载体包含足以实现表达的顺式作用元件；用于表达的其它元件可以由宿主细胞提供或在体外表达系统中提供。表达载体包括可以掺入所述重组多核苷酸的本领域已知的所有表达载体，包括粘粒、质粒(例如裸露的或包含在脂质体中的)和病毒(例如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、和腺相关病毒)。
术语“慢病毒”指慢病毒科的属。慢病毒在逆转录病毒中是独特的，能够感染非分裂细胞；它们能将显著量的遗传信息递送到宿主细胞的DNA中，由此它们是最为有效的基因递送载体方法之一。HIV、SIV和FIV均是慢病毒的例子。
术语“慢病毒载体”指源自慢病毒基因组的至少一个部分的载体，包括尤其是Miloneetal.,Mol.Ther.17(8):1453–1464(2009)中提供的自失活慢病毒载体。可以在临床上使用的慢病毒载体的其它例子包括但不限于，例如OxfordBioMedica的基因递送技术、Lentigen的LENTIMAXTM载体系统等。非临床类的慢病毒载体也可以获得，并是本领域技术人员已知的。
术语“同源性”或“同一性”指两个聚合物分子之间，例如两个核酸分子之间、例如两个DNA分子或两个RNA分子之间、或两个多肽分子之间的亚单位序列同一性。当一个亚单位位置在两个分子中被相同单体亚单位占据时，例如当两个DNA分子在一个位置上都被腺苷占据时，则它们在该位置是同源的或同一的。两个序列之间的同源性是匹配的或同源的位置数的直接函数；例如，当两个序列中半数位置(例如在长10个亚单位的聚合物中5个位置)是同源的，则这两个序列50％同源；如果90％的位置(例如10个中9个)是匹配的或同源的，则这两个序列90％同源。
非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式是含有源自非人免疫球蛋白的最少序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2、或抗体的其它抗原结合子序列)。就大部分而言，人源化抗体和其抗体片段是人免疫球蛋白(受体抗体或抗体片段)，其中受体的互补决定区(CDR)的残基被来自具有期望特异性、亲和性和能力的非人物种(例如小鼠、大鼠或兔)(供体抗体)的CDR的残基替代。一些情况下，人免疫球蛋白的Fv构架区(FR)残基被相应的非人残基替代。此外，人源化抗体/抗体片段可以包含既不存在于受体抗体中也不存在于导入的CDR或构架序列中的残基。这些修饰可以进一步精细化和优化抗体或抗体片段的性能。一般地，人源化抗体或其抗体片段包含至少一个，典型地两个，可变结构域的实质上全部，其中全部或实质上全部的CDR区对应于非人免疫球蛋白的CDR区，而全部或显著部分的FR区为人免疫球蛋白序列的。人源化抗体或抗体片段也可以包含至少一部分的免疫球蛋白恒定区(Fc)，典型地人免疫球蛋白的Fc。至于进一步的细节，参见Jones等,Nature,321:522-525,1986；Reichmann等,Nature,332:323-329,1988；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596,1992。
“完全人”指，免疫球蛋白例如抗体或抗体片段的整个分子是人来源的、或由与该抗体或免疫球蛋白的人形式相同的氨基酸序列组成。
术语“分离的”意指，从天然状态改变或移出。例如，天然存在于活动物中的核酸或肽不是“分离的”，但与其天然状态下的共存物部分地或完全地分开的该核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白可以以基本上纯化的形式存在，或可以存在于非天然环境例如宿主细胞中。
在本发明中，对于常见核酸碱基，使用以下缩写。“A”指腺苷，“C”指胞嘧啶，“G”指鸟苷，“T”指胸腺嘧啶，“U”指尿嘧啶。”
术语“有效连接”或“转录控制”指，调节序列和异源核酸序列之间功能性连接从而导致后者表达。例如，第一核酸序列与第二核酸序列有效连接，则第一核酸序列被置于与第二核酸序列的功能性关系中。例如，启动子与编码序列有效连接时，启动子影响编码序列的转录或表达。有效连接的DNA序列可以彼此相邻，并例如在需要连接两个蛋白编码区时，在相同的读框中。
术语“腹膜外”施用免疫原性组合物包括，例如皮下(s.c.)、静脉内(i.v.)、肌内(i.m.)、或胸骨内注射、肿瘤内、或输注技术。
术语“核酸”或“多核苷酸”指，单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)和其聚合物。除非特别限定，否则该术语涵盖包含天然核苷酸的已知类似物的核酸，其中该核酸与参考核酸具有相似的结合性质并以类似于天然核苷酸的方式被代谢。除非另外指出，否则一个特定核酸序列也隐含地包括其保守修饰的变体(例如简并密码子替代)、等位基因、直向同源物、SNP和互补序列、以及该明确指出的序列。特别地，简并密码子替代可以通过如下实现：产生序列，在该序列中一个或多个选定的(或所有)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基替代(Batzeretal.,NucleicAcidRes.19:5081(1991)；Ohtsukaetal.,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；andRossolinietal.,Mol.Cell.Probes8:91-98(1994))。
术语“肽”、“多肽”、和“蛋白”可互换使用，指由通过肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，对于可以包含蛋白或肽序列的氨基酸的最大数目没有限制。多肽包括含有彼此通过肽键连接的两个或两个以上氨基酸的任何肽或蛋白质。在本文中，该术语既指短链(在本领域中通常也称作例如肽、寡肽和寡聚物)，也指较长链(通常在本领域中称为蛋白质)，存在许多类型的蛋白质。“多肽”包括例如生物活性片段、基本同源多肽、寡肽、同二聚体、异二聚体、多肽变体、修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等等。多肽包括天然肽、重组肽或其组合。
术语“启动子”指，可以被细胞的合成机器或引入的合成机器识别的、启动多核苷酸序列的特定转录所需的DNA序列。
术语“启动子/调节序列”指，表达基因产物所需的核酸序列，其中所述基因产物与该启动子/调节序列有效连接。在一些情况中，该序列可以是核心启动子序列，在其它情况中该序列还可以包括增强子序列和表达基因产物所需的其它调节元件。启动子/调节序列可以例如以组织特异性方式表达基因产物。
术语“组成型”启动子指这样的核苷酸序列，当与编码或规定基因产物的多核苷酸有效连接时，该核苷酸序列在细胞的大多数或所有生理条件下造成基因产物在细胞中产生。
术语“诱导性”启动子指这样的核苷酸序列，当与编码或规定基因产物的多核苷酸有效连接时，该核苷酸序列基本上仅在细胞中存在对应于该启动子的诱导物时才造成基因产物在细胞中产生。
术语“组织特异性”启动子指这样的核苷酸序列，当与编码或规定基因产物的多核苷酸有效连接时，该核苷酸序列基本上仅在细胞是对应于该启动子的组织类型的细胞时才造成基因产物在该细胞中产生。
术语“柔性多肽接头”或“接头”用于scFv的上下文中时指，由氨基酸例如甘氨酸和/或丝氨酸残基组成的肽接头，其单独或组合使用，以将可变重链区和可变轻链区连接在一起。一个实施方案中，柔性多肽接头是Gly/Ser接头，包括氨基酸序列(Gly-Gly-Gly-Ser)n，其中n是等于或大于1的正整数。例如，n＝1,n＝2,n＝3.n＝4,n＝5和n＝6,n＝7,n＝8,n＝9和n＝10(SEQIDNO:105)。在一个实施方案中，柔性多肽接头包括，但不限于，(Gly4Ser)4(SEQIDNO：106)或(Gly4Ser)3(SEQIDNO：107)。在另一实施方案中，接头包括(Gly2Ser),(GlySer)或(Gly3Ser)(SEQIDNO：108)的多个重复。WO2012/138475(并入本文作为参考)中描述的接头也包括在本发明的范围内。
在本文中，5’帽子(也称作RNA帽子、RNA7-甲基鸟苷帽子、或RNAm7G帽子)是修饰的鸟嘌呤核苷酸，其在转录开始后不久添加到真核信使RNA的“前”或5’末端。5’帽子由与第一个转录的核苷酸连接的端基组成。其存在对于核糖体识别和抗RNA酶保护作用是关键的。加帽与转录偶联，以共转录方式发生，由此加帽与转录彼此影响。在转录开始后不久，与RNA聚合酶缔合的帽子合成复合物结合到正在合成的mRNA的5’末端。该酶学复合物催化mRNA加帽所需的化学反应。合成以多步骤生物化学反应进行。可以修饰加帽部分以调节mRNA的功能性，例如其稳定性或翻译效率。
在本文中，“体外转录的RNA”指已经体外合成的RNA，优选mRNA。一般地，体外转录的RNA从体外转录载体产生。体外转录载体包含用于产生该体外转录RNA的模板。
在本文中，poly(A)是通过多腺苷酸化连接到mRNA上的一系列腺苷。在用于瞬时表达的构建体的优选实施方案中，polyA为50到5000(SEQIDNO:109)，优选大于64，更优选大于100，更优选大于300或400。可以化学或酶学修饰poly(A)序列，以调节mRNA功能性，例如定位、稳定性或翻译效率。
在本文中，“多腺苷酸化”指将多腺苷酰基部分或其修饰变体共价连接到信使RNA分子上。在真核生物中，大多数信使RNA(mRNA)分子在3’末端被多腺苷酸化。3’poly(A)尾是通过酶(多腺苷酸化聚合酶)的作用加到mRNA前体上的腺嘌呤核苷酸(常常几百个)长序列。在高等真核生物中，poly(A)尾添加到含有特定序列(多腺苷酸化信号)的转录物上。Poly(A)尾和与其结合的蛋白质有助于保护mRNA免于外切核酸酶的降解。多腺苷酸化对于转录终止、mRNA从细胞核的输出、和翻译也是重要的。多腺苷酸化可以在细胞核中在DNA转录成RNA后立即发生，但此外，也可以随后在细胞质中发生。转录终止后，通过与RNA聚合物缔合的内切核酸酶复合物的作用，mRNA链被切割。切割位点通常的特征是在切割位点附近存在碱基序列AAUAAA。在切割mRNA后，腺苷残基添加到切割位点的游离3'末端。
本文中，“瞬时”指未整合的转基因为期数小时、数天或数周的表达，其中该表达时间少于当基因整合在基因组中或包含在宿主细胞的稳定质粒复制子中时的基因表达时间。
术语“信号转导途径”指多种信号转导分子之间的生物化学关系，这些分子在信号从细胞的一部分传递到细胞的另一部分中起作用。术语“细胞表面受体”包括能够接受信号并跨细胞膜传递信号的分子和分子复合物。
术语“受试者”旨在包括可以在其中引起免疫反应的活生物体(例如，哺乳动物，人)。
术语“基本上纯的”细胞指，该细胞基本上不含其他细胞类型。基本上纯的细胞也指，该细胞已经与在其天然状态下和其正常相关的其他细胞类型分开。在一些情况下，基本上纯的细胞的群体指均质细胞群体。在其它情况下，该术语仅指，细胞已经与在其天然状态下和其天然相关的细胞分开。在一些方面，在体外培养细胞。在其它方面，不在体外培养细胞。
术语“治疗”(therapeutic)在本文中意指治疗(treatment)。治疗效果通过降低、抑制、减轻或根除疾病状态而获得。
术语“预防”(prophylaxis)在本文中意指对疾病或疾病状态的防止或预防性治疗。
在本发明中，“肿瘤抗原”或“过度增生性病症抗原”或“与过度增生病症相关的抗原”指，特定过度增生性病症所共有的抗原。在一些方面，本发明的过度增生性病症抗原来源于癌症，包括但不限于，原发性或转移性黑素瘤、胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、肺癌、肝癌、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’slymphoma)、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkinslymphoma)、白血病、子宫癌、宫颈癌、膀胱癌、肾癌、和腺癌例如胸腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌等。
术语“转染的”或“转化的”或“转导的”指，将外源核酸转移或引入宿主细胞中的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经被转染了、转化了或转导了外源核酸的细胞。该细胞包括原代受试细胞和其后代。
术语“特异结合”指，抗体或配体识别和结合样品中存在的关连结合配偶体蛋白(例如，存在于T细胞上的刺激和/或共刺激分子)，但基本上不识别或结合样品中的其它分子。
范围：在整个本公开中，本发明的多个方面可以以范围的形式给出。应当理解，以范围形式描述仅仅是为方便和简短起见，不应理解为对本发明范围构成硬性限制。因此，范围的描述应当视为已经具体公开了所有可能的子范围以及在该范围内的各个数值。例如，诸如1至6的范围描述应视为已经具体公开了子范围例如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等等，以及落入该范围的各个数值，例如1,2,2.7,3,4,5,5.3,和6。作为另一实例，范围例如95-99％同一性包括95％,96％,97％,98％或99％同一性，并包括子范围例如96-99％,96-98％,96-97％,97-99％,97-98％和98-99％同一性。无论范围的宽度如何，这均适用。
发明详述
本文提供使用人源化抗CD19嵌合抗原受体(CAR)治疗疾病例如癌症的组合物和方法。
一方面，本发明提供多种嵌合抗原受体(CAR)，其包含经工程化而增强结合CD19蛋白的抗体或抗体片段。一方面，本发明提供经工程化而表达CAR的细胞(例如T细胞)，其中该CART细胞(“CART”)表现出抗肿瘤性质。一方面，用CAR转化细胞，CAR在细胞表面上表达。一些实施方案中，用编码CAR的病毒载体转导细胞(例如T细胞)。在一些实施方案中，病毒载体是逆转录病毒载体。一些实施方案中，病毒载体是慢病毒载体。一些这样的实施方案中，细胞可以稳定地表达CAR。在其它实施方案中，用编码CAR的核酸，例如mRNA、cDNA、DNA，转染细胞(例如T细胞)。在一些这样的实施方案中，细胞可以瞬时表达CAR。
一方面，CAR的抗CD19蛋白结合部分是scFv抗体片段。一方面，该抗体片段是功能性的，由此，与其所来自的IgG抗体相比，其保持等价的结合亲合力，例如其以相当的功效结合相同抗原。一方面，该抗体片段是功能性的，由此其提供生物学反应，如本领域技术人员理解的，所述反应可以包括但不限于激活免疫反应、抑制从其靶抗原的信号传导起始、抑制激酶活性等。一方面，CAR的抗CD19抗原结合结构域是，相对于其所源自的鼠序列scFv被人源化的scFv抗体片段。一方面，亲本鼠scFv序列是PCT公布WO2012/079000中提供的CAR19构建体，在本文中提供为SEQIDNO:58。
一些方面，本发明抗体并入嵌合抗原受体(CAR)中。一方面，CAR包含PCT公布WO2012/079000中以SEQIDNO:12提供的多肽序列(在本文中以SEQIDNO:58提供),其中该scFv结构域可以被选自SEQIDNOS:1-12的一个或多个序列替代。一方面，SEQIDNOS:1-12的scFv结构域是SEQIDNO:59的scFv结构域——与人CD19特异性结合的鼠源scFv片段——的人源化变体。该鼠scFv的人源化对于临床环境可能是期望的，其中小鼠特异性残基可能在接受CART19治疗(例如用转导了该CAR19构建体的T细胞治疗)的患者中诱导人抗鼠抗原(HAMA)反应。
一方面，本发明CAR的抗CD19结合结构域(例如人源化scFv)部分由转基因编码，该转基因的序列已经针对在哺乳动物细胞中表达而进行了密码子优化。一方面，本发明的整个CAR构建体由转基因编码，该转基因的整个序列已经针对在哺乳动物细胞中表达而进行了密码子优化。密码子优化指，同义密码子(即，编码相同氨基酸的密码子)在编码DNA中的出现频率在不同物种中存在偏好。密码子简并性允许多个核苷酸序列编码相同的多肽。本领域已知多种密码子优化方法，包括例如公开在至少美国专利号5,786,464和6,114,148中的方法。
一方面，人源化CAR19包含SEQIDNO：1中提供的scFv部分。一方面，人源化CAR19包含SEQIDNO：2中提供的scFv部分。一方面，人源化CAR19包含SEQIDNO：3中提供的scFv部分。一方面，人源化CAR19包含SEQIDNO：4中提供的scFv部分。一方面，人源化CAR19包含SEQIDNO：5中提供的scFv部分。一方面，人源化CAR19包含SEQIDNO：6中提供的scFv部分。一方面，人源化CAR19包含SEQIDNO：7中提供的scFv部分。一方面，人源化CAR19包含SEQIDNO：8中提供的scFv部分。一方面，人源化CAR19包含SEQIDNO：9中提供的scFv部分。一方面，人源化CAR19包含SEQIDNO：10中提供的scFv部分。一方面，人源化CAR19包含SEQIDNO：11中提供的scFv部分。一方面，人源化CAR19包含SEQIDNO：12中提供的scFv部分。
一方面，本发明CAR将特定抗体的抗原结合结构域和胞内信号传导分子组合在一起。例如，一些方面，胞内信号传导分子包括但不限于，CD3-ζ链、4-1BB和CD28信号传导模块及其组合。一方面，抗原结合结构域结合CD19。一方面，CD19CAR包含选自SEQIDNOS:31-42的一个或多个中所给序列的CAR。一方面，CD19CAR包含SEQIDNO：31中提供的序列。一方面，CD19CAR包含SEQIDNO：32中提供的序列。一方面，CD19CAR包含SEQIDNO：33中提供的序列。一方面，CD19CAR包含SEQIDNO：34中提供的序列。一方面，CD19CAR包含SEQIDNO：35中提供的序列。一方面，CD19CAR包含SEQIDNO：36中提供的序列。一方面，CD19CAR包含SEQIDNO：37中提供的序列。一方面，CD19CAR包含SEQIDNO：38中提供的序列。一方面，CD19CAR包含SEQIDNO：39中提供的序列。一方面，CD19CAR包含SEQIDNO：40中提供的序列。一方面，CD19CAR包含SEQIDNO：41中提供的序列。一方面，CD19CAR包含SEQIDNO：42中提供的序列。
此外，本发明提供CD19CAR组合物、及其在用于治疗疾病例如癌症或任何恶性或自身免疫疾病的药物或方法中的应用，其中所述疾病涉及表达CD19的细胞或组织。
一方面，本发明CAR可以用于根除表达CD19的正常细胞，由此适于在细胞移植前用作细胞调理治疗(cellularconditioningtherapy)。一方面，表达CD19的正常细胞是表达CD19的正常干细胞，而细胞移植是干细胞移植。
一方面，本发明提供经工程化而表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞(例如T细胞)，其中该CART细胞(“CART”)表现出抗肿瘤性质。一个优选的抗原是CD19。一方面，CAR的抗原结合结构域包含部分人源化的抗CD19抗体片段。一方面，CAR的抗原结合结构域包含部分人源化的抗CD19抗体片段，其包含scFv。因此，本发明提供，经工程化并入T细胞中的、包含人源化抗CD19结合结构域的CD19-CAR、以及将其用于过继性治疗的方法。
一方面，CD19-CAR包含至少一个胞内信号传导结构域，其选自CD137(4-1BB)信号传导结构域、CD28信号传导结构域、CD3ζ信号结构域，及其任何组合。一方面，CD19-CAR包含至少一个胞内信号传导结构域，其来自一个或多个非CD137(4-1BB)或CD28的共刺激分子。
嵌合抗原受体(CAR)
本发明涵盖包含编码CAR的序列的重组DNA构建体，其中CAR包含与CD19(例如人CD19)特异结合的人源化抗体片段，其中抗体片段的序列与编码胞内信号传导结构域的核酸序列相邻并在相同的读框中。胞内信号传导结构域可以包含共刺激信号传导结构域和/或第一信号传导结构域，例如ζ链。共刺激信号传导结构域指包含共刺激分子的胞内结构域的至少一部分的CAR部分。
在特定方面，本发明CAR构建体包含选自SEQIDNO1-12的scFv结构域，其中该scFv可以前接可选的前导序列，例如SEQIDNO:13中提供的前导序列，并后接可选的铰链序列(例如SEQIDNO:14或SEQIDNO:45或SEQIDNO:47或SEQIDNO:49中提供的铰链序列)、跨膜区(例如SEQIDNO:15中提供的跨膜区)、包括SEQIDNO:16或SEQIDNO:51的胞内信号传导结构域和包括SEQIDNO:17或SEQIDNO:43的CD3ζ序列，其中这些结构域相邻并在相同读框中以形成单个融合蛋白。本发明还包括，编码具有选自SEQIDNO:1,SEQIDNO:2,SEQIDNO:3,SEQIDNO:4,SEQIDNO:5,SEQIDNO:6,SEQIDNO:7,SEQIDNO:8,SEQIDNO:9,SEQIDNO:10,SEQIDNO:11和SEQIDNO:12的scFv片段之一的多肽的核苷酸序列。本发明还包括，编码具有选自SEQIDNO:1,SEQIDNO:2,SEQIDNO:3,SEQIDNO:4,SEQIDNO:5,SEQIDNO:6,SEQIDNO:7,SEQIDNO:8,SEQIDNO:9,SEQIDNO:10,SEQIDNO:11和SEQIDNO:12的scFv片段之一以及SEQIDNOS:13-17之每一个结构域的多肽的核苷酸序列、和编码的本发明CD19CAR融合蛋白。一方面，示例性CD19CAR构建体包含可选前导序列、胞外抗原结合结构域、铰链、跨膜结构域、和胞内刺激结构域。一方面，示例性CD19CAR构建体包含可选前导序列、胞外抗原结合结构域、铰链、跨膜结构域、胞内共刺激结构域和胞内刺激结构域。SEQIDNOS:31-42提供了包含本发明人源化scFv结构域的特定CD19CAR构建体。
全长CAR序列也提供在SEQIDNOS:31-42中，见表3。
一个示例性前导序列为SEQIDNO:13。一个示例性铰链/间隔序列提供为SEQIDNO:14或SEQIDNO:45或SEQIDNO:47或SEQIDNO:49。一个示例性跨膜结构域序列为SEQIDNO:15。一个示例性4-1BB蛋白的胞内信号传导结构域序列为SEQIDNO:16。一个示例性CD27蛋白的胞内信号传导结构域序列为SEQIDNO:51。一个示例性CD3ζ结构域序列为SEQIDNO:17或SEQIDNO:43。
一方面，本发明涵盖包含编码CAR的核酸分子的重组核酸构建体，其中该核酸分子包含与编码胞内信号传导结构域的核酸序列相邻并在相同的读框中的、编码(例如如本文所述的)抗CD19结合结构域的核酸序列。一方面，抗CD19结合结构域选自SEQIDNOS:1-12中的一个或多个。一方面，抗CD19结合结构域由SEQIDNOS:61-72之一个或多个中提供的序列的核苷酸残基64至813编码。一方面，抗CD19结合结构域由SEQIDNO:61的核苷酸残基64-813编码。一方面，抗CD19结合结构域由SEQIDNO:62的核苷酸残基64-813编码。一方面，抗CD19结合结构域由SEQIDNO:63的核苷酸残基64-813编码。一方面，抗CD19结合结构域由SEQIDNO:64的核苷酸残基64-813编码。一方面，抗CD19结合结构域由SEQIDNO:65的核苷酸残基64-813编码。一方面，抗CD19结合结构域由SEQIDNO:66的核苷酸残基64-813编码。一方面，抗CD19结合结构域由SEQIDNO:67的核苷酸残基64-813编码。一方面，抗CD19结合结构域由SEQIDNO:68的核苷酸残基64-813编码。一方面，抗CD19结合结构域由SEQIDNO:69的核苷酸残基64-813编码。一方面，抗CD19结合结构域由SEQIDNO:70的核苷酸残基64-813编码。一方面，抗CD19结合结构域由SEQIDNO:71的核苷酸残基64-813编码。一方面，抗CD19结合结构域由SEQIDNO:72的核苷酸残基64-813编码。
一方面，本发明涵盖包含编码CAR的转基因的重组核酸构建体，其中所述核酸分子包含编码选自SEQIDNOS:61-72之一或多个的抗CD19结合结构域的核酸序列，其中该序列与编码胞内信号传导结构域的核酸序列相邻并在相同读框中。可以用于CAR中的示例性胞内信号传导结构域包括但不限于，例如CD3-ζ,CD28,4-1BB等的一个或多个胞内信号传导结构域。一些情况下，CAR可以包含CD3-ζ,CD28,4-1BB等的任何组合。一方面，本发明CAR构建体的核酸序列选自SEQIDNOS:85-96中的一个或多个。一方面，CAR构建体的核酸序列是SEQIDNO：85。一方面，CAR构建体的核酸序列是SEQIDNO：86。一方面，CAR构建体的核酸序列是SEQIDNO：87。一方面，CAR构建体的核酸序列是SEQIDNO：88。一方面，CAR构建体的核酸序列是SEQIDNO：89。一方面，CAR构建体的核酸序列是SEQIDNO：90。一方面，CAR构建体的核酸序列是SEQIDNO：91。一方面，CAR构建体的核酸序列是SEQIDNO：92。一方面，CAR构建体的核酸序列是SEQIDNO：93。一方面，CAR构建体的核酸序列是SEQIDNO：94。一方面，CAR构建体的核酸序列是SEQIDNO：95。一方面，CAR构建体的核酸序列是SEQIDNO：96。一方面，CAR构建体的核酸序列是SEQIDNO：97。一方面，CAR构建体的核酸序列是SEQIDNO：98。一方面，CAR构建体的核酸序列是SEQIDNO：99。
编码期望分子的核酸序列可以使用标准技术，使用本领域已知的重组方法获得，例如，从表达该基因的细胞筛选文库、从已知包括该基因的载体获得该基因、或直接从含有该基因的细胞和组织分离。备选地，目的核酸可以合成产生，而不进行克隆。
本发明包括可以直接转导至细胞中的、表达CAR的逆转录病毒和慢病毒载体构建体。
本发明还包括可以直接地转染至细胞中的RNA构建体。产生可以用于转染的mRNA的方法包括：用特别设计的引物体外转录(IVT)模板，之后添加polyA，以产生含有3’和5’非翻译序列(UTR)、5’帽子和/或内部核糖体进入位点(IRES)、待表达核酸和polyA尾(典型地50-2000个碱基长度)的构建体(SEQIDNO:118)。由此产生的RNA可以有效地转染不同类型的细胞。一个实施方案中，模板包括编码CAR的序列。在一个实施方案中，RNACAR载体通过电穿孔转导入T细胞。
抗原结合结构域
一方面，本发明CAR包含靶特异性结合元件(也称作抗原结合结构域)。该部分的选择取决于定义靶细胞表面的配体的类型和数量。例如，可以选择抗原结合结构域以识别这样的配体，所述配体作为靶细胞上与特定疾病状态相关的细胞表面标志发挥作用。由此，可以充当本发明CAR的抗原结合结构域的配体的细胞表面标志的例子包括，与病毒、细菌和寄生物感染、自身免疫疾病和癌细胞相关的那些细胞表面标志。
一方面，可以通过将特异性结合期望抗原的抗原结合结构域工程化掺入CAR中，使CAR介导的T细胞反应指向目的抗原。
一方面，包含抗原结合结构域的CAR部分包含靶向CD19的抗原结合结构域。一方面，抗原结合结构域靶向人CD19。一方面，CAR的抗原结合结构域与Nicholsonetal.Mol.Immun.34(16-17):1157-1165(1997)中描述的FMC63scFv片段具有相同或相似的结合特异性。
抗原结合结构域可以是与抗原结合的任何结构域，包括但不限于，单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体、及其功能性片段，包括但不限于，单结构域抗体如重链可变结构域(VH)、轻链可变结构域(VL)、和驼源纳米抗体(nanobody)的可变结构域(VHH)、以及本领域已知的发挥抗原结合结构域功能的替代性支架，例如重组纤连蛋白结构域，等。在一些情况下，有利的是，抗原结合结构域来源于CAR将最终用于的相同物种。例如，为了用于人类，对于CAR的抗原结合结构域，可能有利的是，包含人或人源化残基用于抗体或抗体片段的抗原结合结构域。
因此，一方面，抗原结合结构域包含人源化抗体或抗体片段。在一个实施方案中，人源化抗CD19结合结构域包含本文所述人源化抗CD19结合结构域的轻链互补决定区1(LCCDR1)、轻链互补决定区2(LCCDR2)和轻链互补决定区3(LCCDR3)之一个或多个(例如所有三个)、以及本文所述人源化抗CD19结合结构域的重链互补决定区1(HCCDR1)、重链互补决定区2(HCCDR2)和重链互补决定区3(HCCDR3)之一个或多个(例如所有三个)，例如，包含一个或多个(如所有三个)LCCDR和一个或多个(如所有三个)HCCDR的人源化抗CD19结合结构域。在一个实施方案中，人源化抗CD19结合结构域包含本文所述人源化抗CD19结合结构域的重链互补决定区1(HCCDR1)、重链互补决定区2(HCCDR2)和重链互补决定区3(HCCDR3)之一个或多个(例如所有三个)，例如，该人源化抗CD19结合结构域具有两个可变重链区，各包含本文所述HCCDR1、HCCDR2和HCCDR3。在一个实施方案中，人源化抗CD19结合结构域包含本文(例如表3)所述人源化轻链可变区和/或本文(例如表3)所述人源化重链可变区。在一个实施方案中，人源化抗CD19结合结构域包含本文(例如表3)所述人源化重链可变区，例如至少两个本文(例如表3)所述人源化重链可变区。在一个实施方案中，抗CD19结合结构域是包含表3的氨基酸序列的轻链和重链的scFv。在一个实施方案中，抗CD19结合结构域(例如scFv)包含：轻链可变区，其包含在表3所示轻链可变区的氨基酸序列上具有至少一个、两个或三个修饰(例如替代)但不超过30个、20个或10个修饰(例如替代)的氨基酸序列、或与表3的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列；和/或重链可变区，其包含在表3所示重链可变区的氨基酸序列上具有至少一个、两个或三个修饰(例如替代)但不超过30个、20个或10个修饰(例如替代)的氨基酸序列、或与表3的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，人源化抗CD19结合结构域包含选自SEQIDNO:1,SEQIDNO:2,SEQIDNO:3,SEQIDNO:4,SEQIDNO:5,SEQIDNO:6,SEQIDNO:7,SEQIDNO:8,SEQIDNO:9,SEQIDNO:10,SEQIDNO:11和SEQIDNO:12的序列、或与其具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，编码人源化抗CD19结合结构域的核酸序列包含选自SEQIDNO:61,SEQIDNO:62,SEQIDNO:63,SEQIDNO:64,SEQIDNO:65,SEQIDNO:66,SEQIDNO:67,SEQIDNO:68,SEQIDNO:70,SEQIDNO:71和SEQIDNO:72的序列、或与其具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，人源化抗CD19结合结构域是scFv,且包含本文(例如表3中)所述氨基酸序列的轻链可变区与包含本文(例如表3中)所述氨基酸序列的重链可变区通过接头,例如本文所述接头连接。在一个实施方案中，人源化抗CD19结合结构域包括(Gly4-Ser)n接头,其中n是1,2,3,4,5,或6,优选地3或4(SEQIDNO:53)。scFv的轻链可变区和重链可变区可以为例如以下的任何取向：轻链可变区-接头-重链可变区或重链可变区-接头-轻链可变区。
一方面，抗原结合结构域部分包含选自SEQIDNOS:1-12的一或多个序列。一方面，人源化CAR选自SEQIDNOS:31-42中的一个或多个序列。一些方面，非人抗体是人源化的，其中抗体的特定序列或区域被修饰以增加与天然产生于人体中的抗体或其片段的相似性。一方面，抗原结合结构域为人源化的。
人源化抗体可以使用本领域熟知的各种技术产生，包括但不限于CDR嫁接(参见例如欧洲专利号EP239,400；国际公布号WO91/09967；和美国专利号5,225,539,5,530,101,和5,585,089,每份文献均特此完整地并入此处作为参考)、镶饰(veneering)或表面重塑(resurfacing)(参见例如欧洲专利号EP592,106和EP519,596；Padlan,1991,MolecularImmunology,28(4/5):489-498；Studnicka等,1994,ProteinEngineering,7(6):805-814；和Roguska等,1994,PNAS,91:969-973，每份文献均特此完整地并入此处作为参考)、链改组(参见例如U.S.Pat.No.5,565,332,文献特此完整地并入此处作为参考),和公开在例如以下文献中的技术：美国专利申请公开号US2005/0042664,美国专利申请公开号US2005/0048617,美国专利号6,407,213,美国专利号5,766,886,国际公布号WO9317105,Tan等,J.Immunol.,169:1119-25(2002),Caldas等,ProteinEng.,13(5):353-60(2000),Morea等,Methods,20(3):267-79(2000),Baca等,J.Biol.Chem.,272(16):10678-84(1997),Roguska等,ProteinEng.,9(10):895-904(1996),Couto等,CancerRes.,55(23Supp):5973s-5977s(1995),Couto等,CancerRes.,55(8):1717-22(1995),SandhuJS,Gene,150(2):409-10(1994),和Pedersen等,J.Mol.Biol.,235(3):959-73(1994),每份文献均特此完整地并入此处作为参考。经常地，构架区中的构架残基被来自CDR供体抗体的相应残基替代，以改变例如改善抗原结合。这些构架替代物可以通过本领域熟知的方法鉴定，例如，通过模建CDR和构架残基的相互作用以鉴定对于抗原结合重要的构架残基、以及进行序列比较以鉴定在特定位置上的不寻常构架残基。(参见例如，Queen等,美国专利号5,585,089；和Riechmann等,1988,Nature,332:323,,每份文献均特此完整地并入此处作为参考)。
人源化抗体或抗体片段中保留来自非人来源的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常被称作“输入”残基，其典型地取自“输入”可变区。在本文中，人源化抗体或抗体片段包含来自非人免疫球蛋白分子的一个或多个CDR和构架区，其中包含构架的氨基酸残基完全地或大多数地来自人种系。本领域熟知多种用于将抗体或抗体片段人源化的技术，其基本上可以按照Winter及其同事的方法进行(Jonesetal.,Nature,321:522-525(1986)；Riechmannetal.,Nature,332:323-327(1988)；Verhoeyenetal.,Science,239:1534-1536(1988))，其中用啮齿类动物CDR或CDR序列替代相应的人抗体序列，即，CDR嫁接(EP239,400；PCT公布号WO91/09967；和U.S.Pat.Nos.4,816,567；6,331,415；5,225,539；5,530,101；5,585,089；6,548,640,文献内容特此完整地并入此处作为参考)。在此人源化抗体和抗体片段中，实质上少于全部的人可变结构域已经被来自非人物种的相应序列替代。人源化抗体常是人抗体，其中一些CDR残基和可能地一些构架(FR)残基被来自啮齿动物抗体中类似位点的残基替代。抗体和抗体片段的人源化也可以通过镶饰或表面重塑实现(EP592,106；EP519,596；Padlan,1991,MolecularImmunology,28(4/5)#489-498；Studnickaetal.,ProteinEngineering,7(6)：805-814(1994)；和Roguskaetal.,PNAS,91#969-973(1994))或通过链改组实现(U.S.Pat.No.5,565,332)，每份文献均特此完整地并入此处作为参考。
可以选择待用于制备人源化抗体的人可变结构域(重和轻两者)，以降低抗原性。根据所谓的“最佳匹配”(best-fit)方法，相对于已知人可变结构域序列的完整文库，筛选啮齿类抗体的可变结构域序列。然后，最接近啮齿类的人序列可以被接受为人构架(FR)用于人源化抗体(Simsetal.,J.Immunol.,151#2296(1993)；Chothiaetal.,J.Mol.Biol.,196#901(1987),文献内容特此完整地并入此处作为参考)。另一方法使用源自共有序列的特定构架，其中所述共有序列为具有特定亚组的轻链或重链的所有人抗体的共有序列。相同构架区可以用于几种不同人源化抗体。(参见例如，Nicholsonetal.Mol.Immun.34(16-17):1157-1165(1997)；Carteretal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；Prestaetal.,J.Immunol.,151:2623(1993),其内容特此完整地并入作为参考)。一些实施方案中，重链可变区的构架区，例如所有4个构架区，来源于VH4_4-59种系序列。一个实施方案中，构架区可以包含一个、两个、三个、四个、或五个修饰，例如替代，例如来自相应鼠序列(例如SEQIDNO:58的序列)的氨基酸。一个实施方案中，轻链链可变区的构架区，例如所有4个构架区，来源于VK3_1.25种系序列。一个实施方案中，该构架区可以包含一个、两个、三个、四个、或五个修饰，例如替代，例如来自相应鼠序列(例如SEQIDNO:58的序列)的氨基酸。
一些方面，本发明CAR组合物中包含抗体片段的部分是人源化的，保留对靶抗原的高度亲合力和其它有利的生物学性质。根据本发明一方面，人源化抗体和抗体片段通过如下方法制备：使用亲本和人源化序列的三维模型，分析亲本序列和各种概念人源化产物。三维免疫球蛋白模型是通常可获得的，并是本领域技术人员熟悉的。可获得描述和展示选定的候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序。通过对这些展示物的观察，可以分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能性中发挥的可能作用，例如，分析影响候选免疫球蛋白结合靶抗原的能力的残基。以此方式，可以从受体和输入序列选择和组合FR残基，以便实现期望的抗体或抗体片段特征，例如对靶抗原增加的亲合力。一般地，CDR残基直接地且最为实质性地参与影响抗原结合。
人源化抗体或抗体片段可以保持与原始抗体相似的抗原特异性，例如在本发明中，结合人CD19的能力。一些实施方案中，人源化抗体或抗体片段可以具有改善的与人CD19结合的亲和力和/或特异性。
一方面，抗CD19结合结构域的特征在于，抗体或抗体片段的特定功能特性或性质。例如，一方面，本发明CAR组合物中包含抗原结合结构域的部分特异地结合人CD19。一方面，抗原结合结构域与Nicholsonetal.Mol.Immun.34(16-17):1157-1165(1997)中描述的FMC63scFv片段具有相同或相似的人CD19结合特异性。一方面，本发明涉及包含抗体或抗体片段的抗原结合结构域，其中所述抗体结合结构域特异地结合CD19蛋白或其片段，其中所述抗体或抗体片段包含包括SEQIDNO:1-12的氨基酸序列的可变轻链和/或可变重链。一方面，抗原结合结构域包含选自SEQIDNOS:1-12的scFv的氨基酸序列。一些方面，scFv与前导序列相邻并在相同的读框中。一方面，前导序列是SEQIDNO：13中提供的多肽序列。
一方面，抗CD19结合结构域是片段，例如单链可变片段(scFv)。一方面，抗CD19结合结构域是Fv、Fab、(Fab')2、或双功能(例如双特异性)杂种抗体(例如Lanzavecchiaetal.,Eur.J.Immunol.17,105(1987))。一方面，本发明抗体和其片段以野生型的或增强的亲合力结合CD19蛋白。
一些情况中，scFv可以根据本领域已知的方法制备(参见例如Birdetal.,(1988)Science242：423-426和Hustonetal.,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：5879-5883)。scFv分子可以通过使用柔性多肽接头将VH和VL区连接在一起而产生。scFv分子可以含有具有优化的长度和/或氨基酸组成的接头(例如Ser-Gly接头)。接头长度可以很大地影响scFv的可变区折叠和相互作用的方式。事实上，如果使用短多肽接头(例如5-10个氨基酸)，可以防止链内折叠。此外也需要链间折叠以将两个可变区拉到一起以形成功能性表位结合位点。对于接头取向和大小的例子，参见例如Hollingeretal.1993ProcNatlAcad.Sci.U.S.A.90:6444-6448,U.S.PatentApplicationPublicationNos.2005/0100543,2005/0175606,2007/0014794,andPCTpublicationNos.WO2006/020258andWO2007/024715,并入此处作为参考。
scFv可以在其VL和VH区之间包含至少12,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,25,30,35,40,45,50,或更多个氨基酸残基的接头。接头序列可以包含任何天然氨基酸。一些实施方案中，接头序列包含氨基酸甘氨酸和丝氨酸。另一实施方案中，接头序列包含成组的甘氨酸和丝氨酸重复，例如(Gly4Ser)n(SEQIDNO:18)，其中n是等于或大于1的正整数。在一个实施方案中，接头可以是(Gly4Ser)4(SEQIDNO:106)或(Gly4Ser)3(SEQIDNO:107)。接头长度的变化可以保持或增强活性，在活性研究中引起优异的功效。
稳定性和突变
抗CD19结合结构域，例如scFv分子(例如可溶性scFv)，的稳定性可以参考常规对照scFv分子或全长抗体的生物物理性质(例如热稳定性)进行评价。一个实施方案中，人源化scFv具有热稳定性，在所描述的试验中该热稳定性比对照结合分子(例如常规scFv分子)的高大约0.1,大约0.25,大约0.5,大约0.75,大约1,大约1.25,大约1.5,大约1.75,大约2,大约2.5,大约3,大约3.5,大约4,大约4.5,大约5,大约5.5,大约6,大约6.5,大约7,大约7.5,大约8,大约8.5,大约9,大约9.5,大约10摄氏度,大约11摄氏度,大约12摄氏度,大约13摄氏度,大约14摄氏度,或大约15摄氏度。
抗CD19结合结构域例如scFv的改良热稳定性将随后被赋予到整个CART19构建体上，导致CART19构建体的改善治疗性质。抗CD19结合结构域例如scFv的热稳定性，相比常规抗体，可以提高至少大约2℃或3℃。一个实施方案中，抗CD19结合结构域，例如scFv，相比常规抗体，具有提高1℃的热稳定性。另一个实施方案中，抗CD19结合结构域，例如scFv，相比常规抗体，具有提高2℃的热稳定性。另一个实施方案中，相比常规抗体，本发明scFv具有提高4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15℃的热稳定性。可以例如在本文公开的scFv分子和该scFv的VH和VL所源自的抗体的scFv分子或Fab片段之间进行比较。可以使用本领域已知的方法测量热稳定性。例如，在一个实施方案中，可以测量Tm。测量Tm的方法和确定蛋白质稳定性的其它方法在下文中有更详细的描述。
scFv的突变(由可溶性scFv的人源化或直接诱变引起)可以改变该scFv的稳定性，并改善该scFv和CART19构建体的整体稳定性。可以使用量度例如Tm、温度变性和温度聚集，比较人源化scFv与鼠scFv的稳定性。
可以使用实施例中描述的试验，确定突变的scFv的结合能力。
一个实施方案中，抗CD19结合结构域，例如scFv包含至少一个由人源化过程引起的突变，由此该突变的scFv赋予CART19构建体改善的稳定性。另一实施方案中，抗CD19结合结构域，例如scFv包含至少1,2,3,4,5,6,7,8,9,10个由人源化过程引起的突变，由此该突变的scFv赋予CART19构建体改善的稳定性。
评价蛋白稳定性的方法
可以使用例如下述方法，评价抗原结合结构域的稳定性。此类方法允许确定多个热解折叠过渡，其中最不稳定的结构域首先解折叠、或限制协同解折叠的多结构域单位(例如，表现出单个解折叠过渡的多结构域蛋白)的整体稳定性阈值。可以以多种其它方式鉴定最不稳定的结构域。可以进行诱变以探测哪个结构域限制整体稳定性。此外，可以在通过DSC或其它光谱方法已知最不稳定的结构域将固有地解折叠的条件下，测定多结构域蛋白的蛋白酶抗性(Fontana,etal.,(1997)Fold.Des.,2:R17-26；Dimasietal.(2009)J.Mol.Biol.393:672-692)。一旦鉴定了最不稳定的结构域，可以使用编码该结构域(或其部分)的序列作为测试序列用于这些方法中。
a)热稳定性
组合物的热稳定性可以使用非限制性的本领域已知的生物物理或生物化学技术分析。在某些实施方案中，可以通过分析性光谱学，评价热稳定性。
一个示例性分析性光谱学方法是差示扫描量热法(DSC)。DSC使用量热仪，该量热仪对伴随大多数蛋白或蛋白结构域的解折叠的热吸收敏感(参见例如，Sanchez-Ruiz,etal.,Biochemistry,27:1648-52,1988)。为了确定蛋白质的热稳定性，将蛋白样品插入量热仪，升高温度直到Fab或scFv解折叠。蛋白质发生解折叠时的温度指示整体蛋白稳定性。
另一示例性分析性光谱学方法是圆二色谱(CD)。CD光谱测量组合物的光学活性随着温度增加而出现的变化。圆二色(CD)光谱测量由于结构的不对称性造成的左圆偏振光和右圆偏振光的吸收差异。由无序的或解折叠的结构导致的CD谱与由有序的或折叠的结构导致的CD谱十分不同。CD谱反映蛋白质对升温的变性效应的敏感性，并由此可以指示蛋白质的热稳定性(见vanMierloandSteemsma,J.Biotechnol.,79(3):281-98,2000)。
另一用于测量热稳定性的示例性分析光谱学方法是荧光发射光谱(参见vanMierlo和Steemsma，同上引文)。再一用于测量热稳定性的示例性分析光谱学方法是核磁共振(NMR)光谱法(参见例如vanMierlo和Steemsma，同上引文)。
组合物的热稳定性可以通过生物化学方法测量。示例性的用于评价热稳定性的生物化学方法是热攻击试验。在“热攻击试验”中，组合物接受一系列的升高温度一段设定的时间。例如，在一个实施方案中，对受试scFv分子或包含scFv分子的分子施予一系列的递增温度，为期例如1-1.5小时。然后，通过相关生物化学试验，测量蛋白质的活性。例如，如果蛋白质是结合蛋白(例如scFv或含scFv的多肽)，则可以通过功能性或定量性ELISA，测量该结合蛋白的结合活性。
此类试验可以以高通量形式进行，在实施例中公开了使用大肠杆菌(E.coli)和高通量筛选的试验。可以使用本领域已知的方法，构建抗CD19结合结构域(例如scFv)变体文库。可以诱导抗CD19结合结构域(例如scFv)表达，并对该抗CD19结合结构域(例如scFv)施加热攻击。可以测试攻击后的受试样品的结合，对稳定的那些抗CD19结合结构域(例如scFv)进行规模扩大和进一步表征。
可以使用上述任何技术(例如分析光谱学技术)，测量组合物的熔解温度(Tm)，评价热稳定性。熔解温度是热转变曲线(thermaltransitioncurve)中点的温度，在此组合物中50％的分子处于折叠态(参见例如Dimasietal.(2009)J.MolBiol.393:672-692)。在一个实施方案中，抗CD19结合结构域,例如scFv,的Tm值是大约40℃,41℃,42℃,43℃,44℃,45℃,46℃,47℃,48℃,49℃,50℃,51℃,52℃,53℃,54℃,55℃,56℃,57℃,58℃,59℃,60℃,61℃,62℃,63℃,64℃,65℃,66℃,67℃,68℃,69℃,70℃,71℃,72℃,73℃,74℃,75℃,76℃,77℃,78℃,79℃,80℃,81℃,82℃,83℃,84℃,85℃,86℃,87℃,88℃,89℃,90℃,91℃,92℃,93℃,94℃,95℃,96℃,97℃,98℃,99℃,100℃。在一个实施方案中，IgG的Tm值是大约40℃,41℃,42℃,43℃,44℃,45℃,46℃,47℃,48℃,49℃,50℃,51℃,52℃,53℃,54℃,55℃,56℃,57℃,58℃,59℃,60℃,61℃,62℃,63℃,64℃,65℃,66℃,67℃,68℃,69℃,70℃,71℃,72℃,73℃,74℃,75℃,76℃,77℃,78℃,79℃,80℃,81℃,82℃,83℃,84℃,85℃,86℃,87℃,88℃,89℃,90℃,91℃,92℃,93℃,94℃,95℃,96℃,97℃,98℃,99℃,100℃。在一个实施方案中，多价抗体的Tm值是大约40℃,41℃,42℃,43℃,44℃,45℃,46℃,47℃,48℃,49℃,50℃,51℃,52℃,53℃,54℃,55℃,56℃,57℃,58℃,59℃,60℃,61℃,62℃,63℃,64℃,65℃,66℃,67℃,68℃,69℃,70℃,71℃,72℃,73℃,74℃,75℃,76℃,77℃,78℃,79℃,80℃,81℃,82℃,83℃,84℃,85℃,86℃,87℃,88℃,89℃,90℃,91℃,92℃,93℃,94℃,95℃,96℃,97℃,98℃,99℃,100℃。
热稳定性也可以通过使用分析性量热技术(例如DSC)测量组合物的比热或热容(Cp)而评价。组合物的比热是上升1℃(1mol水的温度)所需的能量(例如，kcal/mol)。大Cp是变性或失活的蛋白质组合物的标志。组合物的热容改变(ΔCp)可以通过确定组合物在其热转变前和后的比热而测量。热稳定性也可以通过测量或确定其它热动力学稳定性参数，包括解折叠的吉布斯自由能(ΔG)、解折叠的焓(ΔH)、或解折叠的熵(ΔS)，来评价。可以用一个或多个上述生物化学试验(例如热攻击试验)，确定组合物的50％保持其活性(例如结合活性)时的温度(即TC值)。
此外，与未突变的抗CD19结合结构域(例如scFv)相比，抗CD19结合结构域(例如scFv)的突变可以改变该抗CD19结合结构域(例如scFv)的热稳定性。当将人源化的抗CD19结合结构域(例如scFv)并入CART19构建体中时，该抗CD19结合结构域(例如人源化scFv)可以赋予整个抗CD19CART构建体热稳定性。一个实施方案中，抗CD19结合结构域(例如scFv)包含可以赋予该抗CD19结合结构域(例如scFv)热稳定性的单突变。另一实施方案中，抗CD19结合结构域(例如scFv)包含可以赋予该抗CD19结合结构域(例如scFv)热稳定性的多突变。一个实施方案中，抗CD19结合结构域(例如scFv)中的多突变对该抗CD19结合结构域(例如scFv)的热稳定性产生加性效应。
b)％聚集
组合物的稳定性可以通过测量其聚集倾向而确定。可以通过多种非限制性的生物化学或生物物理学技术测量聚集。例如，可以使用色谱法，例如大小排阻色谱(SEC)，评价组合物的聚集。SEC基于大小分离分子。以半固体聚合物凝胶珠装柱，所述珠子可以允许离子和小分子进入其内部但不允许大分子进入。当将蛋白质组合物加至柱顶端后，与大蛋白聚集物可得的溶剂体积相比，致密折叠的蛋白质(即，未聚集蛋白质)通过更大的溶剂体积分布。因此，大聚集物更为快速地移动通过柱子，并以此方式可以将混合物分离或分级分离为组分。可以在从凝胶中洗脱后，分开地对每个级分进行定量(例如通过光散射)。因此，组合物的％聚集可以通过比较级分浓度和上样到凝胶上的蛋白质的总浓度而确定。稳定的组合物作为基本上单一的级分从柱子上洗脱，并在洗脱谱或色谱中表现为基本上单一的峰。
c)结合亲合力
组合物的稳定性可以通过确定其靶标结合亲合力而评价。本领域已知众多的确定结合亲合力的方法。一个示例性确定结合亲合力的方法使用表面等离子体共振。表面等离子体共振是一种光学现象，利用该现象，通过例如使用BIAcore系统(PharmaciaBiosensorAB,Uppsala,SwedenandPiscataway,N.J.)，检测生物传感器基质中蛋白浓度的变化，可以分析实时的生物特异性相互作用。对于进一步描述，参见Jonsson,U.,etal.(1993)Ann.Biol.Clin.51:19-26；Jonsson,U.,i(1991)Biotechniques11:620-627；Johnsson,B.,etal.(1995)J.Mol.Recognit.8:125-131；和Johnnson,B.,etal.(1991)Anal.Biochem.198:268-277。
一方面，CAR的抗原结合结构域包含与本文所述抗原结合结构域的氨基酸序列同源的氨基酸序列，并且该抗原结合结构域保持本文所述抗CD19抗体片段的期望功能性质。一个特定方面，本发明CAR组合物包含抗体片段。再一方面，该抗体片段包含scFv。
在多个方面，CAR的抗原结合结构域被工程化改造，其中修饰一个或两个可变区(例如VH和/或VL)中，例如一个或多个CDR区中和/或一个或多个构架区中的一个或多个氨基酸。一个特定方面，本发明CAR组合物包含抗体片段。再一方面，该抗体片段包含scFv。
本领域普通技术人员明了，可以进一步修饰本发明抗体或抗体片段，使其在氨基酸序列上发生变化(例如不同于野生型)但在期望活性上不变。例如，可以对蛋白质在“非必需”氨基酸残基位置实施导致氨基酸替代的其他核苷酸替代。例如，可以将分子中的非必需氨基酸残基替代为来自相同侧链家族的另一氨基酸残基。另一实施方案中，可以将一个氨基酸链替代为在侧链家族成员的组成上和/或顺序上不同的结构相似链，例如可以进行保守替代——将氨基酸残基替代为具有相似侧链的氨基酸残基。
本领域中已经鉴定了具有相似侧链的氨基酸残基的家族，包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)、和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
对于两个或两个以上核酸或多肽序列，同一性百分数涉及相同的两个或两个以上序列。当使用以下序列比较算法之一或通过手工比对和目视而将两个序列在比较窗或指定区域中比较并基于最大对应性而对齐后，如果两个序列具有规定百分数的相同氨基酸残基或核苷酸(例如，在规定区域中，或在未规定区域时在整个序列上，60％同一，任选地70％,71％.72％.73％,74％,75％,76％,77％,78％,79％,80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％同一)，则两个序列“基本上相同”。任选地，同一性存在于长度至少大约50个核苷酸(或10个氨基酸)的区域上，或更优选地长度100至500或1000或更多个核苷酸(或20、50、200或更多个氨基酸)的区域上。
为了序列比较，典型地，一个序列充当参考序列，与受试序列进行比较。当使用序列比较算法时，将受试序列和参考序列输入计算机，指定子序列坐标(如果必要的话)，并指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数，或可以指定替代参数。然后序列比较算法将基于程序参数计算受试序列相对于参考序列的百分数序列同一性。本领域熟知用于比较的序列比对方法。用于比较的最佳序列比对可以例如通过如下方式实现：Smith和Waterman,(1970)Adv.Appl.Math.2:482c的局部同源性算法；Needleman和Wunsch,(1970)J.Mol.Biol.48:443的同源性比对算法；Pearson和Lipman,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444的相似性搜索方法；这些算法的计算机化执行程序(GAP,BESTFIT,FASTA,和TFASTA，在WisconsinGenetics软件包中,GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.,Madison,WI)；或手工比对和目视检查(参见，例如Brentetal.,(2003)CurrentProtocolsinMolecularBiology)。
适用于确定百分数序列同一性和序列相似性的两个算法例子是BLAST和BLAST2.0算法，其分别描述在Altschuletal.,(1977)Nuc.AcidsRes.25:3389-3402；和Altschuletal.,(1990)J.Mol.Biol.215:403-410。实施BLAST分析的软件可以通过美国国立生物技术信息中心而为公众所获得。
也可以使用已经并入ALIGN程序(版本2.0)的E.MeyersandW.Miller,(1988)Comput.Appl.Biosci.4:11-17算法，使用PAM120权重残基表、12的空位长度罚分和4的空位罚分，确定两个氨基酸序列之间的同一性百分数。此外，可以使用已经并入GCG软件包GAP程序的Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:444-453算法(可从www.gcg.com获得),使用Blossom62矩阵或PAM250矩阵、以及16,14,12,10,8,6,或4的空位权重和1,2,3,4,5,或6的长度权重，确定两个氨基酸序列之间的同一性百分数。
一方面，本发明考虑修饰起始抗体或片段(例如scFv)氨基酸序列，产生功能性等价分子。例如，可以修饰包含在CAR中的抗CD19结合结构域(例如scFv)的VH或VL，以保留该抗CD19结合结构域(例如scFv)的起始VH或VL构架区的至少大约70％,71％.72％.73％,74％,75％,76％,77％,78％,79％,80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％同一性。本发明考虑修饰整个CAR构建体，例如在CAR构建体的多个结构域的一个或多个氨基酸序列中进行修饰，以产生功能性等价分子。可以修饰CAR构建体，以保留起始CAR构建体的至少大约70％,71％,72％,73％,74％,75％,76％,77％,78％,79％,80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％同一性。
跨膜结构域
就跨膜结构域而言，在多个实施方案中，CAR可以设计以包含与CAR的胞外结构域连接的跨膜结构域。跨膜结构域可以包括与该跨膜区相邻的一个或多个额外的氨基酸，例如与该跨膜区所源自的蛋白质的胞外区相关的一个或多个氨基酸(例如，该胞外区的1,2,3,4,5,6,7,8,9,10至多达15个氨基酸)，和/或与该跨膜区所源自的蛋白质的胞内区相关的一个或多个氨基酸(例如，该胞内区的1,2,3,4,5,6,7,8,9,10至多达15个氨基酸)。一方面，跨膜结构域是与CAR所用的其它结构域之一相关的跨膜结构域。一些情况下，跨膜结构域可以经选择或氨基酸替代修饰而避免该结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，例如，以最小化与受体复合物的其它成员的相互作用。一方面，跨膜结构域能够与CART细胞表面上的另一CAR发生同二聚化。一个不同方面，可以修饰或替代跨膜结构域的氨基酸序列，以最小化与相同CART中存在的天然结合配偶体的结合结构域的相互作用。
跨膜结构域可以来源于天然或重组来源。当来源是天然来源时，结构域可以源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。在一个方面，无论何时CAR与靶标结合，跨膜结构域均能够将信号传导至胞内结构域。在本发明中特别有用的跨膜结构域可以包括至少如下蛋白的跨膜区:例如,T细胞受体的α,β或ζ链,CD28,CD3ε,CD45,CD4,CD5,CD8,CD9,CD16,CD22,CD33,CD37,CD64,CD80,CD86,CD134,CD137和CD154。
一些情况下，跨膜结构域可以通过铰链例如来自人蛋白的铰链与CAR的胞外区，例如CAR的抗原结合结构域连接。例如，一个实施方案中，铰链可以是人Ig(免疫球蛋白)铰链，例如IgG4铰链，或CD8a铰链。一个实施方案中，铰链或间隔包含(例如为)SEQIDNO:14的氨基酸序列。一方面，跨膜结构域包含(例如为)SEQIDNO:15的跨膜结构域。
一方面，铰链或间隔包含IgG4铰链。例如，一个实施方案中，铰链或间隔包含如下氨基酸序列的铰链
ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKM
(SEQIDNO:45)。一些实施方案中，铰链或间隔包含由如下核苷酸序列编码的铰链
GAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCTGCCCCCGAGTTCCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAGCAGTTCAATAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGGCCTGCCCAGCAGCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCCAAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTCGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACACCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCCGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAGGGCAACGTCTTTAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAGATG(SEQIDNO:46).
一方面，铰链或间隔包含IgD铰链。例如，一个实施方案中，铰链或间隔包含具有如下氨基酸序列的铰链:
RWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGVYLLTPAVQDLWLRDKATFTCFVVGSDLKDAHLTWEVAGKVPTGGVEEGLLERHSNGSQSQHSRLTLPRSLWNAGTSVTCTLNHPSLPPQRLMALREPAAQAPVKLSLNLLASSDPPEAASWLLCEVSGFSPPNILLMWLEDQREVNTSGFAPARPPPQPGSTTFWAWSVLRVPAPPSPQPATYTCVVSHEDSRTLLNASRSLEVSYVTDH(SEQIDNO:47)。一些实施方案中，铰链或间隔包含由如下核苷酸序列编码的铰链AGGTGGCCCGAAAGTCCCAAGGCCCAGGCATCTAGTGTTCCTACTGCACAGCCCCAGGCAGAAGGCAGCCTAGCCAAAGCTACTACTGCACCTGCCACTACGCGCAATACTGGCCGTGGCGGGGAGGAGAAGAAAAAGGAGAAAGAGAAAGAAGAACAGGAAGAGAGGGAGACCAAGACCCCTGAATGTCCATCCCATACCCAGCCGCTGGGCGTCTATCTCTTGACTCCCGCAGTACAGGACTTGTGGCTTAGAGATAAGGCCACCTTTACATGTTTCGTCGTGGGCTCTGACCTGAAGGATGCCCATTTGACTTGGGAGGTTGCCGGAAAGGTACCCACAGGGGGGGTTGAGGAAGGGTTGCTGGAGCGCCATTCCAATGGCTCTCAGAGCCAGCACTCAAGACTCACCCTTCCGAGATCCCTGTGGAACGCCGGGACCTCTGTCACATGTACTCTAAATCATCCTAGCCTGCCCCCACAGCGTCTGATGGCCCTTAGAGAGCCAGCCGCCCAGGCACCAGTTAAGCTTAGCCTGAATCTGCTCGCCAGTAGTGATCCCCCAGAGGCCGCCAGCTGGCTCTTATGCGAAGTGTCCGGCTTTAGCCCGCCCAACATCTTGCTCATGTGGCTGGAGGACCAGCGAGAAGTGAACACCAGCGGCTTCGCTCCAGCCCGGCCCCCACCCCAGCCGGGTTCTACCACATTCTGGGCCTGGAGTGTCTTAAGGGTCCCAGCACCACCTAGCCCCCAGCCAGCCACATACACCTGTGTTGTGTCCCATGAAGATAGCAGGACCCTGCTAAATGCTTCTAGGAGTCTGGAGGTTTCCTACGTGACTGACCATT(SEQIDNO：48)
一方面，跨膜结构域可以是重组的，在此情形下其可以主要包含疏水残基例如亮氨酸和缬氨酸。一方面，苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸三联体可以存在于重组跨膜结构域的两端。
任选地，通过短寡肽或多肽接头(2至10个氨基酸长度)，可以在CAR的跨膜结构域和胞质区之间形成连接。甘氨酸-丝氨酸二联体提供尤其适宜的接头。例如，一方面，接头包含氨基酸序列GGGGSGGGGS(SEQIDNO:49)。在一些实施方案中，接头由GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC(SEQIDNO:50)的核苷酸序列编码。
胞质结构域
CAR的胞质结构域或区域包括胞内信号传导结构域。胞内信号传导结构域通常负责激活已经引入了CAR的免疫细胞的至少一种正常效应子功能。术语“效应子功能”是指细胞的特化功能。T细胞的效应子功能，例如，可以是细胞裂解活性或辅助活性，包括分泌细胞因子。因此，术语“胞内信号传导结构域”指蛋白质中可以转导效应子功能信号和指导细胞实现特化功能的部分。尽管通常可以使用整个胞内信号传导结构域，但许多情况下无需使用整条链。就使用胞内信号传导结构域的截短部分而言，只要该截短部分可以转导效应子功能信号，则可以使用该截短部分替代完整链。术语胞内信号传导结构域由此意在包括足以转导效应子功能信号的胞内信号传导结构域的任何截短部分。
可以用于本发明CAR中的胞内信号传导结构域的例子包括，T细胞受体(TCR)和共受体(两者在抗原受体缔合后协同起作用以起始信号转导)的胞质序列、以及这些序列的任何衍生物或变体、和具有相同功能性能力的任何重组序列。
已知，通过TCR单独产生的信号不足以完全激活T细胞，还需要第二和/或共刺激信号。因此，可以说，T细胞活化由两类不同的胞质信号传导序列介导：通过TCR起始抗原依赖性初始活化的序列(第一胞内信号传导结构域)、和以抗原非依赖性方式起作用以提供第二或共刺激信号的序列(第二胞质结构域，例如共刺激结构域)。
第一信号传导结构域以刺激方式或以抑制方式调节TCR复合物的初始活化。以刺激性方式起作用的第一胞内信号传导结构域可以含有称作免疫受体酪氨酸激活基序或ITAM的信号传导基序。
在本发明中尤其有用的含有ITAM的第一胞内信号传导结构域的例子包括，TCRζ、FcRγ,FcRβ,CD3γ,CD3δ,CD3ε,CD5,CD22,CD79a,CD79b,和CD66d的第一胞内信号传导结构域。在一个实施方案中，本发明CAR包含胞内信号传导结构域，例如CD3ζ的第一信号传导结构域。
一个实施方案中，第一信号传导结构域包含相对于天然ITAM结构域具有改变的(例如增加或减少的)活性的修饰ITAM结构域，例如突变的ITAM结构域。一个实施方案中，第一信号传导结构域包含含有修饰的ITAM的第一胞内信号传导结构域，例如，含有优化的和/或截短的ITAM的第一胞内信号传导结构域。一个实施方案中，第一信号传导结构域包含一个、两个、三个、四个或更多个ITAM基序。
CAR的胞内信号传导结构域可以包含CD3ζ信号传导结构域本身，或其可以与在本发明CAR中有用的任何其它期望的胞内信号传导结构域组合。例如，CAR的胞内信号传导结构域可以包含CD3ζ链部分和共刺激信号传导结构域。共刺激信号传导结构域指，CAR中包含共刺激分子的胞内结构域的部分。共刺激分子是非抗原受体或其配体的细胞表面分子，其是淋巴细胞对抗原产生有效应答所必需的。此类分子的例子包括CD27,CD28,4-1BB(CD137),OX40,CD30,CD40,PD1,ICOS,淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1),CD2,CD7,LIGHT,NKG2C,B7-H3,和特异性结合CD83的配体，等等。例如，CD27共刺激已经被证实可以体外增强人CART细胞的扩增、效应子功能、和存活，以及体内提高人T细胞的持久性和抗肿瘤活性(Song等，Blood.2012；119(3):696-706)。
在本发明CAR的胞质部分中胞内信号传导序列可以以随机或规定的顺序彼此连接。可选地，短寡肽或多肽接头，例如2-10个氨基酸长度(例如2,3,4,5,6,7,8,9,或10个氨基酸)，可以在胞内信号传导序列之间形成连接。一个实施方案中，甘氨酸-丝氨酸二联体可以用作适宜的接头。一个实施方案中，可以使用单氨基酸，例如丙氨酸、甘氨酸作为合适的接头。
一方面，设计胞内信号传导结构域，以包含两个或更多个例如2、3、4、5或更多个共刺激信号传导结构域。一个实施方案中，该两个或更多个，例如2、3、4、5或更多个共刺激信号传导结构域通过接头分子，例如本文所述接头分子分开。一个实施方案中，胞内信号传导结构域包含两个共刺激信号传导结构域。一些实施方案中，接头分子是甘氨酸残基。一些实施方案中，接头是丙氨酸残基。
一方面，设计胞内信号传导结构域，以包含CD3-ζ的信号传导结构域和CD28的信号传导结构域。一方面，设计胞内信号传导结构域，以包含CD3-ζ的信号传导结构域和4-1BB的信号传导结构域。一方面，4-1BB的信号传导结构域是SEQIDNO:16的信号传导结构域。一方面，CD3-ζ的信号传导结构域是SEQIDNO:17的信号传导结构域。
一方面，设计胞内信号传导结构域，以包含CD3-ζ的信号传导结构域和CD27的信号传导结构域。一方面，CD27的信号传导结构域包含氨基酸序列
QRRKYRSNKGESPVEPAEPCRYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP(SEQIDNO:51)一方面，CD27的信号传导结构域由如下核苷酸序列编码
AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC(SEQIDNO:52)
一方面，本文所述CAR表达细胞可以进一步包含第二CAR，例如包括不同抗原结合结构域(例如针对相同靶标(CD19)或不同靶标(例如，CD123))的第二CAR。一个实施方案中，当CAR表达细胞包含两种或更多种不同CAR时，这些不同CAR的抗原结合结构域可以是彼此无相互作用的抗原结合结构域。例如，表达第一和第二CAR的细胞可以具有这样的第一CAR的抗原结合结构域，例如片段，例如scFv,该第一CAR的抗原结合结构域与第二CAR的抗原结合结构域不形成结合，例如该第二CAR的抗原结合结构域是VHH。
另一方面，本文所述CAR表达细胞还可以表达另外的活性剂，例如增强CAR表达细胞活性的活性剂。例如，一个实施方案中，所述活性剂可以是抑制抑制性分子的活性剂。抑制性分子例如PD1可以在一些实施方案中降低CAR表达细胞发动免疫效应子反应的能力。抑制性分子的例子包括PD1,PD-L1,CTLA4,TIM3,LAG3,VISTA,BTLA,TIGIT,LAIR1,CD160,2B4和TGFRβ。一个实施方案中，抑制抑制性分子的活性剂包含第一多肽，例如抑制性分子，其中所述第一多肽与向细胞提供阳性信号的第二多肽，例如本文所述胞内信号传导结构域，结合。一个实施方案中，活性剂包含第一多肽和第二多肽，其中所述第一多肽是例如抑制性分子，例如PD1,LAG3,CTLA4,CD160,BTLA,LAIR1,TIM3,2B4和TIGIT，或其任一的片段(例如，其任一的胞外域的至少一部分)，其中所述第二多肽是本文所述胞内信号传导结构域(例如，包含共刺激结构域(例如,41BB,CD27或CD28,例如，如本文所述)和/或第一信号传导结构域(例如本文所述CD3ζ信号传导结构域))。一个实施方案中，活性剂包含第一多肽和第二多肽，其中所述第一多肽是PD1或其片段(例如，PD1的胞外域的至少一部分)，其中所述第二多肽是本文所述胞内信号传导结构域(例如，本文所述CD28信号传导结构域和/或本文所述CD3ζ信号传导结构域)。PD1是CD28受体家族的抑制性成员，该受体家族还包括CD28,CTLA-4,ICOS,和BTLA。PD-1在活化的B细胞、T细胞和髓样细胞上表达(Agata等，1996Int.Immunol8:765-75)。PD1的两个配体，PD-L1和PD-L2，已经被证实在与PD1结合后下调T细胞活化(Freemaneta.2000JExpMed192:1027-34；Latchmanetal.2001NatImmunol2:261-8；Carteretal.2002EurJImmunol32:634-43)。PD-L1大量存在于人癌症中(Dongetal2003JMolMed81:281-7；Blanketal2005CancerImmunolImmunother54:307-314；Konishietal2004ClinCancerRes10：5094)。可以通过抑制PD1与PD-L1的局部相互作用，逆转免疫抑制。
一个实施方案中，活性剂包含抑制性分子例如程序化死亡分子1(PD1)的胞外域(ECD)，其可以与跨膜结构域和胞内信号传导结构域例如41BB和CD3ζ融合(在本文中也称作PD1CAR)。一个实施方案中，PD1CAR，当与本文所述CD19CAR组合使用时，改善T细胞的持久性。在一个实施方案中，CAR是包含SEQIDNO：121中以下划线指出的PD1胞外域的PD1CAR。在一个实施方案中，PD1CAR包含SEQIDNO：121的氨基酸序列。
MalpvtalllplalllhaarppgwffdspdrpwnPptfspallvvtegdnatftcsfsntsesfvlnwyrmspsnqtdk laafpcdrsqpgqdcrfrvtqlpngrdfhmsvvrarndsgtylcgaislapkaqikcslraclrvtcrracvptahpspsprpagqfqtl vtttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalPPr(SEQIDNO：121).
在一个实施方案中，PD1CAR包含以下提供的氨基酸序列(SEQIDNO：119)。
pgwfldspdrpwnpptfspallvvtegdnatftcsfsntsesfvlnwyrmspsnqtdklaafpedrsqpgqdcrfrvt qlpngrdfhmsvvrarrndsgtylcgaislapkaqikeslraelrvterraevptahpspsprpagqfqtlvtttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(SEQIDNO：119).
在一个实施方案中，活性剂包含编码PD1CAR，例如本文所述PD1CAR的核酸序列。在一个实施方案中，PD1CAR的核酸序列显示如下，其中在SEQIDNO：120中以下划线指出PD1ECD：
atggccctccctgtcactgccctgcttctccccctcgcactcctgctccacgccgctagaccacccggatggtttctggac tctccggatcgcccgtggaatcccccaaccttctcaccggcactcttggttgtgactgagggcgataatgcgaccttcacgtgctcgttctc caacacctccgaatcattcgtgctgaactggtaccgcatgagcccgtcaaaccagaccgacaagctcgccgcgtttccggaagatcggt cgcaaccggggacaggattgtcggttccgcgtgactcaactgccgaatggcagagacttccacatgagcgtggtccgcgctaggcgaaa cgactccgggacctacctgtgcggagccatctcgctggcgcctaaggcccaaatcaaagagagcttgagggccgaactgagagtgac cgagcgcagagctgaggtgccaactgcacatccatccccatcgcctcggcctgcggggcagtttcagaccctggtcacgaccactccggcgccgcgcccaccgactccggccccaactatcgcgagccagcccctgtcgctgaggccggaagcatgccgccctgccgccggaggtgctgtgcatacccggggattggacttcgcatgcgacatctacatttgggctcctctcgccggaacttgtggcgtgctccttctgtccctggtcatcaccctgtactgcaagcggggtcggaaaaagcttctgtacattttcaagcagcccttcatgaggcccgtgcaaaccacccaggaggaggacggtgctcctgccggttccccgaagaggaagaaggaggttgcgagctgcgcgtgaagttctcccggagcgccgacgcccccgcctataagcagggccagaaccagctgtacaacgaactgaacctgggacggcgggaagagtacgatgtgctggacaagcggcgcggccgggaccccgaaatgggcgggaagcctagaagaaagaaccctcaggaaggcctgtataacgagctgcagaaggacaagatggccgaggcctactccgaaattgggatgaagggagagcggcggaggggaaaggggcacgacggcctgtaccaaggactgtccaccgccaccaaggacacatacgatgccctgcacatgcaggcccttccccctcgc(SEQIDNO：120).
另一方面，本发明提供CAR表达细胞例如CART细胞群。一些实施方案中，CAR表达细胞群包含表达不同CAR的细胞的混合物。例如，一个实施方案中，CART细胞群可以包括第一细胞和第二细胞，第一细胞表达具有本文所述抗CD19结合结构域的CAR，第二细胞表达具有不同抗CD19结构域(例如，与第一细胞表达的CAR中的抗CD19结合结构域不同的、本文描述的抗CD19结合结构域)的CAR。另一实例，CAR表达细胞群可以包括第一细胞和第二细胞，第一细胞表达包括(如本文所述的)抗CD19结合结构域的CAR，第二细胞表达包括针对非CD19靶(例如CD123)的抗原结合结构域的CAR。一个实施方案中，CAR表达细胞群包括例如第一细胞和第二细胞，第一细胞表达包括第一胞内信号传导结构域的CAR，第二细胞表达包括第二信号传导结构域的CAR。
另一方面，本发明提供细胞群，其中群体中至少一种细胞表达具有本文所述抗CD19结构域的CAR，第二细胞表达其它活性剂，例如，增强CAR表达细胞的活性的活性剂。例如，一个实施方案中，所述活性剂可以是抑制抑制性分子的活性剂。抑制性分子例如可以在一些实施方案中降低CAR表达细胞发动免疫效应子反应的能力。抑制性分子的例子包括PD1,PD-L1,CTLA4,TIM3,LAG3,VISTA,BTLA,TIGIT,LAIR1,CD160,2B4和TGFRβ。一个实施方案中，抑制抑制性分子的活性剂包含第一多肽，例如抑制性分子，其中所述第一多肽与向细胞提供阳性信号的第二多肽，例如本文所述胞内信号传导结构域，结合。一个实施方案中，活性剂包含第一多肽和第二多肽，其中所述第一多肽是例如抑制性分子，例如PD1,CTLA4,TIM3,LAG3,VISTA,BTLA,TIGIT,LAIR1,CD160,2B4和TGFRβ，或其任一的片段(例如，其任一的胞外域的至少一部分)，其中所述第二多肽是本文所述胞内信号传导结构域(例如，包含共刺激结构域(例如,41BB,CD27或CD28,例如，如本文所述)和/或第一信号传导结构域(例如本文所述CD3ζ信号传导结构域))。一个实施方案中，活性剂包含第一多肽和第二多肽，其中所述第一多肽是PD1或其片段(例如，PD1的胞外域的至少一部分)，其中所述第二多肽是本文所述胞内信号传导结构域(例如，本文所述CD28信号传导结构域和/或本文所述CD3ζ信号传导结构域)。
RNA转染
本文公开用于产生体外转录的RNACAR的方法。本发明还包括编码CAR的RNA构建体，其可以直接地转染至细胞中。用于产生可以用于转染的mRNA的方法可以包括：用特别设计的引物体外转录(IVT)模板，之后添加polyA，以产生含有3'和5'非翻译序列(“UTR”)、5'帽子和/或内部核糖体进入位点(IRES)、待表达核酸和polyA尾(典型地50-2000个碱基长度)(SEQIDNO:118)的构建体。由此产生的RNA可以有效地转染不同类型的细胞。一个实施方案中，模板包括编码CAR的序列。
一方面，抗CD19CAR由信使RNA(mRNA)编码。一个方面，将编码抗CD19CAR的mRNA引入T细胞中以产生CART细胞。
一个实施方案中，可以将体外转录的RNACAR以瞬时转染的形式引入细胞。该RNA可以使用聚合酶链式反应(PCR)产生的模板，通过体外转录而产生。来自任何来源的目的DNA均可以通过PCR直接地转化为模板，并利用合适的引物和RNA聚合酶以体外合成mRNA。该DNA的来源可以是例如基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、cDNA、合成的DNA序列、或任何其它合适的DNA来源。用于体外转录的期望模板是本发明的CAR。例如，RNACAR的模板可以包含含有抗肿瘤抗体的单链可变结构域的胞外区；铰链区，跨膜结构域(例如CD8a的跨膜结构域)；和包括胞内信号传导结构域(例如包含CD3-ζ的信号传导结构域和4-1BB的信号传导结构域)的胞质区。
一个实施方案中，待用于PCR的DNA包含开放阅读框。该DNA可以来自生物体基因组的天然DNA序列。一个实施方案中，该核酸可以包括5’和/或3’非翻译区(UTR)的一些或全部。该核酸可以包括内含子和外显子。一个实施方案中，待用于PCR的DNA是人核酸序列。另一实施方案中，待用于PCR的DNA是包括5'和3'UTR的人核酸序列。该DNA可以备选地是正常不在天然生物体中表达的人工DNA序列。一个示例性人工DNA序列含有连接在一起以形成编码融合蛋白的开放阅读框的基因的部分。这些连接在一起的DNA部分可以来自单个生物体，或来自一种以上的生物。
可以使用PCR产生用于体外转录mRNA的模板，其中所述mRNA可以用于转染。本领域熟知实施PCR的方法。可以设计用于PCR的引物，以具有与待用作PCR模板的DNA的区域实质性互补的区域。“实质性互补”在本文中指这样的核苷酸序列，其中该引物序列中的大多数或全部的碱基是互补的，或一个或多个碱基是不互补的或错配的。实质性互补序列能够与目的DNA靶标在用于PCR的退火条件下退火或杂交。可以设计引物以实质性互补于DNA模板的任何部分。例如，可以设计引物，以扩增正常在细胞中转录的核酸部分(开放阅读框)，包括5'和3'UTRs。也可以设计引物，以扩增编码目的特定结构域的核酸部分。一个实施方案中，可设计引物，以扩增人cDNA的编码区，包括5'和3'UTRs的全部或部分。用于PCR的引物可以通过本领域熟知的合成方法产生。“正向引物”是含有与DNA模板上待扩增DNA序列上游的核苷酸实质性互补的核苷酸区域的引物。“上游”在本文中用于指，相对于编码链而言，位于待扩增DNA序列的5’的位置。“反向引物”是含有与待扩增DNA序列下游的双链DNA模板实质性互补的核苷酸区域的引物。“下游”在本文中用于指，相对于编码链而言，位于待扩增DNA序列的3’的位置。
可以用于PCR的任何DNA聚合酶均可以用于本文公开的方法中。试剂和聚合酶可以从多个来源商购获得。
也可以使用能够促进稳定性和/或翻译效率的化学结构。RNA优选具有5'和3'UTRs。一个实施方案中，5'UTR长1至3000个核苷酸。加到编码区上的5'和3'UTR序列的长度可以通过不同方法改变，包括但不限于，设计与UTR的不同区域退火的PCR引物。使用该方法，本领域普通技术人员可以修饰所需的5'和3'UTR长度，以在转录的RNA转染后实现最佳的翻译效率。
对于目的核酸，5'和3'UTRs可以是天然的、内源的5'和3'UTRs。或者，可以通过将对于目的核酸而言非内源的UTR序列并入正向和反向引物中，或通过对模板的任何其它修饰，以加入该UTR序列。可以通过使用对于目的核酸而言非内源的UTR序列，改变RNA的稳定性和/或翻译效率。例如，已知3'UTR序列中富AU元件可以降低mRNA的稳定性。因此，可以基于本领域已知的UTR的性质，选择或设计3'UTRs以增加转录的RNA的稳定性。
一个实施方案中，5'UTR可以包含内源核酸的Kozak序列。或者，当通过如上所述PCR添加相对于目的核酸而言非内源的5'UTR时，可以通过加入该5'UTR序列而重新设计共有Kozak序列。Kozak序列可以增加一些RNA转录物的翻译效率，但似乎不是所有RNA实现有效翻译所必需的。本领域已知许多mRNA对Kozak序列的要求。其它实施方案中，5'UTR可以是RNA病毒的5'UTR，其中所述RNA病毒的RNA基因组在细胞中是稳定的。其它实施方案中，可以在3'或5'UTR中使用各种核苷酸类似物以阻碍mRNA的外切核酸酶降解。
为了从DNA模板合成RNA而无需基因克隆，应当将转录启动子与DNA模板连接，置于待转录的序列的上游。当将发挥RNA聚合酶启动子功能的序列加至正向引物的5’末端时，该RNA聚合酶启动子将并入PCR产物中位于待转录的开放阅读框上游。一个优选实施方案中，启动子是T7聚合酶启动子，见本文其它地方的描述。其它有用的启动子包括但不限于，T3和SP6RNA聚合酶启动子。本领域已知T7、T3和SP6启动子的共有核苷酸序列。
在一个优选实施方案中，mRNA具有5’末端帽子和3’poly(A)尾，其决定核糖体结合、翻译起始和mRNA在细胞中的稳定性。在环状DNA模板上，例如，质粒DNA上，RNA聚合酶产生长的连环体产物，该产物不适于在真核细胞中表达。转录在3’UTR末端线性化的质粒DNA，可以导致正常大小的mRNA，该mRNA即使在转录后可以被多腺苷酸化，在真核生物转染中也是无效的。
在线性DNA模板上，噬菌体T7RNA聚合酶可以延长转录物的3’末端以超过模板的最后一个碱基(SchenbornandMierendorf,NucAcidsRes.,13:6223-36(1985)；NachevaandBerzal-Herranz,Eur.。J.Biochem.,270:1485-65(2003)。
分子克隆是将polyA/T链整合入DNA模板中的常规方法。然而，加入质粒DNA中的polyA/T序列可造成质粒不稳定，这就是为什么从细菌细胞中获得的质粒DNA模板常常被缺失和其它异常高度污染的原因。这使得克隆程序不仅仅是费力的费时的，而且常常是不可靠的。因此，高度期望无需克隆而允许构建带有polyA/T3’链的DNA模板的方法。
可以通过含有polyT尾,例如100T尾(SEQIDNO:110)的反向引物(大小可以是50-5000T(SEQIDNO:111))在PCR期间，或通过任何其它方法(包括但不限于DNA连接或体外重组)在PCR之后，产生转录DNA模板的polyA/T片段。Poly(A)尾也可以赋予RNA稳定性，减少其降解。一般地，poly(A)尾的长度与转录的RNA的稳定性正相关。一个实施方案中，poly(A)尾为100至5000个腺苷(SEQIDNO:112)。
RNA的poly(A)尾可以在体外转录后使用poly(A)聚合酶，例如大肠杆菌polyA聚合酶(E-PAP)进一步延长。一个实施方案中，将poly(A)尾的长度从100个核苷酸增加至300到400个核苷酸(SEQIDNO:113)导致RNA翻译效率的大约2倍增加。此外，在3’末端连接不同化学基团也可以增加mRNA稳定性。该连接物可以含有修饰的/人工的核苷酸、适体(aptamer)和其它化合物。例如，ATP类似物可以使用poly(A)聚合酶加入poly(A)尾中。ATP类似物可以进一步增加RNA的稳定性。
5’帽子也可以向RNA分子提供稳定性。在一个优选实施方案中，通过本文方法产生的RNA包括5’帽子。5’帽子可以使用本领域已知和本文描述的技术提供(Cougot,etal.,TrendsinBiochem.Sci.,29:436-444(2001)；Stepinski,etal.,RNA,7:1468-95(2001)；Elango,etal.,Biochim.Biophys.Res.Commun.,330:958-966(2005))。.
通过本文所述方法产生的RNA也可以含有内部核糖体进入位点(IRES)序列。IRES序列可以是任何病毒的、染色体的或人工设计的序列，其可以起始帽子非依赖性的核糖体与mRNA的结合、以及促进翻译起始。可以包括适于细胞电穿孔的任何溶质，所述溶质可以含有利于细胞通透性和存活力的因素，例如糖、肽、脂质、蛋白质、抗氧化剂、和表面活性剂。
可以使用多种不同方法将RNA引入靶细胞，例如，商业可得方法，包括但不限于，电穿孔(AmaxaNucleofector-II(AmaxaBiosystems,Cologne,Germany)),(ECM830(BTX)(HarvardInstruments,Boston,Mass.)或GenePulserII(BioRad,Denver,Colo.),Multiporator(Eppendort,HamburgGermany),使用脂转染的阳离子脂质体介导的转染、聚合物囊化、肽介导的转染、或生物轰击粒子递送系统例如“基因枪”(参见例如,Nishikawa,etal.HumGeneTher.,12(8):861-70(2001)。
编码CAR的核酸构建体
本发明还提供编码一个或多个本文所述CAR构建体的核酸分子。一方面，核酸分子以信使RNA转录物的形式提供。一方面，核酸分子以DNA构建体的形式提供。
因此，一方面，本发明涉及编码嵌合抗原受体(CAR)的分离核酸分子，其中CAR包含抗CD19结合结构域(例如人源化抗CD19结合结构域)、跨膜结构域、和胞内信号传导结构域，其中所述胞内信号传导结构域包含刺激结构域，例如共刺激信号传导结构域和/或第一信号传导结构域，例如ζ链。在一个实施方案中，抗CD19结合结构域是本文所述抗CD19结合结构域，例如包含选自SEQIDNO:1,SEQIDNO:2,SEQIDNO:3,SEQIDNO:4,SEQIDNO:5,SEQIDNO:6,SEQIDNO:7,SEQIDNO:8,SEQIDNO:9,SEQIDNO:10,SEQIDNO:11,和SEQIDNO:12的序列、或与其具有95-99％同一性的序列的抗CD19结合结构域。在一个实施方案中，跨膜结构域是选自以下的蛋白的跨膜结构域：T细胞受体的α,β或ζ链,CD28,CD3ε,CD45,CD4,CD5,CD8,CD9,CD16,CD22,CD33,CD37,CD64,CD80,CD86,CD134,CD137和CD154。在一个实施方案中，跨膜结构域包含SEQIDNO:15的序列、或与其具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，抗CD19结合结构域与跨膜结构域通过铰链区,例如本文所述的铰链连接。在一个实施方案中，铰链区包含SEQIDNO:14或SEQIDNO:45或SEQIDNO:47或SEQIDNO:49、或与其具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，分离的核酸分子还包含编码共刺激结构域的序列。在一个实施方案中，共刺激结构域是选自以下的蛋白的功能性信号传导结构域：OX40,CD27,CD28,CDS,ICAM-1,LFA-1(CD11a/CD18),ICOS(CD278)和4-1BB(CD137)。在一个实施方案中，共刺激结构域包含SEQIDNO:16的序列、或与其具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，胞内信号传导结构域包含4-1BB的功能性信号传导结构域和CD3ζ的功能性信号传导结构域。在一个实施方案中，胞内信号传导结构域包含SEQIDNO:16或SEQIDNO:51的序列或与其具有95-99％同一性的序列、以及SEQIDNO:17或SEQIDNO:43的序列或与其具有95-99％同一性的序列,其中包含胞内信号传导结构域的这些序列在相同的读框中作为单个多肽链表达。
另一方面，本发明涉及编码CAR构建体的分离核酸分子，所述CAR构建体包含SEQIDNO:13的前导序列、具有选自SEQIDNO:1,SEQIDNO:2,SEQIDNO:3,SEQIDNO:4,SEQIDNO:5,SEQIDNO:6,SEQIDNO:7,SEQIDNO:8,SEQIDNO:9,SEQIDNO:10,SEQIDNO:11,和SEQIDNO:12的序列(或与其具有95-99％同一性的序列)的scFv结构域、SEQIDNO:14或SEQIDNO:45或SEQIDNO:47或SEQIDNO:49(或与其具有95-99％同一性的序列)的铰链区、具有SEQIDNO:15的序列(或与其具有95-99％同一性的序列)的跨膜结构域、具有SEQIDNO:16的序列的4-1BB共刺激结构域或具有SEQIDNO:51的序列的CD27共刺激结构域(或与其具有95-99％同一性的序列)、和具有SEQIDNO:17或SEQIDNO:43(或与其具有95-99％同一性的序列)的CD3ζ刺激结构域。
另一方面，本发明涉及核酸分子编码的分离多肽分子。在一个实施方案中，分离的多肽分子包含选自SEQIDNO:31,SEQIDNO:32,SEQIDNO:33,SEQIDNO:34,SEQIDNO:35,SEQIDNO:36,SEQIDNO:37,SEQIDNO:38,SEQIDNO:39,SEQIDNO:40,SEQIDNO:41和SEQIDNO:42的序列、或与其具有95-99％同一性的序列。
另一方面，本发明涉及编码嵌合抗原受体(CAR)分子的核酸分子，所述CAR分子包含抗CD19结合结构域、跨膜结构域、和包含刺激结构域的胞内信号传导结构域，其中所述抗CD19结合结构域包含选自SEQIDNO:1,SEQIDNO:2,SEQIDNO:3,SEQIDNO:4,SEQIDNO:5,SEQIDNO:6,SEQIDNO:7,SEQIDNO:8,SEQIDNO:9,SEQIDNO:10,SEQIDNO:11,和SEQIDNO:12的序列、或与其具有95-99％同一性的序列。
在一个实施方案中，编码的CAR分子还包含编码共刺激结构域的序列。在一个实施方案中，共刺激结构域是选自以下蛋白的功能性信号传导结构域：OX40,CD27,CD28,CDS,ICAM-1,LFA-1(CD11a/CD18)和4-1BB(CD137)。在一个实施方案中，共刺激结构域包含SEQIDNO：16的序列。在一个实施方案中，跨膜结构域是选自以下的蛋白的跨膜结构域：T细胞受体的α,β或ζ链,CD28,CD3ε,CD45,CD4,CD5,CD8,CD9,CD16,CD22,CD33,CD37,CD64,CD80,CD86,CD134,CD137和CD154。在一个实施方案中，跨膜结构域包含SEQIDNO：15的序列。在一个实施方案中，胞内信号传导结构域包含4-1BB的功能性信号传导结构域和ζ的功能性信号传导结构域。在一个实施方案中，胞内信号传导结构域包含SEQIDNO:16的序列和SEQIDNO:17的序列,其中包含胞内信号传导结构域的这些序列在相同读框中作为单一多肽链表达。在一个实施方案中，抗CD19结合结构域通过铰链区与跨膜结构域连接。在一个实施方案中，铰链区包含SEQIDNO：14。在一个实施方案中，铰链区包含SEQIDNO:45或SEQIDNO:47或SEQIDNO:49。
另一方面，本发明涉及编码的CAR分子，所述CAR分子包含：SEQIDNO:13的前导序列；具有选自SEQIDNO:1,SEQIDNO:2,SEQIDNO:3,SEQIDNO:4,SEQIDNO:5,SEQIDNO:6,SEQIDNO:7,SEQIDNO:8,SEQIDNO:9,SEQIDNO:10,SEQIDNO:11,和SEQIDNO:12的序列或与其具有95-99％同一性的序列的scFv结构域；SEQIDNO:14或SEQIDNO:45或SEQIDNO:47或SEQIDNO:49的铰链区；具有SEQIDNO:15的序列的跨膜结构域；具有SEQIDNO:16的序列的4-1BB共刺激结构域或具有SEQIDNO:51的序列的CD27共刺激结构域；和具有SEQIDNO:17或SEQIDNO:43的序列的CD3ζ刺激结构域。在一个实施方案中，编码的CAR分子包含选自SEQIDNO:31,SEQIDNO:32,SEQIDNO:33,SEQIDNO:34,SEQIDNO:35,SEQIDNO:36,SEQIDNO:37,SEQIDNO:38,SEQIDNO:39,SEQIDNO:40,SEQIDNO:41和SEQIDNO:42的序列、或与其具有95-99％同一性的序列。
编码期望分子的核酸序列可以使用标准技术，使用本领域已知的重组方法获得，例如，自表达该基因的细胞进行文库筛选、从已知包括该基因的载体获得该基因、或直接从含有该基因的细胞和组织分离。备选地，目的基因可以合成产生，而不进行克隆。
本发明还提供其中插入了本发明DNA的载体。源自逆转录病毒如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，这是因为其允许转基因长期稳定整合和在子代细胞中扩增。相对于来源于致癌逆转录病毒例如鼠白血病病毒的载体，慢病毒载体具有额外的优势——其可以转导非增殖细胞，例如肝细胞。慢病毒载体还具有低免疫原性的额外优势。
在另一个实施方案中，包含编码期望CAR的本发明核酸的载体是腺病毒载体(A5/35)。另一实施方案中，编码CAR的核酸的表达可以使用转座子，例如sleepingbeauty,crisper,CAS9,和锌指核酸酶实现。参见以下Juneetal.2009NatureReviewsImmunology9.10:704-716，并入此处作为参考。
简述之，典型地可以通过将编码CAR多肽或其部分的核酸与启动子有效连接、将该构建体插入表达载体中，而实现编码CAR的天然或合成核酸的表达。载体可以适于在真核生物中复制和整合。典型的克隆载体含有转录和翻译终止子、起始序列、和用于调节期望核酸序列表达的启动子。
使用标准基因递送方案，本发明表达构建体也可以用于核酸免疫和基因治疗。用于基因递送的方法是本领域已知的。参见例如美国专利号5,399,346,5,580,859,5,589,466，其特此完整地并入此处作为参考。另一实施方案中，本发明提供基因治疗载体。
核酸可以克隆在多种类型的载体中。例如，可以将核酸克隆在载体，包括但不限制，质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒中。尤其有意义的载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体、和测序载体。
此外，表达载体可以以病毒载体的形式提供给细胞。病毒载体技术是本领域熟知的，并描述在例如Sambrooketal.,2012,MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL,volumes1-4,ColdSpringHarborPress,NY、以及其它病毒学和分子生物学手册中。可以用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。一般，合适的载体含有在至少一种生物中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制性内切酶位点、和一种或多种选择标记(例如，WO01/96584；WO01/29058；和美国专利号6,326,193)。
许多基于病毒的系统已经被开发出来用于将基因转移至哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒为基因递送系统提供了方便的平台。可以使用本领域已知的技术，将选定的基因插入载体中，包装入逆转录病毒粒子。然后可以分离重组病毒，并将其体内或离体递送至受试者的细胞中。本领域已知许多逆转录病毒系统。一些实施方案中，使用腺病毒载体。本领域已知许多腺病毒载体。一个实施方案中，使用慢病毒载体。
其它启动子元件例如增强子调节转录起始的频率。典型地，这些元件位于起始位点上游30-110bp的区域中，但是已经证实许多启动子在起始位点下游也含有功能性元件。启动子元件之间的间隔常常是灵活可变的，因此当元件彼此相对发生颠倒或移位时启动子功能可以被保留。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件间的间隔可以增加至50bp远，此后活性才开始下降。取决于启动子，各元件看起来可以协同地或独立地发挥作用以激活转录。
能够在哺乳动物T细胞中表达CAR转基因的一个启动子实例是EF1a启动子。天然EF1a启动子驱动延伸因子1复合物(负责将氨酰基tRNA酶促递送至核糖体)的α亚基表达。EF1a启动子已经广泛地用于哺乳动物表达质粒中，并且已经证实可以有效地驱动从克隆在慢病毒载体中的转基因表达CAR。参见例如，Miloneetal.,Mol.Ther.17(8):1453–1464(2009).一方面，EF1a启动子包含SEQIDNO：100中提供的序列。
启动子的另一个例子是立即早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是强组成型启动子序列，能够驱动与其有效连接的任何多核苷酸序列高水平表达。然而，也可以使用其他组成型启动子，包括但不限于，猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、EP病毒立即早期启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，例如，但不限于，肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、延伸因子-1α启动子、血红蛋白启动子、肌酸激酶启动子。此外，本发明不应限于应用组成型启动子。诱导性启动子也被视为本发明的部分。诱导性启动子的使用提供了一个分子开关，使得能够在期望表达发生的时候打开与该启动子有效连接的多核苷酸序列的表达、或在不期望表达发生时关闭该表达。诱导性启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子、和四环素启动子。
为了评价CAR多肽或其部分的表达，待引入细胞的表达载体也可以含有选择标记基因或报告基因或两者，以利于从病毒载体转染或感染的细胞群中鉴定和选择出表达细胞。其它方面，选择标记可以携带在分开的DNA段上，用于共转染程序。选择标记和报告基因可以侧接合适的调节序列以便在宿主细胞中表达。有用的选择标记包括例如抗生素抗性基因，例如neo等等。
报告基因可以用于鉴定潜在转染的细胞和用于评价调节序列的功能性。一般地，报告基因是在受体生物体或组织中不存在或不表达的基因，其编码的多肽的表达可以通过一些易于检测的性质，例如酶学活性来体现。可以在将DNA引入受体细胞中后在合适的时间测试报告基因的表达。合适的报告基因可以包括编码萤光素酶、β半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌性碱性磷酸酶的基因、或绿色荧光蛋白基因(例如，Ui-Teietal.,2000FEBSLetters479:79-82)。合适的表达系统是熟知的，可以使用已知技术制备或商业购买获得。一般，将表现出最高报告基因表达水平的、具有最少5’侧翼区的构建体鉴定为启动子。该启动子区域可以与报告基因连接，用于评价活性剂调节启动子驱动的转录的能力。
本领域已知用于将基因引入细胞和在细胞中表达的方法。就表达载体而言，该载体可以通过本领域的任何方法容易地引入宿主细胞，例如哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，可以通过物理、化学或生物学手段，将表达载体转移至宿主细胞中。
可以将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等等。用于产生包含载体和/或外源核酸的细胞的方法是本领域熟知的。参见例如，Sambrook，ALABORATORYMANUAL,volumes1-4,ColdSpringHarborPress,NY)。将多核苷酸引入宿主细胞的一个优选方法是磷酸钙转染。
将目的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，尤其是逆转录病毒载体，已经成为将基因插入哺乳动物、例如人细胞中的最为广泛使用的方法。其它病毒载体可以源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒、和腺相关病毒，等等。参见例如美国专利号5,350,674和5,585,362。
将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，例如大分子复合物、纳米囊、微球、珠、和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、微胶粒、混合微胶粒、和脂质体。可以体外和体内用作递送运载体的一个示例性胶体系统是脂质体(例如人工膜小泡)。可以获得其它本领域靶向递送核酸的方法，例如用靶向的纳米颗粒、或其它合适的亚微米大小的递送系统递送多核苷酸。
在利用非病毒递送系统的情况下，一个示例性递送运载体是脂质体。可以考虑使用脂质制剂将核酸引入宿主细胞(体外、离体或体内)。另一方面，可以使核酸与脂质关联。与脂质关联的核酸可以被包封在脂质体的水性内部、分散在脂质体的脂质双层中、通过与脂质体和该寡核苷酸两者结合的连接分子附着于脂质体、截留在脂质体中、与脂质体复合、分散在含脂质溶液中、与脂质混合、与脂质组合、以悬浮液形式包含在脂质中、包含在微胶粒中或与微胶粒复合、或以其它方式与脂质关联。脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体相关组合物不限于在溶液中的任何具体结构。例如，它们可以在双层结构中、作为微胶粒、或与“塌陷”结构一起存在。它们也可以仅仅分散在溶液中，可能地形成在大小或形状上不均一的聚集物。脂质是脂肪物质，其可以是天然或合成的脂质。例如，脂质包括天然存在于胞质中的脂肪小滴、以及含有长链脂族烃及其衍生物例如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛的一类化合物。
适用的脂质可以从商业来源获得。例如，二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)可以从Sigma,St.Louis,MO获得；磷酸二鲸蜡酯(DCP)可以从K&KLaboratories(Plainview,NY)获得；胆固醇(Choi)可以从Calbiochem-Behring获得；二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)和其它脂质可以从AvantiPolarLipids,Inc.(Birmingham,AL)获得。脂质在氯仿或氯仿/甲醇中的贮存溶液可以储存在大约-20℃。因为氯仿比甲醇更容易蒸发，故可以将氯仿用作唯一溶剂。“脂质体”是一个一般术语，涵盖通过产生闭合的脂质双层或聚集物而形成的各种单层和多层的脂质运载体。脂质体可以表征为，具有带磷脂双层膜和内部水性介质的小泡结构。多层脂质体具有多个脂质层，层之间通过水性介质分开。当将磷脂悬浮在过量的水性溶液中时，脂质体自发形成。脂质组分经历自重排，之后形成闭合的结构，将水和溶解的溶质截留在脂质双层之间(Ghoshetal.,1991Glycobiology5:505-10)。然而，在溶液中具有与正常小泡结构不同的结构的组合物也涵盖在该术语中。例如，脂质可以采取微胶粒结构，或仅仅以非均一的脂质分子聚合物形式存在。本发明也考虑lipofectamine-核酸复合物。
不管用于将外源核酸引入宿主细胞或使细胞暴露于本发明抑制剂的方法如何，可以实施多种试验来验证宿主细胞中重组DNA序列的存在。这些试验包括，例如，本领域技术人员熟知的“分子生物学”试验，例如Southern和Northern印迹、RT-PCR和PCR；“生物化学”试验，例如，通过如免疫学手段(ELISA和Westen印迹)检测特定肽的存在或不存在，或通过本文所述试验鉴定落入本发明范围的活性剂。
本发明还提供包含CAR编码核酸分子的载体。一方面，可以直接将CAR载体转导至细胞，例如T细胞中。一方面，载体是克隆或表达载体，例如，包括但不限于，一种或多种质粒(例如表达质粒、克隆载体、小环、微载体、双微小染色体)、逆转录病毒和慢病毒载体构建体。一方面，载体能够在哺乳动物T细胞中表达CAR构建体。一方面，哺乳动物T细胞是人T细胞。
T细胞来源
在扩增和遗传修饰前，从受试者获得T细胞源。术语“受试者”旨在包括可以在其中引发免疫反应的活生物体(例如哺乳动物)。受试者的实例包括人、狗、猫、小鼠、大鼠、及其转基因物种。可以从多种来源，包括外周血单个核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织、和肿瘤，获得T细胞。在本发明一些方面，可以使用本领域可得的任何T细胞系。本发明一些方面，T细胞可以使用本领域已知的任何技术(例如FicollTM分离术)从采集自受试者的血液单位获得。一个优选方面，通过单采血液成分术，从受试者循环血液获得细胞。单采血液成分术的产品典型地含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它具核白细胞、红细胞、和血小板。一方面，可以洗涤通过单采血液成分术收集的细胞，以去除血浆级分，并将细胞放入合适的缓冲液或介质中以用于随后的加工步骤。在本发明的一个方面，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在备选方面，洗涤溶液缺钙，并可以缺镁或可以缺失即使不是所有也是很多的二价阳离子。在缺钙的情况下初始活化步骤可以导致放大的活化。本领域普通技术人员易于明了，洗涤步骤可以通过本领域已知的方法进行，例如根据厂商说明书使用半自动“贯流式”(flow-through)离心机(例如，Cobe2991细胞处理器、BaxterCytoMate、或HaemoneticsCellSaver5)。洗涤后，可以将细胞重悬浮在各种生物相容性缓冲液中，例如无Ca、无Mg的PBS、PlasmaLyteA、或具有或不具有缓冲剂的其它盐水溶液。备选地，可以除去单采血液成分术样品的不期望成分，将细胞直接重悬浮在培养基中。
一方面，通过裂解红细胞和消除单核细胞，例如通过PERCOLLTM梯度离心或通过对流离心淘洗，从外周血淋巴细胞分离T细胞。可以通过阳性或阴性选择技术，进一步分离特定的T细胞亚群，例如CD3+,CD28+,CD4+,CD8+,CD45RA+,和CD45RO+T细胞。例如，一方面，可以通过与抗CD3/抗CD28(例如3x28)-缀合珠，例如 M-450CD3/CD28T，一起孵育足以实现期望T细胞的阳性选择的一段时间，以分离T细胞。一方面，时间为大约30分钟。再一方面，时间可以为30分钟至36小时或更长、以及居间的所有整数值。再一方面，时间为至少1、2、3、4、5、或6小时。另一优选方面，时间为10至24小时。一方面，孵育时间是24小时。在相对其他细胞类型存在很少的T细胞的任何情况下，可以使用更长的孵育时间以分离T细胞，例如从肿瘤组织或从免疫受损受试者分离肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)。此外，可以使用更长的孵育时间，以增加捕获CD8+T细胞的效率。因此，通过简单地缩短或延长允许T细胞结合CD3/CD28珠的时间，和/或通过增加或减少珠子与T细胞的比例(如本文进一步描述)，可以在培养开始时或在培养过程中的其他时间点上，优先地选出或选择除去T细胞的亚群。此外，通过增加或减少珠子或其它表面上抗CD3和/或抗CD28抗体的比例，可以在培养开始时或在其他期望时间点上，优先地选出或选择除去T细胞的亚群。本领域技术人员明了，在本发明中也可以使用多个回合的选择。一些方面中，可能期望实施选择程序并在活化和扩增程序中使用“未被选择的”细胞。也可以对“未被选择的”细胞进行其它回合的选择。
可以使用针对表面标志的抗体的组合，通过阴性选择而富集T细胞群，其中所述表面标志独特于该阴性选择的细胞。一个方法是，通过阴性磁性免疫粘附或流式细胞术进行的细胞分选和/或选择，其中使用针对阴性选择的细胞上存在的细胞表面标志的单克隆抗体混合物。例如，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物典型地包括抗CD14,CD20,CD11b,CD16,HLA-DR和CD8的抗体。一些方面，可能期望富集或阳性选择典型地表达CD4+,CD25+,CD62Lhi,GITR+和FoxP3+的调节性T细胞。备选地，在一些方面，通过抗C25缀合珠或其它类似的选择方法，耗竭T调节细胞。
一个实施方案中，可以选择表达IFN-γ,TNFα,IL-17A,IL-2,IL-3,IL-4,GM-CSF,IL-10,IL-13,粒酶B和穿孔蛋白中的一种或多种或其它合适分子(例如其它细胞因子)的T细胞群。可以例如通过PCT公布号WO2013/126712中描述的方法，确定用于筛选细胞表达的方法。.
为了通过阴性或阳性选择分离期望细胞群，可以变化细胞和表面(例如颗粒如珠)的浓度。一些方面，可能期望显著减少珠子和细胞混合在一起的体积(例如增加细胞浓度)，从而保证细胞和珠子的最大接触。例如，一方面，使用20亿细胞/ml的浓度。一方面，使用10亿细胞/ml的浓度。再一方面，使用大于1亿细胞/ml的浓度。再一方面，使用1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,3.5,4.0,4.5,或5.0千万细胞/ml的浓度。一方面，使用7.5,8.0,8.5,9.0,9.5,或10.0千万细胞/ml的浓度。再一方面，可以使用1.25或1.50亿细胞/ml的浓度。使用高浓度可以导致增加的细胞产率、细胞激活和细胞扩增。此外，使用高细胞浓度可以更有效地捕获可能弱表达目的靶抗原的细胞，例如CD28阴性T细胞，或从有许多肿瘤细胞存在的样品(例如白血病血液、肿瘤组织等)中实现更有效的捕获。此类细胞群可以具有治疗价值，并可能期望获得。例如，使用高浓度细胞将允许更有效地选择正常具有较弱的CD28表达的CD8+T细胞。
在一个相关方面，可能期望使用较低的细胞浓度。通过显著稀释T细胞和表面(例如颗粒如珠)的混合物，可以最小化颗粒和细胞之间的相互作用。这可以选择表达高量与颗粒结合的期望抗原的细胞。例如，与CD8+T细胞相比，CD4+T细胞表达较高水平的CD28，在稀释浓度中可以更为有效地被捕获。一方面，使用的细胞浓度是5X10e6/ml。其它方面，所用浓度可以是大约1X105/ml至1X106/ml、以及居间的任何整数数值。
其它方面，可以在转子上，在2-10℃或室温，以变化的速度孵育细胞变化长度的时间。
也可以在洗涤步骤后冷冻用于刺激的T细胞。不受理论的约束，冷冻和随后的融化步骤可以通过去除细胞群中的粒细胞和一定程度地单核细胞而导致更均一的产品。在去除血浆和血小板的洗涤步骤后，可以将细胞悬浮在冷冻溶液中。许多冷冻溶液和参数是本领域已知的并可以用于本发明中，其中一个方法涉及使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS，或含有10％葡聚糖40(Dextran40)和5％葡萄糖(Dextrose)、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO、或31.25％Plasmalyte-A、31.25％葡萄糖5％、0.45％NaCl、10％葡聚糖40和5％葡萄糖、20％人血清白蛋白、和7.5％DMSO的培养基，或含有例如Hespan和PlasmaLyteA的其它合适细胞冷冻介质；然后，细胞可以以每分钟1℃的速度冷冻至-80℃，并在液氮储存罐的气相中保存。可以使用其它的受控冷冻方法，以及在-20℃或在液氮中立即地不受控冷冻。
一些方面，按本文所述将冷藏的细胞融化和洗涤，允许其在室温停留1小时，之后使用本发明方法活化。
本发明也考虑，在可能需要本文的扩增细胞前的时间，从受试者收集血液样品或单采血液成分术产品。由此，可以在所需的任何时间点收集待扩增的细胞的来源，分离和冷冻期望的细胞例如T细胞，以随后在T细胞治疗中将其用于将受益于T细胞治疗的任何疾病或病症，如本文所述的疾病和病症。一方面，从总体健康的受试者采集血液样品或单采血液成分。一些方面，从总体健康的受试者采集血液样品或单采血液成分，其中所述受试者有罹患疾病的风险但尚未出现疾病；并分离和冷冻目的细胞用于后期使用。在一些方面，可以扩增、冷冻和随后使用T细胞。一些方面，在诊断出本文所述特定疾病不久但在任何治疗之前从患者收集样品。再一方面，在任何相关治疗形式之前，从获自受试者的血液样品或单采血液成分中分离细胞，其中所述相关治疗形式包括但不限于，用活性剂治疗，例如那他珠单抗(Natalizumab)、依法珠单抗(efalizumab)、抗病毒药、化疗、放射、免疫抑制剂例如环孢素(cyclosporin)、硫唑嘌呤(azathioprine)、甲氨蝶呤(methotrexate)、霉酚酸酯(mycophenolate)和FK506、抗体或其它免疫清除剂(immunoablativeagents)例如CAMPATH、抗CD3抗体、环磷酰胺(cytoxan)、氟达拉滨(fludarabine)、环孢素(cyclosporin)、FK506、雷帕霉素(rapamycin)、霉酚酸(mycophenolicacid)、类固醇(steroids)、FR901228和辐射。
在本发明的再一方面，直接在保留受试者的功能性T细胞的治疗后，从患者获得T细胞。在此方面，已经观察到，在某些癌症治疗之后，尤其是使用损伤免疫系统的药物进行治疗之后，在治疗后不久在患者从该治疗正常恢复的时间段中，获得的T细胞的质量就其离体扩增的能力而言可能是最佳的或者是改善的。同样地，在使用本文所述方法离体操作后，就增强的植入和体内扩增而言，这些细胞也可能处于优选的状态。因此，本发明考虑，在该恢复期收集血液细胞，包括T细胞、树突细胞、或造血谱系的其它细胞。此外，在一些方面，可以使用动员(例如用GM-CSF动员)和调理方案以在受试者中创造这样的条件，该条件将利于，尤其是在治疗后的规定时间窗中，特定细胞类型的种群恢复、再循环、再生、和/或扩增。示例性细胞类型包括T细胞、B细胞、树突细胞、和免疫系统的其它细胞。
T细胞的活化和扩增
通常可以使用在例如美国专利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；和美国专利申请公布号20060121005中描述的方法，活化和扩增T细胞。
一般地，本发明的T细胞可以通过与表面接触进行扩增，其中所述表面已经连接了可以刺激CD3/TCR复合物相关信号的活性剂和可以刺激T细胞表面上的共刺激分子的配体。特别地，可以如本文所述刺激T细胞群，例如通过接触固定在表面上的抗CD3抗体或其抗原结合片段或抗CD2抗体，或通过接触与钙离子载体缀合的蛋白激酶C激活物(例如苔藓抑制素)。为了共刺激T细胞表面上的辅助分子，可以使用结合该辅助分子的配体。例如，可以在合适刺激T细胞增殖的条件下，使T细胞群接触抗CD3抗体和抗C28抗体。为了刺激CD4+T细胞或CD8+T细胞增殖，可以使用抗CD3抗体和抗CD28抗体。抗CD28抗体的例子包括9.3,B-T3,XR-CD28(Diaclone,Besancon,France)，也可以使用本领域通常已知的其它方法(Bergetal.,TransplantProc.30(8):3975-3977,1998；Haanenetal.,J.Exp.Med.190(9):13191328,1999；Garlandetal.,J.ImmunolMeth.227(1-2):53-63,1999)。
在一些方面，用于T细胞的第一刺激信号和共刺激信号可以通过不同的方案提供。例如，提供各信号的活性剂可以在溶液中或偶联在表面上。当与表面偶联时，这些活性剂可以与相同表面偶联(即，“顺式”方式)，或与分开的表面偶联(即，“反式”方式)。备选地，可以将一种活性剂偶联在表面上，而另一活性剂可以在溶液中。一方面，提供共刺激信号的活性剂与细胞表面结合，而提供第一活化信号的活性剂在溶液中或偶联在表面上。一些方面，两种活性剂均可以在溶液中。一个方面，这些活性剂可以是可溶形式，然后交联到表面上，所述表面为例如表达与所述活性剂结合的Fc受体或抗体或其它结合剂的细胞。在此方面，关于可以考虑用于本发明中激活和扩增T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPCs)，参见例如美国专利申请公开号20040101519和20060034810。
一方面，将两种活性剂固定在珠子上，在相同珠子上(即“顺式”)或在不同的珠子上(即“反式”)。例如，提供第一活化信号的活性剂是抗CD3抗体或其抗原结合片段，提供共刺激信号的活性剂是抗CD28抗体或其抗原结合片段；两种活性剂以等分子量共同固定在相同的珠子上。一方面，与珠子结合的各抗体以1:1比例用于CD4+T细胞扩增和T细胞生长。在本发明一些方面，使用一定比例的与珠子结合的抗CD3:CD28抗体，该比例导致所观察到的T细胞扩增比使用1:1比例时所观察到的T细胞扩增增加。一个特别的方面，与使用1:1比例观察到的扩增相比，观察到大约1至大约3倍的增加。一方面，与珠子结合的CD3:CD28抗体的比例可以为100:1至1:100，以及其间的所有整数值。本发明一方面，与抗CD3抗体相比，更多的抗CD28抗体与颗粒结合，即，CD3:CD28比例小于1。在本发明一些方面，与珠子结合的抗CD28抗体与抗CD3抗体的比例大于2:1。一个特定方面，与珠子结合的抗CD3:CD28抗体以1:100的比例使用。一个方面，与珠子结合的抗体以1:75的CD3:CD28比例使用。再一方面，与珠子结合的抗体以1:50的CD3:CD28比例使用。一个方面，与珠子结合的抗体以1:30的CD3:CD28比例使用。一个优选方面，与珠子结合的抗体以1:10:的CD3:CD28比例使用。一个方面，与珠子结合的抗体以1:3的CD3:CD28比例使用。再一个方面，与珠子结合的抗体以3:1的CD3:CD28比例使用。
可以使用1:500至500:1以及其间任何整数数值的颗粒:细胞比例，以刺激T细胞或其它靶细胞。本领域普通技术人员可以明了，颗粒与细胞的比例可取决于颗粒相对于靶细胞的大小。例如，小尺寸的珠子仅能结合少数细胞，而较大的珠子能够结合许多细胞。一些方面，细胞与颗粒的比例可以为1:100至100:1、以及其间的任何整数数值；在其它方面，也可以使用1:9至9:1以及其间的任何整数数值的比例以刺激T细胞。可以导致T细胞刺激的抗CD3和抗CD28偶联颗粒与T细胞的比例可以如上所述变动，然而一些优选的值包括1:100,1:50,1:40,1:30,1:20,1:10,1:9,1:8,1:7,1:6,1:5,1:4,1:3,1:2,1:1,2:1,3:1,4:1,5:1,6:1,7:1,8:1,9:1,10:1,和15:1，其中一个优选比例是至少1:1颗粒/T细胞。一方面，使用1:1或更少的颗粒:细胞比例。一个特定方面，优选的颗粒:细胞比例是1:5。其它方面，可以根据刺激日，改变颗粒:细胞比例。例如，一方面，在第一日颗粒:细胞比例为1:1至10:1，之后为期多达10天以1:1至1:10的最终比例(基于添加日的细胞计数)每天或每隔一天向细胞中添加额外的颗粒。一个特定方面，颗粒:细胞比例在刺激的第一日为1:1，在刺激的第三日和第五日调整至1:5。一方面，每日或每隔一日加入颗粒，在第一天达最终比例1:1，在刺激的第三日和第五日达1:5。一方面，颗粒:细胞比例在刺激的第一日为2:1，在刺激的第三日和第五日调节至1:10。一方面，每日或每隔一日加入颗粒，在第一天达最终比例1:1，在刺激的第三日和第五日达1:10。本领域技术人员明了，本发明可以适用各种其它比例。尤其是，可以根据颗粒大小和细胞大小和类型，改变比例。一方面，第一日可用的最典型的比例是在1:1、2:1和3:1附近。
在本发明其他方面，细胞例如T细胞与活性剂包被的珠组合，随后分离细胞和珠子，然后培养细胞。在备选方面，在培养之前，活性剂包被的珠与细胞不分离，而是一起培养。再一方面，首先通过施加力例如磁力浓缩珠子和细胞，导致增加的细胞表面标志连接，由此诱导细胞刺激。
例如，可以通过使抗CD3和抗CD28抗体附着的顺磁珠(3x28珠)与T细胞接触，以连接细胞表面蛋白。一方面，将细胞(例如，104至109个T细胞)与珠子(例如M-450CD3/CD28T顺磁珠，1:1比例)在缓冲液例如PBS(无二价阳离子例如钙和镁)中组合。再次，本领域普通技术人员将明了，可以使用任何细胞浓度。例如，样品中的靶细胞可十分稀少，仅占样品的0.01％；或整个样品(即100％)可以包含目的靶细胞。因此，任何细胞数量都在本发明范围内。一些方面，可能期望显著降低颗粒和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞浓度)，以确保细胞和颗粒的最大接触。例如，一方面，使用大约20亿细胞/ml的浓度。再一方面，使用大于1亿细胞/ml的浓度。再一方面，使用1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,3.5,4.0,4.5,或5.0千万细胞/ml的浓度。一方面，使用7.5,8.0,8.5,9.0,9.5,或10.0千万细胞/ml的浓度。再一方面，可以使用1.25或1.50亿细胞/ml的浓度。使用高浓度可以导致增加的细胞产率、细胞激活和细胞扩增。此外，使用高细胞浓度，可以更有效地捕获可能弱表达目的靶抗原的细胞，例如CD28阴性T细胞。此类细胞群可以具有治疗价值，并在一些方面是期望获得的。例如，使用高浓度细胞将允许更有效地选择正常具有较弱的CD28表达的CD8+T细胞。
本发明一方面，可以培养混合物几个小时(大约3小时)至大约14天或其间任何小时整数值。一方面，可以培养混合物21天。本发明一方面，将珠子和T细胞一起培养大约8天。一方面，将珠子和T细胞一起培养2-3天。也可能期望几个刺激循环，这样T细胞培养时间可以是60天或更多。适用于T细胞培养的条件包括合适的培养基(例如，极限必需培养基或RPMI培养基1640或X-vivo15(Lonza))，所述培养基可以含有增殖和存活所需的因子，包括血清(例如胎牛血清或人血清)、白介素2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ和TNF-α、或本领域已知的用于细胞生长的任何其它添加剂。用于细胞生长的其它添加剂包括但不限于，表面活性剂、plasmanate、和还原剂如N-乙酰基半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可以包括RPMI1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo15和X-Vivo20、Optimizer，具有添加的氨基酸、丙酮酸钠、和维生素、无血清或补充了合适量的血清(或血浆)或规定的一组激素、和/或对于T细胞生长和扩增足够量的细胞因子。抗生素例如青霉素和链霉素仅包括在实验培养物中，而不包括在待输注于受试者的细胞培养物中。将靶细胞维持在支持生长所需的条件下，例如合适的温度(例如37℃)和大气(例如空气加5％CO2)下。
接受不同次数刺激的T细胞可以表现出不同特征。例如，典型的血液或单采血液成分术外周血单个核细胞产品中辅助T细胞群(TH,CD4+)大于细胞毒性或抑制性T细胞群(TC,CD8+)。通过刺激CD3和CD28受体离体扩增T细胞，将产生T细胞群，该T细胞群在大约第8-9天前主要由TH细胞组成，而在大约第8-9天后该T细胞群包含日益更大的TC细胞群。因此，取决于治疗目的，可能有利的是，向受试者输注主要包含TH细胞的T细胞群。相似地，如果分离抗原特异性TC细胞亚组，则将该亚组扩增至更大程度可能是有利的。
此外，除了CD4和CD8标志，其它表型标志在细胞扩增过程期间也显著地，但在很大程度上可重现地，变化。因此，该可重现性使得能够针对特定目的按需定制活化的T细胞产品。
一旦构建CD19CAR，可以使用各种试验评价该分子的活性，例如但不限于，在抗原刺激后扩增T细胞的能力，在缺乏再刺激的情况下维持T细胞扩增的能力，和在合适的体外和动物模型中抗癌活性。以下更详细地描述用于评价CD19CAR的效果的试验。
可以使用Western印迹分析原代T细胞中的CAR表达，以检测单体和二聚体的存在。参见例如Miloneetal.,MolecularTherapy17(8):1453-1464(2009)。极简言之，在体外扩增表达CAR的T细胞(CD4+和CD8+T细胞的1:1混合物)10天以上，之后裂解，在还原条件下进行SDS-PAGE。通过western印迹，使用抗TCR-ζ链抗体，检测含有全长TCR-ζ胞质结构域的CAR和内源TCR-ζ链。对该相同的T细胞亚组，在非还原条件下进行SDS-PAGE分析，以允许评价共价二聚体的形成。
可以通过流式细胞术，测量抗原刺激后CAR+T细胞的体外扩增。例如，用αCD3/αCD28aAPC刺激CD4+和CD8+T细胞的混合物，之后用在待分析的启动子控制下表达GFP的慢病毒载体转导。示例性启动子包括CMVIE基因、EF-1α、泛素C或磷酸甘油激酶(PGK)启动子。可以在培养第6天在该CD4+和/或CD8+T细胞亚组中通过流式细胞术评价GFP荧光。参见例如Miloneetal.,MolecularTherapy17(8):1453-1464(2009)。备选地，用αCD3/αCD28包被的磁珠在第0天刺激CD4+和CD8+T细胞的混合物，并在第1天通过表达CAR和eGFP以及使用2A核糖体跳跃序列的双顺反子慢病毒载体、向所述混合物转导CAR。在洗涤后，用抗CD3和抗CD28抗体存在下表达hCD32和4-1BBL的K562细胞(K562-BBL-3/28)、或CD19+K562细胞(K562-CD19)或野生型K562细胞(K562野生型)，再刺激培养物。向培养物每隔一天以100IU/ml加入外源IL-2。使用基于珠子的计数，通过流式细胞术，计数GFP+T细胞。参见例如，Miloneetal.,MolecularTherapy17(8):1453-1464(2009)。
也可以测量在无再刺激的情况下维持的CAR+T细胞扩增。参见例如，Miloneetal.,MolecularTherapy17(8):1453-1464(2009)。.简言之，在用αCD3/αCD28包被的磁珠在第0天刺激并用所示的CAR在第1天转导后，在培养的第8天使用CoulterMultisizerIII颗粒计数器测量平均T细胞体积(fl)。
也可以使用动物模型测量CART活性。例如，可以使用异种移植物模型，在免疫缺陷小鼠中使用人CD19特异性CAR+T细胞治疗原代人前BALL。参见例如，Miloneetal.,MolecularTherapy17(8):1453-1464(2009)。.非常简要地说，在ALL确立后，将小鼠随机化分组到治疗组。不同数量的αCD19-ζ和αCD19-BB-ζ工程化T细胞以1:1比例共注射到携带B-ALL的NOD-SCID-γ-/-小鼠中。在T细胞注射后不同时间，在来自小鼠的脾DNA中评价αCD19-ζ和αCD19-BB-ζ载体的拷贝数。每周间隔对动物进行白血病评价。在注射了αCD19-ζCAR+T细胞或模拟转导的T细胞的小鼠中测量外周血CD19+B-ALL母细胞数。使用log-rank检验，比较组的存活曲线。此外，还可以分析T细胞注射NOD-SCID-γ-/-小鼠后4周绝对外周血CD4+和CD8+T细胞数。给小鼠注射白血病细胞，并且3周后注射工程化表达CAR的T细胞，其中所述T细胞通过编码与eGFP连接的CAR的双顺反子慢病毒载体表达CAR。在注射前通过与模拟(mock)转导的细胞混合，将T细胞标化至45-50％输出GFP+T细胞，并通过流式细胞术确认。以1周间隔对动物进行白血病评价。使用log-rank检验，比较CAR+T细胞组的存活曲线。
可以评价剂量依赖性CAR治疗反应。参见例如，Miloneetal.,MolecularTherapy17(8):1453-1464(2009)。.例如，在第21日注射CART细胞、相等数量的模拟转导的T细胞、或不注射T细胞的小鼠中，在建立白血病后35-70天获取外周血细胞。从每个组的小鼠随机采血用于确定外周血CD19+ALL母细胞数量，之后于第35和49日处死。剩余动物在第57和70日进行评价。
可以如先前描述，例如Milone等MolecularTherapy17(8):1453-1464(2009)，评价细胞增殖和细胞因子产生。简言之，在微量滴定板中，通过将洗涤后的T细胞与表达CD19(K19)或CD32和CD137(KT32-BBL)的K562细胞，以2:1最终T细胞:K562比例混合，从而评价CAR介导的增殖。K562在使用前用γ射线照射。将抗CD3(克隆OKT3)和抗CD28(克隆9.3)单克隆抗体加入具有KT32-BBL细胞的培养物中，以充当刺激T细胞增殖的阳性对照，这是因为这些信号可以支持长期的CD8+T细胞离体扩增。使用CountBrightTM荧光珠(Invitrogen,Carlsbad,CA)和流式细胞术，按厂商所述，计数培养物中的T细胞。使用以eGFP-2A连接的CAR表达慢病毒载体工程化构建的T细胞，通过GFP表达，鉴定CAR+T细胞。对于不表达GFP的CAR+T细胞，可以使用生物素化的重组CD19蛋白和第二亲和素-PE缀合物，检测CAR+T细胞。也可以使用特异性单克隆抗体(BDBiosciences)同时检测T细胞上的CD4+和CD8+表达。可以使用人TH1/TH2细胞因子细胞计量珠阵列试剂盒(BDBiosciences,SanDiego,CA)，根据厂商说明书，在再刺激后24小时收集的上清液上，进行细胞因子测量。使用FACScalibur流式细胞仪评价荧光，根据厂商说明书分析数据。
可以通过标准51Cr-释放试验，评价细胞毒性。参见例如，Miloneetal.,MolecularTherapy17(8):1453-1464(2009)。.简言之，在37℃在频繁搅拌下用51Cr(作为NaCrO4,NewEnglandNuclear,Boston,MA)加载靶细胞(K562细胞系和原代前B-ALL细胞)2小时，在完全RPMI中洗涤两次，接种在微量滴定板中。在孔中在完全RPMI中以不同的效应细胞:靶细胞比例(E:T)，将效应T细胞和靶细胞混合。也制备仅含有培养基(自发释放，SR)或1％triton-X100洗涤剂溶液(总释放，TR)的其它孔。在37℃孵育4小时后，收获来自各孔的上清液。然后使用γ粒子计数器(PackardInstrumentCo.,Waltham,MA)测量释放的51Cr。每个条件至少一式三份重复，使用公式:％裂解＝(ER-SR)/(TR–SR)，计算裂解百分数，其中ER代表每个试验条件下释放的平均51Cr。
可以使用成像技术，在携带肿瘤的动物模型中评价CAR的特异性运输和增殖。此类试验已经描述在例如Barrett等，HumanGeneTherapy22:1575-1586(2011)中。简言之，给NOD/SCID/γc–/–(NSG)小鼠IV注射Nalm-6细胞，7天后注射以CAR构建体电穿孔后4小时的T细胞。慢病毒构建体稳定地转染T细胞以表达萤火虫萤光素酶，通过生物发光对小鼠进行成像。备选地，可以如下所述，在Nalm-6异种移植物模型中测量单次注射CAR+T细胞的治疗功效和特异性：给NSG小鼠注射经转导而稳定表达萤火虫萤光素酶的Nalm-6细胞，之后7天后单次尾静脉注射以CD19CAR电穿孔的T细胞。在注射后的不同时间对动物进行成像。例如，可以产生在第5日(治疗前2日)和第8日(CAR+PBLs后24小时)代表性小鼠中萤火虫萤光素酶阳性白血病的光子密度热图。
其它试验，包括本文实施例部分描述的试验，以及本领域已知的那些试验，也可以用于评价本发明的CD19CAR构建体。
治疗应用
CD19相关疾病和/或病症
一方面，本发明提供治疗CD19表达相关疾病的方法。一方面，本发明提供治疗疾病的方法，其中部分肿瘤是CD19阴性，而部分肿瘤是CD19阳性。例如，本发明CAR可以用于治疗受试者，其中所述受试者已经经历过与CD19的升高表达相关的疾病的治疗，其中已经经历过针对CD19升高水平的治疗的受试者表现出与CD19的升高水平相关的疾病。
一方面，本发明涉及包含CD19CAR的载体，其中所述CAR与用于哺乳动物T细胞中表达的启动子有效连接。一方面，本发明提供表达CD19CAR的重组T细胞用于治疗CD19表达肿瘤的用途，其中表达CD19CAR的重组T细胞被称作CD19CART。一方面，本发明CD19CART能够通过其表面上表达的至少一个本发明CD19CAR与肿瘤细胞接触，从而该CART靶向肿瘤细胞并抑制肿瘤生长。
一方面，本发明涉及抑制表达CD19的肿瘤细胞生长的方法，包括使肿瘤细胞与本发明CD19CART细胞接触，从而该CART将响应该抗原而被激活并靶向癌细胞，其中肿瘤的生长被抑制。
一方面，本发明涉及在受试者中治疗癌症的方法。该方法包括向受试者施用本发明CD19CART细胞，从而治疗受试者中的癌症。可以通过本发明CD19CART细胞治疗的一个癌症例子是与CD19表达相关的癌症。一方面，与CD19表达相关的癌症是血液学癌症(hematologicalcancer)。一方面，血液癌症(hematolicalcancer)是白血病或淋巴瘤。一方面，CD19表达相关癌症包括癌症和恶性肿瘤，包括但不限于，例如一种或多种急性白血病，包括但不限于，例如，B细胞急性淋巴样白血病(“BALL”)、T细胞急性淋巴样白血病(“TALL”)、急性淋巴样白血病(“ALL”)；一或多种慢性白血病，包括但不限于，例如，慢性髓性白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)。其它与CD19表达相关的癌症或血液学病症，包括但不限于，例如，B细胞早幼淋巴细胞样白血病(Bcellprolymphocyticleukemia)、母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤(blasticplasmacytoiddendriticcellneoplasm)、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt'slymphoma)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuselargeBcelllymphoma)、滤泡性淋巴瘤(follicularlymphoma)、毛细胞性白血病(hairycellleukemia)、小细胞或大细胞性-滤泡性淋巴瘤(smallcell-oralargecell-follicularlymphoma)、恶性淋巴组织增生病症(malignantlymphoproliferativeconditions)、MALT淋巴瘤、外套细胞淋巴瘤(mantlecelllymphoma)、边缘带淋巴瘤(Marginalzonelymphoma)、多发性骨髓瘤(multiplemyeloma)、骨髓增生异常(myelodysplasia)和骨髓增生异常综合征(myelodysplasticsyndrome)、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin'slymphoma)、浆母细胞性淋巴瘤(plasmablasticlymphoma)、浆细胞样树突状细胞肿瘤(plasmacytoiddendriticcellneoplasm)、Waldenstrom巨球蛋白血症(Waldenstrommacroglobulinemia)、和“白血病前期”(通过髓系血液细胞的无效生产(或发育异常)而统一在一起的一系列各种各样血液学病症)，等等。其它与CD19表达相关的疾病，包括但不限于，例如，与CD19表达相关的非典型和/或非经典的癌症、恶性肿瘤、癌前病症、或增生性疾病。
一些实施方案中，可以用CD19CAR，例如本文所述CD19CAR治疗的癌症是多发性骨髓瘤。多发性骨髓瘤是血液癌症，特征在于骨髓中浆细胞克隆的聚集。目前的多发性骨髓瘤疗法包括，但不限于，用来那度胺(lenalidomide)——沙利度胺(Thalidomide)的类似物——治疗。来那度胺具有多种活性，包括抗肿瘤活性、血管生成抑制作用、和免疫调节作用。一般地，骨髓瘤细胞通过流式细胞术被认为是CD19表达阴性。本发明涵盖这样的认识——如实施例6所证实，小百分数的骨髓瘤肿瘤细胞表达CD19。因此，一些实施方案中，CD19CAR，例如本文所述CD19CAR，可以用于靶向骨髓瘤细胞。一些实施方案中，CD19CAR治疗可以与一种或多种其它疗法，例如来那度胺治疗，组合使用。
本发明包括细胞治疗形式，其中遗传修饰T细胞以表达嵌合抗原受体(CAR)，将该CART细胞输注入有需要的受体中。输注的细胞能够在受体中杀死肿瘤细胞。与抗体治疗不同，CAR修饰的T细胞能够体内复制，导致长期持久性，从而这可以导致维持的肿瘤控制。在多个方面，在T细胞施用给患者后，施用给患者的T细胞或其后代在患者中维持至少4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月、21个月、22个月、23个月、两年、三年、四年、或五年。
本发明还包括细胞治疗形式，其中(例如通过体外转录的RNA)修饰T细胞以瞬时表达嵌合抗原受体(CAR)，将该CART细胞输注入有需要的受体中。输注的细胞能够在受体中杀死肿瘤细胞。因此，在多个方面，在将T细胞施用给患者后，施用给患者的T细胞存在不到一个月，例如三周、两周、一周。
不希望受任何特定理论的束缚，由CAR修饰T细胞引起的抗肿瘤免疫反应可是主动或被动免疫反应，或备选地可由于直接vs间接免疫反应引起。一方面，CAR转导的T细胞响应表达CD19的人癌细胞表现出特异的促炎性细胞因子分泌和有力的细胞溶解活性，抵抗可溶性CD19抑制作用，介导旁观者杀伤并介导建立的人肿瘤的消退。例如，在CD19表达性肿瘤的异质区域中具有较少抗原的肿瘤细胞可能易于被之前已对相邻抗原阳性癌细胞具有反应性的CD19重定向T细胞而间接破坏。
一方面，本发明全人CAR修饰的T细胞可以是疫苗形式，用于哺乳动物的离体免疫和/或体内治疗。一方面，哺乳动物是人。
有关离体免疫，在将细胞施用给哺乳动物之前，至少实施以下之一：i)扩增细胞；ii)将编码CAR的核酸引入细胞；或iii)冷藏该细胞。
离体程序是本领域熟知的，下面将更详细地讨论。简言之，从哺乳动物(例如人)分离细胞，用表达本文所述CAR的载体对细胞进行遗传修饰(例如体外转导或转染)。CAR修饰的细胞可以施用给哺乳动物受体以提供治疗益处。哺乳动物受体可以是人，CAR修饰的细胞可以是受体的自体细胞。或者，细胞相对于受体而言可以是同种异体的、同种同基因的或异种的。
离体扩增造血干细胞和祖先细胞的方法描述在美国专利号5,199,942，该文献并入此处作为参考，该方法可以用于本发明的细胞。其它适宜的方法是本领域已知的，因此，本发明不限于任何特定的离体细胞扩增方法。简言之，T细胞的离体培养和扩增可以包括：(1)从哺乳动物从采集的外周血或骨髓外植体，收集CD34+造血干细胞和祖先细胞；和(2)离体扩增该细胞。除了美国专利号5,199,942描述的细胞生长因子外，还可以使用其它因子例如flt3L,IL-1,IL-3和c-kit配体用于培养和扩增细胞。
除了在离体免疫的情况下使用基于细胞的疫苗外，本发明还提供用于体内免疫的组合物和方法以在患者中引发针对抗原的免疫反应。
一般地，可以将如本文所述活化和扩增的细胞用于治疗和预防免疫受损个体中的疾病。尤其是，本发明的CAR修饰T细胞可以用于治疗与CD19表达相关的疾病、病症和病况。一些方面，本发明细胞用于治疗有罹患CD19表达相关疾病、病症和病况的危险的患者。因此，本发明提供治疗或预防与CD19表达相关的疾病、病症和病况的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本发明CAR修饰T细胞。
一方面，本发明CART细胞可以用于治疗增生性疾病，例如癌症或恶性肿瘤或癌前病症例如骨髓增生异常、骨髓增生异常综合征或白血病前期。一方面，癌症是血液癌症(hematolicalcancer)。一方面，血液癌症(hematolicalcancer)是白血病或淋巴瘤。一方面，本发明CART细胞可以用于治疗癌症和恶性肿瘤，包括但不限于，例如急性白血病，包括但不限于，例如，B细胞急性淋巴样白血病(BALL)、T细胞急性淋巴样白血病(TALL)、急性淋巴样白血病(ALL)；一或多种慢性白血病，包括但不限于，例如，慢性髓性白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)；其它血液学癌症或血液学病症，包括但不限于，例如，B细胞早幼淋巴细胞样白血病(Bcellprolymphocyticleukemia)、母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤(blasticplasmacytoiddendriticcellneoplasm)、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt'slymphoma)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuselargeBcelllymphoma)、滤泡性淋巴瘤(follicularlymphoma)、毛细胞性白血病(hairycellleukemia)、小细胞或大细胞性-滤泡性淋巴瘤(smallcell-oralargecell-follicularlymphoma)、恶性淋巴组织增生病症(malignantlymphoproliferativeconditions)、MALT淋巴瘤、外套细胞淋巴瘤(mantlecelllymphoma)、边缘带淋巴瘤(Marginalzonelymphoma)、多发性骨髓瘤(multiplemyeloma)、骨髓增生异常(myelodysplasia)和骨髓增生异常综合征(myelodysplasticsyndrome)、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin'slymphoma)、浆母细胞性淋巴瘤(plasmablasticlymphoma)、浆细胞样树突状细胞肿瘤(plasmacytoiddendriticcellneoplasm)、Waldenstrom巨球蛋白血症(Waldenstrommacroglobulinemia)、和“白血病前期”(通过髓系血液细胞的无效生产(或发育异常)而统一在一起的一系列各种各样血液学病症)，等等。其它与CD19表达相关的疾病，包括但不限于，例如，表达CD19的非典型和/或非经典的癌症、恶性肿瘤、癌前病症、或增生性疾病。与CD19表达相关的非癌相关适应症包括，但不限于，例如，自身免疫病(例如，狼疮)、炎性病症(变态反应和哮喘)和移植。
本发明CAR修饰T细胞可以单独地施用，或者与稀释剂和/或与其它成分例如IL-2或其它细胞因子或细胞群组合以药物组合物的形式施用。
血液学癌症
血液学癌症是影响血液、骨髓和淋巴系统的癌症类型，例如白血病和恶性淋巴增生病症。
白血病可以被划分为急性白血病和慢性白血病。急性白血病可以进一步分类为急性髓性白血病(AML)和急性淋巴样白血病(ALL)。慢性白血病包括慢性髓性白血病(CML)和慢性淋巴样白血病(CLL)。其它相关病症包括骨髓增生异常综合征(myelodysplasticsyndrome)(MDS，先前称作”白血病前期”)，其是通过髓系血液细胞的无效生产(或发育异常)而统一在一起的一系列各种各样的血液学病症，存在转化为AML的危险。
本发明提供治疗癌症的组合物和方法。一方面，癌症是血液学癌症，包括但不限于血液癌症(hematolicalcancer)，白血病或淋巴瘤。一方面，本发明CART细胞可以用于治疗癌症和恶性肿瘤，包括但不限于，例如急性白血病，包括但不限于，例如，B细胞急性淋巴样白血病(BALL)、T细胞急性淋巴样白血病(TALL)、急性淋巴样白血病(ALL)；一或多种慢性白血病，包括但不限于，例如，慢性髓性白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)；其它血液学癌症或血液学病症，包括但不限于，例如，B细胞早幼淋巴细胞样白血病、母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤、伯基特氏淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞性白血病、小细胞或大细胞性-滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴组织增生病症、MALT淋巴瘤、外套细胞淋巴瘤、边缘带淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、浆细胞样树突状细胞肿瘤、Waldenstrom巨球蛋白血症、和“白血病前期”(通过髓样血液细胞的无效生产(或发育异常)而统一在一起的一系列各种各样血液学病症)，等等。其它与CD19表达相关的疾病，包括但不限于，例如，表达CD19的非典型和/或非经典的癌症、恶性肿瘤、癌前病症、或增生性疾病。
本发明还提供用于抑制CD19表达细胞群增殖或减少该细胞群的方法，该方法包括使包含CD19表达细胞的细胞群与结合该CD19表达细胞的本文所述CD19CART细胞接触。一个特定方面，本发明提供抑制CD19表达癌细胞群的增殖或减少该癌细胞群的方法，该方法包括使CD19表达癌细胞群与结合该CD19表达细胞的本发明CD19CART细胞接触。一个方面，本发明提供抑制CD19表达癌细胞群的增殖或减少该癌细胞群的方法，该方法包括使CD19表达癌细胞群与结合该CD19表达细胞的本发明抗CD19CART细胞接触。在一些方面，在髓样白血病或与CD19表达细胞相关的其它癌症的受试者或动物模型中，与阴性对照相比，本发明抗CD19CART细胞使受试者或动物模型中细胞和/或癌细胞的数量、数目、量或百分比减少至少25％,至少30％,至少40％,至少50％,至少65％,至少75％,至少85％,至少95％,或至少99％。一方面，受试者是人。
本发明还提供预防、治疗和/或管理与CD19表达细胞相关的病症(例如表达CD19的血液学癌症或非典型癌症)的方法，该方法包括向有需要的受试者施用本发明与CD19表达细胞结合的抗CD19CART细胞。一方面，受试者是人。与CD19表达细胞相关的病症的非限制性例子包括自身免疫病(例如，狼疮)、炎性病症(变态反应和哮喘)和癌症(例如表达CD19的血液学癌症或非典型癌症)。
本发明还提供预防、治疗和/或管理与CD19表达细胞相关的病症的方法，该方法包括向有需要的受试者施用本发明与CD19表达细胞结合的抗CD19CART细胞。一方面，受试者是人。
本发明还提供防止与CD19表达细胞相关的癌症复发的方法，该方法包括向有需要的受试者施用本发明与CD19表达细胞结合的抗CD19CART细胞。一方面，该方法包括向有需要的受试者组合施用有效量的结合该CD19表达细胞的抗CD19CART细胞以及有效量的其它治疗。
组合治疗
本文所述CAR表达细胞可以与其它已知活性剂和治疗组合使用。“组合”施用在本文中意指，两种(或两种以上)不同治疗在受试者罹患病症的过程中被递送给受试者，例如，在受试者被诊断出患有病症之后并在该病症被治愈或消除或由于其它原因而停止治疗之前，向受试者递送该两种或两种以上治疗。一些实施方案中，一种治疗在第二治疗递送开始时仍然在继续，由此在施用上存在重叠。有时这被称作“同时”或“并行递送”。在其它实施方案中，一种治疗递送结束后，开始其它治疗递送。在任一情况的一些实施方案中，由于组合施用，治疗更为有效。例如，与在无第一治疗的情况下施用第二治疗时相比，该第二治疗更有效，例如，施用更少的第二治疗观察到相同效果，或第二治疗更大程度地减少了症状，或者在第一治疗上观察到相似的情况。一些实施方案中，递送导致，症状或病症的其它相关参数的减少大于递送一种治疗而缺少另一种治疗时所观察到的减少。两种治疗的效果可以是部分相加的、完全相加的、或大于加合的。可以进行递送，使递送的第一治疗的效果在递送第二治疗时仍能够检测到。
本文所述CAR表达细胞和至少一种其它的治疗剂可以同时地、在相同的组合物或分开的组合物中施用，或顺序地施用。对于顺序施用，可以首先施用本文所述CAR表达细胞，第二活性剂可以第二施用，或可以将施用顺序颠倒。
在其它方面，可以在治疗方案中将本文所述CAR表达细胞与如下治疗组合使用：手术、化疗、放射、免疫抑制剂，例如环孢素(cyclosporin)、硫唑嘌呤(azathioprine)、甲氨蝶呤(methotrexate)、霉酚酸酯(mycophenolate)和FK506、抗体或其它免疫清除剂(immunoablativeagents)例如CAMPATH、抗CD3抗体或其它抗体治疗、环磷酰胺(cytoxan)、氟达拉滨(fludarabine)、环孢素(cyclosporin)、FK506、雷帕霉素(rapamycin)、霉酚酸(mycophenolicacid)、类固醇(steroids)、FR901228、细胞因子和辐射，肽疫苗例如Izumotoetal.，2008JNeurosurg108:963-971中描述的。.
一个实施方案中，本文所述CAR表达细胞可以与化疗剂组合使用。化疗剂的例子包括蒽环类(anthracycline)(例如，多柔比星(doxorubicin)(例如，脂质体多柔比星))；长春花生物碱(vincaalkaloid)(例如，长春花碱(vinblastine)、长春花新碱(vincristine)、长春地辛(vindesine)、长春瑞滨(vinorelbine)；烷化剂(例如，环磷酰胺(cyclophosphamide)、达卡巴嗪(decarbazine)、美法仑(melphalan)、异环磷酰胺(ifosfamide)、替莫唑胺(temozolomide)；免疫细胞抗体(例如，alemtuzamab,吉姆单抗(gemtuzumab)、利妥昔单抗(rituximab)、托西莫单抗(tositumomab))；抗代谢物(包括，例如，叶酸拮抗剂(folicacidantagonists)、嘧啶类似物、嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制剂(例如，氟达拉滨(fludarabine))；mTOR抑制剂；TNFR糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)激动剂；蛋白酶体抑制剂(例如，阿克拉霉素A(aclacinomycinA)、胶霉毒素(gliotoxin)或硼替佐米(bortezomib))；免疫调节剂例如沙立度胺(thalidomide)或沙立度胺衍生物(例如，来那度胺(Lenalidomide)。
考虑用于联合治疗中的一般化疗剂包括，阿那曲唑(anastrozole)比卡鲁胺(bicalutamide)硫酸博来霉素(bleomycinsulfate)白消安(busulfan)白消安注射剂(busulfaninjection)卡培他滨(capecitabine)N4-戊氧基羰基-5-脱氧-5-氟胞苷,卡铂(carboplatin)卡莫司汀(carmustine)苯丁酸氮芥(chlorambucil)顺铂(cisplatin)克拉屈滨(cladribine)环磷酰胺(cyclophosphamide)(或),阿糖胞苷(cytarabine),胞嘧啶阿糖苷(cytosinearabinoside)阿糖胞苷脂质体注射剂(cytarabineliposomeinjection)达卡巴嗪(dacarbazine)更生霉素(dactinomycin)(ActinomycinD,Cosmegan),盐酸佐柔比星(daunorubicinhydrochloride)柠檬酸佐柔比星脂质体注射剂(daunorubicincitrateliposomeinjection)地塞米松(dexamethasone),多西他赛(docetaxel)盐酸多柔比星(doxorubicinhydrochloride)依托泊苷(etoposide)磷酸氟达拉滨(fludarabinephosphate)5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)氟他胺(flutamide)替扎他滨(tezacitibine),吉西他滨(Gemcitabine)(difluorodeoxycitidine),羟基脲(hydroxyurea)伊达比星(Idarubicin)异环磷酰胺(ifosfamide)伊立替康(irinotecan)L-天冬酰胺酶(L-asparaginase)甲酰四氢叶酸钙(leucovorincalcium),美法仑(melphalan)6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine)氨甲蝶呤(methotrexate)米托蒽醌(mitoxantrone)米罗他(mylotarg),紫杉醇(paclitaxel)phoenix(钇90/MX-DTPA),喷司他丁(pentostatin),聚苯丙生20(polifeprosan20)连同卡莫司汀植入物柠檬酸他莫昔芬(tamoxifencitrate)替尼泊苷(teniposide)6-硫鸟嘌呤(6-thioguanine),塞替派(thiotepa),替拉扎明(tirapazamine)注射用盐酸拓扑替康(topotecanhydrochlorideforinjection)长春花碱(vinblastine)长春新碱(vincristine)长春瑞滨(vinorelbine)
烷化剂的例子包括，但不限于，氮芥(nitrogenmustards),乙烯亚胺衍生物(ethyleniminederivatives),烷基磺酸盐类(alkylsulfonates),亚硝基脲类(nitrosoureas)和三氮烯类(triazenes))：尿嘧啶氮芥(Aminouracil Uracilnitrogen ),甲川氯(chlormethine)环磷酰胺( RevimmuneTM),异环磷酰胺美法仑苯丁酸氮芥哌泊溴烷(pipobroman) 三乙烯三聚氰胺(triethylenemelamine) 三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramine),替莫唑胺(temozolomide)噻替派(thiotepa)白消安(Myleran)卡莫司汀罗莫司汀(lomustine)链佐星(streptozocin)和达卡巴嗪其它示例性烷化剂包括,但不限于，奥沙利铂Oxaliplatin替莫唑胺(temozolomide)(和)；更生霉素(dactinomycin)(也称作放线菌素D(actinomycin-D),)；美法仑(也称作L-PAM,L-苯基丙氨酸氮芥(L-sarcolysin)，和苯丙氨酸氮芥(phenylalaninemustard),)；六甲蜜胺(Altretamine)(也称作六甲三聚氰胺(hexamethylmelamine)(HMM),)；卡莫司汀(Carmustine)苯达莫司汀(Bendamustine)白消安(和)；卡铂洛莫司汀(Lomustine)(也称作CCNU,)；顺铂(也称作CDDP,和)；苯丁酸氮芥环磷酰胺(和)；达卡巴嗪(也称作DTIC,DIC和咪唑羧酰胺(imidazolecarboxamide),)；六甲蜜胺(Altretamine)(也称作六甲三聚氰胺(hexamethylmelamine)(HMM),Hexalen)；异环磷酰胺Prednumustine；丙卡巴肼(Procarbazine)氮芥(Mechlorethamine)(也称作氮芥(nitrogenmustard),氮芥(mustine)和氮芥盐酸盐(mechloroethaminehydrochloride),)；链佐星(streptozocin)塞替派(也称作硫代膦酰胺(thiophosphoamide),TESPA和TSPA,)；环磷酰胺和苯达莫司汀HCl(Bendamustine)
示例性mTOR抑制剂包括，例如，坦罗莫司(temsirolimus)；地磷莫司(ridaforolimus)(正式地称作deferolimus，(1R,2R,4S)-4-[(2R)-2[(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-二羟基-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-2,3,10,14,20-五氧代-11,36-二氧杂-4-氮杂三环[30.3.1.04,9]三十六碳-16,24,26,28-四烯-12-基]丙基]-2-甲氧基环己基二甲基次膦酸酯,也称作AP23573和MK8669,并描述在PCT公布号WO03/064383)；依维莫司(everolimus)(或RAD001)；雷帕霉素(rapamycin)(AY22989,)；simapimod(CAS164301-51-3)；emsirolimus,(5-{2,4-双[(3S)-3-甲基吗啉-4-基]吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基}-2-甲氧基苯基)甲醇(AZD8055)；2-氨基-8-[反式-4-(2-羟基乙氧基)环己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PF04691502,CAS1013101-36-4)；和N2-[1,4-二氧代-[[4-(4-氧代-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-2基)吗啉翁-4-基]甲氧基]丁基]-L-精氨酰甘氨酰-L-α-天冬氨酰-L-丝氨酸-内盐(SF1126,CAS936487-67-1),和XL765。
示例性免疫调节剂包括，例如，afutuzumab(可获自)；聚乙二醇化非格司亭(pegfilgrastim)来那度胺(lenalidomide)(CC-5013,)；沙立度胺(thalidomide)actimid(CC4047)；和IRX-2(包括白细胞介素1,白细胞介素2,和干扰素γ的人细胞因子混合物,CAS951209-71-5,可获自IRXTherapeutics)。
示例性蒽环类(anthracyclines)包括，例如，多柔比星(and)；博来霉素柔红霉素(daunorubicin)(盐酸柔红霉素,道诺霉素(daunomycin),和盐酸红比霉素(rubidomycinhydrochloride),)；柔红霉素脂质体(daunorubicinliposomal)(柠檬酸佐柔比星脂质体(daunorubicincitrateliposome),)；米托蒽醌(DHAD,)；表柔比星(epirubicin)(EllenceTM)；伊达比星(idarubicin)(Idamycin)；丝裂霉素C(mitomycinC)格尔德霉素(geldanamycin)；除莠霉素(herbimycin)；拉维霉素(ravidomycin)；和去乙酰基拉维霉素(desacetylravidomycin)。
示例性长春花生物碱包括，例如，酒石酸长春瑞滨(vinorelbinetartrate)长春花新碱(Vincristine)和长春地辛)；长春花碱(vinblastine)(也称作硫酸长春碱(vinblastinesulfate),长春碱(vincaleukoblastine)和VLB,和)；和长春瑞滨(vinorelbine)
示例性蛋白酶体抑制剂包括,硼替佐米(bortezomib)卡菲佐米(carfilzomib)(PX-171-007,(S)-4-甲基-N-((S)-1-(((S)-4-甲基-1-((R)-2-甲基环氧乙烷-2-基)-1-氧代戊烷-2-基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)-2-((S)-2-(2-吗啉基乙酰氨基)-4-苯基丁酰氨基)-戊酰胺)；marizomib(NPI-0052)；柠檬酸ixazomib(MLN-9708)；delanzomib(CEP-18770)；和O-甲基-N-[(2-甲基-5-噻唑基)羰基]-L-丝氨酰-O-甲基-N-[(1S)-2-[(2R)-2-甲基-2-环氧乙烷基]-2-氧代-1-(苯基甲基)乙基]-L-丝氨酰胺(ONX-0912)。
示例性GITR激动剂包括，例如，GITR融合蛋白和抗GITR抗体(例如，二价抗GITR抗体)，例如,描述在如下文献中的GITR融合蛋白：美国专利号6,111,090,欧洲专利号090505B1,美国专利号8,586,023,PCT公布号WO2010/003118和2011/090754,或描述在如下文献中的抗GITR抗体：例如，美国专利号7,025,962,欧洲专利号1947183B1,美国专利号7,812,135,美国专利号8,388,967,美国专利号8,591,886,欧洲专利号EP1866339,PCT公布号WO2011/028683,PCT公布号WO2013/039954,PCT公布号WO2005/007190,PCT公布号WO2007/133822,PCT公布号WO2005/055808,PCT公布号WO99/40196,PCT公布号WO2001/03720,PCT公布号WO99/20758,PCT公布号WO2006/083289,PCT公布号WO2005/115451,美国专利号7,618,632,和PCT公布号WO2011/051726。
一个实施方案中，本文所述CAR表达细胞与mTOR抑制剂，例如本文所述mTOR抑制剂，例如rapalog，如依维莫司(everolimus)，联合施用给受试者。在一个实施方案中，在CAR表达细胞前施用mTOR抑制剂。例如，在一个实施方案中，可以在细胞的单采血液成分术前，施用mTOR抑制剂。一个实施方案中，受试者患有CLL。
一个实施方案中，本文所述CAR表达细胞与GITR激动剂，例如本文所述GITR激动剂，联合施用给受试者。在一个实施方案中，在CAR表达细胞前施用GITR激动剂。例如，在一个实施方案中，可以在细胞的单采血液成分术前，施用GITR激动剂。一个实施方案中，受试者患有CLL。
也可以使用抑制钙依赖性磷酸酶calcineurin(环孢素和FK506)或抑制对生长因子诱导的信号传导重要的p70S6激酶(雷帕霉素)的药物。(Liuetal.,Cell66:807-815,1991；Hendersonetal.,Immun.73:316-321,1991；Biereretal.,Curr.Opin.Immun.5:763-773,1993)也可以使用。再一方面，本发明细胞组合物可以与以下治疗联合(例如，在之前、同时或之后)施用给患者：骨髓移植、使用化疗剂的T细胞清除治疗(Tcellablativetherapy)例如氟达拉滨(fludarabine)、外射线放疗(XRT),环磷酰胺,和/或抗体例如OKT3或CAMPATH。一方面，在B细胞清除治疗，例如与CD20反应的药物，例如Rituxan之后，施用本发明细胞组合物。例如，一个实施方案中，受试者可以经历标准治疗，其中在高剂量化疗之后接受外周血干细胞移植。一些实施方案中，在移植后，受试者接受输注本发明的扩增的免疫细胞。在再一实施方案中，扩增的细胞在手术之前或之后施用。
一个实施方案中，可以向受试者施用减少或改善与CAR表达细胞施用相关的副反应的活性剂。与CAR表达细胞施用相关的副反应包括，但不限于，CRS,和噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(hemophagocyticlymphohistiocytosis,HLH)，又称巨噬细胞活化综合征(macrophageactivationsyndrome,MAS)。CRS的症状包括高热、恶心、短暂性低血压(transienthypotension)、缺氧等等。因此，本文所述方法可以包括向受试者施用本发明CAR表达细胞并进一步施用活性剂以管理由CAR表达细胞治疗引起的可溶性因子的升高水平。一个实施方案中，在受试者中升高的可溶性因子是IFN-γ,TNFα,IL-2和IL-6中的一种或多种。因此，施用以处理该副作用的活性剂可以是中和这些可溶性因子之一或多个的活性剂。此类活性剂包括但不限于，类固醇、TNFα抑制剂、和IL-6抑制剂。TNFα抑制剂的一个例子是依那西普(Etanercept)。IL-6抑制剂的一个例子是托珠单抗(Tocilizumab)(toc)。
一个实施方案中，向受试者施用增强CAR表达细胞活性的活性剂。例如，一个实施方案中，所述活性剂可以是抑制抑制性分子的活性剂。抑制性分子例如程序化死亡分子1(PD1)在一些实施方案中可以减少CAR表达细胞引发免疫效应子反应的功能。抑制性分子的例子包括PD1,PD-L1,CTLA4,TIM3,LAG3,VISTA,BTLA,TIGIT,LAIR1,CD160,2B4和TGFRβ。抑制抑制性分子(例如通过在DNA、RNA或蛋白水平的抑制作用)可以优化CAR表达细胞性能。在实施方案中，抑制性核酸例如dsRNA，例如siRNA或shRNA，可以用于抑制抑制性分子在CAR表达细胞中的表达。在一个实施方案中，抑制剂是shRNA。在一个实施方案中，CAR表达细胞中抑制性分子被抑制。在这些实施方案中，抑制抑制性分子表达的dsRNA分子可以与编码CAR的成分(例如所有成分)的核酸连接。一个实施方案中，抑制性信号的抑制剂可以是例如与抑制性分子结合的抗体或抗体片段。例如，该活性剂可以是与PD1,PD-L1,PD-L2或CTLA4结合的抗体或抗体片段(例如伊匹单抗(ipilimumab)(也称作MDX-010和MDX-101,商品名Bristol-MyersSquibb；Tremelimumab(可从Pfizer获得的IgG2单克隆抗体，以前称作ticilimumab,CP-675,206))。在一个实施方案中，活性剂是与TIM3结合的抗体或抗体片段。在一个实施方案中，活性剂是与LAG3结合的抗体或抗体片段。
PD1是CD28受体家族的抑制性成员，该受体家族还包括CD28,CTLA-4,ICOS,和BTLA。PD-1在活化的B细胞、T细胞和髓样细胞上表达(Agata等1996Int.Immunol8:765-75)。PD1的两个配体，PD-L1和PD-L2，已经被证实在与PD1结合后下调T细胞活化(Freemaneta.2000JExpMed192:1027-34；Latchmanetal.2001NatImmunol2:261-8；Carteretal.2002EurJImmunol32:634-43)。PD-L1大量存在于人癌症中(Dongetal.2003JMolMed81:281-7；Blanketal.2005CancerImmunol.Immunother54:307-314；Konishietal.2004ClinCancerRes10:5094)。可以通过抑制PD1与PD-L1的局部相互作用，逆转免疫抑制。PD1,PD-L1和PD-L2的抗体、抗体片段和其它抑制剂是本领域可得的，并可以与本文所述CD19CAR组合使用。例如，纳武单抗(nivolumab)(也称作BMS-936558或MDX1106；Bristol-MyersSquibb)是特异性阻断PD-1的全人IgG4单克隆抗体。纳武单抗(克隆5C4)和其它特异性结合PD-1的人单克隆抗体公开在US8,008,449和WO2006/121168。Pidilizumab(CT-011；CureTech)是与PD-1结合的人源化IgG1k单克隆抗体。Pidilizumab和其它人源化抗PD1单克隆抗体公开在WO2009/101611。Lambrolizumab(也称作MK03475；Merck)是与PD1结合的人源化IgG4单克隆抗体。Lambrolizumab和其它人源化抗-PD1抗体公开在US8,354,509和WO2009/114335。MDPL3280A(Genentech/Roche)是结合PD-L1的人Fc优化的IgG1单克隆抗体。MDPL3280A和其它抗PD-L1人单克隆抗体公开在美国专利号7,943,743和美国公布号20120039906。其它抗-PD-L1结合剂包括YW243.55.S70(重和轻链可变区示于WO2010/077634的SEQIDNOs：20和21)和MDX-1105(也称作BMS-936559,以及例如公开在WO2007/005874中的抗-PD-L1结合剂)。AMP-224(B7-DCIg；Amplimmune；例如公开在WO2010/027827和WO2011/066342),是PD-L2Fc融合可溶性受体，阻断PD1与B7-H1的相互作用。其它抗-PD1抗体包括AMP514(Amplimmune),等等,例如公开在US8,609,089,US2010028330,和/或US20120114649中的抗PD1抗体。
在一些实施方案中，增强CAR表达细胞活性的活性剂可以是,例如包含第一结构域和第二结构域的融合蛋白,其中第一结构域是抑制性分子或其片段，而第二结构域是与阳性信号相关的多肽，例如，包含本文所述胞内信号传导结构域的多肽。在一些实施方案中，与阳性信号相关的多肽可以包括CD28,CD27,ICOS的共刺激结构域，例如CD28,CD27和/或ICOS的胞内信号传导结构域，和/或第一信号传导结构域(例如CD3ζ的第一信号传导结构域，例如如本文所述)。在一个实施方案中，在表达CAR的相同细胞中表达该融合蛋白。在另一实施方案中，该融合蛋白由不表达抗CD19CAR的细胞，例如T细胞，表达。
在一个实施方案中，增强本文所述CAR表达细胞活性的活性剂是miR-17-92。
药物组合物和治疗
本发明药物组合物可以包含本文所述CAR表达细胞，例如多个CAR表达细胞，以及一种或多种制药学或生理学可接受的载体、稀释剂或赋形剂。该组合物可以包含缓冲剂例如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；糖，例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露糖醇；蛋白质；多肽或氨基酸例如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂例如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明组合物可以在一方面配制用于静脉内施用。
本发明药物组合物可以以合适待治疗(或预防)的疾病的方式施用。尽管施用的量和频率将取决于多种因素例如患者状况、患者疾病的类型和严重度，但合适剂量可以通过临床试验确定。
一个实施方案中，药物组合物基本上不含杂质，例如不存在可检测水平的杂质，例如选自下述的杂质：内毒素、支原体、具有复制能力的慢病毒(RCL)、p24、VSV-G核酸、HIVgag、残留的抗CD3/抗CD28包被的珠、小鼠抗体、合并的人血清、牛血清白蛋白、牛血清、培养基组分、载体包装细胞或质粒组分、细菌和真菌。一个实施方案中，细菌是选自以下的至少之一：粪产碱菌(Alcaligenesfaecalis),白假丝酵母(Candidaalbicans),大肠杆菌(Escherichiacoli),流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenza),脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningitides),铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa),金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus),肺炎链球菌(Streptococcuspneumonia),化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)A组。
当提及”免疫学有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤抑制有效量”、或“治疗有效量”时，待施用的本发明组合物的准确量可以由医师考虑患者(受试者)在年龄、体重、肿瘤大小、感染程度或转移程度、以及状况方面的个体差异而确定。一般而言，包含本文所述T细胞的药物组合物可以以104到109细胞/kg体重的剂量、一些情况下105到106细胞/kg体重的剂量(包括其间所有整数值)施用。也可以以这些剂量多次使用T细胞组合物。可以通过免疫治疗领域通常已知的输注技术，施用这些细胞(参见例如，Rosenbergetal.,NewEng.J.ofMed.319:1676,1988)。
一些方面，可能期望向受试者施用活化的T细胞，并随后重新抽血(或实施单采血液成分术)，根据本发明活化由此获得的T细胞，将这些活化的扩增的T细胞重新输入患者体内。该过程可以每隔几周进行多次。一些方面，可以从10cc至400cc的血液抽取物活化T细胞。一些方面，可以从20cc,30cc,40cc,50cc,60cc,70cc,80cc,90cc,或100cc的血液抽取物活化T细胞。
可以以任何方便的方式，包括通过气溶胶吸入、注射、吞咽、输血、移植或植入，施用本发明组合物。本文所述组合物可以经动脉、皮下、皮内、肿瘤内、结节内、髓内、肌内、静脉内(i.v.)注射、或腹膜内，施用给患者。一方面，本发明T细胞组合物通过皮内或皮下注射施用给患者。一个方面，通过静脉内注射施用本发明T细胞组合物。可以将T细胞组合物直接注射到肿瘤、淋巴结或感染部位中。
在一个特别的示例性方面，可以对受试者实施白细胞单采术，其中收集、富集或离体耗竭白细胞以选择和/或分离目的细胞，例如T细胞。可以通过本领域已知方法，扩增这些T细胞分离物，并处理以便可以引入一个或多个本发明CAR构建体，由此产生本发明CART细胞。随后可以对有需要的受试者施用标准治疗——高剂量化疗之后外周血干细胞移植。一些方面，在移植之后或并行地，受试者接受扩增的本发明CART细胞输注。再一方面，在手术之前或之后施用扩增的细胞。
施用给患者的上述治疗的剂量将随着所治疗的病况的准确性质和所治疗的受体而变。可以根据本领域公认的实践，进行剂量放大以用于人施用。CAMPATH剂量例如对于成年患者一般可以在1至大约100mg范围内，通常每日施用持续1至30天。优选每日剂量是每日1至10mg，但一些情况下可以使用多达每日40mg的更大剂量(参见美国专利号6,120,766)。
一个实施方案中，例如使用体外转录，将CAR分子引入T细胞中，并且受试者(例如人)接受本发明CART细胞的初始施用、和本发明CART细胞的一个或多个随后施用，其中该一个或多个随后施用在前次施用之后不到15天，例如14,13,12,11,10,9,8,7,6,5,4,3,或2天施用。一个实施方案中，每周向受试者(例如人)施用一次以上的本发明CART细胞，例如每周施用2次、3次或4次本发明CART细胞。一个实施方案中，受试者(例如人受试者)接受每周一次以上的CART细胞施用(例如，每周2、3或4次施用)(在本文中也称作周期)，之后一周无CART细胞施用，然后再向受试者施用一次或多次该CART细胞(例如，每周一次以上的CART细胞施用)。另一实施方案中，受试者(例如人受试者)接受一个以上周期的本发明CART细胞，每个周期之间的时间少于10,9,8,7,6,5,4,或3天。一个实施方案中，每隔一天施用CART细胞，每周施用3次。一个实施方案中，施用本发明CART细胞至少2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、或更多周。
一方面，CD19CART使用慢病毒载体，例如慢病毒产生。以此方式产生的CART将具有稳定的CAR表达。
一方面，转导后，CARTs瞬时表达CAR载体4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15天。可以通过RNACAR载体递送，实现CAR的瞬时表达。一方面，CARRNA通过电穿孔转导入T细胞。
在使用瞬时表达的CART细胞(尤其是使用携带鼠scFv的CART)时可能在所治疗的患者中引起的一个潜在问题是，多次治疗后的过敏反应。
不受理论的束缚，据信，该过敏反应可能在形成体液抗CAR反应(即，具有抗IgE同种型的抗CAR抗体)的患者中引起。据认为，当暴露于抗原的过程中存在10至14天中断，患者的抗体生产细胞会经历从IgG同种型(不引起过敏反应)向IgE同种型的类型转换。
如果在瞬时CAR疗法(例如通过RNA转导产生的CAR)过程中患者有产生抗CAR抗体反应的高风险，则CART输注中断不应持续超过10至14天。
实施例
本发明通过参考以下实验实施例进一步详细描述。除非具体说明，否则这些实施例仅为了举例说明目的而提供，不旨在构成限制。因此，本发明不应以任何方式理解为限于下述实施例，相反地应理解为涵盖了根据本文教导而明显的任何和所有变形方案。
不进一步描述，可以认为本领域普通技术人员能够通过使用前述描述和下述举例说明性实施例而制备和利用本发明的组合物并实施本发明的方法。下述实施例具体指向本发明的多个方面，不应理解为以任何方式对本公开的其余部分构成限制。
实施例1：鼠抗CD19抗体的人源化
鼠CD19抗体的人源化对于临床环境可能是期望的，其中小鼠特异性残基可能在接受CART19治疗(即，用转导了CAR19构建体的T细胞治疗)的患者中诱导人抗小鼠抗原(HAMA)反应。自公开的文献(Nicholsonetal,1997,同上引文)提取杂交瘤来源的鼠CD19抗体的VH和VL序列。通过将来自鼠CD19抗体的CDR区嫁接到人种系受体构架VH4_4-59和VK3_L25(vBASE数据库)上，进行人源化。除了CDR区外，还保留了五个构架残基，即VH#71,#73,#78和VL#71#87，来自鼠序列；这些残基被认为支持CDR区的结构完整性。此外，人J元件JH4和JK2分别用于重链和轻链。所得人源化抗体的氨基酸序列分别命名为FMC63_VL_hz和FMC63_VH_hz1，见下表1。根据Kabat(KabatE.A.etal,1991,supra)进行残基编号。对于CDR定义，使用了Kabat以及Chothia(1987引文同上)两者。来自小鼠CD19的残基以粗/斜体显示。加框的位置#60/61/62指示CDRH2(也称作HCDR2)中潜在的翻译后修饰(PTM)位点。
表1：人源化CD19可变结构域的氨基酸序列(按出现的顺序分别为SEQIDNOs:114-117)。
使用这些人源化CD19IgG，以产生可溶性scFv用于检测表达和产生scFv用于完整CARTCD19构建体(见下面实施例)。有趣的是，在人源化过程中，CDRH2区中位置62优选是丝氨酸残基而非鼠CDRH2中存在的丙氨酸。该鼠序列缺少翻译后修饰(PTM)，并在CDRH2中位置60/61/62分别具有天冬酰胺-丝氨酸-丙氨酸。在人源化过程中这产生潜在PTM基序(在CDRH2中以加框方式显示)。检测了在人源化过程中产生的该PTM位点是否事实上是“真实的”PTM位点，或仅仅是理论位点。假设，氨基酸基序——天冬酰胺后接丝氨酸(NS)——可能易于发生翻译后脱酰胺，但可能不是十分明显的事。还假设，天冬酰胺后接除脯氨酸之外的任何氨基酸并随后接丝氨酸(NxS,x≠P)可能易于发生翻译后N糖基化。为了检验该假设，产生了两个IgG变体，其中60位天冬酰胺(已知为糖基化位点)被突变为丝氨酸或谷氨酰胺，并分别命名为FMC63_VH_hz2(N60S)和FMC63_VH_hz2(N60Q)。产生这些构建体，以消除该潜在的翻译后修饰位点(PTM)，并测试保留的活性(见下面的实施例2)。
克隆:
获得编码小鼠和人源化VL和VH结构域的DNA序列，并且，为在来自智人(Homosapiens)的细胞中表达，对构建体的密码子进行优化。
将编码VL和VH结构域的序列从克隆载体亚克隆到适于在哺乳动物细胞中分泌的表达载体中。将重链和轻链克隆到不同表达载体以允许共转染。表达载体的元件包括启动子(巨细胞病毒(CMV)增强子-启动子)、利于分泌的信号序列、多腺苷酸化信号和转录终止子(牛生长激素(BGH)基因)、允许附加型复制和在原核细胞中复制的元件(例如，SV40起点和ColE1或本领域已知的其它元件)、以及允许实施选择的元件(氨苄青霉素抗性基因和zeocin标记)。
表达：
在HEK293F哺乳动物细胞中以1ml规模表达嵌合的和人源化的IgG候选物。使用澄清的上清液用于FACS结合研究。更精确地，在补充了Pen/Strep的FreeStyle培养基中将HEK293F细胞稀释到5E5细胞/ml，并将1ml转移到24孔圆底深孔板中。0.5μg轻链和0.5μg重链哺乳动物表达质粒与4μl的FuGENEHD(RocheREF04709705001)一起稀释在相同培养基中。15minRT温育后，将DNA/Fugene混合物逐滴加入细胞，并放置于5％CO2温箱中250rpm,37℃孵育5天。然后通过离心从细胞分离上清液。为了测量IgG含量，将200μL等分试样放入96孔微量滴定板的孔中。所有样品和标准使用蛋白ADip和read生物传感器(FortebioCatNo18-5010)一式两份地测量。将板子放置在Octet仪器(ForteBio)中，允许在温控室中平衡至27℃。使用Octet用户软件3.0版本自动处理数据，并通过与IgG标准曲线比较以确定浓度。
通过FACS进行结合分析：
使用细胞系300.19-hsCD19FL，通过流式细胞术结合试验，评价了人源化和嵌合抗体。通过使用编码全长人CD19编码序列和天然启动子以及Zeocin抗性基因的载体(hCD19FL/pEF4-myc-HisA)转染小鼠前B细胞系300.19，产生了该细胞系。简言之，用线性化的质粒电穿孔300.19细胞，然后使用APC缀合的抗人CD19Ab(克隆HIB19来自BD555415)鉴定表达高水平hsCD19的细胞，随后使用FACSAria流式细胞仪分拣。培养分拣的hsCD19+细胞并确认其稳定表达高水平的hsCD19。
可以使用含有表达的IgG的无血清培养基，直接进行该结合试验。所有评价的IgG都标化至相同浓度(85nM),之后以三倍系列稀释方式稀释到1.4pM。然后，在96孔板中，将5x105个细胞/孔的等分试样在4℃与稀释的IgG一起孵育30分钟。细胞用FACS缓冲液(PBS中0.5％BSA)洗涤两次，之后加入在FACS缓冲液中1:1000稀释的检测抗体——APC缀合的山羊抗huIgG，Fc片段特异的(Dianova#109-136-098)。细胞在4℃再孵育30分钟，然后在FACS缓冲液中洗涤两次，使用FACSCalibur(BDBioscience)分析。使用GraphPadPrismTM3.0软件和非线形回归分析、S形剂量反应(可变斜率)，进行结合曲线作图(荧光强度平均值vs.IgG浓度)和EC50确定。
该FACS分析显示，所有评价的IgG的表观结合可以变化很大，一些构建体以IgG形式相对于scFv表现出在EC50上的5至10倍迁移。基于EC50值，选择先导候选物，其相对于嵌合参照物具有2倍以内或更好的结合亲合力。
实施例2：表征来自人源化CD19IgG抗体的抗CD19可溶性scFv片段
使用标准分子生物学技术，从实施例1所述的人源化CD19IgG，产生了可溶性scFv片段。在表征研究中使用这些可溶性scFv，以检查其稳定性、细胞表面表达和结合性质。此外，还进行实验以调查在人源化过程中引入的该潜在PTM的影响。
scFv表达和纯化
对于每个scFv构建体的转染，用100μg质粒，使用PEI作为转染试剂，以3:1(PEI:DNA)比例，转染了大约3e8293F细胞。在100mlEXPi293表达培养基(Invitrogen)中，在摇瓶中以37℃、125rpm、8％CO2，培养细胞。6天后收获培养物，用于蛋白纯化。
3500g离心20分钟，收获293F细胞。收集上清液，通过VacuCap90PFFilterUnit(w/0.8/0.2μmSuperMembrane,PALL)过滤。将大约400ulNi-NTA琼脂糖珠(Qiagen)加入上清液。转动混合物并4℃孵育4小时。上样纯化柱，用具有20mM组氨酸的洗涤缓冲液洗涤。用具有300mM组氨酸的500μl洗脱缓冲液，洗脱蛋白。在4℃用PBS缓冲液透析样品过夜。使用nanodrop2000c，定量蛋白样品。
scFv构象和胶体稳定性分析
通过DSF确定scFv的热稳定性:10-20μl蛋白样品与1:1000最终稀释度的染料Sypro橙(InvitrogenCat#S6650)混合,在PBS中总体积25μl,运行BioRadCFX1000(25℃为期2min,然后0.5℃渐增，为期30秒，从25至95℃)。
对于分析性SEC实验，以0.3ml/min流速，在nAgilent1100系列上，将在20μlPBS中的大约15-20μgscFv蛋白样品注射到TSKgelSuperSW2000上。
通过FACS结合测定EC50
小鼠细胞系300.CD19培养在含有0.5mg/mlZeocin的RPMI1640中。将大约5e5细胞/孔转移到BDFalcon96孔板。900rpm(SorvalLegendXT离心机)离心细胞3分钟。移出上清液。将抗CD19scFv蛋白样品稀释在具有5％FBS的DPBS中。将样品加入孔中，与细胞充分混合，并孵育1小时。在具有5％FBS的DPBS中洗涤细胞两次。细胞与antipolyHisPE(R&D)孵育1小时，洗涤两次，之后进行FACS分析(LSRII，来自BDBiosciences)。
通过Proteon进行动力学分析
使用Bio-RadProteon确定动力学。使用标准胺偶联，在GLC传感器芯片上实施固定化。将scFv样品在乙酸盐pH4.5中稀释至0.03mg/mL，以流速30μL/min向芯片施加300秒。然后将CD19配体系列稀释在PBS-Tween中，以50μL/min流速注射120秒，其中解离时间为480秒。使用甘氨酸pH2.5再生芯片表面。使用1:1Langmuir模型拟合数据。
CART19构建体的表面表达和FACS染色
HEK293F悬浮细胞用不同抗hCD19CART瞬时转染，转染后2天收获细胞。在V形96孔板(GreinerBio-One,Germany)每孔中接种大约1e6细胞，用0.2mlFACS缓冲液(含有4％牛血清白蛋白(BSA)(BSAfractionV,RocheDiagnostics,Indianapolis,IN)的1XPBS)洗涤3次。将细胞重悬浮在具有0.2μg生物素化的蛋白L(GenScript,Piscataway,NJ)或100nM的hCD19(AA1-291)-hIgG1Fc(GeneratedinNIBRI)的0.2mlFCAS缓冲液中，4℃温育30分钟。然后用0.2mlFACS缓冲液洗涤细胞三次，与具有1μl链霉亲和素AlexaFluor488(LifeTechnologies,GrandIsland,NY)的0.2mlFACS缓冲液(对于具有蛋白L的样品)，或与具有2μlPE抗人(JacksonImmunoResearchLaboratories,WestGrove,PA)的0.2mlFACS缓冲液(对于具有hCD19-hIgG1Fc的样品)，在暗处4℃孵育30分钟。在用0.2mlFACS缓冲液洗涤3次后，在LSRII(BDBiosciences,SanJose,CA)机器上使用FACSDiva软件(BDBiosciences,SanJose,CA)分析细胞。以活细胞的相对log荧光，分析免疫荧光染色，并测量AlexaFluor488阳性或PE阳性细胞的百分比。
分析在人源化过程中产生的潜在PMT
如实施例1中所述，有意义的是，在人源化过程中，CDRH2区中位置62优选是丝氨酸残基而非鼠CDRH2中存在的丙氨酸。检测了在人源化过程中产生的该PTM位点是否事实上是“真实的”PTM位点，或仅仅是理论位点。产生了两个IgG变体，其中60位天冬酰胺(已知为糖基化位点)被突变为丝氨酸或谷氨酰胺，并分别命名为FMC63_VH_hz2(N60S)和FMC63_VH_hz2(N60Q)。产生这些构建体，以消除该潜在的翻译后修饰位点(PTM)，并测试保留的活性。
结果
在293F细胞中表达了抗CD19人源化scFv和小鼠scFv，并通过His标签纯化。所有人源化scFv的表达和产率均比原始小鼠scFv的高得多(数据未显示)。
为了验证身份和评价完整性，分析scFv构建体，其中与N-聚糖酶F(PNGaseF)孵育或不孵育，之后进行高效液相色谱质谱(HPLC-MS)(见图3)和SDS-PAGE(数据未显示)。PNGaseF是特异地从共有序列N-X-S/T/C(其中X是除脯氨酸之外的任何氨基酸)上除去N连接的聚糖结构的酶。简言之，样品稀释在水中至0.1μg/μL，之后不加处理或与PNGaseF以1:2(w/w)PNGaseF:scFV比例在37℃温育3小时。
使用Novex的NuPAGE4-12％Bis-Tris凝胶，进行SDS-PAGE分析。每泳道上样大约2μgscFV，以200V恒压电泳40分钟。电泳后，使用PhastGelBlueR250stain(AmershamPharmacia)染色凝胶，用10％乙酸、30％甲醇脱色。
在与Xevo-Tof质谱仪偶联的Water’sAcquityUPLC系统上进行HPLC-MS分析。.每个样品大约1μg以0.5mL/min流速上样到设定至60℃的R1/102.1x100mm10μmPOROS柱(AppliedBiosciences)上。移动相由0.1％甲酸(A)和0.1％甲酸、75％异丙醇、25％乙腈(B)组成。使用反向梯度在12分钟内从25％-90％B从柱子上洗脱蛋白质。使用电喷雾正离子扫描，在600-4000Da的m/z范围，使用源锥孔电压斜坡20-50V，进行获取。使用MaxEnt1将所得质谱解卷积。
在人源化过程中引入了糖基化位点。非PTM变体(VH:N60S或N60Q)不具有该额外形式。该构建体是唯一一个在HCCDR2中具有N连接糖基化的共有位点的构建体。从SDS-PAGE分析上，对于103101-WT(S/N)之外的所有其它构建体，未处理的样品作为与序列的近似分子量相符的单一条带迁移，而103101-WT(S/N)观察到两条条带。该构建体是唯一一个在H-CDR2中具有N连接糖基化的共有位点的构建体。当用PNGaseF处理后，双条带中的较高分子量带不再存在，提示该位点被部分占据。相似地，从解卷积的质谱上观察到的分子量与从氨基酸序列预测的相符。然而，尽管其它构建体显示出了单一一种主要分子，但103101-WT(S/N)还具有比从序列预测的分子量高1217道尔顿的群体，其在PNGaseF处理后不再存在。这与单个主要N连接糖形的存在相符，基于质量可能是寡聚甘露糖5。如图3所示，该糖基化形式的存在被MS分析证实。
通过差示扫描荧光测定法(DSF)测量了构象稳定性。如图4所示，小鼠scFv的Tm是57℃，而人变体显示出在大约70℃的较高Tm。所有人源化scFv的Tm均比小鼠scFv好得多，证实所有人源化scFv均比小鼠scFv更稳定。该稳定性将可能传递给CART19构建体，从而可能导致改善的治疗性质。
使用基于SPR的检测方法，通过与hCD19表达细胞的结合，以及通过与hCD19抗原的结合，测量了纯化的scFv的活性。使用小鼠细胞系300确定scFv的结合。小鼠scFv对hCD19的EC50是大约0.6-1.6nM。人源化变体显示出在低或亚nMEC50范围内的相同范围的EC50。
实施例3：CD19CAR构建体
用于最终CAR构建体中的ScFv来源于实施例1中所描述的人源化IgG。在scFv中VL和VH结构域的顺序是变化的(即,VL-VH,或VH-VL取向)，其中使用了3或4个拷贝的“G4S”(SEQIDNO:18)亚单位(其中每个亚单位包含序列GGGGS(SEQIDNO:18)，例如，(G4S)3(SEQIDNO:107)或(G4S)4(SEQIDNO:106))，连接这些可变结构域以构建出scFv结构域的完整性，见表2。
表2.人源化CD19scFv构建体，其中显示VH和VL取向和接头长度("3G4S"公开为SEQIDNO:107，"4G4S"公开为SEQIDNO:106)。
人源化scFv片段的序列(SEQIDNOS：1-12)提供在下表3中。全长CAR构建体使用SEQIDNOs：1-12和其它序列SEQIDNOs：13-17产生，如下所示，产生了具有SEQIDNOs：31-42的全长CAR构建体。
·前导(氨基酸序列)(SEQIDNO：13)
MALPVTALLLPLALLLHAARP
·前导(核酸序列)(SEQIDNO：54)
ATGGCCCTGCCTGTGACAGCCCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCATGCCGCTAGACCC
·CD8铰链(氨基酸序列)(SEQIDNO：14)
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD
·CD8铰链(核酸序列)(SEQIDNO：55)
ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGAT
·CD8跨膜(氨基酸序列)(SEQIDNO：15)
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
·跨膜(核酸序列)(SEQIDNO：56)
ATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGC
·4-1BB胞内域(氨基酸序列)(SEQIDNO：16)
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
·4-1BB胞内域(核酸序列)(SEQIDNO：60)
AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG
·CD3ζ结构域(氨基酸序列)(SEQIDNO：17)
RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
·CD3ζ(核酸序列)(SEQIDNO：101)
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
·CD3ζ结构域(氨基酸序列NCBI参考序列NM_000734.3)(SEQIDNO：43)
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
·CD3ζ(核酸序列NCBI参考序列NM_000734.3)(SEQIDNO：44)
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
IgG4铰链(氨基酸序列)(SEQIDNO：102)
ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKM
IgG4铰链(核苷酸序列)(SEQIDNO：103)
GAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCTGCCCCCGAGTTCCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATCATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAGCAGTTCAATAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCAGCAGCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCCAAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCCGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAGGGCAACGTCTTTAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAGATG
这些克隆均在来源4-1BB的共刺激结构域的信号结构域中含有Q/K残基改变。
表3：人源化CDT9CAR构建体
scFv结构域的人源化CDR序列，对于重链可变结构域，显示在表4中，而对于轻链可变结构域，显示在表5中。“ID”代表每个CDR的相应SEQIDNO。
表4.重链可变结构域CDRs(Kabat)
候选物 FW HCDR1 ID HCDR2 ID HCDR3 ID
鼠_CART19 GVSLPDYGVS 19 VIWGSETTYYNSALKS 20 HYYYGGSYAMDY 24
人源化_CART19a VH4 GVSLPDYGVS 19 VIWGSETTYYSSSLKS 21 HYYYGGSYAMDY 24
人源化_CART19b VH4 GvsLPDYGVS 19 VIWGSETTYYQSSLKS 22 HYYYGGSYAMDY 24
人源化_CART19c VH4 GVSLPDYGVS 19 VIWGSETTYYNSSLKS 23 HYYYGGSYAMDY 24
表5.轻链可变结构域CDRs
候选物 FW LCDR1 ID LCDR2 ID LCDR3 ID
鼠_CART19 RASQDISKYLN 25 HTSRLHS 26 QQGNTLPYT 27
人源化_CART19a VK3 RASQDISKYLN 25 HTSRLHS 26 QQGNTLPYT 27
人源化_CART19b VK3 RASQDISKYLN 25 HTSRLHS 26 QQGNTLPYT 27
人源化_CART19c VK3 RASQDISKYLN 25 HTSRLHS 26 QQGNTLPYT 27
表6是检索表，将CD19构建体的数字名字与该scFv的轻重链的具体取向、分隔重链和轻链的接头单位的数目(即，(G4S)3(SEQIDNO：107)或(G4S)4(SEQIDNO：106))、以及重链CDR2中的区别性氨基酸序列关联在一起。
表6：CD19CAR命名
然后将CARscFV片段克隆在慢病毒载体中以产生在单个编码框中的全长CAR构建体，其中使用EF1α启动子用于表达(SEQIDNO：100)。
EF1α启动子
CGTGAGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGA(SEQIDNO：100).
人源化CAR构建体的分析如实施例4中所述进行。
实施例4：分析CART中的人源化CD19构建体
为了评价通过CAR技术靶向CD19的可行性，将抗CD19抗体的单链可变片段与CD3ζ链和4-1BB共刺激分子以4种不同构型克隆至慢病毒CAR表达载体中，并基于CD19CAR转导T细胞(“CART19”或“CART19T细胞”)响应CD19+靶而产生的效应T细胞反应的数量和质量，选择最佳构建体。效应T细胞反应包括但不限于，细胞扩增、增殖、倍增、细胞因子产生、和靶细胞杀伤或细胞裂解活性(脱粒)。
材料和方法
产生重定向的人源化CART19T细胞
使用人源化CART19慢病毒转移载体，产生包装在VSVg假型慢病毒颗粒中的基因组物质。慢病毒转移载体DNA与VSVg的三个包装成分gag/pol和rev以及lipofectamine试剂混合，将它们一起转染到293T细胞中。24和48hr后，收集培养基，过滤，通过超离心浓缩。所得病毒制备物储存在-80℃。通过在SupT1细胞上滴定，确定转导单位数。通过与CD3x28珠结合24小时以活化新鲜幼稚T细胞，然后加入合适数量的转导单位以获得期望的转导T细胞百分比，从而产生重定向的CART19T细胞。允许这些修饰的T细胞扩增，直到其静息下来并且大小减少，在此点冷藏细胞用于后期分析。使用CoultermultisizerIII测量细胞数量和大小。在冷藏之前，在LSRII上通过流式细胞术分析，确定转导的细胞(在细胞表面上表达CART19)的百分比和其表达的相对荧光强度。从直方图，可以通过比较转导的百分比与其相对荧光强度，检查CAR的相对表达水平。
评价人源化CART19重定向T细胞的细胞裂解活性、增殖能力和细胞因子分泌
为了评价人源化CAR19T细胞的杀伤、增殖和分泌细胞因子的功能性能力，融化细胞，过夜恢复。除了人源化CART19外，使用鼠CART19用于比较目的，而SS1-BBz作为非靶向表达的CAR用于背景CAR/T细胞效应。“对照”金标准(GS)CART19用于所有试验中以比较试验变异性。重要的是，GSCART19是在研究级别(即，非临床级别)的生产条件中产生的细胞，包括向生长培养物添加IL-2。这可能影响这些细胞的总体存活力和功能性，不应评价为与其它转导T细胞群的研究级别生产的直接比较。T细胞杀伤针对K562(表达或不表达CD19的慢性髓性白血病细胞系)或Pt14(从CLL患者分离的B细胞)。对于该流式细胞毒性试验(flowbasedcytotoxicityassay)，用CSFE染色靶细胞以定量其存在。对靶细胞进行CD19表达染色以证实相似的靶抗原水平。通过滴定10:1,3:1,1:1,0.3:1和0:1效应细胞:靶细胞比例，测量CAR19T细胞的细胞裂解活性，在此效应细胞被定义为表达抗CD19嵌合受体的T细胞。通过将合适数量的T细胞与恒定数量的靶细胞混合，开始试验。在16小时后，移出每个混合物的总体积，洗涤各孔，适当地合并。对T细胞进行CD2染色，并用live/dead标记物7AAD染色所有细胞。在最终洗涤后，将沉淀的细胞与预先确定数目的计数珠重悬在特定体积中。通过LSRII流式细胞术收集细胞染色数据，用FloJo软件分析，使用珠子以量化结果。
为了测量人源化CAR19T细胞的细胞增殖和细胞因子产生，融合细胞，过夜恢复。除了人源化CART19外，使用鼠CART19用于比较目的，而SS1-BBz作为非靶向表达的CAR用于背景CAR/T细胞效应。“对照”金标准(GS)CART19用于所有试验中以比较试验变异性。T细胞针对K562(表达或不表达CD19的慢性髓性白血病细胞系)或Pt14(从CLL患者分离的B细胞)。此外，使用CD3x28珠评价T细胞响应内源性免疫学信号的潜力。为了分析增殖，用CSFE染色T细胞。增殖为CSFE染色的稀释，反映亲本标记现分开到两个子代细胞中。该试验仅测试1:1和1:0的效应细胞:靶细胞比例，在此效应细胞被定义为表达抗CD19嵌合受体的T细胞。该试验一式两份进行，在混合细胞后24小时，50％培养基被移出/替换，通过使用Luminex10-plexpanel的人细胞因子检测，用于细胞因子分析。5天后，对T细胞进行CAR表达染色，表型分型为CD4或CD8细胞，并用7AAD进行活/死染色。在最终的洗涤后，将沉淀的细胞与预定数量的BD计数珠一起重悬在特定体积中。通过LSRII流式细胞术收集细胞染色数据，用FloJo软件分析，使用珠子以量化结果。将相对于特定数量的珠子计数到的细胞数乘以仍待计数的珠子的分数，确定总细胞计数。
为了评价人源化CART19细胞与目前成功的鼠CART19以相似方式起作用的可能性，考虑了体外评价其杀伤靶细胞、响应于靶抗原而增殖、以及表现出持久性迹象的能力。通过包装各人源化CART19慢病毒载体并在SupT1细胞上滴定，能够确定病毒的量，以将转导标化至大约50％。起始于每细胞中相似的平均整合位点，这允许更为直接地比较活性。
从被单采血液成分的正常供体的血液开始，产生治疗性CAR19T细胞，其中通过T细胞阴性选择而获得所述供体的幼稚T细胞，CD4+和CD8+淋巴细胞。这些细胞通过CD3x28珠在10％RPMI和37C,5％CO2活化。
24小时后，T细胞分裂(blasting)，加入标化量的病毒。T细胞开始分裂进入对数生长模式，通过测量每ml的细胞计数和细胞大小对此进行监视。当T细胞开始静息下来时，对数生长消退，细胞的尺寸缩小。缓慢生长速率与T细胞大小接近～300fl相组合可以确定有待进行冷藏或重刺激的T细胞状态。
通过大小观察到，存在非常类似的T细胞静息趋势。人源化CART细胞与目前的鼠CART19和UTD群之间几乎重叠的模式说明，人源化CAR19对正常T细胞激活后的扩增没有造成不寻常的作用。作为对照，使用SS1-BBz确定不想要的抗原非依赖性CAR活性。总细胞数的扩增曲线显示，各单个扩增在实际数量上的差异可能主要是由不同的起始细胞数量导致的。通过标准化起始T细胞数，针对所有CART19细胞，观察到紧密的簇集。此外，在低于且远离群组的系(line)中，检测到不想要的抗原非依赖性CAR活化效应。
确定了这些CAR19表达细胞各自的表面表达水平。针对转导标化的滴定后病毒显示出可比的表达水平，与转导效率(转导细胞的百分数)相关。一些CAR具有从早期包装外推的滴度，并且尽管它们的转导百分数较低，但其MFI也如预期地减少。结果说明，与UTD和鼠CAR19T细胞相比，人源化CAR19对细胞正常扩增的能力没有可检测的负面影响。
分析人源化CART19细胞选择性分辨表达在细胞上的细胞表面特异性表位并破坏细胞的能力。野生型K562细胞不表达CD19，但可以被转导以表达CD19。比较这些杀伤曲线，滴定效应细胞的量显示，表达CD19的那些细胞被破坏。来自相同供体并用人源化CART19细胞或现临床鼠CART19细胞修饰的重定向T细胞显示在其杀伤能力上没有区别。杀伤曲线显示，在靶向来自患者14的CD19+CLL细胞的人源化CART19细胞中发现非常相似的杀伤能力。有趣的是，总细胞裂解活性有降低(尤其是GSCART19)，说明这些细胞可能具有特异的抑制性性质。在靶细胞上表达的CD19的相似水平说明，表达水平不是导致细胞杀伤差异的原因。
在用对照CD3x28珠和CD19表达靶刺激后，人源化CART19细胞在看见靶细胞后增殖的必要性质出现于所有构建体中。用轻链到重链取向的scFv，靶向Pt14CLL细胞看起来显示稍微更高的增殖速率，其中用3x或4xGGGGS连接(分别是，SEQIDNOS107和106)时没有观察到偏向。增殖结果反映经5天累积的总细胞数，说明人源化CART19s,2146,2144,2136,2141和2137向T细胞提供更多的增殖信号。令人印象深刻的是,这是在靶向Pt14CLL细胞的人源化CART19细胞中检测到的。
总之，人源化CART19构建体针对抗原特异性靶显示出与现鼠CART19在细胞裂解活性、增殖反应、和细胞因子分泌上非常相似的特征。人源化CART19细胞(2146,2144,2136,2141和2137)在靶激活后驱动更多的增殖信号达到T细胞的潜力，似乎是这些新构建体的额外益处，以潜在地增强治疗反应。
结果
使用脱粒和细胞因子产生试验，证实工程化的CART19T细胞特异地靶向CD19+细胞。
分析了用人源化CD19CAR构建体(又称作“huCART19”)转导的ND317细胞。相对于鼠CART19和未修饰的(UTD)T细胞，在CD3x28活化和用人源化CART19候选物转导后，在T细胞扩增期间的T细胞的大小上有着严格的相似性。
实验显示，相对于鼠CART19和未修饰的(UTD)T细胞，在CD3x28活化和用不同人源化CART19候选物转导后，在T细胞扩增期间累积的T细胞数量上几乎没有差异。
人源化CART19的细胞表面表达与鼠CART19的相当，并且其表达水平非常类似于鼠CART19的。绘制各人源化CART19转导T细胞的细胞表面表达染色模式的直方图重叠，从这些图计算的平均荧光强度(MFI)与转导的细胞的百分比良好相关。
此外，人源化CART19在靶向CD19表达靶细胞方面具有相似的特异性细胞毒活性，与鼠CART19的相当。从16小时流式细胞毒性试验(flowbasedcytotoxicityassay)作图，其中滴定效应细胞:靶(E:T)比，效应细胞是人源化CART19细胞，靶向CSFE标记的K562cc(图1A.不表达CD19的对照),K562.CD19(图1B,经转导而表达CD19的K562细胞)或Pt14(图1C,来自CLL患者的B细胞)。所有人源化CART19细胞的细胞裂解活性是相似的，与鼠CART19的相当。不同靶标之间细胞裂解活性的差异是相似的和相当的，说明鼠CART19的活性在CART19的人源化形式中得到保存。
在与靶细胞混合后6天，CFSE标记的人源化CART19细胞的直方图重叠，说明其增殖能力(图5)。为了发展阳性临床反应，从CAR19传递的增殖反应是靶细胞结合和杀伤后的必要反应。SS1-BBzCSFE染色的稀释(分裂的子代细胞稀释亲本细胞染色的指示物)是未静息的T细胞以靶向非依赖性机制维持分裂的结果。
细胞群体的总增殖能力用CD3x28珠评价，所述CD3x28珠可以模拟TCR和共刺激物CD28的内源性结合。数据表明，每个细胞群体都具有相当的增殖潜力。所有人源化和鼠CART19细胞在结合表达CD19的K562细胞后均强烈地并相当地增殖。人源化CART19细胞也对获自CLL患者的B细胞产生良好反应，尽管一些似乎反应稍小。通过更大的CSFE染色稀释所证实的，如图2A和2B所示，可以看出，人源化CART19细胞2136,2137,2140,2141,2144和2146具有稍微更有力的增殖。这些构建体全部具有相同的轻链到重链的可变链取向，说明这是首选的取向。更为仔细地审视重链CDR2位点中的氨基酸改变(表1)，揭示出，在看起来遇见靶标后具有更有力增殖的构建体中，三个变体YSSSL,YQSSL和YNSSL(分别是，SEQIDNOS:28,29和30)均有出现。此外，在观察的这些构建体中，具有含3拷贝亚单位的G4S接头(3G4S)(SEQIDNO:107)和含4拷贝亚单位的G4S接头(4G4S)(SEQIDNO:106)两者，说明接头的大小不影响功能。
从上述增殖扩增，确定在肿瘤结合后5天后总细胞数。细胞显示出比最初接种时数量下降，说明需要活化来维持存活。分析内源性活化对照，显示在6天结束时总细胞计数相似。靶向表达CD19的K562细胞的人源化CART19细胞显示，两种鼠CART19细胞均终结于较高的细胞数，其中2146稍高于所有其它构建体(具有相似值)。也分析了暴露于来自患者14的B细胞(pt14)后6天的总细胞数，并且有意义的是，显示之前选出的人源化CART19构建体2146,2144,2136,2141和2137(所有均具有轻链到重链取向并代表三种氨基酸变异YSSSL,YQSSL和YNSSL(分别是SEQIDNOS:28,29和30))导致了更高的总细胞数，高于鼠CART19。在这些不同人源化抗CD19CAR克隆之间的该意料之外的差异，可能翻译为这些构建体转导的CART细胞的更好临床效力。
分析了在暴露于不表达CD19的对照K562细胞后人源化CART19细胞产生的细胞因子背景水平。使用luminex30-plexpanel，分析了24小时上清液。使用CD3x28珠从内源免疫系统刺激得到的潜在细胞因子谱指示，每个细胞群都具有相当的细胞因子谱。
数据也显示，人源化CDRT19和鼠CART19当响应于相同靶标时以相似水平产生相似的细胞因子谱。当靶向Pt14靶细胞时，细胞因子谱较低但相似。
实施例5：在体内ALL模型中人源化CD19CART细胞治疗
可以在免疫受损小鼠中生长原代人ALL细胞，而无需体外培养这些细胞。可以使用这些小鼠检查嵌合抗原受体(CAR)T细胞在模型中的效力，其中所述模型代表将出现在临床上的患者群。在此使用的模型HALLX5447，在用于检测CART细胞功效的研究之前，在NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)小鼠上已经传代了两次。
之前已经证实，鼠CD19CART细胞可以在原代人ALL的NSG小鼠模型中靶向并杀死白血病细胞。将CD19scFv(单链Fc可变片段)人源化，并且在本实施例中相对于鼠CD19CART细胞，比较表达人源化CD19CAR(CAR2)的T细胞在体内消除ALL肿瘤细胞的能力。在此，通过人CD19+细胞的外周血FACS分析，在具有建立的原代人ALL的小鼠中直接地比较了这些细胞的效力。在静脉内植入1.5x106原代ALL细胞后，到肿瘤植入后2周，血液中达到2.5-4％CD19+人细胞的疾病负荷。该CD19百分数是基于小鼠血液中总细胞的百分数。在小鼠中在CART细胞处理前100％的人细胞是肿瘤细胞。在外周血中2％以上百分数的CD19+人细胞被视为在该模型中建立了人ALL疾病。一旦白血病在小鼠中建立后，大约在肿瘤植入后2至3周，用CART细胞治疗白血病携带小鼠。每组小鼠用5x106总人T细胞治疗。用CAR表达慢病毒转导该供体人T细胞的转导效率是40-60％。在用T细胞治疗后，每周从小鼠采血，用于分析血液中CD19+人细胞的百分数作为疾病进程的生物标志。
材料和方法
原代人ALL细胞:原代细胞在植入前不进行体外培养。从ALL患者收获这些细胞，然后转移到小鼠中用于建立和扩增。在小鼠中扩增肿瘤细胞后，收获骨髓和脾细胞，并分批存活冷冻用于再植入。细胞以每毫升5x106个细胞的最小浓度冷冻在90％DMSO和10％FBS中。为了再植入，融化冷冻的ALL细胞，然后静脉内注射入NSG小鼠中，以产生带有ALL的小鼠，该小鼠将用于比较人源化CD19CART细胞和鼠CD19CART细胞的抗肿瘤功效。
小鼠：6周龄NSG(NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ)小鼠从Jackson实验室(储存编号005557)获得。允许动物适应NovartisNIBRI动物设施至少3天，之后用于实验。根据NovartisACUC条例和指南，处理动物。
肿瘤植入：体内系列传代的原代人ALL细胞，模型HALLX5447,在37℃水浴中融化。然后，将细胞转移到15ml锥形管中，用冷无菌PBS洗涤两次。然后计数原代ALL细胞，以每毫升PBS中15x106个细胞的浓度重悬。将细胞置于冰上，立即(1小时内)植入小鼠。通过尾静脉在100μl体积中静脉内注射ALL细胞，每只小鼠总共1.5x106个细胞。
CART细胞给药：在肿瘤植入后16天，给小鼠施用5x106个T细胞。在37摄氏度水浴中将细胞部分融化，然后向含有细胞的管中加入1ml冷的无菌PBS以将细胞完全融化。然后，将融化的细胞转移到15mlfalcon管中，用PBS调整到10ml最终体积。以1000rpm洗涤细胞两次(每次10分钟)，然后在血细胞计数器上计数。然后以每毫升冷PBS中50x106个细胞的浓度重悬T细胞，保持在冰上直到向小鼠给药之前。通过尾静脉给小鼠静脉内注射100μlCART细胞，剂量为每只小鼠5x106个T细胞。用100μlPBS单独(PBS)、未转导的T细胞(模拟物mock)、小鼠CD19CART细胞(muCTL019)、或人源化CD19CART细胞(huCTL019)，处理每组5只小鼠。该未转导的T细胞、muCTL019T细胞和huCTL019T细胞从相同人供体平行地制备。
动物监测：每天监测小鼠的健康状况，包括每周两次体重测量。体重改变的百分数计算为(BWcurrent–BWinitial)/(BWinitial)x100％。通过外周血FACS分析，每周监测肿瘤负荷。每周通过尾静脉从小鼠采血，放入置于冰上的EDTA包被管中。从管中取10-20μl血液接种到冰上的96孔板中。用ACK红细胞裂解缓冲液(LifeTechnologies,产品目录号A10492-01)裂解红细胞，然后用冷PBS洗涤两次。将具有人和小鼠Fc阻断物(MiltenyiBiotec,目录号130-059-901和130-092-575)的Fc阻断混合物与细胞一起温育30分钟，之后与抗人CD19抗体温育30分钟。用2％多聚甲醛溶液固定细胞20分钟，洗涤并储存在PBS+2％FBS中过夜，之后在BDCanto或Fortessa上分析，之后用FlowJoFACS分析软件进一步分析。分析细胞，以确定人CD19+细胞在携带人HALLX5447ALL肿瘤的NSG小鼠的血液中的百分数。血液中CD19百分数报道为平均值±平均值的标准差(SEM)。
使用下面的公式计算治疗/对照(T/C)值百分数：
如果ΔT≥0，％T/C＝100xΔT/ΔC；
如果ΔT<0，％消退＝100xΔT/T初始；
其中，T＝研究最后一天时药物处理组的平均外周血CD19百分数；T初始＝给药第一天时药物处理组的外周血CD19百分数；ΔT＝研究最后一天时药物处理组的平均外周血CD19百分数–给药第一天时药物处理组的平均外周血CD19百分数；C＝研究最后一天时对照组的平均外周血CD19百分数；和ΔC＝研究最后一天时对照组的平均外周血CD19百分数–给药第一天时对照组的平均外周血CD19百分数。
在100％至42％的范围中的T/C值被解释为没有或具有极小的抗肿瘤活性；<42％且>10％的T/C值被解释为具有抗肿瘤活性或肿瘤生长抑制作用。<10％的T/C值或>-10％的消退值被解释为具有肿瘤停滞作用。<-10％的消退值被报道为消退。
结果
在原代人ALL模型中，评价并直接比较了鼠和人源化CD19CART细胞的抗肿瘤活性。在第0天肿瘤植入后，将小鼠随机分到处理组中，并在第16天通过静脉内用5x106个T细胞处理。监测ALL疾病负荷和动物健康，直到动物达到终点。在肿瘤植入后第65天对所有组中的小鼠实施安乐死，此时对照组中疾病负荷为外周血中80％以上的人CD19+细胞。
在对照组和以鼠或人源化CD19CART细胞治疗的组之间观察到明显的疾病负荷差异，自肿瘤植入后第24天起P<0.01,并且持续到第65天研究结束时。鼠和人CD19CART细胞表现出控制人HALLX5447ALL肿瘤细胞在NSG小鼠中生长的相似能力。两组均在HALLX5447植入后第21天表现出12-15％人CD19+细胞的峰值外周血疾病水平。肿瘤细胞植入后42天，在huCTL019组中没有检测到人CD19+细胞，而在muCTL019组中人CD19+细胞的百分数降低到大约1％。鼠和人源化CD19CART细胞两者导致了控制原代人ALL细胞在该模型中扩增的相当能力(P>0.05)。对于模拟(mock)转导的T细胞群，％T/C值为94.40％，说明该模拟转导的T细胞不具有抗肿瘤活性。muCTL019组的消退百分数是-89.75％，huCTL019组的是-90.46％,说明这些处理均能够造成HALLX5447肿瘤模型的消退。外周血人CD19+细胞百分数作为这些小鼠中疾病负荷的量度显示在图7中。PBS处理组未接受任何T细胞，显示了在静脉内植入的NSG小鼠中基线的原代ALL肿瘤生长动力学。模拟处理组接受了未转导的T细胞，所述T细胞经历了与CART细胞相同的体外扩增过程。这些细胞用作T细胞对照以显示在该肿瘤模型中T细胞的非特异性反应。PBS和模拟转导T细胞处理组两者在实验的整个过程中均表现出了持续的肿瘤进展。鼠和人源化CD19CART细胞两者均在5x106个T细胞注射的一周内控制了疾病进展，并在该65天研究的过程中显示出维持疾病控制的相似能力。
在携带原代人ALL模型HALLX5447的NSG小鼠中，在功效研究中，评价了鼠和人源化CD19CAR转导T细胞的抗肿瘤活性。该研究证实，在原代人ALL模型中鼠和人源化CD19CART细胞(muCTL019和huCTL019)均能够发动抗肿瘤反应。此外，该反应(通过外周血疾病负荷测定)对于muCTL019和huCTL019细胞是相同的。在向小鼠施用T细胞的1周内，鼠和人源化CD19CART细胞两者均控制了原代ALL的生长。处理后起初，疾病负荷持续增加，之后降低至实际上无法检测的水平。在对照处理小鼠的65天疾病进展过程中，用小鼠或人源化CART细胞一次处理导致了维持的抗肿瘤反应。与用鼠CD19CART细胞时观察到的相比，人源化CD19CART细胞展示出发动有效抗CD19肿瘤反应和控制ALL疾病负荷的相似能力。
实施例6：CD19CART细胞用于治疗多发性骨髓瘤
甚至是使用化疗，靶向治疗、和自体干细胞移植的目前方案，骨髓瘤仍被视为不可治愈的疾病。本实施例描述用定向于CD19的自体T细胞治疗多发性骨髓瘤(MM)，其中所述自体T细胞具有嵌合抗原受体(慢病毒/CD19:4-1BB:CD3ζ；也称作“CART19”或CTL019)。本实施例证实，基于靶向表达非常低(通过大多数方法无法检测)水平的CD19的骨髓瘤干细胞和/或肿瘤细胞，CD19定向的CAR治疗具有建立深度的长期持久性消退的潜力。
在治疗患有侵袭性继发性浆细胞白血病(secondaryplasmacellleukemia)的患者时，我们发现，在通过多线化疗已经进展的患者中，在拯救自体干细胞移植后两天施用的CART19导致了对浆细胞白血病的快速清除和非常好的部分反应。在该治疗前，所述患者持续数月依赖于输血；在治疗后两个月时，她恢复了其血液计数(具有正常范围的血小板计数和白细胞计数)，并且自她通过该治疗而离开医院起，她一直没有需要输血。
由于骨髓瘤细胞并不天然表达CD19，该发现——CART19治疗在该肿瘤中诱导了快速和显著的肿瘤反应——是令人惊奇的。不希望受特定理论的束缚，推测CART19能够用于治疗骨髓瘤的原因是：(1)尽管骨髓瘤细胞通过流式细胞术在传统上被认为是CD19表达阴性的，但有数据表明，骨髓瘤细胞可以表达非常低水平的CD19，以致于该表达可以通过RNA检测但不能通过流式细胞术或免疫组织化学检测；和(2)靶向克隆型B细胞的想法，克隆型B细胞被认为是造成多发性骨髓瘤的癌性干细胞并尤其地抵抗化疗。在B细胞和骨髓瘤肿瘤细胞之间存在克隆关系，但传统的骨髓瘤疗法瞄准的是恶性浆细胞而非B细胞。用于治疗骨髓瘤的CART19因此与大多数骨髓瘤疗法靶向不同的细胞群。
在我们的单个患者经验中，该患者具有循环浆细胞，我们能够检测其肿瘤细胞的CD19表达。其肿瘤细胞的大约1-2％表达CD19抗原。(图8)。因此，推断，CART19可能对其肿瘤细胞中非常小的群体具有直接作用；非常好的部分反应——尽管基于仅靶向该非常小的CD19+肿瘤细胞群，这是不被预期的。
在该例中，在高剂量美法仑后的自体干细胞移植拯救后，施用了CART19。尽管这在骨髓瘤中是标准疗法，但其不是治愈性的。此外，该患者之前已经经历过了串联自体干细胞移植，并在移植后早期(<6月)复发。不希望受特定理论的束缚，本实施例中所述CART19细胞的使用，当与拯救自体干细胞移植组合时，可能具有非重叠的骨髓瘤治疗机制。
在I期试验中用CART19治疗另外10名多发性骨髓瘤患者。
剂量原理和危险/益处
对于此方案，我们已经选择通过静脉施用途径使用固定剂量(flatdosing)。该方案的主要目的是，检查向多发性骨髓瘤患者施用CART-19细胞的安全性和可行性。预期的主要毒性是：(1)当CAR遭遇恶性或正常B细胞上其CD19抗原替代物(surrogate)时细胞因子的释放；(2)类似于利妥昔单抗治疗，正常B细胞的耗竭；(3)类固醇反应性皮肤和胃肠道综合征，类似于移植物抗宿主疾病(之前在将扩增的/共刺激的自体T细胞与ASCT偶联用于MM时已经观察到)。理论上的担心是，响应于高水平CD19，可能发生CART-19T细胞的转化或不受控增殖。与另一CLL患者研究相比，这在本应用中是较少担心的，因为在MM中克隆型B细胞的负荷预期比该研究处理的顽固性CLL患者中恶性B细胞的负荷要低得多。
剂量原理
使用头3名患者，我们已经以1.4xl07至1.1xl09个CART-19细胞的剂量观察了临床活性。该观察显示，至少在治疗的该头3名患者中，没有明显的剂量反应关系。在施用了两个log倍数差异剂量的患者中观察到了完全反应。因此，与被代谢的标准药物不同，CART细胞可以具有宽剂量反应范围。这极为可能是因为CART细胞能够在患者中广泛地增殖。因此，我们设定l-5x108个CART-19细胞的剂量范围用于输注。在基于体恤使用基础提供的该单患者研究中，向该患者提供了不超过5xl08个CART19细胞，没有剂量下限。对于该10名患者试验，患者将被提供1-5x107个CART-19细胞。
一般设计
这是基于体恤使用基础提供的单患者研究；其仿照I期研究以确定是否输注经转导而表达CART-19的自体T细胞是完全的。本研究的第一目的是，CART-19T细胞在患者中的安全性、耐受性和植入可能性，其中所述患者在第一ASCT后早期复发后经历拯救ASCT。该方案是开放标签先导性研究(openlabelpilotstudy)。
在入选时，受试者经历骨髓活检和对其MM的常规实验室和影像评价。对符合条件的受试者实施稳态白细胞单采术，以获得大量外周血单个核细胞(PBMC)用于CART19生产。从PBMC纯化T细胞，用TCRζ/4-1BB慢病毒转导，体外扩增，然后冷冻用于将来的施用。与成功生产了T细胞的患者的数量相比，记录具有不足的T细胞收集、扩增或生产的患者的数量；产品生产的可行性在该患者群体中预期不是问题。
受试者一般已经具有在准备其第一次ASCT而实施动员/采集时保留下来可以进行两次额外ASCT的充足外周血干细胞。对于没有充足外周血干细胞的受试者，可以在进行稳态单采血液成分术之前或之后，接受二次动员/采集程序，其中方案可以根据治疗医师的偏好采用。在最初的白细胞单采术后大约2周，受试者入院，接受高剂量美法仑(第-2天)，之后在2天后(第0天)接受自体干细胞输注，并且所有患者在4天后(第+2天)接受CART-19细胞输注。入选多达10名患者。
规律间隔地对所有受试者进行血液检查至研究的第4周，以评估CART-19细胞的安全性、植入和持久性。在第+42和+100天，对受试者进行骨髓穿刺/活检，评价骨髓浆细胞负荷和CART-19细胞向骨髓的转运。根据国际骨髓瘤工作组(IMWG)标准136在第100天进行正式反应评价(formalresponseassessment)，并根据用于多发性骨髓瘤患者的常规临床实践监测TTP。在本研究中测量的主要功效结果是，患者初始ASCT后的TTP与在本研究中ASCT后的TTP的比较。
因为本研究的主要终点是CART-19细胞输注与ASCT一起的安全性和可行性，故本研究将使用早期终止原则。简言之，如果在头5名治疗的患者中出现少于2个严重的意料不到的不良事件，则研究将增加另外5名患者，达到10的靶入选。在CART-19输注后观察治疗的受试者40天(即，在第42天，通过第一官方反应评价)，之后入选随后的受试者，直到5名患者均已经入选并如此进行了观察。对于第二组5名患者的治疗，患者之间不要求等待期。
在深度随访6个月后，至少为期2年，按季度，通过医学史、身体检查和血液检查，评价受试者。在该评价之后，受试者进入滚动式研究，每年通过电话和问卷随访，再持续多达13年，以对长期健康问题的诊断，例如新恶性病的出现，进行评价。
主要研究终点
先导性试验设计以检查转导了CD19TCRζ/4-lBB的自体T细胞在患者中的安全性和可行性，其中所述患者在第一次ASCT后的早期复发后接受MM的拯救ASCT。
主要安全性和可行性终点包括：
定义为NCJCTC2的研究相关不良事件的发生：自输注起到第24周的任何时间上，可能、也许或确定与研究治疗相关的3级体征/症状、实验室毒性、和临床事件。这包括输注毒性和可能与CART-19细胞相关的任何毒性，包括但不限于：
a.发热
b.皮疹
c.中性粒细胞减少(Neutropenia),血小板减少(thrombocytopenia),贫血(anemia),骨髓发育不良(marrowaplasia)
d.肝功能缺陷(Hepaticdysfunction)
e.肺浸润或其它肺毒性
f.影响胃肠道或皮肤的GVHD样症状
从患者单采血液成分术产品生产CART-19细胞的可行性。就载体转导效率、T细胞纯度、存活力、无菌性和肿瘤污染，确定不符合发放标准的生产产品的数量。
将自体干细胞移植和CART19后反应的深度和持续时间，与标准自体干细胞移植后每个患者最初实现的反应深度和持续时间，进行比较。
受试者选择和撤回
入选标准
受试者必须已经经历过MM的在先ASCT，并在干细胞输注的365天内已经疾病进展。作为计划的串联ASCT巩固方案的一部分已经经历了两次在先ASCT的受试者是合格的。根据IMWG的进展性疾病标准，或针对初始ASCT后获得CR或sCR的患者，根据自CR复发的标准，定义进展(Durieetal.Leukemia2006；20(9):1467-1473)。N.B.:不要求患者必须在在先ASCT的365天内入选，并且在入选本研究之前在在先ASCT之后在复发/进展后患者可以接受其它活性剂治疗，包括实验性活性剂。
受试者必须已经签署了书面知情通知书。
在美法仑输注日之前12周内测量，受试者必须具有如以下标准定义的充分的生命器官功能以接受高剂量美法仑：a.血清肌酐≤2.5或估计的肌酐清除率≥30ml/min并且不是透析依赖性的。b.SGOT≤3x正常上限且总胆红素≤2.0mg/dl(高胆红素血症归因于Gilbert综合征的患者除外)。c.左心室射血分数(LVEF)≥45％，或如果LVEF<45％，则由心脏病学家给出确定无临床显著的心血管功能损伤的正式评价。LVEF评价必须已经在入选的6周内实施。d.充足的肺功能，具有FEV1,FVC,TLC,DLCO(在针对肺容量和血红蛋白浓度进行了适当调整后)≥40％的预期值。肺功能检查必须已经在入选的6周内实施。
受试者必须具有0-2的ECOG活动状态(ECOGperformancestatus)，除非更高的活动状态仅仅由于骨疼引起。
淘汰标准受试者必须无：
任何活动和不受控的感染。
活动性乙肝、丙肝、或HIV感染。
列出的、排出参与的任何不受控的医学症状
治疗方案
复发/进展性多发性骨髓瘤的治疗
患者在入选前可以根据其治疗医师的偏好接受复发/进展性多发性骨髓瘤治疗。治疗可以持续到入选时。
患者必须在单采血液成分术之前两周和高剂量美法仑之前2周终止所有治疗。如果在单采血液成分和高剂量美法仑之间预期经过2周以上，则患者可以在单采血液成分后在其治疗医师判定下继续治疗。
高剂量美法仑(第-2天)
患者在第-3或-2天入院，经主治医师检查和常规实验室检查，包括监测肿瘤溶解综合征(tumorlysissyndrome)的参数，之后开始本治疗方案。如果在入院7日内尚未抽取血液用于MM监测性实验室检查(SPEP,定量免疫球蛋白、和无血清轻链分析)，则在治疗开始前抽血用于该检查。
高剂量治疗为，在第-2天，经过大约20分钟静脉内施用200mg/m2剂量的美法仑。在>70岁的患者中，或在经治疗医师判定可能不能耐受200mg/m2剂量的任何年龄患者中，美法仑剂量可以降低到140mg/m2。所有患者接受标准镇吐药预防治疗——这可以包括地塞米松——和标准抗生素预防治疗。
干细胞再输注(第0天)
在高剂量美法仑施用后至少18小时，在第0天进行干细胞输注。根据标准机构实践，在术前用药后，经过大约20-60分钟静脉内输注干细胞。应当输注至少2x106CD34+祖先细胞/kg体重。此外，应当可以获得至少1x106CD34+祖先细胞/kg体重，作为备份干细胞产品以在万一发生延迟的植入或后期植入失败时用于输注。G-CSF应当在第+5天开始SQ施用，剂量根据标准机构实践给予。其它支持性护理措施，例如输血支持，将根据标准机构指南进行。
CART19细胞输注(第+2天)
给予的单剂CART-19转导T细胞为多达5x107CART-19细胞。在单患者方案中，对于输注CD19TCRζ4-1BB载体转导的细胞，无最小可接受剂量。CART-19细胞作为单剂通过快速i.v.输注在干细胞输注后于第+2天给予。
维持来那度胺
在第一次ASCT后接受并耐受维持来那度胺的患者，如果按照治疗医师判断不存在禁止征象，则在大约第+100天重新开始来那度胺维持治疗。
制备和施用研究药物
在CVPF中制备CART19T细胞，并直到满足FDA批准的输注细胞发放标准(例如，细胞剂量、细胞纯度、无菌性、平均载体拷贝数/细胞等等)后才从CVPF发放。一旦发放后，细胞被拿到病床边施用。
细胞融化。冷冻的细胞在干冰上运输至受试者的床边。在床边使用维持在36℃至38℃的水浴融化细胞。轻柔地按揉袋子直到细胞恰好融化。容器中应当无冷冻块残留。如果CART-19细胞产品看上起有损坏或者袋子渗漏、或以其它方式看上起受损，则应当不用于输注，并应当返回CVPF，见如下详述。
术前用药。T细胞输注后的副作用包括暂时性发热、恶寒、和/或恶心；综述参见Cruz等(Cytotherapy2010；12(6):743-749)。推荐，在输注CART-19细胞前，受试者接受醋氨酚(acetaminophen)和苯海拉明(diphenhydramine)盐酸盐术前给药。这些药物可以按需每6小时重复一次。如果患者持续有不能通过醋氨酚缓解的发热，则可以处方非类固醇抗炎药疗程。推荐，除了在危及生命的紧急情况时外，在任何时候，患者都不接受系统的皮质类固醇药物，例如，氢化可的松、泼尼松、甲泼尼龙、或地塞米松，这是因为这可能对T细胞产生不良影响。如果皮质类固醇药物被要求用于急性输注反应，则推荐100mg初始剂量的氢化可的松。
发热反应。在受试者于CART细胞输注后出现败血病或全身性菌血症的不太可能事件中，应当启动适当的培养和医学管理。如果怀疑CART-19T细胞产品污染，则可以使用储存在CVPF中的存档样品，重新检查该产品的无菌性。
施用。输注在Rhods中在隔离室中进行，使用用于免疫抑制患者的预防措施。通过快速静脉内输注，以大约10ml至20ml每分钟的流速，通过具有3通道活塞的18号无乳胶Y型血液组合，施用转导的T细胞。输注持续时间大约2-20分钟。每个输注袋将附有含有如下内容的标签：“仅自体使用”。此外，标签将具有至少两个独特标识，例如患者的姓名首字母、出生日期和研究编号。在输注前，两名个体将在受试者在场的情况下独立地验证所有该信息，由此确认该信息与该参与者是正确匹配的。
紧急医疗设备(即，紧急手推车)在输注过程中可得，以防受试者出现过敏反应、或严重的低血压危险、或任何与输注相关的其它反应。生命体征(温度、呼吸速度、脉搏和血压)将在输注前和后测量，然后持续至少一小时每15分钟测量一次，直到这些体征良好且稳定。在医师认为可以安全离开之前，受试者被要求不要离开。
包装
输注为单剂1-5x108个CAT19转导的细胞，其中对于输注，最小可接受剂量是1x107CART-19细胞。每个袋子含有等分(剂量依赖性体积)的cryomedia，其含有如下输注级别的试剂(％v/v):31.25％plasmalyte-A,31.25％葡萄糖(5％),0.45％NaCl,多达7.5％DMSO,1％葡聚糖40,5％人血清白蛋白。
单采血液成分术
在单采血液成分中心，进行大体积(12-15升或4-6血液体积)的单采血液成分术程序。在该过程中，获取PBMC用于CART-19。为生产CART-19T细胞，从单次白血病单采，旨在收获至少50x109个白细胞。也可以获得用于FDA回顾要求和用于研究的基线白细胞，并冷藏。预期细胞产品在大约2-4周后可以准备好用于发放。流式细胞术淋巴细胞子集定量，包括CD19和CD20B细胞确定。针对人抗VSV-G和抗鼠抗体(HAMA)，进行基线评价。如果受试者先前已经根据现药品生产和质量管理在临床细胞和疫苗生产机构保存了充足的单采血液成分术收集物，则这些细胞可以用作CART-19生产的细胞来源。使用保存的单采血液成分术产品，可以避免受试者接受额外单采血液成分术收集的费用、时间和风险。
细胞减少性化疗
本文所述的高剂量美法仑是淋巴细胞耗竭性化疗。
CART-19输注
输注开始于干细胞再输注后第+2天。
在第一次输注前第+2天，对患者实施CBC伴分类、和CD3、CD4及CD8计数评价，这是因为给予的化疗部分地诱导淋巴细胞减少。
第一剂量将以单剂形式施用。在患者床边融化细胞。融化的细胞以可以耐受的快输注速度施用，由此输注持续时间为大约10-15分钟。为了利于混合，使用Y适配器，同时施用细胞。如本文所述，对受试者进行输注和术前给药。在给药前、在输注结束时、以及之后1小时每15分钟，评价受试者的生命体征并进行脉搏血氧定量，直到这些均良好且稳定为止。在第一次输注前任何时间和每次输注后20分钟至4小时，获取用于确定基线CART-19水平的血液样品(并送至TCSL)。
出现与高剂量美法仑相关毒性的患者将延迟其输注方案，直到这些毒性获得解决。导致有必要延迟T细胞输注的具体毒性包括：1)肺：要求补氧以保持大于95％的饱和度或X射线胸片上存在进展的放射照像异常；2)心脏:不受医学管理控制的新心律失常；3)要求血管加压支持的低血压。4)活动性感染：在T细胞输注的48小时内针对细菌、真菌或病毒的阳性血液培养。
毒性管理
不受控的T细胞增殖。与同种异体或自体T细胞输注相关的毒性使用药理学免疫抑制疗程进行管理。已经报道了T体相关毒性响应全身性皮质类固醇药物。如果发生不受控的T细胞增殖(与CART-19细胞相关的3或4级毒性)，则可以使用皮质类固醇药物治疗受试者。用脉冲甲泼尼龙(2mg/kgi.v.分剂量q8hrx2天)，之后快速渐减，处理受试者。
此外，基于在另一方案上治疗的患者的观察结果，对巨细胞活化综合征(MAS)存在一些担心，但是CD19+肿瘤负荷预期在骨髓瘤患者中比在ALL患者中低得多。该毒性的治疗和治疗时机将取决于患者医师和研究调差人员的判断。建议的管理可以包括：如果受试者有高于101°F的发热并持续连续2天以上并且无感染迹象(阴性血液培养、CXR或其它来源)，则可以考虑tocilizumab4mg/kg。根据医师的判断，可以考虑添加皮质类固醇药物和抗TNF治疗。
B细胞耗竭。可能发生B细胞耗竭和低丙种球蛋白血症。这在抗CD20定向的治疗中是常见的。在临床显著低丙种球蛋白血症(即，全身感染)的情况下，受试者可以根据建立的临床剂量指南被给予静脉内免疫球蛋白(IVIG)以恢复正常水平的血清免疫球蛋白水平，如在使用利妥昔单抗时那样。
主要移植失败。主要移植失败(即，未植入)可能在第二次ASCT后比在第一次ASCT后更常见。合格性标准规定，必须可以得到根据治疗医师判断在主要移植失败的情况下用于拯救再输注的足够干细胞。
等同方案
本文引用的每一份和所有专利、专利申请和出版物的内容均特此完整地并入此处作为参考。尽管本发明已经就特定方面进行了公开，但明显地，本领域技术人员可以想到本发明的其它方面和变形，而不偏离本发明的真实精神和范围。后附权利要求书应理解为包括所有这些方面和等同变形方案。

Claims (97)

1.编码嵌合抗原受体(CAR)的分离核酸分子，其中该CAR包含包括人源化抗CD19结合结构域的抗体或抗体片段、跨膜结构域、和包含刺激结构域的胞内信号传导结构域，其中所述抗CD19结合结构域包含表3所列任何抗CD19轻链结合结构域氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCCDR1)、轻链互补决定区2(LCCDR2)和轻链互补决定区3(LCCDR3)之一个或多个、以及表3所列任何抗CD19重链结合结构域氨基酸序列的重链互补决定区1(HCCDR1)、重链互补决定区2(HCCDR2)和重链互补决定区3(HCCDR3)之一个或多个。
2.权利要求1的分离核酸分子，包含表3所列任何抗CD19轻链结合结构域氨基酸序列的LCCDR1、LCCDR2和LCCDR3。
3.权利要求1的分离核酸分子，包含表3所列任何抗CD19轻链结合结构域氨基酸序列的HCCDR1、HCCDR2和HCCDR3。
4.权利要求1的分离核酸分子，包含表3所列任何抗CD19轻链结合结构域氨基酸序列的LCCDR1、LCCDR2和LCCDR3，以及表3所列任何抗CD19重链结合结构域氨基酸序列的HCCDR1、HCCDR2和HCCDR3。
5.权利要求1的分离核酸分子，包含表3所列任何轻链可变区。
6.权利要求1的分离核酸分子，包含表3所列任何重链可变区。
7.权利要求1的分离核酸分子，包含表3所列任何轻链可变区和表3所列任何重链可变区。
8.任何前述权利要求的分离核酸分子，其中CD19结合结构域是scFv。
9.任何前述权利要求的分离核酸分子，其中轻链可变区包含在表3所示轻链可变区的氨基酸序列中具有至少一个、两个或三个修饰但不超过30个、20个或10个修饰的氨基酸序列、或与表3所示氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。
10.任何前述权利要求的分离核酸分子，其中重链可变区包含在表3所示重链可变区的氨基酸序列中具有至少一个、两个或三个修饰但不超过30个、20个或10个修饰的氨基酸序列、或与表3所示氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。
11.任何前述权利要求的分离核酸分子，其中抗CD19结合结构域包含选自SEQIDNO:1,SEQIDNO:2,SEQIDNO:3,SEQIDNO:4,SEQIDNO:5,SEQIDNO:6,SEQIDNO:7,SEQIDNO:8,SEQIDNO:9,SEQIDNO:10,SEQIDNO:11,和SEQIDNO:12的序列、或与其具有95-99％同一性的序列。
12.任何前述权利要求的分离核酸分子，其中编码抗CD19结合结构域的核酸序列包含选自SEQIDNO:61,SEQIDNO:62,SEQIDNO:63,SEQIDNO:64,SEQIDNO:65,SEQIDNO:66,SEQIDNO:67,SEQIDNO:68,SEQIDNO:70,SEQIDNO:71和SEQIDNO:72的序列、或与其具有95-99％同一性的序列。
13.任何前述权利要求的分离核酸分子，其中编码的CAR包括跨膜结构域，所述跨膜结构域包含选自以下的蛋白的跨膜结构域：T细胞受体的α,β或ζ链,CD28,CD3ε,CD45,CD4,CD5,CD8,CD9,CD16,CD22,CD33,CD37,CD64,CD80,CD86,CD134,CD137和CD154。
14.任何前述权利要求的分离核酸分子，其中编码的跨膜结构域包含SEQIDNO:15的序列。
15.任何前述权利要求的分离核酸分子，其中编码的跨膜结构域包含在SEQIDNO:15的氨基酸序列中具有至少一个、两个或三个修饰但不超过20个、10个或5个修饰的氨基酸序列、或与SEQIDNO:15的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。
16.任何前述权利要求的分离核酸分子，其中编码跨膜结构域的核酸序列包含SEQIDNO:15的序列、或与其具有95-99％同一性的序列。
17.任何前述权利要求的分离核酸分子，其中编码的抗CD19结合结构域通过铰链区与跨膜结构域连接。
18.权利要求17的分离核酸分子，其中编码的铰链区包含SEQIDNO:14、或与其具有95-99％同一性的序列。
19.权利要求17的分离核酸分子，其中编码铰链区的核酸序列包含SEQIDNO:55的序列、或与其具有95-99％同一性的序列。
20.任何前述权利要求的分离核酸分子，还包含编码共刺激结构域的序列。
21.权利要求20的分离核酸分子，其中共刺激结构域是从选自以下的蛋白获得的功能性信号传导结构域：OX40,CD2,CD27,CD28,CDS,ICAM-1,LFA-1(CD11a/CD18),ICOS(CD278),和4-1BB(CD137)。
22.权利要求20或21的分离核酸分子，其中编码的共刺激结构域包含SEQIDNO:16的序列。
23.权利要求20或21的分离核酸分子，其中编码的共刺激结构域包含在SEQIDNO:16的氨基酸序列中具有至少一个、两个或三个修饰但不超过20个、10个或5个修饰的氨基酸序列、或与SEQIDNO:16的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。
24.权利要求20或21的分离核酸分子，其中编码共刺激结构域的核酸序列包含SEQIDNO:60的序列、或与其具有95-99％同一性的序列。
25.任何前述权利要求的分离核酸分子，还包含编码胞内信号传导结构域的序列。
26.任何前述权利要求的分离核酸分子，其中编码的胞内信号传导结构域包含4-1BB的功能性信号传导结构域和/或CD3ζ的功能性信号传导结构域。
27.任何前述权利要求的分离核酸分子，其中编码的胞内信号传导结构域包含SEQIDNO:16的序列和/或SEQIDNO:17或SEQIDNO:43的序列。
28.任何前述权利要求的分离核酸分子，其中胞内信号传导结构域包含在SEQIDNO:16的氨基酸序列和/或SEQIDNO:17或SEQIDNO:43的氨基酸序列上具有至少一个、两个或三个修饰但不超过20个、10个或5个修饰的氨基酸序列、或与SEQIDNO:16的氨基酸序列和/或SEQIDNO:17或SEQIDNO:43的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。
29.任何前述权利要求的分离核酸分子，其中编码的胞内信号传导结构域包含SEQIDNO:16的序列和SEQIDNO:17或SEQIDNO:43的序列,其中包含胞内信号传导结构域的这些序列在相同读框中作为单一多肽链表达。
30.任何前述权利要求的分离核酸分子，其中编码胞内信号传导结构域的核酸序列包含SEQIDNO:60的序列或与其具有95-99％同一性的序列、和/或SEQIDNO:101或SEQIDNO:44的序列或与其具有95-99％同一性的序列。
31.任何前述权利要求的分离核酸分子，还包含前导序列。
32.权利要求31的分离核酸分子，其中前导序列包含SEQIDNO:13。
33.由权利要求1-32之任一项的核酸分子编码的分离的多肽分子。
34.权利要求33的分离的多肽，其包含选自SEQIDNO:31,SEQIDNO:32,SEQIDNO:33,SEQIDNO:34,SEQIDNO:35,SEQIDNO:36,SEQIDNO:37,SEQIDNO:38,SEQIDNO:39,SEQIDNO:40,SEQIDNO:41,和SEQIDNO:42的序列。
35.权利要求34的分离的多肽，包含SEQIDNO：31的序列。
36.权利要求34的分离的多肽，包含SEQIDNO：32的序列。
37.权利要求34的分离的多肽，包含SEQIDNO：35的序列。
38.权利要求34的分离的多肽，包含SEQIDNO：36的序列。
39.权利要求34的分离的多肽，包含SEQIDNO：37的序列。
40.分离的嵌合抗原受体(CAR)分子，其包含人源化抗CD19结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域。
41.权利要求40的分离CAR分子，其包含包括人源化抗CD19结合结构域的抗体或抗体片段、跨膜结构域和胞内信号传导结构域。
42.权利要求40或41的分离CAR分子，其中人源化抗CD19结合结构域包含表3所列任何人源化抗CD19结合结构域的轻链互补决定区1(LCCDR1)、轻链互补决定区2(LCCDR2)和轻链互补决定区3(LCCDR3)之一个或多个、以及表3所列任何人源化抗CD19结合结构域的重链互补决定区1(HCCDR1)、重链互补决定区2(HCCDR2)和重链互补决定区3(HCCDR3)之一个或多个。
43.权利要求40-42之任一项的分离CAR分子，包含表3所列任何抗CD19轻链结合结构域氨基酸序列的LCCDR1、LCCDR2和LCCDR3。
44.权利要求40-43之任一项的分离CAR分子，包含表3所列任何抗CD19重链结合结构域氨基酸序列的HCCDR1、HCCDR2和HCCDR3。
45.权利要求40-44之任一项的分离CAR分子，包含表3所列任何抗CD19轻链结合结构域氨基酸序列的LCCDR1、LCCDR2和LCCDR3，以及表3所列任何抗CD19重链结合结构域氨基酸序列的HCCDR1、HCCDR2和HCCDR3。
46.权利要求40-45之任一项的分离CAR分子，其中抗CD19结合结构域是scFv。
47.权利要求40-46之任一项的分离CAR分子，其中抗CD19结合结构域包含表3所列氨基酸序列的轻链和重链。
48.权利要求40-47之任一项的分离CAR分子，其中抗CD19结合结构域包含：轻链可变区，其包含在表3所示轻链可变区的氨基酸序列中具有至少一个、两个或三个修饰但不超过30个、20个或10个修饰的氨基酸序列、或与表3所示氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。
49.权利要求40-48之任一项的分离CAR分子，其中抗CD19结合结构域包含重链可变区，所述重链可变区包含在表3所示重链可变区的氨基酸序列中具有至少一个、两个或三个修饰但不超过30个、20个或10个修饰的氨基酸序列、或与表3所示氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。
50.权利要求40-49之任一项的分离CAR分子，其中抗CD19结合结构域包含选自SEQIDNO:1,SEQIDNO:2,SEQIDNO:3,SEQIDNO:4,SEQIDNO:5,SEQIDNO:6,SEQIDNO:7,SEQIDNO:8,SEQIDNO:9,SEQIDNO:10,SEQIDNO:11和SEQIDNO:12的序列、或与其具有95-99％同一性的序列。
51.权利要求40-50之任一项的分离CAR分子，还包含选自以下的蛋白的跨膜结构域：T细胞受体的α,β或ζ链,CD28,CD3ε,CD45,CD4,CD5,CD8,CD9,CD16,CD22,CD33,CD37,CD64,CD80,CD86,CD134,CD137和CD154。
52.权利要求51的分离CAR分子，其中跨膜结构域包含SEQIDNO:15的序列。
53.权利要求51或52的分离核酸分子，其中跨膜结构域包含在SEQIDNO:15的氨基酸序列中具有至少一个、两个或三个修饰但不超过20个、10个或5个修饰的氨基酸序列、或与SEQIDNO:15的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。
54.权利要求40-53之任一项的分离CAR分子，其中人源化抗CD19结合结构域通过铰链区与跨膜结构域连接。
55.权利要求54的分离CAR分子，其中编码的铰链区包含SEQIDNO:14或SEQIDNO:102、或与其具有95-99％同一性的序列。
56.权利要求40-55之任一项的分离CAR分子，还包含编码共刺激结构域的序列。
57.权利要求56的分离CAR分子，其中共刺激结构域包含选自以下的蛋白的功能性信号传导结构域：OX40,CD2,CD27,CD28,CDS,ICAM-1,LFA-1(CD11a/CD18)和4-1BB(CD137)。
58.权利要求56或57的分离CAR分子，其中共刺激结构域包含SEQIDNO:16的序列。
59.权利要求56或57的分离CAR分子，其中共刺激结构域包含在SEQIDNO:16的氨基酸序列中具有至少一个、两个或三个修饰但不超过20个、10个或5个修饰的氨基酸序列、或与SEQIDNO:16的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。
60.权利要求40-59之任一项的分离CAR分子，还包含编码胞内信号传导结构域的序列。
61.权利要求60的分离CAR分子，其中胞内信号传导结构域包含4-1BB的功能性信号传导结构域和/或CD3ζ的功能性信号传导结构域。
62.权利要求60或61的分离CAR分子，其中胞内信号传导结构域包含SEQIDNO:16的序列和/或SEQIDNO:17的序列。
63.权利要求60或61的分离CAR分子，其中胞内信号传导结构域包含SEQIDNO:16的序列和/或SEQIDNO:43的序列。
64.权利要求60-63之任一项的分离CAR分子，其中胞内信号传导结构域包含在SEQIDNO:16的氨基酸序列和/或SEQIDNO:17或SEQIDNO:43的氨基酸序列上具有至少一个、两个或三个修饰但不超过20个、10个或5个修饰的氨基酸序列、或与SEQIDNO:16的氨基酸序列和/或SEQIDNO:17或SEQIDNO:43的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。
65.权利要求60-64之任一项的分离CAR分子，其中胞内信号传导结构域包含SEQIDNO:16的序列和SEQIDNO:17或SEQIDNO:43的序列,其中包含胞内信号传导结构域的这些序列在相同读框中作为单一多肽链表达。
66.权利要求40-65之任一项的分离CAR分子，还包含前导序列。
67.权利要求66的分离CAR分子，其中前导序列包含SEQIDNO：13的氨基酸序列、或与SEQIDNO：13的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。
68.人源化抗CD19结合结构域，其包含SEQIDNO:1,SEQIDNO:2,SEQIDNO:3,SEQIDNO:4,SEQIDNO:5,SEQIDNO:6,SEQIDNO:7,SEQIDNO:8,SEQIDNO:9,SEQIDNO:10,SEQIDNO:11,和SEQIDNO:12中任何抗CD19结合结构域的轻链互补决定区1(LCCDR1)、轻链互补决定区2(LCCDR2)和轻链互补决定区3(LCCDR3)之一个或多个、以及SEQIDNO:1,SEQIDNO:2,SEQIDNO:3,SEQIDNO:4,SEQIDNO:5,SEQIDNO:6,SEQIDNO:7,SEQIDNO:8,SEQIDNO:9,SEQIDNO:10,SEQIDNO:11,和SEQIDNO:12中任何人源化抗CD19结合结构域的重链互补决定区1(HCCDR1)、重链互补决定区2(HCCDR2)和重链互补决定区3(HCCDR3)之一个或多个。
69.权利要求68的人源化抗CD19结合结构域，其中该人源化抗CD19结合结构域是scFv，包含SEQIDNO:1,SEQIDNO:2,SEQIDNO:3,SEQIDNO:4,SEQIDNO:5,SEQIDNO:6,SEQIDNO:7,SEQIDNO:8,SEQIDNO:9,SEQIDNO:10,SEQIDNO:11,或SEQIDNO:12的氨基酸序列的轻链和重链。
70.权利要求68或69的人源化抗CD19结合结构域，其中该人源化抗CD19结合结构域包含：轻链可变区，其包含在SEQIDNO:1,SEQIDNO:2,SEQIDNO:3,SEQIDNO:4,SEQIDNO:5,SEQIDNO:6,SEQIDNO:7,SEQIDNO:8,SEQIDNO:9,SEQIDNO:10,SEQIDNO:11,和SEQIDNO:12所示轻链可变区的氨基酸序列中具有至少一个、两个或三个修饰但不超过30、20或10个修饰的氨基酸序列、或与SEQIDNO:1,SEQIDNO:2,SEQIDNO:3,SEQIDNO:4,SEQIDNO:5,SEQIDNO:6,SEQIDNO:7,SEQIDNO:8,SEQIDNO:9,SEQIDNO:10,SEQIDNO:11,和SEQIDNO:12的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列；和/或重链可变区，其包含在SEQIDNO:1,SEQIDNO:2,SEQIDNO:3,SEQIDNO:4,SEQIDNO:5,SEQIDNO:6,SEQIDNO:7,SEQIDNO:8,SEQIDNO:9,SEQIDNO:10,SEQIDNO:11,和SEQIDNO:12所示重链可变区的氨基酸序列中具有至少一个、两个或三个修饰但不超过30、20或10个修饰的氨基酸序列、或与SEQIDNO:1,SEQIDNO:2,SEQIDNO:3,SEQIDNO:4,SEQIDNO:5,SEQIDNO:6,SEQIDNO:7,SEQIDNO:8,SEQIDNO:9,SEQIDNO:10,SEQIDNO:11,和SEQIDNO:12的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。
71.载体，其包含编码任何前述权利要求的CAR的核酸分子。
72.权利要求71的载体，其中所述载体选自DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、或逆转录病毒载体。
73.权利要求71或72的载体，还包含启动子。
74.权利要求73的载体，其中启动子是EF-1启动子。
75.权利要求74的载体，其中EF-1启动子包含SEQIDNO:100的序列。
76.权利要求71-75之任一项的载体，其中载体是体外转录载体。
77.权利要求71-75之任一项的载体，其中该核酸序列在载体中还包含poly(A)尾。
78.权利要求71-76之任一项的载体，其中该核酸序列在载体中还包含3’UTR。
79.包含权利要求71-78之任一项的载体的细胞。
80.权利要求79的细胞，其中细胞是人T细胞。
81.权利要求80的细胞，其中T细胞是CD8+T细胞。
82.制备细胞的方法，包括用权利要求71-78之任一项的载体转导T细胞。
83.产生RNA工程化细胞的群体的方法，包括将体外转录的RNA或合成的RNA引入细胞，其中该RNA包含编码任何前述权利要求的CAR分子的核酸。
84.在哺乳动物中提供抗肿瘤免疫的方法，包括向哺乳动物施用有效量的表达任何前述权利要求的CAR分子的细胞。
85.权利要求84的方法，其中细胞是自体T细胞。
86.权利要求84或85的方法，其中细胞是同种异体T细胞。
87.权利要求84-86之任一项的方法，其中哺乳动物是人。
88.治疗患有CD19表达相关疾病的哺乳动物的方法，包括向哺乳动物施用有效量的包含任何前述权利要求的CAR分子的细胞。
89.权利要求88的方法，其中CD19表达相关疾病选自增生性疾病，例如癌症或恶性肿瘤或癌前病症，例如骨髓增生异常、骨髓增生异常综合征或白血病前期，或是与CD19表达相关的非癌相关适应症。
90.权利要求88或89的方法，其中疾病是血液学癌症，选自一种或多种急性白血病，包括但不限于，B细胞急性淋巴样白血病(BALL)、T细胞急性淋巴样白血病(TALL)、急性淋巴样白血病(ALL)；一或多种慢性白血病，包括但不限于，慢性髓性白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)；其它血液学癌症或血液学病症，包括但不限于，B细胞早幼淋巴细胞样白血病、母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤、伯基特氏淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞性白血病、小细胞或大细胞性-滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴组织增生病症、MALT淋巴瘤、外套细胞淋巴瘤、边缘带淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、浆细胞样树突状细胞肿瘤、Waldenstrom巨球蛋白血症、和”白血病前期”——通过髓系血液细胞的无效生产(或发育异常)而统一在一起的一系列各种各样血液学病症，以及其它与CD19表达相关的疾病，包括但不限于，表达CD19的非典型和/或非经典的癌症、恶性肿瘤、癌前病症、或增生性疾病；及其组合。
91.权利要求88-90之任一项的方法，其中表达CAR分子的细胞，与增加CAR分子表达细胞的功效的活性剂，组合施用。
92.权利要求88-91之任一项的方法，其中表达CAR分子的细胞与改善一种或多种副作用的活性剂组合施用，其中所述副作用和CAR分子表达细胞的施用相关。
93.权利要求88-92之任一项的方法，其中表达CAR分子的细胞，与治疗CD19相关疾病的活性剂，组合施用。
94.权利要求1-32之任一项的分离核酸分子、权利要求33-39之任一项的分离多肽分子、权利要求40-67之任一项的分离CAR、权利要求68-70之任一项的抗CD19结合结构域、权利要求71-78之任一项的载体、或权利要求79-81之任一项的细胞用作药物。
95.权利要求1-32之任一项的分离核酸分子、权利要求33-39之任一项的分离多肽分子、权利要求40-68之任一项的分离CAR、权利要求69-71之任一项的抗CD19结合结构域、权利要求72-79之任一项的载体、或权利要求80-82之任一项的细胞用于治疗表达CD19的疾病。
96.权利要求79-81之任一项的细胞，还表达抑制性分子，所述抑制性分子包含与第二多肽结合的第一多肽，其中所述第一多肽至少包含抑制性分子的一部分，其中所述第二多肽包含来自胞内信号传导结构域的阳性信号。
97.权利要求96的细胞，其中抑制性分子包含第一多肽和第二多肽，其中所述第一多肽至少包含PD1的一部分，其中所述第二多肽包含共刺激结构域和第一信号传导结构域。
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Cited By (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106011174A (zh) * 2016-07-26 2016-10-12 黑龙江天晴干细胞股份有限公司 一种通用型慢病毒载体及其制备方法
CN106117366A (zh) * 2016-06-24 2016-11-16 安徽未名细胞治疗有限公司 一种cd19特异性嵌合抗原受体及其编码基因、应用
CN106178163A (zh) * 2016-07-01 2016-12-07 翁炳焕 艾滋病生物细胞免疫治疗仪
CN106267409A (zh) * 2016-07-01 2017-01-04 翁炳焕 艾滋病生物治疗反应器
CN106350487A (zh) * 2016-09-13 2017-01-25 北京多赢时代转化医学研究院 联合制备car‑nk细胞和car‑nkt细胞的方法
CN106399242A (zh) * 2016-09-13 2017-02-15 北京多赢时代转化医学研究院 联合制备CAR‑Vγ9Vδ2T细胞和CAR‑NKT细胞的方法
CN107058390A (zh) * 2017-01-17 2017-08-18 上海交通大学医学院附属第九人民医院 一种慢病毒载体、重组慢病毒质粒、病毒及病毒的应用
CN107383196A (zh) * 2017-08-30 2017-11-24 广州百暨基因科技有限公司 人源化抗cd19的抗原结合片段
CN107523548A (zh) * 2016-06-20 2017-12-29 上海细胞治疗研究院 一种高效稳定表达抗体的t细胞及其用途
CN107523549A (zh) * 2016-06-20 2017-12-29 上海细胞治疗研究院 一种高效稳定表达激活型抗体的car‑t细胞及其用途
WO2018006881A1 (zh) * 2016-07-08 2018-01-11 生命序有限公司 重组免疫检查点受体及其应用
WO2018006880A1 (zh) * 2016-07-08 2018-01-11 生命序有限公司 重组免疫检查点受体及免疫检查点抑制分子的共表达及应用
WO2018058431A1 (zh) * 2016-09-28 2018-04-05 李华顺 一种嵌合抗原受体分子及其应用
CN107880128A (zh) * 2017-12-21 2018-04-06 常州费洛斯药业科技有限公司 一种抗cd19的全人源抗体或抗体片段及其方法和应用
WO2018076391A1 (zh) * 2016-10-26 2018-05-03 李华顺 一种pd-1 car nk-92细胞及其制备方法与应用
WO2018108106A1 (zh) * 2016-12-13 2018-06-21 科济生物医药（上海）有限公司 抗cd19的人源化抗体以及靶向cd19的免疫效应细胞
WO2018121604A1 (zh) 2016-12-29 2018-07-05 天津天锐生物科技有限公司 一种多靶点嵌合抗原受体
CN108728459A (zh) * 2017-04-24 2018-11-02 上海恒润达生生物科技有限公司 靶向cd19的嵌合抗原受体并联合表达il-15的方法和用途
WO2018218710A1 (zh) * 2017-06-02 2018-12-06 阿思科力(苏州)生物科技有限公司 一种以robo1为靶点的嵌合抗原受体细胞及其制备和应用
CN109069537A (zh) * 2016-04-04 2018-12-21 亘喜生物科技（上海）有限公司 共刺激结构域中具有重复结合基序的car
CN109195985A (zh) * 2016-03-23 2019-01-11 德国亥姆霍兹慕尼黑中心健康与环境研究中心（有限公司） Pd-1和4-1bb的融合蛋白
CN109562151A (zh) * 2016-06-06 2019-04-02 朱诺治疗学股份有限公司 使用过继细胞疗法治疗b细胞恶性肿瘤的方法
CN109716139A (zh) * 2015-09-16 2019-05-03 安娜贝尔·罗德里格斯奥昆多 重组淋巴细胞活化基因-3的用途
CN109836493A (zh) * 2017-11-25 2019-06-04 深圳宾德生物技术有限公司 一种靶向cd19的单链抗体、嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用
WO2019154313A1 (zh) * 2018-02-11 2019-08-15 江苏恒瑞医药股份有限公司 一种分离的嵌合抗原受体以及包含其的修饰t细胞及用途
CN110248677A (zh) * 2017-01-05 2019-09-17 上海斯丹赛生物技术有限公司 人源化抗cd19抗体及其与嵌合抗原受体的用途
CN110819679A (zh) * 2018-08-07 2020-02-21 上海恒润达生生物科技有限公司 一种评估cart细胞体内代谢的方法
CN111373261A (zh) * 2017-11-20 2020-07-03 尤利乌斯·马克西米利安维尔茨堡大学 Cd19 cart细胞可清除表达极低水平cd19的骨髓瘤细胞
CN111683971A (zh) * 2017-12-23 2020-09-18 宇越生医科技股份有限公司 医药重组受体组成物及方法
CN111801421A (zh) * 2018-01-12 2020-10-20 酷罗赛尔公司 使用双重shrna的增强的免疫细胞及包含免疫细胞的组合物
CN112390891A (zh) * 2019-08-14 2021-02-23 苏州方德门达新药开发有限公司 嵌合抗原受体及其构建方法和应用
CN112512537A (zh) * 2018-06-01 2021-03-16 凯德药业股份有限公司 嵌合抗原受体t细胞疗法
CN113039209A (zh) * 2018-08-30 2021-06-25 T细胞受体治疗公司 用于使用融合蛋白进行tcr重编程的组合物和方法
CN113045676A (zh) * 2020-04-07 2021-06-29 北京荣瑷医学生物科技有限责任公司 一种抗cd19蛋白分子的抗体及其应用
CN113549600A (zh) * 2021-06-30 2021-10-26 徐州医科大学 一种具有CD19的特异性抗性的CAR-iNKT细胞
CN113710253A (zh) * 2019-02-04 2021-11-26 普洛迈博生物技术公司 编码嵌合抗原受体和il-6或检查点抑制剂的短发夹rna序列的核酸序列
WO2022111562A1 (zh) * 2020-11-26 2022-06-02 上海医药集团生物治疗技术有限公司 一种经修饰的免疫细胞及其应用
US11590167B2 (en) 2016-12-03 2023-02-28 Juno Therapeutic, Inc. Methods and compositions for use of therapeutic T cells in combination with kinase inhibitors
CN116063575A (zh) * 2022-11-15 2023-05-05 北京瑜阳科技有限公司 一种嵌合抗原受体（car）以及在治疗肿瘤中的应用
WO2023208157A1 (zh) * 2022-04-29 2023-11-02 上海先博生物科技有限公司 靶向cd19的嵌合抗原受体及其应用
WO2024086191A3 (en) * 2022-10-18 2024-05-30 Kite Pharma, Inc. Car-t constructs comprising a novel cd19 binder combined with il18 and methods of using the same

Families Citing this family (387)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7435596B2 (en) 2004-11-04 2008-10-14 St. Jude Children's Research Hospital, Inc. Modified cell line and method for expansion of NK cell
US20130266551A1 (en) * 2003-11-05 2013-10-10 St. Jude Children's Research Hospital, Inc. Chimeric receptors with 4-1bb stimulatory signaling domain
PL2697397T3 (pl) 2011-04-15 2017-08-31 The Johns Hopkins University System bezpiecznego sekwencjonowania
KR20140127816A (ko) 2012-02-22 2014-11-04 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 암의 치료에 유용한 t 세포의 지속성 집단을 생성시키기 위한 조성물 및 방법
CA2889937C (en) 2012-10-29 2020-12-29 The Johns Hopkins University Papanicolaou test for ovarian and endometrial cancers
EP4282419A1 (en) 2012-12-20 2023-11-29 Purdue Research Foundation Chimeric antigen receptor-expressing t cells as anti-cancer therapeutics
US9394368B2 (en) 2013-02-20 2016-07-19 Novartis Ag Treatment of cancer using humanized anti-EGFRvIII chimeric antigen receptor
WO2014130635A1 (en) 2013-02-20 2014-08-28 Novartis Ag Effective targeting of primary human leukemia using anti-cd123 chimeric antigen receptor engineered t cells
US9657105B2 (en) 2013-03-15 2017-05-23 City Of Hope CD123-specific chimeric antigen receptor redirected T cells and methods of their use
WO2014145252A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Milone Michael C Targeting cytotoxic cells with chimeric receptors for adoptive immunotherapy
UY35468A (es) 2013-03-16 2014-10-31 Novartis Ag Tratamiento de cáncer utilizando un receptor quimérico de antígeno anti-cd19
JP6779785B2 (ja) 2013-12-19 2020-11-04 ノバルティス アーゲー ヒトメソテリンキメラ抗原受容体およびその使用
US10287354B2 (en) 2013-12-20 2019-05-14 Novartis Ag Regulatable chimeric antigen receptor
EP3808410A1 (en) * 2013-12-20 2021-04-21 Cellectis Method of engineering multi-input signal sensitive t cell for immunotherapy
WO2015112626A1 (en) 2014-01-21 2015-07-30 June Carl H Enhanced antigen presenting ability of car t cells by co-introduction of costimulatory molecules
US10189908B2 (en) 2014-02-05 2019-01-29 The University Of Chicago Chimeric antigen receptors recognizing cancer-specific TN glycopeptide variants
US10323077B2 (en) 2014-02-10 2019-06-18 Emory University Expression of chimeric polypeptide with variable lymphocyte receptors on immune cells and uses for treating cancer
JP6689202B2 (ja) * 2014-03-19 2020-04-28 セレクティスＣｅｌｌｅｃｔｉｓ 癌免疫治療のためのｃｄ１２３特異的キメラ抗原受容体
DK3888674T3 (da) * 2014-04-07 2024-07-08 Novartis Ag Behandling af cancer ved anvendelse af anti-cd19-kimær antigenreceptor
MY186846A (en) 2014-04-10 2021-08-26 Seattle Childrens Hospital Dba Seattle Childrens Res Inst Method and compositions for cellular immunotherapy
US10167330B2 (en) 2014-05-02 2019-01-01 Emory University Modified recombinant variable lymphocyte receptors (VLR)
PT3143134T (pt) 2014-05-15 2020-12-04 Nat Univ Singapore Células assassinas naturais modificadas e seus usos
US10287350B2 (en) * 2014-06-02 2019-05-14 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Chimeric antigen receptors targeting CD-19
KR20170032406A (ko) 2014-07-15 2017-03-22 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 입양 세포 치료를 위한 조작된 세포
US11542488B2 (en) 2014-07-21 2023-01-03 Novartis Ag Sortase synthesized chimeric antigen receptors
SG11201700416TA (en) 2014-07-21 2017-02-27 Novartis Ag Treatment of cancer using a cd33 chimeric antigen receptor
WO2016014535A1 (en) 2014-07-21 2016-01-28 Novartis Ag Treatment of cancer using a cll-1 chimeric antigen receptor
AU2015292744C1 (en) 2014-07-21 2021-01-21 Novartis Ag Treatment of cancer using humanized anti-BCMA chimeric antigen receptor
EP3193915A1 (en) 2014-07-21 2017-07-26 Novartis AG Combinations of low, immune enhancing. doses of mtor inhibitors and cars
WO2016014789A2 (en) 2014-07-24 2016-01-28 Bluebird Bio, Inc. Bcma chimeric antigen receptors
WO2016019300A1 (en) 2014-07-31 2016-02-04 Novartis Ag Subset-optimized chimeric antigen receptor-containing t-cells
WO2016028896A1 (en) 2014-08-19 2016-02-25 Novartis Ag Anti-cd123 chimeric antigen receptor (car) for use in cancer treatment
TWI805109B (zh) 2014-08-28 2023-06-11 美商奇諾治療有限公司 對cd19具專一性之抗體及嵌合抗原受體
CN107580628B (zh) 2014-09-17 2022-01-07 诺华股份有限公司 用于过继免疫疗法的具有嵌合受体的靶向细胞毒性细胞
CN107109368A (zh) * 2014-10-07 2017-08-29 塞勒克提斯公司 用于调节car诱导的免疫细胞活性的方法
KR20170068504A (ko) * 2014-10-08 2017-06-19 노파르티스 아게 키메라 항원 수용체 요법에 대한 치료 반응성을 예측하는 바이오마커 및 그의 용도
WO2016061368A1 (en) * 2014-10-15 2016-04-21 The Children's Hospital Of Philadelphia Compositions and methods for treating b-lymphoid malignancies
SG10202104804PA (en) 2014-10-20 2021-06-29 Juno Therapeutics Inc Methods and compositions for dosing in adoptive cell therapy
NZ731279A (en) 2014-10-27 2021-12-24 Hutchinson Fred Cancer Res Compositions and methods for boosting the efficacy of adoptive cellular immunotherapy
CN113736828A (zh) * 2014-11-05 2021-12-03 朱诺治疗学股份有限公司 用于转导及细胞处理的方法
US20180334490A1 (en) 2014-12-03 2018-11-22 Qilong H. Wu Methods for b cell preconditioning in car therapy
KR20170087514A (ko) 2014-12-03 2017-07-28 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 입양 세포 치료를 위한 방법 및 조성물
EP3640262A1 (en) 2014-12-12 2020-04-22 Bluebird Bio, Inc. Bcma chimeric antigen receptors for use in the treatment of a hematological malignancy
CA2969384A1 (en) * 2014-12-17 2016-06-23 Cellectis Inhibitory chimeric antigen receptor (icar or n-car) expressing non-t cell transduction domain
SG11201705293WA (en) * 2014-12-29 2017-07-28 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
EP3245288A1 (en) 2015-01-12 2017-11-22 Pieris Pharmaceuticals GmbH Engineered t cells and uses therefor
US11459390B2 (en) 2015-01-16 2022-10-04 Novartis Ag Phosphoglycerate kinase 1 (PGK) promoters and methods of use for expressing chimeric antigen receptor
GB201501004D0 (en) 2015-01-21 2015-03-04 Cancer Rec Tech Ltd Inhibitors
CA2973524A1 (en) 2015-01-26 2016-08-04 Cellectis Anti-hsp70 specific chimeric antigen receptors (cars) for cancer immunotherapy
WO2016123143A1 (en) 2015-01-26 2016-08-04 The University Of Chicago CAR T-CELLS RECOGNIZING CANCER-SPECIFIC IL 13Rα2
EP3250609A4 (en) 2015-01-26 2018-07-11 The University of Chicago Il13ra alpha 2 binding agents and use thereof in cancer treatment
CA2975384A1 (en) * 2015-01-29 2016-08-04 Regents Of The University Of Minnesota Chimeric antigen receptors, compositions, and methods
US11161907B2 (en) 2015-02-02 2021-11-02 Novartis Ag Car-expressing cells against multiple tumor antigens and uses thereof
WO2016149485A1 (en) * 2015-03-17 2016-09-22 The Regents Of The University Of California Novel chemoimmunotherapy for epithelial cancer
ES2876974T3 (es) 2015-04-07 2021-11-15 Novartis Ag Combinación de terapia con receptor de antígeno quimérico y derivados de amino pirimidina
PT3280729T (pt) 2015-04-08 2022-08-01 Novartis Ag Terapias para cd20, terapias para cd22 e terapias de combinação com uma célula que expressa o recetor de antigénio quimérico (car) para cd19
SG11201708516YA (en) 2015-04-17 2017-11-29 David Maxwell Barrett Methods for improving the efficacy and expansion of chimeric antigen receptor-expressing cells
US12128069B2 (en) 2015-04-23 2024-10-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Treatment of cancer using chimeric antigen receptor and protein kinase a blocker
GB201507111D0 (en) * 2015-04-27 2015-06-10 Ucl Business Plc Nucleic acid construct
GB201507368D0 (en) * 2015-04-30 2015-06-17 Ucl Business Plc Cell
US10925972B2 (en) 2015-05-01 2021-02-23 The Regents Of The University Of California Glycan-dependent immunotherapeutic molecules
SG10201914069SA (en) 2015-05-18 2020-03-30 Tcr2 Therapeutics Inc Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins
EP3932428A1 (en) 2015-05-21 2022-01-05 Harpoon Therapeutics, Inc. Trispecific binding proteins and methods of use
US20180161369A1 (en) 2015-05-29 2018-06-14 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions for cellular immunotherapy
JP7269733B2 (ja) 2015-06-12 2023-05-09 レンティジェン・テクノロジー・インコーポレイテッド 操作されたｔ細胞を用いて癌を処置するための方法
EP4349854A3 (en) 2015-06-19 2024-07-10 Kobold, Sebastian Pd1-cd28 fusion proteins and their use in medicine
MA42902A (fr) 2015-07-08 2018-05-16 Univ Johns Hopkins Lymphocytes infiltrant la moelle (mil) en tant que source de lymphocytes t pour une thérapie par des récepteurs chimériques d'un antigène (car)
MA42895A (fr) 2015-07-15 2018-05-23 Juno Therapeutics Inc Cellules modifiées pour thérapie cellulaire adoptive
CN116196426A (zh) 2015-07-16 2023-06-02 百欧肯治疗有限公司 治疗癌症的组合物及方法
AU2016297014B2 (en) * 2015-07-21 2021-06-17 Novartis Ag Methods for improving the efficacy and expansion of immune cells
US10493139B2 (en) 2015-07-24 2019-12-03 Innovative Cellular Therapeutics CO., LTD. Humanized anti-CD19 antibody and use thereof with chimeric antigen receptor
EP3149046B1 (en) * 2015-07-24 2020-02-26 Innovative Cellular Therapeutics Co., Ltd. Humanized anti-cd19 antibody and use thereof
EP3331920A4 (en) * 2015-08-07 2019-04-03 Seattle Children's Hospital, dba Seattle Children's Research Institute BIS SPECIFIC CAR T CELLS FOR TARGETING OF SOLID TUMORS
EP3331913A1 (en) 2015-08-07 2018-06-13 Novartis AG Treatment of cancer using chimeric cd3 receptor proteins
CN105384825B (zh) 2015-08-11 2018-06-01 南京传奇生物科技有限公司 一种基于单域抗体的双特异性嵌合抗原受体及其应用
WO2017027653A1 (en) 2015-08-11 2017-02-16 The Johns Hopkins University Assaying ovarian cyst fluid
WO2017027843A1 (en) 2015-08-12 2017-02-16 Massachusetts Institute Of Technology Cell surface coupling of nanoparticles
CN106467906B (zh) * 2015-08-20 2019-09-27 北京马力喏生物科技有限公司 构建体、转基因淋巴细胞及其制备方法和用途
WO2017035117A1 (en) * 2015-08-24 2017-03-02 University Of Houston System Combination therpay combining car + t cells with appropriately timed immunodulatory antibodies
JP6905163B2 (ja) 2015-09-03 2021-07-21 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア サイトカイン放出症候群を予測するバイオマーカー
MA44909A (fr) * 2015-09-15 2018-07-25 Acerta Pharma Bv Association thérapeutique d'un inhibiteur du cd19 et d'un inhibiteur de la btk
MX2018003463A (es) 2015-09-22 2018-09-06 Univ Pennsylvania Método de redireccionamiento de células t para tratar la infección por virus de inmunodeficiencia humana (vih).
WO2017053889A2 (en) * 2015-09-23 2017-03-30 Precision Immunotherapy, Inc. Flt3 directed car cells for immunotherapy
US20180264038A1 (en) * 2015-09-28 2018-09-20 Regents Of The University Of Minnesota Chimeric antigen receptor (car) t cells as therapeutic interventions for auto- and allo-immunity
CN108779162B (zh) * 2015-10-09 2021-12-07 美天施生物科技有限公司 嵌合抗原受体和使用方法
MX2018004515A (es) 2015-10-13 2019-04-15 Eureka Therapeutics Inc Agentes de anticuerpo especificos para cd19 humano y usos de los mismos.
KR20180056780A (ko) * 2015-10-13 2018-05-29 시티 오브 호프 클로로톡신 도메인을 함유하는 키메라 항원 수용체
US20180303935A1 (en) * 2015-10-16 2018-10-25 University Of Utah Research Foundation A nanomaterial complex comprising graphene oxide associated with a therapeutic agent and methods of use
CA3001507C (en) * 2015-10-16 2023-09-19 Ludwig-Maximilians-Universitat Munchen Cxcr6-transduced t cells for targeted tumor therapy
MA44314A (fr) 2015-11-05 2018-09-12 Juno Therapeutics Inc Récepteurs chimériques contenant des domaines induisant traf, et compositions et méthodes associées
US11020429B2 (en) 2015-11-05 2021-06-01 Juno Therapeutics, Inc. Vectors and genetically engineered immune cells expressing metabolic pathway modulators and uses in adoptive cell therapy
CN105331585A (zh) 2015-11-13 2016-02-17 科济生物医药（上海）有限公司 携带pd-l1阻断剂的嵌合抗原受体修饰的免疫效应细胞
WO2017087589A2 (en) 2015-11-18 2017-05-26 Merck Sharp & Dohme Corp. Pd1 and/or lag3 binders
WO2017096327A2 (en) * 2015-12-03 2017-06-08 Juno Therapeutics, Inc. Compositions and methods for reducing immune responses against cell therapies
EP3383892B1 (en) 2015-12-03 2022-12-21 Juno Therapeutics, Inc. Modified chimeric receptors and related compositions and methods
EA201891338A1 (ru) 2015-12-04 2018-12-28 Новартис Аг Композиции и способы для иммуноонкологии
MA43377A (fr) * 2015-12-04 2021-05-19 Hutchinson Fred Cancer Res Méthodes et compositions liées à la toxicité associée à la thérapie cellulaire
WO2017112741A1 (en) 2015-12-22 2017-06-29 Novartis Ag Mesothelin chimeric antigen receptor (car) and antibody against pd-l1 inhibitor for combined use in anticancer therapy
JP2019500874A (ja) 2015-12-28 2019-01-17 ノバルティス アーゲー キメラ抗原受容体発現細胞の作製方法
EP3397756B1 (en) 2015-12-30 2023-03-08 Novartis AG Immune effector cell therapies with enhanced efficacy
WO2017123559A2 (en) 2016-01-11 2017-07-20 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Chimeric proteins and methods of regulating gene expression
MY194127A (en) 2016-01-11 2022-11-14 Univ Leland Stanford Junior Chimeric proteins and methods of immunotherapy
CN105950645A (zh) * 2016-01-11 2016-09-21 灏灵赛奥（天津）生物科技有限公司 Car-cd19抗原受体的人源化融合基因片段、其构建方法及应用
CN107034193B (zh) * 2016-02-03 2020-06-05 北京马力喏生物科技有限公司 治疗b细胞白血病及b细胞淋巴瘤的治疗组合物
SG11201807489PA (en) 2016-03-04 2018-09-27 Novartis Ag Cells expressing multiple chimeric antigen receptor (car) molecules and uses therefore
WO2017161208A1 (en) 2016-03-16 2017-09-21 Juno Therapeutics, Inc. Methods for determining dosing of a therapeutic agent and related treatments
US20190355459A1 (en) 2016-03-16 2019-11-21 Juno Therapeutics, Inc. Methods for adaptive design of a treatment regimen and related treatments
CA3015369A1 (en) 2016-03-18 2017-09-21 Oliver Press Compositions and methods for cd20 immunotherapy
US11111505B2 (en) 2016-03-19 2021-09-07 Exuma Biotech, Corp. Methods and compositions for transducing lymphocytes and regulating the activity thereof
BR112018069251A2 (pt) 2016-03-22 2019-01-22 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) métodos de intervenção precoce para prevenir ou melhorar a toxicidade
US11549099B2 (en) 2016-03-23 2023-01-10 Novartis Ag Cell secreted minibodies and uses thereof
US20190112380A1 (en) * 2016-03-29 2019-04-18 University Of Southern California Chimeric antigen receptors targeting cancer
JP7282521B2 (ja) 2016-04-08 2023-05-29 パーデュー・リサーチ・ファウンデイション Ｃａｒ ｔ細胞療法のための方法および組成物
US11446398B2 (en) 2016-04-11 2022-09-20 Obsidian Therapeutics, Inc. Regulated biocircuit systems
PT3443096T (pt) 2016-04-15 2023-05-30 Novartis Ag Composições e métodos para expressão seletiva de recetores de antigénios quiméricos
CA3022267A1 (en) 2016-05-04 2017-11-09 Fred Hutchinson Cancer Research Center Cell-based neoantigen vaccines and uses thereof
CN105950663B (zh) * 2016-05-17 2019-04-02 上海优卡迪生物医药科技有限公司 一种靶向cd30的复制缺陷性重组慢病毒car-t转基因载体及其构建方法和应用
CN105950662B (zh) * 2016-05-17 2019-04-30 上海优卡迪生物医药科技有限公司 一种靶向cd22的复制缺陷性重组慢病毒car-t转基因载体及其构建方法和应用
CN105950664B (zh) * 2016-05-17 2019-03-29 上海优卡迪生物医药科技有限公司 一种靶向cd123的复制缺陷性重组慢病毒car-t转基因载体及其构建方法和应用
CN105969805B (zh) * 2016-05-17 2019-03-29 上海优卡迪生物医药科技有限公司 一种靶向Mesothelin的复制缺陷性重组慢病毒CAR-T转基因载体及其构建方法和应用
EP3464375A2 (en) 2016-06-02 2019-04-10 Novartis AG Therapeutic regimens for chimeric antigen receptor (car)- expressing cells
JP2019517518A (ja) * 2016-06-03 2019-06-24 メモリアル スローン ケタリング キャンサー センター 早期治療選択肢としての養子細胞療法
CA3027428A1 (en) 2016-06-14 2017-12-21 Regents Of The University Of Minnesota Genetically modified cells, tissues, and organs for treating disease
JP6987134B2 (ja) 2016-06-27 2021-12-22 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド ペプチドエピトープを同定する方法、そのようなエピトープに結合する分子および関連用途
MA45491A (fr) 2016-06-27 2019-05-01 Juno Therapeutics Inc Épitopes à restriction cmh-e, molécules de liaison et procédés et utilisations associés
EP3478722A1 (en) 2016-06-30 2019-05-08 F. Hoffmann-La Roche AG Improved adoptive t-cell therapy
AU2017295886C1 (en) 2016-07-15 2024-05-16 Novartis Ag Treatment and prevention of cytokine release syndrome using a chimeric antigen receptor in combination with a kinase inhibitor
CA3031542A1 (en) 2016-07-20 2018-01-25 University Of Utah Research Foundation Cd229 car t cells and methods of use thereof
KR20190034588A (ko) 2016-07-28 2019-04-02 노파르티스 아게 키메라 항원 수용체 및 pd-1 억제제의 조합 요법
EP3491024B1 (en) 2016-07-29 2024-12-18 Juno Therapeutics, Inc. Anti-idiotypic antibodies against anti-cd19 antibodies
EP3490590A2 (en) 2016-08-01 2019-06-05 Novartis AG Treatment of cancer using a chimeric antigen receptor in combination with an inhibitor of a pro-m2 macrophage molecule
WO2018026953A1 (en) 2016-08-02 2018-02-08 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins
US11077178B2 (en) 2016-09-21 2021-08-03 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Chimeric antigen receptor (CAR) that targets chemokine receptor CCR4 and its use
EP3518943A4 (en) 2016-09-28 2020-04-22 Atossa Therapeutics, Inc. METHOD FOR ADAPTIVE CELL THERAPY
EP3519577A1 (en) 2016-09-28 2019-08-07 Novartis AG Porous membrane-based macromolecule delivery system
US11155832B2 (en) 2016-09-30 2021-10-26 Genvec, Inc. Adenovectors for delivery of therapeutic genetic material into T cells
HUE054080T2 (hu) 2016-10-07 2021-08-30 Tcr2 Therapeutics Inc Készítmények és eljárások a T-sejt receptorok átprogramozására fúziós fehérjék felhasználásával
CA3039646A1 (en) 2016-10-07 2018-04-12 Novartis Ag Chimeric antigen receptors for the treatment of cancer
JP7623784B2 (ja) 2016-10-13 2025-01-29 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド トリプトファン代謝経路調節剤を含む免疫療法の方法および組成物
CA3040914A1 (en) 2016-11-03 2018-05-24 Juno Therapeutics, Inc. Combination therapy of a cell based therapy and a microglia inhibitor
EP3534938A2 (en) 2016-11-03 2019-09-11 Juno Therapeutics, Inc. Combination therapy of a t cell therapy and a btk inhibitor
WO2018085690A1 (en) 2016-11-04 2018-05-11 Bluebird Bio, Inc. Anti-bcma car t cell compositions
CA3044593A1 (en) 2016-11-22 2018-05-31 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins
AU2017366739B2 (en) 2016-12-02 2023-11-23 Angeles Therapeutics, Inc. Synthetic immune receptors and methods of use thereof
US11793833B2 (en) 2016-12-02 2023-10-24 Juno Therapeutics, Inc. Engineered B cells and related compositions and methods
RU2019120398A (ru) 2016-12-03 2021-01-12 Джуно Терапьютикс, Инк. Способы определения дозировки cart-клеток
KR20230156808A (ko) 2016-12-03 2023-11-14 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 Car-t 세포의 조절 방법
EP3551197B1 (en) 2016-12-12 2023-11-22 Seattle Children's Hospital (DBA Seattle Children's Research Institute) Chimeric transcription factor variants with augmented sensitivity to drug ligand induction of transgene expression in mammalian cells
EP3346001A1 (en) * 2017-01-06 2018-07-11 TXCell Monospecific regulatory t cell population with cytotoxicity for b cells
US12161668B2 (en) * 2017-01-10 2024-12-10 The General Hospital Corporation T cells expressing a chimeric antigen receptor
JP7429338B2 (ja) 2017-01-10 2024-02-08 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド 細胞療法および関連方法のエピジェネティック解析
EP3574005B1 (en) 2017-01-26 2021-12-15 Novartis AG Cd28 compositions and methods for chimeric antigen receptor therapy
EP3577134A1 (en) 2017-01-31 2019-12-11 Novartis AG Treatment of cancer using chimeric t cell receptor proteins having multiple specificities
US11649288B2 (en) 2017-02-07 2023-05-16 Seattle Children's Hospital Phospholipid ether (PLE) CAR T cell tumor targeting (CTCT) agents
SG11201907580SA (en) 2017-02-17 2019-09-27 Hutchinson Fred Cancer Res Combination therapies for treatment of bcma-related cancers and autoimmune disorders
EP3585402B1 (en) 2017-02-27 2024-03-06 Juno Therapeutics, Inc. Compositions, articles of manufacture and methods related to dosing in cell therapy
EP4501352A3 (en) 2017-02-28 2025-04-16 Endocyte, Inc. Compositions and methods for car t cell therapy
WO2018160731A1 (en) 2017-02-28 2018-09-07 Novartis Ag Shp inhibitor compositions and uses for chimeric antigen receptor therapy
JP7359751B2 (ja) 2017-03-14 2023-10-11 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド 極低温保管のための方法
RU2019133280A (ru) 2017-03-22 2021-04-22 Новартис Аг Композиции и способы для иммуноонкологии
US11896616B2 (en) 2017-03-27 2024-02-13 National University Of Singapore Stimulatory cell lines for ex vivo expansion and activation of natural killer cells
CN117384929A (zh) 2017-03-27 2024-01-12 新加坡国立大学 一种编码由细胞表达的嵌合受体的多核苷酸
CN107058232B (zh) * 2017-04-12 2018-03-30 上海优卡迪生物医药科技有限公司 胆固醇转脂酶soat1被抑制的car‑t细胞及其制备方法和应用
MX2019012189A (es) 2017-04-14 2020-12-10 Juno Therapeutics Inc Metodos para valorar la glucosilacion de la superficie celular.
JOP20180042A1 (ar) * 2017-04-24 2019-01-30 Kite Pharma Inc نطاقات ربط مولد ضد متوافقة مع البشر وطرق الاستخدام
EP3615055A1 (en) 2017-04-28 2020-03-04 Novartis AG Cells expressing a bcma-targeting chimeric antigen receptor, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
CA3061945A1 (en) 2017-05-01 2018-11-08 Juno Therapeutics, Inc. Combination of a cell therapy and an immunomodulatory compound
JP7158416B2 (ja) 2017-05-24 2022-10-21 イーフェクター セラピューティクス， インコーポレイテッド 抗腫瘍免疫応答を改善するための組成物および方法
EP3630132A1 (en) 2017-06-02 2020-04-08 Juno Therapeutics, Inc. Articles of manufacture and methods for treatment using adoptive cell therapy
KR20200015717A (ko) 2017-06-09 2020-02-12 프로비던스 헬스 앤드 서비시즈 - 오레곤 암 치료를 위한 인간 종양 반응성 t 세포의 확인을 위한 cd39 및 cd103의 활용
WO2018231759A1 (en) * 2017-06-12 2018-12-20 Obsidian Therapeutics, Inc. Pde5 compositions and methods for immunotherapy
AU2018291032A1 (en) 2017-06-29 2020-01-16 Juno Therapeutics, Inc. Mouse model for assessing toxicities associated with immunotherapies
US12144825B2 (en) 2017-06-30 2024-11-19 Cellectis Cellular immunotherapy for repetitive administration
CN111164203A (zh) * 2017-08-02 2020-05-15 奥托路斯有限公司 表达嵌合抗原受体或工程化tcr并包含选择性表达的核苷酸序列的细胞
MX2020001575A (es) 2017-08-07 2020-11-18 Univ Johns Hopkins Materiales y métodos para evaluar y tratar el cáncer.
US20210071258A1 (en) 2017-09-01 2021-03-11 Juno Therapeutics, Inc. Gene expression and assessment of risk of developing toxicity following cell therapy
CN119120527A (zh) * 2017-09-15 2024-12-13 莱蒂恩技术公司 用于用抗cd19免疫治疗来治疗癌症的组合物和方法
CN111194350A (zh) 2017-09-18 2020-05-22 博雅辑因（北京）生物科技有限公司 一种基因编辑t细胞及其用途
US20200230221A1 (en) 2017-09-19 2020-07-23 Massachusetts Institute Of Technology Compositions for chimeric antigen receptor t cell therapy and uses thereof
US20200354452A1 (en) * 2017-09-29 2020-11-12 City Of Hope Cars and bispecific antibodies for treatment of mantle cell lymphoma
IL315737A (en) 2017-10-13 2024-11-01 Harpoon Therapeutics Inc B-cell maturation antigen-binding proteins
CN111629749A (zh) 2017-10-18 2020-09-04 诺华股份有限公司 用于选择性蛋白质降解的组合物和方法
US20200370012A1 (en) 2017-10-25 2020-11-26 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
BR112020008727A2 (pt) 2017-10-30 2020-10-20 Neuropore Therapies, Inc. fenil sulfonil fenil triazol tionas substituídas e usos destas
TW201923072A (zh) * 2017-10-31 2019-06-16 美商異基因治療有限公司 投藥同種異體嵌合抗原受體t細胞之方法及組合物
WO2019089798A1 (en) 2017-10-31 2019-05-09 Novartis Ag Anti-car compositions and methods
US11851679B2 (en) 2017-11-01 2023-12-26 Juno Therapeutics, Inc. Method of assessing activity of recombinant antigen receptors
SG11202003657VA (en) 2017-11-01 2020-05-28 Juno Therapeutics Inc Process for producing a t cell composition
EP4512823A2 (en) 2017-11-01 2025-02-26 Juno Therapeutics, Inc. Process for generating therapeutic compositions of engineered cells
MX2020004572A (es) 2017-11-01 2020-10-07 Juno Therapeutics Inc Receptores de antigenos quimericos especificos para el antigeno de maduracion de celulas b y polinucleotidos que codifican los mismos.
WO2019089848A1 (en) 2017-11-01 2019-05-09 Juno Therapeutics, Inc. Methods associated with tumor burden for assessing response to a cell therapy
US12031975B2 (en) 2017-11-01 2024-07-09 Juno Therapeutics, Inc. Methods of assessing or monitoring a response to a cell therapy
AU2018359907A1 (en) 2017-11-06 2020-05-07 Fred Hutchinson Cancer Center Combination of a cell therapy and a gamma secretase inhibitor
US12024715B2 (en) 2017-11-07 2024-07-02 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Compositions and methods for improved T cells
WO2019094498A1 (en) * 2017-11-07 2019-05-16 City Of Hope Treatment of cns lymphoma and systemic lymphoma with intracerebroventricularly administered cd19 car
EP3707160A1 (en) 2017-11-10 2020-09-16 The U.S.A. as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Chimeric antigen receptors targeting tumor antigens
MX2020004948A (es) 2017-11-15 2020-11-11 Novartis Ag Receptor de antígeno quimérico que selecciona como diana bcma, receptor de antígeno quimérico que selecciona como diana cd19 y terapias de combinación.
WO2019104245A1 (en) 2017-11-22 2019-05-31 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Use and production of engineered immune cells
KR20200096253A (ko) 2017-11-30 2020-08-11 노파르티스 아게 Bcma-표적화 키메라 항원 수용체, 및 이의 용도
EP3716980A1 (en) 2017-12-01 2020-10-07 Juno Therapeutics, Inc. Methods for dosing and for modulation of genetically engineered cells
AU2018379502A1 (en) 2017-12-06 2020-06-18 Abclon Inc. Antibody or antigen binding fragment thereof for specifically recognizing B cell malignancy, chimeric antigen receptor comprising same, and use thereof
KR20200108278A (ko) 2017-12-08 2020-09-17 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 조작된 ｔ 세포의 조성물을 제조하는 방법
MX2020005907A (es) 2017-12-08 2020-10-19 Juno Therapeutics Inc Formulacion de medio libre de suero para cultivar celulas y metodos de uso de la misma.
CN109053899B (zh) 2017-12-22 2021-11-16 湖南远泰生物技术有限公司 一种含人转铁蛋白抗原表位序列的嵌合体抗原受体
TW201930591A (zh) 2018-01-08 2019-08-01 瑞士商諾華公司 用於與嵌合抗原受體療法併用之免疫增強rna
JP2021510540A (ja) * 2018-01-11 2021-04-30 イノベイティブ セルラー セラピューティクス インク．Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ． 修飾細胞の増幅およびその応用
US10561686B2 (en) 2018-01-12 2020-02-18 Innovative Cellular Therapeutics CO., LTD. Modified cell expansion and uses thereof
SG11202006886VA (en) 2018-01-22 2020-08-28 Seattle Childrens Hospital Dba Seattle Childrens Res Inst Methods of use for car t cells
CN108017717B (zh) * 2018-01-24 2019-08-16 首都医科大学宣武医院 一种用于体外高效定向扩增的嵌合抗原受体及其应用
CN110093359B (zh) * 2018-01-29 2023-10-13 华南生物医药研究院 含cd3启动子序列和car序列的可分离的核酸及应用
AU2019215031A1 (en) 2018-01-31 2020-08-20 Novartis Ag Combination therapy using a chimeric antigen receptor
CN111801104A (zh) 2018-02-06 2020-10-20 西雅图儿童医院（Dba西雅图儿童研究所） Car-t细胞的封闭系统制造过程
EP3749685A4 (en) 2018-02-09 2021-12-22 National University of Singapore ACTIVATOR CHEMERIC RECEPTORS AND THEIR USES IN NATURAL KILLING CELL IMMUNOTHERAPY
WO2019159193A1 (en) * 2018-02-13 2019-08-22 Indian Institute Of Technology Bombay Novel humanized anti-cd19 chimeric antigen receptor, its nucelic acid sequence and its preparation
EP3752203A1 (en) 2018-02-13 2020-12-23 Novartis AG Chimeric antigen receptor therapy in combination with il-15r and il15
WO2019165237A1 (en) 2018-02-23 2019-08-29 Endocyte, Inc. Sequencing method for car t cell therapy
EP3762012A1 (en) 2018-03-09 2021-01-13 Ospedale San Raffaele S.r.l. Il-1 antagonist and toxicity induced by cell therapy
IL277267B2 (en) 2018-03-14 2025-01-01 Seattle Childrens Hospital D/B/A Seattle Childrens Res Institute IL13RA2 receptor alpha 2 (IL13RA2) chimeric antigen receptor for tumor-specific T cells in immunotherapy
CN111918877A (zh) * 2018-03-14 2020-11-10 美国卫生和人力服务部 抗cd33嵌合抗原受体及其用途
CA3093791A1 (en) 2018-03-14 2019-09-19 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) Il-13 receptor alpha 2 targeted, zetakine directed t cell immunotherapy
US10751399B2 (en) 2018-03-20 2020-08-25 Cho Pharma Usa, Inc. Chimeric antigen receptors that bind to SSEA4 and uses thereof
US20210079384A1 (en) 2018-04-13 2021-03-18 The Johns Hopkins University Non-invasive detection of response to a targeted therapy
US20210155986A1 (en) 2018-04-13 2021-05-27 The Johns Hopkins University Non-invasive detection of response to immunotherapy
US10869888B2 (en) 2018-04-17 2020-12-22 Innovative Cellular Therapeutics CO., LTD. Modified cell expansion and uses thereof
WO2019210153A1 (en) 2018-04-27 2019-10-31 Novartis Ag Car t cell therapies with enhanced efficacy
EP3788369A1 (en) 2018-05-01 2021-03-10 Novartis Ag Biomarkers for evaluating car-t cells to predict clinical outcome
EP3790900A1 (en) 2018-05-09 2021-03-17 Yissum Research Development Company of The Hebrew University of Jerusalem Ltd. Antibodies specific to human nectin4
EP3794348A4 (en) 2018-05-18 2022-03-09 The Johns Hopkins University ACELLULAR DNA FOR ASSESSING AND/OR TREATING CANCER
EP3801769A1 (en) 2018-05-25 2021-04-14 Novartis AG Combination therapy with chimeric antigen receptor (car) therapies
US20210214723A1 (en) * 2018-06-01 2021-07-15 Mayo Foundation For Medical Education And Research Materials and methods for treating cancer
US11492409B2 (en) 2018-06-01 2022-11-08 Novartis Ag Binding molecules against BCMA and uses thereof
EP3802825A1 (en) 2018-06-08 2021-04-14 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for immunooncology
US11608382B2 (en) 2018-06-13 2023-03-21 Novartis Ag BCMA chimeric antigen receptors and uses thereof
KR20190141511A (ko) * 2018-06-14 2019-12-24 주식회사 녹십자랩셀 신규 펩티드, 이를 포함하는 키메라 항원 수용체 및 이를 발현하는 면역 세포
CN112292140B (zh) * 2018-06-22 2025-03-11 综合医院公司 靶向cd37和cd19的嵌合抗原受体
AR116109A1 (es) 2018-07-10 2021-03-31 Novartis Ag Derivados de 3-(5-amino-1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona y usos de los mismos
AU2019311077A1 (en) 2018-07-23 2021-02-25 Heidelberg Pharma Research Gmbh Use of anti-CD5 antibody drug conjugate (ADC) in allogeneic cell therapy
KR20210059715A (ko) 2018-08-09 2021-05-25 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 통합된 핵산 평가 방법
US12240915B2 (en) 2018-08-30 2025-03-04 Innovative Cellular Therapeutics Holdings, Ltd. Chimeric antigen receptor cells for treating solid tumor
WO2020047449A2 (en) 2018-08-31 2020-03-05 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
CN112639083A (zh) 2018-08-31 2021-04-09 诺华股份有限公司 制备表达嵌合抗原受体的细胞的方法
EP3843778A1 (en) 2018-08-31 2021-07-07 Invectys Sa Chimeric antigen receptors against multiple hla-g isoforms
US12195544B2 (en) 2018-09-21 2025-01-14 Harpoon Therapeutics, Inc. EGFR binding proteins and methods of use
EP3856771A4 (en) 2018-09-25 2022-06-29 Harpoon Therapeutics, Inc. Dll3 binding proteins and methods of use
EP3856779A1 (en) 2018-09-28 2021-08-04 Novartis AG Cd22 chimeric antigen receptor (car) therapies
JP7557882B2 (ja) 2018-09-28 2024-09-30 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー コラーゲンに局在化される免疫調節分子およびその方法
EP3856782A1 (en) 2018-09-28 2021-08-04 Novartis AG Cd19 chimeric antigen receptor (car) and cd22 car combination therapies
KR20210098450A (ko) 2018-10-31 2021-08-10 주노 테라퓨틱스 게엠베하 세포의 선택 및 자극을 위한 방법 및 이를 위한 장치
AU2019374790A1 (en) 2018-11-06 2021-05-27 Juno Therapeutics, Inc. Process for producing genetically engineered T cells
SG11202104411VA (en) 2018-11-08 2021-05-28 Juno Therapeutics Inc Methods and combinations for treatment and t cell modulation
BR112021009420A2 (pt) 2018-11-16 2021-11-23 Juno Therapeutics Inc Métodos de dosagem de células t manipuladas para o tratamento de malignidades de células b
US10918667B2 (en) 2018-11-20 2021-02-16 Innovative Cellular Therapeutics CO., LTD. Modified cell expressing therapeutic agent and uses thereof
CN113166253B (zh) * 2018-11-29 2023-04-28 浙江瑞加美生物科技有限公司 具有在CDR1区突变的人源化CD19 scFv的CAR-T细胞
WO2020113194A2 (en) 2018-11-30 2020-06-04 Juno Therapeutics, Inc. Methods for treatment using adoptive cell therapy
MX2021006244A (es) 2018-11-30 2021-09-10 Juno Therapeutics Inc Metodos de dosificacion y tratamiento de canceres de celulas b en terapia celular adoptiva.
CA3177829A1 (en) 2018-12-12 2020-06-18 Kite Pharma, Inc. Chimeric antigen and t cell receptors and methods of use
WO2020124021A1 (en) * 2018-12-13 2020-06-18 The General Hospital Corporation Chimeric antigen receptors targeting cd79b and cd19
US20220016171A1 (en) 2018-12-18 2022-01-20 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Mucosal-associated invariant t (mait) cells expressing chimeric antigen receptors
EP3897637A1 (en) 2018-12-20 2021-10-27 Novartis AG Dosing regimen and pharmaceutical combination comprising 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives
CA3125751A1 (en) * 2019-01-07 2020-07-16 Magenta Therapeutics, Inc. Use of an anti-cd45 antibody drug conjugate (adc) in cell therapy
CN109734813B (zh) * 2019-01-28 2022-06-17 广东昭泰体内生物医药科技有限公司 一种嵌合抗原受体及其应用
WO2020163448A1 (en) * 2019-02-06 2020-08-13 The Regents Of The University Of Michigan Chimeric antigen receptors targeting abnormal glycobiology
JP7483732B2 (ja) 2019-02-15 2024-05-15 ノバルティス アーゲー ３－（１－オキソ－５－（ピペリジン－４－イル）イソインドリン－２－イル）ピペリジン－２，６－ジオン誘導体及びその使用
JP7488826B2 (ja) 2019-02-15 2024-05-22 ノバルティス アーゲー 置換３－（１－オキソイソインドリン－２－イル）ピペリジン－２，６－ジオン誘導体及びその使用
MX2021010150A (es) 2019-02-25 2021-09-14 Novartis Ag Composiciones de particulas de silice mesoporosa para administracion viral.
CN118546959A (zh) 2019-03-05 2024-08-27 恩卡尔塔公司 Cd19定向性嵌合抗原受体及其在免疫疗法中的用途
WO2020180551A1 (en) 2019-03-05 2020-09-10 Promab Biotechnologies, Inc. Car-t cells with humanized cd19 scfv
SG11202109172TA (en) 2019-03-08 2021-09-29 Obsidian Therapeutics Inc Human carbonic anhydrase 2 compositions and methods for tunable regulation
EP3942025A1 (en) 2019-03-21 2022-01-26 Novartis AG Car-t cell therapies with enhanced efficacy
EP3952886A1 (en) 2019-04-10 2022-02-16 Elevatebio Technologies, Inc Flt3-specific chimeric antigen receptors and methods of using the same
EP3953455A1 (en) 2019-04-12 2022-02-16 Novartis AG Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
EP3959320A1 (en) 2019-04-24 2022-03-02 Novartis AG Compositions and methods for selective protein degradation
CU20210096A7 (es) 2019-05-21 2022-06-06 Novartis Ag Moléculas de unión a cd19
BR112021024404A2 (pt) 2019-06-07 2022-04-19 Juno Therapeutics Inc Cultura de célula t automatizada
BR112021024822A2 (pt) 2019-06-12 2022-04-12 Juno Therapeutics Inc Terapia de combinação de terapia citotóxica mediada por células e inibidor de proteína da família bcl2 pró-sobrevivência
US11642409B2 (en) 2019-06-26 2023-05-09 Massachusetts Insttute of Technology Immunomodulatory fusion protein-metal hydroxide complexes and methods thereof
KR20220066892A (ko) 2019-08-22 2022-05-24 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 Ｔ 세포 요법 및 제스트 동족체 2의 인핸서 (ｅｚｈ2) 억제제의 병용 요법 및 관련 방법
WO2021038036A1 (en) * 2019-08-28 2021-03-04 King's College London B CELL TARGETED PARALLEL CAR (pCAR) THERAPEUTIC AGENTS
US11058725B2 (en) 2019-09-10 2021-07-13 Obsidian Therapeutics, Inc. CA2 compositions and methods for tunable regulation
WO2021061648A1 (en) 2019-09-23 2021-04-01 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for stimulation of endogenous t cell responses
JP2023500318A (ja) 2019-10-30 2023-01-05 ジュノ セラピューティクス ゲーエムベーハー 細胞選択および／または細胞刺激デバイスならびに使用方法
WO2021108613A1 (en) 2019-11-26 2021-06-03 Novartis Ag Cd19 and cd22 chimeric antigen receptors and uses thereof
AR120566A1 (es) 2019-11-26 2022-02-23 Novartis Ag Receptores de antígeno quiméricos y sus usos
CN115916817A (zh) 2019-12-06 2023-04-04 朱诺治疗学股份有限公司 针对bcma靶向结合结构域的抗独特型抗体及相关组合物和方法
IL293393A (en) 2019-12-06 2022-07-01 Juno Therapeutics Inc Methods related to toxicity and response associated with cell therapy for treating b cell malignancies
EP4069742A1 (en) 2019-12-06 2022-10-12 Juno Therapeutics, Inc. Anti-idiotypic antibodies to gprc5d-targeted binding domains and related compositions and methods
IL293889A (en) 2019-12-20 2022-08-01 Novartis Ag Uses of anti-tgf-beta antibodies and checkpoint inhibitors for the treatment of proliferative diseases
WO2021136415A1 (zh) 2019-12-30 2021-07-08 博雅辑因（北京）生物科技有限公司 一种纯化ucart细胞的方法与应用
WO2021136176A1 (zh) 2019-12-30 2021-07-08 博雅辑因（北京）生物科技有限公司 一种靶向t细胞淋巴瘤细胞的通用型car-t及其制备方法和应用
IL294715A (en) 2020-01-23 2022-09-01 Childrens Medical Ct Corp Stroma-free t cell differentiation from human pluripotent stem cells
US20230111593A1 (en) 2020-02-14 2023-04-13 Novartis Ag Method of predicting response to chimeric antigen receptor therapy
US12076343B2 (en) 2020-02-19 2024-09-03 Innovative Cellular Therapeutics Holdings, Ltd. Engineered safety in cell therapy
WO2021173674A1 (en) 2020-02-26 2021-09-02 A2 Biotherapeutics, Inc. Polypeptides targeting mage-a3 peptide-mhc complexes and methods of use thereof
US20230174933A1 (en) 2020-02-27 2023-06-08 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
CN115175695A (zh) 2020-02-27 2022-10-11 诺华股份有限公司 制备表达嵌合抗原受体的细胞的方法
US20210292713A1 (en) 2020-02-28 2021-09-23 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Method for producing natural killer cells from pluripotent stem cells
CN115484978A (zh) 2020-03-05 2022-12-16 尼奥克斯医疗有限公司 使用免疫细胞治疗癌症的方法和组合物
BR112022018105A2 (pt) 2020-03-10 2022-11-22 Massachusetts Inst Technology Métodos para gerar células nk tipo-memória modificadas e composições das mesmas
CA3173981A1 (en) 2020-03-10 2021-09-16 Massachusetts Institute Of Technology Compositions and methods for immunotherapy of npm1c-positive cancer
CN113402612A (zh) 2020-03-17 2021-09-17 西比曼生物科技（香港）有限公司 靶向cd19和cd20的联合嵌合抗原受体及其应用
CN111411085A (zh) * 2020-04-10 2020-07-14 格源致善(上海)生物科技有限公司 一种嵌合抗原受体t细胞及其应用
MX2022012990A (es) 2020-04-15 2023-01-11 Amgen Inc Proceso para generar células t autólogas modificadas genéticamente.
US12241086B2 (en) 2020-04-15 2025-03-04 Amgen Inc. Process for generating genetically engineered autologous T cells
BR112022021788A2 (pt) 2020-04-28 2023-01-17 Juno Therapeutics Inc Combinação de terapia com células t direcionada para bcma e um composto imunomodulador
WO2021221782A1 (en) 2020-05-01 2021-11-04 Massachusetts Institute Of Technology Chimeric antigen receptor-targeting ligands and uses thereof
WO2021221783A1 (en) 2020-05-01 2021-11-04 Massachusetts Institute Of Technology Methods for identifying chimeric antigen receptor-targeting ligands and uses thereof
WO2021231661A2 (en) 2020-05-13 2021-11-18 Juno Therapeutics, Inc. Process for producing donor-batched cells expressing a recombinant receptor
US20230178239A1 (en) 2020-05-13 2023-06-08 Juno Therapeutics, Inc. Methods of identifying features associated with clinical response and uses thereof
US12043654B2 (en) 2020-06-02 2024-07-23 Innovative Cellular Therapeutics Holdings, Ltd. Anti-GCC antibody and CAR thereof for treating digestive system cancer
EP4165169A1 (en) 2020-06-11 2023-04-19 Novartis AG Zbtb32 inhibitors and uses thereof
IL298262A (en) 2020-06-23 2023-01-01 Novartis Ag Dosing regimen comprising 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives
CN111733186A (zh) * 2020-07-03 2020-10-02 天津英科赛奥科技有限公司 靶向cd19的人源化嵌合抗原受体制备及其应用
JP2023532852A (ja) 2020-07-07 2023-08-01 キャンキュア， エルエルシー Ｍｉｃ抗体及び結合剤ならびにそれらの使用方法
WO2022016119A1 (en) 2020-07-17 2022-01-20 Simurx, Inc. Chimeric myd88 receptors for redirecting immunosuppressive signaling and related compositions and methods
EP4188549A1 (en) 2020-08-03 2023-06-07 Novartis AG Heteroaryl substituted 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives and uses thereof
WO2022031597A1 (en) 2020-08-03 2022-02-10 Kyverna Therapeutics, Inc. Methods of producing t regulatory cells, methods of transducing t cells, and uses of the same
US20230324408A1 (en) 2020-08-05 2023-10-12 Juno Therapeutics, Inc. Anti-idiotypic antibodies to ror1-targeted binding domains and related compositions and methods
CN116390946A (zh) 2020-08-13 2023-07-04 美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表) 用于治疗实体瘤的靶向磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1（gpc1）的含igg4铰链的嵌合抗原受体
MX2023002107A (es) 2020-08-21 2023-03-15 Novartis Ag Composiciones y metodos para la generacion in vivo de celulas que expresan car.
IL302412A (en) 2020-11-06 2023-06-01 Novartis Ag Anti-cd19 agent and b cell targeting agent combination therapy for treating b cell malignancies
CN114438034A (zh) * 2020-11-06 2022-05-06 上海赛比曼生物科技有限公司 一种基因修饰的细胞制备方法
AU2021378316A1 (en) 2020-11-13 2023-06-01 Novartis Ag Combination therapies with chimeric antigen receptor (car)-expressing cells
WO2022105811A1 (zh) * 2020-11-20 2022-05-27 江苏先声药业有限公司 Cd19人源化抗体及其应用
AU2021392032A1 (en) 2020-12-03 2023-06-22 Century Therapeutics, Inc. Genetically engineered cells and uses thereof
US11661459B2 (en) 2020-12-03 2023-05-30 Century Therapeutics, Inc. Artificial cell death polypeptide for chimeric antigen receptor and uses thereof
WO2022133030A1 (en) 2020-12-16 2022-06-23 Juno Therapeutics, Inc. Combination therapy of a cell therapy and a bcl2 inhibitor
EP4263600A1 (en) 2020-12-18 2023-10-25 Century Therapeutics, Inc. Chimeric antigen receptor systems with adaptable receptor specificity
CN117396607A (zh) 2020-12-30 2024-01-12 阿劳诺斯治疗公司 包含多顺反子表达盒的重组载体及其使用方法
TW202242121A (zh) 2021-01-11 2022-11-01 美商薩那生物科技公司 靶向cd8之病毒載體之用途
US20240425563A1 (en) * 2021-01-13 2024-12-26 Washington University MHC-INDEPENDENT TCRs AND METHODS OF MAKING AND USING SAME
EP4284394A1 (en) 2021-01-26 2023-12-06 Cytocares (Shanghai) Inc. Chimeric antigen receptor (car) constructs and nk cells expressing car constructs
WO2022165419A1 (en) 2021-02-01 2022-08-04 Kyverna Therapeutics, Inc. Methods for increasing t-cell function
WO2022180586A1 (en) * 2021-02-25 2022-09-01 Senthil Natesan Car t-cell product and method of preparation thereof
JP2024509853A (ja) 2021-03-03 2024-03-05 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド Ｔ細胞療法およびｄｇｋ阻害剤の組合せ
US20240168012A1 (en) 2021-03-22 2024-05-23 Juno Therapeutics, Inc. Methods of determining potency of a therapeutic cell composition
IL307262A (en) 2021-03-29 2023-11-01 Juno Therapeutics Inc METHODS FOR DOSAGE AND THERAPY IN COMBINATION OF CHECKPOINT INHIBITOR AND CAR T CELL THERAPY
TW202304979A (zh) 2021-04-07 2023-02-01 瑞士商諾華公司 抗ＴＧＦβ抗體及其他治療劑用於治療增殖性疾病之用途
AU2022257093A1 (en) 2021-04-16 2023-11-02 Celgene Corporation T cell therapy in patients who have had prior stem cell transplant
CN118201618A (zh) 2021-04-16 2024-06-14 细胞基因公司 与bcma定向t细胞疗法的组合疗法
WO2022229853A1 (en) 2021-04-27 2022-11-03 Novartis Ag Viral vector production system
KR20240018454A (ko) 2021-05-06 2024-02-13 주노 테라퓨틱스 게엠베하 T 세포의 자극 및 형질도입 방법
WO2022234158A1 (es) * 2021-05-06 2022-11-10 Institut D'investigacions Biomèdiques August Pi I Sunyer (Idibaps) Terapia de células t con receptor de antígeno quimérico específico de cd19
EP4346912A1 (en) 2021-05-25 2024-04-10 Institut Curie Myeloid cells overexpressing bcl2
EP4351595A1 (en) 2021-06-07 2024-04-17 Providence Health & Services - Oregon Cxcr5, pd-1, and icos expressing tumor reactive cd4 t cells and their use
AR126145A1 (es) 2021-06-15 2023-09-13 Takeda Pharmaceuticals Co Método para producir linfocitos citolíticos naturales a partir de células madre pluripotentes
JP2024528981A (ja) 2021-08-04 2024-08-01 サナ バイオテクノロジー，インコーポレイテッド Ｃｄ４標的化ウイルスベクターの使用
EP4384621A4 (en) * 2021-08-09 2025-04-09 Univ Pennsylvania Optimizing T-cell differentiation status with microRNAs
AU2022330406A1 (en) 2021-08-20 2024-03-07 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor–expressing cells
WO2023081715A1 (en) 2021-11-03 2023-05-11 Viracta Therapeutics, Inc. Combination of car t-cell therapy with btk inhibitors and methods of use thereof
JP2024540320A (ja) 2021-11-03 2024-10-31 セルジーン コーポレーション 骨髄腫を処置する際に使用するための、ｂ細胞成熟抗原に特異的なキメラ抗原受容体
WO2023086829A1 (en) 2021-11-09 2023-05-19 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Igg4 hinge-containing chimeric antigen receptors targeting glypican-3 (gpc3) and use thereof
WO2023115041A1 (en) 2021-12-17 2023-06-22 Sana Biotechnology, Inc. Modified paramyxoviridae attachment glycoproteins
EP4448549A2 (en) 2021-12-17 2024-10-23 Sana Biotechnology, Inc. Modified paramyxoviridae fusion glycoproteins
WO2023150518A1 (en) 2022-02-01 2023-08-10 Sana Biotechnology, Inc. Cd3-targeted lentiviral vectors and uses thereof
CN119156404A (zh) 2022-02-15 2024-12-17 美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表) 靶向gpc2的含有cd28铰链和跨膜结构的嵌合抗原受体及其用途
WO2023156587A1 (en) 2022-02-18 2023-08-24 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of tcr-deficient car-tregs in combination with anti-tcr complex monoclonal antibodies for inducing durable tolerance
WO2023193015A1 (en) 2022-04-01 2023-10-05 Sana Biotechnology, Inc. Cytokine receptor agonist and viral vector combination therapies
EP4519304A1 (en) 2022-05-02 2025-03-12 The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Compositions targeting gpc2 and gpc3 and their use for treating solid tumors
WO2023214325A1 (en) 2022-05-05 2023-11-09 Novartis Ag Pyrazolopyrimidine derivatives and uses thereof as tet2 inhibitors
WO2023213969A1 (en) 2022-05-05 2023-11-09 Juno Therapeutics Gmbh Viral-binding protein and related reagents, articles, and methods of use
KR20250008774A (ko) 2022-05-11 2025-01-15 셀진 코포레이션 T 세포 요법 및 그의 생산과 관련된 방법 및 용도
WO2023220655A1 (en) 2022-05-11 2023-11-16 Celgene Corporation Methods to overcome drug resistance by re-sensitizing cancer cells to treatment with a prior therapy via treatment with a t cell therapy
WO2023230581A1 (en) 2022-05-25 2023-11-30 Celgene Corporation Methods of manufacturing t cell therapies
WO2023230548A1 (en) 2022-05-25 2023-11-30 Celgene Corporation Method for predicting response to a t cell therapy
WO2023237663A1 (en) 2022-06-09 2023-12-14 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Use of the f359l missense irf4 variant for increasing the stability of regulatory t cells
WO2023250400A1 (en) 2022-06-22 2023-12-28 Juno Therapeutics, Inc. Treatment methods for second line therapy of cd19-targeted car t cells
AU2023308641A1 (en) * 2022-07-15 2025-02-27 Albert Einstein College Of Medicine Chimeric antigen receptors comprising a tmigd2 costimulatory domain and associated methods of using the same
WO2024047110A1 (en) 2022-08-31 2024-03-07 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Method to generate more efficient car-t cells
WO2024054944A1 (en) 2022-09-08 2024-03-14 Juno Therapeutics, Inc. Combination of a t cell therapy and continuous or intermittent dgk inhibitor dosing
AU2023342547A1 (en) 2022-09-15 2025-03-06 Novartis Ag Treatment of autoimmune disorders using chimeric antigen receptor therapy
WO2024074713A1 (en) 2022-10-07 2024-04-11 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Method to generate improving car-t cells
WO2024081820A1 (en) 2022-10-13 2024-04-18 Sana Biotechnology, Inc. Viral particles targeting hematopoietic stem cells
WO2024089639A1 (en) 2022-10-26 2024-05-02 Novartis Ag Lentiviral formulations
WO2024097905A1 (en) 2022-11-02 2024-05-10 Celgene Corporation Methods of treatment with t cell therapy and immunomodulatory agent maintenance therapy
WO2024100604A1 (en) 2022-11-09 2024-05-16 Juno Therapeutics Gmbh Methods for manufacturing engineered immune cells
WO2024124132A1 (en) 2022-12-09 2024-06-13 Juno Therapeutics, Inc. Machine learning methods for predicting cell phenotype using holographic imaging
WO2024133052A1 (en) * 2022-12-19 2024-06-27 Universität Basel Vizerektorat Forschung T-cell receptor fusion protein
WO2024161021A1 (en) 2023-02-03 2024-08-08 Juno Therapeutics Gmbh Methods for non-viral manufacturing of engineered immune cells
WO2024220588A1 (en) 2023-04-18 2024-10-24 Juno Therapeutics, Inc. Cytotoxicity assay for assessing potency of therapeutic cell compositions
WO2024220560A1 (en) 2023-04-18 2024-10-24 Sana Biotechnology, Inc. Engineered protein g fusogens and related lipid particles and methods thereof
WO2024220574A1 (en) 2023-04-18 2024-10-24 Sana Biotechnology, Inc. Universal protein g fusogens and adapter systems thereof and related lipid particles and uses
WO2024220598A2 (en) 2023-04-18 2024-10-24 Sana Biotechnology, Inc. Lentiviral vectors with two or more genomes
WO2024243365A2 (en) 2023-05-23 2024-11-28 Juno Therapeutics, Inc. Activation markers of t cells and method for assessing t cell activation
TW202448956A (zh) 2023-06-09 2024-12-16 大陸商上海藥明巨諾生物醫藥研發有限公司 融合蛋白及其醫藥用途
WO2025051339A1 (en) 2023-09-05 2025-03-13 Tiber Biotech Srl SINGLE-CHAIN VARIABLE FRAGMENT AND MOLECULES DERIVING THEREFROM THAT BIND FRAGMENT TRVB5-1 OF THE β CHAIN OF HUMAN T-CELL RECEPTOR
WO2025054202A1 (en) 2023-09-05 2025-03-13 Sana Biotechnology, Inc. Method of screening a sample comprising a transgene with a unique barcode
WO2025072450A1 (en) 2023-09-26 2025-04-03 Werewolf Therapeutics, Inc. Enhanced adoptive cell therapy

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101583626A (zh) * 2006-10-10 2009-11-18 瓦西尼斯公司 抗cd20抗体和使用方法
WO2012079000A1 (en) * 2010-12-09 2012-06-14 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Use of chimeric antigen receptor-modified t cells to treat cancer

Family Cites Families (232)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2116183B (en) 1982-03-03 1985-06-05 Genentech Inc Human antithrombin iii dna sequences therefore expression vehicles and cloning vectors containing such sequences and cell cultures transformed thereby a process for expressing human antithrombin iii and pharmaceutical compositions comprising it
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4882282A (en) 1985-08-16 1989-11-21 Immunex Corporation DNA sequences encoding bovine interleukin-2
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US5906936A (en) 1988-05-04 1999-05-25 Yeda Research And Development Co. Ltd. Endowing lymphocytes with antibody specificity
US6303121B1 (en) 1992-07-30 2001-10-16 Advanced Research And Technology Method of using human receptor protein 4-1BB
US6905680B2 (en) 1988-11-23 2005-06-14 Genetics Institute, Inc. Methods of treating HIV infected subjects
US5858358A (en) 1992-04-07 1999-01-12 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US6352694B1 (en) 1994-06-03 2002-03-05 Genetics Institute, Inc. Methods for inducing a population of T cells to proliferate using agents which recognize TCR/CD3 and ligands which stimulate an accessory molecule on the surface of the T cells
US6534055B1 (en) 1988-11-23 2003-03-18 Genetics Institute, Inc. Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
US5585362A (en) 1989-08-22 1996-12-17 The Regents Of The University Of Michigan Adenovirus vectors for gene therapy
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
AU643109B2 (en) 1990-12-14 1993-11-04 Cell Genesys, Inc. Chimeric chains for receptor-associated signal transduction pathways
US6319494B1 (en) 1990-12-14 2001-11-20 Cell Genesys, Inc. Chimeric chains for receptor-associated signal transduction pathways
US6004811A (en) 1991-03-07 1999-12-21 The Massachussetts General Hospital Redirection of cellular immunity by protein tyrosine kinase chimeras
US7049136B2 (en) 1991-03-07 2006-05-23 The General Hospital Corporation Redirection of cellular immunity by receptor chimeras
IL101147A (en) 1991-03-07 2004-06-20 Gen Hospital Corp Redirection of cellular immunity by receptor chimeras
EP0519596B1 (en) 1991-05-17 2005-02-23 Merck & Co. Inc. A method for reducing the immunogenicity of antibody variable domains
US5199942A (en) 1991-06-07 1993-04-06 Immunex Corporation Method for improving autologous transplantation
US6407213B1 (en) 1991-06-14 2002-06-18 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
GB9125768D0 (en) 1991-12-04 1992-02-05 Hale Geoffrey Therapeutic method
DE69233204T2 (de) 1991-12-13 2004-07-15 Xoma Corp., Berkeley Verfahren und materialien zur herstellung von modifizierten variablen antikörperdomänen und ihre therapeutische verwendung
GB9203459D0 (en) 1992-02-19 1992-04-08 Scotgen Ltd Antibodies with germ-line variable regions
IL104570A0 (en) 1992-03-18 1993-05-13 Yeda Res & Dev Chimeric genes and cells transformed therewith
US8211422B2 (en) 1992-03-18 2012-07-03 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Chimeric receptor genes and cells transformed therewith
US5350674A (en) 1992-09-04 1994-09-27 Becton, Dickinson And Company Intrinsic factor - horse peroxidase conjugates and a method for increasing the stability thereof
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
US7211259B1 (en) 1993-05-07 2007-05-01 Immunex Corporation 4-1BB polypeptides and DNA encoding 4-1BB polypeptides
NZ273838A (en) 1993-09-16 1997-09-22 Indiana University Foundation Human receptor protein h4-1bb
NZ285395A (en) 1994-05-02 1998-10-28 Novartis Ag Chimeric antibody, cancer treatment
US7175843B2 (en) 1994-06-03 2007-02-13 Genetics Institute, Llc Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US5786464C1 (en) 1994-09-19 2012-04-24 Gen Hospital Corp Overexpression of mammalian and viral proteins
US5712149A (en) 1995-02-03 1998-01-27 Cell Genesys, Inc. Chimeric receptor molecules for delivery of co-stimulatory signals
US6103521A (en) 1995-02-06 2000-08-15 Cell Genesys, Inc. Multispecific chimeric receptors
EP0871495B1 (en) 1995-02-24 2005-06-15 The General Hospital Corporation Redirection of cellular immunity by receptor chimeras
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US6692964B1 (en) 1995-05-04 2004-02-17 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for transfecting T cells
US7067318B2 (en) 1995-06-07 2006-06-27 The Regents Of The University Of Michigan Methods for transfecting T cells
GB9526131D0 (en) 1995-12-21 1996-02-21 Celltech Therapeutics Ltd Recombinant chimeric receptors
US5874240A (en) 1996-03-15 1999-02-23 Human Genome Sciences, Inc. Human 4-1BB receptor splicing variant
EP0920505B1 (en) 1996-08-16 2008-06-04 Schering Corporation Mammalian cell surface antigens; related reagents
US6111090A (en) 1996-08-16 2000-08-29 Schering Corporation Mammalian cell surface antigens; related reagents
US6114148C1 (en) 1996-09-20 2012-05-01 Gen Hospital Corp High level expression of proteins
EP0937095A4 (en) 1996-10-25 1999-12-22 Cell Genesys Inc TARGETED CYTOLYSIS OF CANCER CELLS
US20030060444A1 (en) 1997-06-25 2003-03-27 Celltech Therapeutics, Ltd. Cell activation process and reagents therefor
GB9713473D0 (en) 1997-06-25 1997-09-03 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
EP1017716A4 (en) 1997-09-19 2001-01-03 Gen Hospital Corp CAR RECEPTORS, MOLECULES AND RELATED METHODS
JP2001520039A (ja) 1997-10-21 2001-10-30 ヒューマン ジノーム サイエンシーズ， インコーポレイテッド ヒト腫瘍壊死因子レセプター様タンパク質、ｔｒ１１，ｔｒ１１ｓｖ１およびｔｒ１１ｓｖ２
IL135799A0 (en) 1997-10-28 2001-05-20 Univ British Columbia Immunological compositions and methods of use to transiently alter mammalian central nervous system myelin to promote neuronal regeneration
CA2319236A1 (en) 1998-02-09 1999-08-12 Genentech, Inc. Novel tumor necrosis factor receptor homolog and nucleic acids encoding the same
CA2328725A1 (en) 1998-04-15 1999-10-21 Brigham & Women's Hospital, Inc. T cell inhibitory receptor compositions and uses thereof
GB9809658D0 (en) 1998-05-06 1998-07-01 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
EP1109921A4 (en) 1998-09-04 2002-08-28 Sloan Kettering Inst Cancer FUSION RECEPTORS SPECIFIC TO MEMBRANE SPECIFIC PROSTATIC ANTIGEN AND USES THEREOF
WO2000023573A2 (en) 1998-10-20 2000-04-27 City Of Hope Cd20-specific redirected t cells and their use in cellular immunotherapy of cd20+ malignancies
WO2000063374A1 (en) 1999-04-16 2000-10-26 Celltech Therapeutics Limited Synthetic transmembrane components
EP1196186B1 (en) 1999-07-12 2007-10-31 Genentech, Inc. Promotion or inhibition of angiogenesis and cardiovascularization by tumor necrosis factor ligand/receptor homologs
JP2003516124A (ja) 1999-10-15 2003-05-13 ユニバーシティー オブ マサチューセッツ 標的とした遺伝的干渉の手段としてのｒｎａ干渉経路遺伝子
GB9925848D0 (en) 1999-11-01 1999-12-29 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
US6326193B1 (en) 1999-11-05 2001-12-04 Cambria Biosciences, Llc Insect control agent
AU784988B2 (en) 1999-11-10 2006-08-17 Uab Research Foundation, The Lentiviral vector transduction of hematopoietic stem cells
US7572631B2 (en) 2000-02-24 2009-08-11 Invitrogen Corporation Activation and expansion of T cells
US6867041B2 (en) 2000-02-24 2005-03-15 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
US6797514B2 (en) 2000-02-24 2004-09-28 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
BR0108545A (pt) 2000-02-24 2004-06-29 Xcyte Therapies Inc Estimulação e concentração simultâneas das células
IL136511A0 (en) 2000-06-01 2001-06-14 Gavish Galilee Bio Appl Ltd Genetically engineered mhc molecules
AU2001275474A1 (en) 2000-06-12 2001-12-24 Akkadix Corporation Materials and methods for the control of nematodes
GB0025307D0 (en) 2000-10-16 2000-11-29 Celltech Chiroscience Ltd Biological products
EP1334188B1 (en) 2000-11-07 2006-08-30 City of Hope Cd19-specific redirected immune cells
US7070995B2 (en) 2001-04-11 2006-07-04 City Of Hope CE7-specific redirected immune cells
CN1294148C (zh) 2001-04-11 2007-01-10 中国科学院遗传与发育生物学研究所 环状单链三特异抗体
WO2002088334A1 (en) 2001-04-30 2002-11-07 City Of Hope Chimeric immunoreceptor useful in treating human cancers
US20090257994A1 (en) 2001-04-30 2009-10-15 City Of Hope Chimeric immunoreceptor useful in treating human cancers
US7514537B2 (en) 2001-04-30 2009-04-07 City Of Hope Chimeric immunoreceptor useful in treating human gliomas
US20030148982A1 (en) 2001-11-13 2003-08-07 Brenner Malcolm K. Bi-spcific chimeric T cells
US7638326B2 (en) 2002-01-03 2009-12-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Activation and expansion of T-cells using an engineered multivalent signaling platform
US7670781B2 (en) 2002-01-03 2010-03-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Activation and expansion of T-cells using an agent that provides a primary activation signal and another agent that provides a co-stimulatory signal
US7745140B2 (en) 2002-01-03 2010-06-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Activation and expansion of T-cells using an engineered multivalent signaling platform as a research tool
EP2407473A3 (en) 2002-02-01 2012-03-21 ARIAD Pharmaceuticals, Inc Method for producing phosphorus-containing compounds
US7446190B2 (en) 2002-05-28 2008-11-04 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Nucleic acids encoding chimeric T cell receptors
EP2366718A3 (en) 2002-06-28 2012-05-02 Domantis Limited Ligand
JP4511943B2 (ja) 2002-12-23 2010-07-28 ワイス エルエルシー Ｐｄ−１に対する抗体およびその使用
US20050129671A1 (en) 2003-03-11 2005-06-16 City Of Hope Mammalian antigen-presenting T cells and bi-specific T cells
US7402431B2 (en) 2004-03-01 2008-07-22 Immunovative Therapies, Ltd. T-cell therapy formulation
RU2369636C2 (ru) 2003-05-23 2009-10-10 Уайт Лиганд gitr и связанные с лигандом gitr молекулы и антитела и варианты их применения
EP1638510B1 (en) 2003-07-01 2015-09-02 Immunomedics, Inc. Multivalent carriers of bi-specific antibodies
US20050048054A1 (en) 2003-07-11 2005-03-03 Shino Hanabuchi Lymphocytes; methods
ES2458636T3 (es) 2003-08-18 2014-05-06 Medimmune, Llc Humanización de anticuerpos
AU2004280333A1 (en) 2003-08-22 2005-04-21 Medimmune, Llc Humanization of antibodies
WO2005019429A2 (en) 2003-08-22 2005-03-03 Potentia Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for enhancing phagocytosis or phagocyte activity
US20050113564A1 (en) 2003-11-05 2005-05-26 St. Jude Children's Research Hospital Chimeric receptors with 4-1BB stimulatory signaling domain
US7435596B2 (en) 2004-11-04 2008-10-14 St. Jude Children's Research Hospital, Inc. Modified cell line and method for expansion of NK cell
JP2007518399A (ja) 2003-12-02 2007-07-12 ジェンザイム コーポレイション 肺癌を診断および治療する組成物並びに方法
GB0409799D0 (en) 2004-04-30 2004-06-09 Isis Innovation Method of generating improved immune response
CA2568344C (en) 2004-05-27 2016-01-19 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Novel artificial antigen presenting cells and uses therefor
WO2006083289A2 (en) 2004-06-04 2006-08-10 Duke University Methods and compositions for enhancement of immunity by in vivo depletion of immunosuppressive cell activity
WO2006020258A2 (en) 2004-07-17 2006-02-23 Imclone Systems Incorporated Novel tetravalent bispecific antibody
US7994298B2 (en) 2004-09-24 2011-08-09 Trustees Of Dartmouth College Chimeric NK receptor and methods for treating cancer
US7462697B2 (en) * 2004-11-08 2008-12-09 Epitomics, Inc. Methods for antibody engineering
WO2006060878A1 (en) 2004-12-10 2006-06-15 Peter Maccallum Cancer Institute Methods and compositions for adoptive immunotherapy
WO2006105021A2 (en) 2005-03-25 2006-10-05 Tolerrx, Inc. Gitr binding molecules and uses therefor
RU2406760C3 (ru) 2005-05-09 2017-11-28 Оно Фармасьютикал Ко., Лтд. Моноклональные антитела человека к белку программируемой смерти 1 (pd-1) и способы лечения рака с использованием анти-pd-1-антител самостоятельно или в комбинации с другими иммунотерапевтическими средствами
NZ581779A (en) 2005-05-17 2011-09-30 Univ Connecticut Composition and methods for immunomodulation in an organism comprising interleukin-15 polypeptide and interleukin-15 receptor subunit A polypeptide complex
KR101607288B1 (ko) 2005-07-01 2016-04-05 이. 알. 스퀴부 앤드 선즈, 엘.엘.씨. 예정 사멸 리간드 1 (피디-엘1)에 대한 인간 모노클로날 항체
US20070036773A1 (en) 2005-08-09 2007-02-15 City Of Hope Generation and application of universal T cells for B-ALL
EP1928506A4 (en) 2005-08-19 2009-10-21 Abbott Lab IMMUNOGLOBULIN HAVING TWO VARIABLE DOMAINS AND USES THEREOF
MX357691B (es) 2006-01-13 2018-07-19 The Government Of The United States As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Il-15 y il-15r-alfa mejoradas para expresion en celulas mamiferas.
WO2007133822A1 (en) 2006-01-19 2007-11-22 Genzyme Corporation Gitr antibodies for the treatment of cancer
PL2529622T3 (pl) 2006-09-22 2018-07-31 Pharmacyclics Llc Inhibitory kinazy tyrozynowej brutona
WO2008045437A2 (en) 2006-10-09 2008-04-17 The General Hospital Corporation Chimeric t-cell receptors and t-cells targeting egfrviii on tumors
EP1916259A1 (en) 2006-10-26 2008-04-30 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Anti-glycoprotein VI SCFV fragment for treatment of thrombosis
US20080131415A1 (en) 2006-11-30 2008-06-05 Riddell Stanley R Adoptive transfer of cd8 + t cell clones derived from central memory cells
CA2584494A1 (en) 2007-03-27 2008-09-27 Jeffrey A. Medin Vector encoding therapeutic polypeptide and safety elements to clear transduced cells
PL2856876T3 (pl) 2007-03-30 2018-06-29 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Konstytutywna ekspresja ligandów kostymulujących na limfocytach T poddanych transferowi adoptywnemu
CN104945508B (zh) 2007-06-18 2019-02-22 默沙东有限责任公司 针对人程序性死亡受体pd-1的抗体
EP2173378B1 (en) 2007-06-27 2014-03-19 Admune Therapeutics LLC Complexes of il-15 and il-15ralpha and uses thereof
DK2175884T3 (en) 2007-07-12 2016-09-26 Gitr Inc Combination USING GITR BINDING MOLECULES
HUE031533T2 (hu) * 2007-10-19 2017-07-28 Seattle Genetics Inc CD19-kötõszerek valamint alkalmazásuk
US9416165B2 (en) 2007-10-26 2016-08-16 The Regents Of The University Of California Methods of inhibiting viral replication and improving T cell function employing soluble Tim-3 inhibitors
WO2009091826A2 (en) * 2008-01-14 2009-07-23 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Compositions and methods related to a human cd19-specific chimeric antigen receptor (h-car)
US10059923B2 (en) 2008-01-30 2018-08-28 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Methods for off-the-shelf tumor immunotherapy using allogeneic T-cell precursors
MX2010008786A (es) 2008-02-11 2010-12-01 Curetech Ltd Anticuerpos monoclonales para tratamiento de tumores.
US8379824B2 (en) 2008-03-06 2013-02-19 At&T Intellectual Property I, Lp Methods and apparatus to provide a network-based caller identification service in a voice over internet protocol network
EP2262837A4 (en) 2008-03-12 2011-04-06 Merck Sharp & Dohme PD-1 BINDING PROTEINS
EA201170031A1 (ru) 2008-07-02 2011-08-30 Эмерджент Продакт Дивелопмент Сиэтл, Ллс СВЯЗЫВАЮЩИЕ НЕСКОЛЬКО МИШЕНЕЙ БЕЛКИ, ОБЛАДАЮЩИЕ АНТАГОНИСТИЧЕСКИМ ДЕЙСТВИЕМ ПО ОТНОШЕНИЮ К TGF-β
AR072999A1 (es) 2008-08-11 2010-10-06 Medarex Inc Anticuerpos humanos que se unen al gen 3 de activacion linfocitaria (lag-3) y los usos de estos
CA2734908A1 (en) 2008-08-25 2010-03-11 Amplimmune, Inc. Compositions of pd-1 antagonists and methods of use
CA2735006A1 (en) 2008-08-25 2010-03-11 Amplimmune, Inc. Pd-1 antagonists and methods of use thereof
SI3006459T1 (sl) 2008-08-26 2022-01-31 City Of Hope Postopek in sestavki za izboljšano protitumorsko efektorsko delovanje T celic
JPWO2010030002A1 (ja) 2008-09-12 2012-02-02 国立大学法人三重大学 外来性ｇｉｔｒリガンド発現細胞
CN108997498A (zh) 2008-12-09 2018-12-14 霍夫曼-拉罗奇有限公司 抗-pd-l1抗体及它们用于增强t细胞功能的用途
EP2389443B1 (en) 2009-01-23 2018-11-14 Roger Williams Hospital Retroviral vectors encoding multiple highly homologous non-viral polypeptides and the use of same
WO2010087972A2 (en) * 2009-01-29 2010-08-05 Abbott Laboratories Il-1 binding proteins
EP3192811A1 (en) 2009-02-09 2017-07-19 Université d'Aix-Marseille Pd-1 antibodies and pd-l1 antibodies and uses thereof
EA201190132A1 (ru) * 2009-02-23 2013-01-30 Гленмарк Фармасьютикалс С.А. Гуманизированные антитела, связывающиеся с cd19, и их применение
JP2013501817A (ja) 2009-08-14 2013-01-17 アメリカ合衆国 胸腺産出の増大およびリンパ球減少症の治療のためのｉｌ−１５の使用
LT3023438T (lt) 2009-09-03 2020-05-11 Merck Sharp & Dohme Corp. Anti-gitr antikūnai
US8465743B2 (en) 2009-10-01 2013-06-18 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Anti-vascular endothelial growth factor receptor-2 chimeric antigen receptors and use of same for the treatment of cancer
WO2011059836A2 (en) 2009-10-29 2011-05-19 Trustees Of Dartmouth College T cell receptor-deficient t cell compositions
GB0919054D0 (en) 2009-10-30 2009-12-16 Isis Innovation Treatment of obesity
WO2011066342A2 (en) 2009-11-24 2011-06-03 Amplimmune, Inc. Simultaneous inhibition of pd-l1/pd-l2
AU2010343056A1 (en) 2009-12-29 2012-08-02 Emergent Product Development Seattle, Llc Ron binding constructs and methods of use thereof
US9133436B2 (en) 2010-02-04 2015-09-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania ICOS critically regulates the expansion and function of inflammatory human Th17 cells
WO2012050374A2 (en) * 2010-10-13 2012-04-19 Innocell, Inc. Immunotherapy for solid tumors
JP6109741B2 (ja) 2010-10-27 2017-04-05 ベイラー カレッジ オブ メディスンＢａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｔ細胞をｃｄ７０陽性悪性腫瘍に仕向けるためのキメラなｃｄ２７受容体
ES2791716T3 (es) 2010-12-14 2020-11-05 Univ Maryland Células T que expresan al receptor de antígeno quimérico antietiqueta universal y métodos para el tratamiento del cáncer
KR20140004174A (ko) 2011-01-18 2014-01-10 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 암 치료를 위한 조성물 및 방법
CA2830953C (en) 2011-03-23 2023-02-28 Fred Hutchinson Cancer Research Center Method and compositions for cellular immunotherapy
WO2012127464A2 (en) 2011-03-23 2012-09-27 Gavish-Galilee Bio Applications Ltd Constitutively activated t cells for use in adoptive cell therapy
EP2694553B1 (en) 2011-04-01 2017-10-11 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center T cell receptor-like antibodies specific for a wt1 peptide presented by hla-a2
NZ723731A (en) 2011-04-08 2020-05-29 Baylor College Medicine Reversing the effects of the tumor microenvironment using chimeric cytokine receptors
US9266960B2 (en) 2011-04-08 2016-02-23 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Anti-epidermal growth factor receptor variant III chimeric antigen receptors and use of same for the treatment of cancer
US20130071414A1 (en) 2011-04-27 2013-03-21 Gianpietro Dotti Engineered cd19-specific t lymphocytes that coexpress il-15 and an inducible caspase-9 based suicide gene for the treatment of b-cell malignancies
EP4488370A2 (en) 2011-07-25 2025-01-08 Nationwide Children's Hospital, Inc. Recombinant virus products and methods for inhibition of expresssion of dux4
ES2888651T3 (es) 2011-07-29 2022-01-05 Univ Pennsylvania Receptores de conmutación coestimulantes
WO2013033626A2 (en) 2011-08-31 2013-03-07 Trustees Of Dartmouth College Nkp30 receptor targeted therapeutics
US20130108641A1 (en) 2011-09-14 2013-05-02 Sanofi Anti-gitr antibodies
EP3692794A1 (en) 2011-09-16 2020-08-12 Baylor College of Medicine Targeting the tumor microenvironment using manipulated nkt cells
EA201490636A1 (ru) 2011-09-16 2014-08-29 Дзе Трастиз Оф Дзе Юниверсити Оф Пенсильвания Сконструированные с помощью рнк t-клетки для лечения злокачественных новообразований
BR112014008849A2 (pt) 2011-10-20 2017-09-12 Us Health receptores quiméricos de antígeno anti-cd22
CA3205751A1 (en) 2012-02-22 2013-08-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Use of icos-based cars to enhance antitumor activity and car persistence
KR20140127816A (ko) 2012-02-22 2014-11-04 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 암의 치료에 유용한 t 세포의 지속성 집단을 생성시키기 위한 조성물 및 방법
EP2817331B1 (en) 2012-02-22 2023-08-30 The Trustees of the University of Pennsylvania Use of the cd2 signaling domain in second-generation chimeric antigen receptors
US20160235787A1 (en) 2012-07-13 2016-08-18 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Epitope Spreading Associated with CAR T-Cells
KR20150029714A (ko) 2012-07-13 2015-03-18 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 이중특이적 항체의 공-도입에 의한 ｃａｒ 세포의 활성 증강
EP2872218A4 (en) 2012-07-13 2016-07-06 Univ Pennsylvania COMPOSITIONS AND METHOD FOR REGULATING HAIR GROWTH
LT4019041T (lt) 2012-07-13 2023-04-11 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Toksiškumo, atsirandančio dėl car receptorių priešnavikinio aktyvumo, suvaldymas
WO2014011996A1 (en) 2012-07-13 2014-01-16 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods of assessing the suitability of transduced t cells for administration
JP2015523386A (ja) 2012-07-13 2015-08-13 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア 寛容を誘導するために正常ｂ細胞を枯渇させるためのｃａｒｔ１９の使用
EP4537839A2 (en) 2012-08-20 2025-04-16 Fred Hutchinson Cancer Center Method and compositions for cellular immunotherapy
US9937205B2 (en) 2012-09-04 2018-04-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Inhibition of diacylglycerol kinase to augment adoptive T cell transfer
TW201414837A (zh) 2012-10-01 2014-04-16 Univ Pennsylvania 標定基質細胞以治療癌症之組合物和方法
US10117896B2 (en) 2012-10-05 2018-11-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Use of a trans-signaling approach in chimeric antigen receptors
WO2014130635A1 (en) 2013-02-20 2014-08-28 Novartis Ag Effective targeting of primary human leukemia using anti-cd123 chimeric antigen receptor engineered t cells
US9394368B2 (en) 2013-02-20 2016-07-19 Novartis Ag Treatment of cancer using humanized anti-EGFRvIII chimeric antigen receptor
US9657105B2 (en) 2013-03-15 2017-05-23 City Of Hope CD123-specific chimeric antigen receptor redirected T cells and methods of their use
WO2014145252A2 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Milone Michael C Targeting cytotoxic cells with chimeric receptors for adoptive immunotherapy
UY35468A (es) 2013-03-16 2014-10-31 Novartis Ag Tratamiento de cáncer utilizando un receptor quimérico de antígeno anti-cd19
CN105814083A (zh) 2013-10-15 2016-07-27 加州生物医学研究所 嵌合抗原受体t细胞开关和其用途
US9512084B2 (en) 2013-11-29 2016-12-06 Novartis Ag Amino pyrimidine derivatives
WO2015095392A1 (en) 2013-12-17 2015-06-25 Genentech, Inc. Anti-cd3 antibodies and methods of use
JP6779785B2 (ja) 2013-12-19 2020-11-04 ノバルティス アーゲー ヒトメソテリンキメラ抗原受容体およびその使用
US10287354B2 (en) 2013-12-20 2019-05-14 Novartis Ag Regulatable chimeric antigen receptor
WO2015112626A1 (en) 2014-01-21 2015-07-30 June Carl H Enhanced antigen presenting ability of car t cells by co-introduction of costimulatory molecules
EP3811970A1 (en) 2014-03-15 2021-04-28 Novartis AG Regulatable chimeric antigen receptor
EP3593812A3 (en) 2014-03-15 2020-05-27 Novartis AG Treatment of cancer using chimeric antigen receptor
EA201691872A1 (ru) 2014-03-19 2017-04-28 Инфинити Фармасьютикалз, Инк. Гетероциклические соединения для применения в лечении pi3k-гамма-опосредованных расстройств
DK3888674T3 (da) 2014-04-07 2024-07-08 Novartis Ag Behandling af cancer ved anvendelse af anti-cd19-kimær antigenreceptor
WO2016014535A1 (en) 2014-07-21 2016-01-28 Novartis Ag Treatment of cancer using a cll-1 chimeric antigen receptor
SG11201700416TA (en) 2014-07-21 2017-02-27 Novartis Ag Treatment of cancer using a cd33 chimeric antigen receptor
EP3193915A1 (en) 2014-07-21 2017-07-26 Novartis AG Combinations of low, immune enhancing. doses of mtor inhibitors and cars
WO2016014501A1 (en) 2014-07-21 2016-01-28 Novartis Ag Sortase molecules and uses thereof
US11542488B2 (en) 2014-07-21 2023-01-03 Novartis Ag Sortase synthesized chimeric antigen receptors
US20170274014A1 (en) 2014-07-21 2017-09-28 Jennifer Brogdon Combinations of low, immune enhancing, doses of mtor inhibitors and cars
AU2015292744C1 (en) 2014-07-21 2021-01-21 Novartis Ag Treatment of cancer using humanized anti-BCMA chimeric antigen receptor
WO2016019300A1 (en) 2014-07-31 2016-02-04 Novartis Ag Subset-optimized chimeric antigen receptor-containing t-cells
CA2958200A1 (en) 2014-08-14 2016-02-18 Novartis Ag Treatment of cancer using a gfr alpha-4 chimeric antigen receptor
WO2016028896A1 (en) 2014-08-19 2016-02-25 Novartis Ag Anti-cd123 chimeric antigen receptor (car) for use in cancer treatment
CN107580628B (zh) 2014-09-17 2022-01-07 诺华股份有限公司 用于过继免疫疗法的具有嵌合受体的靶向细胞毒性细胞
KR20170068504A (ko) 2014-10-08 2017-06-19 노파르티스 아게 키메라 항원 수용체 요법에 대한 치료 반응성을 예측하는 바이오마커 및 그의 용도
WO2016061368A1 (en) 2014-10-15 2016-04-21 The Children's Hospital Of Philadelphia Compositions and methods for treating b-lymphoid malignancies
SG11201705293WA (en) 2014-12-29 2017-07-28 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
US11459390B2 (en) 2015-01-16 2022-10-04 Novartis Ag Phosphoglycerate kinase 1 (PGK) promoters and methods of use for expressing chimeric antigen receptor
US11161907B2 (en) 2015-02-02 2021-11-02 Novartis Ag Car-expressing cells against multiple tumor antigens and uses thereof
ES2876974T3 (es) 2015-04-07 2021-11-15 Novartis Ag Combinación de terapia con receptor de antígeno quimérico y derivados de amino pirimidina
PT3280729T (pt) 2015-04-08 2022-08-01 Novartis Ag Terapias para cd20, terapias para cd22 e terapias de combinação com uma célula que expressa o recetor de antigénio quimérico (car) para cd19
SG11201708516YA (en) 2015-04-17 2017-11-29 David Maxwell Barrett Methods for improving the efficacy and expansion of chimeric antigen receptor-expressing cells
US12128069B2 (en) 2015-04-23 2024-10-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Treatment of cancer using chimeric antigen receptor and protein kinase a blocker
AU2016297014B2 (en) 2015-07-21 2021-06-17 Novartis Ag Methods for improving the efficacy and expansion of immune cells
EP3331913A1 (en) 2015-08-07 2018-06-13 Novartis AG Treatment of cancer using chimeric cd3 receptor proteins
JP6905163B2 (ja) 2015-09-03 2021-07-21 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア サイトカイン放出症候群を予測するバイオマーカー
IL297003A (en) 2015-09-17 2022-12-01 Novartis Ag Car t cell therapies with enhanced efficacy
WO2017112741A1 (en) 2015-12-22 2017-06-29 Novartis Ag Mesothelin chimeric antigen receptor (car) and antibody against pd-l1 inhibitor for combined use in anticancer therapy
EP3397756B1 (en) 2015-12-30 2023-03-08 Novartis AG Immune effector cell therapies with enhanced efficacy
AU2017295886C1 (en) 2016-07-15 2024-05-16 Novartis Ag Treatment and prevention of cytokine release syndrome using a chimeric antigen receptor in combination with a kinase inhibitor
KR20190034588A (ko) 2016-07-28 2019-04-02 노파르티스 아게 키메라 항원 수용체 및 pd-1 억제제의 조합 요법
EP3490590A2 (en) 2016-08-01 2019-06-05 Novartis AG Treatment of cancer using a chimeric antigen receptor in combination with an inhibitor of a pro-m2 macrophage molecule
CN110582488A (zh) 2016-09-30 2019-12-17 诺华股份有限公司 具有增强功效的免疫效应细胞疗法
CA3039646A1 (en) 2016-10-07 2018-04-12 Novartis Ag Chimeric antigen receptors for the treatment of cancer
EP3574005B1 (en) 2017-01-26 2021-12-15 Novartis AG Cd28 compositions and methods for chimeric antigen receptor therapy
EP3577134A1 (en) 2017-01-31 2019-12-11 Novartis AG Treatment of cancer using chimeric t cell receptor proteins having multiple specificities
WO2018160731A1 (en) 2017-02-28 2018-09-07 Novartis Ag Shp inhibitor compositions and uses for chimeric antigen receptor therapy
RU2019133286A (ru) 2017-03-22 2021-04-22 Новартис Аг Биомаркеры и средства терапии на основе т-клеток с car с повышенной эффективностью
EP3615055A1 (en) 2017-04-28 2020-03-04 Novartis AG Cells expressing a bcma-targeting chimeric antigen receptor, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
US20200061113A1 (en) 2018-04-12 2020-02-27 Novartis Ag Chimeric antigen receptor therapy characterization assays and uses thereof
US20200085869A1 (en) 2018-05-16 2020-03-19 Novartis Ag Therapeutic regimens for chimeric antigen receptor therapies
US11608382B2 (en) 2018-06-13 2023-03-21 Novartis Ag BCMA chimeric antigen receptors and uses thereof

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101583626A (zh) * 2006-10-10 2009-11-18 瓦西尼斯公司 抗cd20抗体和使用方法
WO2012079000A1 (en) * 2010-12-09 2012-06-14 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Use of chimeric antigen receptor-modified t cells to treat cancer

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
C P WONG ET AL.: "Recombinant adenovirus vaccine encoding a chimeric T-cell antigen receptor induces protective immunity against a T-cell lymphoma", 《CANCER RES》 *
秦方园等: "嵌合抗原受体修饰T细胞免疫治疗肿瘤的研究进展", 《中国肿瘤生物治疗杂志》 *

Cited By (58)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109716139A (zh) * 2015-09-16 2019-05-03 安娜贝尔·罗德里格斯奥昆多 重组淋巴细胞活化基因-3的用途
US11365237B2 (en) 2016-03-23 2022-06-21 Helmholtz Zentrum Muenchen—Deutsches Forschungszentrum Fuer Gesundheit Und Umwelt (Gmbh) Fusion proteins of PD-1 and 4-1BB
CN109195985A (zh) * 2016-03-23 2019-01-11 德国亥姆霍兹慕尼黑中心健康与环境研究中心（有限公司） Pd-1和4-1bb的融合蛋白
CN109069537B (zh) * 2016-04-04 2022-04-15 亘喜生物科技（上海）有限公司 共刺激结构域中具有重复结合基序的car
CN109069537A (zh) * 2016-04-04 2018-12-21 亘喜生物科技（上海）有限公司 共刺激结构域中具有重复结合基序的car
CN109562151A (zh) * 2016-06-06 2019-04-02 朱诺治疗学股份有限公司 使用过继细胞疗法治疗b细胞恶性肿瘤的方法
CN107523549A (zh) * 2016-06-20 2017-12-29 上海细胞治疗研究院 一种高效稳定表达激活型抗体的car‑t细胞及其用途
CN107523548A (zh) * 2016-06-20 2017-12-29 上海细胞治疗研究院 一种高效稳定表达抗体的t细胞及其用途
CN106117366A (zh) * 2016-06-24 2016-11-16 安徽未名细胞治疗有限公司 一种cd19特异性嵌合抗原受体及其编码基因、应用
CN106178163B (zh) * 2016-07-01 2019-02-01 翁炳焕 艾滋病生物细胞免疫治疗仪
CN106178163A (zh) * 2016-07-01 2016-12-07 翁炳焕 艾滋病生物细胞免疫治疗仪
CN106267409A (zh) * 2016-07-01 2017-01-04 翁炳焕 艾滋病生物治疗反应器
CN106267409B (zh) * 2016-07-01 2019-02-01 翁炳焕 艾滋病生物治疗反应器
WO2018006881A1 (zh) * 2016-07-08 2018-01-11 生命序有限公司 重组免疫检查点受体及其应用
WO2018006880A1 (zh) * 2016-07-08 2018-01-11 生命序有限公司 重组免疫检查点受体及免疫检查点抑制分子的共表达及应用
CN107586342A (zh) * 2016-07-08 2018-01-16 生命序有限公司 重组免疫检查点受体及其应用
CN106011174A (zh) * 2016-07-26 2016-10-12 黑龙江天晴干细胞股份有限公司 一种通用型慢病毒载体及其制备方法
CN106399242A (zh) * 2016-09-13 2017-02-15 北京多赢时代转化医学研究院 联合制备CAR‑Vγ9Vδ2T细胞和CAR‑NKT细胞的方法
CN106350487A (zh) * 2016-09-13 2017-01-25 北京多赢时代转化医学研究院 联合制备car‑nk细胞和car‑nkt细胞的方法
CN106350487B (zh) * 2016-09-13 2019-01-25 北京多赢时代转化医学研究院 联合制备car-nk细胞和car-nkt细胞的方法
WO2018058431A1 (zh) * 2016-09-28 2018-04-05 李华顺 一种嵌合抗原受体分子及其应用
WO2018076391A1 (zh) * 2016-10-26 2018-05-03 李华顺 一种pd-1 car nk-92细胞及其制备方法与应用
US11331345B2 (en) 2016-10-26 2022-05-17 Asclepius (Suzhou) Technology Company Group Co., Ltd. PD-1 CAR NK-92 cell and preparation method and use thereof
US11590167B2 (en) 2016-12-03 2023-02-28 Juno Therapeutic, Inc. Methods and compositions for use of therapeutic T cells in combination with kinase inhibitors
WO2018108106A1 (zh) * 2016-12-13 2018-06-21 科济生物医药（上海）有限公司 抗cd19的人源化抗体以及靶向cd19的免疫效应细胞
US11427633B2 (en) 2016-12-13 2022-08-30 Crage Medical Co., Limited Anti-CD19 humanized antibody and immune effector cell targeting cd 19
CN108610420B (zh) * 2016-12-13 2023-09-26 科济生物医药（上海）有限公司 抗cd19的人源化抗体以及靶向cd19的免疫效应细胞
CN108610420A (zh) * 2016-12-13 2018-10-02 科济生物医药（上海）有限公司 抗cd19的人源化抗体以及靶向cd19的免疫效应细胞
WO2018121604A1 (zh) 2016-12-29 2018-07-05 天津天锐生物科技有限公司 一种多靶点嵌合抗原受体
CN110248677A (zh) * 2017-01-05 2019-09-17 上海斯丹赛生物技术有限公司 人源化抗cd19抗体及其与嵌合抗原受体的用途
CN107058390A (zh) * 2017-01-17 2017-08-18 上海交通大学医学院附属第九人民医院 一种慢病毒载体、重组慢病毒质粒、病毒及病毒的应用
CN108728459B (zh) * 2017-04-24 2023-08-04 上海恒润达生生物科技股份有限公司 靶向cd19的嵌合抗原受体并联合表达il-15的方法和用途
CN108728459A (zh) * 2017-04-24 2018-11-02 上海恒润达生生物科技有限公司 靶向cd19的嵌合抗原受体并联合表达il-15的方法和用途
WO2018218710A1 (zh) * 2017-06-02 2018-12-06 阿思科力(苏州)生物科技有限公司 一种以robo1为靶点的嵌合抗原受体细胞及其制备和应用
US11697685B2 (en) 2017-06-02 2023-07-11 Asclepius (Suzhou) Technology Company Group Co., Ltd. Chimeric antigen receptor cells targeting ROBO1, preparation method and use thereof
CN107383196B (zh) * 2017-08-30 2019-12-17 广州百暨基因科技有限公司 人源化抗cd19的抗原结合片段
CN107383196A (zh) * 2017-08-30 2017-11-24 广州百暨基因科技有限公司 人源化抗cd19的抗原结合片段
CN111373261A (zh) * 2017-11-20 2020-07-03 尤利乌斯·马克西米利安维尔茨堡大学 Cd19 cart细胞可清除表达极低水平cd19的骨髓瘤细胞
CN109836493A (zh) * 2017-11-25 2019-06-04 深圳宾德生物技术有限公司 一种靶向cd19的单链抗体、嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用
CN107880128A (zh) * 2017-12-21 2018-04-06 常州费洛斯药业科技有限公司 一种抗cd19的全人源抗体或抗体片段及其方法和应用
CN107880128B (zh) * 2017-12-21 2021-03-02 常州费洛斯药业科技有限公司 一种抗cd19的全人源抗体或抗体片段及其方法和应用
CN111683971A (zh) * 2017-12-23 2020-09-18 宇越生医科技股份有限公司 医药重组受体组成物及方法
CN111801421B (zh) * 2018-01-12 2024-12-20 酷罗赛尔公司 使用双重shrna的增强的免疫细胞及包含免疫细胞的组合物
CN111801421A (zh) * 2018-01-12 2020-10-20 酷罗赛尔公司 使用双重shrna的增强的免疫细胞及包含免疫细胞的组合物
CN111094358A (zh) * 2018-02-11 2020-05-01 江苏恒瑞医药股份有限公司 一种分离的嵌合抗原受体以及包含其的修饰t细胞及用途
WO2019154313A1 (zh) * 2018-02-11 2019-08-15 江苏恒瑞医药股份有限公司 一种分离的嵌合抗原受体以及包含其的修饰t细胞及用途
CN112512537A (zh) * 2018-06-01 2021-03-16 凯德药业股份有限公司 嵌合抗原受体t细胞疗法
CN110819679A (zh) * 2018-08-07 2020-02-21 上海恒润达生生物科技有限公司 一种评估cart细胞体内代谢的方法
CN113039209A (zh) * 2018-08-30 2021-06-25 T细胞受体治疗公司 用于使用融合蛋白进行tcr重编程的组合物和方法
CN113710253A (zh) * 2019-02-04 2021-11-26 普洛迈博生物技术公司 编码嵌合抗原受体和il-6或检查点抑制剂的短发夹rna序列的核酸序列
CN112390891B (zh) * 2019-08-14 2022-06-03 苏州方德门达新药开发有限公司 嵌合抗原受体及其构建方法和应用
CN112390891A (zh) * 2019-08-14 2021-02-23 苏州方德门达新药开发有限公司 嵌合抗原受体及其构建方法和应用
CN113045676A (zh) * 2020-04-07 2021-06-29 北京荣瑷医学生物科技有限责任公司 一种抗cd19蛋白分子的抗体及其应用
WO2022111562A1 (zh) * 2020-11-26 2022-06-02 上海医药集团生物治疗技术有限公司 一种经修饰的免疫细胞及其应用
CN113549600A (zh) * 2021-06-30 2021-10-26 徐州医科大学 一种具有CD19的特异性抗性的CAR-iNKT细胞
WO2023208157A1 (zh) * 2022-04-29 2023-11-02 上海先博生物科技有限公司 靶向cd19的嵌合抗原受体及其应用
WO2024086191A3 (en) * 2022-10-18 2024-05-30 Kite Pharma, Inc. Car-t constructs comprising a novel cd19 binder combined with il18 and methods of using the same
CN116063575A (zh) * 2022-11-15 2023-05-05 北京瑜阳科技有限公司 一种嵌合抗原受体（car）以及在治疗肿瘤中的应用

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Publication number Publication date
MX2015013194A (es) 2016-04-20
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TW201512222A (zh) 2015-04-01
RU2711975C2 (ru) 2020-01-23
AU2014236098A8 (en) 2019-08-29
WO2014153270A1 (en) 2014-09-25
JP2016514462A (ja) 2016-05-23
AU2019216689C1 (en) 2022-04-14
HUE058832T2 (hu) 2022-09-28
KR102293062B1 (ko) 2021-08-24
CA2907100A1 (en) 2014-09-25
AU2014236098B8 (en) 2019-08-29
SG11201506603PA (en) 2015-09-29
SG10201806293WA (en) 2018-08-30
IL241261A0 (en) 2015-11-30
RU2015144332A (ru) 2017-04-27
LT3539986T (lt) 2022-06-27
EP2970482A1 (en) 2016-01-20
HK1218922A1 (zh) 2017-03-17
PT3539986T (pt) 2022-06-02
KR20150132850A (ko) 2015-11-26
SI3539986T1 (sl) 2022-10-28
MX2020007021A (es) 2020-09-07
DK3539986T3 (da) 2022-06-20
HUE042803T2 (hu) 2019-07-29
HRP20220767T1 (hr) 2022-10-14
PL3539986T3 (pl) 2022-08-22
RU2020100865A (ru) 2020-02-18
US20190135940A1 (en) 2019-05-09
DK2970482T3 (en) 2019-04-23
AU2014236098B2 (en) 2019-05-16
LT2970482T (lt) 2019-05-27
AU2014236098A1 (en) 2015-09-17
MY187624A (en) 2021-10-05
TWI654206B (zh) 2019-03-21
JP7439002B2 (ja) 2024-02-27
AU2019216689A1 (en) 2019-09-05
US20140271635A1 (en) 2014-09-18
JP2019106995A (ja) 2019-07-04
PL2970482T3 (pl) 2019-09-30
JP7187327B2 (ja) 2022-12-12
ES2923397T3 (es) 2022-09-27
JP6466401B2 (ja) 2019-02-06

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US20210347851A1 (en) Cd19 chimeric antigen receptor (car) and cd22 car combination therapies
US20220047633A1 (en) Cd22 chimeric antigen receptor (car) therapies
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