CN113045676A - 一种抗cd19蛋白分子的抗体及其应用 - Google Patents
一种抗cd19蛋白分子的抗体及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种抗CD19蛋白分子的抗体及其应用，属于免疫技术领域。所述抗CD19蛋白分子的抗体，包括重链可变区，所述重链可变区的核苷酸序列如SEQ I D NO.1所示，氨基酸序列如SEQ I D NO.2所示。本发明还公开了一种嵌合抗原受体、一种融合蛋白和一种载体。本发明的抗CD19蛋白分子的抗体,为来源于羊驼的小分子量抗体，采用靶向于CD19分子的纳米抗体作为受体的特异性识别结构组分，能够特异性地识别、杀伤以CD19分子作为标志物的细胞，治疗CD19+为标志的疾病。
Description
技术领域
本发明涉及一种抗CD19蛋白分子的抗体及其应用，属于免疫技术领域。
背景技术
近些年来，免疫学领域中对于转化医学的研究越来越多，尤其是肿瘤免疫。肿瘤免疫治疗中应用比较广泛的是CAR-T细胞免疫治疗策略。在90年代早期，这种免疫治疗策略在转化医学中就获得了好的效果。CAR-T细胞经历了一代、二代到三代的转变。通过这种技术和设计上的革新，逐步对治疗过程中细胞毒作用的活化、杀伤信号的持久进行优化。靶向于CD19分子的CAR-T细胞应用较为广泛，尤其是治疗B淋巴细胞瘤等血液肿瘤。正常机体内的T细胞被有效刺激并发挥免疫学功能需要多重信号的调控，主要包括T细胞受体(TCR)与MHC-抗原肽复合物的识别作为第一信号、T细胞表面的共刺激分子识别活化作为第二信号，甚至还需要细胞因子参与形成第三信号。这种嵌合抗原受体主要是将T细胞刺激和活化的过程所需的蛋白分子进行人工的串联整合，从而促进T细胞的活化和特异性杀伤。CAR-T细胞的特异性杀伤主要是前端的抗体分子部分的识别和结合。目前使用较为广泛的是基于人或其它种属的单克隆抗体单链可变区(Single chain Fv,ScFv)对靶蛋白的特异性识别。但存在如下缺陷：在ScFv与纳米抗体亲和力相当的基础上，ScFv相对于纳米抗体来讲分子量较大，在分子表达和功能发挥上存在一定的限制。纳米抗体是天然存在的最小的抗体片段。ScFv由其亲本单克隆抗体衍生而来，在活性和稳定性等方面可能存在着一定的不足。
鉴于此，有必要提供一种抗CD19蛋白分子的抗体，用于构建新的嵌合抗原受体和/或融合蛋白，以解决现有技术的不足。
发明内容
本发明的目的之一，是提供一种抗CD19蛋白分子的抗体。本发明的抗CD19蛋白分子的抗体,为来源于羊驼的小分子量抗体，采用靶向于CD19分子的纳米抗体作为受体的特异性识别结构组分，能够特异性地识别和杀伤表达CD19的细胞，如B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、多毛细胞白血病、急性髓性白血病和因浆细胞表达大量自身抗体引起的适应证如红斑狼疮、风湿性关节炎、自身免疫性紫癜等适应证中的CD19+细胞，抑制、治疗以CD19分子作为标志物的疾病。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种抗CD19蛋白分子的抗体，来源于羊驼，包括重链可变区，所述重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的抗CD19蛋白分子的抗体的原理是：
本发明采用CD19单链抗体作为受体的特异性识别结构组分。该CD19单链抗体来源于羊驼，是羊驼天然存在的一种缺失轻链的抗体分子。该抗体只包含一个重链可变区(Variable domain of heavy chain of heavy chain antibody,VHH)和两个常规的CH2和CH3区，单独克隆并表达出来的重链可变区(VHH)结构与其完整的重链抗体相比，在抗体结构稳定性以及与抗原的结合活性中都是相当的，是目前已知的具有最小蛋白分子量的抗体结构，故称这段重链可变区(VHH)结构为纳米抗体(nanobody，Nb)。相较于现有技术的单克隆抗体单链可变区(Single chain Fv,ScFv)，该CD19单链抗体的重链可变区具有结构更小的优点，在嵌合抗原受体的表达和对T细胞的修饰中均具有优势。
本发明的抗CD19蛋白分子的抗体的有益效果是：
本发明的抗CD19蛋白分子的抗体,为来源于羊驼的小分子量抗体，采用靶向于CD19分子的纳米抗体作为受体的特异性识别结构组分，能够特异性地识别、杀伤表达CD19分子的细胞，治疗以CD19分子作为标志物的疾病，如B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、多毛细胞白血病、急性髓性白血病和因浆细胞表达大量自身抗体引起的适应证如红斑狼疮、风湿性关节炎、自身免疫性紫癜等适应证。
本发明的目的之二，是提供一种嵌合抗原受体。本发明的嵌合抗原受体，含抗人CD19蛋白分子的纳米抗体，靶向识别表达人CD19蛋白分子的细胞，可以引起被识别的靶细胞死亡，同时引起宿主细胞释放细胞因子等，表达该嵌合抗原受体的宿主细胞可以发挥抗肿瘤作用，或者抗自身免疫病作用。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种嵌合抗原受体，结构为：SP-VHH-HINGE-TM-CD-SD，其中SP为信号肽，或称之为前导肽，VHH为权利要求1所述的抗CD19蛋白分子的抗体，是抗原结合结构域，HINGE为铰链区，TM为跨膜区，CD为共刺激区，SD为信号转导区，“－”为连接肽或肽键。
本发明的嵌合抗原受体的有益效果是：
1、本发明的嵌合抗原受体，含抗人CD19蛋白分子的纳米抗体，靶向识别表达人CD19蛋白分子的细胞，可以引起被识别的靶细胞死亡，同时引起宿主细胞释放细胞因子等，表达该嵌合抗原受体的宿主细胞可以发挥抗肿瘤作用，或者抗自身免疫病作用。
2、本发明的嵌合抗原受体，可以用于检测表达人CD19蛋白分子的细胞或其它生物组织或细胞，如噬菌体、病毒和细菌等；还可以用于识别和检测游离的人CD19蛋白分子。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，所述SP选自CD8α、GM-CSFR和Igκ的信号肽中的任意一种，其中，所述CD8α信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述GM-CSFR信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述Igκ信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
采用上述进一步的有益效果是：信号肽可以介导CAR蛋白表达后向细胞膜外进行定位分布。
进一步，所述HINGE选自CD8α铰链区，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。。
采用上述进一步的有益效果是：CD8α链铰链区可以促进CAR结构胞外段的稳定，并促进胞外段CAR结构形成二聚体。
进一步，所述TM选自CD8α或者CD28的跨膜区，其中，所述CD8α跨膜区的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示；所述CD28跨膜区的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示。
采用上述进一步的有益效果是：CD8α链跨膜区可以促进CAR结构定位在细胞膜上。
进一步，所述CD选自CD28和/或4-1BB的共刺激区，其中，所述CD28的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示；所述4-1BB的核苷酸序列如SEQ IDNO.17所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示。
采用上述进一步的有益效果是：CD28分子共刺激区可以作为共刺激分子，对T细胞进行活化。4-1BB分子共刺激区可以作为共刺激分子，对T细胞进行活化。
进一步，所述SD为CD3ζ胞内信号转导区，其核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示。
采用上述进一步的有益效果是：CD3ζ胞内信号转导区可以传导T细胞活化信号至细胞内信号通路。
本发明的目的之三，是提供一种融合蛋白。本发明的融合蛋白，可以实现靶向识别抗原、发挥细胞毒作用的功能；可以发挥特异性标记靶抗原的功能；也可以用于检测表达人CD19蛋白分子的细胞或其它生物组织或细胞，如噬菌体、病毒和细菌等；还可以用于识别和检测游离的人CD19蛋白分子。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种融合蛋白，含有上述的抗CD19蛋白分子的抗体。
本发明的融合蛋白的有益效果是：
本发明的融合蛋白，可以实现靶向识别抗原、发挥细胞毒作用的功能；可以发挥特异性标记靶抗原的功能；也可以用于检测表达人CD19蛋白分子的细胞或其它生物组织或细胞，如噬菌体、病毒和细菌等；还可以用于识别和检测游离的人CD19蛋白分子。
本发明的目的之四，是提供一种载体。本发明的载体，可以是一种质粒载体，可以携带上述抗CD19蛋白分子的抗体的核苷酸序列，或携带上述嵌合抗原受体，或携带上述融合蛋白的核苷酸序列。本发明的载体，可以单独表达上述抗CD19蛋白分子的抗体的核苷酸序列、上述嵌合抗原受体和上述融合蛋白的核苷酸序列中的任意一种，也可以与相关辅助质粒共同表达，合成一种病毒载体，这种病毒载体后续可以转染宿主细胞，将上述抗CD19蛋白分子的抗体的核苷酸序列，或所述嵌合抗原受体，或所述融合蛋白的核苷酸序列转入宿主细胞，可以在宿主细胞中瞬时表达上述抗CD19蛋白分子的抗体、上述嵌合抗原受体或上述的融合蛋白，也可以将上述核苷酸序列整合进宿主细胞染色体中，然后表达上述抗CD19蛋白分子的抗体、上述嵌合抗原受体或上述融合蛋白。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种载体，含有上述的抗CD19蛋白分子的抗体的核苷酸序列、上述的嵌合抗原受体和上述的融合蛋白的核苷酸序列中的任意一种。
本发明的载体的有益效果是：
1、本发明的载体，能够较稳定的储存、复制、扩增上述抗体、嵌合抗原受体或融合蛋白的核苷酸序列，更方便的将上述上述抗体、嵌合抗原受体或融合蛋白的核苷酸转入宿主细胞，更高效地表达上述抗体、嵌合抗原受体或融合蛋白。
2、本发明的载体，携带了一种含有较小分子量纳米抗体的核苷酸序列，可以较稳定的储存、复制、扩增，也可以更高效的转导进入宿主细胞并表达上述含有上述纳米抗体，该纳米抗体具有优于传统抗体的稳定性。
本发明的目的之五，是提供一种宿主细胞。本发明的宿主细胞，属于免疫细胞或能够分化成免疫细胞的干细胞、祖细胞。本发明的宿主细胞的一类免疫细胞，包括T细胞、NK细胞、NKT细胞、单核巨噬细胞、树突状细胞，其特征是具有杀伤或吞噬功能、免疫调节功能和释放细胞因子的功能。本发明的宿主细胞中的T细胞，包含αβT细胞、γδT细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、调节性T细胞、杀伤性T细胞等各种亚型。本发明的宿主细胞的另一类是干细胞，其中可以是诱导多能干细胞或造血干细胞，所述干细胞能够分化成上述免疫细胞中的一种或多种。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种宿主细胞，含有上述的抗CD19蛋白分子的抗体的核苷酸序列、上述的嵌合抗原受体、上述的融合蛋白的核苷酸序列和上述的载体中的任意一种，或者染色体中整合有外源的上述的抗CD19蛋白分子的抗体的核苷酸序列、上述的嵌合抗原受体和上述的融合蛋白的核苷酸序列中的任意一种。
本发明的宿主细胞的有益效果是：
1、本发明的宿主细胞，通过表达上述抗CD19蛋白分子的抗体、上述的嵌合抗原受体、上述的融合蛋白，起到靶向CD19分子，发挥识别、杀伤CD19+细胞的作用，同时结合了抗CD19蛋白分子的抗体的靶向性和宿主细胞的杀伤、调节和分泌细胞因子的功能。
2、本发明的宿主细胞，能够靶向识别、杀伤CD19+细胞、发挥抗肿瘤或清除细胞的作用。
附图说明
图1为本发明的A23纳米抗体VHH区与CD19胞外段蛋白的亲和力检测。
图2为本发明的包含A23纳米抗体VHH区的嵌合抗原受体在293T中的表达情况和结合CD19蛋白分子的情况。其中，A图为293T细胞经慢病毒感染后不使用CD19抗原进行免疫荧光染色；B图为293T细胞经慢病毒感染后采用抗VHH的F(ab)2抗体染色，可以看到293T细胞表达A23嵌合抗原受体；C图为293T细胞经慢病毒感染后采用CD19蛋白检测，表明293T细胞表达的A23嵌合抗原受体能够靶向识别CD19蛋白。
图3为本发明的实施例中，流式细胞术检测CAR-T细胞表达嵌合抗原受体的情况。其中，A图为T细胞未经携带本发明所述嵌合抗原受体基因的慢病毒感染，不能检测到T细胞结合CD19抗原；B图为T细胞经携带本发明所述嵌合抗原受体基因的慢病毒原液300μL感染，能检测到T细胞结合CD19抗原，能结合CD19抗原的CAR-T细胞阳性约为75.2％；C图为T细胞经携带本发明所述嵌合抗原受体基因的慢病毒原液300μL感染，能检测到T细胞结合CD19抗原，能结合CD19抗原的CAR-T细胞阳性约为80.9％，D图为T细胞经携带本发明所述嵌合抗原受体基因的慢病毒原液300μL感染，能检测到T细胞结合CD19抗原，能结合CD19抗原的CAR-T细胞阳性约为79.7％。
图4为本发明的实施例中，检测CD19-K562刺激CAR-T细胞活化产生TNFα细胞因子的情况。图中，Effector cell指效应细胞；PMA/iono指佛波酯和离子霉素；TNFα指肿瘤坏死因子α。
图5为本发明的实施例中，检测CD19-K562刺激CAR-T细胞活化产生IFNγ细胞因子的情况。图中，Effector cell指效应细胞；PMA/iono指佛波酯和离子霉素；IFNγ指干扰素γ。
图6为本发明的实施例中，检测CAR-T细胞对CD19-K562靶细胞的杀伤情况。图中，E：T ratio，指效靶比；％Cytotoxicity，指细胞毒效应百分数。
具体实施方式
以下结合具体附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
CAR-T Cell Immunotherapy，全称是Chimeric Antigen Receptor T-CellImmunotherapy，嵌合抗原受体T细胞免疫疗法。
CAR，全称是Chimeric Antigen Receptor，嵌合抗原受体。
实施例1：靶向于CD19分子的纳米抗体的制备
步骤1：经真核表达系统在293T细胞中表达CD19蛋白胞外段，并在C末端加入His标签，使用镍柱纯化蛋白，经分子筛纯化蛋白后检测蛋白浓度，分装，于-80℃保存。
步骤2：将纯化后的CD19分子作为抗原免疫羊驼，经过四次抗原的免疫，每次间隔20天，检测羊驼外周血血清的抗体效价。
步骤3：采集羊驼外周血并提取外周血单个核细胞(PBMC)，提取RNA，反转录，PCR扩增重链可变区，连接载体后构建文库。
步骤4：通过噬菌体展示，采用间接ELISA筛选阳性克隆(OD值大于1)，筛选能够结合抗原的抗体克隆序列。
步骤5：测序确认靶向于CD19分子的纳米抗体的重链可变区序列。
实施例2：靶向于CD19分子的纳米抗体的亲和力分析
步骤1：将实施例1得到的靶向于CD19分子的纳米抗体的重链可变区序列克隆至人型支原体(MH)抗体表达载体中，并在C末端加入His标签。载体转染293T细胞以在真核细胞中进行抗体的表达，通过镍柱纯化抗体蛋白，经分子筛纯化蛋白后检测蛋白浓度，于4℃保存。
步骤2：使用Biacore T200设备(购自GE Healthcare)进行抗原抗体结合亲和力(动力学)分析，采用CM5芯片氨基偶联CD19蛋白分子，同时使用不同浓度的抗体蛋白循环结合已偶联的抗原蛋白，分析结合动力学曲线并计算亲和力。
步骤3：通过亲和力验证，筛选出KD值达到10-8M的抗体克隆，命名为A23纳米抗体。
实施例3：抗CD19蛋白分子的抗体质粒载体的构建
步骤1：将实施例2得到的A23纳米抗体序列通过PCR扩增后，与基因合成的嵌合抗原受体其它结构组分序列通过重叠PCR方法进行拼接构建。完整的抗CD19蛋白分子的抗体，包括依次连接的靶向于CD19分子的纳米抗体重链可变区、CD8α链铰链区、CD8α链跨膜区、CD28分子胞内段、4-1BB分子胞内段和CD3ζ链。
步骤2：将构建好的DNA片段插入至PLVX慢病毒表达载体(本载体经过改造，原载体为PLVX-IRES-ZsGreen1，将CMV启动子替换为PGK启动子，并去除了IRES-ZsGreen1结构)中，并经过测序验证质粒构建的准确性，即得到抗CD19蛋白分子的抗体慢病毒表达质粒载体。
实施例4：慢病毒的包装与制备
步骤1：慢病毒包装在293T细胞中进行，所需质粒包括PLVX-A23-28BBz、dR8.74和MD2.G。采用聚乙烯亚胺(Polyethylenimine，PEI)转染试剂进行转染，具体方法详见聚乙烯亚胺转染试剂说明书。该聚乙烯亚胺转染试剂可以市售购买，如可以购自Sigma，货号为408727。
步骤2：传代293T细胞至新的10cm培养皿中，接种密度在70％-80％；
步骤3：传代后12h进行转染，按照质量比PLVX-A23-28BBz：dR8.74：MD2.G＝6:5:1，按照质量体积比为质粒：聚乙烯亚胺＝1μg:2.5μL，质粒按比例混合于无血清无抗生素的DMEM基础培养基中，聚乙烯亚胺同样按比例进行配制，室温静置5min，将质粒混悬液与聚乙烯亚胺混悬液等体积混合后，室温静置20min，将转染混悬液小心加入至293T细胞培养上清中，每皿加入1mL。
步骤4：转染后12h进行全量换液，更换完全DMEM培养基后继续培养。
步骤5：总转染时间为36h后收集培养上清，2600g离心10min，转移上清至新的离心管并保存。
实施例5：293T细胞表达抗CD19分子的嵌合抗原受体及其对CD19蛋白分子的识别
步骤1：293T细胞贴壁培养，80％融合度。
步骤2：取慢病毒原液500μL，加入终浓度为6μg/mL的聚凝胺(polybrene)，充分混匀，加入至10cm培养皿中。
步骤3：细胞置于培养箱正常培养，慢病毒感染6h后，置换为新鲜的完全培养基，并继续培养24-48h。
步骤4：转导后的293T细胞消化收获，收集细胞，分三管，每管1×106细胞并使用PBS洗涤，300g离心3min。
步骤5：弃上清，500μL的PBS重悬细胞，三管细胞分别：1)不加入抗体、2)按体积比1:500剂量加入生物素山羊抗羊驼抗体(Biotin-Goat Anti-Alpaca IgG),特异性识别重链可变区(VHH区)抗体(购自美国Jackson Immuno公司)，3)加入PE荧光标记的CD19蛋白，振荡混匀，室温孵育20min。
步骤6：加入3mL PBS洗涤细胞，振荡混匀，300g离心3min。重复两次。
步骤7：弃上清，300μL的PBS重悬细胞，2)管细胞加入1μg的PE标记的链霉亲和素(PE-Streptavidin)抗体(购自BD公司,Becton,Dickinson and Company)，振荡混匀，室温孵育20min。
步骤8：加入3mL的PBS洗涤细胞，振荡混匀，300g离心3min。
步骤7：弃上清，300μL的PBS重悬细胞，振荡混匀，上机检测。
流式细胞术检测所得结果说明，除了通过特异性识别重链可变区(VHH区)抗体能够检测到抗CD19嵌合抗原受体表达于293T细胞表面，还能通过人CD19蛋白特异性检测到抗CD19嵌合抗原受体表达于293T细胞表面，表明表达于293T细胞表面的抗CD19嵌合抗原受体能够特异性识别人CD19蛋白。
实施例6：PBMC(外周血单个核细胞)的分离与培养
步骤1：取50mL健康人的外周血样本，使用等体积的PBS稀释样本。
步骤2：准备新的离心管并加入等体积的淋巴细胞分离液，巴斯德管小心吸取稀释后的样本加入至分离液上层。
步骤3：600g室温离心20min，离心机转动采用缓升缓降模式。
步骤4：巴斯德管小心吸取中间层的白膜层细胞至新的离心管中。
步骤5：加入3-5倍体积的PBS稀释白膜层细胞进行洗涤，充分混匀，300g离心10min。
步骤6：弃上清，小体积PBS重悬细胞沉淀，加入40mL PBS再次进行洗涤，充分混匀，300g离心5min。
步骤7：弃上清，使用T细胞无血清培养基(ImmunoCult-XF T cell Exp Medium,STEM CELL)重悬细胞进行培养，并加入终浓度为1000IU/mL的IL2、50ng/mL的CD3激活抗体和50ng/mL的CD28激活抗体，激活培养48h。
步骤8：收集细胞悬液，300g离心3min，弃上清，更换新鲜的培养基，并加入终浓度为1000IU/mL的IL2，继续培养。
实施例7：CAR-T细胞的转导制备
步骤1：取培养7天的T细胞进行转导实验，计数收集1.2×107细胞，使用T细胞完全培养基重悬细胞并接种于24孔板中，每孔500μL细胞悬液，每孔5×105细胞。
步骤2：取包装好的慢病毒悬液12mL，加入终浓度为5μg/mL的聚凝胺(polybrene)，充分混匀，加入至24孔板中，每孔加入0、300、600、900μL病毒原液。
步骤3：细胞置于培养箱正常培养，慢病毒感染12h后将所有细胞重悬离心后全量换液，置换为新鲜的完全培养基，并继续培养。
步骤4：可以按照步骤3继续进行第二次感染，并继续培养。
实施例8：CAR-T细胞CAR结构表达的阳性率检测
步骤1：转导后的T细胞培养4-6天进行CAR表达情况的阳性率检测，使用流式细胞术进行检测。
步骤2：收集1×106细胞并使用PBS洗涤，300g离心3min。
步骤3：弃上清，500μL的PBS重悬细胞，按体积比1:500剂量加入生物素山羊抗羊驼抗体(Biotin-Goat Anti-Alpaca IgG),特异性识别重链可变区(VHH区)抗体(购自美国Jackson Immuno公司)，或一个检测用量的CD19-PE直接标记，振荡混匀，室温孵育30min。
步骤4：加入1mL PBS洗涤细胞，振荡混匀，300g离心3min。
步骤5：弃上清，100μL的PBS重悬细胞，加入1test剂量的anti-CD3-APC-Cy7抗体(购自BD公司,Becton,Dickinson and Company)，同时加入1μg的PE标记的链霉亲和素(PE-Streptavidin)抗体(购自BD公司,Becton,Dickinson and Company)，振荡混匀，室温孵育30min。
步骤6：加入1mL的PBS洗涤细胞，振荡混匀，300g离心3min。
步骤7：弃上清，300μL的PBS重悬细胞，振荡混匀，上机检测。
实施例9：CAR-T细胞活化功能检测
步骤1：使用未转导的T细胞作为对照，检测CAR-T与CD19-K562(K562细胞系稳定表达CD19分子)靶细胞共孵育后细胞因子的释放。
步骤2：收集培养中的CAR T细胞，通过细胞计数得到活化实验所需细胞进行离心收集。
步骤3：同样的，收集CD19-K562细胞，得到所需数量细胞。
步骤4：按照表1的方案进行细胞接种，细胞接种于V型底的96孔板中，
表1细胞接种方案
注：表中，E指effector cells，效应细胞；T指target cells，靶细胞；Effectorcell only指只有效应细胞。PMA/iono指佛波酯和离子霉素。每组同时实验两个副孔。
步骤5：细胞置于培养箱中正常培养孵育24h。
步骤6：小心吸取细胞上清至新的EP管中，使用ELISA方法检测细胞培养上清中的TNF-α和IFN-γ的表达水平，ELISA检测使用博士德生物产品试剂盒，具体操作按照说明书进行。
实施例10：CAR-T细胞体外杀伤活性检测
步骤1：使用未转导的T细胞作为对照，检测CAR-T与CD19-K562(K562细胞系稳定表达CD19分子)靶细胞共孵育后对靶细胞的细胞毒作用。
步骤2：采用
EuTDA Cytotoxicity Reagents试剂盒(购自美国PerkinElmer公司)进行实验，按照试剂盒操作说明预标记CD19-K562靶细胞，并使用T细胞培养基接种于V底的96孔板中，每孔5000个细胞，同时设置自发释放孔和最大释放孔；
步骤3：将收集好的效应细胞按照比例接种至孔板中，按照E：T为1:1、5:1、10:1、30:1、60:1的梯度进行接种，每孔培养基体积为200μL。
步骤4：将细胞置于37℃培养箱正常培养2h后，使用Lysis buffer裂解最大释放孔中的靶细胞。
步骤5：继续孵育2h后，即共孵育4h后，按照说明书操作规范，将V型孔板置于平板离心机上进行离心，500g离心5min。
步骤6：每孔小心吸取20μL上清至荧光测定专用96孔板(白板)中，每孔加入200μLEu-Solution，摇床振荡避光室温孵育15min。
步骤7：采用时间分辨荧光(time-resolved fluorescence)检测每孔的荧光信号。
步骤8：按下列公式，计算细胞杀伤百分数。
结论：
本发明采用自主筛选的纳米抗体替换传统的scFv作为主要策略，设计建立的嵌合抗原受体具有独特性。我们成功筛选到了能够靶向于CD19蛋白的纳米抗体克隆，并验证了纳米抗体A23克隆的重链可变区可以很好的与CD19结合，具有较好的亲和力(图1)。实验设置了纳米抗体的5种不同浓度梯度，分别为2nM、4nM、8nM、16nM、32nM，经过曲线拟合报告出纳米抗体A23克隆蛋白与CD19胞外段蛋白的亲和力KD(M)值为6.61E-08M。
我们成功构建了靶向于CD19分子的纳米抗体重链可变区来源的嵌合抗原受体结构慢病毒表达载体，即A23-28BBz。我们成功制备了用于嵌合抗原受体转导的慢病毒，利用该慢病毒，我们成功感染了293T细胞，并检测到CAR-293T细胞能够特异性结合人CD19抗原(图2C)，而且通过间接法能够检测到293T细胞表达含有VHH结构的蛋白(图2B)。同时通过该慢病毒感染T细胞，并经扩增得到CAR-T细胞。通过实验验证制备的CAR-T细胞能够很好的表达所设计的嵌合抗原受体结构(图3B、C、D),而且给予300μL、600μL、900μL慢病毒原液使T细胞感染和表达接近饱和状态。
通过细胞活化功能实验验证了我们制备的CAR-T细胞受到特异性靶细胞刺激后能够进行有效的活化，分泌相应的细胞因子(图4和图5)。
通过细胞毒实验验证了我们制备的CAR-T细胞能够特异性的对靶细胞进行杀伤(图6)。CAR-T细胞功能检测过程中加入了geneBank中已提交的anti-CD19 scFv构建的嵌合抗原受体结构作为对比。通过以上实验能够证实我们设计的嵌合抗原受体结构以及CAR-T细胞在体外能够很好的发挥对靶细胞的杀伤作用。我们设计的纳米抗体来源的嵌合抗原受体具有一定的有效性和独特性。因此本发明所述优选例之一的嵌合抗原受体A23-CD8α-CD28-41BB-CD3ζ可在肿瘤(比如B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、多毛细胞白血病、急性髓性白血病和因浆细胞表达大量自身抗体引起的适应证如红斑狼疮、风湿性关节炎、自身免疫性紫癜等)治疗中得到一定的应用。
本发明所述的用于构建嵌合抗原受体的质粒载体、慢病毒载体，不限于本发明所列举的实例中使用的载体，如质粒载体除了pLVX系列载体外还可以是pCDH系列载体及其它适合克隆、表达蛋白质、包装病毒的载体。所述病毒载体不限于慢病毒载体，也可以是其它逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、溶瘤病毒类的其它病毒载体等及其相适应的质粒载体。
基于本发明所述抗CD19蛋白分子的抗体，除了构建所述嵌合抗原受体外，所述抗CD19蛋白分子的抗体的核苷酸和/或氨基酸序列可以作为目的序列的一部分，还可以构建其它融合蛋白，包含但不限于双特异性抗体、连接/融合IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4重链恒定区、其它受体分子融合蛋白等。
基于本发明所述抗人CD19蛋白分子的纳米抗体，所述抗人CD19蛋白分子的纳米抗体的核苷酸和/或氨基酸序列可以作为目的序列的一部分，除了用于研究、制备和生产CAR-T细胞，还可以用于研究、制备和生产CAR-γδT细胞、CAR-NK细胞、CAR-NKT细胞、CAR-Mo/Mφ细胞，以及作为诱导多能干细胞(iPS)及其诱导细胞(如由iPS诱导来源的T细胞、NK细胞、NKT细胞、Mo或Mφ细胞)的修饰分子。
本发明所述抗人CD19蛋白分子的纳米抗体除了可以应用于肿瘤免疫治疗领域还可以用于检测，作为人CD19蛋白分子检测试剂或试剂盒的一部分。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 北京荣瑷医学生物科技有限责任公司
<120> 一种抗CD19蛋白分子的抗体及其应用
<150> 202010265380.7
<151> 2020-04-07
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cagttgcagc tcgtggagtc tgggggagga gcagcgcaga ctgggggctc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggagg cgacagcaat atcaatatca tgggctggaa ccgccaggtt 120
ccggggaagc agcgcgagtt ggtcgcagct attactagtg atggtaacag taattatgga 180
ggctccgcga agggccgatt caccatctcc agagacaacg ccaagaacac ggtgtatctg 240
caaatgaaca gcctgaaacc tgaggacacg gccgtctatt attgtactgt gtggacctat 300
agtggtaaat acgaaggcca ggggacccag gtcaccgtct cctcagaacc caagacacca 360
aaaccacaag ac 372
<210> 2
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ala Ala Gln Thr Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Asp Ser Asn Ile Asn
20 25 30
Ile Met Gly Trp Asn Arg Gln Val Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Thr Ser Asp Gly Asn Ser Asn Tyr Gly Gly Ser Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Val Trp Thr Tyr Ser Gly Lys Tyr Glu Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Asp
115 120
<210> 3
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccg 63
<210> 4
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 5
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atccca 66
<210> 6
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro
20
<210> 7
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atggagacag acacactcct gttatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60
<210> 8
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly
20
<210> 9
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120
gacttcgcct gtgat 135
<210> 10
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 11
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60
accctttact gcaaccacag gaac 84
<210> 12
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
<210> 13
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60
gcctttatta ttttctgggt g 81
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60
gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120
tcc 123
<210> 16
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
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<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
aaacggggca gaaagaagct cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120
gaactg 126
<210> 18
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
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<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
Claims (5)
1.一种抗CD19蛋白分子的抗体，其特征在于，来源于羊驼，包括重链可变区，所述重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种嵌合抗原受体，其特征在于，结构为：SP-VHH-HINGE-TM-CD-SD，其中SP为信号肽，VHH为权利要求1所述的抗CD19蛋白分子的抗体，是抗原结合结构域，HINGE为铰链区，TM为跨膜区，CD为共刺激区，SD为信号转导区，“－”为连接肽或肽键。
3.一种融合蛋白，其特征在于，含有权利要求1所述的抗CD19蛋白分子的抗体。
4.一种载体，其特征在于，含有如权利要求1所述的抗CD19蛋白分子的抗体的核苷酸序列、权利要求2所述的嵌合抗原受体和权利要求3所述的融合蛋白的核苷酸序列中的任意一种。
5.一种宿主细胞，其特征在于，含有如权利要求1所述的抗CD19蛋白分子的抗体的核苷酸序列、权利要求2所述的嵌合抗原受体、权利要求3所述的融合蛋白的核苷酸序列和权利要求4所述的载体中的任意一种，或者染色体中整合有外源的如权利要求1所述的抗CD19蛋白分子的抗体的核苷酸序列、权利要求2所述的嵌合抗原受体和权利要求3所述的融合蛋白的核苷酸序列中的任意一种。
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