CN106267409B - 艾滋病生物治疗反应器 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医学领域的艾滋病生物治疗反应器，其特征在于，以外源基因整合改变T细胞的基因结构而制备永生细胞系并以T细胞表面抗体为细胞生长激活剂人工产业制备能结合HIV和产生细胞因子的CD4+细胞，以高生物相容性材料包裹而制成既能防止细胞及其碎片甚至HIV滤出又能为CD4+细胞产生细胞因子及结合HIV提供场所的反应器，当体外分离的血浆流经反应器时HIV与CD4+细胞发生结合或进入胞内而被清除，同时产生的细胞因子随血浆经细胞间隙流出而回输体内，从而实现了既清除HIV又补充细胞因子的将HIV引出体外加以清除的人工CD4+T细胞替代疗法，比局限于体内杀灭HIV但难以实现的传统疗法更可行而无毒副作用。

Description

艾滋病生物治疗反应器

技术领域

本发明涉及生物医学领域中艾滋病生物治疗反应器，主要用于体外清除游离于艾滋病患者血细胞外的艾滋病毒，与此同时补充艾滋病患者体内所缺乏的CD4+T细胞因子，达到治疗艾滋病的目的。

背景技术

艾滋病是由人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)引起的传染病，在全球广泛流行，根据世界卫生组织(WHO)和联合国艾滋病规划署的有关报告，自1981年美国发现首例艾滋病病例以来，至今全球有208个国家和地区受到了艾滋病的严重威胁，约有4000万人感染了艾滋病，死亡人数已超过2000万，每天约有6000人成为艾滋病感染者，同时每天约有300多人死于艾滋病。在中国HIV感染者正处于高速增长期，目前已远超过100万。艾滋病已经成为继肿瘤、心脑血管疾病、结核病、糖尿病后又一个人类面临的重大感染性疾病，已成为全球关注的严重的公共卫生和社会问题。

HIV是感染人类免疫细胞的反转录病毒，直径约120纳米，大致呈球形，外膜是类脂包膜(来自宿主细胞)，并嵌有病毒的蛋白gp120与gp41，gp41是跨膜蛋白，gp120位于表面，并与gp41通过非共价作用结合，向内是由蛋白p17形成的球形基质(Matrix)，以及蛋白p24形成的半锥形衣壳(Capsid)，衣壳内含有病毒的RNA基因组、酶(逆转录酶、整合酶、蛋白酶)以及其他来自宿主细胞的成分。HIV进入人体后，首先被巨噬细胞吞噬，但HIV很快改变了巨噬细胞内某些部位的酸性环境，创造了适合其生存的条件，不但不被杀灭反而在其内繁殖。因为CD4是HIV的受体，所以经巨噬细胞内繁殖的HIV通过其囊膜蛋白gp120并在gp41的辅助下(gp41起着桥的作用，利用自身的疏水作用介导病毒囊膜与细胞膜融合)进入CD4+细胞(细胞、单核巨噬细胞、树突状细胞等)，在细胞内迅速增殖，每天产生10⁹～10¹⁰病毒颗粒，并不断进入其他正常的和再生的CD4+细胞内复制，制造更多的病毒感染细胞，使外周血CD4+T细胞持续破坏、减少。CD4+T细胞是最重要的免疫细胞，感染者一旦失去了大量CD4+T细胞，整个免疫系统就会遭到致命的打击，对各种疾病的感染都失去抵抗力；HIV进入宿主CD4+细胞后也可以表现为长期潜伏而不表现出临床症状，其基因组RNA反转录成双链DNA，与病毒整合酶进入宿主细胞核内，在整合酶的作用下，双链DNA整合到宿主细胞基因组内，被整合的病毒DNA称为前病毒，可潜伏数月甚至多年不复制，造成AIDS数月至多年的潜伏期。在AIDS的潜伏期，HIV主要在淋巴结的巨噬细胞和树突状细胞内繁殖，这些细胞是体内的HIV贮存库，可释放至外周血或转染外周血中的CD4+T细胞，有丝分裂原、抗原、TNF、IL-2和淋巴素(LT)都能激发HIV前病毒基因在感染的CD4+T细胞内转录复制。经大量增殖后，HIV病毒颗粒不断从被破坏的感染细胞释放并游离于血液，然后再进入其他细胞继续感染过程；HIV感染后可刺激机体生产囊膜蛋白(Gp120，Gp41)抗体和核心蛋白(P24)抗体。在HIV携带者、艾滋病病人血清中测出低水平的抗病毒中和抗体，其中艾滋病病人水平最低，HIV携带者最高，说明该抗体在体内有保护作用。但抗体不能与单核巨噬细胞内存留的病毒接触，且HIV囊膜蛋白易发生抗原性变异，原有抗体失去作用，使中和抗体不能发挥应有的作用。在潜伏感染阶段，HIV前病毒整合入宿主细胞基因组中，因此HIV不会被免疫系统所识别，所以仅依靠自身免疫功能无法将其清除。另外一个很重要的原因应该是，根据抗体杀灭、清除抗原的机理推测，免疫性抗体与抗原结合后，要产生免疫效应，要么通过激活补体，介导ADCC效应溶解细胞性抗原，但HIV不是细胞性抗原；要么通过趋化作用吸引吞噬细胞吞噬清除抗原，但HIV反而在吞噬细胞内被保护、增殖；要么抗体与抗原结合起中和作用，使失去感染力，但HIV无法被免疫系统杀灭、清除，终究要在抗体失去中和活性后又恢复感染力。

目前艾滋病治疗常用的抗病毒一线药物是逆转录酶抑制剂，该药不能杀灭HIV，存在个体差异、耐药性、腺粒体毒性、骨髓抑制、红细胞性贫血、粒细胞和血小板减少、胰腺炎、肝损伤等多种毒副作用，其他如HIV蛋白酶抑制剂、HIV整合酶抑制剂、细胞因子、疫苗治疗、基因治疗和单克隆抗体被动免疫疗法等，均因为各种原因而难以普遍应用。有文献报道利用T细胞表面CD3分子的单克隆抗体作为细胞生长的刺激剂，大量培养艾滋病患者分离的T细胞后，作为自身治疗性细胞回输，但HIV也随着HIV感染细胞的培养繁殖而在胞内增殖，增量T细胞的回输也导致了增量HIV的回输。

CD4+T细胞是T淋巴细胞的一种，平均寿命一般为7天左右，但某些T细胞特别是经永生化成细胞系(株)后可长期存活、无限扩增。国外文献报道，猴肾病毒40(SV40)可以使某些人类细胞发生永生化。Poulin DL、Kung AL和Sullivan CS等研究表明，SV40T抗原基因的导入能加快转化细胞的生长速率，永生化细胞在体外多次传代后，仍具有相对稳定的增殖特性和功能状态，同时也能保留其原始细胞的许多分化表型。Reilly用猿猴病毒大T抗原基因转化来建立血管平滑肌细胞株，构建细胞模型以研究肝素对血管平滑肌的抑制作用机制。Su等利用经SV40转化的角化上皮细胞株，构建细胞模型来分析上皮细胞内蛋白质合成的调控作用。Miquel等用SV40转化的角化上皮细胞株，作为细胞模型研究层粘连蛋白5介导的细胞粘附作用。Webber等用经SV40转化的前列腺上皮细胞株作为细胞模型来研究前列腺上皮细胞的生理功能和分泌功能。Racusen等用经Ad12-SV40转化肾小管上皮细胞模型来研究近曲小管的损伤和疾病。Hougton等用SV40转化建立骨髓基质细胞株作为细胞模型以研究在一定培养条件下，细胞具有向脂肪细胞和成骨细胞的双向分化的潜能，进一步研究骨质疏松的机制。国外研究还表明，导入外源性人端粒酶逆转录酶(hTERT)可以使细胞保持正常表型及分化特征。近年来已利用hTERT成功建立了某些细胞的永生化细胞系，基本保持染色体稳定、分化正常、接触抑制、无致瘤性等相对正常的生长特征。在口腔医学领域，日本学者Kamata、Fujita和Fujii转染hTERT建立了永生化人牙龈成纤维细胞、牙周细胞、牙髓细胞系和牙囊细胞系，细胞群体倍增数达150次以上，细胞均表现原有的生物学特性，诱导培养后都可以表达来源细胞的相关蛋白。Kitagawa等转染hTERT建立了人成牙骨质细胞系，细胞倍增达200次以上，细胞分化标志物如碱性磷酸酶、I型胶原等表达稳定。但未见制备CD4+T细胞用于体外治疗艾滋病的报道。

发明内容

为了解决久攻不克的艾滋病治疗领域的世界性难题，本发明人提出了本发明。

本发明的目的是要提供艾滋病生物治疗反应器；另一目的是要提供反应器的制备及应用方法。

本发明的目的是这样实现的：基于HIV通过其受体CD4分子选择性地感染CD4+T细胞且造成CD4+T细胞大量破坏和免疫功能丧失而致病的机理，通过外源基因整合而改变CD4+T细胞的基因结构，从而使之转化为既保持原细胞生物学特性又能在体外无限制生长的永生化细胞系，并利用CD4+T细胞表面特有分子抗体作为细胞生长的刺激剂，建立适应体外人工产业制备既能结合HIV又能产生细胞因子的CD4+T细胞的方法，将由此制备的CD4+T细胞以高生物相容性材料包裹而进一步制备能防止细胞及其碎片甚至HIV滤出的、能为CD4+T细胞产生细胞因子及结合HIV提供场所的反应器，体外循环中分离的血浆流经反应器时，其中的HIV与CD4+T细胞发生结合反应随后进入胞内而从血浆中清除，同时CD4+T细胞产生的细胞因子随血浆经细胞间隙流出反应器而回输体内，从而实现既清除HIV又补充所需细胞因子的艾滋病人工CD4+T细胞替代疗法。

本发明根据HIV选择性地感染CD4+T细胞、生物人工肝治疗细胞永生化的制备方法以及血液置换治疗等机制，实施以人工制备CD4+T细胞并进一步制成生物反应器用以清除血浆HIV及补充相应细胞因子的艾滋病治疗新方法，因CD4+T细胞表面的CD4分子是HIV的受体而成为HIV的易感细胞，与HIV相遇时能吸附HIV，被吸附的HIV随CD4+T细胞被固定于反应器，制备的生物反应器能防止细胞及其碎片甚至HIV滤出，能为CD4+T细胞产生细胞因子及结合HIV提供场所，本发明的技术方案能有效阻断新生的CD4+T细胞再被HIV感染，能使体内HIV不断被清除而减少直至消失，从而达到免疫重建的治疗目的，与目前无法杀灭HIV和有效阻断从血浆到CD4+T细胞的循环感染途径、且费用昂贵、药副作用大的常规抗逆转录病毒治疗方法相比，本发明更经济，实现了人工将HIV从体内转移到体外加以清除的治疗新方法。

具体实施方式

图1是根据本发明提出的艾滋病生物治疗反应器的应用示意图。

图2是根据本发明提出的血浆分离器的内部结构示意图。

图3是根据本发明提出的艾滋病生物治疗反应器的内部结构示意图。

图1中，动脉血路管(1)的一端与动脉血管相连通，另一端经肝素泵(2)和血液泵(3)与血浆分离器(4)相连，血浆分离器(4)经血浆泵(6)和循环管路(7)与两个并联的反应器(8)、反应器(9)相连，然后依次与循环管路(10)、静脉管路(5)相连，静脉管路(5)的另一端与静脉血管相连。

图2中，1是血浆分离器，2是血浆分离器内腔，3是血浆分离器内腔管壁上的微孔，4是不能通过微孔(3)的血细胞，5是能通过微孔(3)的小分子血浆成份，6是血浆分离器外腔，7是血浆流出口，8是可开关的阀门。

图3中，1是反应器，2是CD4+T细胞，3是进入反应器的游离的HIV，4是HIV与CD4+T细胞结合物，5是CD4+T细胞产生的细胞因子。

下面结合图1、图2和图3，对本发明提出的艾滋病生物治疗反应器的实施方案作详细的描述。

一、生物治疗反应器的制备

1、制备依据

(1)根据CD4+T细胞是HIV的易感细胞制备：HIV进入人体后，被巨噬细胞(含CD4分子)吞噬，但HIV很快改变了巨噬细胞内某些部位的酸性环境，创造了适合其生存的条件，不但不被杀灭反而在其内繁殖。因为CD4是HIV的受体，所以经巨噬细胞内繁殖的HIV通过其囊膜蛋白gp120并在gp41的辅助下(gp41起着桥的作用，利用自身的疏水作用介导病毒囊膜与细胞膜融合)进入其他CD4+细胞，如单核巨噬细胞、树突状细胞等，特别是CD4+T细胞，在细胞内迅速增殖，每天产生10⁹～10¹⁰病毒颗粒，并不断进入其他正常的CD4+T细胞内或再生的CD4+T细胞内复制，制造更多的病毒感染细胞，使外周血CD4+T细胞持续破坏、减少。在HIV感染CD4+T细胞的过程中存在游离于血浆的时机，设计以CD4+T细胞为吸附细胞的生物治疗反应器，用以吸附清除体外分离血浆中的HIV，从而使体内HIV不断被清除而减少直至消失，有效阻断新生的CD4+T细胞再感染HIV途径，达到免疫重建的治疗目的。

(2)CD4+T细胞能产生细胞因子：如IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6和IL-10，其中IL-2被认为是最重要的T细胞生长因子和动态平衡的主要调节因子，引起CD4+T细胞增殖并增加CD8+T细胞的细胞毒性潜能，能使CD4+T细胞计数长时间增加；分泌的IFN具有促进感染致炎症性反应的作用；分泌的IL-4和IL-10具有抑制炎症反应的作用；分泌的IL-6具有参与炎症反应和自身免疫性疾病反应的作用。HIV感染的主要特征是进行性免疫缺陷，包括以CD4+T细胞为主的免疫细胞数量减少和功能异常，各种细胞因子分泌减少或消失，导致免疫功能丧失。

2、反应剂的制备

制备CD4+T细胞(包括其他CD4+细胞)，作为反应器内部吸附HIV的反应剂(基质)。

(1)原代淋巴细胞的来源：有以下种途经：①用于科研保存的传染病实验室样本库中冻存的淋巴细胞株(经灭活HIV全病毒免疫但未感染HIV的淋巴细胞)；②购买血站新鲜浓缩白细胞，然后进行过灭活HIV感染株免疫的淋巴细胞；③从商家直接购买的T淋巴细胞系(株)；④用于科研保存的脐带血淋巴细胞(经灭活HIV免疫)；⑤直接取自因做其他实验而顺便采集的HIV-1感染者的存余的外周血淋巴细胞(用于自身)，采用Histopaque淋巴细胞分离液分离单个核细胞(PBMC)。

(2)CD4+T细胞的制备：①主要试剂与仪器：CD4、CD8免疫磁珠(德国美天旎生物技术有限公司)；异硫氰酸荧光素CD4-FITC、CD8-FITC、IgG1-FITC(Immunotech公司)；淋巴细胞分离液(上海恒信生化试剂有限公司)；乙二胺四乙酸(EDTA)、0.2％台盼蓝染色液(上海生工生物工程技术服务公司)；新生牛血清(Hyclone公司)；MiniMACS磁力分离系统(德国美天旎生物技术有限公司)；EpicsXL型流式细胞仪(美国BeckmanCoulter公司)。②单个核细胞(PBMC)的分离(密度梯度离心法)：无菌取20mL血样(500IU/mL2mL肝素钠抗凝)；PBS液将血液稀释2～3倍，充分混匀后将6mL抗凝静脉血用滴管沿管壁缓慢叠加于已加入4mL淋巴细胞分离液的10mL离心管中水平离心机中水平离心(400r/min，20℃)35min；离心后管内分为3层，上层为血浆和PBS液，下层主要为红细胞和粒细胞，中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带为PBMC，用毛细吸管插到云雾层，吸取PBMC置入另-50mL离心管中，加入5倍以上体积PBS离心(300r/min，20℃)10min，弃上清50mLPBS重悬细胞，离心(350r/min，20℃)15min，弃上清，加入Buffer(PBS+0.5％新生牛血清+2mmol/LEDTA，pH7.2)2mL重悬细胞，取15uL细胞悬液加入血球计数板上显微镜下计数4个大方格内的细胞(PBMC)总数。③CD4+T细胞和CD8+T细胞的分离纯化：PBMC细胞悬液均分至两个1.5mLEppendorf管，离心(300r/min，20℃)10min，弃去上清，重悬细胞每80uLBuffer含细胞数10⁷个，每10⁷个细胞加20uLCD4MicroBeads或CD8MicroBeads，充分混匀，在4～8℃孵化15min，用1mLBuffer洗涤细胞，离心(300r/min，20℃)10min，弃去上清500uLBuffer重悬细胞，将MS分离柱放置在MACS分离器的磁场中，以500uLBuffer漂洗，将500uL细胞悬液通过分离柱，用500uLBuffer冲洗分离柱重复操作3次，收集流出液，流出液中含非CD4+T淋巴细胞或非CD8+T淋巴细胞，自分离器中取出分离柱，用1000uLBuffer加压冲洗分离柱，收集流出液，此为CD4+T淋巴细胞或CD8+T淋巴细胞(细胞活力检测：细胞纯化前后分别取15uL细胞悬液与等体积台盼蓝溶液混合，显微镜下观察不着色发亮者为活细胞，着色胀大者为死细胞，计算200个细胞中活细胞的百分比)。

(3)体外产业制备CD4+T细胞

有文献报道利用T细胞表面CD3分子的单克隆抗体作为细胞生长的刺激剂，大量培养艾滋病患者分离的T细胞后，作为自身治疗性细胞回输。但HIV也随着HIV感染细胞的培养繁殖而在胞内增殖，增量T细胞的回输也导致了增量HIV的回输。本发明以SV40或hTERT永生化CD4+T细胞，并以CD3单克隆抗体为细胞生长刺激剂，大量扩增CD4+T细胞，用于制备反应器，结合血液净化技术，在体外清除HIV。

以CD3单克隆抗体为细胞生长刺激剂的方法是：将抗CD3单抗(CD4+T细胞同时含有CD3分子)包被到培养板上刺激单个核细胞(淋巴细胞)生长，称为抗CD3抗体包被法，可获得很好的扩增效果，应用这种方法扩增的淋巴细胞已用于肿瘤的二期临床治疗并取得了一定的疗效。国外文献报道[Shimizu等]亦用此方法培养了5例晚期艾滋病患者的淋巴细胞，培养4周就可获得1000倍的扩增，且扩增的细胞群中CD4+/CD8+T均可大量扩增(CD4+T细胞更明显)。另一种是抗CD3/CD28双抗交联法，即将抗CD3/CD28双抗交联于滋珠上作为刺激剂培养HIV感染者外周血单个核细胞(淋巴细胞)，可以扩增大量的CD4+T细胞，并且扩增的CD4+T细胞具有对抗HIV感染的能力，其培养过程中病毒也低于检测水平，之后发现这可能与CD28提供了第二信号，选择性诱导分泌大量的Th1细胞因子和趋化因子有关，用此方法扩增的CD4+T细胞已用于HIV感染者的临床治疗回输，无风险但效果一般。

以hTERT永生化CD4+T细胞的方法是：以内切酶EcoR I和Xho I双酶切质粒pCIneo-hTERT和载体pLXSNneo，以Ligation Mix连接经PCR扩增、凝胶电泳分离的hTERT和pLXSNneo酶切产物，构建pLXSNneo-hTERT重组子，转化DH5a感受态细胞以扩增、纯化并挑取耐氨苄青霉素菌落抽提质粒，以脂质体转染法导入离体传代呈对数生长的T淋巴细胞，使重组子与细胞的DNA整合，并扩大培养经G418筛选的阳性重组子的克隆，筛选细胞形态、生长曲线、染色体核型、裸鼠致瘤试验、转染细胞端粒酶活性、hTERT mRNA表达产物、免疫组织化学染色、细胞增殖周期及细胞凋亡率符合永生化细胞特性并与原代细胞相同或相近者作为hTERT永生化的CD4+T细胞。

以SV40永生化CD4+T细胞的方法是：以T4 DNA连接酶连接同时经BamHI酶切的pcDNA3.1(-)DNA和PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳分离的SV40LTag DNA，构建SV40LTag-pcDNA3.1(-)重组质粒，转化DH5a大肠杆菌感受态细胞以扩增、纯化并挑取耐氨苄青霉素的菌落抽提质粒，以脂质体转染法导入体外培养的T淋巴细胞，使重组子与细胞的DNA整合，以G418筛选的含阳性重组子的细胞，作传代、扩大培养，筛选细胞形态、细胞生长曲线、染色体核型、裸鼠致瘤试验、转染细胞DNA中SV40大T基因检测、mRNA表达产物测定及DNA序列测定结果符合永生化细胞特性并与原代细胞相同或相近者作为SV40永生化的CD4+T细胞。

①以hTERT永生化CD4+T细胞的具体方法

(I)hTERT的提取：(i)酶切pClneo-hTERT：hTERT位于质粒pClneo-hTERT的EcoRI与SalI位点之间，pLXSNneo载体多克隆位点(MCS)含EcoRI与XhoI酶切位点。市售购买pCIneo-hTERT质粒，溶解于适量的超净H₂O或TE缓冲液中，加2uL10×酶切缓冲液和18uL H₂O，加限制性内切酶EcoR I和Xho I各0.5ul，37℃温育1h，75℃加热15min，灭活酶，加入5uL电泳加样缓冲液(也可通过加入0.5mol/L EDTA)终止反应，按常规PCR法扩增hTERT后，收取扩增物以备电泳。(ii)hTERT电泳：取电泳级琼脂糖以电泳缓冲液配成10％琼脂糖凝胶，倒入已封好的凝胶灌制平台上，插上样品梳，待胶凝固后从制胶平台上除去封带，拔出梳子，放入加有足够电泳缓冲液的电泳槽中，缓冲液高出凝胶表面大约1mm，用适量的10×加样缓冲液制备hTERT酶切样品，然后用移液器将样品加入样品孔中，并同时做合适的标准对照物，接通电极，使hTERT向阳极移动，然后在1-10V/cm(80V)凝胶的电压下电泳至足够分离hTERT片段的距离时(30min)，关闭电源。(iii)hTERT纯化与回收：从琼脂糖中分离hTERT条带：在长波紫外光源下将含目标hTERT片段的凝胶条带切下装入透析袋中，向透析袋内加入2ml电泳缓冲液，使之浸没凝胶，并排空汽泡，将透析袋水平放入电泳槽(长度方向与电泳平行)，加入适量缓冲液将透析袋浸没(约6-7mm)，接通电源，150伏电洗，在紫外灯下观察待hTERT全部移出凝胶，改变电场方向继续通电1分钟，从透析袋中吸出缓冲液于1-5ml Eppendorf管中，加入1.5倍体积正丁醇，混匀抽提去EB，在台式离心机上最高速2分钟，吸去上层正丁醇溶液，如此重复二次，自下层hTERT的溶液中加入等体积酚氯仿(2个)抽提2次，上清转入另一Eppendorf管中加入1/10倍体积3M NaAc、2倍体积预冷无水乙醇，于20℃过夜，12000g，4℃下离心10分钟，得hTERT沉淀，弃上清，加入70％乙醇洗涤2次后弃干乙醇，加入50μl TE溶解hTERT。此外，还可用低熔点琼脂糖凝胶法、hTERT滤膜插片法等将目的hTERT片段从凝胶中分离、纯化出来。

(II)hTERT与pLXSNneo载体的连接：取9μl上述纯化的hTERT成份(0.1-5μg)、1μ110mmol/L ATP、10ul Ligation Mix或大肠杆菌DNA连接酶、2ul pLXSNneo空载体混合，15℃温育24h，构建pLXSNneo-hTERT重组子。

(III)pLXSNneo-hTERT重组子的纯化、扩增、鉴定：(i)大肠杆菌感受态的制备：其基本方法是用冰预冷的CaCl₂或多种2价阳离子等处理细菌，使之进入感受态得以转化，用CaCl₂制备新鲜或冷冻的大肠杆菌感受态细胞，常用于成批制备感受态细菌，本法适用于大多数大肠杆菌菌株，操作过程简述如下：从37℃培养16～20h的新鲜平板中挑取一个单菌落(如大肠杆菌DH52)，或1ml新鲜的16～20h过夜培养物，转到一个含有100mlLB培养基的1L或500ml烧瓶中，于37℃剧烈振摇培养约2～3h(旋转摇床200～300r/min)，每隔20～30min测量OD600值≈0.4，在无菌条件下将细菌转移到一个，用冰预冷的50ml聚丙烯离心管中，在冰上放置10～20min，于4℃用SorvallGS2转头(或与其离心管相配的转头)以4000r/min离心10min，以回收细胞，倒数培养液，将管倒置1min以使最后残留的痕量培养液流尽，以10ml用冰预冷的0.1mMCaCl₂重悬每份沉淀，放于冰上，于4℃用SorvallGS3转头(或与其相应的转头)以4000r/min离心10min，以回收细胞，倒出培养液，将管倒置1min以使最后残留的痕量培养液流尽，每50ml初始培养物用2ml冰预冷的0.1M CaCl₂重悬每份沉定，此时，可以迅速将细胞分装成小份，液氮中冰冻，-70℃贮存备用。(ii)以感受态大肠杆菌纯化、扩增pLXSNneo-hTERT重组子：用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200μl转移到无菌的微量离心管中，每管加DNA或连接反应混合物(体积≤10μl，DNA≤50ng)，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30min，将离心管放到预加温到40℃的循环水浴中的试管架上，放置90s～2min，不要摇动试管，快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1～2min，每离心管加800μlSOC培养基，用水浴将培养基加温到37℃，然后将管转移到37℃摇床上，温育45min使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性标记基因，将适当体积(每90mm平板可达200μl)已转化的感受态细胞转移到含200mmol/LMgSO4和相应抗生素的SOB培养基上，将平板置于室温至液体被吸收，倒置平皿，于37℃培养，12～16h后可出现菌落。(iii)筛选、扩增重组子：用无菌牙签或灭菌接种针挑选单个菌落接种于5mL无菌的LB培养基或丰富培养基(如超级肉汤或TB超级肉汤培养基)中，培养过夜后，再加入到500mL含LB培养基(含有适当抗生素)的2L烧瓶中，再于37℃培养至饱和状态(OD₆₀₀≈4，为提高产量，应采用表面积较大及带折流板的烧瓶以尽量增大通气度，振摇速度应大于400r/min)，于4℃，6000g离心10min，用4mL GTL溶液重悬沉淀，并转移到一个容积≥20mL的高速离心管中(细菌沉淀可以在-20℃或-70℃无限期保存)，加入1mL新配的含25mg/mL溶菌酶的GTE溶液，重悬沉淀，于室温放置10min，加入10mL新配NaOH/SDS溶液，并且轻轻混匀直至液体变得均一、清亮而粘稠，于冰上放置10min，加入7.5mL乙酸溶液，用吸管轻轻搅拌直至粘稠度下降并形成大的沉淀，于冰上放置10min，于4℃，20 000g离心10min，将上清轻轻倒入至另一个干净的离心管中，如果有可见的飘浮物可用数层纱布过滤，加入0.6倍体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置5～10min，于室温，1500g离心10min，加入2mL 70％乙醇轻轻洗涤沉淀，然后短暂快速离心，吸去乙醇，真空干燥(沉淀可在4℃长期保存)。(iv)重组质粒的鉴定与扩增：挑取平皿上的单菌落，接种于3ml含100ug/ml氨苄青霉素LB培养基中，37℃，250r/min摇床中培养，14h后收集培养物，4℃、10000r/min离心5min，按试剂盒说明书小量提取并纯化重组质粒；以EcoRI和HindIII双酶切重组质粒反应体系：限制性内切酶各0.5ul、10×buffer 2ul、重组质粒10ul、加水补足至20ul，37℃酶切1h。酶切产物于80V电压条件下进行0.8％琼脂糖电泳，时间30min，凝胶成像系统拍照；按常规测定重组质粒的序列；重组质粒经酶切、测序鉴定准确后，将含有该质粒的细菌接种至LB培养液中，扩增培养，按大剂量质粒抽提试剂盒说明书进行大剂量质粒抽提纯化，紫外分光光度计测定质粒浓度及纯度后备用。

(IV)CD4+T细胞：从本发明“(2)CD4+T细胞的制备”取样制备。

(V)CD4+T细胞预培养：将上述细胞接种于含5～10nmol/L胰岛素、20％胎牛血清的RPMI1640液中，或接种于含20％胎牛血清、5～10nmol/L胰岛素的低糖DMEM细胞培养基中，一般接种于3ml新鲜配制的培养基(1.6％1M HEPES缓冲液；15％胎牛血清(FBS)；1％青霉素和链霉素；PRMI 1640补足到100％)，置于37℃，体积分数5％CO2培养箱内，培养1-2天，离心，去上清液，备用。

(VI)pLXSNneo-hTERT重组子导入T淋巴细胞及扩大培养：在1.5ml微量离心管中制备下列溶液：管A，将pLXSNneo-hTERT重组子溶于100μl无血清培养液中；管B，将20μlLipofectamine溶于80μl无血清培养液中，将管A和管B混匀，室温下静置45min，用无血清培养液洗涤上述T淋巴细胞2次。在Lipofectamine-pLXSNneo-hTERT混合物中加入1ml无血清培养液，轻轻混匀，滴加至上述T淋巴细胞中，加入1ml无血清培养液(胎牛血清浓度为20ml/L)，在CO₂培养箱培养10h，吸出转染液，加4ml完全培养液(胎牛血清浓度为20％)，继续培养20h，弃去培养液，更换浓度为400mg·L^-1的G418培养液继续培养，8天后选择活细胞作扩大培养后，再加大G418浓度到800mg·L^-1，将能在高浓度的G418环境中稳定生长的细胞继续进行扩增培养。培养9天左右镜下观察，可见淋巴细胞明显增大，出现聚集现象。如果细胞增长慢，或细胞密度低，或培养液pH值呈酸性，吸出半量培养液，进行等量换液。当总量达到14ml时转移到75ml培养瓶中，每2-3周加入5-10ml新鲜培养基。细胞培养至9-10周(约第75代)，仍处于对数生长期，即细胞增加数量与培养时间呈倍增关系，死亡细胞少于10％(通过读取培养容器的刻度判断细胞数量的增加情况；通过台盼蓝染色法鉴别死细胞和活细胞。因为正常的活细胞，胞膜结构完整，能够排斥，使台盼蓝不能够进入胞内；而丧失活性的细胞，胞膜的通透性增加，可被台盼蓝染成蓝色，可判断为细胞已经死亡。方法是每周吸取一定量的细胞培养悬液，与台盼蓝染色剂混合后置室温5～10分钟，然后制成细胞薄片，在显微镜下计数1000个细胞总数，计算着色的死细胞和不着色的活细胞的百分比)。此后随着培养代数的增加和培养时间的延长，细胞数量的增加变慢、死亡细胞越来越多，直至细胞不再增加，甚至溶解、减少、全部死亡。当总量达到45ml时，置50ml离心管中，离心1500转，10分钟，弃上清后，加入3ml冻存培养基(5％二甲基亚枫(dimethyl sufoxide)，95％FBS)混匀，成细胞悬浮液(细胞浓度约为10⁵/ml)。冻存管分装，1ml/管，置-20℃2h，再置-70℃2h，然后冻存在-196℃液氮中(或立即置零下80度，1-2小时后移入液氮罐中)。

(VII)永生化CD4+T细胞生物学特性的鉴定：(i)观察细胞形态：可见淋巴细胞明显增大，出现聚集现象，具有淋巴母细胞化特征。(ii)观察细胞生长曲线：取生长较好的转染细胞，制成细胞悬液，经计数，分别取1.4×10⁴细胞接种于30个含15FBS低糖DMEM培养基培养瓶。每天取2瓶细胞进行计数，计算均值，连续观察直至细胞数量明显下降，培养3天后每隔2天给未计数的细胞换液，采用同样方法观察转染细胞在hepato ZYME-SFM无血清培养基中的生长情况。结果以培养时间为横轴，细胞数量为纵轴(对数)，描绘在半对数座标上制成曲线后即成该细胞的生长曲线，永生化细胞系呈典型的“S”特征或“穹隆”形成；(iii)检查染色体：通过分析染色体核型，如果染色体核型为二倍体“46，XX”或“46，XY”，则说明该细胞系没有发生恶性转化(同时可用流式细胞仪分析细胞系中是否出现异常的DNA群体，如果没有，也说明细胞系未出现瘤性特征)。染色体核型分析方法是：按5mL培养液中加入预热的250ug/ml秋水仙素100ul，混匀后置37℃培养箱4小时，经离心、去上清液、低渗、固定、制片、G显带后分析染色体核型；(iv)流式细胞术检测：检测第19代细胞系中合成、分裂的细胞比例，如果其增殖能力明显比未建系的正常细胞增强，说明是hTERT整合、表达的结果。(vii)DNA序列测定：按常规测序仪检测，显示hTERT基因序列。(v)转染细胞DNA中hTERT检测：如以免疫组织化学检测，hTERT转染的细胞核内染色可见大量棕色颗粒，表明hTERT已整合入细胞内；(vi)mRNA表达产物测定：取100μl体系的PCR扩增产物，用凝胶回收试剂盒(Takara，日本)回收产物，取2μl DNA溶液稀释100倍，测浓度，余下的DNA及上、下游引物各10μl进行测序。

(VIII)hTERT介导CD4+T细胞库：筛选并继续传代、扩大培养经上述鉴定后符合永生化细胞特性并与原代细胞相同或相近的细胞，取生长状态良好、处于对数生长期的不同世代的细胞，经离心分离(1200r/min，6min)，用含二甲亚砜的冻存液0.5～1ml重悬细胞，细胞密度为5×10⁵个/ml，加入冻存管，经4℃，0.5h；-20℃，2h；-70℃，过夜，入-196℃液氮冻存，以此法构建生物学特性稳定的永生化CD4+T细胞库备用。

②以SV40永生化CD4+T细胞的具体方法

(I)SV40大T抗原DNA的提取：(i)SV40DNA酶切：从市售购买含有大T抗原基因的SV40冰冻干粉或SV40质粒，溶解于适量的H₂O或TE缓冲液中，加2uL10×酶切缓冲液和18uLH₂O，加限制性内切酶BamH I(1-5U/ugDNA)，37℃温育1h，75℃加热15min，灭活酶，加入5uL电泳加样缓冲液(也可通过加入0.5mol/L EDTA)终止反应以备电泳。(ii)SV40DNA电泳：取电泳级琼脂糖以电泳缓冲液配成10％琼脂糖凝胶，倒入已封好的凝胶灌制平台上，插上样品梳，待胶凝固后从制胶平台上除去封带，拔出梳子，放入加有足够电泳缓冲液的电泳槽中，缓冲液高出凝胶表面约1mm，用适量的10×加样缓冲液制备DNA样品，然后用移液器将样品加入样品孔中，并同时做合适的DNA分子量标准对照物，接通电极，使DNA向阳极移动，在1-10V/cm凝胶的电压下电泳至足够分离DNA片段的距离时，关闭电源。(iii)从琼脂糖中分离约2600bp SV40大T抗原DNA：在300-360nm长波紫外光源下(使用长波紫外光源以防止DNA损伤)将含目标DNA片段的凝胶条带切下装入透析袋中，向透析袋内加入2ml电泳缓冲液，使之浸没凝胶，并排空汽泡，将透析袋水平放入电泳槽(长度方向与电泳平行)，加入适量缓冲液将透析袋浸没(约6-7mm)，接通电源，150伏电洗，在紫外灯下观察待DNA全部移出凝胶，改变电场方向继续通电1分钟，从透析袋中吸出缓冲液于1-5ml Eppendorf管中，加入1.5倍体积正丁醇，混匀抽提去EB，在台式离心机上最高速2分钟，吸去上层正丁醇溶液，如此重复二次，自下层言DNA的溶液中加入等体积酚氯仿(2个)抽提2次，上清转入另一Eppendorf管中加入1/10倍体积3M NaAc、2倍体积预冷无水乙醇，于20℃过夜，12000g，4℃下离心10分钟，得DNA沉淀，弃上清，加入70％乙醇洗涤2次后弃干乙醇，加入50μl TE溶解DNA。此外，还可用低熔点琼脂糖凝胶法、DNA滤膜插片法等将目的DNA片段从凝胶中分离、纯化出来。

(II)SV40大T抗原DNA与pcDNA3.1基因载体的连接：取9μl上述DNA成份(0.1-5μg)、10μl 2×连接缓冲液、1μl 10mmol/L ATP、T4 DNA连接酶(20～500粘性末端单位)或大肠杆菌DNA连接酶、pcDNA3.1空载体混合，15℃温育24h，构建成SV40T/pcDNA3.1重组子。

(III)SV40T/pcDNA3.1重组子的扩增、分离与鉴定：(i)大肠杆菌感受态的制备：其基本方法是用冰预冷的CaCl₂或多种2价阳离子等处理细菌，使之进入感受态得以转化，用CaCl₂制备新鲜或冷冻的大肠杆菌感受态细胞，常用于成批制备感受态细菌，本法适用于大多数大肠杆菌菌株，操作过程简述如下：从37℃培养16～20h的新鲜平板中挑取一个单菌落(如大肠杆菌DH52)，或1ml新鲜的16～20h过夜培养物，转到一个含有100mlLB培养基的1L或500ml烧瓶中，于37℃剧烈振摇培养约2～3h(旋转摇床200～300r/min)，每隔20～30min测量OD600值≈0.4，在无菌条件下将细菌转移到一个，用冰预冷的50ml聚丙烯离心管中，在冰上放置10～20min，于4℃用SorvallGS2转头(或与其离心管相配的转头)以4000r/min离心10min，以回收细胞，倒数培养液，将管倒置1min以使最后残留的痕量培养液流尽，以10ml用冰预冷的0.1mMCaCl₂重悬每份沉淀，放于冰上，于4℃用SorvallGS3转头(或与其相应的转头)以4000r/min离心10min，以回收细胞，倒出培养液，将管倒置1min以使最后残留的痕量培养液流尽，每50ml初始培养物用2ml冰预冷的0.1M CaCl₂重悬每份沉定，此时，可以迅速将细胞分装成小份，液氮中冰冻，-70℃贮存备用，用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200μl转移到无菌的微量离心管中，应在每管中加DNA或连接反应混合物(体积≤10μl，DNA≤50ng)，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30min，将离心管放到预加温到40℃的循环水浴中的试管架上，放置90s～2min，不要摇动试管，快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1～2min，每离心管加800μlSOC培养基，用水浴将培养基加温到37℃，然后将管转移到37℃摇床上，温育45min使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性标记基因，将适当体积(每个90mm平板可达200μl)已转化的感受态细胞转移到含200mmol/LMgSO4和相应抗生素的SOB培养基上，将平板置于室温至液体被吸收，倒置平皿，于37℃培养，12～16h后可出现菌落。(ii)重组子的筛选、扩增与提取：用无菌牙签或灭菌接种针挑选单个菌落接种于5mL无菌的LB培养基或丰富培养基(如超级肉汤或TB超级肉汤培养基)中，培养过夜后，再加入到500mL含LB培养基(含有适当抗生素)的2L烧瓶中，再于37℃培养至饱和状态(OD₆₀₀≈4，为提高产量，应采用表面积较大及带折流板的烧瓶以尽量增大通气度，振摇速度应大于400r/min)，于4℃，6000g离心10min，用4mL GTL溶液重悬沉淀，并转移到一个容积≥20mL的高速离心管中(细菌沉淀可以在-20℃或-70℃无限期保存)，加入1mL新配的含25mg/mL溶菌酶的GTE溶液，重悬沉淀，于室温放置10min，加入10mL新配NaOH/SDS溶液，并且轻轻混匀直至液体变得均一、清亮而粘稠，于冰上放置10min，加入7.5mL乙酸溶液，用吸管轻轻搅拌直至粘稠度下降并形成大的沉淀，于冰上放置10min，于4℃，20 000g离心10min，将上清轻轻倒入至另一个干净的离心管中，如果有可见的飘浮物可用数层纱布过滤，加入0.6倍体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置5～10min，于室温，1500g离心10min，加入2mL 70％乙醇轻轻洗涤沉淀，然后短暂快速离心，吸去乙醇，并真空干燥(沉淀可在4℃长期保存)。(iii)重组子的鉴定：上述从感受态大肠杆菌中提取的DNA(含重组子SV40T/pcDNA3.1)，同上法用限制性内切酶BamH I进行酶切，10g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，获得大小约2600bp及5600bp的2条带，前者符合GenBank中SV40T片段的大小。

(IV)CD4+T细胞：从本发明“(2)CD4+T细胞的制备”取样制备。

(V)CD4+T细胞预培养：将上述细胞接种于含5～10nmol/L胰岛素、20％胎牛血清的RPMI1640液中，或接种于含20％胎牛血清、5～10nmol/L胰岛素的低糖DMEM细胞培养基中，一般接种于3ml新鲜配制的培养基(1.6％1M HEPES缓冲液；15％胎牛血清(FBS)；1％青霉素和链霉素；PRMI 1640补足到100％)，置于37℃，体积分数5％CO2培养箱内，培养1-2天，离心，去上清液，备用。

(VI)SV40T/pcDNA3.1的导入及扩大培养：在1.5ml微量离心管中制备下列溶液：管A，将SV40T/pcDNA3.1溶于100μl无血清培养液(胎牛血清浓度为20ml/L)中；管B，将20μlLipofectamine溶于80μl无血清培养液中，将管A和管B混匀，室温下置45min。用无血清培养液洗涤上述T淋巴细胞2次。在Lipofectamine-SV40T/pcDNA3.1混合物中加入1ml无血清培养液，轻轻混匀，再滴加至上述T淋巴细胞中，然后加入1ml无血清培养液(胎牛血清浓度为20ml/L)，在CO₂培养箱培养10h，吸出转染液，加4ml完全培养液(胎牛血清浓度为20％)，继续培养20h，弃去培养液，更换浓度为400mg·L^-1的G418培养液继续培养，8天后选择活细胞作扩大培养后，再加大G418浓度到800mg·L^-1，将能在高浓度的G418环境中稳定生长的细胞继续进行扩增培养。培养9天左右镜下观察，可见淋巴细胞明显增大，出现聚集现象。如果细胞增长慢，或细胞密度低，或培养液pH值呈酸性，吸出半量培养液，进行等量换液。当总量达到14ml时转移到75ml培养瓶中，每2-3周加入5-10ml新鲜培养基。细胞培养约6-8周(约第55代)，仍处于对数生长，即培养时间与细胞增加数量呈倍增关系，死亡细胞少于10％(通过读取培养容器的刻度判断细胞数量的增加情况；通过台盼蓝染色法鉴别死细胞和活细胞。因为正常的活细胞，胞膜结构完整，能够排斥，使台盼蓝不能够进入胞内；而丧失活性的细胞，胞膜的通透性增加，可被台盼蓝染成蓝色，可判断为细胞已经死亡。方法是每周吸取一定量的细胞培养悬液，与台盼蓝染色剂混合后置室温5～10分钟，然后制成细胞薄片，在显微镜下计数1000个细胞总数，计算着色的死细胞和不着色的活细胞的百分比)。此后随着培养代数的增加和培养时间的延长，细胞数量的增加变慢、死亡细胞越来越多，直至细胞不再增加，甚至溶解、减少、全部死亡。当总量达到45ml时，置50ml离心管中，离心1500转，10分钟，弃上清，加入3ml冻存培养基(5％二甲基亚枫(dimethyl sufoxide)，95％FBS)混匀，成细胞悬浮液(细胞浓度约为10⁵/ml)。冻存管分装，1ml/管，置-20℃2h，再置-70℃2h，然后冻存在-196℃液氮中(或立即置零下80度，1-2小时后移入液氮罐中)。

(VII)永生化CD4+T细胞生物学特性的鉴定：(i)观察细胞形态：可见淋巴细胞明显增大，出现聚集现象，具有淋巴母细胞化特征。(ii)观察细胞生长曲线：取生长较好的转染细胞，制成细胞悬液，经计数，分别取1.4×10⁴细胞接种于30个含15FBS低糖DMEM培养基培养瓶。每天取2瓶细胞进行计数，计算均值，连续观察直至细胞数量明显下降，培养3天后每隔2天给未计数的细胞换液，采用同样方法观察转染细胞在hepato ZYME-SFM无血清培养基中的生长情况。结果以培养时间为横轴，细胞数量为纵轴(对数)，描绘在半对数座标上制成曲线后即成该细胞的生长曲线，永生化细胞系呈典型的“S”特征或“穹隆”形成；(iii)检查染色体：通过分析染色体核型，如果染色体核型为二倍体“46，XX”或“46，XY”，则说明该细胞系没有发生恶性转化(同时可用流式细胞仪分析细胞系中是否出现异常的DNA群体，如没有，说明细胞系未出现瘤性特征)。染色体核型分析方法是：按5mL培养液中加入预热的250ug/ml秋水仙素100ul，混匀后置37℃培养箱4小时，经离心、去上清液、低渗、固定、制片、G显带后分析染色体核型；(iv)流式细胞术检测：检测第19代细胞系中合成、分裂的细胞比例，如果其增殖能力明显比未建系的正常细胞增强，说明是SV40大T抗原整合、表达的结果。(viii)DNA序列测定：按常规测序仪检测，显示SV40大T抗原DNA序列。(v)转染细胞DNA中SV40大T基因检测：如以免疫组织化学检测，SV40转染的细胞核内染色可见大量棕色颗粒，表明SV40T抗原已整合入细胞内；也可用RT-PCR法检测T抗原在细胞中的表达，其中T抗原的引物：上游引物(A4239)5’-GTT ATG ATT ATA ACT GTT ATG-3’，下游引物(S4496)5’-GAAATG CCA TCT AGT GAT-3’；扩增产物长度为268bp，扩增条件为94℃，5min，即：(94℃，1min；55℃，1min，-0.5℃/循环；72℃，1min)×30、(94℃，30S；40℃，30S，72℃，30S)×15，扩增体系为50μl：[Mg²⁺]2mmol/L、dNTPs 200μmol/L、引物浓度0.4μmol/L、Taq1U、模板5μl；实验组以第19代细胞的cDNA为模板(参照市售cDNA第一链合成试剂盒进行cDNA第一链合成，产物-20℃保存)；阴性对照设两个，分别以无菌水、原代细胞的cDNA做模板，阳性对照以SV40 DNA为模板(参照SDS-蛋白酶K法提取SV40 DNA，因为SV40病毒无包膜，不使用SDS破膜，取5μl进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，其余-20℃保存备用)；(vi)mRNA表达产物测定：T抗原mRNART-PCR产物测序：取100μl体系的扩增产物，用凝胶回收试剂盒(Takara，日本)回收产物，取2μl DNA溶液稀释100倍，测浓度，余下的DNA及上、下游引物各10μl进行测序。

(VIII)SV40LT基因介导CD4+T细胞库：筛选并继续传代、扩大培养经上述鉴定后符合永生化细胞特性并与原代细胞相同或相近的细胞，取生长状态良好、处于对数生长期的不同世代的细胞，经离心分离(1200r/min，6min)，用含二甲亚砜的冻存液0.5～1ml重悬细胞，细胞密度为5×10⁵个/ml，加入冻存管，经4℃，0.5h；-20℃，2h；-70℃，过夜，入-196℃液氮冻存，以此法构建生物学特性稳定的CD4+T细胞库备用。

(4)与CD4+T细胞相似功能颗粒的制备：可将CD4分子、基因重组的CD4分子及类似功能的分子通过常规化学偶联、交联、亲和吸附等固定于载体上制成包被有CD4分子的颗粒，或直接取用功能相似的颗粒替代CD4+细胞应用。本发明的CD4+T细胞代表其他CD4+细胞，包括用其他方法制备永生化CD4+T细胞。

3、反应器的规格

将本发明制备的CD4+T细胞，以无菌生理盐水清洗后，再以1000r/min离心5min(低速短时离心)，取细胞沉淀装配丙烯酸酯之类高生物相容性材料(与血浆分离器材料相同)制成的圆柱形容器，然后加满无菌生理盐水，使CD4+T细胞的浓度为80％～90％，封口，制成即时使用的反应器。反应器可为漏斗形，底径小，顶径大，容积为200～300ml，进出口均设有细胞筛网，进口处顶径筛网目数为800目；出口处底径筛网目数为2.0～5.0目(2.5～5.0目相当于0.1～0.2微米或100～200纳米)，具体可制成2.0目、2.5目、3.0目、3.5目、4.0目、4.5目和5.0目的7种不同规格，用以阻挡120纳米的HIV病毒或更大的细菌；液体出口处设置目数为100目(相当于4微米)的细胞滤网，用以阻挡可能滤出的细胞；液体进出口与网筛之间设有缓冲区，有利于系统循环的稳定性。当被分离的血浆流经反应器时，游离的HIV被相应的CD4+T细胞吸附，净化后的血浆从反应器流出与血细胞汇合后回输。

二、血浆分离器的制备

1、原理：根据血细胞和血浆成份的分子大小制备。如人体血液中有形成份(血细胞)的大小为：正常红细胞大约为7微米(μm)，是双凹圆盘状的细胞；白细胞分为5种，中性粒细胞约12μm，嗜酸性粒细胞略大些，嗜碱性粒细胞与中性粒细胞接近，小淋巴细胞6-8μm，与红细胞近似，单核细胞最大，约15-20μm。血小板为圆盘形，直径1～4微米到7～8微米不等，人的血小板平均直径为2-4微米，厚0.5～1.5微米。

2、材料：用性质稳定、生物相容性好、通透性高的高分子聚合物，要求几乎不激活补体、不引起炎症反应、不引起白细胞、血小板、血氧分压、补体C3a、C5a的改变。可通过共价、接枝、聚合等方法改进材料的结构、调节表面的微观不均匀性、亲水性、减少对凝血及氧化应激的影响、从而提高筛滤充分性和生物相容性、减少并发症的发生，如选用聚醋无纺布、醋酸纤维、脱脂棉等。

3、型号与规格：就分离器的外形来说，可以醋酸纤维或脱脂棉等材料作滤芯制备成柱形结构、以聚醋无纺布等材料作滤芯制备成扁平结构等形状，按待分离的血细胞和血浆成份的分子大小确定孔径。本发明的血浆分离器制成空心纤维型滤器，空心纤维膜直径为270～370μm，膜厚度为50μm，孔径为0.2～0.6μm，纤维长度为13.5～26μm。该孔仅准许血浆滤过，但能阻挡所有的细胞成分。

三、生物治疗反应器的应用

1、体外循环装置的构成及作用

(1)反应器：内含反应剂(CD4+T细胞)，用于吸附、清除HIV。

(2)血浆分离器：用于体外循环装置中分离血浆和血细胞。

(3)动静脉压监测：动脉压监测主要用以动态监测血浆分离器微孔的堵塞情况，另外用以监测体外循环血栓、凝固和压力的变化。当血流不足时，动脉压就会降低；当有凝血、血栓形成，特别是分离器微孔堵塞时，动脉压就会升高；静脉压监测用来监测管路血液回流的压力，当分离器微孔堵塞、凝血、血栓形成、血流不足以及静脉血回流针头脱落时，静脉压就会下降，如果血路回流管扭曲堵塞或回流针头发生堵塞时，静脉压就会升高。

(4)空气监测(Air Detector)：用来监测血液流路的空气气泡，一般用超声波探测的原理，为了避免病人发生空气栓塞而设置。当监测到有空气气泡时，检测系统会驱动动、静脉血路夹来阻断血流，防止危险的发生。

其他还包括温度控制系统、配液系统、除气系统、电导率监测系统、超滤监测和漏血监测等部分。总之，在本发明构成体系的基础上，有望进一步研发自动化治疗仪器，发展为操作的人性化、治疗的个性化、设计的安全性以及模块化、自动监测及调控、液晶显示、自行判断警报原因及解除信号等微电脑处理系统。

2、使用方法

(1)安装：以无菌操作连接各部件，包括血浆分离器、反应器及各循环管路。

(2)排气：以无菌生理盐水充液分离器、反应器及各循环管路，排除分离器、反应器及其循环管道内的气体、气泡，仔细检查，确认无气体、气泡后使用。

(3)通液：将动脉血路管(1)接通艾滋病患者的动脉血管，在操作中再次仔细检查排气是否完全，液流是否通畅，并避免管内流液污染。

(4)抗凝：从肝素泵向液流中注射抗凝剂(肝素)，初次为2500∪或20～30∪/kg。

(5)启动：将静脉管路(5)接通艾滋病患者的静脉血管，然后打开血液泵，血流量为100～150ml/min，如图1，当动脉血液经动脉血路管(1)进入血浆分离器(4)，分离出来的血浆在血浆泵(6)的作用下经循环管路(7)到达反应器(8)，待充满血浆、约10分钟，开始放出血浆，经循环管路(10)流出，同步向反应器(9)灌注血浆，在反应器(8)内的血浆将近流完时，再次开始灌注血浆，此时反应器(9)开始放出血浆，两个并联的反应器(8)、反应器(9)交替进行。如此直至事先设定的血浆循环量(通常为9L)，治疗才宣告结束。如果配套电脑程序控制，整个治疗过程均由电脑控制，并可随时检测工作状态，使用会更加方便、自动化和安全。如图2，当待分离的血液进入血浆分离器(1)的内腔(2)时，经阀门(8)的作用，能通过微孔(3)的小分子血浆成份(5)进入分离器的外腔(6)，然后经血浆出口(7)流出，而不能通过微孔(3)的血细胞(4)经阀门(8)流出。如图3，当含有HIV(3)的血浆进入反应器(1)时，其中的HIV(3)被固定在反应器中的CD4+T细胞(2)结合成复合物(4)而不再往下移动，而CD4+T细胞产生的细胞因子(5)混合在吸附了HIV后的血浆中从CD4+T细胞的间隙流出反应器后回输体内，同时，反应器出口处2.5～5.0目的底径筛网也能阻挡HIV病毒或更大的细菌。

四、反应器治疗功效的验证

为了解CD4+T细胞的功效，本发明设计了简易反应器的测试方法：取灭菌的2.5×300mm魏氏血沉管5支，分别吸取经离心(1000r/min，5min)沉淀的CD4+T细胞至200mm刻度，接着吸取经100℃溶化后保温在56℃备用的0.9％琼脂糖C1-4B，达到约10mm长刻度，置血沉架冷却后，琼脂糖成为半固体，能阻止血沉管内细胞流出但不会阻止小分子的水和化学成份之类的物质通过。另取生物样本库保存的艾滋病(AIDS)患者的5例血浆，各约10mL，各取9mLAIDS滤前血浆分批次注入血沉管上端空管，待流经血沉管下层的CD4+T细胞层并从血沉管内流出后，收集流出液，称为AIDS滤后血浆。取AIDS滤前血浆和滤后血浆，根据HIV-1p24抗原检测试剂盒(酶联免疫法，上海启发生物科技有限公司)操作，以已知浓度0pg/ml、0.5pg/ml、1pg/ml、2.5pg/ml、5pg/ml、20pg/ml、40pg/ml、80pg/ml的p24抗原作为对照，最低检测限低于5pg/ml，测定范围0～400pg/ml，线性范围0.5pg/ml～80pg/ml，15min内450nm测定吸光度(OD)，空白对照校准品吸光度值不高于0.050，0pg吸光度值不高于0.100，1000pg/ml吸光度不低于1.000，当吸光度＞0.12时被认为是阳性，检测结果(表1)说明，AIDS血浆滤过简易反应器后，部分HIV已被CD4+T细胞吸附，经第1次滤过后，HIV总清除率为22.84％，经第2次滤过后，总清除率为35.31％，经第3次滤过后，总清除率为41.9％。说明随着滤过次数的增加HIV会被不断地清除，从而达到治疗AIDS目的。

表1 AIDS血浆滤过简易反应器前后p24检测结果(pg/ml)

Claims (9)

1.一种用于生物医学领域的艾滋病生物治疗反应器，其特征在于，以外源基因整合CD4+细胞的基因组制备CD4+细胞永生细胞系，所述CD4+细胞永生细胞系能结合HIV和产生细胞因子，再以高生物相容性材料包裹所述CD4+细胞永生细胞系，从而制成既能防止细胞及其碎片以及HIV滤出，又能为CD4+细胞产生细胞因子及CD4+细胞结合HIV提供场所的反应器。

2.根据权利要求1所述的艾滋病生物治疗反应器，其特征在于，所述的CD4+细胞包括CD4+T细胞、CD4+单核细胞、CD4+巨噬细胞、CD4+树突状细胞、通过化学偶联、交联、亲和吸附制成的包被有CD4分子的颗粒。

3.根据权利要求1所述的艾滋病生物治疗反应器，其特征在于，所述的CD4+细胞永生细胞系是以CD4+细胞表面抗体为细胞生长激活剂制备而成。

4.根据权利要求3所述的艾滋病生物治疗反应器，其特征在于，所述的CD4+细胞表面抗体包括抗CD3单克隆抗体、抗CD3/CD28双抗体。

5.根据权利要求1所述的艾滋病生物治疗反应器，其特征在于，所述反应器与血浆分离器相连，当经血浆分离器分离的血浆流经反应器时，HIV与CD4+细胞发生结合或进入胞内而被清除，同时产生的细胞因子随血浆经细胞间隙流出。

6.根据权利要求5所述的艾滋病生物治疗反应器，其特征在于，所述的血浆分离器为空心纤维型，直径为270～370μm、膜厚度为50μm、孔径为0.2～0.6μm、长度为13.5～26μm，仅准许血浆滤过。

7.根据权利要求1-6任一所述的艾滋病生物治疗反应器，其特征在于，所述反应器的容积为200～300ml，进口处设有顶径细胞筛网，顶径细胞筛网目数为800目，出口处设有底径细胞筛网和细胞滤网，底径细胞筛网目数为2.0-5.0目，细胞滤网目数为100目，液体进出口与筛网之间亦设有缓冲区，有利于系统循环的稳定性。

8.根据权利要求7所述的艾滋病生物治疗反应器，其特征在于，所述出口处底径筛网目数制成2.0目、2.5目、3.0目、3.5目、4.0目、4.5目和5.0目的7种不同规格。

9.权利要求1-8任一所述的艾滋病生物治疗反应器在制备体外血液循环装置中的应用，其特征在于，所述体外血液循环装置包括动脉血路管(1)，经肝素泵(2)和血液泵(3)与血浆分离器(4)相连，血浆分离器(4)经血浆泵(6)和第一部分循环管路(7)与2个并联的反应器相连，然后依次与第二部分循环管路(10)、静脉管路(5)相连。