CN102268405B - 自体nk细胞体外活化扩增培养的方法及其专用培养基 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种自体NK细胞体外活化扩增培养的方法及其专用培养基。该方法是利用如下成套培养基并同时添加饲养细胞体外活化扩增自体NK细胞：由培养基1、培养基2和培养基3组成的成套培养基；所述培养基1是在干细胞生长培养基中添加人白细胞介素2、人白细胞介素12、人白细胞介素15、人白细胞介素18、植物血凝素、抗人T细胞CD3单克隆抗体和离体的人血浆得到的液体培养基；所述培养基2与所述培养基1相比，所述培养基2中无所述植物血凝素和所述抗人T细胞CD3单克隆抗体，其它成分均与所述培养基1的相同；所述培养基3与所述培养基2相比，所述培养基3将所述培养基2中的所述离体的人血浆替换为离体的人AB血清，其它成分均与所述培养基2的相同。

Description

自体NK细胞体外活化扩增培养的方法及其专用培养基

技术领域

本发明涉及免疫治疗领域中一种自体NK细胞体外活化扩增培养的方法及其专用培养基。

背景技术

20世纪70年代Kiessling和Herberman首次在小鼠体内发现了一种区别于T细胞杀伤特征的免疫细胞并将其命名为自然杀伤细胞(natural killer cell)(以下，本发明说明书中省略为“NK细胞”)。NK细胞是机体抵抗恶性肿瘤和病毒感染的重要免疫调节细胞，起源于骨髓来源的CD34⁺造血祖细胞，无需有抗体存在或预先致敏便可直接杀伤肿瘤细胞，是肿瘤免疫治疗的重要效应细胞。随着对NK细胞识别人类肿瘤分子机制研究的深入，以NK细胞为基础的抗肿瘤免疫治疗引起重视并取得重大进展。目前有关NK细胞在肿瘤免疫治疗的研究主要集中在自体NK细胞过继免疫治疗、异体NK细胞过继免疫治疗及基因修饰NK细胞免疫治疗等，并已取得显著成效。但如何在保证临床安全性的前提下提高NK细胞体外增殖效率和杀伤活性一直是科研工作者和临床医生共同探索研究的重点。

目前各类动物模型试验都已证明自体NK细胞过继性治疗是安全有效的，Alicie等报道应用自体NK细胞治疗多发性骨髓瘤模型的同源免疫活性小鼠(Alici E，Konstan-tinidis KV，Sutlu T，et al.Exp Hematol，2007，35(12)：1839-1846)，以及Siegler等将体外活化扩增的急性骨髓性白血病(acute myeloid leukemia AML)患者NK细胞对非肥胖糖尿病型重症联合免疫缺陷型(NOD/SCID)小鼠模型中的自体AML芽细胞杀伤都证实这一点(Siegler U，Kalberer CP，Nowbakht P，et al.Leukemia，2005，19(12).2215-2222)。各种临床研究证明自体NK细胞治疗技术是一种安全有效的治疗肿瘤手段。2009年5月1日我国卫生部颁布《医疗技术临床应用管理办法》正式生效，批准在国内开展自体免疫细胞(T细胞、NK细胞)治疗技术并制定相应管理规范，使得探求一种安全有效的自体NK细胞体外活化扩增体系成为可能。

目前主要是从培养基和血清种类，细胞刺激因子，辅助饲养细胞等各方面探索NK细胞高效培养的捷径。体外NK细胞扩增培养体系中，常用培养基分别为CellGro SCGM，RPMI-1640培养基，无血清培养基(X-VIVO TM Serum-free Media)3大类。各培养基的使用效果证实CellGro SCGM培养基比RPMI-1640和X-Vivo10培养基能更有效支持NK细胞生长活化与扩增。SCGM培养基是德国Cell Gro公司研制的一种用于造血干细胞培养的专门培养基(含有一些人源或人基因重组蛋白质)，已通过欧洲药典委员会和欧洲药物治疗管理局认证，可以用于临床。已知IL-2、IL-15、IL-18和IL-12等细胞因子对NK细胞的活化与扩增非常重要，其中IL-15的作用尤为重要。IL-2是体外扩增NK细胞体系中最常用的细胞因子，可以在24h反应期内提高NK杀伤活性并刺激其增殖。近期Strivastava等研究证实IL-15单独或联合IL-2使用通常会导致最低限度NK细胞扩增(Strivastava S，Lundqvist A，Childs RW.Cytotherapy，2008，10(8)：775-783)。大量研究证明细胞因子对NK细胞的活化和扩增是必要的，但是仅有细胞因子并不能刺激NK细胞达到最理想的增殖状态。Alici等在多发性骨髓瘤患者体外NK细胞扩增的研究中使用IL-2和OKT3作为其细胞刺激因子，细胞扩增明显(Alici E，Sutlu T，Bjorkstrand B，Gilljam M，et al.Blood，2008，111(6)：3155-3162)。另外绝大多数研究人员认为NK细胞持续增殖需要在细胞因子的基础上增加额外刺激信号，比如同种异体单核细胞、自体淋巴细胞、促分裂素活性淋巴细胞、脐血间充质干细胞等辅助饲养细胞。目前多采用病毒转染的B淋巴细胞及肿瘤细胞作饲养细胞以提高NK细胞扩增倍数，但其安全性尚待探讨。

总体来说，目前的NK细胞扩增效果仍不能满足实际应用，且安全性较低，临床适用性差。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种自体NK细胞体外活化扩增培养的方法及其专用培养基和含有该专用培养基的产品。该自体NK细胞体外活化扩增培养的方法可有效提高NK细胞的扩增倍数及杀伤活性并增加其安全性，从而使该细胞达到了能应用于临床的细胞质量指标。

本发明所提供的体外培养人NK细胞的成套培养基，由培养基1、培养基2和培养基3组成；所述培养基1是在干细胞生长培养基中添加人白细胞介素2(IL-2)、人白细胞介素12(IL-12)、人白细胞介素15(IL-15)、人白细胞介素18(IL-18)、植物血凝素(PHA)、抗人T细胞CD3单克隆抗体(OKT3)和离体的人血浆得到的液体培养基。

所述培养基2与所述培养基1相比，所述培养基2中无所述植物血凝素(PHA)和所述抗人T细胞CD3单克隆抗体(OKT3)，其它成分均与所述培养基1的相同；

所述培养基3与所述培养基2相比，所述培养基3将所述培养基2中的所述离体的人血浆替换为离体的人AB血清，其它成分均与所述培养基2的相同。

其中，所述培养基1、培养基2和培养基3中，所述人白细胞介素2的终浓度均为500U/ml，所述人白细胞介素12的终浓度均为10ng/ml，所述人白细胞介素15的终浓度均为20ng/ml，所述人白细胞介素18的终浓度均为10ng/ml。

所述培养基1和培养基2中，所述离体的人血浆终浓度均为5％(体积百分比)；

所述培养基1中，所述植物血凝素(PHA)的终浓度为2μg/ml、抗人T细胞CD3单克隆抗体(OKT3)的终浓度为100ng/ml；

所述培养基3中，所述离体的人AB血清的终浓度为5％(体积百分比)。

所述抗人T细胞CD3单克隆抗体(OKT3)具体可为鼠抗人T细胞CD3单克隆抗体。

上述成套培养基中，所述干细胞生长培养基是德国CellGro公司生产的SCGM培养基。

上述成套培养基可按照包括如下步骤的方法制备：分别制备所述培养基1、所述培养基2和所述培养基3，再将所述培养基1、所述培养基2和所述培养基3分别进行独立包装，得到所述成套培养基。

本发明还提供了体外培养人NK细胞的产品。

本发明所提供的体外培养人NK细胞的产品，由上述体外培养人NK细胞的成套培养基和饲养细胞组成，所述成套培养基和所述饲养细胞均独立包装；所述饲养细胞为将离体的人PBMC细胞经射线辐照后得到的细胞；所述饲养细胞和所述成套培养基中的所述离体的人血浆均来自同一个体。

所述饲养细胞具体可为将离体的人PBMC细胞经30Gyγ射线辐照后得到的细胞。

所述γ射线辐照中的辐照速率具体可为200cGy/min。

体外培养人NK细胞的产品可按照包括如下步骤的方法制备：将所述成套培养基和所述饲养细胞分别独立包装，得到所述体外培养人NK细胞的产品。

所述饲养细胞可放入瓶中，该饲养细胞瓶可装入如下包装盒：钢精铝质圆筒，直径6cm，高10cm，泡沫塑料内架设置凹槽(直径2.5cm，高8cm)。将饲养细胞瓶完全包埋在内架中央。此包装盒适于-80℃保存及干冰冷冻运输。

本发明所提供的利用上述任一所述的产品体外培养人NK细胞的方法，包括以下步骤：1)将离体的人NK细胞作为种子加入所述培养基1中并添加所述饲养细胞培养3-4天后，将经所述培养基1培养的人NK细胞转入所述培养基2中并添加所述饲养细胞培养至第14天，第15天开始将经所述培养基2培养的人NK细胞转入所述培养基3中并添加所述饲养细胞进行培养，直至第21天得到扩增后的人NK细胞；上述培养时间均以接入所述培养基1的时刻为0时刻；

所述离体的人NK细胞、所述饲养细胞和所述离体的人血浆来自于同一个体。

所述饲养细胞和所述离体的人NK细胞可按照10∶1的个数比加入所述培养基1，所述饲养细胞和所述经所述培养基1培养的人NK细胞可按照10∶1的个数比加入所述培养基2，所述饲养细胞和所述经所述培养基2培养的人NK细胞可按照10∶1的个数比加入所述培养基3。所述培养基1、所述培养基2和所述培养基3中，所述饲养细胞的含量均可为2×10⁶个/ml。

所述离体的人NK细胞、所述饲养细胞和上述任一成套培养基中的所述离体的人血浆来自于同一个体。

所述方法中，所述培养的条件可均为35℃-37℃、空气中CO₂体积含量为4.0％-10.0％和CO₂流速为0.10L/min-0.25L/min。

所述方法中，所述温度具体可为37℃，所述空气中CO₂体积含量具体可为5.0％，所述CO₂流速具体可为0.15L/min。

本发明方法扩增得到的人NK细胞是CD3^-CD56⁺NK细胞，本发明的方法使体外自体NK细胞的扩增效果增强，经过三周的培养NK细胞大量增殖，NK细胞纯度达到96.83％，NK细胞总数扩增了137倍，经流式细胞仪检测得NK细胞活化性受体上调。

本发明方法扩增得到的人NK细胞可用于治疗患者自体的疾病或阻滞疾病(尤其是癌症、免疫缺陷病等疾病)发展。自体NK细胞非肿瘤细胞系，直接输注患者体内不具有增殖成瘤的危险性，安全性更高。以患者自体外周单个核细胞(PBMC)来源的NK细胞作为饲养细胞，无异体肿瘤细胞，与采用病毒转染的B淋巴细胞及肿瘤细胞作饲养细胞的自体NK细胞扩增法相比安全性更高；用患者自体血浆代替动物血清，在伦理学方面患者易于接受。活化扩增后的NK细胞在体外对肿瘤细胞(K562细胞、HO-8910细胞、自体原代卵巢癌细胞)的杀伤活性是活化扩增前的NK细胞的2倍以上，活化扩增后的NK细胞在体内对早期和晚期荷人卵巢癌腹水瘤裸鼠均有治疗作用，具体表现为用本发明方法扩增得到的人NK细胞治疗后的早期荷人卵巢癌腹水瘤裸鼠中位生存期由治疗对照组的65天延长至117天；用本发明方法扩增得到的人NK细胞治疗后的晚期荷人卵巢癌腹水瘤裸鼠中位生存期由治疗对照组的64天延长至95天。外源性因子(细菌、支原体、真菌、病毒及添加成分残留等)和PCR等检测结果表明，本发明方法扩增得到的人NK细胞的安全性符合临床研究的相关标准。

本发明从临床安全性、有效性的角度提高NK细胞的扩增倍数及活性，并从NK细胞来源，培养基和血清种类，细胞刺激因子，辅助饲养细胞等各方面条件联合培养细胞，以期优化NK细胞体外扩增的效率及杀伤活性，为NK细胞的进一步临床应用奠定基础。

附图说明

图1为卵巢癌患者(低分化浆液性腺癌)癌组织HE染色图片

图2为原代卵巢癌细胞镜下图片

图3为扩增活化前NK细胞表面分子的表达情况

图4为NK细胞在培养基1、培养基2和培养基3中的生长速率

图5为扩增活化后NK细胞表面分子的表达情况

图6为不同效靶比NK细胞(扩增前)对K562细胞、HO-8910细胞和自体原代卵巢癌细胞的杀伤率

图7为活化扩增前后的NK细胞对K562细胞杀伤活性的变化

图8为活化扩增前后的NK细胞对Ho-8910细胞杀伤活性的变化

图9为活化扩增前后的NK细胞对自体原代卵巢癌细胞杀伤活性的变化

图10为不同效靶比NK细胞(扩增活化后)对K562细胞、HO-8910细胞和自体原代卵巢癌细胞的杀伤率

图11A为腹腔注射2×10⁶个Ho-8910细胞第21天鼠荷瘤情况

图11B为早期治疗组和治疗对照组两组鼠腹围

图11C为早期治疗组和治疗对照组两组鼠生存率

图12A为腹腔注射2×10⁶个Ho-8910细胞第35天鼠荷瘤情况

图12B为晚期治疗组和治疗对照组两组鼠腹围

图12C为晚期治疗组和治疗对照组两组鼠生存率

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可以从商业途径得到。

材料：

MACS磁珠购自Miltemyi Biotec公司，胎牛血清购自美国Hyclone公司，CellGroSCGM细胞培养基购自德国CellGro公司，RPMI-1640培养基购自美国GIBCO公司，人白细胞介素2(IL-2)购自北京四环生物制药有限公司、国药准字：S10970015，人白细胞介素12(IL-12)购自PEPROTECH公司、商品目录号：200-12，人白细胞介素15(IL-15)购自PEPROTECH公司、商品目录号：200-15，人白细胞介素18(IL-18)购自PROSPEC公司、商品目录号：CYT-269，植物血凝素(PHA)购自sigma公司、商品目录号：L8754，抗人T细胞CD3鼠单抗(OKT3)购自武汉生物制品研究所、国药准字：S19990012，人AB血清购自上海佳伦生物科技有限公司、商品目录号：JL1010，⁵¹Cr购自中国同位素总公司，人红白血病细胞系K562购自中国科学院上海细胞研究所，人卵巢癌细胞株Ho-8910购自中国科学院上海细胞生物研究所细胞库，裸鼠购于南京大学动物模式研究所，青霉素-链霉素溶液(100×)购自上海碧云天生物技术有限公司。

CO₂细胞培养箱购自ThermoForma公司，SW-CJ-2FB型双人水平垂直两用净化工作台购自苏州净化公司，倒置生物显微镜XDS-1B购自重庆奥特显微镜厂，pH计Delta320购自Mettler-Toledo，数显恒温水浴箱HH-2购自江苏金坛市环宇科学仪器厂，78-1型磁力加热搅拌器购自江苏安普电子工程有限公司，超低温冰箱购自Harris Manufa-cturing CO公司，离心管(50ml，20ml)购自Corning公司，25cm²矩形培养瓶购自Corning公司，移液管(10ml、25ml)购自Costar STRIPETTE公司，电动移液枪购自Dragon MED公司，冻存管购自Corning公司，常温离心机1-15K购自Sigma公司，低温冷冻离心机1-15K购自Sigma公司，低温冷冻离心机ROTAN4R购自Sigma公司，γ射线辐照仪(Biobeam 2000)购自德国BIOBEAM公司，γ-计数仪(GC-911)购自安徽中科中佳科学仪器有限公司，β-液体闪烁计数仪(FJ-2107A)购自西安262厂。

实验方法

本发明涉及的NK细胞来自血液样本。血液样本的采集可来源于各种免疫缺陷疾病患者的血液：自身免疫性疾病(溶血性贫血，系统性红斑狼疮，糖尿病等)、传染性疾病(肺结核，艾滋病等)以及恶性血液疾病(急性髓细胞性白血病，慢性淋巴细胞白血病等)或癌症(多发性骨髓瘤，肾癌等)。为多方面充分评价自体NK细胞的安全性和有效性，下述实施例选取的血液样本来自于卵巢癌患者(浆液性)。

NK细胞可以通过目前已知的各种方法纯化，例如可通过抗体标记流式细胞仪分选、Percoll不连续密度梯度离心法、Panning法、补体裂解法、绵羊红细胞花环法、试剂盒分选法。下述实施例1采用NK细胞分离试剂盒，用MACS法分选纯化NK细胞。

下述实施例1中的扩增活化前的NK细胞均按照如下方法获取：

1、外周血标本：肝素钠抗凝管采集卵巢癌患者外周血50ml，并经患者同意。

2、自体血浆制备：取50ml患者外周血，经1500rpm×5min低速离心后吸取上层淡黄色血浆即为自体血浆，置4℃冰箱备用。

3、外周血单个核细胞的分离：

Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞。

1)取剩余抗凝血与PBS 1∶1充分混匀。

2)短管中加入等体积的淋巴细胞分离液(购自天津灏洋生物制品科技有限责任公司，商品目录号：CDS1075)，用滴管沿管壁将血液缓慢加于分离液面上，注意保持清楚的界面。水平离心1500-2000rpm×20分钟。离心机升速为1，降速为0。

3)离心后管内分为三层，上层为血浆和PBS液，下层主要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。

4)用毛细管插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一短中管中，加入5倍以上体积的PBS，1500rpm×10分钟，洗涤细胞两次。短中管中即为分离所得的外周血单个核细胞(PBMCs)

4、自体饲养细胞的制备：步骤3中所得的外周血单个核细胞(PBMCs)分为两部分，第一部分用于分选高纯度的NK细胞，第二部分用以¹³⁷Cs为辐照源的γ射线进行辐照作为饲养细胞。所述辐照的剂量可为20Gy-100Gy。所述辐照的速率可为50cGy/min-200cGy/min。下述实施例1的饲养细胞是将外周血单个核细胞(PBMCs)进行如下以¹³⁷Cs为辐照源的γ射线辐照得到的：辐照剂量为30Gy，辐照的速率为200cGy/min。

5、MACS法分选高纯度的NK细胞：利用NK细胞分选试剂盒(NK Cell IsolationKit II，德国Miltenyi Biotec公司，商品目录号：130-091-152)按照如下方法分离NK细胞：计数步骤3中所得的第一部分PBMCs，准备磁珠标记并用流式细胞仪分析扩增前NK细胞的含量(绝对值及百分比)。将细胞1500rpm×10min离心后弃上清，按40ul/10⁷个细胞加入MACS buffer重悬细胞，按照10ul/10⁷个细胞加入生物素一抗(NKcell Biotin Antibody Cocktail)混匀后4℃孵育10min，按30ul/10⁷个细胞加入MACSbuffer同时按20ul/10⁷个细胞加入生物素二抗(NK cell MicroBeads Cocktail)混匀后4℃孵育15min，离心弃上清，按500ul/10⁸个细胞重悬细胞。将LS分离柱放置在分离器(Vario MACS)上，下方放置12ml无菌离心管，将3mlMACS buffer缓冲释液缓慢加入分选柱中，待buffer开始滴下时加入细胞悬液，收集未标记的细胞，待细胞悬液通过时用3ml buffer洗柱3次，试管中的细胞即为NK细胞(扩增前的NK细胞)。

下述实施例1中的NK细胞的生物学特性均按照下述方法检测：

一、流式细胞仪分析MACS分选后NK细胞的情况及表面分子

①使用流式细胞仪检测NK细胞表面分子(CD3、CD56、NKp30，NKp44，NKp46和NKG2D)的表达，所述抗体如表1所示：

表1流式细胞仪检测所用抗体

特异性荧光抗体	克隆号	类型	荧光	公司	商品目录号
						CD3	UCHT1	Mouse IgG1，κ	FITC	BD Pharmingen	555332
CD56	MEM188	Mouse IgG2a，κ	FITC	eBioscience	11-0569
						CD56	B159	Mouse IgG1，κ	PE	BD Pharmingen	555516
NKp30	P30-15	Mouse IgG1，κ	PE	BD Pharmingen	325208
						NKp44	P44-8.1	Mouse IgG1，κ	PE	BD Pharmingen	558563

NKp46	9E2/NKp46	Mouse IgG1，κ	PE	BD Pharmingen	557991
						NKG2D	1D11	Mouse IgG1，κ	PE	eBioscience	12-5878

②细胞免疫表型分析

1、NK细胞纯度的检测

I待测标本的处理

(1)取培养前后的NK细胞(已通过MACS分选)，1×PBS洗涤2次，调整细胞数至1×10⁶/ml，分装1.5mlEppendorf管，每管100ul(约1-5×10⁵个细胞)；

(2)设空白管(不加荧光抗体)、单标管(CD3-FITC，CD56-PE)和标本管(CD3-FITC/CD56-PE)；

(3)加入10ul小鼠血清，以阻断FC受体(空白对照管除外)，4℃避光放置30min；样本管各加入荧光标记单克隆抗体各2ul，4℃避光放置30min；

(4)1×PBS洗涤2次，200ul PBS重悬细胞，上机检测。

II流式细胞仪检测及分析

(1)采用488nm激发光源，使用标准微球(CaliBRITE Beads，BD公司)调试仪器，使各参数变异系数小于2％，调整补偿；

(2)检测对照管，建立二维散点图，在散点图上调整参数前向角散射/侧向角散射(FSC/SSC)，调整域值，排除碎片和噪声的干扰，圈定待测NK细胞设门以获取细胞；

(3)建立抗FITC-CD3、PE-CD56双参数图，并对这群细胞上CD3和CD56的表达进行定量检测。将对照管荧光强度设为非特异本底荧光，并在此基础上确定阳性荧光表达率；

(4)每个样本均获取10000个细胞，数据以List mode形式储存，采用CellQuest功能软件进行分析。了解CD56⁺CD3^-NK细胞纯度。

2、NK细胞表面活化性受体(NKp30，NKp44，NKp46和NKG2D受体)的测定

I待测标本的处理

(1)取培养前后的NK细胞(已通过MACS分选)，1×PBS洗涤2次，调整细胞数至1×10⁶/ml，分装1.5mlEppendorf管，每管100ul(约1-5×10⁵个细胞)；

(2)设空白管(不加荧光抗体)、单标管(CD56-FITC，NKp30-PE)和标本管(CD56-FITC/NKp30-PE)；

(3)加入10ul小鼠血清，以阻断FC受体(空白对照管除外)，4℃避光放置30min；样本管各加入荧光标记单克隆抗体各2ul，4℃避光放置30min；

(4)1×PBS洗涤2次，200ul PBS重悬细胞，上机检测。

II流式细胞仪检测及分析

(1)采用488nm激发光源，使用标准微球(CaliBRITE Beads，BD公司)调试仪器，使各参数变异系数小于2％，调整补偿；

(2)检测对照管，建立二维散点图，在散点图上调整参数前向角散射/侧向角散射(FSC/SSC)，调整域值，排除碎片和噪声的干扰，圈定待测NK细胞设门以获取细胞；

(3)建立抗FITC-CD56、PE-NKp30双参数图，并对这群细胞上CD56和NKp30的表达进行定量检测。将对照管荧光强度设为非特异本底荧光，并在此基础上确定阳性荧光表达率；

(4)每个样本均获取10000个细胞，数据以List mode形式储存，采用CellQuest功能软件进行分析。了解CD56⁺NK细胞NKp30的表达率。

III其他活化性受体的测定

NKp44，NKp46和NKG2D受体的表达遵照步骤I、II进行测定。

二、4h⁵¹Cr释放法检测NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性

该实验中所检测的肿瘤细胞是K562细胞、HO-8910细胞、自体原代卵巢癌细胞。

自体肿瘤细胞的获取和纯化

①肿瘤细胞的获取

术中取卵巢癌患者新鲜肿瘤组织，将其浸入含200U/ml青霉素及200μg/ml链霉素的DMEM/F-12培养基中，30min内送细胞培养室。无菌PBS冲洗3遍，去除血管、坏死组织，剔除血块。用眼科剪将组织剪成约1mm³大小，然后加入等体积的0.6％的胶原酶，37℃恒温水箱内振荡消化3小时。加入含血清培养基终止消化，100目滤网过滤，滤液1000r/min离心5min，弃上清。用DMEM/F-12培养基离心洗涤2次。用含10％胎牛血清的DMEM/F-12培养基悬浮沉淀块，吹打管轻缓吹匀，计数细胞，以5×10⁵/ml的密度将细胞接种于培养瓶中，置37℃、5％CO₂孵箱中培养。

②肿瘤细胞的纯化

用反复贴壁法纯化原代卵巢癌细胞。

根据肿瘤细胞与成纤维细胞贴壁快慢的差异，可以把2种细胞分开。用消化酶消化细胞，接种到培养瓶后，加入培养基，将培养瓶(A)放置37℃、10-20分钟左右，将培养上清倒到另一培养瓶(B)，加入新培养基，放置37℃、10-20分钟，将B瓶上清倒入C瓶，置37℃培养。将A、B、C瓶于37℃培养24h-48h后于显微镜下观察，将含有成纤维细胞的培养瓶弃去，保留含上皮细胞的培养瓶，如果上皮细胞中仍含有成纤维细胞，可按上述方法继续重复处理，直到成纤维细胞去除。图1为实施例中该卵巢癌患者癌组织HE染色图片，图2为从该卵巢癌患者癌组织分离得到的原代卵巢癌细胞镜下图片。

实施例1、体外扩增活化人自体NK细胞

一、体外培养人自体NK细胞的成套培养基

该成套培养基由培养基1、培养基2和培养基3组成。其中，培养基1、培养基2和培养基3均是在CellGro SCGM细胞培养基(德国CellGro公司，商品目录号：2001)的基础上添加其它物质得到的。

培养基1是在CellGro SCGM细胞培养基中添加人白细胞介素2(IL-2)、人白细胞介素12(IL-12)、人白细胞介素15(IL-15)、人白细胞介素18(IL-18)、植物血凝素(PHA)、抗人T细胞CD3鼠单抗(OKT3)和离体的人自体血浆得到的液体培养基。

培养基2是在CellGro SCGM细胞培养基中添加人白细胞介素2(IL-2)、人白细胞介素12(IL-12)、人白细胞介素15(IL-15)、人白细胞介素18(IL-18)和离体的人自体血浆得到的液体培养基。

培养基3是在CellGro SCGM细胞培养基中添加人白细胞介素2(IL-2)、人白细胞介素12(IL-12)、人白细胞介素15(IL-15)、人白细胞介素18(IL-18)和离体的人AB血清得到的液体培养基。

所述培养基1、培养基2和培养基3中，所述人白细胞介素2的终浓度均为500U/ml，所述人白细胞介素12的终浓度均为10ng/ml，所述人白细胞介素15的终浓度均为20ng/ml，所述人白细胞介素18的终浓度均为10ng/ml。

所述培养基1、培养基2中，所述离体的人自体血浆终浓度均为5％(体积百分比)；

所述培养基1中，所述植物血凝素(PHA)的终浓度为2μg/ml、抗人T细胞CD3鼠单克隆抗体(OKT3)的终浓度为100ng/ml；

所述培养基3中，所述离体的人AB血清的终浓度为5％(体积百分比)。

二、培养基的检测

培养基1、培养基2和培养基3依照2010年版《中国药典》生物制品(三部)中附录XIII B《无菌检查法》、附录XIII D《细菌内毒素检查法》进行抽样的质量控制实验，检测无菌和内毒素水平以保证该培养基可支持NK细胞的生长及维持扩增后的抗癌活性。结果显示，供试品符合无菌检查法的规定，在规定检验条件下未发现微生物污染；供试品溶液所有平行管的平均内毒素浓度乘以稀释倍数后，小于规定的内毒素限值，符合规定。

三、NK细胞体外扩增培养

(1)培养板培养

作为种子的离体的人NK细胞(扩增活化前NK细胞)使用流式细胞仪检测NK细胞表面分子的表达。结果如图3所示，该扩增活化前NK细胞为CD3^-CD56⁺NK细胞，表达自然杀伤细胞活化性受体：NKp30，NKp44，NKp46和NKG2D受体。图3中CD3^-CD56⁺NK细胞所占比例为98.02％(即NK细胞纯度)，在CD56⁺NK细胞中，NKG2D、NKp46、NKp44和NKp30的表达率分别为59.78％、51.28％、74.38％、93.83％。

将上述作为种子的离体的人NK细胞按照2×10⁵个/ml的密度，每孔1ml接种于24孔培养板(装有培养基1)中，并同时添加饲养细胞，每孔中的饲养细胞是2×10⁶个(按照10∶1的比例添加)。每三天对孔中的液体进行半量换液，第五天将从培养基1中收集的离体的人NK细胞以2×10⁵个/ml的密度接种于装有培养基2的24孔培养板中，并同时添加饲养细胞，每孔中的饲养细胞的密度是2×10⁶个/ml；第八至第十天将该24孔培养板中的离体的人NK细胞以2×10⁵个/ml的密度接种于装有培养基2的6孔培养板中，并同时添加饲养细胞，每孔中的饲养细胞的密度是2×10⁶个/ml，培养至第十四天。作为种子的离体的人NK细胞(扩增活化前NK细胞)，饲养细胞与步骤一的体外培养人自体NK细胞的成套培养基中的离体的人血浆均来自于同一卵巢癌患者。

上述培养条件均为37℃，5％CO₂孵箱培养，CO₂的流速为0.15L/min。上述培养时间均以接入培养基1的时刻为0时刻。

(2)培养瓶培养

第15天将从6孔培养板中收集的离体的人NK细胞用无菌PBS洗涤(800rpm 10min25℃)两遍后，以2×10⁵个/ml的密度分别接种于装有5ml培养基3的25cm²培养瓶中，并同时添加饲养细胞，饲养细胞的密度是2×10⁶个/ml(按照10∶1的比例添加)。传入培养瓶中培养后每隔1-2天要进行一次活细胞计数，按需要加入新鲜培养基，第二十一天收集细胞，得到活化扩增后NK细胞。上述培养条件均为37℃，5％CO₂孵箱培养，CO₂的流速为0.15L/min。接入培养基3的离体的人NK细胞的生长曲线如图4所示。上述培养时间均以接入培养基1的时刻为0时刻。图4中的0时刻是接入培养基1的时刻。上述培养的条件均为37℃，所述空气中CO₂体积含量为5.0％，所述CO₂流速为0.15L/min。

图3所示扩增活化前NK细胞中CD3^-CD56⁺NK细胞所占比例(即NK细胞纯度)为98.02％，图4所示扩增培养后NK细胞总数由培养第一天的1×10⁶个增加至第二十一天的1.37×10⁸个，表明经过三周的培养NK细胞大量增殖，NK细胞纯度达到96.83％(如图5所示)，NK细胞总数扩增了137倍，本发明的方法使体外自体NK细胞的扩增效果增强。

四、体外活化扩增的自体NK细胞效果监测

1、流式细胞仪检测NK细胞表面分子

将步骤三得到的活化扩增后NK细胞使用流式细胞仪检测NK细胞表面分子的表达。结果如图5所示，该离体的人NK细胞为CD3^-CD56⁺NK细胞，表达自然杀伤细胞活化性受体：NKp30，NKp44，NKp46和NKG2D受体。图5中CD56⁺CD3^-NK细胞所占比例为96.83％(即NK细胞纯度)，在CD56⁺NK细胞中，NKG2D、NKp46、NKp44和NKp30的表达率分别为77.51％、48.01％、96.65％、95.13％。表明，较活化扩增前相比(图3)自然杀伤细胞活化性受体：NKp30，NKp44和NKG2D受体表达上调。

2、有效性检测

(1)体外试验

4h⁵¹Cr释放法检测NK细胞对K562细胞、HO-8910细胞、自体原代卵巢癌细胞的杀伤活性

收集靶细胞K562细胞、HO-8910细胞、自体原代卵巢癌细胞(与步骤三的活化扩增后NK细胞均来自于同一卵巢癌患者)，按每10⁶个细胞加入100uci⁵¹Cr进行标记，37℃，孵育1小时，标记的过程中每5-10min摇晃一次，混匀细胞。标记结束后，用含10％胎牛血清的完全1640培养基洗涤细胞4次，3000rpm，10分钟，20℃，共三次。

使用1640培养液将细胞浓度调整为1×10⁵/ml，备用；步骤三的活化扩增后NK细胞或步骤三的扩增活化前NK细胞为效应细胞。4小时⁵¹Cr释放实验：在96孔圆底细胞培养板中加入⁵¹Cr标记的靶细胞，每孔加入100ul。根据效应细胞与靶细胞的比例(按效靶比分别为1∶1、2∶1、5∶1、10∶1和20∶1)调整效应细胞(步骤三得到的活化扩增前后的NK细胞)浓度，并向各孔中加入NK细胞，体积为100ul/孔。自然释放孔不加效应细胞只加100ul的1640培养液，最大释放孔中加100ul 2％Triti-on-X100(TX)。每个实验重复3次，每次重复置四个复孔。短暂离心后37℃，5％CO₂，培养4小时。1000rpm，10分钟，离心培养板，每孔吸出100ul上清液于检测管中，在γ计数仪上测定上清液中的每分钟放射性活性(cpm值)。每次试验要求自然释放组cpm值小于最大释放组cpm值的25％。按下列公式计算杀伤活性：

表2⁵¹Cr检测活化扩增前后NK细胞对靶细胞的杀伤率(％)

如图6-10和表2所示，⁵¹Cr释放法检测活化扩增前后NK细胞对K562细胞、HO-8910细胞、自体原代卵巢癌细胞的杀伤效果，结果显示步骤三得到的活化扩增后NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性明显增高，且随着效靶比升高，杀伤活性随之升高(图7、图8、图9)。以上结果表明活化扩增的自体NK细胞可在卵巢癌患者体内发挥抗肿瘤效应。(图6、10)

(2)体内试验

NK细胞对荷人卵巢癌腹水瘤裸鼠的治疗作用

I.裸鼠荷人卵巢癌腹水瘤模型的构建及检测

①HO-8910细胞的准备：收集细胞前换液，使细胞处于良好的状态。收集处于对数生长期的HO-8910细胞，0.25％胰蛋白酶消化后，转移到50ml离心管中，800rpm，10min，20℃离心，无血清1640培养基或PBS重悬细胞，洗涤2次。台盼蓝染色计算活率≥95％，将细胞调制浓度为1.0×10⁷cells/ml细胞悬液，备用。

②实验动物：取裸鼠(Balb/C背景)，雌性，3-5周龄，SPF级，40只，体重为14-16g，随机分为4组，10只/组。

③接种：将已准备好的细胞悬液用1ml注射器经腹腔注射到30只裸鼠体内，200ul每只鼠，模型对照组的10只裸鼠每只腹腔注入200ul无血清1640培养基。

④观察指标：接种后裸鼠给予正常饮食，观察小鼠精神状态、活动情况，监测体重及腹围变化。

⑤成瘤的判断：接种后裸鼠出现腹围增加明显，腹部触及瘤体，活动减少，消瘦等症状即判断为成瘤。

⑥病理组织学检查：脱臼处死裸鼠后，打开腹腔，可见转移的实体肿瘤组织，取瘤组织及腹水行病理学检查，HE染色，镜下见癌细胞核大、深染，可有核分裂象，核仁明显，部分区域见凝固性坏死。组织病理学形态与人卵巢浆液性囊腺癌相符，提示成功建立裸鼠荷人卵巢癌腹水瘤模型。30只裸鼠荷人卵巢癌腹水瘤模型鼠均分为3组，即治疗对照组、早期治疗组和晚期治疗组。其中，治疗对照组仅腹腔注射H0-8910细胞，早期治疗组在注入Ho-8910细胞后第21天过继转输步骤三活化扩增后的NK细胞，晚期治疗组在注入Ho-8910细胞后第35天过继转输步骤三活化扩增后的NK细胞。

II.NK细胞对荷人卵巢癌腹水瘤裸鼠的治疗作用

将早期治疗组的10只小鼠在注入Ho-8910细胞后第21天过继转输步骤三活化扩增后的NK细胞，NK细胞浓度6.67×10⁷/ml，10μl/只。肉眼观，早期治疗组的小鼠在注入Ho-8910细胞后第21天未过继转输NK细胞时无明显腹隆，腹部可触及实体瘤组织，视为早期肿瘤(图11A)，治疗后小鼠的腹围较对照组(治疗对照组)小(图11B)，说明治疗后的小鼠肿瘤进展缓慢，观察到140天，治疗组(早期治疗组)仍有30％的小鼠存活，中位生存期由治疗对照组的65天延长至117天(图11C)。

将晚期治疗组的10只小鼠在注入Ho-8910细胞后第35天过继转输步骤三活化扩增后的NK细胞，NK细胞浓度6.67×10⁷/ml，10μl/只。晚期治疗组的小鼠在注入Ho-8910细胞后第35天未过继转输NK细胞时腹隆明显，盆腔可见实体瘤组织，肝、脾及肠组织可见肿瘤转移，视为晚期肿瘤(图12A)，虽然小鼠最终死于肿瘤，但中位生存期由治疗对照组的64天延长至95天(图12B、图12C)。结果表明，活化扩增后的NK细胞对早期和晚期荷瘤鼠均有治疗作用。

3、安全性检测

(一)NK细胞输注剂的制备

在细胞状态良好且数量达到2×10⁹个以上时可开始收集细胞，将细胞离心收集后用无菌生理盐水洗涤3次，配制成100ml的生理盐水细胞悬液，临床使用前，用5％人血清白蛋白洗涤以防止细胞聚集。

(二)NK细胞输注剂外源性因子检测

依照2010年版《中国药典》生物制品(三部)中《生物制品生产和检定用动物细胞基质制备及检定规程》对NK细胞输注剂进行外源性因子(细菌、支原体、真菌、病毒及添加成分残留等)的检测。

(1)细胞形态检查

自体NK细胞在使用前，对其培养物进行外观检查和镜检，经检测无任何可疑、异常和病变。

(2)对照细胞检查

每批所得原代细胞留取5％悬液，细胞浓度和处理均与该批次输注剂制备过程相同，至少观察14天，并作下列各项检查。

①无菌检查

依法检查，结果为阴性，符合规定【依照《中国药典》生物制品(三部)附录XII A】。

②支原体检查

依法检查，结果为阴性，符合规定【依照《中国药典》生物制品(三部)附录XII B】。

③病毒污染检查

PCR检测NK细胞输注剂HIV、HCV、HSV1/2和CMV均为阴性【依照《中国药典》生物制品(三部)附录XII C】。

检测结果均符合临床研究的相关标准，可输注。

Claims (7)

1. 体外培养人NK细胞的成套培养基，由培养基1、培养基2和培养基3组成；所述培养基1是在干细胞生长培养基中添加人白细胞介素2、人白细胞介素12、人白细胞介素15、人白细胞介素18、植物血凝素、抗人T细胞CD3单克隆抗体和离体的人血浆得到的液体培养基；

所述培养基2与所述培养基1相比，所述培养基2中无所述植物血凝素和所述抗人T细胞CD3单克隆抗体，其它成分均与所述培养基1的相同；

所述培养基3与所述培养基2相比，所述培养基3将所述培养基2中的所述离体的人血浆替换为离体的人AB血清，其它成分均与所述培养基2相同；

所述人NK细胞和所述离体的人血浆来自于同一个体；

所述培养基1、培养基2和培养基3中，所述人白细胞介素2的终浓度均为500U/ml，所述人白细胞介素12的终浓度均为10ng/ml，所述人白细胞介素15的终浓度均为20ng/ml，所述人白细胞介素18的终浓度均为10ng/ml；

所述培养基1和培养基2中，所述离体的人血浆按体积比浓度为5%；

所述培养基1中，所述植物血凝素的终浓度为2μg/ml、抗人T细胞CD3单克隆抗体的终浓度为100ng/ml；

所述培养基3中，所述离体的人AB血清按体积比浓度为5%；

所述干细胞生长培养基是德国CellGro公司生产的SCGM培养基。

2.体外培养人NK细胞的产品，由权利要求1所述的体外培养人NK细胞的成套培养基和饲养细胞组成，所述成套培养基和所述饲养细胞均独立包装；所述饲养细胞为将离体的人PBMC细胞经射线辐照后得到的细胞；所述饲养细胞和所述成套培养基中的所述离体的人血浆均来自同一个体；

所述饲养细胞为将离体的人PBMC细胞经30Gyγ射线辐照后得到的细胞。

3.根据权利要求2所述的产品，其特征在于：所述γ射线辐照中的辐照速率为200 cGy/min。

4. 权利要求1所述的成套培养基的制备方法，包括如下步骤：分别制备所述培养基1、所述培养基2和所述培养基3，再将所述培养基1、所述培养基2和所述培养基3分别进行独立包装，得到所述成套培养基。

5. 权利要求2或3所述产品的制备方法，包括如下步骤：将按照权利要求4所述的方法制备得到的成套培养基和权利要求2或3所述的饲养细胞分别独立包装，得到所述体外培养人NK细胞的产品。

6. 利用权利要求2或3所述的产品体外培养人NK细胞的方法，包括以下步骤： 1）将离体的人NK细胞作为种子加入所述培养基1中并添加所述饲养细胞培养3-4天后，将经所述培养基1培养的人NK细胞转入所述培养基2中并添加所述饲养细胞培养至第14天，第15天开始将经所述培养基2培养的人NK细胞转入所述培养基3中并添加所述饲养细胞进行培养，直至第21天得到扩增后的人NK细胞；上述培养时间均以接入所述培养基1的时刻为0时刻；

所述离体的人NK细胞、所述饲养细胞和所述离体的人血浆来自于同一个体；

所述饲养细胞和所述离体的人NK细胞按照10:1的个数比加入所述培养基1，所述饲养细胞和所述经所述培养基1培养的人NK细胞按照10:1的个数比加入所述培养基2，所述饲养细胞和所述经所述培养基2培养的人NK细胞按照10:1的个数比加入所述培养基3；

所述方法中，所述培养的条件均为35℃-37℃、空气中CO₂体积含量为4.0%-10.0%和CO₂流速为0.10L/min-0.25 L/min。

7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述方法中，所述培养的条件均为37℃、空气中CO₂体积含量为5.0%和CO₂流速为0.15 L/min。

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