CN106267420B

CN106267420B - Hiv吞噬细胞器

Info

Publication number: CN106267420B
Application number: CN201610539278.5A
Authority: CN
Inventors: 翁炳焕; 李兰娟; 潘小平; 虞晓鹏; 严恺
Original assignee: Individual
Current assignee: Shu Lan Hangzhou Hospital Ltd; Women's Hospital, School of Medicine, Zhejiang University
Priority date: 2016-07-01
Filing date: 2016-07-01
Publication date: 2019-01-22
Anticipated expiration: 2036-07-01
Also published as: CN106267420A

Abstract

本发明涉及生物医学领域的HIV吞噬细胞器，其特征在于以免疫磁珠法分离出CD14细胞，进而制备既保留原巨噬细胞特性又能无限生长的杂交瘤巨噬细胞株，选择对HIV强吞噬性的克隆作扩增培养和保存，将由此制备的杂交瘤巨噬细胞株以高生物相容性材料包裹而制备能防止细胞及其碎片甚至HIV滤出的、能为细胞株吞噬HIV提供场所的细胞器，与血浆分离器构成体外循环，分离的血浆经细胞器滤出后，其中的HIV被巨噬细胞株吞噬清除，同时产生的抗感染巨噬细胞因子随血浆回输体内，从而实现既清除HIV又补充所需巨噬细胞因子的艾滋病杂交瘤技术体外新疗法，比局限于在体内杀灭HIV但又难以实现的传统疗法更可行而无毒副作用。

Description

HIV吞噬细胞器

技术领域

本发明涉及生物医学领域中HIV吞噬细胞器，主要通过人工产业制备HIV敏感细胞，用于体外吞噬血浆中的游离的HIV，达到治疗艾滋病的目的。

背景技术

艾滋病是由人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)引起的传染病，在全球广泛流行，根据世界卫生组织(WHO)和联合国艾滋病规划署的有关报告，自1981年美国发现首例艾滋病病例以来，至今全球有208个国家和地区受到了艾滋病的严重威胁，约有4000万人感染了艾滋病，死亡人数已超过2000万，每天约有6000人成为艾滋病感染者，同时每天约有300多人死于艾滋病。在中国HIV感染者正处于高速增长期，目前已远超过100万。艾滋病已经成为继肿瘤、心脑血管疾病、结核病、糖尿病后又一个人类面临的重大感染性疾病，已成为全球关注的严重的公共卫生和社会问题。

HIV是感染人类免疫细胞的反转录病毒，直径约120纳米，大致呈球形，外膜是类脂包膜(来自宿主细胞)，并嵌有病毒的蛋白gp120与gp41，gp41是跨膜蛋白，gp120位于表面，并与gp41通过非共价作用结合，向内是由蛋白p17形成的球形基质(Matrix)，以及蛋白p24形成的半锥形衣壳(Capsid)，衣壳内含有病毒的RNA基因组、酶(逆转录酶、整合酶、蛋白酶)以及其他来自宿主细胞的成分。

HIV进入人体后，首先遭到巨噬细胞的吞噬，但HIV很快改变了巨噬细胞内某些部位的酸性环境，创造了适合其生存的条件，不但不被杀灭反而在其内大量繁殖聚集。因为CD4是HIV的受体，所以经巨噬细胞内繁殖的HIV通过其囊膜蛋白gp120并在gp41的辅助下(gp41起着桥的作用，利用自身的疏水作用介导病毒囊膜与细胞膜融合)进入CD4+细胞(细胞、单核巨噬细胞、树突状细胞等)，在细胞内迅速增殖，每天产生10⁹～10¹⁰病毒颗粒，并不断进入其他正常的和再生的CD4+细胞内复制，制造更多的病毒感染细胞，使外周血CD4+T细胞持续破坏、减少。CD4+T细胞是最重要的免疫细胞，感染者一旦失去了大量CD4+T细胞，整个免疫系统就会遭到致命的打击，对各种疾病的感染都失去抵抗力；HIV进入宿主CD4+细胞后也可以表现为长期潜伏而不表现出临床症状，其基因组RNA反转录成双链DNA，与病毒整合酶进入宿主细胞核内，在整合酶的作用下，双链DNA整合到宿主细胞基因组内，被整合的病毒DNA称为前病毒，可潜伏数月甚至多年不复制，造成AIDS数月至多年的潜伏期。在AIDS的潜伏期，HIV主要在淋巴结的巨噬细胞和树突状细胞内繁殖，这些细胞是体内的HIV贮存库，可释放至外周血或转染外周血中的CD4+T细胞，有丝分裂原、抗原、TNF、IL-2和淋巴素(LT)都能激发HIV前病毒基因在感染的CD4+T细胞内转录复制。经大量增殖后，HIV病毒颗粒不断从被破坏的感染细胞释放并游离于血液，然后再进入其他细胞继续感染过程。

HIV感染后可刺激机体生产囊膜蛋白(Gp120，Gp41)抗体和核心蛋白(P24)抗体。在HIV携带者、艾滋病病人血清中测出低水平的抗病毒中和抗体，其中艾滋病病人水平最低，HIV携带者最高，说明该抗体在体内有保护作用。但抗体不能与单核巨噬细胞内存留的病毒接触，且HIV囊膜蛋白易发生抗原性变异，原有抗体失去作用，使中和抗体不能发挥应有的作用。在潜伏感染阶段，HIV前病毒整合入宿主细胞基因组中，因此HIV不会被免疫系统所识别，所以仅依靠自身免疫功能无法将其清除。另一个很重要的原因是，根据抗体杀灭、清除抗原的机理，免疫性抗体与抗原结合后，要产生免疫效应，要么通过激活补体，介导ADCC效应溶解细胞性抗原，但HIV不是细胞性抗原；要么通过趋化作用吸引吞噬细胞吞噬清除抗原，但HIV反而在吞噬细胞内被保护、增殖；要么抗体与抗原结合起中和作用，使失去感染力，但HIV无法被免疫系统杀灭、清除。

20世纪开始研究的血液净化技术，是指把患者的血液引出体外并通过一种净化装置，除去其中某些致病物质，净化血液，再回输入体内，达到治疗疾病的目的。早期的血液净化常指血液透析技术，用于尿毒症患者肾替代治疗，随着医学的进步和血液净化装置的发展，在血液透析的基础上派生出不同的血液净化方式，如血浆置换、血液灌流、免疫吸附、血液滤过等。不同血液净化技术的应用，大大改善了某些疑难复杂疾病的治疗，主要应用血浆置换技术分离并清除大分子免疫复合物类致病因子以减轻、调节和治疗某些免疫性疾病。20世纪80年代以来，浙大一院李兰娟团队开始运用血浆置换治疗肝衰竭，取得了较好疗效，并在此基础上创立了非生物型、生物型、混合型人工肝支持系统，以及所涉及的人工肝透析器、血液滤过器、活性炭(树脂)吸附器、生物反应器等人工肝支持系统部件的改良和创新。但未见以血液净化技术清除HIV感染细胞及游离的HIV的报道。

目前艾滋病治疗常用的抗病毒一线药物是逆转录酶抑制剂，该药不能杀灭HIV，存在个体差异、耐药性、腺粒体毒性、骨髓抑制、红细胞性贫血、粒细胞和血小板减少、胰腺炎、肝损伤等多种毒副作用，其他如HIV蛋白酶抑制剂、HIV整合酶抑制剂、细胞因子、疫苗治疗、基因治疗和单克隆抗体被动免疫疗法等，均因为各种原因而难以普遍应用。有文献报道利用T细胞表面CD3分子的单克隆抗体作为细胞生长的刺激剂，大量培养艾滋病患者分离的T细胞后，作为自身治疗性细胞回输，但HIV也随着HIV感染细胞的培养繁殖而在胞内增殖，增量T细胞的回输也导致了增量HIV的回输。

人类的吞噬细胞有大、小两种，小吞噬细胞是外周血中的中性粒细胞，大吞噬细胞是血中的单核细胞和多种器官、组织中的巨噬细胞，两者构成单核吞噬细胞系统。单核细胞由骨髓中的单核细胞前体发育分化而成，约占血液中白细胞总数的3％一8％，其体积较淋巴细胞略大，单核细胞在血液中仅停留12-24小时，然后进入结缔组织或器官，发育成熟为巨噬细胞，巨噬细胞是单核吞噬细胞系统中高度分化、成熟的细胞类型，具有较强的吞噬功能，游走巨噬细胞大于单核细胞数倍，寿命较长，可在组织中存活几个月，定居的巨噬细胞有不同的名称，在肝中为枯否细胞、在脑中为小胶质细胞、在骨中为破骨细胞等，其表达Fc受体、C3b受体和CD14，在固有免疫中发挥防御功能，也是参与适应性免疫的专职抗原提呈细胞。巨噬细胞表达的CD4分子，是艾滋病毒(HIV)的受体，HIV进入人体后，首先遭到巨噬细胞的吞噬，但HIV很快改变了巨噬细胞内某些部位的酸性环境，创造了适合其生存的条件，不但不被杀灭反而在其内大量繁殖聚集，转而将HIV传递给CD4+T细胞。

综上所述，巨噬细胞表达的CD4分子，是艾滋病毒(HIV)的受体，HIV进入人体后，首先遭到巨噬细胞的吞噬，但HIV很快改变了巨噬细胞内某些部位的酸性环境，创造了适合其生存的条件，不但不被杀灭反而在其内大量繁殖聚集，转而将HIV传递给CD4+T细胞，最后死于CD4+T细胞大量破坏、功能丧失而致的各种疾病。

人体缺乏杀灭HIV的免疫力，体内使用的药物疗效不佳且毒副作用大，艾滋病是久攻不克的世界性难题。

发明内容

为了解决久攻不克的艾滋病治疗领域的世界性难题，本发明人提出了本发明。

本发明的目的是要提供HIV吞噬细胞器；另一目的是要提供细胞器的制备及应用方法。

本发明的目的是这样实现的：以免疫磁珠法分离出CD14细胞，进而制备既保留原巨噬细胞特性又能无限生长的杂交瘤巨噬细胞株，选择对HIV强吞噬性的克隆作扩增培养和保存，将由此制备的杂交瘤巨噬细胞株配制于细胞冻存液，以高生物相容性材料包裹而制备能防止细胞及其碎片甚至HIV滤出的、能为细胞株吞噬HIV提供场所的细胞器，与血浆分离器共同构成体外循环装置，血浆分离器分离的血浆经细胞器滤出后，其中的HIV被巨噬细胞株吞噬清除，同时产生的抗感染巨噬细胞因子随血浆回输体内，从而实现既清除HIV又补充所需巨噬细胞因子的艾滋病杂交瘤技术体外新疗法，比局限于在体内杀灭HIV但又难以实现的传统疗法更可行而无毒副作用。

本发明以经典的免疫磁珠分离法分离巨噬细胞，以经典的杂交瘤技术制备巨噬细胞杂交瘤细胞株，使之既保留吞噬HIV的活性，又具有无限生长的骨髓瘤细胞特性，经扩增后以高生物相容性材料包裹制成HIV吞噬细胞器，其中的巨噬细胞配制于细胞冻存液中，便于保存，巨噬细胞表达的CD4分子是艾滋病毒的受体，具有天然吞噬HIV的特性，本发明模拟巨噬细胞的体内非特异性吞噬模式，当含有HIV的血浆流经细胞器时，HIV与巨噬细胞发生接触而被吞噬，清除HIV后的血浆与血细胞汇合后回输，能在治疗中使体内HIV不断被清除而减少直至消失，能有效阻断新生的CD4+T细胞再被HIV感染，从而达到免疫重建的治疗目的，与目前难以在体内杀灭HIV和难以有效阻断从血浆到巨噬细胞再到CD4+T细胞的循环感染途径，且费用昂贵，药副作用大的常规抗逆转录治疗相比，本发明更经济、几乎无药副作用，实现了人工将HIV从体内转移到体外而清除的治疗新方法。

具体实施方式

图1是根据本发明提出的HIV吞噬细胞器的应用示意图。

图2是根据本发明提出的血浆分离器的内部结构图。

图3是根据本发明提出的HIV吞噬细胞器的内部结构图。

图1中，动脉血路管(1)的一端与动脉血管相连通，另一端经肝素泵(2)和血液泵(3)与血浆分离器(4)相连，血浆分离器(4)经血浆泵(6)和循环管路(7)与两个并联的细胞器(8)、细胞器(9)相连，然后依次与循环管路(10)、静脉管路(5)相连，静脉管路(5)的另一端与静脉血管相连。

图2中，1是血浆分离器，2是血浆分离器内腔，3是血浆分离器内腔管壁上的微孔，4是不能通过微孔(3)的血细胞，5是能通过微孔(3)的小分子血浆成份，6是血浆分离器外腔，7是血浆流出口，8是可开关的阀门。

图3中，1是细胞器，2是杂交瘤巨噬细胞株，3是进入细胞器的游离的HIV，4是HIV与杂交瘤巨噬细胞株的结合物，5是杂交瘤巨噬细胞株产生的细胞因子。

下面结合图1、图2和图3，对本发明提出的HIV吞噬细胞器的实施方案作详细的描述。

1、原代细胞来源

(1)单个核血液细胞：指以密度梯度离心法从血液中分离的淋巴细胞和单核巨噬细胞。具体方法是：购买血液中心的浓缩白细胞或为科研而保存的脐带血，取2mL标本，PBS液将血液稀释2～3倍，充分混匀后将6mL抗凝血用滴管沿管壁缓慢叠加于已加入4mL淋巴细胞分离液的10mL离心管中水平离心机中水平离心(400r/min，20℃)35min；离心后管内分为3层，上层为血浆和PBS液，下层主要为红细胞和粒细胞，中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带为PBMC，用毛细吸管插到云雾层，吸取PBMC置入另一50mL离心管中，加入5倍以上体积PBS离心(300r/min，20℃)10min，弃上清50mLPBS重悬细胞，离心(350r/min，20℃)15min，弃上清，加入Buffer(PBS+0.5％新生牛血清+2mmol/LEDTA，pH7.2)2mL重悬细胞，取15uL细胞悬液加入血球计数板上显微镜下计数4个大方格内的细胞(PBMC)总数。

(2)单个核组织细胞：由浙江大学组织工程研究平台提供。实质上属于来自脾脏的巨噬细胞，其制备方法是：①脾脏组织的获取和转运：在论理委员会批准和患者知情同意下，取手术切除的脾脏标本组织，立即剪碎成体积约1mm³的小组织块，移入装有预冷4℃的无菌密封瓶内，迅速转运至细胞培养室。②脾脏组织细胞混悬液的制备：将脾脏组织块移至无菌操作台，PBS洗涤3次，RPMI-1640洗涤2次，以清除组织内的血液并保证组织的无菌。机械研磨脾脏组织，这时便有大量的组织细胞悬混于RPMI-1640液中。用200目不锈钢滤网过滤悬混有组织细胞的RPMI-1640液，滤液为脾脏组织细胞混悬液(主要含红细胞、淋巴细胞、巨噬细胞等)。③脾脏组织细胞混悬液中红细胞的裂解：然后用RPMI-1640液洗涤离心(1000r/min，3min)，以去除细胞碎屑，加入Tris-NH4Cl作用5min，裂解红细胞，迅速离心(1000r/min，3min)，去除上清液内的裂解红细胞碎片，PBS洗涤离心3次，RPMI-1640洗涤离心1次，以清除混悬液中残存的Tris-NH4Cl，避免其影响细胞的存活，此时，混悬液中主要含脾脏组织巨噬细胞和淋巴细胞。④脾脏组织巨噬细胞的贴壁培养：将前述混悬液作为培养细胞原液，台盼蓝染色判定活力并计数，用RPMI-1640液调整细胞浓度为(3～5)×10⁶/L，将调整好浓度的细胞悬液接种于玻璃培养瓶内，培养条件为37℃，50mL/LCO₂，100％湿度，分别培养2～3h，相差显微镜下观察形态。贴壁脾脏组织巨噬细胞的消化：贴壁脾脏组织巨噬细胞的消化：吸去培养上清液，巨噬细胞贴壁，PBS反复吹打、消化，所得细胞悬液洗涤离心(1000r/min，3min)，得到分离纯化的巨噬细胞。此外，还可以取治疗或手术后废弃的标本提取制备，如腹膜腔液、肺泡、肝脏、脾脏、腹膜组织、小肠黏膜等。

(3)羊水、绒毛细胞：浙江大学附属妇产科医院生殖遗传实验室备用。在论理委员会批准和患者知情同意下，取实验诊断报告后的剩余羊水、绒毛细胞，选择对数生长期细胞留用。

2、细胞培养及巨噬细胞贴壁初步分选

按常规细胞培养，但根据细胞性质的不同，适当调整培养时间，培养条件等，一般贴壁法将单个核血液细胞(PBMC)或单个核组织细胞(巨噬细胞)置于含有RPMI-1640培养基的培养皿中，于37℃，5％CO₂的细胞培养箱(Themo electro corporation CLASS 100，美国)中孵育2h，待单个核细胞贴壁后，吸弃上层悬浮细胞(巨噬细胞以外的细胞不易贴壁而随上层液除去)，PBs缓冲液轻轻洗涤3遍，加入少量RPMI一1640培养基，用细胞刮刀刮下贴壁细胞(主要为巨噬细胞，但还有少量其他贴壁细胞)。1 000r/min离心5min，弃上清。羊水细胞、绒毛细胞培养1～7天，出现细胞生长克隆、细胞生长汇合率达到60～80％的对数生长期细胞，以胰酶消化，PBS清洗，获取细胞悬液，配成合适细胞浓度。

3、CD4细胞分选

采用免疫磁珠法分选CD4细胞：①主要试剂和仪器：CD4免疫磁珠(德国美天旎生物技术有限公司)；0.2％台盼蓝染色液(上海生工生物工程技术服务公司)；新生牛血清(Hyclone公司)；MiniMACS磁力分离系统(德国美天旎生物技术有限公司)。②CD4细胞免疫磁珠分选方法：细胞悬液均分至两个1.5mLEppendorf管，离心(300r/min，20℃)10min，弃去上清，重悬细胞每80uLBuffer含细胞数10⁷个，每10⁷个细胞加20uLCD4MicroBeads或CD8MicroBeads，充分混匀，在4～8℃孵化15min，用1mLBuffer洗涤细胞，离心(300r/min，20℃)10min，弃去上清500uLBuffer重悬细胞，将MS分离柱放置在MACS分离器的磁场中，以500uLBuffer漂洗，将500uL细胞悬液通过分离柱，用500uLBuffer冲洗分离柱重复操作3次，收集流出液，流出液中含非CD4细胞，自分离器中取出分离柱，用1000uLBuffer加压冲洗分离柱，收集流出液，此为CD4细胞(细胞活力检测：细胞纯化前后分别取15uL细胞悬液与等体积台盼蓝溶液混合，显微镜下观察不着色发亮者为活细胞，着色胀大者为死细胞，计算200个细胞中活细胞的百分比)。此时分选的细胞主要为巨噬细胞。

4、CD14细胞(巨噬细胞)分选

CD14为单核细胞和巨噬细胞特有的表面标志，理论上如果从单个核组织细胞、羊水细胞及绒毛细胞中分选，则所得细胞为巨噬细胞；如果从单个核血液细胞中分选，则所得细胞包括单核细胞和巨噬细胞；但因单核细胞寿命短、仅在外周血中存活1天且远不如巨噬细胞易于贴壁生长，所以在本发明的细胞贴壁培养中已基本除去，分选出来的细胞基本为巨噬细胞。

基本方法类同于CD4细胞，采用免疫磁珠法。①试剂：人CD14免疫磁珠试剂盒(Miltenyi Biotec，德国)，RPMI-1640培养基(Hyclone，美国)；②免疫磁珠法：(A)磁珠与特异性靶细胞一单核细胞结合：每1×10⁸个PBMC加入200uL偶联CD14抗体的磁珠和800uL缓冲液(含有10％的牛血清白蛋白2.5mL和2mol/L EDTA0.5mL，4℃冰箱预冷)，在15mL离心管中充分混匀，4℃孵育15min，中间可轻微振摇1次。15min后取出离心管，每1×10⁷个细胞加入1～2mL预冷缓冲液，1 000r/min，离心8min，弃上清，加入0.5mL缓冲液并吹打成单细胞悬液。(B)收集磁珠标记的单核细胞：将细胞分离柱置于MACS磁力架上，加入1mL缓冲液平衡细胞分离柱，待无液体滴下，立即将上述细胞悬液加人细胞分离柱中，用0.5mL缓冲液冲洗细胞分离柱3次。待冲洗完毕后，加入1mL缓冲液，从磁力架中移出细胞分离柱，用针柱快速推动，冲出在分离柱中与CD14抗体一磁珠相结合的细胞，即为CD14+的巨噬细胞。

此外，还可采用以下2种方法分选，包括①贴壁法：将PBMC置于含有RPMI-1640培养基的培养皿中，于37℃，含5％C0：的细胞培养箱(Themo electro corporation CLASS 100，美国)中孵育2h。待单核细胞贴壁后，吸弃上层悬浮细胞，PBs缓冲液轻轻洗涤3遍，加入少量RPMI一1640培养基，用细胞刮刀刮下贴壁细胞。1 000r/min离心5min，弃上清。②流式细胞术法：CD14标记：取PBMC，用缓冲液(含有10％的牛血清白蛋白2.5mL和2mol/LEDTA 0.5mL)调整细胞密度为1×10⁸/mL，在每毫升细胞悬液中加入CD14+-FITC抗体100uL，4℃避光标记18min，再向离心管中加入1mL流式缓冲液以终止染色，PBs洗涤3次，用含2％青链霉素的PBS调整细胞密度为2×107/mL。流式细胞仪分选：将制备的细胞在流式细胞仪(BD FAcsAriaII，美国)上分选，根据CD14抗体的荧光强度、细胞的相对大小以及细胞的相对颗粒性和内部结构的复杂性，收集CD14+的细胞。

5、CD14杂交瘤细胞株(杂交瘤巨噬细胞株)制备

(1)培养基及主要试剂：DMEM培养基、HAT、HT选择培养基购自Sigma公司，优级胎牛血清(FBS)购白天津市灏洋生物制品科技责任有限公司；DMSO(-甲基亚砜)为国产分析纯试剂。

(2)骨髓瘤细胞准备：融合前一周从液氮罐内取出一管冻存的骨髓瘤细胞(SP2/0)，立即放入热水解冻(应用最多的是Sp2/0细胞株，该细胞株生长及融合效率均佳，本身不分泌任何免疫球蛋白重链或轻链，细胞的最高生长刻度为9×10⁵/ml，倍增时间通常为10～15h；与人体相关的实际应用中考虑选择同源细胞株，如上海复祥生物科技有限公司向ATCC细胞库引进的NCI-H929人骨髓瘤细胞株)。融化后加入适量完全培养液，1000r/m离心3min；重复1次。将沉淀物移入细胞培养瓶中，加DMEM培养液，置CO2培养箱培养，3-4天进行一次传代或扩大培养，融合前24小时内调整细胞状态，保证融合前细胞形态良好、生长旺盛。加入适量基础培养基到离心管中，轻轻敲打混匀后1000r/m离心5-10min，重复洗涤细胞2次。

(3)待杂交CD14细胞(巨噬细胞)准备：本发明分选的单核巨噬细胞以基础培养基调整总细胞数到1×10⁸～2×10⁸用于细胞融合。以台盼兰染色用相差显微镜检查，活细胞数应高于80％为合格。

(4)细胞融合：将CD14细胞(单核巨噬细胞)与骨髓瘤细胞以10∶1-5∶1的比例加入离心管中，混和均匀，1000r/m离心5min，弃去上清，轻轻敲打管底至细胞无颗粒状沉淀，重复2次。在37℃水浴中轻轻旋转预热离心管，取出后无菌条件下将预热的1000μL的50％PEG3000在60s内沿管壁滴加到融合管中同时轻轻旋转离心管，之后将预热的25mL的基础培养基在3-5min内也沿管壁滴加到离心管中，在加入的过程中轻轻地旋转离心管，然后静置于37℃水浴10min，1000r/m离心5min，弃去上清，加入50mL HA T培养基。适当混匀后接种到96孔培养板中，置于37℃，5％的CO2培养箱中培养。

(5)具有吞噬功能的杂交瘤单核巨噬细胞株筛选：观察96孔培养板中细胞生长情况，7-10天后仅有杂交瘤细胞能够生长分裂，此时弃去HAT培养基，更换完全培养基。细胞克隆生长面积达到1/10个细胞孔时，去培养上清，选择有生长状态良好的杂交瘤细胞株的培养孔，显微镜下标记细胞株生长的位置、大小，使用无菌枪头在标注的位置吸取细胞克隆到新的有完全培养基的培养孔内，然后依次倍比稀释到后面数孔，37℃，5％CO2培养箱内培养一周左右，显微镜下观察细胞生长情况，待细胞克隆长满至孔底面积1/10以上时，取细胞或培养上清检测杂交瘤巨噬细胞(Mφ)株功能。具体方法如下：

①杂交瘤巨噬细胞株吞噬细菌功能检测：将巨噬细胞与葡萄球菌或白色念珠菌悬液混合温育，涂片，固定，碱性亚甲兰液染色，在油镜下观察吞噬情况，计数吞噬细菌和未吞噬细菌的巨噬细胞数比例，以吞噬细菌功能强的巨噬细胞作为备选阳性克隆株。

②杂交瘤巨噬细胞株吞噬HIV功能检测：取疾控中心保存的艾滋病(AIDS)患者的血浆与杂交瘤巨噬细胞株混合培养后，分离细胞株，PBS清洗3次，测定经裂解的吞噬细胞株吞噬HIV的功能，具体根据HIV-1p24抗原检测试剂盒(酶联免疫法，上海启发生物科技有限公司)操作，以已知浓度0pg/ml、0.5pg/ml、1pg/ml、2.5pg/ml、5pg/ml、20pg/ml、40pg/ml、80pg/ml的p24抗原作为对照，最低检测限低于5pg/ml，测定范围0～400pg/ml，线性范围0.5pg/ml～80pg/ml，15min内450nm测定吸光度(OD)，空白对照校准品吸光度值不高于0.050，0pg吸光度值不高于0.100，1000pg/ml吸光度不低于1.000，当吸光度＞0.12时被认为是阳性。具体按试剂盒说明书操作。

③杂交瘤巨噬细胞株产生巨噬细胞因子检测：以人巨噬细胞移动抑制因子(MIF)ELISA检测试剂盒(上海百蕊生物科技有限公司)按说明书操作，检测范围为0～800pg/ml，敏感度为1.0pg/ml，可在白色背景下，直接用肉眼观察：反应孔内颜色越深，阳性越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性，具体按试剂盒说明书操作。MIF是集细胞因子、生长因子、激素和酶特性于一身的多效能蛋白分子，作为固有免疫和炎症反应的调节因子发挥中枢性的作用，在各种感染和急慢性炎症性疾病中发挥多种免疫功能。

根据检测结果，挑选具有较强巨噬细胞功能的培养孔中的细胞克隆重复进行下一轮稀释培养，重复2-3轮，检测功能稳定后取出，转入培养瓶大量培养。

(6)杂交瘤巨噬细胞株的保存与复苏：保存前12小时调整细胞生长状态，取一瓶生长旺盛，形态良好的细胞，适当消化后制成细胞悬液，1000r/min离心5min，去上清液，轻弹管底使细胞松散，加入4℃保存的9份完全培养液和1份DMSO，分装细胞冻存管，1mL/管，-70℃冰箱过夜，取出后将冻存管放入液氮容器中保存备用。复苏前准备好40℃左右的热水，将冻存管从液氮中小心取出，迅速置于热水中均匀摇动使细胞解冻，解冻后在1000r/min离心5min，超净工作台内无菌条件下打开冻存管，将解冻后的细胞用完全培养液洗涤一次，然后在1000r/min离心5min，弃去上清，以备作扩大培养。

6、杂交瘤巨噬细胞株的扩增

即杂交瘤巨噬细胞株的产业培养。将上述细胞沉淀使用完全培养液轻轻重悬后移入培养瓶内，置37℃，5％CO2培养箱中培养。反复传代扩增培养，直至所需的杂交瘤细胞株数量，每传代培养阳性杂交瘤细胞株10代，检测杂交瘤巨噬细胞株的功能，观察是否稳定。继续在数瓶内进行大规模产业化制备。

7、杂交瘤巨噬细胞株细胞器的制备(HIV吞噬细胞器的制备)

将本发明制备的杂交瘤巨噬细胞株，以无菌生理盐水清洗后，再以1000r/min离心5min(低速短时离心)，取细胞沉淀装配丙烯酸酯之类高生物相容性材料(与血浆分离器材料相同)制成的圆柱形反应器，至4/5，然后加细胞冻存液(含30％胎牛血清、12％二甲亚砜的1640培养液)，使细胞浓度达80％，轻轻摇匀，封口，经4℃，0.5h；-20℃，2h；-70℃，过夜，入-196℃液氮冻存备用。解冻使用时，需迅速将冻存管投入到已经预热的37℃水浴中，并不断摇动，使管中的液体迅速融化，然后以无菌生理盐水清洗后使用。

细胞器的外形可制成漏斗形，底径小，顶径大，容积为200～300ml，进出口均设有细胞筛网，进口处顶径筛网目数为800目；出口处底径筛网目数为2.0～5.0目(2.5～5.0目相当于0.1～0.2微米或100～200纳米)，具体可制成2.0目、2.5目、3.0目、3.5目、4.0目、4.5目和5.0目的规格，用以阻挡120纳米的HIV病毒或更大的细菌；液体出口处设置目数为100目(相当于4微米)的细胞滤网，用以阻挡可能滤出的细胞；液体进出口与网筛之间设有缓冲区，有利于系统循环的稳定性。当经体外循环装置分离的血浆流经细胞器时，游离的HIV被相应的杂交瘤巨噬细胞株吞噬吸附，净化后的血浆从细胞器流出，与分离器分离的血细胞汇合后回输体内。本发明的HIV吞噬细胞器可以委托专业商家制备。

8、血浆分离器的制备

(1)制备原理：根据血细胞和血浆成份的分子大小制备。如人体血液中有形成份(血细胞)的大小为：正常红细胞大约为7微米(μm)，是双凹圆盘状的细胞；白细胞分为5种，中性粒细胞约12μm，嗜酸性粒细胞略大些，嗜碱性粒细胞与中性粒细胞接近，小淋巴细胞6-8μm，与红细胞近似，单核细胞最大，约15-20μm。血小板为圆盘形，直径1～4微米到7～8微米不等，人的血小板平均直径为2-4微米，厚0.5～1.5微米。

(2)材料：可选用聚醋无纺布、醋酸纤维、脱脂棉等，要求生物相容性好，几乎不激活补体、不引起炎症反应、不引起白细胞、血小板、血氧分压、补体C3a、C5a的改变。可通过共价、接枝、聚合等方法改进材料的结构、调节表面的微观不均匀性、亲水性、减少对凝血及氧化应激的影响、从而提高筛滤充分性和生物相容性、减少并发症的发生。

(3)型号与规格：就分离器的外形来说，可以醋酸纤维或脱脂棉等材料作滤芯制备成柱形结构、以聚醋无纺布等材料作滤芯制备成扁平结构等形状；按待分离的血细胞和血浆成份的分子大小确定孔径。本发明所涉及的血浆分离器用性质稳定、生物相容性好、通透性高的高分子聚合物制成空心纤维型滤器，空心纤维膜直径为270～370μm，膜厚度为50μm，孔径为0.2～0.6μm，纤维长度为13.5～26μm。该孔仅准许血浆滤过，但能阻挡所有的细胞成分。

9、HIV吞噬细胞器的应用

按本发明中图1的应用示意图，连接血浆分离器和细胞器，构成体外循环装置，具体方法如下：

(1)安装：以无菌操作连接各部件，包括血浆分离器、细胞器及各循环管路。

(2)排气：以无菌生理盐水充液分离器、细胞器及各循环管路，排除分离器、细胞器及其循环管道内的气体、气泡，仔细检查，确认无气体、气泡后使用。

(3)通液：将动脉血路管1接通艾滋病患者的动脉血管，在操作中再次仔细检查排气是否完全，液流是否通畅，并避免管内流液污染。

(4)抗凝：从肝素泵向液流中注射抗凝剂(肝素)，初次为2500U或20～30U/kg。

(5)启动：将静脉管路(5)接通艾滋病患者的静脉血管，然后打开血液泵，血流量为100～150ml/min，如图1，当动脉血液经动脉血路管(1)进入血浆分离器(4)时，分离出来的血浆在血浆泵6的作用下经循环管路(7)到达细胞器(8)，待充满血浆、约10分钟，开始放出血浆，经循环管路(10)流出，同步向细胞器(9)灌注血浆，在细胞器(8)内的血浆将近流完时，再次开始灌注血浆，此时细胞器(9)开始放出血浆，两个并联的细胞器(8)、细胞器(9)交替进行。如图2，当待分离的血液进入血浆分离器(1)的内腔(2)时，经阀门(8)的作用，能通过微孔(3)的小分子血浆成份(5)进入分离器的外腔(6)，然后经血浆出口(7)流出，而不能通过微孔(3)的血细胞(4)经阀门(8)流出。如图3，当含有HIV(3)的血浆进入细胞器(1)时，其中的HIV(3)被固定在细胞器中的杂交瘤巨噬细胞株(2)吞噬吸附，形成复合物(4)而不再往下移动，而杂交瘤巨噬细胞株产生的细胞因子(5)混合在清除了HIV后的血浆中流出细胞器后，经图1所示的静脉管路(5)回输。如此直至事先设定的血浆循环量(通常为9L)，治疗才宣告结束。如果配套电脑程序控制，整个治疗过程均由电脑控制，并可随时检测工作状态，使用会更加方便、自动化和安全。

10、HIV吞噬细胞器的附加部件

图1给出的HIV吞噬细胞器是本发明的基本构成部份，在此基础上还可以改装以下部件，包括动静脉压和空气监测、温度控制系统、配液系统、除气系统、电导率监测系统、超滤监测和漏血监测等部分。

(1)动静脉压监测：动脉压监测主要用以动态监测细胞器微孔的堵塞情况，另外用以监测体外循环血栓、凝固和压力的变化。当血流不足时，动脉压就会降低；当有凝血、血栓形成，特别是分离器微孔堵塞时，动脉压就会升高；静脉压监测用来监测管路血液回流的压力，当分离器微孔堵塞、凝血、血栓形成、血流不足以及静脉血回流针头脱落时，静脉压就会下降，如果血路回流管扭曲堵塞或回流针头发生堵塞时，静脉压就会升高。

(2)空气监测(Air Detector)：用来监测血液流路的空气气泡，一般用超声波探测的原理，为了避免病人发生空气栓塞而设置。当监测到有空气气泡时，检测系统会驱动动、静脉血路夹来阻断血流，防止危险的发生。

总之，在本发明基本构成体系的基础上，有望进一步研发自动化治疗仪器，发展为操作的人性化、治疗的个性化、设计的安全性以及模块化、自动监测及调控、液晶显示、自行判断警报原因及解除信号等微电脑处理系统。

11、实验验证

为了解本发明的功效，设计了简易细胞器的功效测试方法：取灭菌的2.5×300mm魏氏血沉管5支，分别吸取经离心(1000r/min，5min)沉淀的杂交瘤巨噬细胞株至200mm刻度，接着吸取经100℃溶化后保温在56℃备用的0.9％琼脂糖C1-4B，达到约10mm长刻度，置血沉架冷却后，琼脂糖成为半固体，能阻止血沉管内细胞流出但不会阻止小分子的水和化学成份之类的物质通过。另取浙江省疾控中心等样本库保存的艾滋病(AIDS)患者的5例血浆，各约10mL，各取9mLAIDS滤前血浆分批次注入血沉管(简易细胞器)上端空管，待流经血沉管下层的杂交瘤巨噬细胞株层并从血沉管内流出后，收集流出液，称为AIDS滤后血浆。取AIDS滤前血浆和滤后血浆，以人巨噬细胞移动抑制因子(MIF)ELISA检测试剂盒(上海百蕊生物科技有限公司)配对检测，按说明书操作，检测范围为0～800pg/ml，敏感度为1.0pg/ml，可在白色背景下，直接用肉眼观察：反应孔内颜色越深，阳性越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。结果如表1，滤前血浆中MIF检测结果均为阴性(或因含量低于检测灵敏度、血浆长期保存致降解等)，而滤后血浆中检测结果均为阳性，说明巨噬细胞杂交瘤细胞株在此过程产生了MIF细胞因子。MIF是集细胞因子、生长因子、激素和酶特性于一身的多效能蛋白分子，作为固有免疫和炎症反应的调节因子发挥中枢性的作用，在各种感染和急慢性炎症性疾病中发挥多种免疫功能。在作AIDS血浆滤过简易细胞器前后MIF配对检测的同时，本发明还做了HIV-1p24的配对检测，根据HIV-1p24抗原检测试剂盒(酶联免疫法，上海启发生物科技有限公司)操作，以已知浓度0pg/ml、0.5pg/ml、1pg/ml、2.5pg/ml、5pg/ml、20pg/ml、40pg/ml、80pg/ml的p24抗原作为对照，最低检测限低于5pg/ml，测定范围0～400pg/ml，线性范围0.5pg/ml～80pg/ml，15min内450nm测定吸光度(OD)，空白对照校准品吸光度值不高于0.050，0pg吸光度值不高于0.100，1000pg/ml吸光度不低于1.000，当吸光度＞0.12时被认为是阳性，检测结果(表2)说明AIDS血浆滤过简易细胞器后，部分HIV已被杂交瘤巨噬细胞株吞噬吸附，滤过后的血浆HIV明显减少，经第1次滤过后，HIV清除率为20.55％，经第2次滤过后，HIV清除率为42.83％，p＜0.01，具有显著的效果，说明随着滤过次数的增加，HIV会被不断地清除，从而达到治疗AIDS目的。

表1 AIDS血浆滤过简易细胞器前后MIF配对检测结果(定量：pg/ml)

表2 AIDS血浆滤过简易细胞器前后p24检测结果(p24：pg/ml)

总之，从表1和表2的结果表明，含有HIV的血浆经本发明的HIV吞噬细胞器滤过后，其中的HIV能被细胞器中的杂交瘤巨噬细胞株吸附清除，效果显著；与此同时，杂交瘤巨噬细胞株产生了具有抗感染和免疫作用的细胞因子。实验结果说明，本发明的HIV吞噬细胞器具有显著的功效。

Claims

1.一种用于生物医学领域的HIV吞噬细胞器，其特征在于，包括高生物相容性材料和细胞株，以高生物相容性材料包裹所述细胞株，制成能防止细胞及其碎片以及HIV滤出并能为细胞株吞噬HIV和产生细胞因子提供场所的细胞器，所述细胞株为分选原代细胞中的CD4细胞，培养后，进一步分选CD14细胞，继之将分选后的细胞制备成既保留原细胞特性又能无限增殖的杂交瘤细胞株，所述细胞株能够吞噬HIV和产生细胞因子。

2.根据权利要求1所述的HIV吞噬细胞器，其特征在于，所述原代细胞包括单个核血液细胞、单个核组织细胞、羊水细胞和/或绒毛细胞。

3.根据权利要求1所述的HIV吞噬细胞器，其特征在于，分选CD14细胞的方法包括免疫磁珠法、贴壁法、流式细胞术法。

4.根据权利要求2所述的HIV吞噬细胞器，其特征在于，分选CD14细胞的方法包括免疫磁珠法、贴壁法、流式细胞术法。

5.根据权利要求1所述的HIV吞噬细胞器，其特征在于，所述杂交瘤细胞株由骨髓瘤细胞SP2/0或人骨髓瘤细胞株制备而成。

6.根据权利要求2所述的HIV吞噬细胞器，其特征在于，所述杂交瘤细胞株由骨髓瘤细胞SP2/0或人骨髓瘤细胞株制备而成。

7.根据权利要求3所述的HIV吞噬细胞器，其特征在于，所述杂交瘤细胞株由骨髓瘤细胞SP2/0或人骨髓瘤细胞株制备而成。

8.根据权利要求4所述的HIV吞噬细胞器，其特征在于，所述杂交瘤细胞株由骨髓瘤细胞SP2/0或人骨髓瘤细胞株制备而成。

9.根据权利要求1-8任一所述的HIV吞噬细胞器，其特征在于，细胞器的容积为200～300ml，进口处顶径细胞筛网目数为800目，出口处底径细胞筛网目数为2.0～5.0目。

10.根据权利要求9所述的HIV吞噬细胞器，其特征在于，细胞器出口处底径筛网目数制成2.0目、2.5目、3.0目、3.5目、4.0目、4.5目和5.0目的7种不同规格。

11.根据权利要求1-8、10任一所述的HIV吞噬细胞器，其特征在于，所述细胞器与血浆分离器相连，所述血浆分离器为空心纤维型，直径为270～370μm、膜厚度为50μm、孔径为0.2～0.6μm、长度为13.5～26μm的空心纤维型，能阻挡所有其他血液成分，仅准许血浆滤过。

12.根据权利要求9所述的HIV吞噬细胞器，其特征在于，所述细胞器与血浆分离器相连，所述血浆分离器为空心纤维型，直径为270～370μm、膜厚度为50μm、孔径为0.2～0.6μm、长度为13.5～26μm的空心纤维型，能阻挡所有其他血液成分，仅准许血浆滤过。