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CN104169300A - Bcma和cd3的结合分子 - Google Patents

Bcma和cd3的结合分子 Download PDF

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CN104169300A
CN104169300A CN201280056358.5A CN201280056358A CN104169300A CN 104169300 A CN104169300 A CN 104169300A CN 201280056358 A CN201280056358 A CN 201280056358A CN 104169300 A CN104169300 A CN 104169300A
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彼得·库菲
托拜厄斯·劳姆
帕特里克·霍夫曼
罗曼·基谢尔
拉尔夫·鲁特布瑟
桃瑞丝·芳
保罗·亚当
E·伯格斯
B·赫比斯
苏珊娜·希普
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Boehringer Ingelheim International GmbH
Amgen Research Munich GmbH
Original Assignee
Boehringer Ingelheim International GmbH
Amgen Research Munich GmbH
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Abstract

本发明涉及包含第一和第二结合结构域的至少双特异性的结合分子，其中第一结合结构域能够结合至BCMA的表位簇，且第二结合结构域能够结合至T细胞CD3受体复合物。此外，本发明提供编码所述结合分子的核酸序列，包含所述核酸序列的载体以及用所述载体转化或转染的宿主细胞。更进一步地，本发明提供用于生产本发明所述结合分子的方法，所述结合分子的医学用途以及包含所述结合分子的试剂盒。

Description

BCMA和CD3的结合分子
背景技术
BCMA(B-细胞成熟抗原，TNFRSF17，CD269)是一种属于TNF受体超家族的跨膜蛋白。BCMA最初报道为人成熟B淋巴细胞的高尔基体内的整合膜蛋白，即，作为细胞内蛋白(Gras等，(1995)International Immunol7(7)：1093-1105)，其表明BCMA看起来在B-细胞发育和稳态中具有重要作用。Gras等的发现可能与这样的事实有关，即Gras等描述的BCMA蛋白由于染色体易位是一种BCMA与IL-2之间的融合蛋白。同时，由于其与也称为TALL-1或TNFSF13B的配体BAFF(B细胞活化因子)和APRIL(增殖诱导配体)推测的必须相互作用，BCMA也被设定为对B-细胞的发育和稳态所必须的B-细胞标记物(Schliemann等，(2001)Science293(5537)：2111-2114)。
BCMA的表达限于B-细胞谱系且主要存在于浆细胞和浆母细胞上，并在一定程度上存在于记忆B-细胞上，但是实际上不存在于外周和纯真B-细胞上。BCMA也在多发性骨髓瘤(MM)细胞上表达。BCMA与其家族成员跨膜激活剂及亲环蛋白配体作用因子(TACI)和TNF家族受体(BAFF-R)的B细胞活化因子一起调节体液免疫、B-细胞发育和稳态的不同方面。BCMA的表达出现在B-细胞分化作用的较后期并有利于浆母细胞和浆细胞在骨髓中的长期存活。小鼠中BCMA基因的靶向缺失不会影响成熟B-细胞的产生、体液免疫应答的质量和幅度、生发中心的形成以及短暂寿命的浆细胞的生成。然而，这种小鼠骨髓中长寿命浆细胞的数量显著降低，这表明了BCMA对其存活的重要性(O’Connor等，2004)。
根据这一发现，BCMA也支持多发性骨髓瘤(MM)细胞的生长和存活。Novak等发现MM细胞系和最新分离的MM细胞在其细胞表面表达BCMA和TACI蛋白并且在其细胞表面具有BAFF-R蛋白的可变表达(Novak等，(2004)Blood103(2)：689-694)。
多发性骨髓瘤(MM)是第二大常见恶性血液病且其占所有癌症死亡例的2％。MM是一种异质性疾病并且多数是由t(11；14)、t(4；14)、t(8；14)、del(13)、del(17)(除其他外)的染色体易位引起的(Drach等，(1998)Blood92(3)：802-809；Gertz等，(2005)Blood106(8)：2837-2840；Facon等：，(2001)Blood97(6)：1566-1571)。MM受累患者可能经历因骨髓浸润、骨质破坏、肾衰竭、免疫缺陷以及癌症诊断的心理负担而经历多种与疾病相关的症状。截至2006年，MM的5年相对生存率约为34％，这表明MM是一种至今无治愈先例的难以治疗的疾病。
令人振奋的新疗法，如化疗和干细胞移植的方法，已可供使用并且其能提高生存率，但是常常伴有有害的副作用，因此MM仍然难以治疗(Lee等，(2004)J Natl Compr Cane Netw8(4)：379-383)。迄今为止，对于多发性骨髓瘤患者而言两种最常用的治疗选择是类固醇、沙利度胺、来那度胺、硼替佐米或多种细胞毒素试剂的组合，和对于较年轻的患者采用高剂量化疗理念配合自体干细胞移植。
多数的移植为自体型，即使用患者自身的细胞。这种移植，尽管不具有治愈性，但其显示延长选定患者的生命。其可在新诊断的患者中作为初始疗法或在复发时进行。有时为了适当的控制疾病，可能会建议选定患者采用一种以上的移植。
用于治疗该疾病的化疗试剂是环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和美法仑，与免疫调节剂如沙利度胺来那度胺硼替佐米和皮质类固醇(如地塞米松)的组合疗法已经成为用于治疗新确诊患者和化疗或移植均失败的疾病晚期患者中骨髓瘤的重要选择。
目前所用疗法是通常非治愈性的。因为高龄、其它严重疾病的存在或其它身体上的限制，干细胞移植可能不是用于多数患者的选择。化疗仅能部分控制多发性骨髓瘤，且极少达到完全缓解。因此，迫切需要新的创新疗法。
Bellucci等(Blood，2005；105(10))在已接受供者淋巴细胞输注(DLI)的多发性骨髓瘤患者中鉴别出了BCMA-特异性抗体。这些患者的血清能够介导由ADCC和CDC对BCMA-特异性细胞裂解并且仅在具有抗肿瘤应答的患者中检测到(4/9)，而未在非应答患者中检测到(0/6)。作者推测，BCMA-特异性抗体的诱导作用有利于骨髓瘤细胞的消除和患者的长期缓解。
Ryan等(Mol.Cancer Ther.2007；6(11))报道了一种拮抗型BCMA-特异性抗体的产生，其阻止与在正常和恶性B-细胞中强效促存活信号转导通路有关的NF-κB活化。另外，该抗体在体外给多发性骨髓瘤细胞系赋予强效的抗体依赖细胞介导的细胞毒性(ADCC)，这由Fc-工程化显著增强。
在对抗血源性肿瘤或自身免疫性障碍方面的其它方法专注于BAFF和APRIL(即TNF配体超家族的配体)与其由BAFF和/或APRIL活化的受体TACI、BAFF-R和BCMA之间的相互作用。例如，通过将人免疫球蛋白的Fc-结构域与Zymogenetics公司的TACI融合产生了阿塞西普(TACI-Ig)，来中和这两种配体并阻止受体的活化。阿塞西普目前正处于用于治疗系统性红斑狼疮(SLE，第III期)多发性硬化症(MS，第II期)及类风湿性关节炎(RA，第II期)的临床试验中，以及处于用于治疗B细胞恶性肿瘤慢性淋巴细胞白血病(CLL)、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)及MM的第I期临床试验中。在临床前研究中，阿塞西普在体外(Moreaux等，Blood，2004，103)和体内(Yaccoby等，Leukemia，2008，22，406-13)降低了初始MM细胞和MM细胞系的生长和存活，这表明了TACI配体对于MM细胞的相关性。由于多数MM细胞及其衍生的细胞系都表达BCMA和TACI，两者的受体可能有利于配体介导的生长与存活。这些数据表明，对BCMA和TACI的拮抗作用可能有益于浆细胞障碍的治疗。另外，已经描述了与TACI交叉反应的BCMA-特异性抗体(WO02/066516)。
人类基因组科学公司和葛兰素史克已经开发出一种称为贝利木单抗的靶向BAFF的抗体。贝利木单抗阻断可溶性BAFF与其受体BAFF-R、BCMA及TACI在B细胞上的结合。贝利木单抗不直接结合B细胞，但是通过结合BAFF，贝利木单抗抑制包括自体反应性B细胞的B细胞的存活，并减少B细胞分化为产生免疫球蛋白的浆细胞。
然而，尽管存在BCMA、BAFF-R和TACI(即属于TNF受体超家族的B细胞受体)及其配体BAFF和APRIL服从在对抗癌症和/或自身免疫性障碍中的治疗方案这一事实，仍然需要据哟用于治疗这种医学病症的其它可用选择。
发明内容
因此，本文提供了一种结合分子形式的用于解决这一问题的手段和方法，该结合分子为至少双特异性的，具有一个与细胞毒性细胞(即细胞毒性T细胞)结合的结合结构域和与BCMA结合的第二结合结构域。
需要注意的是，除非本文另有明确说明，本文所用单数形式“一种”、“一个”和“该”包含所提及的复数形式。因而，例如，提到“一种试剂”包括此类不同试剂的一种或多种，及提到“该方法”包括提到本领域普通技术人员已知的能够修饰或取代本文所述方法的等同步骤和方法。
除非本文另有说明，一系列要素前的术语“至少”应理解为是指这一系列的每个要素。本领域技术人员采用不超出常规实验即能认识到或确定许多与本文描述的本发明具体实施方案的等同情况。本发明旨在涵盖这些等同情况。
本文所用术语“和/或”包括“和”、“或”及“所述术语连接的要素的所有或任意其它组合”的含义。
本文所用术语“大约”或“接近”表示在给出值或范围的±20％内，优选在±15％内，更优选在±10％内，最优选在±5％内。
在本文整个说明书及以下的权利要求书中，除非上下文另有所指，词语“包含(comprise)”及其变形如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”应理解为意指包括所述整数或步骤或者整数或步骤的组，但不排除任意其它整数或步骤或者整数或步骤的组。本文所用术语“包含”又可用术语“含有”或“包括”替代，或本文所用术语有时可用术语“具有”替代。
本文所用“由...组成”排除未在要求保护的要素中具体提到的任一要素、步骤或成分。当本文使用“基本上由...：组成”时不排除对权利要求的基本和新特征没有重大影响的材料或步骤。
在本文每个实例中任一术语“包含”、“基本上由...组成”和“由...组成”可用其它二词中任一取代。
发明内容
表位簇1、2、3、4、5、6、7由BCMA的胞外结构域组成。“BCMA的胞外结构域”或“BCMA ECD”是指基本上不含BCMA跨膜结构域及胞质结构域的BCMA的一种形式。技术人员可以理解，鉴定的本发明所述BCMA多肽的跨膜结构域是根据本领域用于识别这种疏水结构域的常规采用标准进行鉴别的。跨膜结构域的精确边界可以变化，但最可能在本文具体提及的结构域的任一末端处变化不超过约5个氨基酸。优选的BCMA ECD示于SEQID NO：1007。一种优选的鼠ECD示于SEQ ID NO：1008。
表位簇1对应于人BCMA胞外结构域(SEQ ID NO：1007)的氨基酸1至7，表位簇2对应于人BCMA胞外结构域(SFQ ID NO：1007)的氨基酸8至21，表位簇3对应于人BCMA胞外结构域(SEQ ID NO：1007)的氨基酸24至41，表位簇4对应于人BCMA胞外结构域(SEQ ID NO：1007)的氨基酸42至54，表位簇5对应于人BCMA胞外结构域(SEQ ID NO：1007)氨基酸22，表位簇6对应于人BCMA胞外结构域(SEQ ID NO：1007)的氨基酸25，表位簇7对应于人BCMA胞外结构域(SEQ ID NO：1007)的氨基酸39。设想到表位簇5至7代表单一氨基酸置换。
T细胞CD3受体复合物是一种蛋白质复合物，由四个不同的链组成。在哺乳动物中，该复合物包含一个CD3γ链、一个CD3δ链及两个CD3ε(epsilon)链。这些链与称为T细胞受体(TCR)的分子和ζ链结合从而在T淋巴细胞中产生活化信号。
由双特异性分子通过募集T细胞导致的靶细胞的重新定向裂解涉及溶细胞突触的形成和穿孔素及颗粒酶的传递。参与的T细胞能够进行连续的靶细胞裂解，且不会受到干扰肽抗原处理及传递的免疫逃逸机制或克隆T细胞分化的影响；参见，例如，WO2007/042261。
从本公开的意义上说，术语“结合分子”表示能够(特异性地)与靶分子BCMA和CD3结合、相互作用或识别的任意分子。根据本发明所述，优选的结合分子是多肽。该种多肽可包括蛋白质性部分和非蛋白质性部分(如化学连接物或化学交联剂，如戊二醛)。
如此说来，结合分子为所述一种或多种结合结构域提供了支架，从而使所述结合结构域能与靶分子BCMA和CD3结合/相互作用。例如，这种支架可以由蛋白质A提供，特别是其Z-结构域(亲和体)、ImmE7(免疫蛋白)、BPTI/APPI(库尼茨结构域)、Ras-结合蛋白AF-6(PDZ-结构域)、卡律布德蝎毒素(蝎毒素)、CTLA-4、Min-23(打结素)、脂质运载蛋白(anticalin)、新制癌菌素、纤连蛋白结构域、锚蛋白共有重复结构域或硫氧还原蛋白(Skerra，Curr.Opin.Biotechnol.18，295-304(2005)；Hosse等，Protein Sci.15，14-27(2006)；Nicaise等，Protein Sci：13，1882-1891(2004)；Nygren和Uhlen，Curr.Opin.Struc.Biol.7，463-469(1997))。优选的结合分子是抗体。
也可以设想到本发明所述结合分子除其与靶分子BCMA和CD3结合的功能外还具有其它功能。在这种情况下，结合分子是三-或多功能结合分子，其通过与BCMA结合靶向浆细胞，通过CD3结合介导细胞毒性T细胞的活性并提供进一步的功能，如通过募集效应细胞如NK细胞来介导抗体-依赖的细胞毒性的功能完整的Fc恒定结构域、标记(荧光等)、治疗剂如毒素或放射性核素和/或增强血清半衰期的方式等。
本文所用术语“双特异性”是指包含至少第一和第二结合结构域的结合分子，其中第一结合结构域能够结合至一个抗原或靶标，第二结合结构域能够结合至另一抗原或靶标。本发明所述“结合分子”也包含多特异性结合分子，如三特异性结合分子，后者包含三个结合结构域。
设想到，结合分子由噬菌体展示或文库筛选方法产生(或可得到)，而不是通过将CDR序列从预先存在的(单克隆)抗体嫁接到支架中，所述支架例如本文所公开的支架。
术语“结合结构域”与本发明联合表征这样的结构域，该结构域能够特异性与靶分子BCMA和CD3上给定的靶表位或给定靶位点结合/相互作用。
结合结构域可源自结合结构域供体，如抗体、蛋白质A、ImmE7(免疫蛋白)、BPTI/APPI(库尼茨结构域)、Ras-结合蛋白AF-6(PDZ-结构域)、卡律布德蝎毒素(蝎毒素)、CTLA-4、Min-23(打结素)、脂质运载蛋白(anticalin)、新制癌菌素、纤连蛋白域、锚蛋白共有重复结构域或硫氧还原蛋白(Skerra，Curr.Opin.Biotechnol.18，295-304(2005)；Hosse等，Protein Sci.15，14-27(2006)；Nicaise等，Protein Sci.13，1882-1891(2004)；Nygren和Uhlen，Curr.Opin.Struc.Biol.7，463-469(1997))。优选的结合结构域源自抗体。设想到，本发明所述结合结构域包括至少前述结合结构域的任一的所述部分，要求该部分与靶分子BCMA和CD3上给定的靶表位或给定靶位点结合/相互作用。
设想到，前述结合结构域供体的结合结构域以这些供体的这一部分为特征，该部分负责结合相应的靶标，即当这一部分从结合结构域供体移除时，所述供体就失去了其结合能力。“失去”是指与结合供体相比结合能力至少下降50％。绘制这些结合位点的图谱的方法为本领域熟知的——因此，其在本领域技术人员定位/绘制结合结构域供体的结合位点且由此从相应的结合结构域供体“衍生”出所述结合结构域的标准知识范围内。
术语“表位”是指与结合结构域特异性结合的抗原上的位点，如抗体或免疫球蛋白或者抗体或免疫球蛋白的衍生物或片段。“表位”为抗原性的，因此本文所述术语表位有时也指“抗原性结构”或“抗原决定簇”。因此，所述结合结构域为“抗原-相互作用-位点”。所述结合/相互作用也可理解为定义“特异性识别”。在一个实例中，所述与靶分子BCMA和CD3上给定的靶表位或给定靶位点(特异性)结合/相互作用的结合结构域是抗体或免疫球蛋白，且所述结合结构域为抗体或免疫球蛋白的VH和/或VL区。“表位”既可由邻接氨基酸也可由通过蛋白质的三级折叠而并列的非邻接氨基酸形成。
“线性表位”是其中氨基酸一级序列含有识别表位的表位。在一个特定的序列中，线性表位通常包括至少3个或至少4个、更通常至少5个或6个或至少7个、例如约8个至约10个氨基酸。
与线性表位相比，“构象表位”是这样的表位，其中包含所述表位的氨基酸一级序列不是识别的表位的唯一定义部件(如，其中氨基酸的一级序列不一定被结合结构域识别的表位)。典型的构象表位相对于线性表位包含数量增加的氨基酸。关于构象表位的识别，所述结合结构域识别抗原、优选肽或蛋白质或其片段的三维结构(在本发明的上下文中，任一结合结构域的抗原包含在BCMA蛋白内)。例如，当蛋白分子折叠形成三维结构时，形成构象表位的某些氨基酸和/或多肽骨架成为并列形式，从而使该抗体能够识别所述表位。确定表位构象的方法包括、但不限于，X-射线晶体学、二维核磁共振(2D-NMR)谱和定点自旋标记法及电子顺磁共振(EPR)光谱。另外，本文提供的实例描述了检测给定结合结构域是否与给定蛋白、特别是BCMA的一个或多个表位簇结合的进一步的方法。
本文所用术语“表位簇”表示位于抗原的限定邻接部分中的表位的整体。表位簇可以包含一个、两个或更多个表位。在本文中本发明所定义的在BCMA的胞外结构域中的表位簇如上所述并示于表1。
术语“(能够)与...结合”、“特异性识别”、“指向”和“与...相互作用”是指与依照本发明所述结合结构域能够特异性与表位的一个或多个、优选至少两个、更优选至少三个且最优选至少四个氨基酸结合。
本文所用术语“特异性相互作用”、“特异性结合”或“特异性的结合”是指结合结构域对特定蛋白或抗原表现出可估量的亲和性，并且通常不会对除BCMA或CD3之外的蛋白质或抗原表现出显著的反应性。“可估量的亲和性”包括以约10-6M(KD)或更强的亲和性结合。优选地，当结合亲和性为约10-12至10-8M、10-12至10-9M、10-12至10-10M、10-11至10-8M、优选为约10-11至10-9M时，所述结合被认为是特异性的。尤其是通过将所述结合结构域与靶蛋白或抗原的反应与所述结合结构域与除BCMA或CD3之外的蛋白质或抗原的反应进行比较，可以测定结合结构域是否特异性与靶标反应或结合。优选地，本发明所述结合结构域基本上不结合或不能够结合除BCMA或CD3以外的蛋白质或抗原(即，第一结合结构域不能与BCMA以外的蛋白质结合且第二结合结构域不能与CD3以外的蛋白质结合)。
人们认为特异性结合受到结合结构域和抗原的氨基酸序列中的特异性基序的影响。因此，结合的发生是由于其一级、二级和/或三级结构以及所述结构的二级修饰的结果。抗原-相互作用-位点与其特异性抗原之间的特异性相互作用可能导致所述位点与抗原的简单结合。另外，作为另外一种选择或除此之外，抗原-相互作用-位点与其特异性抗原的特异性相互作用可能导致信号的启动，如由于抗原构象的改变、抗原寡聚化等的诱导等。
术语“基本上不结合”或“不能够结合”是指本发明所述结合结构域不结合除BCMA或CD3之外的另一蛋白质或抗原，即当与BCMA或CD3的结合分别设定为100％时，该结合结构域与除BCMA或CD3以外的蛋白或抗原表现出的反应性不超过30％，优选不超过20％，更优选不超过10％，特别优选不超过9％、8％、7％、6％或5％。
“蛋白质”(包含其片段，优选生物活性片段，以及通常具有少于30个氨基酸的肽)包含通过共价肽键彼此相连的一个或多个氨基酸(从而产生一个氨基酸链)。本文所用术语“多肽”描述了一组由超过30个氨基酸组成的分子。多肽可更进一步形成多聚体如二聚体、三聚体及更高的低聚体，即由多于一个多肽分子组成。形成此类二聚体或三聚体等的多肽分子可以相同或不同。这种多聚体对应的较高阶结构因此称为同源二聚体或异源二聚体，同源三聚体或异源三聚体等。一个异源多聚体的实例是抗体分子，在其天然存在的形式中由两个相同的轻多肽链和两个相同的重多肽链组成。术语“多肽”和“蛋白质”也指经天然修饰的多肽/蛋白，其中所述修饰由如蛋白质翻译后修饰(如糖基化、乙酰化、磷酸化等)产生。本文所提到的“多肽”也可以经化学修饰，如经聚乙二醇化。这些修饰是本领域熟知的。
术语“氨基酸”或“氨基酸残基”通常指具有其本领域公知定义的氨基酸，如选自以下的氨基酸：丙氨酸(Ala或A)；精氨酸(Arg或R)；天冬酰胺(Asn或N)；天冬氨酸(Asp或D)；半胱氨酸(Cys或C)；谷氨酰胺(Gln或Q)；谷氨酸(Glu或E)；甘氨酸(Gly或G)；组氨酸(His或H)；异亮氨酸(He或I)；亮氨酸(Leu或L)；赖氨酸(Lys或K)；甲硫氨酸(Met或M)；苯丙氨酸(Phe或F)；脯氨酸(Pro或P)；丝氨酸(Ser或S)；苏氨酸(Thr或T)；色氨酸(Trp或W)；酪氨酸(Tyr或Y)；及缬氨酸(Val或V)，尽管可以根据需要使用修饰、合成或罕见的氨基酸。通常，可以根据所具有的非极性侧链(如Ala、Cys、He、Leu、Met、Phe、Pro、Val)；具有负电荷的侧链(如Asp、Glu)；具有正电荷的侧链(如Arg、His、Lys)或不带电荷的极性侧链(如Asn、Cys、Gln、Gly、His、Met、Phe、Ser、Thr、Trp和Tyr)将氨基酸分组。
术语“抗体”的定义包括如单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、人源化抗体及人抗体的实施方案。除全长抗体之外，该定义还包括抗体衍生物及抗体片段，尤其是Fab片段。抗体片段或衍生物进一步包括F(ab′)2、Fv、scFv片段或单结构域抗体如结构域抗体或纳米抗体、包含可能为VHH、VH或VL的仅一个可变结构域的单可变结构域抗体或免疫球蛋白单可变结构域，其独立于其它V区或结构域特异性结合抗原或表位；参见，例如Harlow和Lane(1988)和(1999)，上述引文；Kontermann和Dübel，Antibody Engineering，Springer，2nded.2010and Little，Recombinant Antibodies for Immunotherapy，CambridgeUniversity Press2009。所述术语也包括双链抗体或双亲和性再靶向(DART)抗体。进一步设想到(双特异性)单链双链抗体、串联双链抗体(Tandab’s)、由如下所列结构示例的“微抗体”：(VH-VL-CH3)2、(scFv-CH3)2或(scFv-CH3-scFv)2；“Fc DART抗体”及“IgG DART”抗体；及多链抗体如三链抗体。
免疫球蛋白单可变结构域不仅包括分离的抗体单可变结构域多肽，而且还包括较大多肽，该种多肽含有抗体单可变结构域多肽序列的一个或多个单体。
免疫球蛋白单可变结构域不仅包括分离的抗体单可变结构域多肽，而且还包括较大多肽，该种多肽含有抗体单可变结构域多肽序列的一个或多个单体。
本领域已知可以用于这种抗体和/或其片段的生产的各种方法。因此，可以通过模拟肽生产(抗体)衍生物。另外，所述用于生产单链抗体的技术(尤其参见美国专利4,946,778，Kontermann和Dübel(2010)，上述引文和Little(2009)，上述引文)可以适用于生产对所选定的多肽具有特异性的单链抗体。此外，转基因动物可用于表达对本发明的多肽和融合蛋白具有特异性的人源化抗体。对于单克隆抗体的制备，可以采用提供通过连续细胞系培养生产的抗体的任何技术。此类技术的实例包括杂交瘤技术和Milstein Nature256(1975)，495-497)、三源杂交瘤技术、人B-细胞杂交瘤技术(Kozbor，Immunology Today4(1983)，72)及用于生产人单克隆抗体的EBV杂交瘤技术(Cole等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.(1985)，77-96)。可以使用BIAcore系统中的表面等离子体共振来增加噬菌体抗体与靶多肽(例如CD3ε)的表位结合的效率(Schier，Human Antibodies Hybridomas7(1996)，97-105；Malmborg，J.Immunol.Methods183(1995)，7-13)。另外设想到在本发明的上下文中，术语“抗体”包含可以在下文所述宿主中表达的抗体构建体，如可以通过特别是病毒或质粒载体转染和/或转导的抗体构建体。
另外，本文所用术语“抗体”也涉及本文描述的与所述抗体具有相同特异性的所述抗体的衍生物或变体。“抗体变体”的实例包括非人抗体的人源化变体、“亲和性成熟的”抗体(参见例如Hawkins等.J.Mol.Biol.254，889-896(1992)和Lowman等，Biochemistry30，10832-10837(1991))和效应功能改变的抗体突变体(参见例如美国专利5,648,260，Kontermann和Dübel(2010)，上述引文和Little(2009)，上述引文)。
一种制备抗体的示例性方法包括蛋白质表达文库(如噬菌体或核糖体展示文库)的筛选。噬菌体展示描述于如Ladner等美国专利No.5,223,409；Smith(1985)Science228：1315-1317；Clackson等(1991)Nature，352：624-628中。
除了展示文库的使用，所述指定抗原可用于免疫接种非人动物，如啮齿类动物，如鼠、仓鼠或大鼠。在一个实施例中，所述非人动物包含人免疫球蛋白基因的至少一部分。例如，可采用人Ig基因座的大片段对在小鼠抗体生产方面具有缺陷的小鼠品系进行基因工程。使用杂交瘤技术，可以生产和筛选源自具有期望特异性的基因的抗原-特异性单克隆抗体。参见例如XENOMOUSETM、Green等.(1994)Nature Genetics7：13-21、US2003-0070185、WO96/34096和WO96/33735。
抗体或其片段还可以通过特异性缺失人T细胞表位或通过描述于WO98/52976和WO00/34317中的方法“去免疫化”来修饰。简言之，可以针对结合MHC-II类的肽，分析抗体重链和轻链的可变结构域；这些肽表示潜在T细胞表位(如WO98/52976和WO00/34317中所定义)。对于潜在T细胞表位的测定，可以应用一种称为“肽线程”的计算机建模方法，另外可以在人MHC-II类结合肽的数据库中搜索存在于VH和VL序列中的基序，如WO98/52976和WO00/34317中所描述。这些基序结合至任一18种主要的MHC-II类DR同种抗免疫球蛋白，从而构成潜在T细胞表位。可以通过置换可变结构域中的少量氨基酸残基，或优选通过单一氨基酸置换来去除检测到的潜在T-细胞表位。典型地，进行保守型置换。通常可使用与人生殖细胞系抗体序列中的位置所共有的氨基酸，但不限于此。如描述于Tomlinson等(1992)J.MoI.Biol.227：776-798；Cook，G.P.等(1995)Immunol.Today Vol.16(5)：237-242；和Tomlinson等(1995)EMBO J.14：14：4628-4638中的人生殖细胞系序列。V BASE目录提供人免疫球蛋白可变区序列的详尽目录(由Tomlinson，LA等MRC Centre for Protein Engineering，Cambridge，UK编汇)。这些序列可用作人序列的来源，如提供框架区及用于CDR。也可以使用共有的人框架区，如美国专利No.6,300,064中所述。
VH和VL的成对一起形成单一抗体结合位点。最接近VH的CH结构域称为CH1。每个L链通过一个共价二硫键连接至H链，而基于H链同工型，两个H链通过一个或多个二硫键相互结合。VH和VL结构域由被称为框架区的相对保守的四个区(FR1、FR2、FR3和FR4)组成，其形成高变序列的三个区(互补决定区即CDR)的支架。所述CDR包含负责抗体与抗原特异性相互作用的大多数残基。CDR称为CDR1、CDR2和CDR3。因此，重链上的CDR组分称为H1、H2及H3，而轻链上的CDR组分称为L1、L2及L3。
术语“可变的”是指免疫球蛋白结构域的在其序列中表现出变异性的且涉及决定特定抗体的特异性和结合亲和性的部分(即，“可变结构域”)。变异性并非均匀分布于抗体的整个可变结构域；其集中在重链及轻链可变区的子结构域中。
这些子结构域被称为“高变”区或“互补决定区”(CDR)。可变结构域的较保守(即非高变的)部分被称为“框架”区(FRM)。天然存在的重链和轻链的可变结构域各自包含四个FRM区，所述四个FRM区大多采用β-折叠结构，其由三个高变区连接形成环状连接，并且在某些情况下形成β折叠结构的部分。FRM使得每条链的高变区与其它链的高变区靠近在一起，从而有助于抗原-结合位点的形成(参见Kabat等，上述引文)。恒定结构域并不直接涉及于抗原结合，但表现出多种效应物功能，如，例如抗体-依赖性的、细胞-介导的细胞毒性及补体活化。
本文所用术语“高变区”(也被称为“互补决定区”或CDR)是指位于免疫球蛋白的V-区结构域(通常是具有极端序列变异性的三个或四个短区)的抗体的氨基酸残基，所述氨基酸残基形成抗原-结合位点并是抗原特异性的主要决定因素。至少有两种方法来鉴别CDR残基：(1)基于跨物种序列变异性的方法(即Kabat等，上述引文)；和(2)基于抗原-抗体复合物的晶体学研究的方法(Chothia，C：等，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。然而，就两个残基鉴别技术界定重叠区而非相同区而言，可将其组合以定义杂合CDR。但是，一般而言，所述CDR残基的鉴别优选根据所谓的Kabat(编号)系统进行。
本文所用术语“抗原-结合结构域”、“抗原-结合片段”及“抗体结合区”是指抗体分子的一部分，该部分包含负责抗体与抗原之间特异性结合的氨基酸。被抗体特异性识别和结合的抗原的一部分称为本文上述的“表位”。如上所述，抗原-结合结构域可以典型地包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)；但是其不必同时包含两个可变区。例如，Fd片段具有两个VH区，其常常保留完整抗原-结合结构域的某个抗原-结合功能。抗体的抗原-结合片段的实例包括(1)Fab片段，其是一种具有VL、VH、CL及CH1结构域的单价片段；(2)F(ab′)2片段，其为具有由在绞链区的二硫键连接的两个Fab片段的一种二价片段；(3)Fd片段，其具有两个VH和CH1结构域；(4)Fv片段，其具有抗体单臂的VL和VH结构域；(5)dAb片段(Ward等，(1989)Nature341：544-546)，其具有VH域；(6)分离的互补决定区(CDR)，及(7)单链FV(scFv)，优选为后者(例如源自scFV文库)。尽管Fv片段的两个结构域即VL和VH是由独立的基因编码的，但是使用重组的方法可以将其连接，通过合成的连接子能够使它们成为单一蛋白链，该蛋白链中的VL和VH区成对形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如Huston等.(1988)Proc.Natl.Acad.SciUSA85：5879-5883)。这些抗体片段采用本领域技术人员已知的常规技术得到，并且根据与完整抗体相同的方法来评估这些片段的功能。
本文所用术语“单克隆抗体”是指从基本上为均质性抗体的群中得到的一种抗体，即，除去可能少量存在的可能天然发生的突变和/或翻译后修饰(如异构化、酰胺化)，组成该群的单个抗体是相同的。单克隆抗体具有高度特异性的，其针对单一的抗原位点。另外，与典型地包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制备物相比，每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除其特异性之外，单克隆抗体的优点在于其通过杂交瘤培养合成，从而未被其它免疫球蛋白污染。修饰词“单克隆”是指从基本上为均质性抗体的群中得到的抗体的特性，而不应当解释为要求通过任何特定的方法来生产抗体。例如，依据本发明所使用的单克隆抗体可以首先通过描述于Kohler等，Nature，256：495(1975)中的杂交瘤方法制备，或可以通过重组DNA方法制备(参见例如美国专利No.4,816,567)。例如，所述“单克隆抗体”还可采用Clackson等，Nature，352：624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)中描述的技术从噬菌体抗体文库中分离。
本发明的单克隆抗体具体地包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其重链和/轻链的部分与源自特定物种或属于特定抗体类型或亚类的抗体的相应序列是相同的或是同源的，而其链的剩余部分与源自另一物种或属于另一抗体类型或亚类的抗体的相应序列是相同的或是同源的，以及这种抗体的片段，只要其能表现出期望的生物活性即可(美国专利No.4,816,567；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855(1984))。本文感兴趣的嵌合抗体包括“灵长类动物化”抗体，该抗体包含源自非人灵长动物类(如旧世界猴、猿(Ape)等)和人恒定区序列的可变结构域抗原-结合序列。
单克隆抗体可以从非人动物中获得，然后可使用本领域已知的重组DNA技术生产进行经修饰如人源化、去免疫化、嵌合化的。已经描述了用于制备嵌合抗体的多种方法。参见例如Morrison等，Proc.Natl.Acad.ScL U.S.A.81：6851，1985；Takeda等，Nature314：452，1985，Cabilly等，美国专利No.4,816,567；Boss等，美国专利No.4,816,397；Tanaguchi等，EP0171496；EP0173494，GB2177096。
非人(如鼠)抗体的“人源化”形式是大部分人序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2或抗体的其它抗原-结合亚序列)，其包含极少数的源自非人免疫球蛋白的序列。多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的高变区(即CDR)的残基被来自如具有所需特异性、亲和性和能力的小鼠、大鼠或兔的非人物种(供体抗体)的高变区的残基替代。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被相应的非人残基替代。此外，本文所用“人源化抗体”可还包括既不存在于受体抗体也不存在于供体抗体中的残基。进行这些修饰是为了进一步改进和优化抗体的性能。所述人源化抗体可选的还包括，免疫球蛋白(特别是人免疫球蛋白)恒定区(Fc)的至少一部分。关于进一步的细节，参见Jones等，Nature，321：522-525(1986)；Reichmann等，Nature，332：323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2：593-596(1992)。人源化抗体还可使用如转基因小鼠生产，所述小鼠表达人重链和轻链基因，而不能表达内源小鼠免疫球蛋白重链和轻链基因。Winter描述了一种可以用于制备本文所述人源化抗体的示例性CDR-移植方法(美国专利No.5,225,539)。特定人抗体的的所有CDR都可被非人CDR的至少一部分替代，或仅仅某些CDR可被非人CDR替代。其只需替代人源化抗体与预定抗原结合所需的CDR数目。
人源化抗体或其片段可以例如通过替代Fv可变结构域的序列来产生，所述Fv可变结构域的序列不直接涉及抗原与来自人Fv可变结构域的等价序列的结合。Morrison(1985)Science229：1202-1207；Oi等.(1986)BioTechniques4：214；和US5,585,089；US5,693,761；US5,693,762；US5,859,205；和US6,407,213提供了用于生产人源化抗体或其片段的示例性方法。这些方法包括分离、操纵及表达编码来自重链或轻链至少一个的所有或部分免疫球蛋白Fv可变结构域的核酸序列。这种核酸可以从杂交瘤中获得，该杂交瘤产生如上所述的针对预定靶标的抗体，也可从其它来源获得。编码人源化抗体分子的重组DNA随后可被克隆至合适的表达载体中。
可以通过保守置换、共有序列置换、种系置换和/或回复突变的引入来优化人源化抗体。这类免疫球蛋白分子的改变可以通过本领域已知的数种技术中任一种来实现(如Teng等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，80：7308-7312，1983；Kozbor等，Immunology Today，4：7279，1983；Olsson等，Meth.Enzymol.，92：3-16，1982)，并且也可依据EP239400的教导实现。
术语“人抗体”包括具有基本上与本领域已知的人生殖细胞系免疫球蛋白序列相应的可变区和恒定区的抗体，包含如由Kabat等(参见Kabat等(1991)上述引文)描述的抗体。本发明的人抗体可包括并非由人生殖细胞系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(如在体内通过随机或位点特异性诱变引入或在体内通过体细胞突变引入的突变)，在如CDR中，特别是在CDR3中。人抗体可具有至少一个、两个、三个、四个、五个或更多个被并非由人生殖细胞系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基替代的位点。
本文所用“体外产生的抗体”是指可变区(如至少一个CDR)的全部或部分是在无免疫力的细胞筛选(如体外噬菌体展示、蛋白质芯片或其它任何能够测定候选序列与抗原结合能力的方法)中产生的抗体。因此该术语优选不包括在免疫细胞中由基因组重排产生的序列。
“双特异性”或“双功能性”抗体或免疫球蛋白是具有两个不同重/轻链对及两个不同结合位点的人工杂交抗体或免疫球蛋白。双特异性抗体可以通过包括杂交瘤的融合技术或Fab’片段连接技术在内的多种方法生产。参见例如Songsivilai&Lachmann，Clin.Exp.Immunol.79：315-321(1990)。本领域已知的许多方法可用来得到抗体或其抗原-结合片段。例如可以采用重组DNA法来生产抗体(美国专利No.4,816,567)。根据已知的方法单克隆抗体也可以通过杂交瘤的产生来生产(参见例如Kohler和Milstein(1975)Nature，256：495-499)。以这种方式形成的杂交瘤之后通过标准方法(如酶联免疫吸附测定(ELISA)和表面等离子共振(BIACORETM)分析法)进行筛选，从而识别一个或多个杂交瘤，所述杂交瘤产生与指定抗原特异性结合的抗体。所述指定抗原的任一形式都能用作免疫原，如重组抗原、天然存在的形式、任一变体或其片段以及其抗原肽。
术语“CDR”及其复数形式“CDRs”，是指互补决定区(CDR)，其中三个构成轻链可变区的结合特性(CDRL1、CDRL2和CDRL3)，三个构成重链可变区的结合特性(CDRH1、CDRH2和CDRH3)。CDR有助于抗体分子的功能活性并被构成骨架或框架区的氨基酸序列分隔。确切定义上的CDR的边界及长度受到不同分类和编号系统的影响。因此，所述CDR可以参考Kabat、Chothia、接触或其他任何边界的定义，包括本文描述的编号系统。尽管具有不同的边界，这些系统的每一个在构成可变序列中的所谓“高变区”时有一定程度的重叠。因此依据这些系统的CDR定义可以就临近的框架区在长度和边界区方面有所不同。参见如Kabat、Chothia、和/或MacCallum(Kabat等，上述引文；Chothia等，J.MoI.Biol，1987，196：901；和MacCallum等.，J.MoI.Biol，1996，262：732)。但是，依据所谓的Kabat系统的编号是优选的。
典型地，CDR形成一个可以分类为经典结构的环形结构。术语“经典结构”是指抗原结合(CDR)环所采用的主链构象。通过比较结构的研究发现，六个抗原结合环中的五个仅具有限制性谱的可用构象。每个经典结构的特征可在于多肽骨架的扭转角。因此，抗体之间对应的环可以具有非常相似的三维结构，尽管这些环的大部分都具有高度氨基酸序列变异性(Chothia和Lesk，J.MoI.Biol.，1987，196：901；Chothia等，Nature，1989，342：877；Martin和Thornton，J.Mol.Biol，1996，263：800，它们中的每一个均通过全文引用并入)。此外，在采用的环结构与其周围的氨基酸序列之间存在联系。特定经典类型的构象是由环的长度和位于环内以及保守框架区(即环外部分)内关键位置的氨基酸残基决定的。因此，经典类型的分配可以在这些关键氨基酸残基存在的情况下进行。术语“经典结构”还可包括关于抗体的线性序列的考虑，如由Kabat进行的编目分类(Kabat等，上述引文)。Kabat编号方案(系统)是广泛认可的以一致的方式编码抗体可变结构域的氨基酸残基的标准，且是如本文别处提到的优选的用于本发明的方案。其它结构方面的考虑因素也可用于抗体经典结构的测定。例如，不能由Kabat编号全部反映的这些差异可以通过Chothia等的编号系统描述和/或通过其它技术(例如晶体学和二维或三维计算机建模)揭示。因此，一个给定的抗体序列能被置于经典类型，除其它事项外，该经典类型允许识别合适的基础(chassis)序列(如基于期望在文库中包含多种经典结构)。抗体氨基酸序列的Kabat编号和如Chothia等(上述引文)描述的结构考虑因素以及其对抗体结构的经典方面分析的影响都描述于文献中。
CDR3是典型的抗体-结合位点中分子多样性的最大来源。例如H3，可以短至两个氨基酸残基或超过26个氨基酸残基。不同类型的免疫球蛋白的亚基结构和三维构象是本领域熟知的。关于抗体结构的综述参见Antibodies：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，eds.Harlow等，1988。本领域技术人员能够认识到每个亚基结构(如CH、VH、CL、VL、CDR、FR结构)都包含活性片段，如结合至抗原结合的VH、VL或CDR亚基的部分，即抗原-结合片段，或，如结合至和/或激活如Fc受体和/或补体的CH亚基的部分。CDR典型地指Kabat CDR，如描述于Sequences of Proteins of immunologicalInterest，US Department of Health and Human Services(1991)，eds.Kabat等。另一个用于表征抗原结合位点的标准是指如由Chothia描述的高变环。参见如Chothia，等(1987；J.MoI.Biol.227：799-817)；和Tomlinson等(1995)EMBO J.14：4628-4638。还有另外一种标准是Oxford Molecular的AbM抗体建模软件使用的AbM定义。整体参见例如Protein Sequence and Structure Analysis ofAntibody Variable Domains.In：Antibody Engineering Lab Manual(Ed.：Duebel，S.和Kontermann，R.，Springer-Verlag，Heidelberg)。可选择地用所述的关于Chothia高变环或AbM定义环的相似的关系实施关于Kabat CDR所述实施方案。
在组装和体细胞突变后抗体基因的序列是高度可变的，并且这些可变的基因预计编码1010种不同的抗体分子(Immunoglobulin Genes，2nd ed.，eds.Jonio等，Academic Press，San Diego，CA，1995)。因此，免疫系统提供免疫球蛋白的谱。术语“谱”是指全部或部分源自至少一个编码至少一种免疫球蛋白的序列的至少一个核苷酸序列。所述序列可以通过在体内重链的V、D和J节段及轻链的V和J节段的重排而产生。或者，所述序列可以在响应于例如体外刺激发生重排的细胞中产生。或者，所述序列的部分或全部可通过DNA剪接、核苷酸合成、诱变及其它方法得到。参见如，美国专利5,565,332。一个谱可包括仅一个序列或可包括多个序列，包括在基因多样性集合中的所述序列。
术语“框架区”是指本领域已知的存在于较高变异度(即高变的)CDR之间的抗体可变区的部分。典型地，这种框架区被称为框架1至4(FR1、FR2、FR3和FR4)并在三维空间中为六个CDR(三个来自重链及三个来自轻链)的呈现提供支架，从而形成抗原-结合表面。
本发明的结合分子优选是“分离的”结合分子。当“分离的”用于描述本文所公开的结合分子时，是指结合分子已经从其生成环境的组分中被识别、分离和/或重新获得。优选地，分离的结合分子不含有与其生成环境相关的其它组分。其生成环境的污染组分，如由重组转染细胞产生的，是将典型地干扰多肽诊断或治疗用途的材料，且可包括酶、激素和其它蛋白质性或非蛋白质性的溶质。在一个优选的实施方案中，所述结合分子将纯化至(1)足以通过使用转杯测序仪获得N-末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(2)在非还原或还原条件下通过SDS-PAGE使用考马斯亮蓝或优选的银染得到均一性。然而，通常一个分离的抗体是通过至少一个纯化步骤制备的。
设想到本文所述结合分子的氨基酸序列的修饰。例如，提高抗体的结合亲和性和/或其它生物性能可以是可取的。所述结合分子的氨基酸序列变体是通过在结合分子核酸序列中引入适当的核苷酸变化或通过肽的合成作用制备的。
这种修饰包括，例如，结合分子氨基酸序列内残基的缺失和/或插入和/或置换。可进行缺失、插入和置换的任意组合以进入最终的构建体中，条件是最终的构建体具有期望特性。氨基酸的改变也可改变结合分子的翻译后过程，如改变糖基化位点的数目或位置。在CDR中，优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸可被置换，而在框架区(FR)中，优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或25个氨基酸可被置换。本文所述的置换优选为保守性置换。除此之外或作为另外一种选择，在每个CDR中可以插入或缺失1、2、3、4、5或6个氨基酸(当然，取决于CDR的长度)，而在每个FR中可以插入或缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或25个氨基酸。
一种用于识别结合分子的某些残基或区域为诱变发生的优选位置的有用方法称为“丙氨酸扫描诱变”，该方法由Cunningham和Wells在Science，244：1081-1085(1989)中描述。在该方法中，识别出结合分子中的一个残基或一组靶残基(如带电荷残基，如arg、asp、his、lys及glu)并被中性或带负电荷氨基酸(最优选为丙氨酸或聚丙氨酸)替代从而影响氨基酸与表位的相互作用。
然后显示出对于置换具有功能敏感性的这些氨基酸位置通过在置换位点的进一步或其它变体的引入进行精制。因此，尽管用于引入氨基酸序列变化的位点是预先确定的，但是突变本身的性质无需预先确定。例如，为了分析突变在给定位点的表现，在靶密码子或区域进行丙氨酸扫描或随机诱变并筛选具有所期望活性的表达的结合分子变体。
优选地，氨基酸序列插入包括长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个残基到包含一百个或更多个残基的多肽的氨基-和/或羧基-末端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入作用。所述结合分子的插入变体包括向抗体的N-或C-与酶的融合或与增加抗体血清半衰期的多肽的融合。
另一种类型的变体是氨基酸置换变体。优选地，这些变体具有结合分子中至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个的氨基酸残基被不同的残基替代。最感兴趣的取代型诱变位点包括重链及/或轻链的CDR，尤其是高变区，但亦设想到重链及/或轻链中的FR改变。
例如，如果CDR序列包含6个氨基酸，设想到这些氨基酸中的一个、两个或三个被置换。类似地，如果CDR序列包含15个氨基酸，设想到这些氨基酸中的一个、两个、三个、四个、五个或六个被置换。
通常，如果重链及/或轻链的一个或多个或全部CDR的氨基酸被置换，则获得的“经置换的”序列与“原始”CDR序列的同一性优选为至少为60％，更优选为65％，甚至更优选为70％，特别优选为75％，更特别优选为80％。其含义是“经置换的”序列与“原始”序列的同一性程度取决于CDR的长度。例如，一个具有5个氨基酸的CDR与其置换序列的同一性优选为80％，这是为了至少有一个被置换的氨基酸。因此，结合分子的CDR与其经置换的序列可以具有不同程度的同一性，如，CDRL1可具有80％，而CDRL3可具有90％。
优选的置换(或替代)是保守性置换。然而，设想到任何置换(包括非-保守性置换或一个或多个列于下文中表1的“示例性置换”)，只要结合分子保持其通过第一结合结构域与BCMA结合以及通过第二结合结构域与CD3ε结合的能力，和/或结合分子的CDR与随后被置换的序列具有同一性(与“原始”CDR序列的同一性至少为60％，更优选为65％，甚至更优选为70％，特别优选为75％，更特别优选为80％)。
保守性置换示于表1中“优选的置换”的标题下。如果这种置换导致生物活性的改变，则可以引入较大幅度的改变(在表1中称为“示例性置换”，或在下文中参照氨基酸类型进一步描述)并对产物进行期望特征的筛选。
表1：氨基酸置换
通过筛选在其维持下列效应上显著不同的置换来完成本发明的结合分子的生物特性的实质性修饰：(a)在置换区域的多肽骨架的结构，如折叠或螺旋构象；(b)分子在靶位点的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。基于常见侧链的特性，天然存在的残基被分为以下几种：(1)疏水性：正亮氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸；(2)中性亲水性：半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸；(3)酸性：天冬氨酸、谷氨酸；(4)碱性：天冬酰胺、gin、组氨酸、赖氨酸、精氨酸；(5)影响链取向的残基：甘氨酸、脯氨酸；和(6)芳香族的：色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸。
非-保守性置换需要将这些类型中的一种类型的成员与其它类型交换。可能置换不涉及维持结合分子的适当构象的任一半胱氨酸残基，通常采用丝氨酸来改进分子的氧化稳定性且防止异常交联生。相反，可将半胱氨酸键添加至抗体来提高其稳定性(特别是当抗体为抗体片段如Fv片段时)。
置换变体的特别优选的类型包括置换母体抗体(如人源化的或人抗体)的一个或多个高变区。通常，筛选出的用于进一步研究的所得变体与生成它们的母体抗体相比具有提高的生物特性。一种简便的生成这种置换变体的方法涉及使用噬菌体展示的亲和性成熟。简言之，数个高变区位点(如6-7位)进行突变，从而在每个位点都发生全部可能的氨基酸置换。由此产生的抗体变体以来自丝状噬菌体颗粒的单价形式展示，作为封装在各个颗粒内的M13的基因III产物的融合蛋白。本文所公开的噬菌体展示变体之后进行生物活性(如结合亲和性)的筛选。为了识别将要修饰的候选高变区位点，可以进行丙氨酸扫描诱变以识别对抗原结合具有显著贡献的高变区残基。作为另外一种选择或除此之外，进行抗原-抗体复合物晶体结构的分析可以是有益的，以识别结合结构域与如人BCMA之间的接触点。根据本文详述的技术，这种接触残基与相邻残基是用于置换的候选残基。一旦此类变体生成，按照本文所述方法进行这组变体的筛选，并且采用一种或多种相关分析法得到的具有优异性能的抗体将被筛选出并用于进一步研究中。
在本文中设想到结合分子的其它修饰。例如，结合分子可以连接至多种非蛋白质类聚合物中的一种，如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇与聚丙二醇的共聚物。也可以将所述结合分子包埋于所制备的微胶囊(例如分别为羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中，例如通过凝聚技术或通过界面聚合；包埋于胶状药物递送系统(如脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)；或包埋于粗乳液中。这些技术描述于Remington′s Pharmaceutical Sciences，16th edition，Oslo，A.，Ed.，(1980)。
本文所公开的结合分子也可制成免疫脂质体。“脂质体”是一种小囊，所述小囊包含多种类型的脂质、磷脂和/或对将药物投递于哺乳动物有用的表面活性剂。脂质体的组分通常以双层形式排列，这与生物膜的脂质排列相似。包含抗体的脂质体采用本领域已知方法制备，如描述于Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：3688(1985)；Hwang等，Proc.Natl Acad.Sci.USA，77：4030(1980)；美国专利No.4,485,045和No：4,544,545；和公开于1997年10月23日的WO97/38731。具有增强的循环时间的脂质体描述于美国专利No.5,013,556。特别有用的脂质体可通过逆相蒸发法制备，该脂质体具有包含磷脂胆碱、胆固醇和PEG-衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组成。通过限定孔径的滤器压出脂质体从而得到具有所需直径的脂质体。如Marti等J.Biol.Chem.257：286-288(1982)中所述，本发明的抗体的Fab′片段可通过二硫化物交换反应缀合至脂质体。任选地，所述脂质体中包含化疗剂。参见Gabizon等J.National Cancer Inst.81(19)1484(1989)。
当使用重组技术时，结合分子可在细胞内产生、在周质空间中产生或直接分泌至培养基中。若所述结合分子是在细胞内产生的，则作为第一步骤，是通过例如离心或超滤移除颗粒碎片，即宿主细胞或裂解片段。Carter等Bio/Technology10：163-167(1992)描述了用于分离被分泌到大肠杆菌的周质空间的抗体的操作。
从细胞中制备的结合分子组合物可以使用例如羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析及亲和层析法纯化，其中亲和层析法是优选的纯化技术。
在另一方面，本发明涉及编码本发明所述结合分子的核酸序列。术语“核酸”是本领域技术人员所熟知的且包含DNA(例如cDNA)和RNA(如mRNA)。核酸可以是双链也可以是单链的，可以是线性的也可以是环形的。所述核酸分子优选包含于载体中，而该载体优选包含于宿主细胞中。所述宿主细胞如在用本发明所述核酸序列转化或转染后，能够表达结合分子。为了达到该目的，核酸分子可操作地与控制序列相连。
载体是一种核酸分子，其用作将(外源)遗传物质运送至细胞中的工具。术语“载体”包含、但不限于质粒、病毒、粘粒及人工染色体。一般情况下，基因工程载体包含复制起点、多克隆位点和可选标记物。载体本身通常为核苷酸序列，常常是DNA序列，所述序列包括插入物(转基因)和用作载体“骨架”的较大的序列。现代载体除了转基因插入和骨架还包括另外的特征：启动子、遗传标记物、抗生素抗性、报告基因、靶向序列、蛋白质纯化标签。称为表达载体(表达构建体)的载体具体为用于在靶细胞中表达转基因，该载体通常具有控制序列，如驱动转基因表达的启动子序列。尽管病毒载体的插入也被称为“转导”，载体向靶细胞中的插入通常被称为细菌细胞的“转化”、真核细胞的“转染”。
本文所用术语“宿主细胞”意指通过转化、转染等方式引入了编码本发明所述结合分子的核酸的细胞。应当理解的是，这些术语不仅指特定的受体细胞，还指这些细胞的子代或潜在子代。因为由于突变或环境的影响，某些修饰可能在后代中出现，而这些后代实际上可能与母本细胞不同但是仍然包含在本文所用术语的范围内。
本文所用术语“表达”包含涉及于本发明所述结合分子生产的任一步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
术语“控制序列”是指可操作地连接的编码序列在特定宿主生物体中表达所必须的DNA序列。适用于原核生物的控制序列例如包括启动子，可选择地包含操纵子序列及核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、聚腺苷酸化信号和增强子。
当核酸与另一核酸序列处于一种功能性关系时，这种核酸是“可操作地连接的”。例如，如果前序列或分泌前导的DNA表达为参与多肽分泌的蛋白前体形式，则前序列或分泌前导的DNA与多肽的DNA是可操作地连接的；如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则其与该序列是可操作地连接的；或如果核糖体结合位点被设置以便促进翻译，则该核糖体结合位点与编码序列是可操作地连接的。通常，在分泌的前导是邻接的且处于阅读相的情况下，“可操作地连接的”指所连接的DNA序列是邻接的。但是，增强子不必是邻接的。连接是通过在合适的限制性位点通过连接反应完成的。如果这种位点不存在，则根据常规经验使用合成的寡核苷酸的衔接子或连接子。
术语“宿主细胞”、“靶细胞”、或“受体细胞”意指包括任意单一细胞或细胞培养物，所述细胞或细胞培养物能够或已经是载体或掺入外源核酸分子、多核苷酸和/或蛋白质的受体。该术语还意在包括单一细胞的子代，以及由于自然的、偶然的或有意的突变，所述子代与来源母细胞可能不必完全一致(在形态学或基因组学或全部DNA补体上)的子代。所述细胞可以是原核的或真核的，且其包括但不限于细菌细胞、酵母细胞、动物细胞和哺乳动物细胞(如鼠、大鼠、猕猴或人)。
合适的宿主细胞包括原核和真核宿主细胞，所述真核宿主细胞包括酵母菌、真菌、昆虫细胞以及哺乳动物细胞。
本发明所述的结合分子可以在细菌中生成。在表达后，本发明的结合分子、优选所述结合分子从大肠杆菌细胞糊料中以可溶级分分离出来，然后可以通过如亲和色谱和/或尺寸排阻法进行纯化。最后的纯化可以类似于用于纯化在如CHO细胞中表达的抗体的方法进行实施。
除原核生物外，真核微生物如丝状真菌或酵母菌也是克隆或表达本发明的结合分子的合适宿主。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或普通面包酵母是最常用的低等真菌宿主微生物。但是，一些其他属、种和菌株也常常适用于本发明，例如，粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces probe)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)宿主(如乳酸克鲁维酵母(K：lactis)、脆壁克鲁维酵母(K：fragilis)(ATCC12424)、保加利亚克鲁维酵母(K：bulgaricus)(ATCC16045)、威克拉姆氏克鲁维酵母(K：wickeramii)(ATCC24178)、瓦特氏克鲁维酵母(K：waltii)(ATCC56500)、果蝇克鲁维酵母(K：drosophilarum)(ATCC36906)、耐热克鲁维酵母(K：thermotolerans)及马克斯克鲁维酵母(K：marxianus)；耶氏酵母属(yarrowia)(EP402226)；巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(EP183070)；念珠菌属(Candida)；瑞氏木霉菌(Trichoderma reesia)(EP244234)；粗糙脉孢菌(Neurospora crasssa)；许旺氏酵母属(Schwanniomyces)(如西方许旺氏酵母(Schwanniomyces occidentalis))；及丝状真菌(如脉孢属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)及曲霉属(Aspergillus)宿主(如小巢状曲霉(A：nidulans)及黑曲霉(A：niger))。
用于表达本发明的糖基化结合分子(优选源自结合分子的抗体)的合适宿主细胞源自多细胞生物体。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经辨识出多种杆状病毒株和变体以及来自宿主的相应允许的昆虫宿主细胞，例如草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛毛虫)、埃及斑蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、白纹伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)(果蝇)及家蚕(Bombyx mori)。用于转染的多种病毒株是公开可获得的，如苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica NPV)L-1变体和家蚕核多角体病毒(Bombyx mori NPV)的Bm-5株，以及根据本发明所述可用作本文的病毒的此类病毒，特别是用于转染草地夜蛾细胞。
棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄、拟南芥和烟草的植物细胞培养物也可用作宿主。可用于在植物细胞培养物中生产蛋白质的克隆和表达载体是本领域技术人员已知的。参见，如Hiatt等，Nature(1989)342：76-78；Owen等(1992)Bio/Technology10：790-794；Artsaenko等(1995)The Plant J8：745-750；和Fecker等(1996)Plant Mol Biol32：979-986。
然而，人们最感兴趣的是脊椎动物细胞，而在培养(组织培养)中增殖脊椎动物细胞已经成为一个常规程序。可用哺乳动物宿主细胞系的实例是由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL1651)；人胚肾系(生长于悬浮培养物的293细胞或亚克隆的293细胞，Graham等，J.Gen Virol.36：59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77：4216(1980))；小鼠睾丸支持细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980))；猴肾细胞(CVI ATCCCCL70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL34)；布法罗大鼠肝细胞(BRL3A，ATCC CRL1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL75)；人肝细胞(Hep G2，14138065)；小鼠乳房肿瘤(MMT060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等，Annals N.YAcad.Sci.383：44-68(1982))；MRC5细胞；FS4细胞；及人肝癌细胞系(Hep G2)。
当采用重组技术时，本发明的结合分子能够在细胞内、周质空间中产生或直接分泌到培养基中。若所述结合分子是在细胞内产生的，则作为第一步骤，是通过例如离心或超滤移除颗粒碎片，即宿主细胞或裂解片段。Carter等Bio/Technology10：163-167(1992)描述了用于分离被分泌到大肠杆菌的周质空间的抗体的操作。简言之，细胞糊料在乙酸钠(pH3.5)、EDTA及苯甲基磺酰氟(PMSF)存在下解冻约30分钟。细胞碎片可通过离心移除。若抗体分泌到培养基中，则通常首先使用可商购获得的蛋白浓缩过滤器(例如Amicon或Millipore Pellicon公司的超滤单元)浓缩来自这种表达系统的上清液。在任一前述步骤中可包括蛋白酶抑制剂如PMSF，以抑制蛋白质水解，且可包括抗生素以阻止外来污染物的生长。
从宿主细胞制备的本发明的结合分子可通过例如羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析及层析法纯化，其中亲和层析法是优选的纯化技术。
亲和性配体最常连接的基质是琼脂糖，但也可以是其它可获得的基质。机械稳定的基质如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯与琼脂糖相比，其所能达到的流速较快且处理时间更短。其中本发明的结合分子包含CH3结构域时，可使用Bakerbond ABXM树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)进行纯化。根据待回收的抗体，也可使用其它蛋白质纯化技术，如在离子交换柱上分馏、乙醇沉淀、反相HPLC、硅胶色谱法、在肝素SEPHAROSETM上的色谱法、在阴离子或阳离子交换树脂(如聚天冬氨酸柱)上的层析法、层析聚焦技术、SDS-PAGE及硫酸铵沉淀。
在另一方面，提供了用于生产本发明的结合分子的方法，所述方法包括在允许结合分子表达的条件下培养本文所定义的宿主细胞，并从培养物中回收产生的结合分子。
术语“培养”是指在合适的条件下，在培养基中细胞的体外维持、分化、生长、增殖及/或繁殖。
在一个可选的实施方案中，提供包含本发明的结合分子或依据本发明的方法所生产的结合分子的组合物。优选地，所述组合物为药物组合物。
本文所用术语“药物组合物”涉及用于给患者(优选人患者)施用的组合物。本发明的特别优选的药物组合物包含本发明的结合分子。优选地，药学组合物包含合适的载体、稳定剂和/或赋形剂的制剂。在一个优选的实施方案中，所述药物组合物包含用于肠胃外、透皮、腔内、动脉内、鞘内和/或鼻内给药或直接注射入组织的组合物。特别设想到，所述组合物通过输注或注射施药于患者。合适的组合物给药可通过不同的方式完成，如通过静脉内、腹膜内、皮下、肌内、局部或皮内给药。特别地，本发明提供合适组合物的不间断给药。作为一个非限制性实例，不间断的即连续给药可以通过患者佩戴用于计量流入患者体内的治疗剂的小泵系统来实现。包含本发明的结合分子的药物组合物可以通过使用所述泵系统给药。该泵系统通常是本领域已知的，且其常依赖于定期更换包含要被注入的治疗剂的药筒。当更换在所述泵系统中的药筒时，其它情况下的治疗剂不间断流入患者体内的现象可能会发生暂时性中断。在这种情况下，仍将药筒更换前的给药阶段和药筒更换后的给药阶段仍被视为在本发明的药学方式和方法的含义之内，并一同构成这种治疗剂的“不间断”给药。
本发明的这些结合分子的连续的或“不间断的”给药可以是通过流体输送设备或小泵系统的方式在静脉内或皮下进行的，所述流体输送设备或小泵系统包括用于驱动流体从贮存器中流出的流体驱动机制和用于致动该驱动机制的致动机制。用于皮下给药的泵系统可以包括用于穿透患者皮肤并将合适的组合物递送至患者体内的针或插管。所述泵系统可直接固定于或附接至患者皮肤上独立于静脉、动脉或血管，从而使得该泵系统与患者皮肤之间直接接触。所述泵系统可以附接于患者皮肤24小时至数天。所述泵系统可以是小型尺寸并具有一个供小容积使用的储存器。作为一个非限制性的实例，用于要给药的合适药物组合物的储存器的容积可以在0.1与50ml之间。
连续的给药可通过佩戴于皮肤上的贴片并每隔一段时间更换的经皮给药的方式进行。本领域技术人员已知适用于本目的的药物递送的贴片系统。值得注意的是，经皮给药特别适用于不间断给药，因为可以有利地同时完成用完第一贴片后的新的第二贴片的更换，例如，将第二贴片放置于紧邻用完的第一贴片的皮肤表面并紧接着移除用完的第一贴片。不会出现流量中断或动力电池故障的问题。
本发明的组合物进一步可包含药学上可接受的载体。合适的药学载体的实例是本领域熟知的，包括溶液(如经磷酸盐缓冲的盐水溶液)、水、乳液(如油/水乳液)、各种类型的润湿剂、无菌溶液、脂质体等。包含这些载体的组合物可以通过本领域熟知的常规方法来配制。制剂可包括碳水化合物、缓冲液、氨基酸和/或表面活性剂。碳水化合物可以是非还原性糖，优选为海藻糖、蔗糖、八硫酸酯、山梨糖醇或木糖醇。通常，本文所用“药学上可接受的载体”是指与药学给药兼容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂与抗真菌剂、等渗剂与吸收延迟剂。这些介质及试剂在药学活性物质中的使用是本领域熟知的。在使用的剂量和浓度下，可接受的载体、赋形剂或稳定剂对受体是无毒的，其包括另外的缓冲剂；防腐剂；共溶剂；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫胺酸；螯合剂诸如EDTA；金属络合物(如Zn-蛋白复合物)；可生物降解的聚合物，如聚酯；形成盐的抗衡离子，如钠、多羟基糖醇类；氨基酸，如丙氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、2-苯丙氨酸及苏氨酸；糖类或糖醇，如海藻糖、蔗糖、八硫酸酯、山梨糖醇或木糖醇水苏糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、肌糖、半乳糖、乳糖醇、核糖醇、肌糖醇、半乳糖醇、丙三醇、环多醇(如环己六醇)、聚乙二醇；含硫还原剂，如谷胱甘肽、硫辛酸、硫代乙醇酸钠、硫代丙三醇、[α]-单硫代丙三醇及硫代硫酸钠；低分子量蛋白，诸如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或其它免疫球蛋白；及亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮。这些制剂可以用于连续给药，所述连续给药可以是使用和/或不使用泵系统的静脉内或皮下给药。氨基酸可以是带电氨基酸，优选为赖氨酸、赖氨酸醋酸盐、精氨酸、谷氨酸和/或组氨酸。表面活性剂可以是洗涤剂，优选具有＞1.2KD的分子量；和/或聚醚，优选具有＞3KD的分子量。优选洗涤剂的非限制性的实例为吐温20、吐温40、吐温60、吐温80或吐温85。优选聚醚的非限制性的实例为PEG3000、PEG3350、PEG4000或PEG5000。本发明中使用的缓冲系统优选的pH可以为5-9，可包括柠檬酸盐、琥珀酸盐、磷酸盐、组氨酸及乙酸盐。
本发明的组合物可以以合适的剂量施用于受试者，所述合适的剂量可以通过如剂量递增研究确定，该研究是将本文所述表现出跨物种特异性的本发明多肽的递增剂量给药于非黑猩猩灵长类动物，例如猕猴。如上所述，本文所述表现出跨物种特异性的本发明的结合分子可以以用于非黑猩猩灵长类动物的临床前实验中的相同形式有利地用作施予人的药物。这些组合物也可以与其它蛋白质性和非蛋白质性药物联合使用。这些药物可以与包含本文所定义的本发明的多肽的组合物同时给药，或在所述多肽给药之前或之后以规定的时间间隔和剂量单独给药。剂量方案由主治医生和临床因素来确定。正如医学领域众所周知的，对于任一患者的剂量取决于许多因素，包括患者的身高、体表面积、年龄、待施用的特定化合物、性别、给药的时间和途径、一般健康状况及同时施用的其它药物。
用于肠胃外给药的制剂包括无菌水溶液或非水溶液、悬浮液及乳液。非水溶剂的实例为丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油及可注射的有机酯如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外载体包括氯化钠溶液、林格氏(Ringer’s)右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸化林格氏液或不挥发油。静脉内载体包括流体与营养补充剂、电解质补充剂(如基于林格氏右旋糖的)等。同时也可以存在防腐剂和其它添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体等。此外，本发明的组合物可能还包含蛋白质性载体，如例如血清白蛋白或免疫球蛋白，所述蛋白优选的为人源蛋白。设想到本发明的组合物除包含本发明所定义的多肽外，还可能包含其它生物活性剂，这取决于该组合物的预期用途。这种试剂可以是作用于胃肠系统的药物、作为细胞抑制剂的药物、防止高尿酸血症的药物、抑制免疫反应的药物(如皮质类固醇)、调节炎症反应的药物、作用于循环系统的药物和/或本领域已知的试剂如细胞因子。也设想到本发明的结合分子用于共同治疗，即与另一种抗癌药物组合使用。
本文所定义的药物组合物的生物活性可以通过如细胞毒性法测定，如下述实例中、WO99/54440中或通过Schlereth等(Cancer Immunol.Immunother.20(2005)，1-12)描述。本文所用“功效”或“体内功效”是指对于本发明的药物组合物的治疗的反应，其使用例如标准化NCI反应标准。使用本发明的药物组合物的治疗功效或在体内的效力是指该组合物对其预期目的的效力，即所述组合物引起其预期效果的能力，即除去病理细胞如肿瘤细胞的能力。可以通过针对相应疾病实体的已建立标准方法来监测体内功效，所述方法包括但不限于白细胞计数、差异性、荧光启动型细胞分选、骨髓穿刺。此外，还可采用各种疾病特异性临床化学参数及其它已建立的标准方法。另外，可以采用计算机辅助断层扫描、X射线、核磁共振成像(如基于美国国家癌症研究所标准反应评估[Cheson BD，Horning SJ，Coiffier B，Shipp MA，Fisher RI，Connors JM，Lister TA，Vose J，Grillo-Lopez A，Hagenbeek A，Cabanillas F，Klippensten D，Hiddemann W，Castellino R，Harris NL，Armitage JO，Carter W，Hoppe R，Canellos GP.Report of an international workshop to standardizeresponse criteria for non-Hodgkin′s lymphomas.NCI Sponsored InternationalWorking Group.J Clin Oncol.1999Apr；17(4)：1244])、正电子发射断层扫瞄、白血球计数、差异性、荧光激活细胞分选、骨髓穿刺、淋巴结活组织检查/组织学检查及各种淋巴瘤特异性临床化学参数(如乳酸脱氢酶)及其它已建立的标准方法。
在药物如本发明的药物组合物研发中所面临的另一主要挑战是药代谢动力学性质的可预测调控。为此，可以建立候选药物的药代动力学曲线，即影响特定药物治疗给定病况的能力的药代动力学参数的情况。影响药物对治疗某个疾病实体能力的药物的药代动力学参数包括但不限于半衰期、分布容积、肝首过代谢及血清结合度。给定药物剂的功效可被上述任一参数影响。
“半衰期”是指所施用药物的50％通过生物过程(如代谢、排泄等)被消除所用的时间。
“肝首过代谢”是指在首次接触肝脏时，即在其第一次通过肝脏期间，药物发生代谢的倾向。
“分布容积”是指药物在体内不同隔室的保留程度，像如细胞内与细胞外间隙、组织和器官等，以及药物在这些隔室中的分布。
“血清结合度”是指药物与血清蛋白诸如白蛋白相互作用和与其结合而导致该药物的生物活性降低或丧失之倾向。
药代谢动力学参数还包括针对所施用药物的给定量的生物利用度、滞后时间(Tlag)、Tmax、吸收率、多发(more onset)及/或Cmax。“生物利用度”是指在血液隔室中的药物的量。“滞后时间”是指药物的给药与其在血液或血浆中检测出及可测得之间的时间延搁。
“Tmax”是指药物达到最大血液浓度所需要的时间，而“Cmax”是指由给定药物得到的最大血液浓度。药物达到其生物效应所需的血液或组织浓度的时间受到所有参数的影响。表现出跨物种特异性的双特异性单链抗体的药代动力学参数可如上文概述在非黑猩猩灵长类动物的临床前动物试验中测定，其也描述于如Schlereth等(Cancer Immunol.Immunother.20(2005)，1-12)的文献中。
本文所用术语“毒性”是指表现为不良事件或严重不良事件的药物毒性作用。这些副作用事件可能是指对于药物缺乏整体耐受性和/或在给药后缺乏局部耐受性。毒性也可包括该药物所引起的致畸或致癌作用。
本文所用术语“安全性”、“体内安全性”或“耐受性”定义在直接施药后(局部耐受性)以及用药后的一个较长时期内药物的施用不会诱导严重不良事件。“安全性”、“体内安全性”或“耐受性”可以在如治疗和后续追踪期间定期进行评价。测量包括临床评价，如器官的表现，以及实验室异常筛查。可以进行临床评价并依据NCI-CTC和/或MedDRA标准将相对于正常有偏差的结果记录/编码。器官的表现可包括如过敏/免疫学、血液/骨髓、心律失常、凝血功能等的标准，如阐述于如不良事件的通用术语标准第3.0版(CTCAE)中。可以进行测试的实验室参数包括如血液学、临床化学、凝血功能情况及尿液分析，及检查其它体液如血清、血浆、淋巴液或脊髓液、液体等。因此，可例如通过身体检查、成像技术(即超声、X光、CT扫描、核磁共振成像(MRI)、其它技术设备的测量(即心电图)、生命体征、通过实验室参数测量并记录不良事件而进行安全性评价。例如，根据本发明所述的用途与方法中的非黑猩猩灵长类动物的不良事件可通过组织病理学和/或组织化学方法检查。
术语“有效剂量”或“有效用量”的定义为足以达到或至少部分达到预期效果的量。术语“治疗有效剂量”的定义为足以治愈或至少部分阻止疾病及其在已经患有该病的患者体内的并发症的量。针对这一用途的有效量取决于感染的严重性和受试者自身免疫系统的一般状态。术语“患者”包括人和其它接受预防性或治疗性治疗的哺乳动物受试者。
本文所用术语“有效且无毒剂量”是指发明的结合分子的耐受剂量，所述剂量应当足够高从而引起病理细胞耗竭、肿瘤消除、肿瘤收缩或疾病的稳定，而不具有或基本不具有较大毒性作用。这一有效且无毒剂量可以通过如本领域描述的剂量递增研究测定，且该剂量应当低于诱导严重不良副作用的剂量(剂量限制性毒性，DLT)。
上述术语也在如Preclinical safety evaluation of biotechnology-derivedpharmaceuticals S6；ICH Harmonised Tripartite Guideline；ICH SteeringCommittee会议(1997年7月16日召开)中提到。
本发明的结合分子的合适剂量或治疗有效量取决于待治疗的病情、病情的严重性、先前的治疗以及患者的临床病史及对治疗剂的反应。所述合适的剂量可以根据主治医师的判断进行调整，从而使得该剂量可以一次施用于患者或者以一系列施药施用于患者。药物组合物根据需要可以作为单一治疗剂或与其它治疗方法如抗癌疗法联合使用。
本发明的药物组合物特别可用于肠胃外给药，即皮下、肌内、静脉内、关节内及/或滑膜内。肠胃外给药可通过单次快速静脉注射或连续输注进行。
若药物组合物已经被冻干，则在给药前所述冻干的物质首先应在适当的液体中重构。所述冻干的物质可重构在如抑菌性注射用水(BWFI)、生理盐水、磷酸盐缓冲液(PBS)或与冻干前蛋白质的相同制剂中。
本发明的结合分子或由本发明的方法生产的结合分子优选用于预防、治疗或改善选自增殖性疾病、肿瘤性疾病或免疫障碍的疾病。
本发明的一个可选的实施方案提供一种用于预防、治疗或改善选自增殖性疾病、肿瘤性疾病或免疫障碍的疾病的方法，所述方法包括给有此需要的患者施用本发明的结合分子或由本发明的方法生产的结合分子的步骤。
本文所描述的制剂作为药物组合物在有此需要的患者中治疗、改善和/或预防如本文中所述的病理性医学病况中是有用的。术语“治疗”是既指治疗性治疗，也指预防或防止性措施。治疗包括将制剂应用于或施用于机体、分离的组织或来自患有疾病/障碍、具有疾病/障碍的症状或具有对疾病/障碍的倾向的患者的细胞，其目的是治愈、治疗、缓解、减轻、改变、补救、改善、增进或影响疾病、该疾病的症状或罹患该疾病的倾向。
那些“需要治疗的”包括那些已经患有障碍以及需要预防该障碍的患者。术语“疾病”是指能够从用本文描述的蛋白质制剂的治疗中获益的任何病况。其包括慢性和急性障碍或疾病，所述障碍或疾病包括使哺乳动物罹患所探讨疾病的倾向的那些病理状况。本文所述待治疗的疾病/障碍的非限制性实例包括增殖性疾病、肿瘤性疾病或免疫障碍。
优选地，本发明的结合分子用于预防、治疗或改善与BCMA(过)表达相关的B细胞障碍，如浆细胞障碍和/或自体免疫疾病。所述自身免疫疾病为例如全身性红斑狼疮或类风湿性关节炎。
由BCMA/CD3双特异性结合分子介导的细胞毒性可以采用多种方法测定。效应细胞可以是例如经刺激富集了(人)CD8的阳性T细胞或未经刺激的(人)外周血单核细胞(PBMC)。如果靶细胞是源自猕猴或表达猕猴BCMA或用猕猴BCMA转染的，则效应细胞也应当是源自猕猴的，如猕猴T细胞系，例如4119LnPx。靶细胞应当表达BCMA(至少应当表达BCMA的胞外域)，如人或猕猴的BCMA。靶细胞可以是用BCMA(如人或猕猴BCMA)稳定地或瞬时地转染的细胞系(如CHO)。或者，靶细胞也可以是BCMA阳性天然表达细胞系，如人多发性骨髓瘤细胞系L363或NCI-H929。通常，靶细胞系在细胞表面表达BCMA水平越高，预期EC50值则越小。效应物与靶细胞比(E∶T)通常为约10∶1，但是也可以发生变化。BCMA/CD3双特异性结合分子的细胞毒性活性可以通过51-铬释出分析法(培养时间约为18小时)或基于FACS的细胞毒性分析法(培养时间约为48小时)测定。也可以修改分析方法的培养时间(即细胞毒性反应)。其它测定细胞毒性的方法是本领域技术人员所熟知的，包括MTT或MTS分析法、包含生物发光分析法的基于ATP的分析法、硫酸若丹明B(SRB)分析法、WST分析法、克隆生成实验及ECIS技术。
由本发明的BCMA/CD3双特异性结合分子介导的细胞毒性活性的测定优选采用基于细胞毒性的分析法。细胞毒性活性用对应于半数最大有效浓度(是指诱导细胞毒性反应在基线浓度与最大浓度之间的一半的结合分子的浓度)的EC50值表示。
本发明还提供了一种用于治疗或改善与BCMA(过)表达相关的B细胞障碍(如浆细胞障碍和/或自体免疫疾病)的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用本发明的结合分子的步骤。所述自身免疫疾病为例如全身性红斑狼疮或类风湿性关节炎。
在浆细胞障碍中，一个浆细胞克隆不受控制地繁殖。结果，该克隆产生大量称为M-蛋白的单一(单克隆)抗体。在一些情况下，例如患有单克隆丙种球蛋白病，产生的抗体是不完整的，其仅由轻链或重链组成。这些异常浆细胞及其产生的抗体通常限于一种类型。
优选地，浆细胞障碍选自：多发性骨髓瘤、浆细胞瘤、浆细胞白血病、巨球蛋白血症、淀粉样变性、华氏巨球蛋白血症、孤立性骨浆细胞瘤、髓外浆细胞瘤、骨硬化性骨髓瘤、重链病、意义不明确的单克隆丙种球蛋白病以及郁积型多发性骨髓瘤。
另一方面，提供包含本发明的结合分子、本发明的核酸分子、本发明的载体或本发明的宿主细胞的试剂盒。所述试剂盒可以包含一个或多个含有结合分子的小瓶及其使用说明。所述试剂盒还可包括用于施用本发明结合分子的手段如注射器、泵、输液器等，用于重构本发明结合分子的手段和/或用于稀释本发明结合分子的手段。
本发明的另一方面，第二结合结构域能够结合至CD3ε。在本发明的又一方面，第二结合结构域能够结合至人CD3和猕猴CD3，优选能够结合至人CD3ε和猕猴CD3ε。作为另外一种选择或除此之外，第二结合结构域能够结合至白鬓狨(Callithrix jacchus)、绒顶柽柳猴(Saguinus oedipus)和/或松鼠猴(Saimiri sciureus)的CD3ε。依据这些实施方案，本发明所述结合分子的一个或两个结合结构域优选地对灵长类动物哺乳动物目成员具有跨物种特异性。跨物种特异性CD3结合结构域描述于如WO2008/119567中。
对本发明的结合分子特别优选的是：能够结合至T细胞CD3受体复合物的第二结合结构域包含VL区，所述VL区含有选自以下的CDR-L1、CDR-L2以及CDR-L3：
(a)如WO2008/119567的SEQ ID NO：27中所示的CDR-L1、如WO2008/119567的SEQ ID NO：28中所示的CDR-L2以及如WO2008/119567的SEQ ID NO：29中所示的CDR-L3；
(b)如WO2008/119567的SEQ ID NO：117中所示的CDR-L1、如WO2008/119567的SEQ ID NO：118中所示的CDR-L2以及如WO2008/119567的SEQ ID NO：119中所示的CDR-L3；以及
(c)如WO2008/119567的SEQ ID NO：153中所示的CDR-L1、如WO2008/119567的SEQ ID NO：154中所示的CDR-L2以及如WO2008/119567的SEQ ID NO：155中所示的CDR-L3。
在本发明的结合分子的一个可选择的优选实施方案中，能够结合至T细胞CD3受体复合物的第二结合结构域包含VH区，所述VH区含有选自以下的CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3：
(a)如WO2008/119567的SEQ ID NO：12中所示的CDR-H1、如WO2008/119567的SEQ ID NO：13中所示的CDR-H2以及如WO2008/119567的SEQ ID NO：14中所示的CDR-H3；
(b)如WO2008/119567的SEQ ID NO：30中所示的CDR-H1、如WO2008/119567的SEQ ID NO：31中所示的CDR-H2以及如WO2008/119567的SEQ ID NO：32中所示的CDR-H3；
(c)如WO2008/119567的SEQ ID NO：48中所示的CDR-H1、如WO2008/119567的SEQ ID NO：49中所示的CDR-H2以及如WO2008/119567的SEQ ID NO：50中所示的CDR-H3；
(d)如WO2008/119567的SEQ ID NO：66中所示的CDR-H1、如WO2008/119567的SEQ ID NO：67中所示的CDR-H2以及如WO2008/119567的SEQ ID NO：68中所示的CDR-H3；
(e)如WO2008/119567的SEQ ID NO：84中所示的CDR-H1、如WO2008/119567的SEQ ID NO：85中所示的CDR-H2以及如WO2008/119567的SEQ ID NO：86中所示的CDR-H3；
(f)如WO2008/119567的SEQ ID NO：102中所示的CDR-H1、如WO2008/119567的SEQ ID NO：103中所示的CDR-H2以及如WO2008/119567的SEQ ID NO：104中所示的CDR-H3；
(g)如WO2008/119567的SEQ ID NO：120中所示的CDR-H1、如WO2008/119567的SEQ ID NO：121中所示的CDR-H2以及如WO2008/119567的SEQ ID NO：122中所示的CDR-H3；
(h)如WO2008/119567的SEQ ID NO：138中所示的CDR-H1、如WO2008/119567的SEQ ID NO：139中所示的CDR-H2以及如WO2008/119567的SEQ ID NO：140中所示的CDR-H3；
(i)如WO2008/119567的SEQ ID NO：156中所示的CDR-H1、如WO2008/119567的SEQ ID NO：157中所示的CDR-H2以及如WO2008/119567的SEQ ID NO：158中所示的CDR-H3；以及
(j)如WO2008/119567的SEQ ID NO：174中所示的CDR-H1、如WO2008/119567的SEQ ID NO：175中所示的CDR-H2以及如WO2008/119567的SEQ ID NO：176中所示的CDR-H3。
本发明的结合分子进一步优选的是，能够结合至T细胞CD3受体复合物的第二结合结构域包含VL区，所述VL区选自如WO2008/119567的SEQID NO：35、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：161或SEQ ID NO：165中所示的VL区。
可选择地优选的是，能够结合至T细胞CD3受体复合物的第二结合结构域包含VH区，所述VH区选自如WO2008/119567的SEQ ID NO：15、SEQID NO：19、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：91、SEQ IDNO：105、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：123、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：177或SEQ ID NO：181中所示的VH区。
更优选地，本发明的结合分子的特征在于能够结合至T细胞CD3受体复合物的第二结合结构域，所述第二结合结构域包含选自以下的VL区和VH区：
(a)如WO2008/119567的SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：21中所示的VL区以及如WO2008/119567的SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：19中所示的VH区；
(b)如WO2008/119567的SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：39中所示的VL区以及如WO2008/119567的SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：37中所示的VH区；
(c)如WO2008/119567的SEQ ID NO：53或SEQ ID NO：57中所示的VL区以及如WO2008/119567的SEQ ID NO：51或SEQ ID NO：55中所示的VH区；
(d)如WO2008/119567的SEQ ID NO：71或SEQ ID NO：75中所示的VL区以及如WO2008/119567的SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：73中所示的VH区；
(e)如WO2008/119567的SEQ ID NO：89或SEQ ID NO：93中所示的VL区以及如WO2008/119567的SEQ ID NO：87或SEQ ID NO：91中所示的VH区；
(f)如WO2008/119567的SEQ ID NO：107或SEQ ID NO：111中所示的VL区以及如WO2008/119567的SEQ ID NO：105或SEQ ID NO：109中所示的VH区；
(g)如WO2008/119567的SEQ ID NO：125或SEQ ID NO：129中所示的VL区以及如WO2008/119567的SEQ ID NO：123或SEQ ID NO：127中所示的VH区；
(h)如WO2008/119567的SEQ ID NO：143或SEQ ID NO：147中所示的VL区以及如WO2008/119567的SEQ ID NO：141或SEQ ID NO：145中所示的VH区；
(i)如WO2008/119567的SEQ ID NO：161或SEQ ID NO：165中所示的VL区以及如WO2008/119567的SEQ ID NO：159或SEQ ID NO：163中所示的VH区；以及
(j)如WO2008/119567的SEQ ID NO：179或SEQ ID NO：183中所示的VL区以及如WO2008/119567的SEQ ID NO：177或SEQ ID NO：181中所示的VH区。
根据本发明的结合分子的一个优选的实施方案，特别是在能够结合至T细胞CD3受体复合物的第二结合结构域中，成对的VH-区和VL-区呈单链抗体(scFv)的形式。该VH和VL区以VH-VL或VL-VH的次序排列。优选地，该VH-区的N-端被定位到连接序列。该VL-区的C-端被定位到连接序列。
本发明的如上所述的结合分子的一个优选实施方案的特征在于：能够结合至T细胞CD3受体复合物的第二结合结构域，所述第二结合结构域包含选自如WO2008/119567的SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：77、SEQ IDNO：79、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：149、SEQ ID NO：151、SEQID NO：167、SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：185或SEQ ID NO：187的氨基酸序列。
在一个实施例中，第一结合结构域或第二结合结构域是抗体或源自抗体。在另一个实施例中，两个结合结构域都是抗体或都源自抗体。
对于本发明的结合分子还优选的是，第一结构域和第二结构域形成选自(scFv)2、(单结构域mAb)2、scFv-单结构域mAb、双链抗体或它们的寡聚体的分子。
进一步设想到，本发明的BCMA/CD3双特异性结合分子能够表现出治疗效果或抗肿瘤活性。这一特性可以在如附加实施例例如实施例A19的中公开的研究中进行评估(晚期人肿瘤异种移植模型)。本领域技术人员知道如何修饰或调整本研究中的某些参数，如注射肿瘤细胞的数量、注射的部位、移植的人T细胞的数量、BCMA/CD3双特异性结合分子的给药量、以及时间轴，而仍达到有意义的和可再现的结果。优选地，所述肿瘤生长抑制的T/C[％]为70或60或更低，更优选为50或40或更低，甚至更优选至少为30或20或更低，最优选为10或更低、5或更低或者甚至2.5或更低。
优选地，本发明的BCMA/CD3双特异性结合分子不会诱导/介导或者不会实质上诱导/介导BCMA阴性细胞如HL60、MES-SA及SNU-16的裂解。术语“不会诱导裂解”或“不会实质上诱导裂解”、“不会介导裂解”或“不会实质上介导裂解”是指本发明的结合分子不会诱导或介导大于30％、优选不大于20％、更优选不大于10％、特别优选不大于9％、8％、7％、6％或5％的BCMA阴性细胞的裂解，其中BCMA阳性细胞如NCI-H929、L-363或OPM-2的裂解设定为100％。这适用于至少高至500nM的结合分子的浓度。本领域技术人员无需再费周折即可知道如何测定细胞裂解。另外，本说明书教导了一种如何测定细胞裂解的具体说明；参见例如下文实施例A20。
本发明还提供包含示于SEQ ID NO：1-1000和1022-1093中的任一氨基酸序列的结合分子。
优选地，结合分子包含三个来自称为“BCMA-(X)”的结合分子的VHCDR序列(称为“VH CDR1”、“VH CDR2”、“VH CDR3”，参见附加序列表的4th列)，其中X为1-100(参见附加序列表的2nd列)，和/或三个来自称为“BCMA-X”的结合分子的VL CDR序列(称为“VLCDR1”、“VH CDR2”、“VHCDR3”，参见附加序列表的4th列)，其中X为1-100(参见附加序列表的2nd列)。
优选地，结合分子包含如附加序列表中给出的VH和/或VL序列(参见附加序列表的4th列：“VH”和“VL”)。
优选地，结合分子包含如附加序列表中给出的scFV序列(参见附加序列表的4th列：“scFV”)。
优选地，结合分子包含如附加序列表中给出的双特异性分子序列(参见附加序列表的4th列：“双特异性分子”)。
本发明还涉及包含至少两个结合结构域的双特异性结合剂，所述结合结构域包含第一结合结构域和第二结合结构域，其中所述第一结合结构域结合至B细胞成熟抗原BCMA且其中所述第二结合结构域结合至CD3(一般项1)，还包含以下一般项(Gl)：
Gl2：项1的双特异性结合剂，其中所述第一结合结构域结合至BCMA的胞外结构域，且所述第二结合结构域结合至CD3的ε链。
Gl3：一般项1或2的双特异性结合剂，其为全长抗体或抗体片段的形式。
Gl4：一般项3的全长抗体形式的双特异性结合剂，其中所述第一BCMA-结合结构域源自小鼠，且其中所述第二CD3-结合结构域源自大鼠。
Gl5：一般项3的双特异性结合剂，其为双链抗体形式的抗体片段的形式，所述双链抗体包含重链可变结构域，所述重链可变结构域与同一多肽链上的轻链可变结构域连接，使得两个结构域不配对。
Gl6：一般项1或2的双特异性结合剂，其为双特异性单链抗体的形式，由两个通过连接肽或通过人血清白蛋白分子连接的scFv分子组成。
Gl7：一般项6的双特异性结合剂，重链区(VH)与相应的可变轻链区(VL)从N末端至C末端的排列顺序为：
VH(BCMA)-VL(BCMA)-VH(CD3)-VL(CD3)，
VH(CD3)-VL(CD3)-VH(BCMA)-VL(BCMA)或
VHCD3)-VL(CD3)-VL(BCMA)-VH(BCMA)。
Gl8：一般项1或2的双特异性结合剂，其为选自VHH或VH的单结构域免疫球蛋白结构域的形式。
Gl9：一般项1或2的双特异性结合剂，其为具有含至少两个结合结构域的四个抗体可变结构域的Fv分子的形式，其中至少一个结合结构域对人BCMA具有特异性，且至少一个结合结构域对人CD3具有特异性。
Gl10：一般项1或2的双特异性结合剂，其为单链结合分子的形式，所述单链结合分子由以下组成：对BCMA具有特异性的第一结合结构域、位于所述第一结合结构域的C-末端的恒定亚-区、位于恒定亚-区C-末端的蝎(scorpion)连接子和位于所述恒定亚-区C-末端的对CD3具有特异性的第二结合结构域。
Gl11：一般项1或2的双特异性结合剂，其为抗体样分子的形式，所述抗体样分子通过抗体或抗体片段的两个重链/轻链Fv结合至BCMA，且通过已经工程化为所述抗体或抗体片段的重链或轻链的非CDR环的结合结构域结合至CD3。
Gl12：项1的双特异性结合剂，其为双特异性锚蛋白重复分子的形式。
Gl13：一般项1的双特异性结合剂，其中所述第一结合结构域具有选自第3至12项中任一项所定义形式的形式，并且其中所述第二结合结构域具有选自第3至12项中任一项所定义形式不同的不同形式。
Gl14：一般项1的双特异性结合剂，其为双环肽。
Gl15：包含至少一个一般项1至14中任一项的双特异性结合剂的药物组合物。
Gl16：一般项1至14中任一项的双特异性结合剂或项14的药物组合物，所述双特异性结合剂或药物组合物用于治疗浆细胞障碍或其它与BCMA表达相关的B细胞障碍及用于治疗自身免疫性疾病。
Gl17：一般项1至14中任一项双特异性结合剂或项目15的药物组合物，所述双特异性结合剂或药物组合物用于治疗选自以下的浆细胞障碍：浆细胞瘤、浆细胞白血病、多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症、淀粉样变性、华氏巨球蛋白血症、孤立性骨浆细胞瘤、髓外浆细胞瘤、骨硬化性骨髓瘤、重链病、意义不明确的单克隆丙种球蛋白病以及郁积型多发性骨髓瘤。
上述项的变体可从EP-Nr10191418.2中推导得出，其也包含在本文范围内。
本发明具体地涉及多组如下所述组合在一起的结合分子。以上描述的定义、实例和/或方面都可用于下述组的结合分子。
第一组结合分子(A)
第一组结合分子包含第一结合结构域和第二结合结构域，其中第一结合结构域能够结合至BCMA的表位簇3和表位簇4，第二结合结构域能够结合至T细胞CD3受体复合物。
因此，本发明的第一个方面提供一种至少双特异性的结合分子，所述结合分子包含第一结合结构域和第二结合结构域，其中
(a)第一结合结构域能够结合至BCMA的表位簇3和表位簇4；和
(b)第二结合结构域能够结合至T细胞CD3受体复合物；且
其中BCMA的表位簇3对应于如SEQ ID NO：1002中所示序列的氨基酸残基24至41，BCMA的表位簇4对应于如SEQ ID NO：1002中所示序列的氨基酸残基42至54。
也设想到，本发明的第一结合结构域能够并存地结合至人BCMA的表位簇3(SEQ ID NO：1016)和表位簇4(SEQ ID NO：1019)。
进一步的方面，本发明的结合分子的第一结合结构域不能够结合至如SEQ ID NO：1015中所示的BCMA的嵌合的胞外结构域。换句话说，表位簇E7，或更具体地，SEQ ID NO：1002的氨基酸残基39(精氨酸)在第一结合结构域与BCMA的结合中起重要的抗原作用。如果这一氨基酸被另一氨基酸所取代，优选通过非保守性置换，如被脯氨酸或丙氨酸置换，则本发明的结合分子的第一结合结构域不再能够结合至BCMA的胞外结构域。
术语“不能够结合”是指本发明的结合分子的第一结合结构域不结合至例如如SEQ ID NO：1015中所示的人/鼠的嵌合BCMA，即其不显示出高于30％、优选高于20％、更优选高于10％、特别优选高于9％、8％、7％、6％或5％的反应性，优选在应用于使用如SEQ ID NO：1015中所示的人/鼠的嵌合BCMA的附加实施例A的条件下进行。
一方面，本发明的第一结合结构域能够结合至人BCMA、优选人BCMAECD的表位簇3和4。因此，当人BCMA蛋白中的相应表位簇与鼠BCMA蛋白中的相应表位簇交换时(产生包含人BCMA的构建体，其中人表位簇3和/4由相应鼠表位簇替代；分别参见示例性的SEQ ID NO：1011和1012)，会出现结合结构域的结合降低。与人BCMA蛋白中的相应表位簇相比，并将与人BCMA蛋白中相应表位簇结合设定为100％，则所述降低优选为至少10％、20％、30％、40％、50％；更优选为至少60％、70％、80％、90％、95％或甚至100％。设想到前述人BCMA/鼠BCMA嵌合体在CHO细胞中表达。还设想到人BCMA/鼠BCMA嵌合体中的至少一个、优选鼠E3/人BCMA嵌合体与不同膜结合蛋白(如EpCAM)的跨膜结构域和/或胞质结构域融合；参见图2a。
一种测试这种由于与非人(如鼠)BCMA抗原的相应表位簇交换导致的结合损失的方法描述于所附实施例A中，特别在实施例A1-A3中。另一种测定靶抗原的特异性残基对于被给定的结合分子或结合结构域识别的贡献的方法是丙氨酸扫描(如参见，Morrison KL&Weiss GA.Cur Opin Chem Biol.2001Jun；5(3)：302-7)，其中每个待分析的残基例如通过定点诱变被丙氨酸替代。采用丙氨酸的原因在于其体积小、化学惰性、具有甲基官能团，仍然能够模拟其它多种氨基酸所具有的二级结构参照。在希望保留突变残基尺寸的情况下，有时可使用大体积的氨基酸如缬氨酸或亮氨酸。丙氨酸扫描法是一种已经使用很长时间的成熟技术。
一方面，本发明的第一结合结构域结合至人BCMA的表位簇3和4，且还能够结合至猕猴BCMA，优选结合至来自如恒河猴(Macaca mulatta)或马来猴(Macaca fascicularis)的猕猴BCMA(分别为SEQ ID NO：1020和1021)的表位簇3和/或4。设想到第一结合结构域确实结合至或不结合至鼠BCMA。
因此，在一个实施例中，结合至人BCMA，特别是结合至BCMA的胞外蛋白结构域的表位簇3和4(分别由如SEQ ID NO：1002中所示的人序列的氨基酸残基24至41及42至54形成)的结合结构域也结合至猕猴BCMA，特别是结合至BCMA的胞外蛋白结构域的表位簇3和/或4(分别由如SEQ IDNO：1006中所示的猕猴BCMA序列的氨基酸残基24至41及42至54形成)。
在一个实施例中，结合分子的第一结合结构域能够结合至BCMA的表位簇3和4，其中BCMA的表位簇3和4分别对应于如SEQ ID NO：1002(人BCMA全长多肽)或SEQ ID NO：1007(人BCMA的胞外结构域：SEQ ID NO：1002的氨基酸1-54)中所示序列的氨基酸残基24至40及41至53。
本发明的一个方面，结合分子的第一结合结构域另外地或可选地能够结合至白鬓狨、绒顶柽柳猴和/或松鼠猴BCMA的表位簇3和/或4。
第一结合结构域对人BCMA的亲和性优选≤40nM，更优选≤35nM、≤15nM或≤10nM，甚至更优选≤5nM，甚至更优选≤1nM，甚至更优选≤0.5nM，甚至更优选≤0.1nM，最优选≤0.05nM。第一结合结构域对猕猴BCMA的亲和性优选≤15nM，更优选≤10nM，甚至更优选≤5nM，甚至更优选≤1nM，甚至更优选≤0.5nM，甚至更优选≤0.1nM，最优选≤0.05nM或甚至≤0.01nM。亲和性的测定可以采用如实施例中描述的Biacore分析法或Scatchard分析法。结合至猕猴BCMA相对于结合至人BCMA的亲和性差距优选为[1∶10-1∶5]或[5∶1-10∶1]，更优选为[1∶5-5∶1]，以及最优选为[1∶2-3∶1]或甚至[1∶1-3∶1]。其它测定亲和性的方法是本领域技术人员熟知的。
由BCMA/CD3双特异性结合分子介导的细胞毒性可以采用多种方法测定。效应细胞可以是例如经刺激富集了(人)CD8的阳性T细胞或未经刺激的(人)外周血单核细胞(PBMC)。如果靶细胞是源自猕猴或表达猕猴BCMA或用猕猴BCMA转染的，则效应细胞也应当是源自猕猴的，如猕猴T细胞系，例如4119LnPx。靶细胞应当表达BCMA(至少应当表达BCMA的胞外域)，如人或猕猴的BCMA。靶细胞可以是用BCMA(如人或猕猴BCMA)稳定地或瞬时地转染的细胞系(如CHO)。或者，靶细胞也可以是BCMA阳性天然表达细胞系，如人多发性骨髓瘤细胞系L363或NCI-H929。通常，靶细胞系在细胞表面表达BCMA水平越高，预期EC50值则越小。效应物与靶细胞比(E∶T)通常为约10∶1，但是也可以发生变化。BCMA/CD3双特异性结合分子的细胞毒性活性可以通过51-铬释出分析法(培养时间约为18小时)或基于FACS的细胞毒性分析法(培养时间约为48小时)测定。也可以修改分析方法的培养时间(即细胞毒性反应)。其它测定细胞毒性的方法是本领域技术人员所熟知的，包括MTT或MTS分析法、包含生物发光分析法的基于ATP的分析法、硫酸若丹明B(SRB)分析法、WST分析法、克隆生成实验及ECIS技术。
由本发明的BCMA/CD3双特异性结合分子介导的细胞毒性活性的测定优选采用基于细胞毒性的分析法。细胞毒性活性用对应于半数最大有效浓度(是指诱导细胞毒性反应在基线浓度与最大浓度之间的一半的结合分子的浓度)的EC50值表示。BCMA/CD3双特异性结合分子的EC50值优选是≤20.000pg/ml，更优选是≤5000pg/ml，甚至更优选是≤1000pg/ml，甚至更优选是≤500pg/ml，甚至更优选是≤250pg/ml，甚至更优选是≤100pg/ml，甚至更优选是≤50pg/ml，甚至更优选是≤10pg/ml，最优选是≤5pg/ml。
上述给出的任一EC50值都能与基于细胞的细胞毒性分析法所示的任一方案组合。例如，当(人)CD8阳性T细胞或猕猴T细胞系用作效应细胞时，BCMA/CD3双特异性结合分子的EC50值优选是≤1000pg/ml，更优选是≤500pg/ml，甚至更优选是≤250pg/ml，甚至更优选是≤100pg/ml，甚至更优选是≤50pg/ml，甚至更优选是≤10pg/ml，最优选是≤5pg/ml。如果在此分析法中靶细胞为(人或猕猴)BCMA转染细胞如CHO细胞，BCMA/CD3双特异性结合分子的EC50值优选是≤150pg/ml，更优选是≤100pg/ml，甚至更优选是≤50pg/ml，甚至更优选是≤30pg/ml，甚至更优选是≤10pg/ml，最优选是≤5pg/ml。如果靶细胞是BCMA阳性天然表达细胞系，则EC50值优选是≤250pg/ml，甚至更优选是≤200pg/ml，甚至更优选是≤100pg/ml，甚至更优选是≤150pg/ml，甚至更优选是≤100pg/ml，最优选是≤50pg/ml或更低。当(人)PBMC用作效应细胞时，BCMA/CD3双特异性结合分子的EC50值优选是≤1000pg/ml，更优选是≤750pg/ml，更优选是≤500pg/ml，甚至更优选是≤250pg/ml，甚至更优选是≤100pg/ml，最优选的是≤50pg/ml或更小。
单个BCMA/CD3双特异性结合分子(如抗体)的单体同种型和二聚同种型之间的细胞毒性活性的差异被称为“效力差距”。这种效力差距可以例如用如分子的单体与二聚体的EC50之间的比值计算。本发明的BCMA/CD3双特异性结合分子的效力差距优选≤5，更优选≤4，甚至更优选≤3，甚至更优选≤2，最优选≤1。
优选地，本发明的BCMA/CD3双特异性结合分子不会与人BAFF-R和/或人TACI结合和/或交叉反应。测定与人BAFF-R和/或人TACI的交叉反应的方法公开在实施例A9中。
还优选地，本发明的BCMA/CD3双特异性结合分子在三次冻结/解冻循环后，具有的二聚体百分数等于或小于1.5％，优选等于或小于0.8％。冻结-解冻循环以及二聚体百分数的测定可以根据实施例A16进行测定。
优选地，本发明的BCMA/CD3双特异性结合分子(如抗体)呈现出良好的热稳定性，其熔解温度高于60℃，更优选为在62℃与63℃之间(参见实施例A17)。
可以进行血浆干扰测试来测定BCMA/CD3双特异性结合分子(如抗体)与人血浆蛋白潜在的相互作用(参见例如实施例A18)。在一个优选的实施方案中，由血浆蛋白介导的BCMA/CD3双特异性结合分子的靶向结合没有显著性下降。相对血浆干扰值优选≤2。
在一个实施例中，本发明的结合分子的第一结合结构域包含VH区和VL区，所述VH区含有选自以下的CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3和所述VL区包含选自以下的CDR-L1、CDR-L2以及CDR-L3：
(a)如SEQ ID NO：231中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：232中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：233中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：234中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：235中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：236中所示的CDR-L3；
(b)如SEQ ID NO：241中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：242中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：243中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：244中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：245中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：246中所示的CDR-L3；
(c)如SEQ ID NO：251中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：252中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：253中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：254中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：255中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：235中所示的CDR-L3；
(d)如SEQ ID NO：261中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：262中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：263中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：264中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：265中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：266中所示的CDR-L3；
(e)如SEQ ID NO：271中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：272中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：273中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：274中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：275中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：276中所示的CDR-L3；
(f)如SEQ ID NO：281中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：282中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：283中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：284中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：285中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：286中所示的CDR-L3；
(g)如SEQ ID NO：291中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：292中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：293中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：294中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：295中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：296中所示的CDR-L3；
(h)如SEQ ID NO：301中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：302中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：303中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：304中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：305中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：306中所示的CDR-L3；
(i)如SEQ ID NO：391中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：392中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：393中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：394中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：395中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：396中所示的CDR-L3；
(k)如SEQ ID NO：401中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：402中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：403中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：404中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：405中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：406中所示的CDR-L3；
(l)如SEQ ID NO：411中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：412中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：413中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：414中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：415中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：416中所示的CDR-L3；
(m)如SEQ ID NO：421中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：422中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：423中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：424中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：425中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：426中所示的CDR-L3；
(n)如SEQ ID NO：431中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：432中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：433中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：434中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：435中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：436中所示的CDR-L3；
(o)如SEQ ID NO：441中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：442中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：443中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：444中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：445中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：446中所示的CDR-L3；
(p)如SEQ ID NO：451中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：452中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：453中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：454中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：455中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：456中所示的CDR-L3；
(q)如SEQ ID NO：461中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：462中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：463中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：464中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：465中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：466中所示的CDR-L3；
(r)如SEQ ID NO：471中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：472中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：473中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：474中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：475中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：476中所示的CDR-L3；
(s)如SEQ ID NO：481中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：482中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：483中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：484中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：485中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：486中所示的CDR-L3；
(t)如SEQ ID NO：491中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：492中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：493中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：494中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：495中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：496中所示的CDR-L3；和
(u)如SEQ ID NO：501中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：502中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：503中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：504中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：505中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：506中所示的CDR-L3。
在另一个实施方案中，所述结合分子的第一结合结构域包含VH区，所述VH区选自如以下序列中所示的VH区：SEQ ID NO：237、SEQ ID NO：247、SEQ ID NO：257、SEQ ID NO：267、SEQ ID NO：277、SEQ ID NO：287、SEQ ID NO：297、SEQ ID NO：307、SEQ ID NO：397、SEQ ID NO：407、SEQ ID NO：417、SEQ ID NO：427、SEQ ID NO：437、SEQ ID NO：447、SEQ ID NO：457、SEQ ID NO：467、SEQ ID NO：477、SEQ ID NO：487、SEQ ID NO：497和SEQ ID NO：507。
在另一个实施方案中，所述结合分子的第一结合结构域包含VL区，所述VL区选自如以下序列中所示的VL区：SEQ ID NO：238、SEQ ID NO：248、SEQ ID NO：258、SEQ ID NO：268、SEQ ID NO：278、SEQ ID NO：288、SEQ ID NO：298、SEQ ID NO：308、SEQ ID NO：398、SEQ ID NO：408、SEQ ID NO：418、SEQ ID NO：428、SEQ ID NO：438、SEQ ID NO：448、SEQ ID NO：458、SEQ ID NO：468、SEQ ID NO：478、SEQ ID NO：488、SEQ ID NO：498和SEQ ID NO：508。
在一个实施方案中，所述结合分子的第一结合结构域包含选自以下的VH区和VL区：
(a)如SEQ ID NO：237中所示的VH区，和如SEQ ID NO：238中所示的VL区；
(b)如SEQ ID NO：247中所示的VH区，和如SEQ ID NO：248中所示的VL区；
(c)如SEQ ID NO：257中所示的VH区，和如SEQ ID NO：258中所示的VL区；
(d)如SEQ ID NO：267中所示的VH区，和如SEQ ID NO：268中所示的VL区；
(e)如SEQ ID NO：277中所示的VH区，和如SEQ ID NO：278中所示的VL区；
(f)如SEQ ID NO：287中所示的VH区，和如SEQ ID NO：288中所示的VL区；
(g)如SEQ ID NO：297中所示的VH区，和如SEQ ID NO：298中所示的VL区；
(h)如SEQ ID NO：307中所示的VH区，和如SEQ ID NO：308中所示的VL区；
(i)如SEQ ID NO：397中所示的VH区，和如SEQ ID NO：398中所示的VL区；
(k)如SEQ ID NO：407中所示的VH区，和如SEQ ID NO：408中所示的VL区；
(l)如SEQ ID NO：417中所示的VH区，和如SEQ ID NO：418中所示的VL区；
(m)如SEQ ID NO：427中所示的VH区，和如SEQ ID NO：428中所示的VL区；
(n)如SEQ ID NO：437中所示的VH区，和如SEQ ID NO：438中所示的VL区；
(o)如SEQ ID NO：447中所示的VH区，和如SEQ ID NO：448中所示的VL区；
(p)如SEQ ID NO：457中所示的VH区，和如SEQ ID NO：458中所示的VL区；
(q)如SEQ ID NO：467中所示的VH区，和如SEQ ID NO：468中所示的VL区；
(r)如SEQ ID NO：477中所示的VH区，和如SEQ ID NO：478中所示的VL区；
(s)如SEQ ID NO：487中所示的VH区，和如SEQ ID NO：488中所示的VL区；
(t)如SEQ ID NO：497中所示的VH区，和如SEQ ID NO：498中所示的VI区；和
(u)如SEQ ID NO：507中所示的VH区，和如SEQ ID NO：508中所示的VL区。
在一个实施例中，第一结合结构域包含选自以下的氨基酸序列：SEQ IDNO：239、SEQ ID NO：249、SEQ ID NO：259、SEQ ID NO：269、SEQ IDNO：279、SEQ ID NO：289、SEQ ID NO：299、SEQ ID NO：309、SEQ IDNO：399、SEQ ID NO：409、SEQ ID NO：419、SEQ ID NO：429、SEQ IDNO：439、SEQ ID NO：449、SEQ ID NO：459、SEQ ID NO：469、SEQ IDNO：479、SEQ ID NO：489、SEQ ID NO：499和SEQ ID NO：509。
一种优选的CDR-H1示于氨基酸序列DYYIN。一种优选的CDR-H2示于氨基酸序列WIYFASGNSEYNQKFTG。一种优选的CDR-H3示于氨基酸序列LYDYDWYFDV。一种优选的CDR-L1示于氨基酸序列KSSQSLVHSNGNTYLH。一种优选的CDR-L2示于氨基酸序列KVSNRFS。一种优选的CDR-L2示于氨基酸序列AETSHVPWT或SQSSIYPWT。
优选的结合分子具有示于SEQ ID NO：300的氨基酸序列。另一优选的结合分子具有示于SEQ ID NO：500的氨基酸序列。
更进一步地，本发明涉及BCMA(优选人BCMA)的表位簇3和4在结合分子(优选为抗体)生产中的用途，所述抗体能够结合至BCMA，优选人BCMA。优选地，BCMA的表位簇3和4分别对应于如SEQ ID NO：1002中所示序列的氨基酸残基24至41和氨基酸残基42至54。
另外，本发明提供一种用于生产抗体、优选双特异性结合分子的方法，所述双特异性结合分子能够结合至BCMA，优选人BCMA，所述方法包括：
(a)用包含BCMA(优选人BCMA)的表位簇3和4的多肽免疫动物，其中BCMA的表位簇3和4对应于如SEQ ID NO：1002中所示序列的氨基酸残基24至41和42至54，
(b)获得所述抗体，和
(c)可选地，将所述抗体转化为双特异性结合分子，所述双特异性结合分子能够结合至人BCMA，优选结合至T细胞CD3受体复合物。
优选地，步骤(b)包括按如下方法检验所获得的抗体：
当人BCMA蛋白中的相应表位簇与鼠BCMA抗原中的相应表位簇交换时(产生包含人BCMA的构建体，其中人表位簇3和/或4由相应鼠表位簇替代)，会出现抗体的结合降低。与人BCMA蛋白中的相应表位簇3和4相比，并将与人BCMA蛋白中相应表位簇3和4的结合设定为100％，则所述降低优选为至少10％、20％、30％、40％、50％；更优选为至少60％、70％、80％、90％、95％或甚至100％。设想到前述人BCMA/鼠BCMA嵌合体在CHO细胞中表达。还设想到人BCMA/鼠BCMA嵌合体中的至少一个与不同膜结合蛋白(如EpCAM)的跨膜结构域和/或胞质结构域融合；参见图2a。一种用于检测由于与非人(如鼠)BCMA抗原的相应表位簇交换而导致的结合损失的方法描述于所附实施例A中，特别是在实施例A1-A3中。
该方法可以进一步包括检测所述抗体是否结合至人BCMA的表位簇3和4以及进一步是否能够结合至猕猴BCMA的表位簇3和/或4如源自恒河猴或马来猴(SEQ ID NO：1017和SEQ ID NO：121)的BCMA。
第二组结合分子(B)
第二组结合分子涉及包含含第一结合结构域和第二结合结构域的双特异性结合分子，其中第一结合结构域能够结合至人BCMA的胞外结构域和鼠BCMA的胞外结构域，第二结合结构域能够结合至T细胞CD3受体复合物。
因此，本发明的第二组的第一个方面提供一种至少双特异性的结合分子，所述结合分子包含第一结合结构域和第二结合结构域，其中
(a)第一结合结构域能够结合至人BCMA的胞外结构域和鼠BCMA的胞外结构域；和
(b)第二结合结构域能够结合至T细胞CD3受体复合物；且其中人BCMA的胞外结构域对应于如SEQ ID NO：1007中所示的氨基酸序列，鼠BCMA的胞外结构域对应于如SEQ ID NO：1008中所示的氨基酸序列。
第一结合结构域能够结合至人BCMA的胞外结构域和鼠BCMA的胞外结构域。人BCMA的胞外结构域(如SEQ ID NO：1007中所示的氨基酸序列)对应于示于SEQ ID NO：1002的人BCMA全长多肽的氨基酸残基1-54。鼠BCMA的胞外结构域(如SEQ ID NO：1008中所示的氨基酸序列)对应于示于SEQ ID NO：1004的鼠BCMA全长多肽的氨基酸残基1-49。
一方面，本发明的第一结合结构域还结合至猕猴BCMA，如源自恒河猴的BCMA(SEQ ID NO：1017)或马来猴的BCMA(SEQ ID NO：1017)。
在本发明的一方面，所述结合分子的第一结合结构域另外地或可选地能够结合至白鬓狨、绒顶柽柳猴和/或松鼠猴的BCMA。
第一结合结构域对人BCMA的亲和性优选≤15nM，更优选≤10nM，甚至更优选≤5nM，最优选≤1nM。
在一个实施方案中，本发明的结合分子的第一结合结构域包含VH区和VL区，所述VH区含有选自以下的CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3，所述VL区含有选自以下的CDR-L1、CDR-L2以及CDR-L3：
(a)如SEQ ID NO：81中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：82中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：83中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：84中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：85中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：86中所示的CDR-L3；
(b)如SEQ ID NO：91中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：92中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：93中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：94中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：95中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：96中所示的CDR-L3；
(c)如SEQ ID NO：101中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：102中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：103中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：104中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：105中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：106中所示的CDR-L3；
(d)如SEQ ID NO：111中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：112中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：113中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：114中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：115中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：116中所示的CDR-L3；
(e)如SEQ ID NO：121中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：122中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：123中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：124中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：125中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：126中所示的CDR-L3；
(f)如SEQ ID NO：131中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：132中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：133中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：134中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：135中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：136中所示的CDR-L3；
(g)如SEQ ID NO：141中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：142中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：143中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：144中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：145中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：146中所示的CDR-L3；和
(h)如SEQ ID NO：151中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：152中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：153中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：154中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：155中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：156中所示的CDR-L3。
在另一个实施方案中，所述结合分子的第一结合结构域包含VH区，所述VH区选自如以下序列中所示的VH区：SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：137、SEQID NO：147和SEQ ID NO：157。
在另一个实施方案中，所述结合分子的第一结合结构域包含VL区，所述VL区选自如以下序列中所示的VL区：SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：128、SEQ ID NO：138、SEQID NO：148和SEQ ID NO：158。
在一个实施方案中，所述结合分子的第一结合结构域包含选自以下的VH区和VL区：
(a)如SEQ ID NO：87中所示的VH区，和如SEQ ID NO：88中所示的VL区；
(b)如SEQ ID NO：97中所示的VH区，和如SEQ ID NO：98中所示的VL区；
(c)如SEQ ID NO：107中所示的VH区，和如SEQ ID NO：108中所示的VL区；
(d)如SEQ ID NO：117中所示的VH区，和如SEQ ID NO：118中所示的VL区；
(e)如SEQ ID NO：127中所示的VH区，和如SEQ ID NO：128中所示的VL区；
(f)如SEQ ID NO：137中所示的VH区，和如SEQ ID NO：138中所示的VL区；
(g)如SEQ ID NO：147中所示的VH区，和如SEQ ID NO：148中所示的VL区；和
(h)如SEQ ID NO：157中所示的VH区，和如SEQ ID NO：158中所示的VL区。
在一个实施例中，第一结合结构域包含选自以下的氨基酸序列：SEQ IDNO：89、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：149和SEQ ID NO：159。
第二组结合分子也涉及以下项：
1：一种包含第一结合结构域和第二结合结构域的结合分子，其中
(a)所述第一结合结构域能够结合至人BCMA的胞外结构域和鼠BCMA的胞外结构域；和
(b)所述第二结合结构域能够结合至T细胞CD3受体复合物；且
其中人BCMA的胞外结构域对应于如SEQ ID NO：1007中所示的氨基酸序列，鼠BCMA的胞外结构域对应于如SEQ ID NO：1008中所示的氨基酸序列。
2：根据第1项所述的结合分子，其中所述第一结合结构域还能够结合至猕猴BCMA。
3：根据第1或2项所述的结合分子，其中所述第二结合结构域能够结合至CD3ε，优选人CD3ε。
4：根据第1至3项中任一项所述的结合分子，其中所述第一结合结构域和/或第二结合结构域源自抗体。
5：根据第4项所述的结合分子，其选自(scFv)2、(单结构域mAb)2、scFV-单结构域mAb、双链抗体和它们的寡聚体。
6：根据前述项中任一项所述的结合分子，其中所述第一结合结构域包含VH区和VL区，所述VH区含有选自以下的CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3，所述VL区含有选自以下的CDR-L1、CDR-L2以及CDR-L3：
(a)如SEQ ID NO：81中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：82中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：83中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：84中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：85中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：86中所示的CDR-L3；
(b)如SEQ ID NO：91中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：92中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：93中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：94中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：95中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：96中所示的CDR-L3；
(c)如SEQ ID NO：101中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：102中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：103中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：104中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：105中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：106中所示的CDR-L3；
(d)如SEQ ID NO：111中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：112中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：113中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：114中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：115中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：116中所示的CDR-L3；
(e)如SEQ ID NO：121中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：122中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：123中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：124中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：125中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：126中所示的CDR-L3；
(f)如SEQ ID NO：131中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：132中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：133中所示的CDR-H3、如SEQ IDNO：134中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：135中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：136中所示的CDR-L3；
(g)如SEQ ID NO：141中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：142中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：143中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：144中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：145中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：146中所示的CDR-L3；和
(h)如SEQ ID NO：151中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：152中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：153中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：154中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：155中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：156中所示的CDR-L3。
7.根据前述项中任一项所述的结合分子，其中所述第一结合结构域包含VH区，所述VH区选自如以下序列中所示的VH区：SEQ ID NO：87、SEQ IDNO：97、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：127、SEQ IDNO：137、SEQ ID NO：147和SEQ ID NO：157。
8.根据前述项中任一项所述的结合分子，其中所述第一结合结构域包含VL区，所述VL区选自如以下序列中所示的VL区：SEQ ID NO：88、SEQ IDNO：98、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：128、SEQ IDNO：138、SEQ ID NO：148和SEQ ID NO：158。
9.根据前述项中任一项所述的结合分子，其中所述第一结合结构域包含选自以下的VH区和VL区：
(a)如SEQ ID NO：87中所示的VH区，和如SEQ ID NO：88中所示的VL区；
(b)如SEQ ID NO：97中所示的VH区，和如SEQ ID NO：98中所示的VL区；
(c)如SEQ ID NO：107中所示的VH区，和如SEQ ID NO：108中所示的VL区；
(d)如SEQ ID NO：117中所示的VH区，和如SEQ ID NO：118中所示的VL区；
(e)如SEQ ID NO：127中所示的VH区，和如SEQ ID NO：128中所示的VL区；
(f)如SEQ ID NO：137中所示的VH区，和如SEQ ID NO：138中所示的VL区；
(g)如SEQ ID NO：147中所示的VH区，和如SEQ ID NO：148中所示的VL区；和
(h)如SEQ ID NO：157中所示的VH区，和如SEQ ID NO：158中所示的VL区。
10.根据第9项所述的结合分子，其中所述第一结合结构域包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：109、SEQ IDNO：119、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：149和SEQ IDNO：159。
11.一种编码如第1至10项中任一项所定义的结合分子的核酸序列。
12.一种包含如第11项中所定义的核酸序列的载体。
13.一种用如第11项中所定义的核酸序列或用如第12项中所定义的载体转化或转染的宿主细胞。
14.一种用于生产根据第1至10项中任一项所述的结合分子的方法，所述方法包括在允许如第1至10项中任一项所定义的结合分子表达的条件下培养如第13项中所定义的宿主细胞并从培养物中回收产生的结合分子。
15.一种包含第1至10项中任一项所述的结合分子或根据第14项所述的方法生产的结合分子的药物组合物。
16.根据第1至10项中任一项所述的结合分子或根据第14项所述的方法生产的结合分子，其用于预防、治疗或改善选自浆细胞障碍、其它与BCMA表达有关的B细胞障碍和自身免疫性疾病的疾病。
17.一种用于治疗或改善选自浆细胞障碍、其它与BCMA表达有关的B细胞障碍和自身免疫性疾病的疾病的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用根据第1至10项中任一项所述的结合分子或根据第14项所述的方法生产的结合分子。
18.根据第17项所述的方法，其中所述浆细胞障碍选自：多发性骨髓瘤、浆细胞瘤、浆细胞白血病、巨球蛋白血症、淀粉样变性、华氏巨球蛋白血症、孤立性骨浆细胞瘤、髓外浆细胞瘤、骨硬化性骨髓瘤、重链病、意义不明确的单克隆丙种球蛋白病以及郁积型多发性骨髓瘤。
19.根据第17项所述的方法，其中自身免疫性疾病是全身性红斑狼疮或类风湿性关节炎。
20.一种包含如第1至10项中任一项所定义的结合分子、如第11项中所定义的核酸分子、如第12项中所定义的载体、或如第13项中所定义的宿主细胞的试剂盒。
第三组结合分子(C)
本发明的第三组结合分子涉及至少双特异性的结合分子，所述结合分子包含第一结合结构域和第二结合结构域，其中所述第一结合结构域能够结合至BCMA的表位簇1和4，所述第二结合结构域能够结合至T细胞CD3受体复合物。
因此，第一个方面，本发明提供至少双特异性的结合分子，所述结合分子包含第一结合结构域和第二结合结构域，其中
(a)所述第一结合结构域能够结合至BCMA的表位簇1(MLQMAGQ)(SEQ ID NO：1018)和表位簇4(NASVTNSVKGTNA)(SEQ ID NO：1019)；和
(b)所述第二结合结构域能够结合至T细胞CD3受体复合物；且其中BCMA的表位簇1对应于如SEQ ID NO：1002中所示序列的氨基酸残基1至7，BCMA的表位簇4对应于如SEQ ID NO：1002中所示序列的氨基酸残基42至54。
也设想到本发明的第一结合结构域能够并存地结合至人BCMA的表位簇1和表位簇4。
一方面，本发明的第一结合结构域能够结合至人BCMA、优选人BCMAECD的表位簇1和4。因此，当人BCMA蛋白中的相应表位簇被鼠抗原中的相应表位簇交换时(产生包含人BCMA的构建体，其中人表位簇1和/或4被相应鼠表位簇替代；分别参见示例性的SEQ ID NO：1009和/或1012)，会出现结合结构域的结合降低。与人BCMA蛋白中的相应表位簇相比，并将与人BCMA蛋白中相应表位簇结合设定为100％，则所述降低优选为至少10％、20％、30％、40％、50％；更优选为至少60％、70％、80％、90％、95％或甚至100％。设想到前述人BCMA/鼠BCMA嵌合体在CHO细胞中表达。还设想到人BCMA/鼠BCMA嵌合体中的至少一个、优选鼠E3/人BCMA嵌合体与不同膜结合蛋白(如EpCAM)的跨膜结构域和/或胞质结构域融合；参见图2a。
一种测试这种由于与非人(如鼠)BCMA抗原的相应表位簇交换导致的结合损失的方法描述于所附实施例中，具体在实施例C1-3中。
一方面，本发明的第一结合结构域结合至人BCMA的表位簇1和4及还能够结合至猕猴BCMA的表位簇1和/或4(分别为SEQ ID NO：1020和1021)，如来自恒河猴或马来猴。设想到第一结合结构域不结合至鼠BCMA。
因此，在一个实施方案中，结合至人BCMA、特别是结合至BCMA的胞外蛋白结构域的表位簇1和4(分别由如SEQ ID NO：1002中所示的人序列的氨基酸残基1至7及42至54形成)的结合结构域也结合至猕猴BCMA，特别是结合至BCMA的胞外蛋白结构域的表位簇1和/或4(分别由如SEQ IDNO：1006中所示的猕猴BCMA序列的氨基酸残基1至7及41至53形成)。
在一个实施方案中，所述结合分子的第一结合结构域能够结合至BCMA的表位簇1和4，其中BCMA的表位簇1和4分别对应于如SEQ ID NO：1002(人BCMA全长多肽)或SEQ ID NO：1007(人BCMA的胞外结构域：SEQID NO：1002的氨基酸残基1-54)中所示序列的氨基酸残基1至7及42至54。
在本发明的一个方面，所述结合分子的第一结合结构域另外地或可选地能够结合至白鬓狨、绒顶柽柳猴和/或松鼠猴BCMA的表位簇1和/或4。
第一结合结构域对人BCMA的亲和性优选≤15nM，更优选≤10nM，甚至更优选≤5nM，最优选≤1nM。
在一个实施方案中，本发明的结合分子的第一结合结构域包含VH区和VL区，所述VH区含有选自以下的CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3，所述VL区含有选自以下的CDR-L1、CDR-L2以及CDR-L3：
(a)如SEQ ID NO：511中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：512中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：513中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：514中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：515中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：516中所示的CDR-L3；
(b)如SEQ ID NO：521中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：522中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：523中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：524中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：525中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：526中所示的CDR-L3；
(c)如SEQ ID NO：531中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：532中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：533中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：534中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：535中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：536中所示的CDR-L3；
(d)如SEQ ID NO：541中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：542中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：543中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：544中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：545中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：546中所示的CDR-L3；
(e)如SEQ ID NO：551中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：552中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：553中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：554中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：555中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：556中所示的CDR-L3；
(f)如SEQ ID NO：561中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：562中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：563中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：564中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：565中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：566中所示的CDR-L3；和
(g)如SEQ ID NO：571中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：572中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：573中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：574中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：575中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：576中所示的CDR-L3。
在另一个实施方案中，所述结合分子的第一结合结构域包含VH区，所述VH区选自如以下序列中所示的VH区：SEQ ID NO：517、SEQ ID NO：527、SEQ ID NO：537、SEQ ID NO：547、SEQ ID NO：557、SEQ ID NO：567和SEQID NO：577。
在另一个实施方案中，所述结合分子的第一结合结构域包含VL区，所述VL区选自如以下序列中所示的VL区：SEQ ID NO：518、SEQ ID NO：528、SEQ ID NO：538、SEQ ID NO：548、SEQ ID NO：558、SEQ ID NO：568和SEQID NO：578。
在一个实施方案中，所述结合分子的第一结合结构域包含选自以下的VH区和VL区：
(a)如SEQ ID NO：517中所示的VH区，和如SEQ ID NO：518中所示的VL区；
(b)如SEQ ID NO：527中所示的VH区，和如SEQ ID NO：528中所示的VL区；
(c)如SEQ ID NO：537中所示的VH区，和如SEQ ID NO：538中所示的VL区；
(d)如SEQ ID NO：547中所示的VH区，和如SEQ ID NO：548中所示的VL区；
(e)如SEQ ID NO：557中所示的VH区，和如SEQ ID NO：558中所示的VL区；
(f)如SEQ ID NO：567中所示的VH区，和如SEQ ID NO：568中所示的VL区；和
(g)如SEQ ID NO：577中所示的VH区，和如SEQ ID NO：578中所示的VL区。
在一个实施例中，所述第一结合结构域包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：519、SEQ ID NO：529、SEQ ID NO：539、SEQ ID NO：549、SEQID NO：559、SEQ ID NO：569和SEQ ID NO：579。
更进一步地，本发明涉及BCMA(优选人BCMA)的表位簇1和4在结合分子(优选为抗体)生产中的用途，所述抗体能够结合至BCMA，优选人BCMA。优选地，BCMA的表位簇1和4分别对应于如SEQ ID NO：1002中所示序列的氨基酸残基1至7和氨基酸残基42至54。
另外，本发明提供一种用于生产抗体、优选双特异性结合分子的方法，该双特异性结合分子能够结合至BCMA，优选人BCMA，所述方法包括：
(a)用包含BCMA(优选人BCMA)的表位簇1和4的多肽免疫动物，其中BCMA的表位簇1和4对应于如SEQ ID NO：1002中所示序列的氨基酸残基1至7位和42至54，
(b)获得所述抗体，和
(c)可选地，将所述抗体转化为双特异性结合分子，所述双特异性结合分子能够结合至人BCMA，优选结合至T细胞CD3受体复合物。
优选地，步骤(b)包括按如下方法检验所获得的抗体：
当人BCMA蛋白中的相应表位簇与鼠BCMA抗原中的相应表位簇交换时(产生包含人BCMA的构建体，其中人表位簇1和/或4由相应鼠表位簇替代)，会出现抗体的结合降低。与人BCMA蛋白中的相应表位簇相比，并将与人BCMA蛋白中相应表位簇1和4的结合设定为100％，则所述降低优选为至少10％、20％、30％、40％、50％；更优选为至少60％、70％、80％、90％、95％或甚至100％。
该方法进一步包括检测所述抗体是否结合至人BCMA的表位簇1和4，以及进一步是否能够结合至猕猴BCMA的表位簇1和/或4。
第三组结合分子还涉及以下项：
1.一种至少双特异性的结合分子，所述结合分子包含第一结合结构域和第二结合结构域，其中
(a)所述第一结合结构域能够结合至BCMA的表位簇1(MLQMAGQ)和4(NASVTNSVKGTNA)；和
(b)所述第二结合结构域能够结合至T细胞CD3受体复合物；且
其中BCMA的表位簇1对应于如SEQ ID NO：1002中所示序列的氨基酸残基1至7，BCMA的表位簇4对应于如SEQ ID NO：1002中所示序列的氨基酸残基42至54。
2.根据第1项所述的结合分子，其中所述第一结合结构域还能够结合至猕猴BCMA的表位簇1(MLQMARQ)和4(NASMTNSVKGMNA)。
3.根据第1或2项所述的结合分子，其中所述第二结合结构域能够结合至CD3ε。
4.根据前述项中任一项所述的结合分子，其中所述第二结合结构域能够结合至人CD3和猕猴CD3。
5.根据前述项中任一项所述的结合分子，其中所述第一结合结构域和/或第二结合结构域源自抗体。
6.根据第5项所述的结合分子，其选自(scFv)2、(单结构域mAb)2、scFV-单结构域mAb、双链抗体及它们的寡聚体。
7.根据前述项中任一项所述的结合分子，其中所述第一结合结构域包含VH区和VL区，所述VH区含有选自以下的CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3，所述VL区含有选自以下的CDR-L1、CDR-L2以及CDR-L3：
(a)如SEQ ID NO：511中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：512中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：513中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：514中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：515中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：516中所示的CDR-L3；
(b)如SEQ ID NO：521中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：522中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：523中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：524中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：525中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：526中所示的CDR-L3；
(c)如SEQ ID NO：531中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：532中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：533中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：534中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：535中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：536中所示的CDR-L3；
(d)如SEQ ID NO：541中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：542中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：543中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：544中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：545中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：546中所示的CDR-L3；
(e)如SEQ ID NO：551中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：552中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：553中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：554中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：555中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：556中所示的CDR-L3；
(f)如SEQ ID NO：561中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：562中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：563中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：564中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：565中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：566中所示的CDR-L3；和
(g)如SEQ ID NO：571中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：572中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：573中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：574中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：575中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：576中所示的CDR-L3。
8.根据前述项中任一项所述的结合分子，其中所述第一结合结构域包含VH区，所述VH区选自如以下序列中所示的VH区：SEQ ID NO：517、SEQ IDNO：527、SEQ ID NO：537、SEQ ID NO：547、SEQ ID NO：557、SEQ ID NO：567和SEQ ID NO：577。
9.根据前述项中任一项所述的结合分子，其中所述第一结合结构域包含VL区，所述VL区选自如以下序列中所示的VL区：SEQ ID NO：518、SEQ IDNO：528、SEQ ID NO：538、SEQ ID NO：548、SEQ ID NO：558、SEQ ID NO：568和SEQ ID NO：578。
10.根据前述项中任一项所述的结合分子，其中所述第一结合结构域包含选自以下的VH区和VL区：
(a)如SEQ ID NO：517中所示的VH区，和如SEQ ID NO：518中所示的VL区；
(b)如SEQ ID NO：527中所示的VH区，和如SEQ ID NO：528中所示的VL区；
(c)如SEQ ID NO：537中所示的VH区，和如SEQ ID NO：538中所示的VL区；
(d)如SEQ ID NO：547中所示的VH区，和如SEQ ID NO：548中所示的VL区；
(e)如SEQ ID NO：557中所示的VH区，和如SEQ ID NO：558中所示的VL区；
(f)如SEQ ID NO：567中所示的VH区，和如SEQ ID NO：568中所示的VL区；和
(g)如SEQ ID NO：577中所示的VH区，和如SEQ ID NO：578中所示的VL区。
11.根据第10项所述的结合分子，其中所述第一结合结构域包含选自以下序列的氨基酸序列：SEQ ID NO：519、SEQ ID NO：529、SEQ ID NO：539、SEQ ID NO：549、SEQ ID NO：559、SEQ ID NO：569和SEQ ID NO：579。
12.一种编码如第1至11项中任一项所定义的结合分子的核酸序列。
13.一种包含如第12项中所定义的核酸序列的载体。
14.一种用如第12项中所定义的核酸序列或用如第13项中所定义的载体转化或转染的宿主细胞。
15.一种用于生产根据第1至11项中任一项所述的结合分子的方法，所述方法包括在允许如第1至11项中任一项所定义的结合分子表达的条件下培养如第14项中所定义的宿主细胞并从培养物中回收产生的结合分子。
16.一种包含第1至11项中任一项所述的结合分子或根据第15项所述的方法生产的结合分子的药物组合物。
17.根据第1至11项中任一项所述的结合分子或根据第15项所述的方法生产的结合分子，其用于预防、治疗或改善选自包含浆细胞障碍、其它与BCMA表达有关的B细胞障碍和自身免疫性疾病的疾病。
18.一种用于治疗或改善选自浆细胞障碍、其它与BCMA表达有关的B细胞障碍和自身免疫性疾病的疾病的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用根据第1至11项中任一项所述的结合分子或根据第15项所述方法生产的结合分子。
19.根据第18项所述的方法，其中所述浆细胞障碍选自：多发性骨髓瘤、浆细胞瘤、浆细胞白血病、巨球蛋白血症、淀粉样变性、华氏巨球蛋白血症、孤立性骨浆细胞瘤、髓外浆细胞瘤、骨硬化性骨髓瘤、重链病、意义不明确的单克隆丙种球蛋白病以及郁积型多发性骨髓瘤。
20.根据第18项所述的方法，其中所述自身免疫性疾病是全身性红斑狼疮。
21.一种包含如第1至11项中任一项所定义的结合分子、如第12项中所定义的核酸分子、如第13项中所定义的载体、和/或如第14项中所定义的宿主细胞的试剂盒。
22.BCMA的表位簇1和表位簇4在结合分子生产中的用途，所述结合分子优选为能够结合至BCMA的抗体，其中BCMA的表位簇1对应于如SEQ ID NO：1002中所示序列的氨基酸残基1至7，BCMA的表位簇4对应于如SEQ ID NO：1002中所示序列的氨基酸残基42至54。
23.一种用于生产抗体的方法，所述抗体优选为能够结合至BCMA的结合分子，所述方法包括：
(a)用包含BCMA的表位簇1和表位簇4的多肽免疫动物，其中BCMA的表位簇1对应于如SEQ ID NO：1002中所示序列的氨基酸残基1至7，BCMA的表位簇4对应于如SEQ ID NO：1002中所示序列的氨基酸残基42至54，
(b)获得所述抗体，和
(c)可选地，将所述抗体转化为双特异性结合分子，所述双特异性结合分子能够结合至人BCMA，优选结合至T细胞CD3受体复合物。
第四组结合分子(D)
本发明的第四组结合分子涉及包含至少第一结合结构域和第二结合结构域的双特异性的结合分子，其中所述第一结合结构域能够结合至人BCMA的胞外结构域和BCMA的至少一个嵌合的胞外结构域，所述嵌合的胞外结构域通过将人BCMA抗原的表位簇或氨基酸与非-人BCMA抗原的相应表位簇或氨基酸交换产生；并且所述第二结合结构域能够结合至T细胞CD3受体复合物。
因此，本发明的第一个方面提供至少双特异性的结合分子，所述结合分子包含第一结合结构域和第二结合结构域，其中
(a)所述第一结合结构域能够结合至
(i)对应于如SEQ ID NO：1007中所示的氨基酸序列的人BCMA的胞外结构域，和
(ii)选自以下的BCMA的至少一个嵌合的胞外结构域：对应于如SEQ ID NO：1009、SEQ ID NO：1010、SEQ ID NO：1011、SEQ ID NO：1012、SEQ ID NO：1013、SEQ ID NO：1014和SEQ ID NO：1015中所示的氨基酸序列的BCMA结构域；和
(b)所述第二结合结构域能够结合至T细胞CD3受体复合物。
在一个优选的实施方案中，如本文(a)(ii)中定义的所述第一结合结构域能够至少结合至如SEQ ID NO：1011中所示的BCMA的嵌合的胞外结构域。在根据本发明的另一个实施方案中，所述第一结合结构域能够结合至两个、三个、四个、五个、六个或所有的如SEQ ID NO：1009、SEQ ID NO：1010、SEQ ID NO：1011、SEQ ID NO：1012、SEQ ID NO：1013、SEQ ID NO：1014和SEQ ID NO：1015中所示的BCMA的嵌合的胞外结构域。在这一实施方案的上下文中，与如SEQ ID NO：1011中所示的BCMA的嵌合的胞外结构域和一个或多个其它嵌合的胞外结构域的组合的结合是优选的。
一方面，本发明的第一结合结构域能够结合至人BCMA、优选人BCMAECD的表位簇1至7。例如，当人BCMA蛋白中的相应表位簇与鼠BCMA抗原中的相应表位簇交换时(如产生包含人BCMA的构建体，其中例如，人表位簇1和/或4由相应鼠表位簇替代；分别参见示例性的SEQ ID NO：1009和1012)，结合结构域仍然能够结合。
设想到第一结合结构域能够结合至嵌合的BCMA构建体，该构建体包含前述在每一个可能组合中的人BCMA ECD的一个或多个鼠表位簇。例如，当人BCMA蛋白中的相应表位簇与鼠BCMA抗原中的相应表位簇交换时(如产生包含人BCMA的构建体，其中例如，人表位簇3被相应鼠表位簇替代；参见示例性的SEQ ID NO：1011)，结合结构域仍然能够结合。当人BCMA ECD中多于一个的表位簇被相应鼠表位簇替代时，优选的是在嵌合体中至少一个表位簇仍然源自人BCMA ECD，优选至少一个、两个、三个或四个表位簇选自源自人BCMA ECD的表位簇1、2、3和4。
设想到前述人BCMA/鼠BCMA嵌合体在CHO细胞中表达。还设想到人BCMA/鼠BCMA嵌合体中的至少一个、例如鼠E1/人BCMA嵌合体与不同膜-结合蛋白(如EpCAM)的跨膜结构域和/或胞质结构域融合；参见图2a。
一种测试这种由于与非-人(如鼠)BCMA抗原的相应表位簇结合的方法描述于所附实施例中，特别在实施例D1-3中。
一方面，优选地，根据本发明所述结合分子的第一结合结构域不能够结合至对应于如SEQ ID NO：1008中所示氨基酸序列的鼠BCMA的胞外结构域。
术语“不能够结合”是指本发明的结合分子的第一结合结构域不结合至鼠BCMA(SEQ ID NO：1008)，即其与鼠BCMA不显示出高于30％、优选高于20％、更优选高于10％、特别优选高于9％、8％、7％、6％或5％的反应性，优选在应用于所附实施例的条件下进行。
人们认为特异性结合受到结合结构域和抗原的氨基酸序列中的特异性基序的影响。因此，结合的发生是由于其一级、二级和/或三级结构以及所述结构的二级修饰的结果。抗原-相互作用-位点与其特异性抗原之间的特异性相互作用可能导致所述位点与抗原的简单结合。另外，作为另外一种选择或除此之外，抗原-相互作用-位点与其特异性抗原的特异性相互作用可能导致信号的启动，如由于抗原构象的改变、抗原寡聚化等的诱导等。
一方面，本发明的第一结合结构域还能够结合至如来自恒河猴或马来猴的猕猴BCMA(分别为SEQ ID NO：1020和1021)。还设想到第一结合结构域不结合至鼠BCMA。
第一结合结构域对人BCMA的亲和性优选≤15nM，更优选≤10nM，甚至更优选≤5nM，最优选≤1nM。
在一个实施方案中，本发明的结合分子的第一结合结构域包含VH区和VL区，所述VH区含有选自以下的CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3，所述VL区含有选自以下的CDR-L1、CDR-L2以及CDR-L3：
(a)如SEQ ID NO：841中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：842中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：843中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：844中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：845中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：846中所示的CDR-L3；
(b)如SEQ ID NO：851中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：852中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：853中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：854中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：855中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：856中所示的CDR-L3；
(c)如SEQ ID NO：861中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：862中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：863中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：864中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：865中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：866中所示的CDR-L3；
(d)如SEQ ID NO：871中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：872中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：873中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：874中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：875中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：876中所示的CDR-L3；
(e)如SEQ ID NO：881中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：882中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：883中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：884中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：885中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：886中所示的CDR-L3；
(f)如SEQ ID NO：891中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：892中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：893中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：894中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：895中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：896中所示的CDR-L3；
(g)如SEQ ID NO：901中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：902中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：903中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：904中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：905中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：906中所示的CDR-L3；
(h)如SEQ ID NO：911中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：912中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：913中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：914中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：915中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：916中所示的CDR-L3；
(i)如SEQ ID NO：921中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：922中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：923中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：924中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：925中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：926中所示的CDR-L3；
(k)如SEQ ID NO：931中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：932中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：933中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：934中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：935中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：936中所示的CDR-L3；
(l)如SEQ ID NO：941中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：942中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：943中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：944中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：945中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：946中所示的CDR-L3；和
(m)如SEQ ID NO：951中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：952中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：953中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：954中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：955中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：956中所示的CDR-L3。
在另一个实施方案中，所述结合分子的第一结合结构域包含VH区，所述VH区选自如以下序列中所示的VH区：SEQ ID NO：847、SEQ ID NO：857、SEQ ID NO：867、SEQ ID NO：877、SEQ ID NO：887、SEQ ID NO：897、SEQID NO：907、SEQ ID NO：917、SEQ ID NO：927、SEQ ID NO：937、SEQ ID NO：947和SEQ ID NO：957。
在另一个实施方案中，所述结合分子的第一结合结构域包含VL区，所述VL区选自如以下序列中所示的VL区：SEQ ID NO：848、SEQ ID NO：858、SEQ ID NO：868、SEQ ID NO：878、SEQ ID NO：888、SEQ ID NO：898、SEQID NO：908、SEQ ID NO：918、SEQ ID NO：928、SEQ ID NO：938、SEQ ID NO：948和SEQ ID NO：958。
在一个实施方案中，所述结合分子的第一结合结构域包含选自以下的VH区和VL区：
(a)如SEQ ID NO：847中所示的VH区，和如SEQ ID NO：848中所示的VL区；
(b)如SEQ ID NO：857中所示的VH区，和如SEQ ID NO：858中所示的VL区；
(c)如SEQ ID NO：867中所示的VH区，和如SEQ ID NO：868中所示的VL区；
(d)如SEQ ID NO：877中所示的VH区，和如SEQ ID NO：878中所示的VL区；
(e)如SEQ ID NO：887中所示的VH区，和如SEQ ID NO：888中所示的VL区；
(f)如SEQ ID NO：897中所示的VH区，和如SEQ ID NO：898中所示的VL区；
(g)如SEQ ID NO：907中所示的VH区，和如SEQ ID NO：908中所示的VL区；
(h)如SEQ ID NO：917中所示的VH区，和如SEQ ID NO：918中所示的VL区；
(i)如SEQ ID NO：927中所示的VH区，和如SEQ ID NO：928中所示的VL区；
(k)如SEQ ID NO：937中所示的VH区，和如SEQ ID NO：938中所示的VL区；
(l)如SEQ ID NO：947中所示的VH区，和如SEQ ID NO：948中所示的VL区；和
(m)如SEQ ID NO：957中所示的VH区，和如SEQ ID NO：958中所示的VL区。
在一个实施方法中，所述第一结合结构域包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：849、SEQ ID NO：859、SEQ ID NO：869、SEQ ID NO：879、SEQID NO：889、SEQ ID NO：899、SEQ ID NO：909、SEQ ID NO：919、SEQ ID NO：929、SEQ ID NO：939、SEQ ID NO：949和SEQ ID NO：959。
第四组结合分子还涉及以下项：
1.一种包含第一结合结构域和第二结合结构域的结合分子，其中
(a)所述第一结合结构域能够结合至
(i)对应于如SEQ ID NO：1007中所示氨基酸序列的人BCMA的胞外结构域，和
(ii)选自以下的BCMA的至少一个嵌合的胞外结构域：对应于如SEQ ID NO：1009、SEQ ID NO：1010、SEQ ID NO：1011、SEQ ID NO：1012、SEQ ID NO：1013、SEQ ID NO：1014和SEQ ID NO：1015中所示氨基酸序列的BCMA结构域；和
(b)所述第二结合结构域能够结合至T细胞CD3受体复合物。
2.根据第1项所述的结合分子，其中所述第一结合结构域还能够结合至猕猴BCMA。
3.根据第1或2项所述的结合分子，其中所述第二结合结构域能够结合至CD3ε。
4.根据前述项中任一项所述的结合分子，其中所述第二结合结构域能够结合至人CD3和猕猴CD3。
5.根据前述项中任一项所述的结合分子，其中所述第一结合结构域不能够结合至对应于如SEQ ID NO：1008中所示氨基酸序列的鼠BCMA的胞外结构域。
6.根据前述项中任一项所述的结合分子，其中所述第一结合结构域和/或第二结合结构域源自抗体。
7.根据第6项所述的结合分子，其选自(scFv)2、(单结构域mAb)2、scFv-单结构域mAb、双链抗体及它们的寡聚体。
8.根据前述项中任一项所述的结合分子，其中所述第一结合结构域包含VH区和VL区，所述VH区含有选自以下的CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3，所述VL区含有选自以下的CDR-L1、CDR-L2以及CDR-L3：
(a)如SEQ ID NO：841中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：842中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：843中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：844中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：845中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：846中所示的CDR-L3；
(b)如SEQ ID NO：851中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：852中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：853中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：854中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：855中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：856中所示的CDR-L3；
(c)如SEQ ID NO：861中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：862中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：863中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：864中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：865中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：866中所示的CDR-L3；
(d)如SEQ ID NO：871中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：872中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：873中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：874中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：875中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：876中所示的CDR-L3；
(e)如SEQ ID NO：881中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：882中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：883中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：884中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：885中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：886中所示的CDR-L3；
(f)如SEQ ID NO：891中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：892中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：893中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：894中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：895中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：896中所示的CDR-L3；
(g)如SEQ ID NO：901中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：902中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：903中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：904中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：905中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：906中所示的CDR-L3；
(h)如SEQ ID NO：911中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：912中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：913中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：914中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：915中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：916中所示的CDR-L3；
(i)如SEQ ID NO：921中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：922中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：923中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：924中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：925中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：926中所示的CDR-L3；
(k)如SEQ ID NO：931中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：932中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：933中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：934中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：935中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：936中所示的CDR-L3；
(l)如SEQ ID NO：941中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：942中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：943中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：944中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：945中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：946中所示的CDR-L3；和
(m)如SEQ ID NO：951中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：952中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：953中所示的CDR-H3、如SEQID NO：954中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：955中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：956中所示的CDR-L3。
9.根据前述项中任一项所述的结合分子，其中所述第一结合结构域包含VH区，所述VH区选自如以下序列中所示的VH区：SEQ ID NO：847、SEQ IDNO：857、SEQ ID NO：867、SEQ ID NO：877、SEQ ID NO：887、SEQ ID NO：897、SEQ ID NO：907、SEQ ID NO：917、SEQ ID NO：927、SEQ ID NO：937、SEQ ID NO：947和SEQ ID NO：957。
10.根据前述项中任一项所述的结合分子，其中所述第一结合结构域包含VL区，所述VL区选自如以下序列中所示的VL区：SEQ ID NO：848、SEQID NO：858、SEQ ID NO：868、SEQ ID NO：878、SEQ ID NO：888、SEQ ID NO：898、SEQ ID NO：908、SEQ ID NO：918、SEQ ID NO：928、SEQ ID NO：938、SEQ ID NO：948和SEQ ID NO：958。
11.根据前述项中任一项所述的结合分子，其中所述第一结合结构域包含选自以下的VH区和VL区：
(a)如SEQ ID NO：847中所示的VH区，和如SEQ ID NO：848中所示的VL区；
(b)如SEQ ID NO：857中所示的VH区，和如SEQ ID NO：858中所示的VL区；
(c)如SEQ ID NO：867中所示的VH区，和如SEQ ID NO：868中所示的VL区；
(d)如SEQ ID NO：877中所示的VH区，和如SEQ ID NO：878中所示的VL区；
(e)如SEQ ID NO：887中所示的VH区，和如SEQ ID NO：888中所示的VL区；
(f)如SEQ ID NO：897中所示的VH区，和如SEQ ID NO：898中所示的VL区；
(g)如SEQ ID NO：907中所示的VH区，和如SEQ ID NO：908中所示的VL区；
(h)如SEQ ID NO：917中所示的VH区，和如SEQ ID NO：918中所示的VI区；
(i)如SEQ ID NO：927中所示的VH区，和如SEQ ID NO：928中所示的VL区；
(k)如SEQ ID NO：937中所示的VH区，和如SEQ ID NO：938中所示的VL区；
(l)如SEQ ID NO：947中所示的VH区，和如SEQ ID NO：948中所示的VL区；和
(m)如SEQ ID NO：957中所示的VH区，和如SEQ ID NO：958中所示的VL区。
12.根据第10项所述的结合分子，其中所述第一结合结构域包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：849、SEQ ID NO：859、SEQ ID NO：869、SEQID NO：879、SEQ ID NO：889、SEQ ID NO：899、SEQ ID NO：909、SEQ ID NO：919、SEQ ID NO：929、SEQ ID NO：939、SEQ ID NO：949和SEQ ID NO：959。
13.一种编码如第1至12项中任一项所定义的结合分子的核酸序列。
14.一种包含如第13项中所定义的核酸序列的载体。
15.一种用第13项中所定义的核酸序列或如第14项中所定义的载体转化或转染的宿主细胞。
16.一种用于生产根据第1至12项中任一项所述的结合分子的生产方法，所述方法包括在如第1至12项中任一项所定义的结合分子表达的条件下培养如第15项中所定义的宿主细胞并从培养物中回收产生的结合分子。
17.一种包含根据第1至12项中任一项所述的结合分子或根据第16项所述的方法生产的结合分子的药物组合物。
18.根据第1至12项中任一项所述的结合分子或根据第16项所述的方法生产的结合分子，其用于预防、治疗或改善选自浆细胞障碍、其它与BCMA表达有关的B细胞障碍和自身免疫性疾病的疾病。
19.一种用于治疗或改善选自浆细胞障碍、其它与BCMA表达有关的B细胞障碍和自身免疫性疾病的疾病的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用根据第1至12项中任一项所述的结合分子或根据第16项所述方法生产的结合分子。
20.根据第19项所述的方法，其中所述浆细胞障碍选自：多发性骨髓瘤、浆细胞瘤、浆细胞白血病、巨球蛋白血症、淀粉样变性、华氏巨球蛋白血症、孤立性骨浆细胞瘤、髓外浆细胞瘤、骨硬化性骨髓瘤、重链病、意义不明确的单克隆丙种球蛋白病以及郁积型多发性骨髓瘤。
21.根据第19项所述的方法，其中所述自身免疫性疾病是全身性红斑狼疮。
22.一种包含如第1至12项中任一项所定义的结合分子、如第13项中所定义的核酸分子、如第14项中所定义的载体、和/或如第15项中所定义的宿主细胞的试剂盒。
应当理解的是，本文所述发明不限于特定的方法学、实验方案和试剂，因为这些是可以变化的。本文所提供的论述和实例仅是为了描述特定的实施方案而非意在限制本发明的范围，本发明的范围仅受到权利要求的限制。
本说明书的全文中所引用的所以出版物和专利(包括所有的专利、专利申请、科技出版物、制造商的说明和使用说明等)，无论是在上文还是在下文中，都全文并入本文作为参考。本文的任何内容不应当被解释为承认本发明由于在先发明而没有资格先于此类公开。在一定程度上，若作为参考并入的材料与本说明书矛盾或不一致，则本说明书将取代任何这类材料。
下述附图和实施例的名称代表其与本文上述(A)至(D)组的结合分子相关。换言之，图A[+序号]和实施例A[+序号]涉及组(A)，图B[+序号]和实施例B[+序号]涉及组(B)，图C[+序号]和实施例C[+序号]涉及组(C)，和图D[+序号]和实施例D[+序号]涉及组(D)。
附图说明：
图1：
人BCMA(全长蛋白的氨基酸残基1-54)与鼠BCMA(全长蛋白的氨基酸残基1-49)的胞外结构域(ECD)的序列比对。突出显示的为在嵌合构建体中被交换的区域(结构域或氨基酸残基)，作为指定的表位成簇(clustering)。半胱氨酸通过黑色线框表示。显示出二硫键。
图2：
BCMA构建体的表位作图。通过流式细胞术显示了在CHO细胞表面表达的人和鼠BCMA(图2a)以及七个嵌合的人-鼠BCMA构建体(图2b)。人BCMA在CHO上的表达通过单克隆抗-人BCMA抗体检测到。鼠BCMA表达通过单克隆抗-鼠BCMA抗体检测到。结合的单克隆抗体通过缀合到藻红蛋白的抗-大鼠IgG-Fc-γ-特异性抗体检测到。
图A3：
对表位簇E3和E4具有特异性的结合分子的实例，如在嵌合的BCMA构建体的表位作图谱中检测到(参见实施例A3)。一些结合分子另外能够结合至人BCMA中39位的氨基酸残基精氨酸(“E7”)。
图B3：
对人和鼠BCMA具有特异性的结合分子的实例(参见实施例B3)。
图C3：
对表位簇E1和E4具有特异性的结合分子的实例，如由嵌合的BCMA构建体的表位作图中检测到(参见实施例C3)。
图D3：
结合至人BCMA的结合分子的实例，所述结合分子不与鼠BCMA交叉反应且另外结合至不同嵌合的BCMA构建体，如在表位作图谱中检测到(参见实施例D3)。
图A4：
使用Biacore系统，在人和猕猴BCMA上的双特异性结合分子(抗BCMA×抗CD3)的结合常数的测定。抗原以低至中等密度(100RU)被固定在CM5芯片上。结合剂的稀释液漂浮在芯片表面上，并用BiaEval软件测定结合。各个结合剂的相应的解离速率和结合常数(KD)示于每幅图之下。
图B4：
在FACS中采用人BCMA转染的CHO细胞分析亲和性成熟的scFv分子的功能性和结合强度。结果以一系列1∶3稀释的周质大肠杆菌细胞提取物的FACS直方图表示，其中绘制荧光强度的对数与相对细胞数。
图C4：
在FACS中采用人BCMA和猕猴BCMA转染的CHO细胞分析亲和性成熟的scFv分子的功能性和结合强度。结果以一系列1∶3稀释的周质大肠杆菌细胞提取物的FACS直方图表示，其中绘制荧光强度的对数与相对细胞数。
图D4：
使用Biacore系统，在人和猕猴BCMA上的双特异性结合分子(抗BCMA×抗CD3)的结合常数的测定。抗原以低至中等密度(100RU)被固定在CM5芯片上。结合剂的稀释液漂浮在芯片表面上，并用BiaEval软件测定结合。各个结合剂的相应的解离速率和结合常数(KD)示于每幅图之下。
图A5：
在18小时51铬释出分析法中测得的BCMA双特异性抗体的细胞毒性活性。效应细胞：经刺激的富集的人CD8T细胞。靶细胞：人BCMA转染的CHO细胞(左图)和猕猴BCMA转染的CHO细胞(右图)。效应细胞与靶细胞的比率(E∶T)为10∶1。
图D5：
在18小时51铬释出分析法中测得的BCMA双特异性抗体的细胞毒性活性。效应细胞：经刺激的富集的人CD8T细胞。靶细胞：人BCMA转染的CHO细胞(左图)和猕猴BCMA转染的CHO细胞(右图)。效应细胞与靶细胞的比率(E∶T)为10∶1。
图A6
使用Biacore系统，在人和猕猴BCMA上的及在人和猕猴CD3上的表位簇E3/E4±E7的BCMA/CD3双特异性抗体的结合常数的测定。抗原以低至中等密度(100-200RU)被固定在CM5芯片上。双特异性抗体的稀释液漂浮在芯片表面上，并用BiaEval软件测定结合。各个双特异性抗体的相应的解离速率和结合速率及得到的结合常数(KD)示于每幅图之下。
图A7
在所示的细胞系上的表位簇E3/E4±E7的BCMA/CD3双特异性抗体的FACS分析：1)人BCMA转染的CHO细胞，2)人CD3阳性人T细胞系HBP-ALL，3)猕猴BCMA转染的CHO细胞，4)猕猴T细胞系4119LnPx，5)BCMA-阳性人多发性骨髓瘤细胞系NCI-H929和6)未经转染的CHO细胞。阴性对照[1)至6)]：不具有在前的BCMA/CD3双特异性抗体的抗体的检测。
图A8
在BCMA-表达细胞上的BCMA/CD3双特异性抗体的Scatchard分析。细胞与浓度递增直至饱和的单体抗体一起培养。抗体采用流式细胞术检测。三份测量值绘制成双曲线和S曲线来证明所用的有效浓度范围。使用Scatchard评估法确定最大的结合，并计算相应的KD值。
图A9
表位簇E3/E4±E7的BCMA/CD3双特异性抗体的细胞毒性活性，其是在针对由人BCMA转染的CHO细胞的18小时51-铬释出分析法中测得的。效应细胞：经刺激的富集的人CD8T细胞。效应细胞与靶细胞的比率(E∶T)为10∶1。
图A10
表位簇E3/E4±E7的BCMA/CD3双特异性抗体的细胞毒性活性，其是在48小时基于FACS的细胞毒性分析法测定的。效应细胞：未经刺激的人PBMC。靶细胞：人BCMA转染的CHO细胞。效应细胞与靶细胞的比率(E∶T)为10∶1。
图A11
在BAFF-R和TACI转染的CHO细胞上的表位簇E3/E4±E7的BCMA/CD3双特并性抗体的FACS分析。细胞系：1)人BAFF-R转染的CHO细胞，2)人TACI转染的CHO细胞，3)多发性骨髓瘤细胞系L363；阴性对照：不具有在前的BCMA/CD3双特异性抗体的检测抗体。阳性对照：BAFF-R检测：由抗-山羊抗体-PE(Jackson705-116-147；1∶50)检测的山羊抗huBAFF-R(R&D AF1162；1∶20)，TACI-检测：由山羊抗兔抗体PE(Sigma P9757；1∶20)检测的兔抗TACI抗体(abcam AB79023；1∶100)。
图A12
在18小时51-铬释出分析法中测得的BCMA/CD3双特异性抗体的细胞毒性活性。效应细胞：经刺激的富集的人CD8T细胞。靶细胞：BCMA-阳性人多发性骨髓瘤细胞系L363(即天然表达者)。效应细胞与靶细胞的比率(E∶T)为10∶1。
图A13
在48小时基于FACS的细胞毒性分析法中测定的BCMA/CD3双特异性抗体的细胞毒性活性。效应细胞：未经刺激的人PBMC。靶细胞：人多发性骨髓瘤细胞系L363(天然BCMA表达者)。效应细胞与靶细胞的比率(E∶T)为10∶1。
图A14
在48小时基于FACS的细胞毒性分析法中测定的BCMA/CD3双特异性抗体的细胞毒性活性。效应细胞：未经刺激的人PBMC。靶细胞：BCMA-阳性人多发性骨髓瘤细胞系NCI-H929。效应细胞与靶细胞的比率(E∶T)为10∶1。
图A15
在48小时基于FACS的细胞毒性分析法中测定的BCMA/CD3双特异性抗体的细胞毒性活性。效应细胞：猕猴T细胞系4119LnPx。靶细胞：由猕猴BCMA转染的CHO细胞。效应细胞与靶细胞的比率(E∶T)为10∶1。
图A16：
在晚期NCI-H929异体移植模型中的表位簇E3/E4±E7的BCMA/CD3双特异性抗体的抗肿瘤活性(参见实施例A16)。
图A17：
基于FACS的细胞毒性分析法，其使用人多发性骨髓瘤细胞系NCI-H929、L-363和OPM-2作为靶细胞，人PBMC作为效应细胞(48小时；E∶T＝10∶1)。该图描绘了细胞因子水平[pg/ml]，其是针对I1-2、IL-6、IL-10、TNF和IFN-γ以表位簇E3/E4±E7的BCMA/CD3双特异性抗体的递增浓度所测定的(参见实施例A22)。
具体实施方式
下列实施例说明本发明。不应将这些实施例解释为限制本发明的范围。这些实施例纳入本文仅为了说明，且本发明仅受到权利要求的限制。
实施例A
实施例A1表达嵌合的BCMA的CHO细胞的产生
为了构建嵌合的表位作图分子，将人BCMA相应表位结构域的氨基酸序列或单一氨基酸残基替换为鼠的序列。构建下列分子：
●人BCMA ECD/E1鼠(SEQ ID NO：1009)
嵌合的胞外BCMA结构域：人胞外BCMA结构域，其中表位簇1(SEQID NO：1002或1007的氨基酸残基1-7)被相应的鼠簇(SEQ ID NO：1004或1008的氨基酸残基1-4)替换
→SEQ ID NO：1002或1007中氨基酸残基1-3的缺失及G6Q突变
●人BCMA ECD/E2鼠(SEQ ID NO：1010)
嵌合的胞外BCMA结构域：人胞外BCMA结构域，其中表位簇2(SEQID NO：1002或1007的氨基酸残基8-21)被相应的鼠簇(SEQ ID NO：1004或1008的氨基酸残基5-18)替换
→SEQ ID NO：1002或1007中S9F、Q10H及N11S突变
●人BCMA ECD/E3鼠(SEQ ID NO：1011)
嵌合的胞外BCMA结构域：人胞外BCMA结构域，其中表位簇3(SEQID NO：1002或1007的氨基酸残基24-41)被相应的鼠簇(SEQ ID NO：1004或1008的氨基酸残基21-36)替换
→SEQ ID NO：1002或1007中氨基酸残基31和32的缺失及Q25H、S30N、L35A和R39P突变
●人BCMA ECD/E4鼠(SEQ ID NO：1012)
嵌合的胞外BCMA结构域：人胞外BCMA结构域，其中表位簇4(SEQID NO：1002或1007的氨基酸残基42-54)被相应的鼠簇(SEQ ID NO：1004或1008的氨基酸残基37-49)替换
→SEQ ID NO：1002或1007中N42D、A43P、N47S、N53Y和A54T突变
●人BCMA ECD/E5鼠(SEQ ID NO：1013)
嵌合的胞外BCMA结构域：人胞外BCMA结构域，其中SEQ ID NO：1002或1007中的第22位的氨基酸残基(异亮氨酸)被SEQ ID NO：1004或1008中其相应的鼠氨基酸残基(赖氨酸，第19位)替换
→SEQ ID NO：1002或1007中122K突变
●人BCMA ECD/E6鼠(SEQ ID NO：1014)
嵌合的胞外BCMA结构域：人胞外BCMA结构域，其中SEQ ID NO：1002或1007中的第25位的氨基酸残基(谷氨酰胺)被SEQ ID NO：1004或1008中其相应的鼠氨基酸残基(组氨酸，第22位)替换
→SEQ ID NO：1002或1007中Q25H突变
●人BCMA ECD/E7鼠(SEQ ID NO：1015)
嵌合的胞外BCMA结构域：人胞外BCMA结构域，其中SEQ ID NO：1002或1007中的第39位的氨基酸残基(精氨酸)被SEQ ID NO：1004或1008中其相应的鼠氨基酸残基(脯氨酸，第34位)替换
→SEQ ID NO：1002或1007中R39P突变
A)将cDNA构建体克隆至哺乳动物表达载体pEF-DHFR中并稳定地转染至CHO细胞中。人BCMA在CHO细胞上的表达通过采用单克隆抗-人BCMA抗体的FACS分析法验证。鼠BCMA的表达通过单克隆抗-小鼠BCMA-抗体证明。所使用的BCMA抗体的浓度为在PBS/2％FCS中10μg/ml。结合的单克隆抗体通过抗-大鼠-IgG-Fcy-PE(在PBS/2％FCS中为1∶100；Jackson-Immuno-Research#112-116-071)检测。作为阴性对照，用PBS/2％FCS替代第一抗体与细胞一起培养。样品通过FACSCanto II仪器(Becton Dickinson)上的流式细胞术测量并用FlowJo软件(7.6版)进行分析。使用不同的抗-BCMA抗体在流式细胞术分析法中分析并证实人-鼠BCMA嵌合体转染的CHO细胞的表面表达(图2)。
B)为了产生表达人、猕猴、小鼠及人/小鼠嵌合的跨膜BCMA的CHO细胞，根据标准方法通过基因合成获得人、猕猴、小鼠BCMA和人-小鼠BCMA嵌合体的编码序列(如基因库(GenBank)所公布的BCMA序列，登录号NM_001192[人]；NM_011608[小鼠]及XM_001106892[猕猴])。该基因合成片段设计为首先包含用于构建体真核表达的Kozak位点和19个氨基酸的免疫球蛋白前导肽的编码序列，在嵌合体具有由人序列交换为鼠序列的相应表位结构域的情况下，该框架中随后是相应的BCMA蛋白的编码序列。
除了人BCMA ECD/E4鼠和人BCMA构建体外，框架中BCMA蛋白的胞外结构域的编码序列之后是人工Ser1-Gly4-Ser1-连接子的编码序列，之后接着是人EpCAM的胞内结构域(氨基酸226-314；如基因库登录号NM_002354所公布的序列)。
所有编码序列之后都是终止密码子。该基因合成片段还设计为引入合适的限制性位点。所述基因合成片段克隆至命名为pEF-DHFR的质粒中(pEF-DHFR描述于Raum等Cancer Immunol Immunother50(2001)141-150中)。所有上述提到的程序都依据标准方案(Sambrook，Molecular Cloning；ALaboratory Manual，3rd edition，Cold Spring Harbour Laboratory Press，ColdSpring Harbour，New York(2001))实施。对于每一抗原，具有已验证序列的核苷酸序列的克隆被转染至用于真核表达构建体的DHFR缺陷型CHO细胞中。在DHFR缺陷型CHO细胞中的真核蛋白表达按如Kaufman R.J.(1990)Methods Enzymol.185，537-566中描述进行。构建体的基因扩增由浓度递增的甲氨蝶呤(MTX)至最终浓度达到20nM的MTX诱导。
实施例A2
2.1在HEK293细胞中的瞬时表达
将具有已验证序列的核苷酸序列的表达质粒的克隆用于转染并在FreeStyle293表达系统(Invitrogen GmbH，Karlsruhe，德国)中根据制造商说明进行蛋白质表达。得到包含表达的蛋白质的上清液，采用离心移除细胞并将上清液在-20℃下贮存。
2.2在CHO细胞中的稳定表达
将具有已验证序列的核苷酸序列的表达质粒的克隆转染至用于真核表达构建体的DHFR缺陷型CHO细胞中。在DHFR缺陷型CHO细胞中的真核蛋白表达按如Kaufman R.J.(1990)Methods Enzymol.185，537-566中描述进行。构建体的基因扩增由浓度递增的甲氨蝶呤(MTX)至最终浓度达到20nM的MTX诱导。经过两次传代的静置培养，细胞在具有无核苷HyQ PFCHO液体大豆培养基(具有4.0mM的L-谷氨酰胺及0.1％普朗尼克F-68；HyClone)的滚瓶中生长7天，然后收集。采用离心移除细胞并将含有表达的蛋白的上清液在-20℃下贮存。
2.3蛋白质纯化
可溶性BCMA蛋白的纯化按如下进行：将Explorer系统(GEHealthcare)和软件用于色谱法。依据制造商所提供的操作程序，使用装载ZnCl2的Fractogel EMD(Merck)进行固定化金属亲和色谱(“IMAC”)。该色谱柱使用缓冲液A(pH7.2的20mM磷酸钠缓冲液、0.1MNaCl)来平衡并且将过滤(0.2μm)的细胞培养物上清液以3ml/min的流速施加至该色谱柱(10ml)。所述色谱柱采用缓冲液A洗涤从而移除未结合的样品。依据下述程序，采用缓冲液B的两步梯度(pH7.2的20mM磷酸钠缓冲液、0.1M NaCl、0.5M咪唑)将结合的蛋白洗脱：
步骤1：6倍色谱柱体积的10％缓冲液B
步骤2：6倍色谱柱体积的100％缓冲液B
将从步骤2洗脱的蛋白质级分汇集用于进一步纯化。所有的化学试剂均为分析级的且购自Sigma(戴森霍芬)或Merck(达姆施塔特)。
凝胶过滤色谱法在用平衡缓冲液(Equi-buffer)(pH7.2的10mM柠檬酸盐、25mM赖氨酸-盐酸，用于在HEK细胞中所表达的蛋白，而pH7.4的PBS用于在CHO细胞中表达的蛋白)平衡的HiLoad16/60Superdex200制备级色谱柱(GE/Amersham)上进行。洗脱的蛋白样品(流速为1ml/min)经受标准SDS-PAGE及蛋白质印记法来检测。采用OD280nm来测定蛋白质的浓度。通过在HEK293细胞中瞬时表达获得的蛋白质用于免疫接种。通过在CHO细胞中稳定表达获得的蛋白质用于筛选结合剂及用于结合的测定。
实施例A3鼠scFv-片段的表位成簇
用人或鼠BCMA、或用嵌合的BCMA分子转染的细胞采用包含结合至人/猕猴BCMA的scFv的天然、未经稀释的周质提取物进行染色。结合的scFv使用1μg/ml的抗-FLAG抗体(Sigma F1804)和经R-PE-标记的抗-小鼠Fcγ-特异性抗体(1∶100；Dianova#115-116-071)进行检测。所有抗体都在具有2％FCS的PBS中进行稀释。作为阴性对照，细胞与PBS/2％FCS而非与周质提取物一起培养。样品通过FACSCanto II仪器(Becton Dickinson)上的流式细胞术测量并用FlowJo软件(7.6版)进行分析。
实施例A4不同重组形式的可溶性人及猕猴BCMA的获得
A)人和恒河猴BCMA的编码序列(如基因库所公布的，登录号NM_001192[人]；XM_001106892[恒河猴])人白蛋白、人Fcγ1和鼠白蛋白的编码序列用于人工cDNA序列的构建，所述人工cDNA序列分别编码人和猕猴BCMA分别与人白蛋白、人IgG1Fc和鼠白蛋白的可溶性融合蛋白以及仅包含BCMA胞外结构域的可溶性蛋白。为了产生用于表达可溶性人和猕猴BCMA蛋白的构建体，通过上述全长BCMA cDNA的PCR诱变和根据标准方案的分子克隆获得cDNA片段。
对于具有人白蛋白的融合蛋白而言，经修饰的cDNA片段被设计为首先包含用于构建体真核表达的Kozak位点，接着分别是人和恒河猴BCMA蛋白的编码序列，其包含分别对应于人及恒河猴BCMA的胞外结构域的氨基酸1至54和1至53，框架中随后是人工Ser1-Gly4-Ser1-连接子的编码序列，框架中随后是人血清白蛋白的编码序列，框架中接着是Flag标签的编码序列，框架中随后是经修饰的组氨酸标签(SGHHGGHHGGHH)的编码序列及终止密码子。
对于具有鼠IgG1的融合蛋白而言，经修饰的cDNA片段被设计为首先包含用于构建体真核表达的Kozak位点，接着分别是人和猕猴BCMA蛋白的编码序列，其包含分别对应于人及恒河猴BCMA的胞外结构域的氨基酸1至54和1至53，框架中随后是人工Ser1-Gly4-Ser1-连接子的编码序列，框架中接着是人IgG1的铰合部分和Fcγ部分的编码序列，框架中随后是六组氨酸标签的编码序列及终止密码子。
对于具有鼠白蛋白的融合蛋白而言，经修饰的cDNA片段被设计为首先包含用于构建体真核表达的Kozak位点，接着分别是人和猕猴BCMA蛋白的编码序列，其包含分别对应于人及恒河猴BCMA的胞外结构域的氨基酸1至54和1至53，框架中随后是人工Ser1-Gly4-Ser1-连接子的编码序列，框架中接着是鼠血清白蛋白的编码序列，框架中接着是Flag标签的编码序列，框架中随后是经修饰的组氨酸标签(SGHHGGHHGGHH)的编码序列及终止密码子。
对于可溶性胞外结构域构建体而言，经修饰的cDNA片段被设计为首先包含用于构建体真核表达的Kozak位点，接着分别是人和猕猴BCMA蛋白的编码序列，其包含分别对应于人及恒河猴BCMA的胞外结构域的氨基酸1至54和1至53，框架中随后是人工Ser1-Gly1-连接子的编码序列，框架中接着是Flag标签的编码序列，框架中随后是经修饰的组氨酸标签(SGHHGGHHGGHH)的编码序列及终止密码子。
所述cDNA片段也被设计为在片段的起点和终点处引入限制性位点。引入的限制性位点(在5’端引入EcoRI及在3’端引入SalI)被应用于以下的克隆过程中。通过EcoRI和SalI将cDNA片段克隆至命名为pEF-DHFR的质粒(pEF-DHFR描述于Raum等Cancer Immunol Immunother50(2001)141-150中)中。上述提到的程序都依据标准方案(Sambrook，Molecular Cloning；ALaboratory Manual，3rd edition，Cold Spring Harbour Laboratory Press，ColdSpring Harbour，New York(2001))实施。
B)上述人和猕猴BCMA的编码序列和人白蛋白、人Fcγ1、鼠Fcγ1、鼠Fcγ2a、鼠白蛋白、大鼠白蛋白、大鼠Fcγ1和大鼠Fcγ2b的编码序列用于人工cDNA序列的构建，所述人工cDNA序列分别编码人和猕猴BCMA分别与人白蛋白、人IgG1Fc、鼠IgG1Fc、鼠IgG2a Fc、鼠白蛋白、大鼠IgG1Fc、大鼠IgG2b及大鼠白蛋白的可溶性融合蛋白以及仅包含BCMA胞外结构域的可溶性蛋白。为了产生用于表达可溶性人和猕猴BCMA蛋白的构建体，通过上述全长BCMA cDNA的PCR诱变和根据标准方案的分子克隆获得cDNA片段。
对于具有白蛋白的融合蛋白，经修饰的cDNA片段被设计为首先包含用于构建体真核表达的Kozak位点和19个氨基酸的免疫球蛋白前导肽的编码序列，框架中随后是相应BCMA蛋白的胞外结构域的编码序列，框架中随后是人工Ser1-Gly4-Ser1-连接子的编码序列，框架中接着是相应的血清白蛋白的编码序列，框架中接着是Flag标签的编码序列，框架中随后是经修饰的组氨酸标签(SGHHGGHHGGHH)的编码序列及终止密码子。
对于具有IgG Fc的融合蛋白而言，经修饰的cDNA片段被设计为首先包含用于构建体真核表达的Kozak位点和19个氨基酸的免疫球蛋白前导肽的编码序列，框架中接着是相应BCMA蛋白的胞外结构域的编码序列，框架中随后是人工Ser1-Gly4-Ser1-连接子的编码序列(除了其中使用人工Ser1-Gly1-连接子的人IgG Fc)，框架中接着是相应IgG的铰合部分和Fcγ部分的编码序列，框架中接着是Flag标签的编码序列，框架中随后是经修饰的组氨酸标签(SGHHGGHHGGHH)的编码序列及终止密码子。
对于可溶性胞外结构域构建体而言，经修饰的cDNA片段被设计为首先包含用于构建体真核表达的Kozak位点和19个氨基酸的免疫球蛋白前导肽的编码序列，框架中接着是相应BCMA的蛋白胞外结构域的编码序列，框架中随后是人工Ser1-Gly1-连接子的编码序列，框架中接着是Flag标签的编码序列，框架中随后是经修饰的组氨酸标签(SGHHGGHHGGHH)的编码序列及终止密码子。
对于构建体的克隆而言，引入了适当的限制性位点。cDNA片段全部被克隆至命名为pEF-DHFR的质粒(pEF-DHFR描述于Raum等，2001)中。上述提到的程序都依据标准方案(Sambrook，2001)实施。
下述构建体被设计为能够在不同表位进行定向淘选。鼠-人BCMA嵌合体和鼠-猕猴BCMA嵌合体(小鼠、人和猕猴BCMA序列如上所述)的编码序列以及鼠白蛋白和鼠Fcγ1的编码序列用于人工cDNA序列的构建，所述人工cDNA序列分别编码鼠-人和鼠-猕猴BCMA嵌合体分别与鼠IgG1Fc和鼠白蛋白的可溶性融合蛋白。为了产生用于表达可溶性鼠-人和鼠-猕猴BCMA嵌合体的构建体，通过根据标准方案采用基因合成获得鼠BCMA(氨基酸1-49)的cDNA片段，该片段的相应表位结构域分别突变为人和猕猴的序列。构建体的克隆按如上所述和根据标准方案(Sambrook，2001)进行。
构建下述分子：
●人氨基酸1-4，鼠IgG1Fc
●人氨基酸1-4，鼠白蛋白
●恒河猴氨基酸1-4，鼠IgG1Fc
●恒河猴氨基酸1-4，鼠白蛋白
●人氨基酸5-18，鼠IgG1Fc
●人氨基酸5-18，鼠白蛋白
●恒河猴氨基酸5-18，鼠IgG1Fc
●恒河猴氨基酸5-18，鼠白蛋白
●人氨基酸37-49，鼠IgG1Fc
●人氨基酸37-49，鼠白蛋白
●恒河猴氨基酸37-49，鼠IgG1Fc
●恒河猴氨基酸37-49，鼠白蛋白
实施例A5
5.1双特异性抗体对人和猕猴BCMA及CD3的亲和性的基于Biacore的测定
使用具有人血清白蛋白(ALB)的重组BCMA融合蛋白进行Biacore分析实验，来测定BCMA靶向结合。对于CD3亲和性的测定，采用具有与人抗体Fc部分融合的CD3ε(CD3e)的N-末端27个氨基酸的重组融合蛋白。所述重组蛋白以人CD3e1-27形式和食蟹猕猴(cynomolgous)CD3e形式存在，二者都具有双特异性抗体中的CD3结合剂的表位。
具体地，根据制造商的说明书，采用pH4.5的醋酸盐缓冲溶液使CM5传感器芯片(GE Healthcare)固定大约100至150RU的相应重组抗原。双特异性抗体样品按照五个浓度装载：用HBS-EP运行缓冲液(GE Healthcare)稀释的50nM、25nM、12.5nM、6.25nM及3.13nM。以流速为30至35μl/min进行3分钟，然后以30至35μl/ml的流速再使用HBS-EP运行缓冲液进行8分钟。使用pH2.45的10mM甘氨酸、0.5M NaCl进行芯片再生。所得数据集使用BiaEval软件进行分析(参见图A4)。通常进行两个独立的实验。
5.2与人和猕猴BCMA的结合亲和性
BCMA/CD3双特异性抗体与人和猕猴BCMA的结合亲和性使用与小鼠白蛋白(ALB)的重组BCMA融合蛋白通过Biacore分析测定。
具体地，根据制造商的说明书，采用pH4.5的醋酸盐缓冲液使CM5传感器芯片(GE Healthcare)固定大约150至200RU的相应重组抗原。双特异性抗体样品按照五个浓度装载：用HBS-EP运行缓冲液(GE Healthcare)稀释的50nM、25nM、12.5nM、6.25nM及3.13nM。对于BCMA亲和性的测定，以流速为35μl/min进行3分钟，然后以35μl/ml的流速再使用HBS-EP运行缓冲液进行10、30或60min。使用由pH1.5的10mM甘氨酸、0.5M NaCl与6M盐酸胍溶液的1∶1混合液组成的缓冲液进行芯片再生。数据集使用BiaEval软件进行分析(参见图A6)。通常进行两个独立的实验。
采用与用于BCMA结合的相同浓度在单独实验中进行验证性的人和猕猴CD3a结合；解离速度的测定在10min解离时间内进行。
所有根据本发明的BCMA/CD3双特异性抗体，即具有表位簇“E3/E4±E7”的那些，都表现出与人BCMA的高亲和性(在亚纳摩尔范围)。对于与猕猴BCMA的结合是平衡的，也显示出在亚纳摩尔范围的亲和性，BCMA/CD3双特异性抗体的亲和性差距示于表2。
表2：表位簇E3/E4±E7的BCMA/CD3双特异性抗体与人和猕猴BCMA的亲和性通过Biacore分析测定，并计算亲和性差距(ma BCMA：hu BCMA)。
5.3双特异性抗体与人和猕猴BCMA亲和性的基于Biacore的测定
用Biacore测定法重复测定BCMA/CD3双特异性抗体与CM5芯片上的重组可溶性BCMA的亲和性，从而再次证实KD，特别是通过采用较长解离时间段(用60min代替用于之前实验中的10min)的解离速度。所有进行实验的BCMA/CD3双特异性抗体都进行两个独立亲和性测定，每个测定按照五个不同浓度进行。
表位簇E3/E4±E7的BCMA/CD3双特异性抗体的亲和性明显为亚纳摩尔，参见表3中的实例。
表3：从使用增长解离时间(各自为两个独立的实验)的Biacore实验得出的表位簇E3/E4±E7的BCMA/CD3双特异性抗体的亲和性(KD)
实施例A6双特异性结合及跨物种交叉反应性
为了确认与人和猕猴BCMA及CD3的结合，采用分别被人和猕猴BCMA转染的CHO细胞、表达天然人BCMA的人多发性骨髓瘤细胞系NCI-H929、表达CD3的人T细胞白血病细胞系HPB-ALL(DSMZ，Braunschweig，ACC483)及表达CD3的猕猴T细胞系4119LnPx(Knappe A等，Blood，2000，95，3256-3261)通过流式细胞术测定双特异性抗体。另外，未经转染的CHO细胞用作阴性对照。
对于流式细胞术而言，相应细胞系的200,000个细胞与50μl浓度为5μg/ml纯化的双特异性抗体在冰上培养30分钟。细胞用PBS/2％FCS洗涤两次且构建体的结合用鼠PentaHis抗体(Qiagen；用50μl PBS/2％FCS1∶20稀释)检测。洗涤过后，结合的PentaHis抗体用与藻红蛋白缀合的Fcγ-特异性抗体(Dianova)(用PBS/2％FCS1∶100稀释)检测。样品在FACSCanto II仪器上通过流式细胞术测定并用FACSDiva软件(两者都来自Becton Dickinson)进行分析。
表位簇E3/E4±E7的BCMA/CD3双特异性抗体将被人和猕猴BCMA转染的CHO细胞、表达人BCMA的多发性骨髓瘤细胞系NCI-H929以及人和猕猴T细胞染色。另外，未经转染的CHO细胞没有染色(参见图A7)。
实施例A7双特异性抗体对人和猕猴BCMA的亲和性的基于Scatchard的测定
对于Scatchard分析，饱和结合实验采用Micromet开发的单价检测系统(抗-His Fab/Alexa488)进行以精确测定双特异性抗体与相应细胞系的单价结合。
各细胞系(表达重组人BCMA的CHO细胞系，表达重组猕猴BCMA的CHO细胞系)的2x104个细胞与起始为100nM的相应BCMA双特异性抗体的各50μl一式三份稀释系列(以1∶2进行八次稀释)一起培养，然后在4℃下搅拌培养16h并进行一次残留洗涤步骤。随后，所述细胞与30μl抗-HisFab/Alexa488溶液(Micromet；30μg/ml)再一起培养30min。在一次洗涤步骤后，细胞悬浮于150μl包含3.5％甲醛的FACS缓冲液中，再培养15min，离心，重新悬浮于FACS缓冲液中并用FACS Canto II仪器及FACS Diva软件进行分析。数据是由两组独立的实验产生的。其值绘制成双曲线结合曲线。计算相应的Scatchard分析值从而推断最大结合(Bmax)。测定在半数最大结合时的双特异性抗体的浓度，从而反映相应的KD。一式三份测定的值绘制成双曲线。采用Scatchard评价法测定最大结合并计算相应的KD。
BCMA/CD3双特异性抗体与被人或猕猴BCMA转染的CHO细胞的亲和性采用Scatchard分析法测定，该分析法是用于测定人与猕猴BCMA之间潜在亲和性差距的最可靠方法。
表达BCMA抗原的细胞与浓度递增直至达到饱和的相应单体BCMA/CD3双特异性抗体一起培养(16h)。通过流式细胞术检测结合的双特异性抗体。测定在半数最大结合时的BCMA/CD3双特异性抗体的浓度，从而反映相应的KD。
一式三份测定的值绘制成双曲线及S型曲线从而证明从最小到最佳结合的适当的浓度范围。采用Scatchard评估法测定最大结合(Bmax)并计算相应的KD。示于表4的值由每个BCMA/CD3双特异性抗体的两个独立实验得到。
基于细胞的Scatchard分析证实，表位簇E3/E4±E7的BCMA/CD3双特异性抗体与人BCMA的亲和性是亚纳摩尔的，且以1.9-2.9的小的种间BCMA亲和性差距存在。
在表位成簇期间识别出另外一组能够结合至BCMA表位簇1和4(“E1/E4”)的抗体(参见实施例A1和A2)。表位簇1为MLQMAGQ(SEQ IDNO：1018)，表位簇4为NASVTNSVKGTNA(SEQ ID NO：1019)。与表位簇E3/E4±E7的BCMA/CD3双特异性抗体相比，表位簇“E1/E4”的抗体显示出在人与鼠BCMA之间为3.9-4.5的较高的亲和性差距。
表4：由基于细胞的Scatchard分析(各为两个独立实验)得到的表位簇E3/E4±E7的BCMA/CD3双特异性抗体的亲和性(KD)并计算亲和性差距KD猕猴BCMA/KD人BCMA。
实施例A8细胞毒性活性
8.1采用经刺激的人T细胞的铬释出分析法
富集CD8+T细胞的经刺激的T细胞按如下述方式获得：在37℃下，将皮氏培养皿(直径为145mm，Greiner bio-one GmbH，Kremsmünster)涂布最终浓度为1μg/ml的市售抗-CD3特异性抗体(OKT3，Orthoclone)达1小时。使用PBS通过一次洗涤步骤移除未结合的蛋白。将3-5x107个人PBMC添加到预涂布的皮氏培养皿中的具有稳定化谷氨酰胺/10％FCS/IL-220U/mlChiron)的120ml RPMI1640中，并刺激两天。第三天，收集细胞并用RPMI1640洗涤一次。添加IL-2至终浓度为20U/ml并在上述相同的细胞培养基中再次培养细胞一天。根据制造商的方案，通过使用Dynal-Beads耗竭CD4+T细胞和CD56+NK细胞，从而富集CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。
采用PBS洗涤两次由猕猴或人BCMA转染的CHO靶细胞，并于37℃下在具有50％FCS的终体积为100μl的RPMI中用11.1MBq51Cr标记60分钟。随后，被标记的靶细胞用5ml RPMI洗涤三次然后用于细胞毒性分析。所述分析在96孔板中以E∶T比为10∶1补充的总体积为200μl的RPMI中进行。采用起始浓度为0.01-1μg/ml的纯化双特异性抗体及其三倍稀释物。该分析的培养时间为18小时。细胞毒性按照上清液中释放的铬相对于最大裂解(添加Triton-X)与自发裂解(没有效应细胞)之间差异的相对值进行测定。所有的测定均重复四次进行。上清液中铬活性的测定在Wizard3”γ计数器(Perkin Elmer LifeSciences GmbH，德国)上进行。使用针对Windows的Prism5(5.0版，GraphPad Software Inc.，San Diego，California，USA)进行结果分析。通过从S形剂量响应曲线分析程序计算的EC50值用于细胞毒性活性的比较(参见图A5)。
8.2重新定向经刺激的人效应T细胞对抗经人BCMA转染的CHO细胞的效力
用经人BCMA转染的CHO细胞作为靶细胞，及经刺激的富集的人CD8T细胞作为效应细胞，在51-铬(51Cr)释放细胞毒性实验中分析BCMA/CD3双特异性抗体的细胞毒性活性。该实验按照实施例A8.1描述实施。
表位簇E3/E4±E7的所有BCMA/CD3双特异性抗体对经人BCMA转染的CHO细胞都表现出强效的细胞毒性活性，其中EC50值在1-位pg/ml的范围内和低2-位pg/ml(图A9和表5)。因此表位簇E3/E4±E7呈现出十分有利的表位活性关系，从而支持了非常强效的双特异性抗体介导的细胞毒性活性。
表5：使用用人BCMA转染的CHO细胞作为靶细胞，及经刺激的富集的人CD8T细胞作为效应细胞，在51-铬(51Cr)释放细胞毒性实验中分析表位簇E3/E4±E7的BCMA/CD3双特异性抗体的EC50值[pg/ml]。
BCMA/CD3双特异性抗体 EC50[pg/ml] R平方值
BCMA-24 4.6 0.91
BCMA-30 6 0.83
BCMA-28 5.7 0.90
BCMA-25 9.7 0.87
BCMA-27 5.4 0.90
BCMA-31 11 0.89
BCMA-29 9 0.89
BCMA-43 12 0.74
BCMA-40 15 0.77
BCMA-49 22 0.76
BCMA-44 13 0.78
BCMA-41 9，9 0.76
BCMA-47 8.0 0.80
BCMA-50 18 0.77
BCMA-45 14 0.81
BCMA-42 22 0.83
BCMA-48 31 0.76
BCMA-51 30 0.83
8.3用未经刺激的人PBMC的基于FACS的细胞毒性实验
效应细胞的分离
通过Ficoll密度梯度离心法，从富集的淋巴细胞制备物(血沉棕黄层)中制备人外周血单核细胞(PBMC)，所述制备物为血库采集输注用血的副产物。血沉棕黄层由当地血库供应并且在血液采集的同一天制备PBMC。Ficoll密度离心并用Dulbecco’s PBS(Gibco)充分洗涤后，通过用红细胞裂解缓冲液(155mM NH4Cl，10mM KHCO3，100μM EDTA)培养，从PBMC中移除残留的红细胞。通过PBMC在100×g离心从上清液中移除血小板。保留的淋巴细胞主要包括B淋巴细胞和T淋巴细胞、NK细胞和单核细胞。PBMC在具有10％FCS(Gibco)的RPMI培养基(Gibco)中于37℃/5％CO2下继续培养。
CD14+和CD56+细胞的耗竭
对于CD14+细胞的耗竭，采用人CD14Microbeads(Milteny Biotec，MACS，#130-050-201)，对于NK细胞的耗竭，采用人CD56Microbeads(MACS，#130-050-401)。对PBMC进行计数并在室温下用300×g离心10分钟。弃去上清液并将细胞沉淀重新悬浮于MACS分离缓冲液[80μL/107个细胞；PBS(Invitrogen，#20012-043)，0.5％(v/v)FBS(Gibco，#10270-106)，2mM EDTA(Sigma-Aldrich，#E-6511)]中。加入CD14Microbeads和CD56Microbeads(20μL/107个细胞)并在4-8℃下培养15分钟。用MACS分离缓冲液(1-2mL/107个细胞)洗涤细胞。离心过后(参见上述)，弃去上清液并将细胞重新悬浮于MACS分离缓冲液中(500μL/108个细胞)。然后使用LS柱(Miltenyi Biotec，#130-042-401)分离CD14/CD56阴性细胞。将不具有CD14+/CD56+细胞的PBMC在37℃的培养箱中的RPMI完全培养基中培养直至使用，所述培养基即补充有10％FBS(Biochrom AG，#S0115)、1x非必需氨基酸(Biochrom AG，#K0293)、10mM Hepes缓冲液(Biochrom AG，#L1613)、1mM丙酮酸钠(Biochrom AG，#L0473)和100U/mL青霉素/链霉素(Biochrom AG，#A2213)的RPMI1640(Biochrom AG，#FG1215)。
靶细胞标记
对于细胞裂解在流式细胞术检测的分析，使用荧光膜染料DiOC18(DiO)(Molecular Probes，#V22886)标记作为靶细胞的人BCMA-或猕猴BCMA-转染的CHO细胞(人/猕猴BCMA-阳性靶细胞)，并将所述细胞从效应细胞中区分出来。简言之，将细胞收集、用PBS洗涤一次并且在包含2％(v/v)FBS和膜染料DiO(5μL/106个细胞)的PBS中调节至106个细胞/mL。在37℃下培养3min后，细胞在完全RPMI培养基中洗涤两次并且将细胞数量调节至1.25x105个细胞/mL。采用0.5％(v/v)的等渗EosinG溶液(Roth，#45380)测定细胞活力。
基于流式细胞术的分析
设计这一分析方法，从而量化在BCMA双特异性抗体的系列稀释液存在下经猕猴或人BCMA转染的CHO细胞的裂解。等体积的Dio标记的靶细胞和效应细胞(即不具有CD14+细胞的PBMC)混合，使E∶T细胞比为10∶1。将160μL的此悬浮液转移至96-孔板的每个孔中。添加40μl BCMA/CD3双特异性抗体的系列稀释液和阴性对照双特异性抗体(一种识别不相关靶抗原的基于CD3的双特异性抗体)或作为附加阴性对照的RPMI完全培养基。由BCMA/CD3双特异性抗体介导的细胞毒性反应在7％CO2加湿培养箱中进行48小时。然后将细胞转移至新的96孔板并且通过添加最终浓度为1μg/mL的碘化丙碇(PI)对靶细胞膜的完整性缺失进行监测。PI是一种膜不渗透染料，其通常被活细胞排除在外，而能够进入死细胞使其能够通过发射荧光而被识别。样品在FACSCanto II仪器上通过流式细胞术测定并用FACSDiva软件(两者都来自Becton Dickinson)进行分析。靶细胞被识别为DiO-阳性细胞。PI-阴性靶细胞归类为活的靶细胞。根据下式计算细胞毒性的百分比：
细胞毒性[％]＝n(死亡靶细胞)×100/n(靶细胞)
n＝事件数目
使用GraphPad Prism5软件(Graph Pad Software，San Diego)，将细胞毒性百分比相对于相应双特异性抗体浓度作图。采用用于评估具有固定斜率的S型剂量响应曲线的四参数logistic回归模型进行剂量响应曲线分析，并计算EC50值。
8.4未经刺激的人PBMC对抗经人BCMA-转染的靶细胞
BCMA/CD3双特异性抗体的细胞毒性活性的分析是使用由人BCMA转染的CHO细胞作为靶细胞，和未经刺激的人PBMC作为效应细胞通过基于FACS的细胞毒性分析法进行的。该分析方法按照如上所述实施(实施例A8.3)。
采用未经刺激的人PBMC作为效应细胞以及经人BCMA转染的CHO细胞作为靶细胞的基于FACS的细胞毒性分析法的结果示于图A10和表6。表6：表位簇E3/E4±E7的BCMA/CD3双特异性抗体的EC50值[pg/ml]，其是由未经刺激的人PBMC作为效应细胞以及由人BCMA转染的CHO细胞作为靶细胞的48小时基于FACS的细胞毒性分析法的测定的。
BCMA/CD3双特异性抗体 EC50[pg/ml] R平方值
BCMA-30 314 0.98
BCMA-50 264 0.97
实施例A9
9.1与BAFF受体交叉反应性的排除
对于流式细胞术而言，相应细胞系的200,000个细胞与50μl浓度为5μg/ml纯化的双特异性分子在冰上培养30分钟。细胞用具有2％FCS的PBS洗涤两次且构建体的结合用鼠PentaHis抗体(Qiagen；用50μl具有2％FCS的PBS1∶20稀释)检测。洗涤过后，结合的PentaHis抗体用与藻红蛋白缀合的Fcγ-特异性抗体(Dianova)(用具有2％FCS的PBS1∶100稀释)检测。样品在FACSCanto II仪器上通过流式细胞术测定并用FACSDiva软件(两者都来自Becton Dickinson公司)进行分析。
双特异性结合剂显示与BAFF受体不具有交叉反应性。
9.2BCMA/CD3双特并性抗体与人BAFF受体(BAFF-R)和TACI交叉反应性的排除
对于与人BAFF-R和TACI结合的排除，采用经人BAFF-R和TACI分别转染的CHO细胞通过流式细胞术测定BCMA/CD3双特异性抗体。此外，将L363多发性骨髓瘤细胞作为阳性对照用于与人BCMA结合。通过两个阳性对照抗体来证实BAFF-R和TACI抗原在CHO细胞上的表达。流式细胞术按照前述实施例中所述的方法实施。
流式细胞术分析证实，表位簇E3/E4±E7的BCMA/CD3双特异性抗体无一与人BAFF-R或人TACI交叉反应(参见图A11)。
实施例A10细胞毒性活性
分析人样BCMA双特异性抗体在重新定向效应T细胞对抗表达BCMA的靶细胞方面的效力，该分析在五个另外的体外细胞毒性实验中进行：
1.BCMA双特异性抗体在重新定向经刺激的人效应T细胞对抗BCMA阳性(人)肿瘤细胞系方面的效力通过51-铬释放实验测定。
2.BCMA双特异性抗体在重新定向未经刺激的人PBMC中T细胞对抗经人BCMA转染的CHO细胞方面的效力通过基于FACS的细胞毒性实验测定。
3.BCMA双特异性抗体在重新定向未经刺激的人PBMC中T细胞对抗BCMA阳性(人)肿瘤细胞系方面的效力通过基于FACS的细胞毒性实验测定。
4.采用猕猴T细胞系作为效应T细胞进行基于FACS的细胞毒性实验，从而证实交叉反应性的BCMA双特异性抗体能够重新定向猕猴T细胞对抗经猕猴BCMA转染的CHO细胞。
5.使用经人BCMA转染的CHO细胞作为靶细胞和经刺激的人T细胞作为效应细胞，通过51-铬释放实验测定BCMA双特异性抗体的单体和二聚体形式之间的效力差距。
实施例A11经刺激的人T细胞对抗BCMA阳性人多发性骨髓瘤细胞系L363
采用BCMA阳性人多发性骨髓瘤细胞系L363(DSMZ No.ACC49)作为靶细胞源，和采用经刺激的富集的人CD8T细胞作为效应细胞，通过51-铬(51Cr)释放细胞毒性实验分析BCMA/CD3双特异性抗体的细胞毒性活性。所述实验按照实施例A8.1所述方法实施。
根据采用经刺激的富集的人CD8T淋巴细胞作为效应细胞和经人BCMA转染的CHO细胞作为靶细胞的51-铬释放实验的结果，表位簇E3/E4±E7的BCMA/CD3双特异性抗体在细胞毒性活性方面是强效的(图A12和表7)。
但是出乎意料的，表位簇E1/E4的BCMA/CD3双特异性抗体尽管在对抗用人BCMA转染的CHO细胞方面的细胞毒性活性是强效的，但是其被证明在对抗在细胞表面以低密度表达天然BCMA的人多发性骨髓瘤细胞系L363方面的细胞毒性相当弱(图A12和表7)。在不希望受到理论束缚的情况下，本发明的发明人相信在天然BCMA表达体上的人BCMA的E1/E4表位比在经BCMA转染的细胞上更不易接近。
表7：在18小时51-铬(51Cr)释出细胞毒性分析法中分析的表位簇E1/E4(第1和2行)和E3(第3和4行)的BCMA/CD3双特异性抗体的EC50值[pg/ml]，其中BCMA-阳性人多发性骨髓瘤细胞系L363作为靶细胞源，经刺激的富集的人CD8T细胞作为效应细胞。
BCMA/CD3双特异性抗体 EC50[pg/ml] R平方值
1 BCMA-54 685 0.84
2 BCMA-53 1107 0.82
3 BCMA-30 182 0.83
4 BCMA-50 148 0.83
实施例A12未经刺激的人PBMC对抗BCMA阳性人多发性骨髓瘤细胞系L363
BCMA/CD3双特异性抗体的细胞毒性活性进一步在基于FACS的细胞毒性实验中分析，该实验采用BCMA阳性人多发性骨髓瘤细胞系L363(DSMZ，ACC49)——其在所有测试的靶T细胞系中显示出天然BCMA的的表面表达最弱——作为靶细胞源，未经刺激的人PBMC作为效应细胞。该实验按照上述方法(实施例A8.3)实施。
从采用经刺激的富集的人CD8T淋巴细胞对抗人多发性骨髓瘤细胞系L363的51-铬释放实验观察到，表位簇E1/E4的BCMA/CD3双特异性抗体——与其对抗用人BCMA转染的CHO细胞的强效细胞毒性活性相比——再次被证明在重新定向的未经刺激的PBMC对抗在细胞表面以低密度表达天然BCMA的人多发性骨髓瘤细胞系L363的细胞毒性活性方面效力较低。这与上文提供的理论相符，即在天然BCMA表达体上的人BCMA的E1/E4表位比在经BCMA转染的细胞上更不易接近。在这一实验中表位簇E3/E4±E7的BCMA/CD3双特异性抗体呈现出3-位pg/ml的EC50值(参见图A13和表8)。
表8：在48小时基于FACS的细胞毒性实验中测定的表位簇E1/E4(第1和2行)和E3(第3和4行)的BCMA/CD3双特异性抗体的EC50值[pg/ml]，其中未经刺激的人PBMC作为效应细胞，人多发性骨髓瘤细胞系L363作为靶细胞源。
BCMA/CD3双特异性抗体 EC50[pg/ml] R平方值
1 BCMA-54 3162 0.99
2 BCMA-53 2284 0.98
3 BCMA-30 589 0.99
4 BCMA-50 305 0.99
预期地，在细胞毒性实验中使用作为效应细胞的未经刺激的PBMC比在细胞毒性实验中使用富集的经刺激的人CD8T细胞具有较高的EC50值。
实施例A13未经刺激的人PBMC对抗BCMA阳性人多发性骨髓瘤细胞系NCI-H929
BCMA/CD3双特异性抗体的细胞毒性活性在基于FACS的细胞毒性实验中分析，该实验采用BCMA阳性人多发性骨髓瘤细胞系NCI-H929(ATCCCRL-9068)作为靶细胞源，未经刺激的人PBMC作为效应细胞。该实验按照上述方法(实施例A8.3)实施。
本实验采用在细胞表面表达天然BCMA的另一人多发骨髓瘤细胞系(即NCI-H929)所得的结果证实了采用人多发性骨髓瘤细胞系L363所获得的那些结果。再次，表位簇E1/E4的BCMA/CD3双特异性抗体——与其对抗用人BCMA转染的CHO细胞的强效细胞毒性活性相比——被证明在重新定向未经刺激的PBMC对抗人多发性骨髓瘤细胞的细胞毒性活性方面效力较低，这证实了这一理论，即在天然BCMA表达体上的人BCMA的E1/E4表位比在经BCMA转染的细胞上可能更不易接近。对于E1/E4结合剂观察到的经BCMA-转染的靶细胞与天然表达体之间的这种活性差距没有对于E3/E4±E7结合剂发现。表位簇E3/E4±E7的BCMA/CD3双特异性抗体呈现出2-位pg/ml的EC50值，因此以出奇的好的EC50值重新定向未经刺激的PBMC对抗NCI-H929靶细胞(参见图A14和表9)。
表9：在48小时基于FACS的细胞毒性实验中测定的表位簇E1/E4(第1和2行)和E3/E4±E7(第3和4行)的BCMA/CD3双特异性抗体的EC50值[pg/ml]，其中未经刺激的人PBMC作为效应细胞，人多发性骨髓瘤细胞系NCI-H929作为靶细胞源。
BCMA/CD3双特异性抗体 EC50[pg/ml] R平方值
1 BCMA-54 2604 0.99
2 BCMA-53 2474 0.99
3 BCMA-30 38.0 0.95
4 BCMA-50 40.4 0.97
如预期的，与L363相比，在细胞表面表达较高水平的BCMA的人多发性骨髓瘤细胞NCI-H929具有较低的EC50值。
实施例A14猕猴T细胞对抗表达猕猴BCMA的靶细胞
最后，BCMA/CD3双特异性抗体的细胞毒性活性通过基于FACS的细胞毒性实验进行分析，其中使用经猕猴BCMA转染的CHO细胞作为靶细胞，猕猴T细胞系作为效应细胞源。
猕猴T细胞系4119LnPx(Knappe等.Blood95：3256-61(2000))用作效应细胞源。经猕猴BCMA转染的CHO细胞的靶细胞标记和基于流式细胞术的细胞毒性活性分析按照上述方法进行。
由表位簇E3/E4±E7的BCMA/CD3双特异性抗体诱导源自细胞系4119LnPx的猕猴T细胞有效杀死经猕猴BCMA转染的CHO细胞。在这一实验中，所述抗体表现出极高效力，其具有1-位pg/ml的EC50值，这证实这些抗体在猕猴系统中是非常活跃的。另一方面，表位簇E1/E4的BCMA/CD3双特异性抗体表现出显著较弱的效力，其EC50值在2-位至3-位pg/ml范围内(参见图A15和表10)。因此，E3/E4±E7特异性抗体在猕猴系统中的效力强约20至超过约100倍。
表10：如在48小时基于FACS的细胞毒性实验中测定的表位簇E1/E4(第1和2行)和E3/E4±E7(第3和4行)的BCMA/CD3双特异性抗体的EC50值[pg/ml]，其中猕猴T细胞系4119LnPx作为效应细胞，经猕猴BCMA转染的CHO细胞作为靶细胞。
BCMA/CD3双特异性 EC50[pg/ml] R平方值
1 BCMA-54 78.5 0.98
2 BCMA-53 183 0.96
3 BCMA-30 1.7 0.97
4 BCMA-50 3.7 0.96
实施例A15BCMA/CD3双特异性抗体单体与二聚体之间的效力差距
为了测定各个BCMA/CD3双特异性抗体单体和二聚体同工型之间的细胞毒性活性方面的差异性(称为效力差距)，采用纯化的BCMA/CD3双特异性抗体单体和二聚体实施如本文上述(实施例A8.1)的51-铬释放细胞毒性实验。效力差距计算为双特异性抗体的单体和二聚体的EC50值之间的比值。测定的表位簇E3/E4±E7的BCMA/CD3双特异性抗体的效力差距在0.2与1.2之间。因此，与其相应的单体相比，实质上不存在活性更高的二聚体。
实施例A16三次冻结/解冻循环后的单体向二聚体的转化
使双特异性BCMA/CD3抗体单体经过三次冻结/解冻循环，随后进行高效SEC来测定初始单体抗体中已经转化为抗体二聚体的百分比。
采用通用缓冲液将15μg的单体抗体调节浓度为250μg/ml，并且随后在-80℃下冷冻30min，之后在室温下解冻30min。三次冻结/解冻循环后通过HP-SEC测定二聚体含量。为此，抗体的单体同工型的15μg等分试样解冻并在原SEC缓冲液(10mM柠檬酸-75mM赖氨酸HCl-4％海藻糖-pH7.2)中均衡至浓度为250μg/ml，随后在37℃下培养7天。将高分离度的SEC柱TSK Gel G3000SWXL(Tosoh，Tokyo-日本)与配有A905自动进样器的Purifier10FPLC(GE Lifesciences)连接。柱的平衡及运行缓冲液由100mMKH2PO4-200mM Na2SO4组成并调成pH6.6。在7天培养后，抗体溶液(15μg蛋白)施用于平衡柱中并以流速为0.75ml/min在最大压力为7MPa下进行洗脱。整个运行过程在280、254和210nm光吸收下监测。通过记录在Unicorn软件运行评估表中的210nm信号的峰值积分进行分析。通过二聚体峰面积除以单体加上二聚体峰的总面积计算二聚体的含量。
表位簇E3/E4±E7的BCMA/CD3双特异性抗体在三次冷冻/解冻循环后呈现的二聚体百分比为0.8至1.5％，这被视为是良好的。但是，表位簇E1/E4的BCMA/CD3双特异性抗体的二聚体转化率达到了不利的高值，其超过了不利的二聚体值≥2.5％的阈值(分别为4.7％和3.8％)，参见表11。
表11：三次冷冻/解冻循环后，由高效体积排阻色谱法(HP-SEC)测定的单体与二聚体的表位簇E1/E4(第1和2行)和E3/E4±E7(第3和4行)的BCMA/CD3双特异性抗体的百分比。
BCMA/CD3双特异性抗体 单体[％] 二聚体[％]
1 BCMA-54 95.3 4.7
2 BCMA-53 96.2 3.8
3 BCMA-30 98.5 1.5
4 BCMA-50 99.2 0.8
实施例A17热稳定性
通过差示扫描量热法(DSC)测得的温度熔融曲线从而确定BCMA/CD3双特异性抗体的固有生物物理蛋白质稳定性。这些实验采用MicroCal LLC(Northampton，MA，U.S.A)VP-DSC仪器进行。记录包含BCMA/CD3双特异性抗体的样品从20至90℃的能量吸收，并与仅包含抗体的制剂缓冲液比较。
详细地说，将BCMA/CD3双特异性抗体在储存缓冲液中调节终浓度为250μg/ml。将300μl所制备的蛋白质溶液转移至深孔板并将该板放置于DSC仪器的冷却式自动进样器机架位置。其它孔中添加SEC运行缓冲液作为测量的参照物质。对于测量过程，蛋白质溶液通过自动进样器转移至毛细管中。在另外的毛细管中添加SEC运行缓冲液作为参照。对所有的样品进行加热并记录了从20至90℃将两个毛细管加热至相同温度所需的热量。
为了记录相应的熔融曲线，逐步增加整体样品温度。记录每一温度T下样品和参照制剂缓冲液的能量吸收。将样品减去参照物的能量吸收Cp(kcal/mole/℃)方面的差异对照相应的温度绘图。熔融温度定义为首次最大能量吸收发生时的温度。
所有测试的表位簇E3/E4±E7的BCMA/CD3双特异性抗体都表现出良好的热稳定性，其熔融温度大于60℃，更精确地在62℃与63℃之间。
实施例A18通过流式细胞术的等离子干扰的排除
为了测定BCMA/CD3双特异性抗体与人血浆蛋白之间潜在的相互作用，建立血浆干扰测试。为此，10μg/ml的相应BCMA/CD3双特异性抗体分子在37℃下在90％人血浆中培养一小时。随后，通过流式细胞术测定与表达人BCMA的CHO细胞的结合。
对于流式细胞术而言，相应细胞系的200,000个细胞与50μl浓度为5μg/ml纯化的抗体在冰上培养30分钟。细胞用PBS/2％FCS洗涤两次且构建体的结合用鼠PentaHis抗体(Qiagen；用50μl PBS/2％FCS1∶20稀释)检测。洗涤过后，结合的PentaHis抗体用与藻红蛋白缀合的Fcγ-特异性抗体(Dianova)(用PBS/2％FCS1∶100稀释)检测。样品在FACSCanto II仪器上通过流式细胞术测定并用FACSDiva软件(两者都来自Becton Dickinson)进行分析。
所得数据与使用PBS替代人血浆的对照实验进行比较。相对结合按如下方法计算：
(PBS样品的信号/不具有检测剂的信号)/(血浆样品的信号/不具有检测剂的信号)。
在这一实验中显而易见的是，由血浆蛋白介导的表位簇E3/E4±E7的相应BCMA/CD3双特异性抗体的靶向结合并没有显著的降低。相对血浆干扰值在1.28±0.38和1.29±0.31之间(认为数值“2”是干扰信号的较低阈值)。
实施例A19BCMA/CD3双特异性抗体在人肿瘤异种移植模型中的治疗功效
在研究的第1天，在雌性NOD/SCID小鼠的右背侧面以皮下方式注射人癌症细胞系NCI-H929的5×106个细胞。
在第9天，当平均肿瘤体积达到约100mm3时，通过注射约2×107个细胞至动物的腹膜腔内将体外扩增的人CD3+T细胞移植至小鼠中。载体对照组1(n＝5)的小鼠并未接受效应细胞并用作未移植的对照，与载体对照组2(n＝10，接受效应细胞)比较，从而监测仅T细胞对肿瘤生长的影响。
抗体的治疗开始于第13天，当平均肿瘤体积达到约200mm3时。在治疗开始的当天，各治疗组的平均肿瘤尺寸与其它任何组(变异性分析)并无统计学上的差异。通过静脉内团注0.5mg/kg/天的BCMA/CD3双特异性抗体BCMA-50×CD3(组3，n＝8)达17天对小鼠进行治疗。
在研究期间采用卡尺测量肿瘤并通过肿瘤体积(TV)的组间比较来评估进展。通过按照T/C％＝100×(分析组的中值TV)/(对照组2的中值TV)计算TV来测定肿瘤生长抑制T/C[％]。结果示于表12和图16。
表12：第13天至30天的中值肿瘤体积(TV)和肿瘤生长抑制(T/C)
实施例A20靶阴性细胞的裂解的排除
采用BCMA-阳性人多发性骨髓瘤细胞系NCI-H929和纯化的T细胞实施体外裂解实验，其中效应细胞与靶细胞的比率为5∶1，培养时间为24小时。在NCI-H929的裂解中表位簇E3/E4±E7的BCMA/CD3双特异性抗体(BCMA-50)表现出高效力和有效性。但是，对于高达500nM的抗体，未在BCMA阴性细胞系HL60(AML/成髓细胞形态)、MES-SA(子宫肉瘤，成纤维细胞形态)和SNU-16(胃癌，上皮形态)中检测到裂解。
实施例A21不同PBMC亚群的T细胞活化的诱导
采用人多发性骨髓瘤细胞系NCI-H929、L-363和OPM-2作为靶细胞及人PBMC(CD4+/CD8+/CD25+/CD69+)的不同亚群作为效应细胞，实施基于FACS的细胞毒性实验(48小时；E∶T＝10∶1)。结果(参见表13)显示，针对所分析的PBMC的不同亚群，如由EC50值度量的活化程度基本上处于相同的范围内。
表13：在48小时基于FACS的细胞毒性实验中测定的表位簇E3/E4±E7的BCMA/CD3双特异性抗体的EC50值[pg/m1]，其中人PBMC的不同亚群作为效应细胞，不同的人多发性骨髓瘤细胞系作为靶细胞。
实施例A22细胞因子释放的诱导
采用人多发性骨髓瘤细胞系NCI-H929、L-363和OPM-2作为靶细胞及人PBMC作为效应细胞，实施基于FACS的细胞毒性实验(48小时；E∶T＝10∶1)。通过递增浓度的表位簇E3/E4±E7的BCMA/CD3双特异性抗体测定细胞因子释放的水平[pg/ml]。分析下列细胞因子：I1-2、IL-6、IL-10、TNF和IFN-γ。结果示于表14和图17。
表14：由2.5μg/ml的表位簇E3/E4±E7的BCMA/CD3双特异性抗体(BCMA-50)在48小时基于FACS的细胞毒性实验中诱导的IL-2、IL-6、IL-10、TNF和IFN-γ的释放，其中人PBMC作为效应细胞，不同人多发性骨髓瘤细胞系作为靶细胞(E∶T＝10∶1)。
实施例B
实施例B1表达嵌合的BCMA的CHO细胞的产生
为了构建嵌合的表位作图分子，将人BCMA相应表位结构域的氨基酸序列或单一氨基酸残基替换为鼠的序列。构建下列分子：
●人BCMA ECD/E1鼠(SEQ ID NO：1009)
嵌合的胞外BCMA结构域：人胞外BCMA结构域，其中表位簇1(SEQID NO：1002或1007的氨基酸残基1-7)被相应的鼠簇(SEQ ID NO：1004或1008的氨基酸残基1-4)替换
→SEQ ID NO：1002或1007中氨基酸残基1-3的缺失及G6Q突变
●人BCMA ECD/E2鼠(SEQ ID NO：1010)
嵌合的胞外BCMA结构域：人胞外BCMA结构域，其中表位簇2(SEQID NO：1002或1007的氨基酸残基8-21)被相应的鼠簇(SEQ ID NO：1004或1008的氨基酸残基5-18)替换
→SEQ ID NO：1002或1007中S9F、Q10H及N11S突变
●人BCMA ECD/E3鼠(SEQ ID NO：1011)
嵌合的胞外BCMA结构域：人胞外BCMA结构域，其中表位簇3(SEQID NO：1002或1007的氨基酸残基24-41)被相应的鼠簇(SEQ ID NO：1004或1008的氨基酸残基21-36)替换
→SEQ ID NO：1002或1007中氨基酸残基31和32的缺失及Q25H、S30N、L35A和R39P突变
●人BCMA ECD/E4鼠(SEQ ID NO：1012)
嵌合的胞外BCMA结构域：人胞外BCMA结构域，其中表位簇4(SEQID NO：1002或1007的氨基酸残基42-54)被相应的鼠簇(SEQ ID NO：1004或1008的氨基酸残基37-49)替换
→SEQ ID NO：1002或1007中N42D、A43P、N47S、N53Y和A54T突变
●人BCMA ECD/E5鼠(SEQ ID NO：1013)
嵌合的胞外BCMA结构域：人胞外BCMA结构域，其中SEQ ID NO：1002或1007中的第22位的氨基酸残基(异亮氨酸)被SEQ ID NO：1004或1008中其相应的鼠氨基酸残基(赖氨酸，第19位)替换
→SEQ ID NO：1002或1007中I22K突变
●人BCMA ECD/E6鼠(SEQ ID NO：1014)
嵌合的胞外BCMA结构域：人胞外BCMA结构域，其中SEQ ID NO：1002或1007中的第25位的氨基酸残基(谷氨酰胺)被SEQ ID NO：1004或1008中其相应的鼠氨基酸残基(组氨酸，第22位)替换
→SEQ ID NO：1002或1007中Q25H突变
●人BCMA ECD/E7鼠(SEQ ID NO：1015)
嵌合的胞外BCMA结构域：人胞外BCMA结构域，其中SEQ ID NO：1002或1007中的第39位的氨基酸残基(精氨酸)被SEQ ID N0：1004或1008中其相应的鼠氨基酸残基(脯氨酸，第34位)替换
→SEQ ID NO：1002或1007中R39P突变
将cDNA构建体克隆至哺乳动物表达载体pEF-DHFR中并稳定地转染至CHO细胞中。人BCMA在CHO细胞上的表达通过采用单克隆抗-人BCMA抗体的FACS分析法验证。鼠BCMA的表达通过单克隆抗-小鼠BCMA-抗体证明。所使用的BCMA抗体的浓度为在PBS/2％FCS中10μg/ml。结合的单克隆抗体通过抗-大鼠-IgG-Fcy-PE(在PBS/2％FCS中为1∶100；Jackson-Immuno-Research#112-116-071)检测。作为阴性对照，用PBS/2％FCS替代第一抗体与细胞一起培养。样品通过FACSCanto II仪器(BectonDickinson)上的流式细胞术测量并用FlowJo软件(7.6版)进行分析。使用不同的抗-BCMA抗体在流式细胞术分析法中分析并证实人-鼠BCMA嵌合体转染的CHO细胞的表面表达(图2)。
实施例B2
2.1在HEK293细胞中的瞬时表达
将具有已验证序列的核苷酸序列的表达质粒的克隆用于转染并在FreeStyle293表达系统(Invitrogen GmbH，Karlsruhe，德国)中根据制造商说明进行蛋白质表达。得到包含表达的蛋白质的上清液，采用离心移除细胞并将上清液在-20℃下贮存。
2.2在CHO细胞中的稳定表达
将具有已验证序列的核苷酸序列的表达质粒的克隆转染至用于真核表达构建体的DHFR缺陷型CHO细胞中。在DHFR缺陷型CHO细胞中的真核蛋白表达按如Kaufman R.J.(1990)Methods Enzymol.185，537-566中描述进行。构建体的基因扩增由浓度递增的甲氨蝶呤(MTX)至最终浓度达到20nM的MTX诱导。经过两次传代的静置培养，细胞在具有无核苷HyQ PFCHO液体大豆培养基(具有4.0mM的L-谷氨酰胺及0.1％普朗尼克F-68；HyClone)的滚瓶中生长7天，然后收集。采用离心移除细胞并将含有表达的蛋白的上清液在-20℃下贮存。
实施例B3鼠类scFv-片段的表位成簇
用人或鼠BCMA、或用嵌合的BCMA分子转染的细胞采用包含结合至人/猕猴BCMA的scFv的天然、未经稀释的周质提取物进行染色。结合的scFv使用1μg/ml的抗-FLAG抗体(Sigma F1804)和经R-PE-标记的抗-小鼠Fcγ-特异性抗体(1∶100；Dianova#115-116-071)进行检测。所有抗体都在具有2％FCS的PBS中进行稀释。作为阴性对照，细胞与PBS/2％FCS而非与周质提取物一起培养。样品通过FACSCanto II仪器(Becton Dickinson)上的流式细胞术测量并用FlowJo软件(7.6版)进行分析。
实施例B4不同重组形式的可溶性人及猕猴BCMA的获得
人和恒河猴BCMA的编码序列(如基因库所公布的，登录号NM_001192[人]；XM_001106892[恒河猴])人白蛋白、人Fcγ1和鼠白蛋白的编码序列用于人工cDNA序列的构建，所述人工cDNA序列分别编码人和猕猴BCMA分别与人白蛋白、人IgG1Fc和鼠白蛋白的可溶性融合蛋白以及仅包含BCMA胞外结构域的可溶性蛋白。为了产生用于表达可溶性人和猕猴BCMA蛋白的构建体，通过上述全长BCMA cDNA的PCR诱变和根据标准方案的分子克隆获得cDNA片段。
对于具有人白蛋白的融合蛋白而言，经修饰的cDNA片段被设计为首先包含用于构建体真核表达的Kozak位点，接着分别是人和恒河猴BCMA蛋白的编码序列，其包含分别对应于人及恒河猴BCMA的胞外结构域的氨基酸1至54和1至53，框架中随后是人工Ser1-Gly4-Ser1-连接子的编码序列，框架中随后是人血清白蛋白的编码序列，框架中接着是Flag标签的编码序列，框架中随后是经修饰的组氨酸标签(SGHHGGHHGGHH)的编码序列及终止密码子。
对于具有鼠IgG1的融合蛋白而言，经修饰的cDNA片段被设计为首先包含用于构建体真核表达的Kozak位点，接着分别是人和猕猴BCMA蛋白的编码序列，其包含分别对应于人及恒河猴BCMA的胞外结构域的氨基酸1至54和1至53，框架中随后是人工Ser1-Gly4-Ser1-连接子的编码序列，框架中接着是人IgG1的铰合部分和Fcγ部分的编码序列，框架中随后是六组氨酸标签的编码序列及终止密码子。
对于具有鼠白蛋白的融合蛋白而言，经修饰的cDNA片段被设计为首先包含用于构建体真核表达的Kozak立点，接着分别是人和猕猴BCMA蛋白的编码序列，其包含分别对应于人及恒河猴BCMA的胞外结构域的氨基酸1至54和1至53，框架中随后是人工Ser1-Gly4-Ser1-连接子的编码序列，框架中接着是鼠血清白蛋白的编码序列，框架中接着是Flag标签的编码序列，框架中随后是经修饰的组氨酸标签(SGHHGGHHGGHH)的编码序列及终止密码子。
对于可溶性胞外结构域构建体而言，经修饰的cDNA片段被设计为首先包含用于构建体真核表达的Kozak位点，接着分别是人和猕猴BCMA蛋白的编码序列，其包含分别对应于人及恒河猴BCMA的胞外结构域的氨基酸1至54和1至53，框架中随后是人工Ser1-Gly1-连接子的编码序列，框架中接着是Flag标签的编码序列，框架中随后是经修饰的组氨酸标签(SGHHGGHHGGHH)的编码序列及终止密码子。
所述cDNA片段也被设计为在片段的起点和终点处引入限制性位点。引入的限制性位点(在5’端引入EcoRI及在3’端引入SalI)被应用于以下的克隆过程中。通过EcoRI和SalI将cDNA片段克隆至命名为pEF-DHFR的质粒(pEF-DHFR描述于Raum等Cancer Immunol Immunother50(2001)141-150中)中。上述提到的程序都依据标准方案(Sambrook，Molecular Cloning；ALaboratory Manual，3rd edition，Cold Spring Harbour Laboratory Press，ColdSpring Harbour，New York(2001))实施。
实施例B5双特异性抗体对人和猕猴BCMA及CD3的亲和性的基于Biacore的测定
使用具有人血清白蛋白(ALB)的重组BCMA融合蛋白进行Biacore分析实验，来测定BCMA靶向结合。对于CD3亲和性的测定，采用具有与人抗体Fc部分融合的CD3ε(CD3e)的N-末端27个氨基酸的重组融合蛋白。所述重组蛋白以人CD3e1-27形式和食蟹猕猴CD3e形式存在，二者都具有双特异性抗体中的CD3结合剂的表位。
具体地，根据制造商的说明书，采用pH4.5的醋酸盐缓冲溶液使CM5传感器芯片(GE Healthcare)固定大约100至150RU的相应重组抗原。双特异性抗体样品按照五个浓度装载：用HBS-EP运行缓冲液(GE Healthcare)稀释的50nM、25nM、12.5nM、6.25nM及3.13nM。以流速为30至35μl/min进行3分钟，然后以30至35μl/ml的流速再使用HBS-EP运行缓冲液进行8分钟。使用pH2.45的10mM甘氨酸、0.5M NaCl进行芯片再生。所得数据集使用BiaEval软件进行分析。通常进行两个独立的实验。
实施例B6流式细胞术分析
在FACS中采用人和鼠BCMA转染的CHO细胞分析亲和性成熟的scFv分子的功能性和结合强度。简言之，将约105个细胞与50μl的一系列1∶3稀释的周质大肠杆菌细胞提取物在冰上培养50min。在用PBS/10％FCS/0.05％的叠氮化钠洗涤后，所述细胞与30μl的Flag-M2IgG(Sigma，在PBS/10％FCS/0.05％叠氮化钠中为1∶900)在冰上培养40分钟。在第二次洗涤后，所述细胞与30μl的R-Phycoerythrin(PE)-标记的山羊抗-小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch，在PBS/10％FCS/0.05％叠氮化钠中为1∶100)在冰上培养40分钟。随后所述细胞再次洗涤并悬浮于200μlPBS/10％FCS/0.05％叠氮化钠中。染色细胞的相对荧光采用FACSCantoTM流式细胞仪(BD)测定。结果以FACS直方图表示，其中绘制荧光强度的对数与相对细胞数(参见图B4)。
实施例B7双特异性结合及跨物种交叉反应性
对于流式细胞术而言，相应细胞系的200,000个细胞与50μl浓度为5μg/ml纯化的双特异性分子在冰上培养30分钟。细胞用具有2％FCS的PBS洗涤两次且构建体的结合用鼠PentaHis抗体(Qiagen；用具有2％FCS的50μl PBS1∶20稀释)检测。洗涤过后，结合的PentaHis抗体用与藻红蛋白缀合的Fcγ-特异性抗体(Dianova)(用具有2％FCS的PBS1∶100稀释)检测。
实施例B8双特异性抗体对人和猕猴BCMA的亲和性的基于Scatchard的测定
对于Scatchard分析，饱和结合实验采用Micromet开发的单价检测系统(抗-His Fab/Alexa488)进行以精确测定双特异性抗体与相应细胞系的单价结合。
各细胞系(表达重组人BCMA的CHO细胞系，表达重组猕猴BCMA的CHO细胞系)的2x104个细胞与起始为100nM的相应BCMA双特异性抗体的各50μl一式三份稀释系列(以1∶2进行八次稀释)一起培养，然后在4℃下搅拌培养16h并进行一次残留洗涤步骤。随后，所述细胞与30μl抗-HisFab/Alexa488溶液(Micromet；30μg/ml)再一起培养30min。在一次洗涤步骤后，细胞悬浮于150μl包含3.5％甲醛的FACS缓冲液中，再培养15min，离心，重新悬浮于FACS缓冲液中并用FACS Canto II仪器及FACS Diva软件进行分析。数据是由两组独立的实验产生的。其值绘制成双曲线结合曲线。计算相应的Scatchard分析值从而推断最大结合(Bmax)。测定在半数最大结合时的双特异性抗体的浓度，从而反映相应的KD。一式三份测定的值绘制成双曲线。采用Scatchard评价法测定最大结合并计算相应的KD。
实施例B9细胞毒性活性
9.1采用经刺激的人T细胞的铬释出分析法
富集CD8+T细胞的经刺激的T细胞按如下述方式获得。
在37℃下，将皮氏培养皿(直径为145mm，Greiner bio-one GmbH，Kremsmünster)涂布最终浓度为1μg/ml的市售抗-CD3特异性抗体(OKT3，Orthoclone)达1小时。使用PBS通过一次洗涤步骤移除未结合的蛋白。将3-5x107个人PBMC添加到预涂布的皮氏培养皿中的具有稳定化谷氨酰胺/10％FCS/IL-220U/mlChiron)的120ml RPMI1640中，并刺激两天。第三天，收集细胞并用RPMI1640洗涤一次。添加IL-2至终浓度为20U/ml并在上述相同的细胞培养基中再次培养细胞一天。
根据制造商的方案，通过使用Dynal-Beads耗竭CD4+T细胞和CD56+NK细胞，从而富集CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。
采用PBS洗涤两次由猕猴或人BCMA转染的CHO靶细胞，并于37℃下在具有50％FCS的终体积为100μl的RPMI中用11.1MBq51Cr标记60分钟。随后，被标记的靶细胞用5ml RPMI洗涤三次然后用于细胞毒性分析。所述分析在96孔板中以E∶T比为10∶1补充的总体积为200μl的RPMI中进行。采用起始浓度为0.01-1μg/ml的纯化双特异性抗体及其三倍稀释物。该分析的培养时间为18小时。细胞毒性按照上清液中释放的铬相对于最大裂解(添加Triton-X)与自发裂解(没有效应细胞)之间差异的相对值进行测定。所有的测定均重复四次进行。上清液中铬活性的测定在Wizard3”γ计数器(Perkin Elmer LifeSciences GmbH，德国)上进行。使用针对Windows的Prism5(5.0版，GraphPad Software Inc.，San Diego，California，USA)进行结果分析。通过从S形剂量响应曲线分析程序计算的EC50值用于细胞毒性活性的比较。
9.2用未经刺激的人PBMC的基于FACS的细胞毒性实验
效应细胞的分离
通过Ficoll密度梯度离心法，从富集的淋巴细胞制备物(血沉棕黄层)中制备人外周血单核细胞(PBMC)，所述制备物为血库采集输注用血的副产物。血沉棕黄层由当地血库供应并且在血液采集的同一天制备PBMC。Ficoll密度离心并用Dulbecco’s PBS(Gibco)充分洗涤后，通过用红细胞裂解缓冲液(155mM NH4Cl，10mM KHCO3，100μM EDTA)培养，从PBMC中移除残留的红细胞。通过PBMC在100×g离心从上清液中移除血小板。保留的淋巴细胞主要包括B淋巴细胞和T淋巴细胞、NK细胞和单核细胞。PBMC在具有10％FCS(Gibco)的RPMI培养基(Gibco)中于37℃/5％CO2下继续培养。
CD14+和CD56+细胞的耗竭
对于CD14+细胞的耗竭，采用人CD14Microbeads(Milteny Biotec，MACS，#130-050-201)，对于NK细胞的耗竭，采用人CD56Microbeads(MACS，#130-050-401)。对PBMC进行计数并在室温下用300×g离心10分钟。弃去上清液并将细胞沉淀重新悬浮于MACS分离缓冲液[80μL/107个细胞；PBS(Invitrogen，#20012-043)，0.5％(v/v)FBS(Gibco，#10270-106)，2mM EDTA(Sigma-Aldrich，#E-6511)]中。加入CD14Microbeads和CD56Microbeads(20μL/107个细胞)并在4-8℃下培养15分钟。用MACS分离缓冲液(1-2mL/107个细胞)洗涤细胞。离心过后(参见上述)，弃去上清液并将细胞重新悬浮于MACS分离缓冲液中(500μL/108个细胞)。然后使用LS柱(Miltenyi Biotec，#130-042-401)分离CD14/CD56阴性细胞。将不具有CD14+/CD56+细胞的PBMC在37℃的培养箱中的RPMI完全培养基中培养直至使用，所述培养基即补充有10％FBS(Biochrom AG，#S0115)、1x非必需氨基酸(Biochrom AG，#K0293)、10mM Hepes缓冲液(Biochrom AG，#L1613)、1mM丙酮酸钠(Biochrom AG，#L0473)和100U/mL青霉素/链霉素(Biochrom AG，#A2213)的RPMI1640(Biochrom AG，#FG1215)。
靶细胞标记
对于细胞裂解在流式细胞术检测的分析，使用荧光膜染料DiOC18(DiO)(Molecular Probes，#V22886)标记作为靶细胞的人BCMA-或猕猴BCMA-转染的CHO细胞，并将所述细胞从效应细胞中区分出来。简言之，将细胞收集、用PBS洗涤一次并且在包含2％(v/v)FBS和膜染料DiO(5μL/106个细胞)的PBS中调节至106个细胞/mL。在37℃下培养3min后，细胞在完全RPMI培养基中洗涤两次并且将细胞数量调节至1.25x105个细胞/mL。采用0.5％(v/v)的等渗EosinG溶液(Roth，#45380)测定细胞活力。
基于流式细胞术的分析
设计这一分析方法，从而量化在BCMA双特异性抗体的系列稀释液存在下经猕猴或人BCMA转染的CHO细胞的裂解。
等体积的Dio标记的靶细胞和效应细胞(即不具有CD14+细胞的PBMC)混合，使E∶T细胞比为10∶1。将160μL的此悬浮液转移至96-孔板的每个孔中。添加40μLBCMA双特异性抗体的系列稀释液和阴性对照双特异性抗体(一种识别不相关靶抗原的基于CD3的双特异性抗体)或作为附加阴性对照的RPMI完全培养基。双特异性抗体介导的细胞毒性反应在7％CO2加湿培养箱中进行48小时。然后将细胞转移至新的96孔板并且通过添加最终浓度为1μg/mL的碘化丙碇(PI)对靶细胞膜的完整性缺失进行监测。PI是一种膜不渗透染料，其通常被活细胞排除在外，而能够进入死细胞使其能够通过发射荧光而被识别。
样品在FACSCanto II仪器上通过流式细胞术测定并用FACSDiva软件(两者都来自Becton Dickinson)进行分析。
靶细胞被识别为DiO-阳性细胞。PI-阴性靶细胞归类为活的靶细胞。根据下式计算细胞毒性的百分比：
n＝事件数目
使用GraphPad Prism5软件(Graph Pad Software，San Diego)，将细胞毒性百分比相对于相应双特异性抗体浓度作图。采用用于评估具有固定斜率的S型剂量响应曲线的四参数logistic回归模型进行剂量响应曲线分析，并计算EC50值。
实施例B10与BAFF受体交叉反应性的排除
对于流式细胞术而言，相应细胞系的200,000个细胞与50μl浓度为5μg/ml纯化的双特异性分子在冰上培养30分钟。细胞用具有2％FCS的PBS洗涤两次且构建体的结合用鼠PentaHis抗体(Qiagen；用50μl具有2％FCS的PBS1∶20稀释)检测。洗涤过后，结合的PentaHis抗体用与藻红蛋白缀合的Fcγ-特异性抗体(Dianova)(用具有2％FCS的PBS1∶100稀释)检测。样品在FACSCanto II仪器上通过流式细胞术测定并用FACSDiva软件(两者都来自Becton Dickinson公司)进行分析。双特异性结合剂显示与BAFF受体不具有交叉反应性。
实施例B11细胞毒性活性
分析人样BCMA双特异性抗体在重新定向效应T细胞对抗表达BCMA的靶细胞方面的效力，该分析在五个另外的体外细胞毒性实验中进行：
1.BCMA双特异性抗体在重新定向经刺激的人效应T细胞对抗BCMA阳性(人)肿瘤细胞系方面的效力通过51-铬释放实验测定。
2.BCMA双特异性抗体在重新定向未经刺激的人PBMC中T细胞对抗经人BCMA转染的CHO细胞方面的效力通过基于FACS的细胞毒性实验测定。
3.BCMA双特异性抗体在重新定向未经刺激的人PBMC中T细胞对抗BCMA阳性(人)肿瘤细胞系方面的效力通过基于FACS的细胞毒性实验测定。
4.采用猕猴T细胞系作为效应T细胞进行基于FACS的细胞毒性实验，从而证实交叉反应性的BCMA双特异性抗体能够重新定向猕猴T细胞对抗经猕猴BCMA转染的CHO细胞。
5.使用经人BCMA转染的CHO细胞作为靶细胞和经刺激的人T细胞作为效应细胞，通过51-铬释放实验测定BCMA双特异性抗体的单体和二聚体形式之间的效力差距。
实施例C
实施例C1表达嵌合的BCMA的CHO细胞的产生
为了构建嵌合的表位作图分子，将人BCMA相应表位结构域的氨基酸序列或单一氨基酸残基替换为鼠的序列。构建下列分子：
●人BCMA ECD/E1鼠(SEQ ID NO：1009)
嵌合的胞外BCMA结构域：人胞外BCMA结构域，其中表位簇1(SEQID NO：1002或1007的氨基酸残基1-7)被相应的鼠簇(SEQ ID NO：1004或1008的氨基酸残基1-4)替换
→SEQ ID NO：1002或1007中氨基酸残基1-3的缺失及G6Q突变
●人BCMA ECD/E2鼠(SEQ ID NO：1010)
嵌合的胞外BCMA结构域：人胞外BCMA结构域，其中表位簇2(SEQID NO：1002或1007的氨基酸残基8-21)被相应的鼠簇(SEQ ID NO：1004或1008的氨基酸残基5-18)替换
→SEQ ID NO：1002或1007中S9F、Q10H及N11S突变
●人BCMA ECD/E3鼠(SEQ ID NO：1011)
嵌合的胞外BCMA结构域：人胞外BCMA结构域，其中表位簇3(SEQID NO：1002或1007的氨基酸残基24-41)被相应的鼠簇(SEQ ID NO：1004或1008的氨基酸残基21-36)替换
→SEQ ID NO：1002或1007中氨基酸残基31和32的缺失及Q25H、S30N、L35A和R39P突变
●人BCMA ECD/E4鼠(SEQ ID NO：1012)
嵌合的胞外BCMA结构域：人胞外BCMA结构域，其中表位簇4(SEQID NO：1002或1007的氨基酸残基42-54)被相应的鼠簇(SEQ ID NO：1004或1008的氨基酸残基37-49)替换
→SEQ ID NO：1002或1007中N42D、A43P、N47S、N53Y和A54T突变
●人BCMA ECD/E5鼠(SEQ ID NO：1013)
嵌合的胞外BCMA结构域：人胞外BCMA结构域，其中SEQ ID NO：1002或1007中的第22位的氨基酸残基(异亮氨酸)被SEQ ID NO：1004或1008中其相应的鼠氨基酸残基(赖氨酸，第19位)替换
→SEQ ID NO：1002或1007中I22K突变
●人BCMA ECD/E6鼠(SEQ ID NO：1014)
嵌合的胞外BCMA结构域：人胞外BCMA结构域，其中SEQ ID NO：1002或1007中的第25位的氨基酸残基(谷氨酰胺)被SEQ ID NO：1004或1008中其相应的鼠氨基酸残基(组氨酸，第22位)替换
→SEQ ID NO：1002或1007中Q25H突变
●人BCMA ECD/E7鼠(SEQ ID NO：1015)
嵌合的胞外BCMA结构域：人胞外BCMA结构域，其中SEQ ID NO：1002或1007中的第39位的氨基酸残基(精氨酸)被SEQ ID NO：1004或1008中其相应的鼠氨基酸残基(脯氨酸，第34位)替换
→SEQ ID NO：1002或1007中R39P突变
将cDNA构建体克隆至哺乳动物表达载体pEF-DHFR中并稳定地转染至CHO细胞中。人BCMA在CHO细胞上的表达通过采用单克隆抗-人BCMA抗体的FACS分析法验证。鼠BCMA的表达通过单克隆抗-小鼠BCMA-抗体证明。所使用的BCMA抗体的浓度为在PBS/2％FCS中10μg/ml。结合的单克隆抗体通过抗-大鼠-IgG-Fcy-PE(在PBS/2％FCS中为1∶100；Jackson-Immuno-Research#112-116-071)检测。作为阴性对照，用PBS/2％FCS替代第一抗体与细胞一起培养。样品通过FACSCanto II仪器(BectonDickinson)上的流式细胞术测量并用FlowJo软件(7.6版)进行分析。使用不同的抗-BCMA抗体在流式细胞术分析法中分析并证实人-鼠BCMA嵌合体转染的CHO细胞的表面表达(图2)。
实施例C2
2.1在HEK293细胞中的瞬时表达
将具有已验证序列的核苷酸序列的表达质粒的克隆用于转染并在FreeStyle293表达系统(Invitrogen GmbH，Karlsruhe，德国)中根据制造商说明进行蛋白质表达。得到包含表达的蛋白质的上清液，采用离心移除细胞并将上清液在-20℃下贮存。
2.2在CHO细胞中的稳定表达
将具有已验证序列的核苷酸序列的表达质粒的克隆转染至用于真核表达构建体的DHFR缺陷型CHO细胞中。在DHFR缺陷型CHO细胞中的真核蛋白表达按如Kaufman R.J.(1990)Methods Enzymol.185，537-566中描述进行。构建体的基因扩增由浓度递增的甲氨蝶呤(MTX)至最终浓度达到20nM的MTX诱导。经过两次传代的静置培养，细胞在具有无核苷HyQ PFCHO液体大豆培养基(具有4.0mM的L-谷氨酰胺及0.1％普朗尼克F-68；HyClone)的滚瓶中生长7天，然后收集。采用离心移除细胞并将含有表达的蛋白的上清液在-20℃下贮存。
实施例C3鼠scFv-片段的表位簇
用人或鼠BCMA、或用嵌合的BCMA分子转染的细胞采用包含结合至人/猕猴BCMA的scFv的天然、未经稀释的周质提取物进行染色。结合的scFv使用1μg/ml的抗-FLAG抗体(Sigma F1804)和经R-PE-标记的抗-小鼠Fcγ-特异性抗体(1∶100；Dianova#115-116-071)进行检测。所有抗体都在具有2％FCS的PBS中进行稀释。作为阴性对照，细胞与PBS/2％FCS而非与周质提取物一起培养。样品通过FACSCanto II仪器(Becton Dickinson)上的流式细胞术测量并用FlowJo软件(7.6版)进行分析。
实施例C4不同重组形式的可溶性人及猕猴BCMA的获得
人和恒河猴BCMA的编码序列(如基因库所公布的，登录号NM_001192[人]；XM_001106892[恒河猴])人白蛋白、人Fcγ1和鼠白蛋白的编码序列用于人工cDNA序列的构建，所述人工cDNA序列分别编码人和猕猴BCMA分别与人白蛋白、人IgG1Fc和鼠白蛋白的可溶性融合蛋白以及仅包含BCMA胞外结构域的可溶性蛋白。为了产生用于表达可溶性人和猕猴BCMA蛋白的构建体，通过上述全长BCMA cDNA的PCR诱变和根据标准方案的分子克隆获得cDNA片段。
对于具有人白蛋白的融合蛋白而言，经修饰的cDNA片段被设计为首先包含用于构建体真核表达的Kozak位点，接着分别是人和恒河猴BCMA蛋白的编码序列，其包含分别对应于人及恒河猴BCMA的胞外结构域的氨基酸1至54和1至53，框架中随后是人工Ser1-Gly4-Ser1-连接子的编码序列，框架中随后是人血清白蛋白的编码序列，框架中接着是Flag标签的编码序列，框架中随后是经修饰的组氨酸标签(SGHHGGHHGGHH)的编码序列及终止密码子。
对于具有鼠IgG1的融合蛋白而言，经修饰的cDNA片段被设计为首先包含用于构建体真核表达的Kozak位点，接着分别是人和猕猴BCMA蛋白的编码序列，其包含分别对应于人及恒河猴BCMA的胞外结构域的氨基酸1至54和1至53，框架中随后是人工Ser1-Gly4-Ser1-连接子的编码序列，框架中接着是人IgG1的铰合部分和Fcγ部分的编码序列，框架中随后是六组氨酸标签的编码序列及终止密码子。
对于具有鼠白蛋白的融合蛋白而言，经修饰的cDNA片段被设计为首先包含用于构建体真核表达的Kozak位点，接着分别是人和猕猴BCMA蛋白的编码序列，其包含分别对应于人及恒河猴BCMA的胞外结构域的氨基酸1至54和1至53，框架中随后是人工Ser1-Gly4-Ser1-连接子的编码序列，框架中接着是鼠血清白蛋白的编码序列，框架中接着是Flag标签的编码序列，框架中随后是经修饰的组氨酸标签(SGHHGGHHGGHH)的编码序列及终止密码子。
对于可溶性胞外结构域构建体而言，经修饰的cDNA片段被设计为首先包含用于构建体真核表达的Kozak位点，接着分别是人和猕猴BCMA蛋白的编码序列，其包含分别对应于人及恒河猴BCMA的胞外结构域的氨基酸1至54和1至53，框架中随后是人工Ser1-Gly1-连接子的编码序列，框架中接着是Flag标签的编码序列，框架中随后是经修饰的组氨酸标签(SGHHGGHHGGHH)的编码序列及终止密码子。
所述cDNA片段也被设计为在片段的起点和终点处引入限制性位点。引入的限制性位点(在5’端引入EcoRI及在3’端引入SalI)被应用于以下的克隆过程中。通过EcoRI和SalI将cDNA片段克隆至命名为pEF-DHFR的质粒(pEF-DHFR描述于Raum等Cancer Immunol Immunother50(2001)141-150中)中。上述提到的程序都依据标准方案(Sambrook，Molecular Cloning；ALaboratory Manual，3rd edition，Cold Spring Harbour Laboratory Press，ColdSpring Harbour，New York(2001))实施。
实施例C5双特异性抗体对人和猕猴BCMA及CD3的亲和性的基于Biacore的测定
使用具有人血清白蛋白(ALB)的重组BCMA融合蛋白进行Biacore分析实验，来测定BCMA靶向结合。对于CD3亲和性的测定，采用具有与人抗体Fc部分融合的CD3ε(CD3e)的N-末端27个氨基酸的重组融合蛋白。所述重组蛋白以人CD3e1-27形式和食蟹猕猴(cynomolgous)CD3e形式存在，二者都具有双特异性抗体中的CD3结合剂的表位。
具体地，根据制造商的说明书，采用pH4.5的醋酸盐缓冲溶液使CM5传感器芯片(GE Healthcare)固定大约100至150RU的相应重组抗原。双特异性抗体样品按照五个浓度装载：用HBS-EP运行缓冲液(GE Healthcare)稀释的50nM、25nM、12.5nM、6.25nM及3.13nM。以流速为30至35μl/min进行3分钟，然后以30至35μl/ml的流速再使用HBS-EP运行缓冲液进行8分钟。使用pH2.45的10mM甘氨酸、0.5M NaCl进行芯片再生。所得数据集使用BiaEval软件进行分析。通常进行两个独立的实验。
实施例C6流式细胞术分析
在FACS中采用人和鼠BCMA转染的CHO细胞分析亲和性成熟的scFv分子的功能性和结合强度。简言之，将约105个细胞与50μl的一系列1∶3稀释的周质大肠杆菌细胞提取物在冰上培养50min。在用PBS/10％FCS/0.05％的叠氮化钠洗涤后，所述细胞与30μl的Flag-M2IgG(Sigma，在PBS/10％FCS/0.05％叠氮化钠中为1∶900)在冰上培养40分钟。在第二次洗涤后，所述细胞与30μl的R-Phycoerythrin(PE)-标记的山羊抗-小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch，在PBS/10％FCS/0.05％叠氮化钠中为1∶100)在冰上培养40分钟。随后所述细胞再次洗涤并悬浮于200μlPBS/10％FCS/0.05％叠氮化钠中。染色细胞的相对荧光采用FACSCantoTM流式细胞仪(BD)测定。结果以FACS直方图表示，其中绘制荧光强度的对数与相对细胞数(参见图C4)。
实施例C7双特异性结合及跨物种交叉反应性
对于流式细胞术而言，相应细胞系的200,000个细胞与50μl浓度为5μg/ml纯化的双特异性分子在冰上培养30分钟。细胞用具有2％FCS的PBS洗涤两次且构建体的结合用鼠PentaHis抗体(Qiagen；用具有2％FCS的50μl PBS1∶20稀释)检测。洗涤过后，结合的PentaHis抗体用与藻红蛋白缀合的Fcγ-特异性抗体(Dianova)(用具有2％FCS的PBS1∶100稀释)检测。
实施例C8双特异性抗体对人和猕猴BCMA的亲和性的基于Scatchard的测定
对于Scatchard分析，饱和结合实验采用Micromet开发的单价检测系统(抗-His Fab/Alexa488)进行以精确测定双特异性抗体与相应细胞系的单价结合。
各细胞系(表达重组人BCMA的CHO细胞系，表达重组猕猴BCMA的CHO细胞系)的2x104个细胞与起始为100nM的相应BCMA双特异性抗体的各50μl一式三份稀释系列(以1∶2进行八次稀释)一起培养，然后在4℃下搅拌培养16h并进行一次残留洗涤步骤。随后，所述细胞与30μl抗-HisFab/Alexa488溶液(Micromet；30μg/ml)再一起培养30min。在一次洗涤步骤后，细胞悬浮于150μl包含3.5％甲醛的FACS缓冲液中，再培养15min，离心，重新悬浮于FACS缓冲液中并用FACS Canto II仪器及FACS Diva软件进行分析。数据是由两组独立的实验产生的。其值绘制成双曲线结合曲线。计算相应的Scatchard分析值从而推断最大结合(Bmax)。测定在半数最大结合时的双特异性抗体的浓度，从而反映相应的KD。一式三份测定的值绘制成双曲线。采用Scatchard评价法测定最大结合并计算相应的KD。
实施例C9细胞毒性活性
9.1采用经刺激的人T细胞的铬释出分析法
富集CD8+T细胞的经刺激的T细胞按如下述方式获得。
在37℃下，将皮氏培养皿(直径为145mm，Greiner bio-one GmbH，Kremsmünster)涂布最终浓度为1μg/ml的市售抗-CD3特异性抗体(OKT3，Orthoclone)达1小时。使用PBS通过一次洗涤步骤移除未结合的蛋白。将3-5x107个人PBMC添加到预涂布的皮氏培养皿中的具有稳定化谷氨酰胺/10％FCS/IL-220U/mlChiron)的120ml RPMI1640中，并刺激两天。第三天，收集细胞并用RPMI1640洗涤一次。添加IL-2至终浓度为20U/ml并在上述相同的细胞培养基中再次培养细胞一天。
根据制造商的方案，通过使用Dynal-Beads耗竭CD4+T细胞和CD56+NK细胞，从而富集CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。
采用PBS洗涤两次由猕猴或人BCMA转染的CHO靶细胞，并于37℃下在具有50％FCS的终体积为100μl的RPMI中用11.1MBq51Cr标记60分钟。随后，被标记的靶细胞用5ml RPMI洗涤三次然后用于细胞毒性分析。所述分析在96孔板中以E∶T比为10∶1补充的总体积为200μl的RPMI中进行。采用起始浓度为0.01-1μg/ml的纯化双特异性抗体及其三倍稀释物。该分析的培养时间为18小时。细胞毒性按照上清液中释放的铬相对于最大裂解(添加Triton-X)与自发裂解(没有效应细胞)之间差异的相对值进行测定。所有的测定均重复四次进行。上清液中铬活性的测定在Wizard3”γ计数器(Perkin Elmer LifeSciences GmbH，德国)上进行。使用针对Windows的Prism5(5.0版，GraphPad Software Inc.，San Diego，California，USA)进行结果分析。通过从S形剂量响应曲线分析程序计算的EC50值用于细胞毒性活性的比较。
9.2用未经刺激的人PBMC的基于FACS的细胞毒性实验
效应细胞的分离
通过Ficoll密度梯度离心法，从富集的淋巴细胞制备物(血沉棕黄层)中制备人外周血单核细胞(PBMC)，所述制备物为血库采集输注用血的副产物。血沉棕黄层由当地血库供应并且在血液采集的同一天制备PBMC。Ficoll密度离心并用Dulbecco’s PBS(Gibco)充分洗涤后，通过用红细胞裂解缓冲液(155mM NH4Cl，10mM KHCO3，100μM EDTA)培养，从PBMC中移除残留的红细胞。通过PBMC在100×g离心从上清液中移除血小板。保留的淋巴细胞主要包括B淋巴细胞和T淋巴细胞、NK细胞和单核细胞。PBMC在具有10％FCS(Gibco)的RPMI培养基(Gibco)中于37℃/5％CO2下继续培养。
CD14+和CD56+细胞的耗竭
对于CD14+细胞的耗竭，采用人CD14Microbeads(Milteny Biotec，MACS，#130-050-201)，对于NK细胞的耗竭，采用人CD56Microbeads(MACS，#130-050-401)。对PBMC进行计数并在室温下用300×g离心10分钟。弃去上清液并将细胞沉淀重新悬浮于MACS分离缓冲液[80μL/107个细胞；PBS(Invitrogen，#20012-043)，0.5％(v/v)FBS(Gibco，#10270-106)，2mM EDTA(Sigma-Aldrich，#E-6511)]中。加入CD14Microbeads和CD56Microbeads(20μL/107个细胞)并在4-8℃下培养15分钟。用MACS分离缓冲液(1-2mL/107个细胞)洗涤细胞。离心过后(参见上述)，弃去上清液并将细胞重新悬浮于MACS分离缓冲液中(500μL/108个细胞)。然后使用LS柱(Miltenyi Biotec，#130-042-401)分离CD14/CD56阴性细胞。将不具有CD14+/CD56+细胞的PBMC在37℃的培养箱中的RPMI完全培养基中培养直至使用，所述培养基即补充有10％FBS(Biochrom AG，#S0115)、1x非必需氨基酸(Biochrom AG，#K0293)、10mM Hepes缓冲液(Biochrom AG，#L1613)、1mM丙酮酸钠(Biochrom AG，#L0473)和100U/mL青霉素/链霉素(BiochromAG，#A2213)的RPMI1640(Biochrom AG，#FG1215)。
靶细胞标记
对于细胞裂解在流式细胞术检测的分析，使用荧光膜染料DiOC18(DiO)(Molecular Probes，#V22886)标记作为靶细胞的人BCMA-或猕猴BCMA-转染的CHO细胞，并将所述细胞从效应细胞中区分出来。简言之，将细胞收集、用PBS洗涤一次并且在包含2％(v/v)FBS和膜染料DiO(5μL/106个细胞)的PBS中调节至106个细胞/mL。在37℃下培养3min后，细胞在完全RPMI培养基中洗涤两次并且将细胞数量调节至1.25x105个细胞/mL。采用0.5％(v/v)的等渗EosinG溶液(Roth，#45380)测定细胞活力。
基于流式细胞术的分析
设计这一分析方法，从而量化在BCMA双特异性抗体的系列稀释液存在下经猕猴或人BCMA转染的CHO细胞的裂解。
等体积的Dio标记的靶细胞和效应细胞(即不具有CD14+细胞的PBMC)混合，使E∶T细胞比为10∶1。将160μL的此悬浮液转移至96-孔板的每个孔中。添加40μL BCMA双特异性抗体的系列稀释液和阴性对照双特异性(一种识别不相关靶抗原的基于CD3的双特异性抗体)或作为附加阴性对照的RPMI完全培养基。双特异性抗体介导的细胞毒性反应在7％CO2加湿培养箱中进行48小时。然后将细胞转移至新的96孔板并且通过添加最终浓度为1μg/mL的碘化丙碇(PI)对靶细胞膜的完整性缺失进行监测。PI是一种膜不渗透染料，其通常被活细胞排除在外，而能够进入死细胞使其能够通过发射荧光而被识别。
样品在FACSCanto II仪器上通过流式细胞术测定并用FACSDiva软件(两者都来自Becton Dickinson)进行分析。
靶细胞被识别为DiO-阳性细胞。PI-阴性靶细胞归类为活的靶细胞。根据下式计算细胞毒性的百分比：
n＝事件数目
使用GraphPad Prism5软件(Graph Pad Software，San Diego)，将细胞毒性百分比相对于相应双特异性抗体浓度作图。采用用于评估具有固定斜率的S型剂量响应曲线的四参数logistic回归模型进行剂量响应曲线分析，并计算EC50值。
实施例C10与BAFF受体交叉反应性的排除
对于流式细胞术而言，相应细胞系的200,000个细胞与50μl浓度为5μg/ml纯化的双特异性分子在冰上培养30分钟。细胞用具有2％FCS的PBS洗涤两次且构建体的结合用鼠PentaHis抗体(Qiagen；用50μl具有2％FCS的PBS1∶20稀释)检测。洗涤过后，结合的PentaHis抗体用与藻红蛋白缀合的Fcγ-特异性抗体(Dianova)(用具有2％FCS的PBS1∶100稀释)检测。样品在FACSCanto II仪器上通过流式细胞术测定并用FACSDiva软件(两者都来自Becton Dickinson公司)进行分析。双特异性结合剂显示与BAFF受体不具有交叉反应性。
实施例C11细胞毒性活性
分析人样BCMA双特异性抗体在重新定向效应T细胞对抗表达BCMA的靶细胞方面的效力，该分析在五个另外的体外细胞毒性实验中进行：
1.BCMA双特异性抗体在重新定向经刺激的人效应T细胞对抗BCMA阳性(人)肿瘤细胞系方面的效力通过51-铬释放实验测定。
2.BCMA双特异性抗体在重新定向未经刺激的人PBMC中T细胞对抗经人BCMA转染的CHO细胞方面的效力通过基于FACS的细胞毒性实验测定。
3.BCMA双特异性抗体在重新定向未经刺激的人PBMC中T细胞对抗BCMA阳性(人)肿瘤细胞系方面的效力通过基于FACS的细胞毒性实验测定。
4.采用猕猴T细胞系作为效应T细胞进行基于FACS的细胞毒性实验，从而证实交叉反应性的BCMA双特异性抗体能够重新定向猕猴T细胞对抗经猕猴BCMA转染的CHO细胞。
5.使用经人BCMA转染的CHO细胞作为靶细胞和经刺激的人T细胞作为效应细胞，通过51-铬释放实验测定BCMA双特异性抗体的单体和二聚体形式之间的效力差距。
实施例D
实施例D1表达嵌合的BCMA的CHO细胞的产生
为了构建嵌合的表位作图分子，将人BCMA相应表位结构域的氨基酸序列或单一氨基酸残基替换为鼠的序列。构建下列分子：
●人BCMA ECD/E1鼠(SEQ ID NO：1009)
嵌合的胞外BCMA结构域：人胞外BCMA结构域，其中表位簇1(SEQID NO：1002或1007的氨基酸残基1-7)被相应的鼠簇(SEQ ID NO：1004或1008的氨基酸残基1-4)替换
→SEQ ID NO：1002或1007中氨基酸残基1-3的缺失及G6Q突变
●人BCMA ECD/E2鼠(SEQ ID NO：1010)
嵌合的胞外BCMA结构域：人胞外BCMA结构域，其中表位簇2(SEQID NO：1002或1007的氨基酸残基8-21)被相应的鼠簇(SEQ ID NO：1004或1008的氨基酸残基5-18)替换
→SEQ ID NO：1002或1007中S9F、Q10H及N11S突变
●人BCMA ECD/E3鼠(SEQ ID NO：1011)
嵌合的胞外BCMA结构域：人胞外BCMA结构域，其中表位簇3(SEQID NO：1002或1007的氨基酸残基24-41)被相应的鼠簇(SEQ ID NO：1004或1008的氨基酸残基21-36)替换
→SEQ ID NO：1002或1007中氨基酸残基31和32的缺失及Q25H、S30N、L35A和R39P突变
●人BCMA ECD/E4鼠(SEQ ID NO：1012)
嵌合的胞外BCMA结构域：人胞外BCMA结构域，其中表位簇4(SEQID NO：1002或1007的氨基酸残基42-54)被相应的鼠簇(SEQ ID NO：1004或1008的氨基酸残基37-49)替换
→SEQ ID NO：1002或1007中N42D、A43P、N47S、N53Y和A54T突变
●人BCMA ECD/E5鼠(SEQ ID NO：1013)
嵌合的胞外BCMA结构域：人胞外BCMA结构域，其中SEQ ID NO：1002或1007中的第22位的氨基酸残基(异亮氨酸)被SEQ ID NO：1004或1008中其相应的鼠氨基酸残基(赖氨酸，第19位)替换
→SEQ ID NO：1002或1007中I22K突变
●人BCMA ECD/E6鼠(SEQ ID NO：1014)
嵌合的胞外BCMA结构域：人胞外BCMA结构域，其中SEQ ID NO：1002或1007中的第25位的氨基酸残基(谷氨酰胺)被SEQ ID NO：1004或1008中其相应的鼠氨基酸残基(组氨酸，第22位)替换
→SEQ ID NO：1002或1007中Q25H突变
●人BCMA ECD/E7鼠(SEQ ID NO：1015)
嵌合的胞外BCMA结构域：人胞外BCMA结构域，其中SEQ ID NO：1002或1007中的第39位的氨基酸残基(精氨酸)被SEQ ID NO：1004或1008中其相应的鼠氨基酸残基(脯氨酸，第34位)替换
→SEQ ID NO：1002或1007中R39P突变
将cDNA构建体克隆至哺乳动物表达载体pEF-DHFR中并稳定地转染至CHO细胞中。人BCMA在CHO细胞上的表达通过采用单克隆抗-人BCMA抗体的FACS分析法验证。鼠BCMA的表达通过单克隆抗-小鼠BCMA-抗体证明。所使用的BCMA抗体的浓度为在PBS/2％FCS中10μg/ml。结合的单克隆抗体通过抗-大鼠-IgG-Fcy-PE(在PBS/2％FCS中为1∶100；Jackson-Immuno-Research#112-116-071)检测。作为阴性对照，用PBS/2％FCS替代第一抗体与细胞一起培养。样品通过FACSCanto II仪器(BectonDickinson)上的流式细胞术测量并用FlowJo软件(7.6版)进行分析。使用不同的抗-BCMA抗体在流式细胞术分析法中分析并证实人-鼠BCMA嵌合体转染的CHO细胞的表面表达(图2)。
实施例D2
2.1在HEK293细胞中的瞬时表达
将具有已验证序列的核苷酸序列的表达质粒的克隆用于转染并在FreeStyle293表达系统(Invitrogen GmbH，Karlsruhe，德国)中根据制造商说明进行蛋白质表达。得到包含表达的蛋白质的上清液，采用离心移除细胞并将上清液在-20℃下贮存。
2.2在CHO细胞中的稳定表达
将具有已验证序列的核苷酸序列的表达质粒的克隆转染至用于真核表达构建体的DHFR缺陷型CHO细胞中。在DHFR缺陷型CHO细胞中的真核蛋白表达按如Kaufman R.J.(1990)Methods Enzymol.185，537-566中描述进行。构建体的基因扩增由浓度递增的甲氨蝶呤(MTX)至最终浓度达到20nM的MTX诱导。经过两次传代的静置培养，细胞在具有无核苷HyQ PFCHO液体大豆培养基(具有4.0mM的L-谷氨酰胺及0.1％普朗尼克F-68；HyClone)的滚瓶中生长7天，然后收集。采用离心移除细胞并将含有表达的蛋白的上清液在-20℃下贮存。
实施例D3鼠类scFv-片段的表位成簇
用人或鼠BCMA、或用嵌合的BCMA分子转染的细胞采用包含结合至人/猕猴BCMA的scFv的天然、未经稀释的周质提取物进行染色。结合的scFv使用1μg/ml的抗-FLAG抗体(Sigma F1804)和经R-PE-标记的抗-小鼠Fcγ-特异性抗体(1∶100；Dianova#115-116-071)进行检测。所有抗体都在具有2％FCS的PBS中进行稀释。作为阴性对照，细胞与PBS/2％FCS而非与周质提取物一起培养。样品通过FACSCanto II仪器(Becton Dickinson)上的流式细胞术测量并用FlowJo软件(7.6版)进行分析。
实施例D4不同重组形式的可溶性人及猕猴BCMA的获得
人和恒河猴BCMA的编码序列(如基因库所公布的，登录号NM_001192[人]；XM_001106892[恒河猴])人白蛋白、人Fcγ1和鼠白蛋白的编码序列用于人工cDNA序列的构建，所述人工cDNA序列分别编码人和猕猴BCMA分别与人白蛋白、人IgG1Fc和鼠白蛋白的可溶性融合蛋白以及仅包含BCMA胞外结构域的可溶性蛋白。为了产生用于表达可溶性人和猕猴BCMA蛋白的构建体，通过上述全长BCMA eDNA的PCR诱变和根据标准方案的分子克隆获得cDNA片段。
对于具有人白蛋白的融合蛋白而言，经修饰的cDNA片段被设计为首先包含用于构建体真核表达的Kozak位点，接着分别是人和恒河猴BCMA蛋白的编码序列，其包含分别对应于人及恒河猴BCMA的胞外结构域的氨基酸1至54和1至53，框架中随后是人工Ser1-Gly4-Ser1-连接子的编码序列，框架中随后是人血清白蛋白的编码序列，框架中接着是Flag标签的编码序列，框架中随后是经修饰的组氨酸标签(SGHHGGHHGGHH)的编码序列及终止密码子。
对于具有鼠IgG1的融合蛋白而言，经修饰的eDNA片段被设计为首先包含用于构建体真核表达的Kozak位点，接着分别是人和猕猴BCMA蛋白的编码序列，其包含分别对应于人及恒河猴BCMA的胞外结构域的氨基酸1至54和1至53，框架中随后是人工Ser1-Gly4-Ser1-连接子的编码序列，框架中接着是人IgG1的铰合部分和Fcγ部分的编码序列，框架中随后是六组氨酸标签的编码序列及终止密码子。
对于具有鼠白蛋白的融合蛋白而言，经修饰的cDNA片段被设计为首先包含用于构建体真核表达的Kozak位点，接着分别是人和猕猴BCMA蛋白的编码序列，其包含分别对应于人及恒河猴BCMA的胞外结构域的氨基酸1至54和1至53，框架中随后是人工Ser1-Gly4-Ser1-连接子的编码序列，框架中接着是鼠血清白蛋白的编码序列，框架中接着是Flag标签的编码序列，框架中随后是经修饰的组氨酸标签(SGHHGGHHGGHH)的编码序列及终止密码子。
对于可溶性胞外结构域构建体而言，经修饰的cDNA片段被设计为首先包含用于构建体真核表达的Kozak位点，接着分别是人和猕猴BCMA蛋白的编码序列，其包含分别对应于人及恒河猴BCMA的胞外结构域的氨基酸1至54和1至53，框架中随后是人工Ser1-Gly1-连接子的编码序列，框架中接着是Flag标签的编码序列，框架中随后是经修饰的组氨酸标签(SGHHGGHHGGHH)的编码序列及终止密码子。
所述cDNA片段也被设计为在片段的起点和终点处引入限制性位点。引入的限制性位点(在5’端引入EcoRI及在3’端引入SalI)被应用于以下的克隆过程中。通过EcoRI和SalI将cDNA片段克隆至命名为pEF-DHFR的质粒(pEF-DHFR描述于Raum等Cancer Immunol Immunother50(2001)141-150中)中。上述提到的程序都依据标准方案(Sambrook，Molecular Cloning；ALaboratory Manual，3rd edition，Cold Spring Harbour Laboratory Press，ColdSpring Harbour，New York(2001))实施。
实施例D5双特异性抗体对人和猕猴BCMA及CD3的亲和性的基于Biacore的测定
使用具有人血清白蛋白(ALB)的重组BCMA融合蛋白进行Biacore分析实验，来测定BCMA靶向结合。对于CD3亲和性的测定，采用具有与人抗体Fc部分融合的CD3ε(CD3e)的N-末端27个氨基酸的重组融合蛋白。所述重组蛋白以人CD3e1-27形式和食蟹猕猴CD3e形式存在，二者都具有双特异性抗体中的CD3结合剂的表位。
具体地，根据制造商的说明书，采用pH4.5的醋酸盐缓冲溶液使CM5传感器芯片(GE Healthcare)固定大约100至150RU的相应重组抗原。双特异性抗体样品按照五个浓度装载：用HBS-EP运行缓冲液(GE Healthcare)稀释的50nM、25nM、12.5nM、6.25nM及3.13nM。以流速为30至35μl/min进行3分钟，然后以30至35μl/ml的流速再使用HBS-EP运行缓冲液进行8分钟。使用pH2.45的10mM甘氨酸、0.5M NaCl进行芯片再生。所得数据集使用BiaEval软件进行分析(参见图D4)。通常进行两个独立的实验。
实施例D6双特异性结合及跨物种交叉反应性
对于流式细胞术而言，相应细胞系的200,000个细胞与50μl浓度为5μg/ml纯化的双特异性分子在冰上培养30分钟。细胞用具有2％FCS的PBS洗涤两次且构建体的结合用鼠PentaHis抗体(Qiagen；用具有2％FCS的50μl PBS1∶20稀释)检测。洗涤过后，结合的PentaHis抗体用与藻红蛋白缀合的Fcγ-特异性抗体(Dianova)(用具有2％FCS的PBS1∶100稀释)检测。
实施例D7双特异性抗体对人和猕猴BCMA的亲和性的基于Scatchard的测定
对于Scatchard分析，饱和结合实验采用Micromet开发的单价检测系统(抗-His Fab/Alexa488)进行以精确测定双特异性抗体与相应细胞系的单价结合。
各细胞系(表达重组人BCMA的CHO细胞系，表达重组猕猴BCMA的CHO细胞系)的2x104个细胞与起始为100nM的相应BCMA双特异性抗体的各50μl一式三份稀释系列(以1∶2进行八次稀释)一起培养，然后在4℃下搅拌培养16h并进行一次残留洗涤步骤。随后，所述细胞与30μl抗-HisFab/Alexa488溶液(Micromet；30μg/ml)再一起培养30min。在一次洗涤步骤后，细胞悬浮于150μl包含3.5％甲醛的FACS缓冲液中，再培养15min，离心，重新悬浮于FACS缓冲液中并用FACS Canto II仪器及FACS Diva软件进行分析。数据是由两组独立的实验产生的。其值绘制成双曲线结合曲线。计算相应的Scatchard分析值从而推断最大结合(Bmax)。测定在半数最大结合时的双特异性抗体的浓度，从而反映相应的KD。一式三份测定的值绘制成双曲线。采用Scatchard评价法测定最大结合并计算相应的KD。
实施例D8细胞毒性活性
8.1采用经刺激的人T细胞的铬释出分析法
富集CD8+T细胞的经刺激的T细胞按如下述方式获得。
在37℃下，将皮氏培养皿(直径为145mm，Greiner bio-one GmbH，Kremsmünster)涂布最终浓度为1μg/ml的市售抗-CD3特异性抗体(OKT3，Orthoclone)达1小时。使用PBS通过一次洗涤步骤移除未结合的蛋白。将3-5x107个人PBMC添加到预涂布的皮氏培养皿中的具有稳定化谷氨酰胺/10％FCS/IL-220U/mlChiron)的120ml RPMI1640中，并刺激两天。第三天，收集细胞并用RPMI1640洗涤一次。添加IL-2至终浓度为20U/ml并在上述相同的细胞培养基中再次培养细胞一天。
根据制造商的方案，通过使用Dynal-Beads耗竭CD4+T细胞和CD56+NK细胞，从而富集CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。
采用PBS洗涤两次由猕猴或人BCMA转染的CHO靶细胞，并于37℃下在具有50％FCS的终体积为100μl的RPMI中用11.1MBq51Cr标记60分钟。随后，被标记的靶细胞用5ml RPMI洗涤三次然后用于细胞毒性分析。所述分析在96孔板中以E∶T比为10∶1补充的总体积为200μl的RPMI中进行。采用起始浓度为0.01-1μg/ml的纯化双特异性抗体及其三倍稀释物。该分析的培养时间为18小时。细胞毒性按照上清液中释放的铬相对于最大裂解(添加Triton-X)与自发裂解(没有效应细胞)之间差异的相对值进行测定。所有的测定均重复四次进行。上清液中铬活性的测定在Wizard3”γ计数器(Perkin Elmer LifeSciences GmbH，德国)上进行。使用针对Windows的Prism5(5.0版，GraphPad Software Inc.，San Diego，California，USA)进行结果分析。通过从S形剂量响应曲线分析程序计算的EC50值用于细胞毒性活性的比较(参见图5D)。
8.2用未经刺激的人PBMC的基于FACS的细胞毒性实验
效应细胞的分离
通过Ficoll密度梯度离心法，从富集的淋巴细胞制备物(血沉棕黄层)中制备人外周血单核细胞(PBMC)，所述制备物为血库采集输注用血的副产物。血沉棕黄层由当地血库供应并且在血液采集的同一天制备PBMC。Ficoll密度离心并用Dulbecco’s PBS(Gibco)充分洗涤后，通过用红细胞裂解缓冲液(155mM NH4Cl，10mM KHCO3，100μM EDTA)培养，从PBMC中移除残留的红细胞。通过PBMC在100×g离心从上清液中移除血小板。保留的淋巴细胞主要包括B淋巴细胞和T淋巴细胞、NK细胞和单核细胞。PBMC在具有10％FCS(Gibco)的RPMI培养基(Gibco)中于37℃/5％CO2下继续培养。
CD14+和CD56+细胞的耗竭
对于CD14+细胞的耗竭，采用人CD14Microbeads(Milteny Biotec，MACS，#130-050-201)，对于NK细胞的耗竭，采用人CD56Microbeads(MACS，#130-050-401)。对PBMC进行计数并在室温下用300×g离心10分钟。弃去上清液并将细胞沉淀重新悬浮于MACS分离缓冲液[80μL/107个细胞；PBS(Invitrogen，#20012-043)，0.5％(v/v)FBS(Gibco，#10270-106)，2mM EDTA(Sigma-Aldrich，#E-6511)]中。加入CD14Microbeads和CD56Microbeads(20μL/107个细胞)并在4-8℃下培养15分钟。用MACS分离缓冲液(1-2mL/107个细胞)洗涤细胞。离心过后(参见上述)，弃去上清液并将细胞重新悬浮于MACS分离缓冲液中(500μL/108个细胞)。然后使用LS柱(Miltenyi Biotec，#130-042-401)分离CD14/CD56阴性细胞。将不具有CD14+/CD56+细胞的PBMC在37℃的培养箱中的RPMI完全培养基中培养直至使用，所述培养基即补充有10％FBS(Biochrom AG，#S0115)、1x非必需氨基酸(Biochrom AG，#K0293)、10mM Hepes缓冲液(Biochrom AG，#L1613)、1mM丙酮酸钠(Biochrom AG，#L0473)和100U/mL青霉素/链霉素(Biochrom AG，#A2213)的RPMI1640(BiochromAG，#FG1215)。
靶细胞标记
对于细胞裂解在流式细胞术检测的分析，使用荧光膜染料DiOC18(DiO)(Molecular Probes，#V22886)标记作为靶细胞的人BCMA-或猕猴BCMA-转染的CHO细胞，并将所述细胞从效应细胞中区分出来。简言之，将细胞收集、用PBS洗涤一次并且在包含2％(v/v)FBS和膜染料DiO(5μL/106个细胞)的PBS中调节至106个细胞/mL。在37℃下培养3min后，细胞在完全RPMI培养基中洗涤两次并且将细胞数量调节至1.25x105个细胞/mL。采用0.5％(v/v)的等渗EosinG溶液(Roth，#45380)测定细胞活力。
基于流式细胞术的分析
设计这一分析方法，从而量化在BCMA双特异性抗体的系列稀释液存在下经猕猴或人BCMA转染的CHO细胞的裂解。
等体积的Dio标记的靶细胞和效应细胞(即不具有CD14+细胞的PBMC)混合，使E∶T细胞比为10∶1。将160μL的此悬浮液转移至96-孔板的每个孔中。添加40μLBCMA双特异性抗体的系列稀释液和阴性对照双特异性(一种识别不相关靶抗原的基于CD3的双特异性抗体)或作为附加阴性对照的RPMI完全培养基。双特异性抗体介导的细胞毒性反应在7％CO2加湿培养箱中进行48小时。然后将细胞转移至新的96孔板并且通过添加最终浓度为1μg/mL的碘化丙碇(PI)对靶细胞膜的完整性缺失进行监测。PI是一种膜不渗透染料，其通常被活细胞排除在外，而能够进入死细胞使其能够通过发射荧光而被识别。
样品在FACSCanto II仪器上通过流式细胞术测定并用FACSDiva软件(两者都来自Becton Dickinson)进行分析。
靶细胞被识别为DiO-阳性细胞。PI-阴性靶细胞归类为活的靶细胞。根据下式计算细胞毒性的百分比：
n＝事件数目
使用GraphPad Prism5软件(Graph Pad Software，San Diego)，将细胞毒性百分比相对于相应双特异性抗体浓度作图。采用用于评估具有固定斜率的S型剂量响应曲线的四参数logistic回归模型进行剂量响应曲线分析，并计算EC50值。
实施例D9与BAFF受体交叉反应性的排除
对于流式细胞术而言，相应细胞系的200,000个细胞与50μl浓度为5μg/ml纯化的双特异性分子在冰上培养30分钟。细胞用具有2％FCS的PBS洗涤两次且构建体的结合用鼠PentaHis抗体(Qiagen；用50μl具有2％FCS的PBS1∶20稀释)检测。洗涤过后，结合的PentaHis抗体用与藻红蛋白缀合的Fcγ-特异性抗体(Dianova)(用具有2％FCS的PBS1∶100稀释)检测。样品在FACSCanto II仪器上通过流式细胞术测定并用FACSDiva软件(两者都来自Becton Dickinson公司)进行分析。双特异性结合剂显示与BAFF受体不具有交叉反应性。
实施例D10细胞毒性活性
分析人样BCMA双特异性抗体在重新定向效应T细胞对抗表达BCMA的靶细胞方面的效力，该分析在五个另外的体外细胞毒性实验中进行：
1.BCMA双特异性抗体在重新定向经刺激的人效应T细胞对抗BCMA阳性(人)肿瘤细胞系方面的效力通过51-铬释放实验测定。
2.BCMA双特异性抗体在重新定向未经刺激的人PBMC中T细胞对抗经人BCMA转染的CHO细胞方面的效力通过基于FACS的细胞毒性实验测定。
3.BCMA双特异性抗体在重新定向未经刺激的人PBMC中T细胞对抗BCMA阳性(人)肿瘤细胞系方面的效力通过基于FACS的细胞毒性实验测定。
4.采用猕猴T细胞系作为效应T细胞进行基于FACS的细胞毒性实验，从而证实交叉反应性的BCMA双特异性抗体能够重新定向猕猴T细胞对抗经猕猴BCMA转染的CHO细胞。
5.使用经人BCMA转染的CHO细胞作为靶细胞和经刺激的人T细胞作为效应细胞通过51-铬释放实验测定BCMA双特异性抗体的单体和二聚体形式之间的效力差距。

Claims (25)

1.一种至少双特异性的结合分子，所述结合分子包含第一结合结构域和第二结合结构域，其中：
(a)所述第一结合结构域能够结合至BCMA的表位簇3和表位簇4；和
(b)所述第二结合结构域能够结合至T细胞CD3受体复合物；且
其中所述BCMA的表位簇3对应于如SEQ ID NO：1002中所示序列的氨基酸残基24至41，所述BCMA的表位簇4对应于如SEQ ID NO：1002中所示序列的氨基酸残基42至54。
2.根据权利要求1所述的结合分子，其中所述第一结合结构域不能够结合至如SEQ ID NO：1015中所示的BCMA的嵌合的胞外结构域。
3.根据权利要求1或2所示的结合分子，其中所述第一结合结构域还能够结合至猕猴BCMA。
4.根据前述权利要求中任一项所述的结合分子，其中所述第二结合结构域能够结合至CD3ε。
5.根据前述权利要求中任一项所述的结合分子，其中所述第二结合结构域能够结合至人CD3和猕猴CD3。
6.根据前述权利要求中任一项所述的结合分子，其中所述第一结合结构域和/或所述第二结合结构域源自抗体。
7.根据权利要求6所述的结合分子，其选自(scFv)2、(单结构域mAb)2、scFv-单结构域mAb、双链抗体和它们的寡聚体。
8.根据前述权利要求中任一项所述的结合分子，其中所述第一结合结构域包含VH区和VL区，所述VH区含有选自以下的CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3，所述VL区含有选自以下的CDR-L1、CDR-L2以及CDR-L3：
(a)如SEQ ID NO：231中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：232中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：233中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：234中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：235中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：236中所示的CDR-L3；
(b)如SEQ ID NO：241中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：242中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：243中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：244中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：245中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：246中所示的CDR-L3；
(c)如SEQ ID NO：251中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：252中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：253中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：254中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：255中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：256中所示的CDR-L3；
(d)如SEQ ID NO：261中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：262中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：263中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：264中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：265中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：266中所示的CDR-L3；
(e)如SEQ ID NO：271中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：272中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：273中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：274中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：275中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：276中所示的CDR-L3；
(f)如SEQ ID NO：281中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：282中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：283中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：284中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：285中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：286中所示的CDR-L3；
(g)如SEQ ID NO：291中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：292中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：293中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：294中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：295中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：296中所示的CDR-L3；
(h)如SEQ ID NO：301中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：302中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：303中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：304中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：305中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：306中所示的CDR-L3；
(i)如SEQ ID NO：391中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：392中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：393中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：394中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：395中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：396中所示的CDR-L3；
(k)如SEQ ID NO：401中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：402中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：403中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：404中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：405中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：406中所示的CDR-L3；
(l)如SEQ ID NO：411中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：412中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：413中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：414中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：415中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：416中所示的CDR-L3；
(m)如SEQ ID NO：421中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：422中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：423中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：424中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：425中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：426中所示的CDR-L3；
(n)如SEQ ID NO：431中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：432中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：433中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：434中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：435中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：436中所示的CDR-L3；
(o)如SEQ ID NO：441中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：442中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：443中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：444中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：445中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：446中所示的CDR-L3；
(p)如SEQ ID NO：451中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：452中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：453中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：454中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：455中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：456中所示的CDR-L3；
(q)如SEQ ID NO：461中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：462中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：463中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：464中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：465中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：466中所示的CDR-L3；
(r)如SEQ ID NO：471中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：472中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：473中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：474中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：475中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：476中所示的CDR-L3；
(s)如SEQ ID NO：481中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：482中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：483中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：484中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：485中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：486中所示的CDR-L3；
(t)如SEQ ID NO：491中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：492中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：493中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：494中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：495中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：496中所示的CDR-L3；和
(u)如SEQ ID NO：501中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：502中所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：503中所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：504中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：505中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：506中所示的CDR-L3。
9.根据前述权利要求中任一项所述的结合分子，其中所述第一结合结构域包含VH区，所述VH区选自如以下序列中所示的VH区：SEQ ID NO：237、SEQ ID NO：247、SEQ ID NO：257、SEQ ID NO：267、SEQ ID NO：277、SEQ ID NO：287、SEQ ID NO：297、SEQ ID NO：307、SEQ ID NO：397、SEQ ID NO：407、SEQ ID NO：417、SEQ ID NO：427、SEQ ID NO：437、SEQ ID NO：447、SEQ ID NO：457、SEQ ID NO：467、SEQ ID NO：477、SEQ ID NO：487、SEQ ID NO：497和SEQ ID NO：507。
10.根据前述权利要求中任一项所述的结合分子，其中所述第一结合结构域包含VL区，所述VL区选自如以下序列中所示的VL区：SEQ IDNO：238、SEQ ID NO：248、SEQ ID NO：258、SEQ ID NO：268、SEQ IDNO：278、SEQ ID NO：288、SEQ ID NO：298、SEQ ID NO：308、SEQ IDNO：398、SEQ ID NO：408、SEQ ID NO：418、SEQ ID NO：428、SEQ IDNO：438、SEQ ID NO：448、SEQ ID NO：458、SEQ ID NO：468、SEQ IDNO：478、SEQ ID NO：488、SEQ ID NO：498和SEQ ID NO：508。
11.根据前述权利要求中任一项所述的结合分子，其中所述第一结合结构域包含选自以下的VH区和VL区：
(a)如SEQ ID NO：237中所示的VH区，和如SEQ ID NO：238中所示的VL区；
(b)如SEQ ID NO：247中所示的VH区，和如SEQ ID NO：248中所示的VL区；
(c)如SEQ ID NO：257中所示的VH区，和如SEQ ID NO：258中所示的VL区；
(d)如SEQ ID NO：267中所示的VH区，和如SEQ ID NO：268中所示的VL区；
(e)如SEQ ID NO：277中所示的VH区，和如SEQ ID NO：278中所示的VL区；
(f)如SEQ ID NO：287中所示的VH区，和如SEQ ID NO：288中所示的VL区；
(g)如SEQ ID NO：297中所示的VH区，和如SEQ ID NO：298中所示的VL区；
(h)如SEQ ID NO：307中所示的VH区，和如SEQ ID NO：308中所示的VL区；
(i)如SEQ ID NO：397中所示的VH区，和如SEQ ID NO：398中所示的VL区；
(k)如SEQ ID NO：407中所示的VH区，和如SEQ ID NO：408中所示的VL区；
(l)如SEQ ID NO：417中所示的VH区，和如SEQ ID NO：418中所示的VL区；
(m)如SEQ ID NO：427中所示的VH区，和如SEQ ID NO：428中所示的VL区；
(n)如SEQ ID NO：437中所示的VH区，和如SEQ ID NO：438中所示的VL区；
(o)如SEQ ID NO：447中所示的VH区，和如SEQ ID NO：448中所示的VL区；
(p)如SEQ ID NO：457中所示的VH区，和如SEQ ID NO：458中所示的VL区；
(q)如SEQ ID NO：467中所示的VH区，和如SEQ ID NO：468中所示的VL区；
(r)如SEQ ID NO：477中所示的VH区，和如SEQ ID NO：478中所示的VL区；
(s)如SEQ ID NO：487中所示的VH区，和如SEQ ID NO：488中所示的VL区；
(t)如SEQ ID NO：497中所示的VH区，和如SEQ ID NO：498中所示的VL区；和
(u)如SEQ ID NO：507中所示的VH区，和如SEQ ID NO：508中所示的VL区。
12.根据权利要求10所述的结合分子，其中所述第一结合结构域包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：239、SEQ ID NO：249、SEQ ID NO：259、SEQ ID NO：269、SEQ ID NO：279、SEQ ID NO：289、SEQ ID NO：299、SEQ ID NO：309、SEQ ID NO：399、SEQ ID NO：409、SEQ ID NO：419、SEQ ID NO：429、SEQ ID NO：439、SEQ ID NO：449、SEQ ID NO：459、SEQ ID NO：469、SEQ ID NO：479、SEQ ID NO：489、SEQ ID NO：499和SEQ ID NO：509。
13.根据权利要求1-7中任一项所述的结合分子，其具有示于SEQ IDNO：300或SEQ ID NO：500的氨基酸序列。
14.一种编码根据权利要求1至13中任一项所定义的结合分子的核酸序列。
15.一种包含根据权利要求14所定义的核酸序列的载体。
16.一种采用根据权利要求14所定义的核酸序列或根据权利要求15所定义的载体转化或转染的宿主细胞。
17.一种用于生产根据权利要求1至13中任一项所述的结合分子的方法，所述方法包括在允许根据权利要求1至13中任一项所定义的结合分子表达的条件下培养根据权利要求16所定义的宿主细胞并从培养物中回收产生的结合分子。
18.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1至13中任一项所述的结合分子或包含根据权利要求17所述的方法生产的结合分子。
19.根据权利要求1至13中任一项所述的结合分子或根据权利要求17所述的方法生产的结合分子，所述结合分子用于预防、治疗或改善选自浆细胞障碍、其它与BCMA表达有关的B细胞障碍和自身免疫性疾病的疾病。
20.一种用于治疗或改善选自浆细胞障碍、其它与BCMA表达有关的B细胞障碍和自身免疫性疾病的疾病的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用根据权利要求1至13中任一项所述的结合分子或根据权利要求17所述的方法生产的结合分子。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述浆细胞障碍选自：多发性骨髓瘤、浆细胞瘤、浆细胞白血病、巨球蛋白血症、淀粉样变性、华氏巨球蛋白血症、孤立性骨浆细胞瘤、髓外浆细胞瘤、骨硬化性骨髓瘤、重链病、意义不明确的单克隆丙种球蛋白病以及郁积型多发性骨髓瘤。
22.根据权利要求20所述的方法，其中所述自身免疫性疾病是全身性红斑狼疮。
23.一种试剂盒，所述试剂盒包含根据权利要求1至13中任一项所定义的结合分子、根据权利要求14所定义的核酸分子、根据权利要求15所定义的载体和/或根据权利要求16所定义的宿主细胞。
24.BCMA的表位簇3和表位簇4在结合分子生产中的用途，所述结合分子优选为能够结合至BCMA的抗体，其中BCMA的表位簇3对应于如SEQ ID NO：1002中所示序列的氨基酸残基24至41，BCMA的表位簇4对应于如SEQ ID NO：1002中所示序列的氨基酸残基42至54。
25.一种用于生产抗体，所述抗体优选为能够结合至BCMA的结合分子的方法，所述方法包括：
(a)用包含BCMA的表位簇3和表位簇4的多肽免疫动物，其中BCMA的表位簇3对应于如SEQ ID NO：1002中所示序列的氨基酸残基24至41，BCMA的表位簇4对应于如SEQ ID NO：1002中所示序列的氨基酸残基42至54；
(b)获得所述抗体，和
(c)可选地，将所述抗体转化为结合分子，所述结合分子能够结合至人BCMA，优选结合至T细胞CD3受体复合物。
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