CN114763383A

CN114763383A - 靶向人bcma的单克隆抗体及其应用

Info

Publication number: CN114763383A
Application number: CN202110044548.6A
Authority: CN
Inventors: 杨林; 游凤涛; 荆光军
Original assignee: Persongen Biotherapeutics Suzhou Co ltd
Current assignee: Persongen Biotherapeutics Suzhou Co ltd
Priority date: 2021-01-13
Filing date: 2021-01-13
Publication date: 2022-07-19
Anticipated expiration: 2041-01-13
Also published as: CN114763383B

Abstract

本发明提供了靶向人BCMA的单克隆抗体及其应用。具体地，本发明提供了一种靶向BCMA的抗体，其对人BCMA具有高亲和力和高特异性。本发明还提供了包含所述抗体的细胞和药物组合物，以及所述抗体的制备方法和应用。

Description

靶向人BCMA的单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及一种靶向人BCMA的单克隆抗体及其应用。

背景技术

B细胞表面成熟抗原(B-cell maturation antigen,BCMA)最早发现于成熟的B淋巴细胞表面，在其他组织细胞中几乎不表达。它在恶性增殖的B淋巴细胞(例如骨髓瘤细胞、白血病细胞)中高度表达。同时它通过介导下游信号通路，在细胞的存活、增殖、转移和耐药中起着关键性的作用，这些特性使得它成为免疫治疗的一个靶点，特别是对于多发性骨髓瘤的治疗。BCMA，由于其仅限于表达在浆细胞中，在天然的和记忆性B细胞中不表达的特性，已作为一个新的药物靶点用于诊断并治疗多发性骨髓瘤。目前，针对BCMA的新型肿瘤免疫治疗方法主要包括CAR-T(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy)疗法、双特异性抗体(Bispecific antibody,BsAb)和抗体药物偶联物(Antibody-drug coupl ing,ADC)。最近研究也表明了靶向BCMA的CAR-T能够在体内有效清除骨髓瘤细胞。

目前，关于BCMA抗体的研究还有很多不足，本领域需要开发新的BCMA抗体以及相关的应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种靶向人BCMA的单克隆抗体及其应用。

本发明的目的还在于提供一种BCMA人源化抗体，并进一步通过构建靶向BCMA的CAR-T或双特异抗体或抗体偶联药物，靶向治疗多发性骨髓瘤。

本发明的第一方面，提供了一种抗体的重链可变区，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：

SEQ ID NO:1所示的CDR1，

SEQ ID NO:2所示的CDR2，和

SEQ ID NO:3所示的CDR3。

在另一优选例中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个(如1-3个，较佳地1-2个，更佳地1个)氨基酸并能够保留BCMA结合亲和力的衍生序列。

在另一优选例中，所述重链可变区还包括人源的FR区或鼠源的FR区。

在另一优选例中，所述重链可变区具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述重链可变区具有SEQ ID NO:9-14所示的氨基酸序列。

本发明的第二方面，提供了一种抗体的重链，所述的重链具有如本发明第一方面所述的重链可变区。

在另一优选例中，所述的抗体的重链还包括重链恒定区。

在另一优选例中，所述的重链恒定区为人源、鼠源或兔源的。

本发明的第三方面，提供了一种抗体的轻链可变区，所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：

SEQ ID NO:4所示的CDR1’，

SEQ ID NO:5所示的CDR2’，和

SEQ ID NO:6所示的CDR3’。

在另一优选例中，所述轻链可变区还包括人源的FR区或鼠源的FR区。

在另一优选例中，所述轻链可变区具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述轻链可变区具有SEQ ID NO:15-20所示的氨基酸序列。

本发明的第四方面，提供了一种抗体的轻链，所述的轻链具有如本发明第三方面所述的轻链可变区。

在另一优选例中，所述的抗体的轻链还包括轻链恒定区。

在另一优选例中，所述的轻链恒定区为人源、鼠源或兔源的。

本发明的第五方面，提供了一种靶向BCMA的抗体，所述抗体具有：

(1)如本发明第一方面所述的重链可变区；和/或

(2)如本发明第三方面所述的轻链可变区；

或者，所述抗体具有：如本发明第二方面所述的重链；和/或如本发明第四方面所述的轻链。

在另一优选例中，所述抗体与人BCMA蛋白(优选野生型)结合的亲和力常数KD(M)为(1-10)×10^-10，较佳地为(1-5)×10^-10。

在另一优选例中，所述抗体选自：动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、或其组合。

在另一优选例中，所述的抗体为双链抗体、或单链抗体。

在另一优选例中，所述的抗体为单克隆抗体。

在另一优选例中，所述的抗体是部分或全人源化的单克隆抗体。

在另一优选例中，所述抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO：7所示；和/或所述的抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO：8所示。

在另一优选例中，所述抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO：10所示；并且所述的抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO：15所示。

在另一优选例中，所述抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO：12所示；并且所述的抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO：16所示。

在本发明的另一方面，提供了一种双特异性抗体，其包含本发明第五方面所述的靶向BCMA的抗体和第二抗体，所述的第二抗体靶向BCMA以外的其他肿瘤抗原。

在另一优选例中，所述的肿瘤抗原包括CD3、CD19。

在另一优选例中，所述的第二抗体为纳米抗体或scFv。

在另一优选例中，所述的第二抗体连接至所述靶向BCMA抗体的选自下组的区域：重链可变区、重链恒定区，或其组合。

本发明的第六方面，提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白具有：

(i)如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或本发明第五方面所述的抗体；以及

(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。

在另一优选例中，所述的标签序列包括6His标签。

在另一优选例中，所述的重组蛋白(或多肽)包括融合蛋白。

在另一优选例中，所述的重组蛋白为单体、二聚体、或多聚体。

本发明的第七方面，提供了一种CAR构建物，所述的CAR构建物的单克隆抗体抗原结合区域的scFV段为特异性结合于BCMA的结合区，并且所述scFv具有如本发明第一方面所述的重链可变区和如本发明第三方面所述的轻链可变区。

在另一优选例中，所述的嵌合抗原受体具有下式I结构：

L-scFv-H-TM-C-CD3ζ(I)

式中，

各“-”独立地为连接肽或肽键；

L为无或信号肽序列；

scFv为靶向BCMA的scFv；

H为任选的铰链区；

TM为跨膜结构域；

C为共刺激信号分子；

CD3ζ为CD3ζ胞浆信号传导序列。

本发明的第八方面，提供了一种重组的免疫细胞，所述的免疫细胞表达外源的如本发明第七方面所述的CAR构建物。

在另一优选例中，所述的免疫细胞选自下组：NK细胞、T细胞。

在另一优选例中，所述的免疫细胞来自人或非人哺乳动物(如鼠)。

本发明的第九方面，提供了一种抗体药物偶联物，所述的抗体药物偶联物含有：

(a)抗体部分，所述抗体部分选自下组：如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或本发明第五方面所述的抗体、或其组合；和

(b)与所述抗体部分偶联的偶联部分，所述偶联部分选自下组：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、或其组合。

在另一优选例中，所述的抗体部分与所述的偶联部分通过化学键或接头进行偶联。

本发明的第十方面，提供了一种活性成分的用途，所述活性成分选自下组：如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或本发明第五方面所述的抗体、如本发明第六方面所述的重组蛋白、如本发明第八方面所述的免疫细胞、如本发明第九方面所述的抗体药物偶联物、或其组合，所述活性成分用于(a)制备检测试剂或试剂盒；和/或(b)制备预防和/或治疗BCMA阳性肿瘤的药物。

在另一优选例中，所述肿瘤选自下组：血液肿瘤、实体瘤、或其组合。

在另一优选例中，所述血液肿瘤选自下组：急性髓细胞白血病(AML)、多发性骨髓瘤(MM)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴白血病(ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、或其组合。

在另一优选例中，所述实体瘤选自下组：胃癌、胃癌腹膜转移、肝癌、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、宫颈癌、卵巢癌、淋巴癌、鼻咽癌、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、脑胶质瘤、子宫内膜癌、睾丸癌、结直肠癌、尿路肿瘤、甲状腺癌、或其组合。

在另一优选例中，所述肿瘤为胃癌、乳腺癌、骨肉瘤。

在另一优选例中，所述的抗体为药物偶联物(ADC)形式。

在另一优选例中，所述检测试剂或试剂盒用于：

(1)检测样品中BCMA蛋白；和/或

(2)检测肿瘤细胞中内源性的BCMA蛋白；和/或

(3)检测表达BCMA蛋白的肿瘤细胞。

在另一优选例中，所述的检测试剂为检测片。

本发明的第十一方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物含有：

(i)活性成分，所述活性成分选自下组：如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或本发明第五方面所述的抗体、如本发明第六方面所述的重组蛋白、如本发明第八方面所述的免疫细胞、如本发明第九方面所述的抗体药物偶联物、或其组合；以及

(ii)药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的药物组合物为液态制剂。

在另一优选例中，所述的药物组合物为注射剂。

本发明的第十二方面，提供了一种多核苷酸，所述的多核苷酸编码选自下组的多肽：

(1)如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或本发明第五方面所述的抗体；或

(2)如本发明第六方面所述的重组蛋白；

(3)如本发明第七方面所述的CAR构建物。

在另一优选例中，所述的核苷酸序列如SEQ ID NO:21-32所示。

本发明的第十三方面，提供了一种载体，所述的载体含有如本发明第十二方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的载体包括：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒、或其他载体。

本发明的第十四方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，所述的宿主细胞含有如本发明第十三方面所述的载体或基因组中整合有如本发明第十二方面所述的多核苷酸。

本发明的第十五方面，提供了一种体外检测(包括诊断性或非诊断性)样品中BCMA蛋白的方法，所述方法包括步骤：

(1)在体外，将所述样品与如本发明第五方面所述的抗体或如本发明第九方面所述的抗体药物偶联物、接触；

(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在BCMA蛋白。

在另一优选例中，所述的方法是非诊断非治疗的。

本发明的第十六方面，提供了一种检测板，所述的检测板包括：基片(支撑板)和测试条，所述的测试条含有如本发明第五方面所述的抗体或如本发明第九方面所述的抗体药物偶联物。

本发明的第十七方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒中包括：

(1)第一容器，所述第一容器中含有如本发明第五方面所述的抗体；和/或

(2)第二容器，所述第二容器中含有抗如本发明第五方面所述的抗体的二抗；

或者，所述试剂盒含有如本发明第十六方面所述的检测板。

本发明的第十八方面，提供了一种重组多肽的制备方法，所述方法包括：

(a)在适合表达的条件下，培养如本发明第十四方面所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出重组多肽，所述的重组多肽是如本发明第五方面所述的抗体或如本发明第六方面所述的重组蛋白。

本发明的第十九方面，提供了一种预防和/或治疗BCMA阳性肿瘤的方法，所述方法包括：给需要的对象施用如本发明第五方面所述的抗体、所述抗体的抗体-药物偶联物、或表达所述抗体的CAR-T细胞、或其组合。

在另一优选例中，所述的方法还包括：给需要的对象施用其他药物或治疗方法进行联合治疗。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了小鼠免疫流程。

图2显示了重链表达载体pcDNA3.1-IgG1Fc，轻链表达载体pcDNA3.1-IgKc的载体示意图。

图3显示了免疫小鼠的FACS检测结果。

图4显示了杂交瘤融合板的ELISA检测结果。

图5显示了杂交瘤融合板的FACS检测结果。

图6显示了第一次亚克隆板的ELISA检测结果。

图7显示了第一次亚克隆的FACS检测结果。

图8显示了第二次亚克隆板的ELISA检测结果。

图9显示了嵌合抗体的FACS检测结果。

图10显示了人源化抗体的FACS检测结果。

图11显示了人源化抗体B1H2-B1L1和B1H4-B1L2的SDS-PAGE结果。

图12显示了人源化抗体B1H2-B1L1与鼠源抗体的比对结果。

图13显示了人源化抗体B1H4-B1L2与鼠源抗体的比对结果。

图14显示了配体偶联预富集结果。

图15显示了配体偶联结果。

图16显示了MH18100901-B1Chimeric的亲和力测定结果。

图17显示了MH18100901-B1H2-B1L1的亲和力测定结果。

图18显示了MH18100901-B1H4-B1L2的亲和力测定结果。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外地发现一种高亲和力高特异性的靶向BCMA的抗体，并制备了亲和力与嵌合抗体相当的人源化抗体。在此基础上完成了本发明。

术语

如本文所用，术语“给予”和“处理”是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物应用于动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体。“给予”和“处理”可以指治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触、以及试剂与流体的接触、流体与细胞的接触。“给予”和“处理”还意指通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理。“处理”当应用于人、动物或研究受试者时，是指治疗处理、预防或预防性措施，研究和诊断；包括BCMA抗体与人或动物、受试者、细胞、组织、生理区室或生理流体的接触。

如本文所用，术语“治疗”指给予患者内用或外用治疗剂，包含本发明的任何一种BCMA抗体及其组合物，所述患者具有一种或多种疾病症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，以有效缓解一种或多种疾病症状的治疗剂的量(治疗有效量)给予患者。

如本文所用，术语“任选”或“任选地”意味着随后所描述的事件或情况可以发生但不是必须发生。例如，“任选包含1-3个抗体重链可变区”是指特定序列的抗体重链可变区可以有但不是必须有，可以是1个、2个或3个。

抗体

如本文所用，术语“抗体”指免疫球蛋白，是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的不同种型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ、和μ。IgG代表免疫球蛋白中最重要的一类，由于化学结构和生物功能差异，它又可以分为4个子类：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。轻链通过恒定区的不同分为κ或λ链。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是本领域人员所熟知的。

抗体重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区(V区)；靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区(C区)。可变区包括3个高变区(HVR)和4个序列相对保守的FR区(FR)。4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。3个高变区决定抗体的特异性，又称为互补性决定区(CDR)。每条轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)由3个CDR区和4个FR区组成，从氨基端到羧基端依次排列的顺序为FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。轻链的3个CDR区，即轻链高变区(LCDR),指LCDR1、LCDR2和LCDR3；重链的3个CDR区，即重链高变区(HCDR),指HCDR1、HCDR2和HCDR3。发明所述的抗体或抗原结合片段的LCVR和HCVR区的CDR氨基酸残基在数量和位置符合已知的Kabat编号规则(LCDR1-3，HCDR2-3)，或者符合kabat和chothia的编号规则(HCDR1)。天然重链和轻链可变区中的四个FR区大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。

如本文所用，术语“抗原结合片段”，指具有抗原结合活性的Fab片段，Fab’片段，F(ab’)2片段，或单一Fv片段。Fv抗体含有抗体重链可变区、轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般的，Fv抗体还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。

如本文所用，术语“抗原决定簇”指抗原上不连续的，由本发明抗体或抗原结合片段识别的三维空间位点。

本发明不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。

在本发明中，抗体包括用本领域技术人员熟知技术所制备的鼠的、嵌合的、人源化的或者全人的抗体。重组抗体，例如嵌合的和人源化的单克隆抗体，包括人的和非人的部分，可以采用本领域熟知的DNA重组技术制备。

如本文所用，术语“单克隆抗体”指得自单个细胞来源的克隆分泌的抗体。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原表位。所述的细胞可能是真核的、原核的或噬菌体的克隆细胞株。

如本文所用，术语“嵌合抗体”是由鼠源性抗体的V区基因与人抗体的C区基因拼接为嵌合基因，然后插入载体，转染宿主细胞表达的抗体分子。既保留了亲本鼠抗体的高特异性和亲和力，又使其人源Fc段能有效介导生物学效应功能。

如本文所用，术语“人源化抗体”，是本发明鼠抗的一种可变区改造形式，具有源自(或基本上源自)非人类抗体(优选小鼠单克隆抗体)的CDR区，和基本源自人源抗体序列的FR区和恒定区；即将鼠抗的CDR区序列嫁接到不同类型的人种系抗体构架序列上。因为CDR序列负责大部分的抗体-抗原相互作用，所以可以通过构建表达载体来表达模拟特定天然存在的抗体性质的重组抗体。

在本发明中，抗体可以是单特异性、双特异性、三特异性、或者更多的多重特异性。

在本发明中，本发明的抗体还包括其保守性变异体，指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。

表A

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

抗BCMA抗体

如本文所用，术语“BCMA”一般是指天然的或重组的人BCMA，以及人BCMA的非人同源物。

本发明提供一种针对BCMA的高特异性和高亲和力的抗体，其包括重链和轻链，所述重链含有重链可变区(VH)氨基酸序列，所述轻链含有轻链可变区(VL)氨基酸序列。

优选地，重链可变区(VH)的CDR选自下组：

SEQ ID NO:1所示的CDR1，

SEQ ID NO:2所示的CDR2，和

SEQ ID NO:3所示的CDR3；和/或

轻链可变区(VL)的CDR选自下组：

SEQ ID NO:4所示的CDR1’，

SEQ ID NO:5所示的CDR2’，和

SEQ ID NO:6所示的CDR3’。

其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个(如1-5、1-3个，较佳地1-2个，更佳地1个)氨基酸的具有BCMA结合亲和力的衍生序列。

在另一优选例中，所述经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸序列所形成的序列优选为同源性为至少80％，较佳地至少85％，更佳地至少为90％，最佳地至少95％的氨基酸序列。

本发明的抗体可以是双链或单链抗体，并且可以是选自动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体，更优选为人源化抗体、人-动物嵌合抗体，更优选为全人源化抗体。

本发明所述抗体衍生物可以是单链抗体、和/或抗体片段，如：Fab、Fab’、(Fab’)₂或该领域内其他已知的抗体衍生物等，以及IgA、IgD、IgE、IgG以及IgM抗体或其他亚型的抗体中的任意一种或几种。

其中，所述动物优选为哺乳动物，如鼠。

本发明抗体可以是靶向人BCMA的鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、CDR嫁接和/或修饰的抗体。

抗体的制备

任何适于产生单克隆抗体的方法都可用于产生本发明的抗BCMA抗体。例如，可以用BCMA或其片段免疫动物。可以使用合适的免疫接种方法，包括佐剂、免疫刺激剂、重复加强免疫接种，可以使用一种或多种途径。

任何合适形式的BCMA(BCMA-Fc重组蛋白)都可以作为免疫原(抗原)，用于产生对BCMA特异的非人抗体，筛选所述抗体的生物学活性。激发免疫原可以是全长的成熟人BCMA，包括天然的同源二聚体，或含单个/多个表位的肽。免疫原可以单独使用，或与本领域已知的一种或多种免疫原性增强剂组合使用。免疫原可以由天然来源纯化，或者在遗传修饰的细胞中产生。编码免疫原的DNA在来源上可以是基因组或非基因组的(例如cDNA)。可以使用合适的遗传载体表达编码免疫原的DNA，所述载体包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、杆状病毒载体、质料和非病毒载体。

人源化抗体可以选自任何种类的免疫球蛋白，包括IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在本发明中，抗体是IgG抗体，使用IgG1亚型。通过用下文实施例中描述的生物学测定筛选抗体易于实现必需恒定结构域序列的最优化，以产生所需生物学活性。

同样，任一类轻链都可以在本文的化合物和方法中使用。具体地说，κ、λ链或其变体在本发明的化合物和方法中是可以用的。

本发明抗体或其片段的DNA分子的序列可以用常规技术，比如利用PCR扩增或基因组文库筛选等方法获得。此外，还可将轻链和重链的编码序列融合在一起，形成单链抗体。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。

本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。优选的动物细胞包括(但并不限于)：CHO-S、CHO-K1、HEK-293细胞。

本发明中所述的用重组DNA转化宿主细胞的步骤可用本领域熟知的技术进行。获得的转化子可用常规方法培养，转化子表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，用常规培养基在合适的条件下培养。

通常，在适合本发明抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞。然后用常规的免疫球蛋白纯化步骤，如蛋白A-Sepharose、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、离子交换层析、疏水层析、分子筛层析或亲和层析等本领域技术人员熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的抗体。

所得单克隆抗体可用常规手段来鉴定。比如，单克隆抗体的结合特异性可用免疫沉淀或体外结合试验(如放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA))来测定。

抗体-药物偶联物(ADC)

本发明还提供了基于本发明抗体的抗体偶联药物(antibody-drug conjugate，ADC)。

典型地，所述抗体偶联药物包括所述抗体、以及效应分子，所述抗体与所述效应分子偶联，并优选为化学偶联。其中，所述效应分子优选为具有治疗活性的药物。此外，所述效应分子可以是毒蛋白、化疗药物、小分子药物或放射性核素中的一种或多种。

本发明抗体与所述效应分子之间可以是通过偶联剂进行偶联。所述偶联剂的例子可以是非选择性偶联剂、利用羧基的偶联剂、肽链、利用二硫键的偶联剂中的任意一种或几种。所述非选择性偶联剂是指使效应分子和抗体形成共价键连接的化合物，如戊二醛等。所述利用羧基的偶联剂可以是顺乌头酸酐类偶联剂(如顺乌头酸酐)、酰基腙类偶联剂(偶联位点为酰基腙)中的任意一种或几种。

抗体上某些残基(如Cys或Lys等)用于与多种功能基团相连，其中包括成像试剂(例如发色基团和荧光基团)，诊断试剂(例如MRI对比剂和放射性同位素)，稳定剂(例如乙二醇聚合物)和治疗剂。抗体可以被偶联到功能剂以形成抗体-功能剂的偶联物。功能剂(例如药物，检测试剂，稳定剂)被偶联(共价连接)至抗体上。功能剂可以直接地、或者是通过接头间接地连接于抗体。

抗体可以偶联药物从而形成抗体药物偶联物(ADCs)。典型地，ADC包含位于药物和抗体之间的接头。接头可以是可降解的或者是不可降解的接头。可降解的接头典型地在细胞内环境下容易降解，例如在目标位点处接头发生降解，从而使药物从抗体上释放出来。合适的可降解的接头包括，例如酶降解的接头，其中包括可以被细胞内蛋白酶(例如溶酶体蛋白酶或者内体蛋白酶)降解的含有肽基的接头，或者糖接头例如，可以被葡糖苷酸酶降解的含葡糖苷酸的接头。肽基接头可以包括，例如二肽，例如缬氨酸-瓜氨酸，苯丙氨酸-赖氨酸或者缬氨酸-丙氨酸。其它合适的可降解的接头包括，例如，pH敏感接头(例如pH小于5.5时水解的接头，例如腙接头)和在还原条件下会降解的接头(例如二硫键接头)。不可降解的接头典型地在抗体被蛋白酶水解的条件下释放药物。

连接到抗体之前，接头具有能够和某些氨基酸残基反应的活性反应基团，连接通过活性反应基团实现。巯基特异性的活性反应基团是优选的，并包括：例如马来酰亚胺类化合物，卤代酰胺(例如碘、溴或氯代的)；卤代酯(例如碘、溴或氯代的)；卤代甲基酮(例如碘、溴或氯代)，苄基卤代物(例如碘、溴或氯代的)；乙烯基砜，吡啶基二硫化物；汞衍生物例如3,6-二-(汞甲基)二氧六环，而对离子是醋酸根、氯离子或者硝酸根；和聚亚甲基二甲基硫醚硫代磺酸盐。接头可以包括，例如，通过硫代丁二酰亚胺连接到抗体上的马来酰亚胺。

药物可以是任何细胞毒性，抑制细胞生长或者免疫抑制的药物。在实施方式中，接头连接抗体和药物，而药物具有可以和接头成键的功能性基团。例如，药物可以具有可以和连接物成键的氨基，羧基，巯基，羟基，或者酮基。在药物直接连接到接头的情况下，药物在连接到抗体之前，具有反应的活性基团。

有用的药物类别包括，例如，抗微管蛋白药物、DNA小沟结合试剂、DNA复制抑制剂、烷化试剂、抗生素、叶酸拮抗物、抗代谢药物、化疗增敏剂、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱等。在本发明中，药物-接头可以用于在一个简单步骤中形成ADC。在其它实施方式中，双功能连接物化合物可以用于在两步或多步方法中形成ADC。例如，半胱氨酸残基在第一步骤中与接头的反应活性部分反应，并且在随后的步骤中，接头上的功能性基团与药物反应，从而形成ADC。

通常，选择接头上功能性基团，以利于特异性地与药物部分上的合适的反应活性基团进行反应。作为非限制性的例子，基于叠氮化合物的部分可以用于特异性地与药物部分上的反应性炔基基团反应。药物通过叠氮和炔基之间的1,3-偶极环加成，从而共价结合于接头。其它的有用的功能性基团包括，例如酮类和醛类(适合与酰肼类和烷氧基胺反应)，膦(适合与叠氮反应)；异氰酸酯和异硫氰酸酯(适合与胺类和醇类反应)；和活化的酯类，例如N-羟基琥珀酰亚胺酯(适合与胺类和醇类反应)。这些和其它的连接策略，例如在《生物偶联技术》，第二版(Elsevier)中所描述的，是本领域技术人员所熟知的。本领域技术人员能够理解，对于药物部分和接头的选择性反应，当选择了一个互补对的反应活性功能基团时，该互补对的每一个成员既可以用于接头，也可以用于药物。

本发明还提供了制备ADC的方法，可进一步地包括：将抗体与药物-接头化合物，在足以形成抗体偶联物(ADC)的条件下进行结合。

在某些实施方式中，本发明方法包括：在足以形成抗体-接头偶联物的条件下，将抗体与双功能接头化合物进行结合。在这些实施方式中，本发明方法还进一步地包括：在足以将药物部分通过接头共价连接到抗体的条件下，将抗体接头偶联物与药物部分进行结合。

在一些实施方式中，抗体药物偶联物ADC如下分子式所示：

其中：

Ab是抗体，

LU是接头；

D是药物；

而且下标p是选自1到8的值。

药物组合物

本发明还提供了一种组合物。在优选例中，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白或其ADC或相应的CAR-T细胞，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。

本发明所述抗体也可以是由核苷酸序列在细胞内表达用于的细胞治疗，比如，所述抗体用于嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(CAR-T)等。

本发明的药物组合物可直接用于结合BCMA蛋白分子，因而可用于预防和治疗BCMA阳性肿瘤。此外，还可同时使用其他治疗剂。

本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％,较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的单克隆抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。

使用药物组合物时，是将安全有效量的药物组合物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约20毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

检测用途和试剂盒

本发明的抗体可用于检测应用，例如用于检测样本，从而提供诊断信息。

本发明中，所采用的样本(样品)包括细胞、组织样本和活检标本。本发明使用的术语“活检”应包括本领域技术人员已知的所有种类的活检。因此本发明中使用的活检可以包括例如通过内窥镜方法或器官的穿刺或针刺活检制备的组织样本。

本发明中使用的样本包括固定的或保存的细胞或组织样本。

本发明还提供了一种指含有本发明的抗体(或其片段)的试剂盒，在本发明的一个优选例中，所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。在优选例中，本发明的抗体可以固定于检测板。

本发明的主要优点包括：

(a)开发了一种靶向人BCMA的新的鼠源单克隆抗体。

(b)开发了一种靶向人BCMA单克隆抗体的人源化抗体序列。

(c)本发明开发的人源化抗体序列构建的双特异抗体、或CAR-T细胞、或抗体偶联药物，与用鼠源抗体序列构建的药物相比，可以降低药物在体内的排斥反应，进一步提高疗效。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

通用材料和方法：

1.实施例中使用的主要试剂如下：

PBS(Gibco,CAT#14190-250)

DMEM(Gibco,CAT#41965-062)

F12K(Gibco,CAT#21127030)

FBS(Gibco,CAT#10099-141)

基因组DNA纯化试剂盒(Thermo，CAT#K0512)

T4 DNA Ligase(Takara,CAT#2011B)

重组人BCMA蛋白(His Tag)(由iCarTab制备)

重组人BCMA蛋白(Fc Tag)(由iCarTab制备)

PrimeScriptTM 1st Strand cDNA合成试剂盒(Takara,Cat#6110A)Trizol RNA提取试剂(Thermo,CAT#15596018)

Q5 PCR克隆试剂盒(NEB,Cat#E0555S)

AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒(Axygen,Cat#AP-GX-250G)

BamHI限制性内切酶(NEB,CAT#R3136M)

KpnI限制性内切酶(NEB,CAT#R3142M)

TOP10感受态(由iCarTab制备)

pcDNA3.1-IgG1Fc载体(由iCarTab制备)

pcDNA3.1-IgKc载体(由iCarTab制备)

PE-Anti-人IgG(Biolegend,CAT#409304)

PE-Anti-鼠IgG(MultiSciences,CAT#70-GAM0041)

FreeStyle^TM293表达培养基(Thermo,CAT#12338018)

LVtransm转染试剂(iCarTab,Cat#LVTran100)

缓冲液：HBS-EP+10X(GE,Cat#BR100669)

氨基偶联试剂盒(GE,Cat#BR100050)

10mM Glycine 2.5(GE,Cat#BR100356)

S系列CM5芯片(GE,Cat#29149603)

2.实施例中使用的主要设备如下：

普通光学倒置显微镜

台式离心机Thermo ST41

高速离心机Thermo RC6+

生物安全柜

Roche480荧光定量PCR仪

Thermo Attune Nxt流式细胞仪

Thermo 3111 CO2培养箱

BiaCore T200

3.实施例中涉及的主要方法如下：

3.1杂交瘤筛选

3.1.1小鼠免疫

小鼠免疫流程如图1所示。

所有小鼠饲养于屏障系统中，使用灭菌颗粒饲料和高压灭菌饮用水进行饲养。取5只Balb/c小鼠(SPF级)用耳标标记，并按上述的免疫流程，使用纯化的BCMA-Fc重组蛋白进行免疫。

3.1.2免疫效价检测

1)从笼子内取出小鼠，使用75％的医用酒精棉球对小鼠的尾部消毒，使用5mm的采血针在小鼠的尾部刺出一个小的创口；

2)使用毛细玻璃采血管收集血滴(需制备100uL血浆)；

3)采集完血液后，使用干的无菌棉球轻轻压迫采血点止血后，将小鼠还至笼内稍作观察；

4)将收集有血液样本的离心管置于37℃培养箱内放置1小时；然后将血液样本转移至4℃过夜。

5)将血清从血块中分离，并转移至一个新的无菌离心管中，4℃、10000xg离心10min；

6)将血清转移至一个新的无菌离心管中，采用FACS检测免疫效价。

3.1.3 FACS检测

1.从液氮中复苏CHO-K1空细胞及CHO-K1-BCMA重组细胞株，使用F12K、10％FBS完全培养基调整细胞状态至对数生长期。

2.将两种细胞分别分为若干份，每份细胞的数量为5×10⁵个细胞，分别加入稀释好的小鼠血清(1:1000稀释)，充分混匀后，室温孵育1小时。

3.800xg室温离心5分钟，去掉含有抗体的上清，使用PBS洗涤细胞3次；

4.加入1uL PE标记的Anti-mouse IgG，充分混匀后，室温避光孵育30min；

5.800xg室温离心5分钟，去掉含有二抗的上清，使用PBS洗涤细胞3次；

6.使用500uL PBS重悬细胞，进行流式分析。

3.1.4杂交瘤融合

1)取免疫效价检测最好的小鼠颈部脱臼处死，无菌条件下获得小鼠脾脏，制备B细胞单细胞悬液，并以1:1的比例与非抗体分泌性SP2/0骨髓瘤细胞混合，使用Bio-rad GenePulser电穿孔系统进行细胞融合。

2)电融合后，所有细胞立即悬浮在完全培养基(DMEM，20％FBS和HAT)中，并接种至96孔板中。

3)融合后约10天改为HT培养基，培养两天后，取上清检测特异性抗体。

3.1.5杂交瘤筛选

从96孔板的每个孔中取出120uL培养基上清，同时向每个孔内补充新鲜的HT培养基。将取出的培养基上清与预包被目的抗原的ELISA孔板进行孵育，按照标准的ELISA操作步骤进行鉴定。选择O.D值较高的孔进行第二轮及第三轮亚克隆。每轮亚克隆结束后，均参照相同的步骤进行ELISA鉴定，直至单克隆形成。

3.1.6 ELISA检测

1)使用无菌PBS稀释BCMA-His重组蛋白至终浓度为1ug/mL。取一块新的96孔板，加入100uL/孔4℃包被过夜。

2)去掉抗原包被液，使用PBST(含0.5％的吐温)洗涤3次。

3)加入200uL/孔的3％BSA 37℃封闭2小时；

4)去掉封闭缓冲液后，使用PBST洗涤孔板3次；

5)加入100ul杂交瘤上清，室温孵育1小时，对照孔为PBS；

6)去掉孔内的液体，并使用PBST洗涤3次；

7)加入100uL HRP-mouse IgG(1:10000稀释)，室温孵育1小时；

8)去掉孔内的液体后，使用PBST洗涤孔板3次；

9)加入100uL/孔TMB显色液；

10)室温避光孵育15分钟；

11)加入50uL/孔终止液；

12)使用酶标仪读取孔内的O.D值。

3.1.7杂交瘤克隆流式检测

1)从液氮中复苏CHO-K1-BCMA细胞株，使用F12K、10％FBS完全培养基调整细胞状态至对数生长期。

2)将CHO-K1-BCMA细胞株分为若干份，每份细胞的数量为5×10⁵个细胞，分别使用100uL杂交瘤上清孵育靶细胞，充分混匀后，室温孵育1小时。

3)800xg室温离心5分钟，去掉含有抗体的上清，使用PBS洗涤细胞3次。

4)加入0.5uL PE标记的Anti-mouse IgG，充分混匀后，室温避光孵育30分钟；

5)800xg室温离心5分钟，去掉含有二抗的上清，使用PBS洗涤细胞3次；

6)使用500uL PBS重悬细胞，进行流式分析。

3.2杂交瘤测序

1)取5x10⁶个最终筛选获得的杂交瘤细胞，使用Trizol进行裂解，参照标准方法提取杂交瘤细胞的总RNA。

2)使用逆转录试剂盒将总RNA逆转录为cDNA样品后，使用杂交瘤测序引物采用PCR法将抗体的重链和轻链可变区扩增出来，然后进行TA克隆，将PCR获得的片段亚克隆至pMD-19T载体中。蓝白斑筛选后，每条链分别挑取10个克隆进行测序。并对最终获取的抗体序列进行分析。

3.3鼠抗人源化

3.3.1人源化抗体序列设计

根据上述测序获取到的目的抗体重链和轻链的氨基酸序列信息进行人源化设计，保留原始抗体的CDR区序列不变，根据germline al ignment的结果以及抗体结构模拟的结果，重链和轻链分别选择不同的人源抗体模版，并在人源化之后的框架区进行回复突变，设计候选的人源化抗体序列。

3.3.2人源化抗体基因合成及表达载体构建

将上述设计的人源化抗体的重链和轻链分别进行基因合成，重链亚克隆至pcDNA3.1-IgG1Fc表达载体，轻链亚克隆至pcDNA3.1-IgKc表达载体(载体示意图如图2所示)。载体经测序验证无误后，使用Qiagen质粒大抽试剂盒制备无内毒素质粒。

3.3.3人源化抗体表达及纯化

1.从冰箱中取出LVTransm转染试剂及抗体表达载体，室温解冻后，用移液枪上下吹打完全混匀。取出PBS或HBSS缓冲液，温热至室温。取2mL PBS至6孔板的一个孔，分别加入2μg pcDNA3.1-IgG1Fc和2μg pcDNA3.1-IgKc，移液枪上下吹打充分混匀后，加入12μLLVTransm，立即用移液器上下吹打混匀，室温下静置10分钟。

2.将上述DNA/LVTransm复合物加入到1.5mL 293F-SVP16细胞中，轻轻晃动充分混匀。将细胞置于37℃、5％CO₂培养箱，130RPM培养6-8小时后，加入1.5mL新鲜的FreeStyle^TM293表达培养基，将细胞重新放回培养箱中继续培养。

3.连续培养3天后，离心收集培养基上清，用0.45μm的滤膜过滤，滤液转至无菌离心管中，进行流式检测。

3.3.4流式鉴定人源化抗体与靶蛋白的结合

2.将两种细胞分别分为若干份，每份细胞的数量为5×10⁵个细胞，分别加入人源化抗体，每个抗体均需与CHO-K1空细胞及CHO-K1-BCMA重组细胞株孵育，充分混匀后，室温孵育1小时。

4.加入2uL PE标记的Anti-human IgG，充分混匀后，室温避光孵育30min；

6.使用500uL PBS重悬细胞，进行流式分析。

3.3.5人源化抗体亲和力检测

将BCMA-Fc重组蛋白使用10mM醋酸偶联缓冲液固定在CM5芯片上，以上述制备的流式鉴定阳性的人源化抗体及人鼠嵌合抗体作为流动相，检测人源化前后抗体与靶蛋白BCMA的结合能力。

实施例1小鼠免疫效价FACS检测

按照上述方法对小鼠进行免疫，从所有免疫小鼠的尾静脉分离血清，按照1:1000进行稀释，分别与CHO-K1和CHO-K1-BCMA细胞进行FACS检测。

FACS检测结果如图3所示，根据实验结果选择29号小鼠进行冲击免疫以及后续的杂交瘤融合。

实施例2融合板ELISA检测

从融合后的孔板中取100uL上清，采用预包被目标抗原的96孔板进行ELISA检测。

融合克隆的ELISA检测结果如图4所示。

根据融合克隆ELISA检测结果，选择OD值高以及生长较好的克隆与CHO-K1-BCMA细胞株进行FACS验证和第一次亚克隆。

融合克隆的FACS检测结果如图5所示，

实施例3第一次亚克隆

从第一次亚克隆后的孔板中取100uL上清，采用预包被目标抗原的96孔板进行ELISA检测。

第一次亚克隆的ELISA检测结果如图6所示。

根据第一次亚克隆ELISA检测结果，选择OD值高以及生长较好的克隆与CHO-K1-BCMA细胞株进行FACS验证和第二次亚克隆。

FACS检测结果如图7所示。

实施例4第二次亚克隆

从第二次亚克隆后的孔板中取100uL上清，采用预包被目标抗原的96孔板进行ELISA检测。

第二次亚克隆的ELISA检测结果如图8所示。

实施例5杂交瘤测序

挑选FACS鉴定结果好的克隆(1-D2-C8-E5，命名为B1)进行扩增，使用TRIZOL试剂裂解，提取RNA并逆转录为cDNA后，使用杂交瘤测序引物对该杂交瘤抗体对应的重链和轻链可变区进行测序，分析其中的CDR区和Framework区，结果如下。

重链氨基酸序列：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4

EVQLQQSGPGLVKPSQSLSLTCTVSGYSITSDYVWNWIRQFPGNKLEWMAYISYSGSTSYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATFYCAVYNYDGIFAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO.:7)

其中，下划线示出的氨基酸序列为CDR区，具体包括：

VH CDR1：SDYVWN(SEQ ID NO.:1)

VH CDR2：YISYSGSTSYNPSLKS(SEQ ID NO.:2)

VH CDR3：YNYDGIFAY(SEQ ID NO.:3)

轻链氨基酸序列：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4

DVQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPWTFGGGTKLKICT(SEQ ID NO.:8)

其中，下划线示出的氨基酸序列为CDR区，具体包括：

VL CDR1：RASQDISNYLN(SEQ ID NO.:4)

VL CDR2：YTSRLHS(SEQ ID NO.:5)

VL CDR3：QQGNTLPWT(SEQ ID NO.:6)

实施例6嵌合抗体表达载体的构建和FACS验证

将测序获得抗体序列构建嵌合表达载体，表达嵌合抗体进行验证。将杂交瘤测序获得的重链可变区亚克隆至pcDNA3.1-IgG1Fc表达载体，轻链可变区亚克隆至pcDNA3.1-IgKc表达载体。将构建好的轻链和重链表达载体分别进行两两组合。瞬时共转293F细胞，转染48小时后，收集表达的上清进行FACS检测。

FACS检测结果如图9所示。

实施例7人源化抗体流式细胞检测

按照通用方法中的记载进行人源化抗体序列设计，共设计了6条人源化重链可变区和6条人源化轻链可变区。

其中，人源化候选抗体核酸序列信息如下：

>H1

CAGGTTCAGCTGCAAGAGTCTGGCCCTGGCCTGGTCAAGCCTAGCCAAACACTGAGCCTGACCTGTACCGTGTCCGGCTACAGCATCACCAGCGACTACGTGTGGAACTGGATCAGACAGCCTCCTGGCAAAGGCCTGGAATGGATCGGCTACATCAGCTACAGCGGCAGCACCAGCTACAACCCCAGCCTGAAGTCCAGAGTGACCATCAGCGTGGACACCAGCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACAGCCGCCGATACAGCCGTGTACTACTGCGCCAGATACAACTACGACGGCATCTTCGCCTATTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACAGTTAGC(SEQ ID NO.:21)

>H2

CAGGTTCAGCTGCAAGAGTCTGGCCCTGGCCTGGTCAAGCCTAGCCAAACACTGAGCCTGACCTGTACCGTGTCCGGCTACAGCATCACCAGCGACTACGTGTGGAACTGGATCAGACAGCCTCCTGGCAAAGGCCTGGAATGGATCGGCTACATCAGCTACAGCGGCAGCACCAGCTACAACCCCAGCCTGAAGTCCAGAGTGACCATCAGCGTGGACACCAGCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACAGCCGCCGATACAGCCGTGTACTACTGCGCCGTGTACAACTACGACGGCATCTTCGCCTATTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACAGTTAGC(SEQ ID NO.:22)

>H3

CAGGTTCAGCTGCAAGAGTCTGGCCCTGGCCTGGTCAAGCCTAGCGAAACACTGAGCCTGACCTGTACCGTGTCCGGCTACAGCATCACCAGCGACTACGTGTGGAACTGGATCAGACAGCCTCCTGGCAAAGGCCTGGAATGGATCGGCTACATCAGCTACAGCGGCAGCACCAGCTACAACCCCAGCCTGAAGTCCAGAGTGACCATCAGCGTGGACACCAGCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACAGCCGCCGATACAGCCGTGTACTACTGCGCCAGATACAACTACGACGGCATCTTCGCCTATTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACAGTTAGC(SEQ ID NO.:23)

>H4

CAGGTTCAGCTGCAAGAGTCTGGCCCTGGCCTGGTCAAGCCTAGCGAAACACTGAGCCTGACCTGTACCGTGTCCGGCTACAGCATCACCAGCGACTACGTGTGGAACTGGATCAGACAGCCTCCTGGCAAAGGCCTGGAATGGATCGGCTACATCAGCTACAGCGGCAGCACCAGCTACAACCCCAGCCTGAAGTCCAGAGTGACCATCAGCGTGGACACCAGCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACAGCCGCCGATACAGCCGTGTACTACTGCGCCGTGTACAACTACGACGGCATCTTCGCCTATTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACAGTTAGC(SEQ ID NO.:24)

>H5

CAGATCACCCTGAAAGAGTCTGGCCCCACACTGGTCAAGCCCACACAGACCCTGACACTGACCTGCACCTTTAGCGGCTACAGCATCACCAGCGACTACGTGTGGAACTGGATCAGACAGCCTCCTGGCAAGGCCCTGGAATGGCTGGCCTACATCAGCTACAGCGGCAGCACCAGCTACAACCCCAGCCTGAAAAGCCGGCTGACCATCACCAAGGACACCAGCAAGAACCAGGTGGTGCTGACCATGACAAACATGGACCCCGTGGACACCGCCACCTACTACTGCGCCCACTACAACTACGACGGCATCTTCGCCTATTGGGGCCAGGGCACACTCGTGACAGTTAGC(SEQ ID NO.:25)

>H6

CAGATCACCCTGAAAGAGTCTGGCCCCACACTGGTCAAGCCCACACAGACCCTGACACTGACCTGCACCTTTAGCGGCTACAGCATCACCAGCGACTACGTGTGGAACTGGATCAGACAGCCTCCTGGCAAGGCCCTGGAATGGCTGGCCTACATCAGCTACAGCGGCAGCACCAGCTACAACCCCAGCCTGAAAAGCCGGCTGACCATCACCAAGGACACCAGCAAGAACCAGGTGGTGCTGACCATGACAAACATGGACCCCGTGGACACCGCCACCTACTACTGCGCCGTGTACAACTACGACGGCATCTTCGCCTATTGGGGCCAGGGCACACTCGTGACAGTTAGC(SEQ ID NO.:26)

>L1

GACATCCAGATGACACAGAGCCCTAGCAGCCTGTCTGCCAGCGTGGGAGACAGAGTGACCATCACCTGTAGAGCCAGCCAGGACATCAGCAACTACCTGAACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTACTACACCAGCAGACTGCACAGCGGCGTGCCCAGCAGATTTTCTGGCTCTGGCAGCGGCACCGACTTCACCTTCACCATATCTAGCCTGCAGCCTGAGGATATCGCCACCTACTACTGCCAGCAGGGCAACACCCTGCCTTGGACATTTGGCGGCGGAACAAAGGTG(SEQ ID NO.:27)

>L2

GACATCCAGATGACACAGAGCCCTAGCAGCCTGTCTGCCAGCGTGGGAGACAGAGTGACCATCACCTGTAGAGCCAGCCAGGACATCAGCAACTACCTGAACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTACTACACCAGCAGACTGCACAGCGGCGTGCCCAGCAGATTTTCTGGCTCTGGCAGCGGCACCGACTTCACCTTTACAATCAGCAGCCTGCAGCAAGAGGATATCGCCACCTACTACTGCCAGCAGGGCAACACCCTGCCTTGGACATTTGGCGGCGGAACAAAGGTG(SEQ ID NO.:28)

>L3

GACATCCAGATGACACAGAGCCCTAGCAGCCTGTCTGCCAGCGTGGGAGACAGAGTGACCATCACCTGTAGAGCCAGCCAGGACATCAGCAACTACCTGAACTGGTATCAGCAGAAACCCGGCAAGGTGCCCAAGCTGCTGATCTACTACACCAGCAGACTGCACAGCGGCGTGCCCAGCAGATTTTCTGGCTCTGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATATCTAGCCTGCAGCCTGAGGACGTGGCCACCTACTATTGCCAGCAGGGCAATACCCTGCCTTGGACCTTTGGCGGCGGAACAAAACTG(SEQ ID NO.:29)

>L4

GACATCCAGATGACACAGAGCCCTAGCAGCCTGTCTGCCAGCGTGGGAGACAGAGTGACCATCACCTGTAGAGCCAGCCAGGACATCAGCAACTACCTGAACTGGTATCAGCAGAAACCTGGCGGCGTGCCCAAGCTGCTGATCTACTACACAAGCAGACTGCACAGCGGAGTGCCCAGCAGATTTTCTGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGACCATATCTAGCCTGCAGCCTGAGGACGTGGCCACCTACTATTGCCAGCAGGGCAATACCCTGCCTTGGACCTTTGGCGGCGGAACAAAACTG(SEQ ID NO.:30)

>L5

GACATCCAGATGACACAGAGCCCTAGCAGCGTGTCCGCCTCTGTGGGAGACAGAGTGACCATCACCTGTAGAGCCAGCCAGGACATCAGCAACTACCTGAACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTACTACACCAGCAGACTGCACAGCGGCGTGCCCAGCAGATTTTCTGGCTCTGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATATCTAGCCTGCAGCCTGAGGACTTCGCCACCTACTATTGCCAGCAGGGCAACACCCTGCCTTGGACATTTGGCCAGGGCACCAAACTG(SEQ ID NO.:31)

>L6

GACATCCAGATGACACAGAGCCCTAGCAGCGTGTCCGCCTCTGTGGGAGACAGAGTGACCATCACCTGTAGAGCCAGCCAGGACATCAGCAACTACCTGAACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTACTACACCAGCAGACTGCACAGCGGCGTGCCCAGCAGATTTTCTGGCTCTGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACAATCTCTAGCCTGCAGCAAGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGGGCAATACCCTGCCTTGGACATTTGGCCAGGGCACCAAACTG(SEQ ID NO.:32)

人源化候选抗体氨基酸序列信息：

>H1

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>H2

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>H3

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>H4

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>H5

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>H6

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>L1

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>L4

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>L5

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>L6

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQQEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKL(SEQ ID NO.:20)

将人源化的抗体表达载体瞬时转染293F细胞后，收集培养基上清，采用流式细胞仪检测人源化后抗体与重组细胞CHO-K1-BCMA细胞膜表面的抗原结合情况。以原始鼠源抗体VH和VL构建的人鼠嵌合抗体作为对照。

FACS检测结果如图10所示，BCMA人源化抗体均与重组CHO-K1-BCMA细胞结合。选择组合B1H2-B1L1和B1H4-B1L2表达纯化抗体进行后续亲和力检测。

人源化抗体B1H2-B1L1和B1H4-B1L2的SDS-PAGE结果如图11所示。

将抗体人源化前后的序列进行对比，B1H2-B1L1的比对结果如图12所示，B1H4-B1L2的比对结果如图13所示。

实施例8人源化抗体亲和力测定

8.1本实施例涉及的实验材料及试剂

S系列CM5芯片：厂家GE，货号29149603

缓冲液：HBS-EP+10X,厂家GE,货号BR100669。使用前用去离子水稀释10倍。

氨基偶联试剂盒：GE,货号BR100050

再生试剂：10mM Glycine 2.5，厂家GE,货号BR100356

8.2配体偶联预富集

配体：BCMA重组蛋白

测试pH：10mM Acetate 5.5/5.0/4.5/4.0

流速：10μl/min

缓冲液：HBS-EP+buffer

结果如14所示，选择10mM Acetate 5.5作为偶联缓冲液。

8.3配体偶联

配体：BCMA重组蛋白

偶联缓冲液：10mM Acetate 5.5

目标偶联量：200RU

结果如图15所示，最终偶联量为205.7RU。

8.4 MH18100901-B1Chimeric、MH18100901-B1H2-B1L1、MH18100901-B1H4-B1L2与BCMA重组蛋白的亲和力测定

实验条件：

抗体浓度：0.15625/0.3125/0.625/1.25/2.5/5.0ug/ml

流速：30μl/min

结合时间：300s

解离时间：400s

再生试剂：Glycine 1.5，30S，2次

MH18100901-B1Chimeric的亲和力测定结果如图16所示，MH18100901-B1H2-B1L1的亲和力测定结果如图17所示，MH18100901-B1H4-B1L2的亲和力测定结果如图18所示。

各抗体亲和力检测结果如表1所示。

表1

	Ka(M<sup>-1</sup>s<sup>-1</sup>)	Kd(s<sup>-1</sup>)	KD(M)
				MH18100901-B1 Chimeric	3.942×10<sup>5</sup>	1.736×10<sup>-4</sup>	4.404×10<sup>-10</sup>
MH18100901-B1H2-B1L1	4.649×10<sup>5</sup>	7.363×10<sup>-5</sup>	1.584×10<sup>-10</sup>
				MH18100901-B1H4-B1L2	2.681×10<sup>5</sup>	8.436×10<sup>-5</sup>	3.147×10<sup>-10</sup>

亲和力检测结果显示，人源化抗体MH18100901-B1H2-B1L1、MH18100901-B1H4-B1L2与嵌合抗体的亲和力一致。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 博生吉医药科技（苏州）有限公司

<120> 靶向人BCMA的单克隆抗体及其应用

<130> P2020-0532

<160> 32

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 6

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 1

Ser Asp Tyr Val Trp Asn

1 5

<210> 2

<211> 16

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 2

Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser

1 5 10 15

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 3

Tyr Asn Tyr Asp Gly Ile Phe Ala Tyr

1 5

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 4

Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 5

Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 6

Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr

1 5

<210> 7

<211> 118

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 7

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

Tyr Val Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp

35 40 45

Met Ala Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe

65 70 75 80

Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Phe Tyr Cys

85 90 95

Ala Val Tyr Asn Tyr Asp Gly Ile Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 8

<211> 108

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 8

Asp Val Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Lys Ile Cys Thr

100 105

<210> 9

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

Tyr Val Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Asn Tyr Asp Gly Ile Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser

115

<210> 10

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

Tyr Val Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Val Tyr Asn Tyr Asp Gly Ile Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser

115

<210> 11

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

Tyr Val Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Asn Tyr Asp Gly Ile Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser

115

<210> 12

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

Tyr Val Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Val Tyr Asn Tyr Asp Gly Ile Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser

115

<210> 13

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln

1 5 10 15

Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

Tyr Val Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp

35 40 45

Leu Ala Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val

65 70 75 80

Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala His Tyr Asn Tyr Asp Gly Ile Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser

115

<210> 14

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln

1 5 10 15

Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

Tyr Val Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp

35 40 45

Leu Ala Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val

65 70 75 80

Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Val Tyr Asn Tyr Asp Gly Ile Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser

115

<210> 15

<211> 104

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val

100

<210> 16

<211> 104

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Gln

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val

100

<210> 17

<211> 104

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu

100

<210> 18

<211> 104

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gly Val Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu

100

<210> 19

<211> 104

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu

100

<210> 20

<211> 104

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Gln

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu

100

<210> 21

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

caggttcagc tgcaagagtc tggccctggc ctggtcaagc ctagccaaac actgagcctg 60

acctgtaccg tgtccggcta cagcatcacc agcgactacg tgtggaactg gatcagacag 120

cctcctggca aaggcctgga atggatcggc tacatcagct acagcggcag caccagctac 180

aaccccagcc tgaagtccag agtgaccatc agcgtggaca ccagcaagaa ccagttctcc 240

ctgaagctga gcagcgtgac agccgccgat acagccgtgt actactgcgc cagatacaac 300

tacgacggca tcttcgccta ttggggccag ggcacactgg tcacagttag c 351

<210> 22

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

caggttcagc tgcaagagtc tggccctggc ctggtcaagc ctagccaaac actgagcctg 60

acctgtaccg tgtccggcta cagcatcacc agcgactacg tgtggaactg gatcagacag 120

cctcctggca aaggcctgga atggatcggc tacatcagct acagcggcag caccagctac 180

aaccccagcc tgaagtccag agtgaccatc agcgtggaca ccagcaagaa ccagttctcc 240

ctgaagctga gcagcgtgac agccgccgat acagccgtgt actactgcgc cgtgtacaac 300

tacgacggca tcttcgccta ttggggccag ggcacactgg tcacagttag c 351

<210> 23

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

caggttcagc tgcaagagtc tggccctggc ctggtcaagc ctagcgaaac actgagcctg 60

acctgtaccg tgtccggcta cagcatcacc agcgactacg tgtggaactg gatcagacag 120

cctcctggca aaggcctgga atggatcggc tacatcagct acagcggcag caccagctac 180

aaccccagcc tgaagtccag agtgaccatc agcgtggaca ccagcaagaa ccagttctcc 240

ctgaagctga gcagcgtgac agccgccgat acagccgtgt actactgcgc cagatacaac 300

tacgacggca tcttcgccta ttggggccag ggcacactgg tcacagttag c 351

<210> 24

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

caggttcagc tgcaagagtc tggccctggc ctggtcaagc ctagcgaaac actgagcctg 60

acctgtaccg tgtccggcta cagcatcacc agcgactacg tgtggaactg gatcagacag 120

cctcctggca aaggcctgga atggatcggc tacatcagct acagcggcag caccagctac 180

aaccccagcc tgaagtccag agtgaccatc agcgtggaca ccagcaagaa ccagttctcc 240

ctgaagctga gcagcgtgac agccgccgat acagccgtgt actactgcgc cgtgtacaac 300

tacgacggca tcttcgccta ttggggccag ggcacactgg tcacagttag c 351

<210> 25

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

cagatcaccc tgaaagagtc tggccccaca ctggtcaagc ccacacagac cctgacactg 60

acctgcacct ttagcggcta cagcatcacc agcgactacg tgtggaactg gatcagacag 120

cctcctggca aggccctgga atggctggcc tacatcagct acagcggcag caccagctac 180

aaccccagcc tgaaaagccg gctgaccatc accaaggaca ccagcaagaa ccaggtggtg 240

ctgaccatga caaacatgga ccccgtggac accgccacct actactgcgc ccactacaac 300

tacgacggca tcttcgccta ttggggccag ggcacactcg tgacagttag c 351

<210> 26

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

cagatcaccc tgaaagagtc tggccccaca ctggtcaagc ccacacagac cctgacactg 60

acctgcacct ttagcggcta cagcatcacc agcgactacg tgtggaactg gatcagacag 120

cctcctggca aggccctgga atggctggcc tacatcagct acagcggcag caccagctac 180

aaccccagcc tgaaaagccg gctgaccatc accaaggaca ccagcaagaa ccaggtggtg 240

ctgaccatga caaacatgga ccccgtggac accgccacct actactgcgc cgtgtacaac 300

tacgacggca tcttcgccta ttggggccag ggcacactcg tgacagttag c 351

<210> 27

<211> 312

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

gacatccaga tgacacagag ccctagcagc ctgtctgcca gcgtgggaga cagagtgacc 60

atcacctgta gagccagcca ggacatcagc aactacctga actggtatca gcagaagccc 120

ggcaaggccc ctaagctgct gatctactac accagcagac tgcacagcgg cgtgcccagc 180

agattttctg gctctggcag cggcaccgac ttcaccttca ccatatctag cctgcagcct 240

gaggatatcg ccacctacta ctgccagcag ggcaacaccc tgccttggac atttggcggc 300

ggaacaaagg tg 312

<210> 28

<211> 312

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

gacatccaga tgacacagag ccctagcagc ctgtctgcca gcgtgggaga cagagtgacc 60

atcacctgta gagccagcca ggacatcagc aactacctga actggtatca gcagaagccc 120

ggcaaggccc ctaagctgct gatctactac accagcagac tgcacagcgg cgtgcccagc 180

agattttctg gctctggcag cggcaccgac ttcaccttta caatcagcag cctgcagcaa 240

gaggatatcg ccacctacta ctgccagcag ggcaacaccc tgccttggac atttggcggc 300

ggaacaaagg tg 312

<210> 29

<211> 312

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

gacatccaga tgacacagag ccctagcagc ctgtctgcca gcgtgggaga cagagtgacc 60

atcacctgta gagccagcca ggacatcagc aactacctga actggtatca gcagaaaccc 120

ggcaaggtgc ccaagctgct gatctactac accagcagac tgcacagcgg cgtgcccagc 180

agattttctg gctctggcag cggcaccgac ttcaccctga ccatatctag cctgcagcct 240

gaggacgtgg ccacctacta ttgccagcag ggcaataccc tgccttggac ctttggcggc 300

ggaacaaaac tg 312

<210> 30

<211> 312

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

gacatccaga tgacacagag ccctagcagc ctgtctgcca gcgtgggaga cagagtgacc 60

atcacctgta gagccagcca ggacatcagc aactacctga actggtatca gcagaaacct 120

ggcggcgtgc ccaagctgct gatctactac acaagcagac tgcacagcgg agtgcccagc 180

agattttctg gcagcggctc tggcaccgac ttcaccctga ccatatctag cctgcagcct 240

gaggacgtgg ccacctacta ttgccagcag ggcaataccc tgccttggac ctttggcggc 300

ggaacaaaac tg 312

<210> 31

<211> 312

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

gacatccaga tgacacagag ccctagcagc gtgtccgcct ctgtgggaga cagagtgacc 60

atcacctgta gagccagcca ggacatcagc aactacctga actggtatca gcagaagccc 120

ggcaaggccc ctaagctgct gatctactac accagcagac tgcacagcgg cgtgcccagc 180

agattttctg gctctggcag cggcaccgac ttcaccctga ccatatctag cctgcagcct 240

gaggacttcg ccacctacta ttgccagcag ggcaacaccc tgccttggac atttggccag 300

ggcaccaaac tg 312

<210> 32

<211> 312

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

gacatccaga tgacacagag ccctagcagc gtgtccgcct ctgtgggaga cagagtgacc 60

atcacctgta gagccagcca ggacatcagc aactacctga actggtatca gcagaagccc 120

ggcaaggccc ctaagctgct gatctactac accagcagac tgcacagcgg cgtgcccagc 180

agattttctg gctctggcag cggcaccgac ttcaccctga caatctctag cctgcagcaa 240

gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag ggcaataccc tgccttggac atttggccag 300

ggcaccaaac tg 312

Claims

1.一种抗体的重链可变区，其特征在于，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：

SEQ ID NO:1所示的CDR1，

SEQ ID NO:2所示的CDR2，和

SEQ ID NO:3所示的CDR3。

2.一种抗体的重链，其特征在于，所述的重链具有如权利要求1所述的重链可变区。

3.一种抗体的轻链可变区，其特征在于，所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：

SEQ ID NO:4所示的CDR1’，

SEQ ID NO:5所示的CDR2’，和

SEQ ID NO:6所示的CDR3’。

4.一种抗体的轻链，其特征在于，所述的轻链具有如权利要求3所述的轻链可变区。

5.一种靶向BCMA的抗体，其特征在于，所述抗体具有：

(1)如权利要求1所述的重链可变区；和/或

(2)如权利要求3所述的轻链可变区；

或者，所述抗体具有：如权利要求2所述的重链；和/或如权利要求4所述的轻链。

6.如权利要求5所述的抗体，其特征在于，所述抗体选自：动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、或其组合。

7.如权利要求5所述的抗体，其特征在于，所述抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO：7、9-14所示；和/或

所述抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO：8、15-20所示。

8.一种CAR构建物，其特征在于，所述的CAR构建物的单克隆抗体抗原结合区域的scFV段为特异性结合于BCMA的结合区，并且所述scFv具有如权利要求1所述的重链可变区和如权利要求3所述的轻链可变区。

9.一种重组的免疫细胞，所述的免疫细胞表达外源的如权利要求8所述的CAR构建物。

10.一种活性成分的用途，所述活性成分选自下组：如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、或如权利要求5所述的抗体、如权利要求9所述的免疫细胞、或其组合，其特征在于，所述活性成分用于(a)制备检测试剂或试剂盒；和/或(b)制备预防和/或治疗BCMA阳性肿瘤的药物。