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TW201326214A - Ｂｃｍａ及ｃｄ３結合分子 - Google Patents

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TW201326214A
TW201326214A TW101142376A TW101142376A TW201326214A TW 201326214 A TW201326214 A TW 201326214A TW 101142376 A TW101142376 A TW 101142376A TW 101142376 A TW101142376 A TW 101142376A TW 201326214 A TW201326214 A TW 201326214A
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Tobias Raum
Patrick Hoffmann
Roman Kischel
Ralf Lutterbuese
Doris Rau
Paul Adam
Eric Borges
Barbara Hebeis
Susanne Hipp
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Amgen Res Munich Gmbh
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Abstract

本發明係有關於一種結合分子，其至少具有雙特異性及包含一個第一結合域與一個第二結合域，其中第一結合域可與BCMA的第3簇抗原決定位結合，而第二結合域可與T細胞CD3受體複合體結合。此外，本發明提供編碼該結合分子之一核酸序列、包含該核酸序列之一載體及經該載體轉形或轉染之一宿主細胞。而且，本發明提供用於生產本發明的結合分子之一種方法、該結合分子的醫療用途及包含該結合分子之一套組。

Description

BCMA及CD3結合分子
本發明係有關於一種結合分子，其至少具有雙特異性及包含一個第一結合域與一個第二結合域，其中第一結合域可與BCMA的第3簇抗原決定位結合，而第二結合域可與T細胞CD3受體複合體結合。此外，本發明提供編碼該結合分子之一核酸序列、包含該核酸序列之一載體及經該載體轉形或轉染之一宿主細胞。而且，本發明提供用於生產本發明的結合分子之一種方法、該結合分子的醫療用途及包含該結合分子之一套組。
BCMA(B細胞成熟抗原、TNFRSF17、CD269)係屬於TNF受體超級家族的一種跨膜蛋白。依據最初的報導，BCMA係人類成熟B淋巴球之高基氏體中的一種嵌入型膜蛋白，亦即一種細胞內蛋白(Gras等人(1995年)於期刊“International Immunol”第7(7)期第1093-1105頁乙文)，顯示BCMA似乎在B細胞發育與體內恆定方面扮演一重要角色。在Gras等人乙文中所述的BCMA蛋白係因為染色體易位而產生之BCMA與IL-2的融合蛋白，而Gras等人之發現可能與該事實相關聯。然而，由於其與亦稱為TALL-1或TNFSF13B之其配位體BAFF(B細胞活化因子)及APRIL(一種增殖誘導配位體)之據推測必要的交互作用，而同時確立BCMA是B細胞發育與體內恆定所必需之一種B細胞標記(Schliemann(2001年)等人於期刊“Science”第293(5537)期第 2111-2114頁乙文)。
BCMA的表現作用係侷限於B細胞譜系及主要存在於漿細胞與漿母細胞上，及在一定程度上存在於記憶B細胞上，但實際上不存在於周邊與純真B細胞上。BCMA亦表現在多發性骨髓瘤(MM)細胞上。BCMA連同其家族成員即跨膜活化作用分子與親環素(cyclophylin)配位體交互作用分子(TACI)及TNF家族受體(BAFF-R)的B細胞活化作用因子，而調節體液免疫、B細胞發育與體內恆定的各種方面。BCMA的表現作用出現在B細胞分化作用的相當後期，及有助於漿母細胞與漿細胞在骨髓中的長期存活。標定刪除小鼠中的BCMA基因並未影響成熟B細胞之產生、體液免疫反應的品質與幅度、生發中心之形成及壽命短暫的漿細胞之產生。然而，該等小鼠骨髓中之長壽命漿細胞的數目顯著較少，表明BCMA在其等存活方面之重要性(O’Connor等人於2004年乙文)。
根據該項發現，BCMA亦支持多發性骨髓瘤(MM)細胞的生長與存活。Novak等人發現MM細胞株與新分離的MM細胞在其等的細胞表面上表現BCMA與TACI蛋白，及在其等的細胞表面上具有可變的BAFF-R蛋白表現作用(Novak等人(2004年)於期刊“Blood”第103(2)期第689-694頁乙文)。
多發性骨髓瘤(MM)係第二常見的血液惡性疾病，及佔了所有癌症死亡人數的2%。MM係一種異質性疾病及大部分由染色體易位所造成，特別是t(11；14)、t(4； 14)、t(8；14)、del(13)、del(17)(Drach等人(1998年)於期刊“Blood”第92(3)期第802-809頁乙文；Gertz等人(2005年)於期刊“Blood”第106(8)期第2837-2840頁乙文；Facon等人(2001年)於期刊“Blood”第97(6)期第1566-1571頁乙文)。罹患MM的病患可能由於骨髓浸潤、骨質破壞、腎衰竭、免疫不全及診斷出癌症所引發的社交心理負擔，而經歷多種疾病相關症狀。截至2006年，MM的五年相對存活率約為34%，突顯出MM係難以治療的疾病，及目前尚無根治性方案。
令人振奮的新療法諸如化療與幹細胞移植法目前已可供使用及已提高存活率，但通常具有不利副作用，因而MM仍然還是無法治愈(Lee等人(2004年)於期刊“J Natl Compr Canc Netw”第8(4)期第379-383頁乙文)。迄今，最常用於多發性骨髓瘤病患的二種治療方案係併用類固醇類、沙利竇邁(thalidomide)、來那度胺(lenalidomide)、硼替佐米(bortezomib)或各種細胞毒性劑，而對於年輕病患係採用高劑量化療理念與自體幹細胞移植。
大部分的移植物係自體類型，亦即使用病患本身的細胞。該等移植物雖然不具有治癒性，但顯示延長特定病患的生命。其等可作為新確診病患的初始療法，或在復發時進行。有時，可能建議特定病患採用一種以上的移植物，以充分控制該疾病。
用於治療該疾病的化療藥物為塞克羅邁得(Cyclophosphamid)、多柔比星(Doxorubicin)、敏克瘤 (Vincristin)及黴法蘭(Melphalan)，以及免疫調節劑諸如沙利竇邁(thalidomide)(Thalomid®)、來那度胺(lenalidomide)(Revlimid®)、硼替佐米(bortezomib)(Velcade®)及皮質類固醇(如地塞米松(Dexamethasone))之合併療法已逐漸成為用於治療新確診病患及化療或移植均無效的疾病晚期病患的骨髓瘤之重要方案。
目前所用的療法通常並非治癒性療法。對於許多病患而言，因為年事已高、存在其他嚴重的疾病或身體上的其他限制，幹細胞移植可能不是選項。化療僅部分控制多發性骨髓瘤，而很少導致完全的緩解。因而，迫切需要一種新的創新療法。
Bellucci等人(於2005年期刊“Blood”第105(10)期乙文)在領受過捐贈者淋巴球輸注(DLI)的多發性骨髓瘤病患中辨識出BCMA特異性抗體。該等病患的血清可媒介ADCC與CDC之BCMA特異性細胞的溶胞作用，及僅在具抗腫瘤反應的病患(9名病患中的4名)中檢測到，而未在不反應病患(6名病患中的0名)檢測到。作者推測BCMA特異性抗體的誘導作用有助於骨髓瘤細胞之去除及病患的長期緩解。
Ryan等人(於2007年期刊“Mol.Cancer Ther.”第6(11)期乙文)報導，一種阻止NF-κB活化作用的拮抗型BCMA特異性抗體之產生作用，NF-κB活化作用係與正常及惡性B細胞中的一種強效的促生存訊息傳遞路徑相關聯。另外，藉由FC基因工程而顯著地強化抗體，該抗體在試管中對於多發性骨髓瘤細胞株具有抗體依賴性細胞所媒介之強 力的細胞毒性(ADCC)。
對抗血源性腫瘤或自體免疫疾患的其他方法，係專注於BAFF與APRIL即TNF配位體超級家族的配位體與其等的受體TACI、BAFF-R及BCMA之間的交互作用，而TACI、BAFF-R及BCMA係由BAFF及/或APRIL活化。例如，藉由將人類免疫球蛋白的Fc-域與齊莫基因(Zymogenetics)有限公司的TACI融合，產生安塔昔西普(Atacicept)(TACI-Ig)，其將該二種配位體中和及阻止受體活化作用。安塔昔西普(Atacicept)目前針對用於治療全身性紅斑狼瘡(SLE，第III期)、多發性硬化症(MS，第II期)及類風濕性關節炎(RA，第II期)進行臨床試驗，以及針對用於治療B細胞惡性疾病即慢性淋巴球白血病(CLL)、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)及MM進行第I期臨床試驗。在臨床前研究中，安塔昔西普(Atacicept)在試管中(Moreaux等人於2004年期刊“Blood”第103期乙文)及活體內(Yaccoby等人於2008年期刊“Leukemia”第22期第406-13頁乙文)減少初代MM細胞與MM細胞株之生長與存活，顯示TACI配位體與MM細胞的關聯性。因為大部分的MM細胞與所衍生的細胞株皆表現BCMA與TACI，該二受體可能有助於配位體所媒介的生長與存活作用。該等數據表明對於BCMA與TACI二者的拮抗作用可能有益於治療漿細胞疾患。另外，已有文獻述及與TACI交叉反應之BCMA特異性抗體(WO 02/066516)。
人類基因體科學(Human Genome Sciences)公司與葛蘭素史克(GlaxoSmithKline)公司已研發出標定BAFF 之一種抗體，稱作貝利木單株抗體(belimumab)。貝利木單株抗體阻斷可溶性BAFF與其在B細胞上的受體BAFF-R、BCMA及TACI之結合作用。貝利木單株抗體並非直接與B細胞結合，而是藉由與BAFF的結合作用，貝利木單株抗體抑制包括自體反應性B細胞在內之B細胞的存活，及減少B細胞分化成為產生免疫球蛋白的漿細胞。
然而，儘管BCMA、BAFF-R與TACI亦即B細胞受體事實上屬於TNF受體超級家族，及其等的配位體BAFF與APRIL係對抗癌症及/或自體免疫疾患的療法之標的，仍需要可用於治療該等醫學病況之其他方案。
因此，在此提供以一種結合分子形式解決該問題之方式與方法，該結合分子係至少具有雙特異性，其具有與細胞毒性細胞亦即細胞毒性T細胞的一個結合域，及具有與BCMA的一個第二結合域。
因而，本發明的第一方面係提供一種結合分子，其至少具有雙特異性及包含一個第一結合域與一個第二結合域，其中(a)第一結合域可與BCMA的第3簇抗原決定位(CQLRCSS NTPPLTCQRYC)(序列辨識編號：1016)結合；及(b)第二結合域可與T細胞CD3受體複合體結合；及其中BCMA的第3簇抗原決定位係對應於序列辨識編號：1002中所述序列的第24至41個胺基酸殘基。
必須注意如本文所用之單數形式的“一(a)”、“一(an)”及“該”係包括複數的提述對象，除非上下文另有明確說明。因而，例如所提及的“一試劑”係包括該等不同試劑中之一或多者，而所提及的“該方法”係包括提及本領域的一般技術人員所知可加以改質或取代本文中所述方法之等效步驟與方法。
應將一系列項目之前的“至少”一詞理解為係指該系列中的每一個項目，除非另有說明。本領域的嫻熟技術人員單單使用例行實驗，即可辨認出或可確定本發明在此所述的具體實施例之眾多等效項目。本發明意欲涵蓋該等等效項目。
凡用於本文中之“及/或”一詞，係包括“及”、“或”以及“由該詞所連接的項目之全部或其他任何組合”之含義。
如本文中所用之“約”或“大約”一詞，係指位於一指定數值或範圍之±20%內，較佳±15%內，更佳±10%內，及最佳±5%。
在整個該說明書與後述的申請專利範圍中，應理解“包含(comprise)”一詞及其變體諸如“包含(comprises)”與“包含(comprising)”係意指包括所述之一整數或步驟或整數或步驟之群組，但不排除其他任何整數或步驟或整數或步驟之群組，除非上下文另有所指。本文中所用之“包含”一詞，可用“含有”或“包括”一詞取代；或有時當用於本文中時，可用“具有”一詞取代。
當用於本文中時，“由...所組成”係將申請專利範圍項目中未指定之任一項目、步驟或成分排除。當用於本文中時，“實質上由...所組成”係不排除對於申請專利範圍的基本與新穎特徵不構成重大影響之物質或步驟。
在本文的各實例中，“包含”、“實質上由...所組成”及“由...所組成”等詞中任一者，可用其他二詞中的任一者置換。
第3簇抗原決定位係由BCMA的細胞外域所組成。“BCMA細胞外域”或“BCMA ECD”係指實質上不含BCMA的跨膜域與胞質域之一種BCMA形式。嫻熟技藝者將瞭解，本發明的BCMA多肽所辨識之跨膜域，係根據本技藝領域中例行用於辨識該類型的疏水域之標準來辨識。一跨膜域的確切界限可能有所不同，但就本文所特別提及之域而言，最可能在其兩側不超過約5個胺基酸。一較佳的BCMA ECD係示於序列辨識編號：1007中。
T細胞CD3受體複合體係一種蛋白複合體，及係由四個不同的鏈組成。在哺乳類動物中，該複合體含有一個CD3γ鏈、一個CD3δ鏈及二個CD3ε鏈。該等鏈與稱為T細胞受體(TCR)之一分子及ζ鏈聯合而在T淋巴球中產生一活化訊號。
雙特異性分子經由募集T細胞所導致之標的細胞的重新定向溶胞作用，係涉及細胞溶解性突觸之形成作用及穿孔蛋白與顆粒酵素之輸送作用。參與的T細胞可進行系列的標的細胞溶胞作用，及不受到干擾肽抗原處理與呈 現之免疫逃逸機制或株系T細胞分化作用之影響；如參見WO 2007/042261。
就本揭露內容涵意而言，“結合分子”一詞係指可(特異性地)與標的分子BCMA與CD3結合、與標的分子BCMA與CD3交互作用或辨識標的分子BCMA與CD3之任一分子。如本發明，結合分子較佳為多肽。該等多肽可包括蛋白質部分與非蛋白質部分(如化學連接基或化學交聯劑諸如戊二醛)。
如此說來，一結合分子將鷹架提供予該一或多種結合域，以使得該結合域可與標的分子BCMA與CD3結合/交互作用。例如，該鷹架可由蛋白A所提供，特別是其Z域(親和體)、ImmE7(免疫性蛋白)、BPTI/APPI(庫尼茨(Kunitz)域)、Ras結合蛋白AF-6(PDZ-域)、卡律布德蝎毒素(eharybdotoxin)(蝎子毒素)、CTLA-4、Min-23(半胱胺酸結肽(knottin))、載脂蛋白類(抗運轉蛋白類)、新制癌菌素(neocarzinostatin)、纖維連接蛋白域、錨蛋白(ankyrin)共有重複域或硫氧化還原蛋白(thioredoxin)(Skerra於期刊“Curr.Opin.Biotechnol.”第18期第295-30頁(2005年)乙文；Hosse等人於期刊“Protein Sci.”第15期第14-27頁(2006年)乙文；Nicaise等人於期刊“Protein Sci.”第13期第1882-1891頁(2004年)乙文；Nygren與Uhlen於期刊“Curr.Opin.Struc.Biol.”第7期第463-469頁(1997年)乙文)。較佳的結合分子係一抗體。
設想藉由噬菌體展示技術或噬菌體庫篩選方法 產生(或獲得)該結合分子，而非將來自現存(單株)抗體的CDR序列接枝至一鷹架中，例如本文中所揭露的一鷹架。
如本文中所用之“雙特異性”一詞，係指至少包含一個第一結合域與一個第二結合域之一種結合分子，其中第一結合域可與一抗原或標的結合，而第二結合域可與另一抗原或標的結合。本發明的“結合分子”亦包含多特異性結合分子，諸如如三特異性結合分子，三特異性結合分子係包括三個結合域。
亦設想本發明的結合分子除了與標的分子BCMA與CD3結合之功能以外，尚具有另一功能。在該形式中，該結合分子係一種三功能或多功能結合分子，因其經由與BCMA結合而標定漿細胞；經由與CD3的結合作用而媒介細胞毒性T細胞活性；及提供另一功能諸如一功能完整的Fc固定域，其經由募集作用細胞如NK細胞、標記(螢光等)、治療劑諸如毒素或放射性核種及/或增進血清半衰期之方式等，而媒介具抗體依賴性細胞之細胞毒性。
針對本發明之“結合域”一詞，係陳述可與標的分子BCMA與CD3上的一指定標的抗原決定位或一指定標的位點進行特異性結合作用/交互作用之一域。
結合域可衍生自一結合域供體，諸如例如抗體、蛋白A、ImmE7(免疫性蛋白)、BPTI/APPI(庫尼茨(Kunitz)域)、Ras結合蛋白AF-6(PDZ-域)、卡律布德蝎毒素(charybdotoxin)(蝎子毒素)、CTLA-4、Min-23(半胱胺酸結肽(knottin))、載脂蛋白類(抗運轉蛋白類)、新制癌菌素 (neocarzinostatin)、纖維連接蛋白域、錨蛋白(ankyrin)共有重複域或硫氧化還原蛋白(thioredoxin)(Skerra於期刊“Curr.Opin.Biotechnol.”第18期第295-30頁(2005年)乙文；Hosse等人於期刊“Protein Sci.”第15期第14-27頁(2006年)乙文；Nicaise等人於期刊“Protein Sci.”第13期第1882-1891頁(2004年)乙文；Nygren與Uhlen於期刊“Curr.Opin.Struc.Biol.”第7期第463-469頁(1997年)乙文)。較佳的結合域係衍生自一抗體。設想本發明的一結合域係至少包含前述任一結合域與標的分子BCMA與CD3上之一指定標的抗原決定位或一指定標的位點結合/交互作用所需之該部分。
設想前述結合域供體的結合域之特徵，係在於負責與個別標的結合之該等供體的該部分，亦即當從該結合域供體移除該部分時，該供體喪失其結合能力。“喪失”係指相較於結合供體，該結合能力降低至少50%。製作該等結合位點圖譜之方法係技藝中眾所周知，因此嫻熟技術人員可應用標準知識來進行一結合域供體的結合位點之定位/製作圖譜，使得以從個別的結合域供體“衍生”該結合域。
“抗原決定位”一詞係指一抗原上之一位點，而一結合域諸如一抗體或免疫球蛋白或一抗體或一免疫球蛋白的衍生物或片段與該位點特異性結合。“抗原決定位”係具有抗原性，因而抗原決定位一詞在本文中有時亦稱作“抗原結構”或“抗原決定子”。因而，結合域係一個“抗原交互作用位點”。亦應瞭解該結合作用/交互作用係界定“特異性辨識作用”。在一實例中，與標的分子BCMA與CD3上之一指 定標的抗原決定位或一指定標的位點(特異性地)結合/交互作用之該結合域，係一抗體或免疫球蛋白；及該結合域係一抗體或一免疫球蛋白之一VH及/或VL區。
“抗原決定位”可由相連胺基酸或因蛋白的三級摺疊作用而相鄰的非相連胺基酸形成。“線性抗原決定位”係一抗原決定位，其中胺基酸的一級序列包含所辨識的抗原決定位。一線性抗原決定位係在一獨特序列中典型地包括至少3個或至少4個胺基酸，及更常見至少5個或至少6個或至少7個胺基酸，例如約8至約10個胺基酸。
相對於線性抗原決定位，“構形抗原決定位”係一抗原決定位及其中包含抗原決定位之胺基酸一級序列並非所辨識的抗原決定位之唯一定義元件(如其中胺基酸一級序列未必被結合域所辨識之一抗原決定位)。相對於線性抗原決定位，構形抗原決定位所包含的胺基酸數目通常較多。就構形抗原決定位的辨識作用而言，該結合域辨識抗原及較佳一種肽或蛋白或其片段的三維結構(在本發明的上下文，針對該等結合域中之一者之抗原係包含在BCMA蛋白之內)。例如，當一蛋白分子摺疊而形成三維結構時，形成構形抗原決定位的某些胺基酸及/或多肽主鏈變成相鄰，使得抗體可以辨識抗原決定位。測定抗原決定位構形之方法，包括但不限於X光繞射結晶法、二維核磁共振(2D-NMR)光譜分析法與定點自旋標記法及電子順磁共振(EPR)光譜分析法。此外，所提供的實例述及另一種方法，其係用於試驗一指定結合域是否與一指定蛋白及尤其 BCMA之一或多簇的抗原決定位結合。
就一方面而言，本發明的第一結合域可與人類BCMA及較佳人類BCMA ECD的第3簇抗原決定位結合。因此，當人類BCMA蛋白中之個別簇的抗原決定位與一鼠類BCMA抗原之個別簇的抗原決定位交換時(產生包含人類BCMA之一構築質體，其中人類第3簇抗原決定位係被鼠類第3簇抗原決定位置換；參見序列辨識編號：1011)，該結合域的結合作用將減少。相較於人類BCMA蛋白中之個別簇的抗原決定位，即人類BCMA蛋白中之個別簇的抗原決定位之結合作用設定為100%，該項減少係較佳至少10%、20%、30%、40%、50%；更佳至少60%、70%、80%、90%、95%或甚至100%。設想前述人類BCMA/鼠類BCMA嵌合體係在CHO細胞中表現。亦設想人類BCMA/鼠類BCMA嵌合體係與一種不同的膜結合型蛋白諸如EpCAM的一跨膜域及/或胞質域融合；參見圖2a。
由於與一種非人類(如鼠類)BCMA抗原之個別簇的抗原決定位交換所導致之結合作用下降之試驗方法，係述於所附實例中，尤其述於第1至3例中。丙胺酸掃瞄法係另一種方法，其測定一標的抗原的一特異性殘基對於一指定結合分子或結合域的辨識作用所作出之貢獻(如參見Morrison KL與Weiss GA於2001年6月期刊“Cur Opin Chem Biol”第5(3)期第302-7頁乙文)，其中待分析的各殘基係例如經由定點誘突變作用而被丙胺酸置換。使用丙胺酸之原因在於其體積並非龐大、其化學惰性，然而其甲基官能基模 擬其他多種胺基酸所具有的二級結構參考。在希望保留突變型殘基的尺寸之情況下，有時可使用體積龐大的胺基酸諸如纈胺酸或白胺酸。丙胺酸掃瞄法係已使用多時的成熟技術。
如本文中所用之“抗原決定位簇”一詞，係指位於一抗原之所界定的連續延伸範圍內之抗原決定位整體。一簇的抗原決定位可包含一個、二個或更多個抗原決定位。在本發明的上下文所界定之位於BCMA的細胞外域中之抗原決定位簇，係如上文所述及示於圖1中。
如本發明，“(可)與結合”、“特異性地辨識”、“導向”及“與反應”等詞，係指可與一抗原決定位的一或多個、較佳至少二個、更佳至少三個及最佳至少四個胺基酸特異性地交互作用之一結合域。
如本文中所用之“特異性地交互作用”、“特異性結合作用”或“特異性地結合”等詞，係指一結合域對於一特定蛋白或抗原展現可察知的親和性，及對於BCMA或CD3以外的蛋白或抗原一般不展現顯著的反應性。“可察知的親和性”係包括親和性約10-6M(KD)或更強之結合作用。較佳，當結合作用親和性約為10-12至10-8M，10-12至10-9M，10-12至10-10M，10-11至10-8M及較佳約為10-11至10-9M時，將結合作用視為具特異性。尤其藉由將該結合域與一標的蛋白或抗原之反應和該結合域與BCMA或CD3以外的蛋白或抗原之反應比較，即可試驗一結合域是否與一標的特異性地反應或結合。本發明的一結合域較佳實質上不與 BCMA或CD3以外的蛋白或抗原結合或無法與其結合(亦即第一結合域無法與BCMA以外的蛋白結合，而第二結合域無法與CD3以外的蛋白結合)。
“實質上不結合”或“無法結合”等詞，係指本發明的一結合域不與BCMA或CD3以外的另一蛋白或抗原結合，亦即當與BCMA或CD3的結合作用分別設定為100%，所顯示之與BCMA或CD3以外的蛋白或抗原的反應性係不超過30%，較佳不超過20%，更佳不超過10%，尤其較佳不超過9%、8%、7%、6%或5%。
特異性結合作用據信係藉由結合域之胺基酸序列中的特異性基序與該抗原而達成。因而，結合作用之達成係因為其等一級、二級及/或三級結構之結果以及該等結構的二級改質作用之結果。抗原交互作用位點與其特異性抗原之特異性交互作用，可能產生該位點與該抗原之一種單純的結合作用。此外，抗原交互作用位點與其特異性抗原之特異性交互作用，可能例如由於引發抗原構形之變化、抗原的低聚合作用等，而任擇地或附加地產生一訊號起始作用。
就一方面而言，本發明的第一結合域係與人類BCMA的第3簇抗原決定位結合及進一步可與獼猴BCMA的第3簇抗原決定位結合，諸如來自恆河獼猴(Macaca mulatta)的BCMA(序列辨識編號：1017)或來自馬來猴(Macaca fascicularis)的BCMA(序列辨識編號：1017)。設想第一結合域係與鼠類BCMA結合或不與鼠類BCMA結合。
因此，在一實施例中，與人類BCMA及尤其與BCMA細胞外蛋白域的第3簇抗原決定位結合之一結合域，係由人類序列辨識編號：1002中所述序列的第24至41個胺基酸殘基所形成；亦與獼猴BCMA及尤其與BCMA細胞外蛋白域的第3簇抗原決定位結合之一結合域，係由獼猴BCMA序列辨識編號：1006所述序列的第24至41個胺基酸殘基所形成。
在一實施例中，一結合分子的第一結合域可與BCMA的第3簇抗原決定位結合，其中BCMA的第3簇抗原決定位係對應於序列辨識編號：1002(人類BCMA全長多肽)中所述序列的第24至41個胺基酸殘基或序列辨識編號：1007(人類BCMA細胞外域即序列辨識編號：1002的第1至54個胺基酸)。
就本發明的一方面而言，該結合分子的第一結合域係可附加地或任擇地與白鬢狨(Callithrix jacchus)、棉冠獠狨(Saguinus oedipus)及/或松鼠猴(Saimiri sciureus)BCMA的第3簇抗原決定位結合。
蛋白(包括其片段及較佳具有生物活性的片段以及通常具有少於30個胺基酸之肽)包含彼此經由一個共價肽鍵偶合之一或多個胺基酸(而產生一胺基酸鏈)。如本文中所用之“多肽”一詞係述及一群組的分子，其係由超過30個胺基酸所組成。多肽可進一步形成多聚體，諸如二聚體、三聚體及更高的寡聚體，亦即由一個以上的多肽分子所組成。形成該等二聚體、三聚體之多肽分子可相同或不 相同。該等多聚體之對應的較高級結構因此稱為同二聚體或雜二聚體、同三聚體或雜三聚體等。雜多聚體之一實例係一抗體分子，其天然存在的形式係由二個相同的多肽輕鏈與二個相同的多肽重鏈所組成。“多肽”與“蛋白”等詞亦指經天然改質的多肽/蛋白，其中改質作用係藉由如醣化作用、乙醯化作用、磷酸化作用之類的後轉譯改質作用達成。在本文中所提及之“多肽”亦可能經化學改質，諸如經聚乙二醇化。該等改質作用係技藝中眾所周知。
在本發明的另一方面，第二結合域可與CD3ε結合。在本發明的又一方面，第二結合域可與人類CD3及與獼猴CD3結合，較佳與人類CD3ε及與獼猴CD3ε結合。第二結合域可附加地或任擇地與白鬢狨(Callithrix jacchus)、棉冠獠狨(Saguinus oedipus)及/或松鼠猴(Saimiri sciureus)CD3ε結合。依據該等實施例，本發明的結合分子之一或二個結合域較佳對於哺乳類動物的靈長目成員具有跨物種特異性。具跨物種特異性的CD3結合域係例如述於WO 2008/119567中。
就本發明的結合分子而言，該第二結合域尤其較佳可與T細胞CD3受體複合體結合，該複合體所包含的一個VL區係包含選自下列之CDR-L1、CDR-L2與CDR-L3：(a)如WO 2008/119567的序列辨識編號：27中所述之CDR-L1、如WO 2008/119567的序列辨識編號：28中所述之CDR-L2及如WO 2008/119567的序列辨識編號：29中所述之CDR-L3； (b)如WO 2008/119567的序列辨識編號：117中所述之CDR-L1、如WO 2008/119567的序列辨識編號：118中所述之CDR-L2及如WO 2008/119567的序列辨識編號：119中所述之CDR-L3；及(c)如WO 2008/119567的序列辨識編號：153中所述之CDR-L1、如WO 2008/119567的序列辨識編號：154中所述之CDR-L2及如WO 2008/119567的序列辨識編號：155中所述之CDR-L3。
在本發明的結合分子之一任擇較佳實施例中，該第二結合域可與T細胞CD3受體複合體結合，該複合體所包含的一個VH區係包含選自下列之CDR-H1、CDR-H2與CDR-H3：(a)如WO 2008/119567的序列辨識編號：12中所述之CDR-H1、如WO 2008/119567的序列辨識編號：13中所述之CDR-H2及如WO 2008/119567的序列辨識編號：14中所述之CDR-H3；(b)如WO 2008/119567的序列辨識編號：30中所述之CDR-H1、如WO 2008/119567的序列辨識編號：31中所述之CDR-H2及如WO 2008/119567的序列辨識編號：32中所述之CDR-H3；(c)如WO 2008/119567的序列辨識編號：48中所述之CDR-H1、如WO 2008/119567的序列辨識編號：49中所述之CDR-H2及如WO 2008/119567的序列辨識編號：50中所述之CDR-H3； (d)如WO 2008/119567的序列辨識編號：66中所述之CDR-H1、如WO 2008/119567的序列辨識編號：67中所述之CDR-H2及如WO 2008/119567的序列辨識編號：68中所述之CDR-H3；(e)如WO 2008/119567的序列辨識編號：84中所述之CDR-H1、如WO 2008/119567的序列辨識編號：85中所述之CDR-H2及如WO 2008/119567的序列辨識編號：86中所述之CDR-H3；(f)如WO 2008/119567的序列辨識編號：102中所述之CDR-H1、如WO 2008/119567的序列辨識編號：103中所述之CDR-H2及如WO 2008/119567的序列辨識編號：104中所述之CDR-H3；(g)如WO 2008/119567的序列辨識編號：120中所述之CDR-H1、如WO 2008/119567的序列辨識編號：121中所述之CDR-H2及如WO 2008/119567的序列辨識編號：122中所述之CDR-H3；(h)如WO 2008/119567的序列辨識編號：138中所述之CDR-H1、如WO 2008/119567的序列辨識編號：139中所述之CDR-H2及如WO 2008/119567的序列辨識編號：140中所述之CDR-H3；(i)如WO 2008/119567的序列辨識編號：156中所述之CDR-H1、如WO 2008/119567的序列辨識編號：157中所述之CDR-H2及如WO 2008/119567的序列辨識編號：158中所述之CDR-H3；及 (j)如WO 2008/119567的序列辨識編號：174中所述之CDR-H1、如WO 2008/119567的序列辨識編號：175中所述之CDR-H2及如WO 2008/119567的序列辨識編號：176中所述之CDR-H3。
就本發明的結合分子而言，該第二結合域較佳可與T細胞CD3受體複合體結合，該複合體所包含的一個VL區係選自由WO 2008/119567的序列辨識編號：35、39、125、129、161或165中所述之一VL區所組成之群組。
任擇地，該第二結合域可較佳與T細胞CD3受體複合體結合，該複合體所包含的一個VH區係選自由WO 2008/119567的序列辨識編號：15、19、33、37、51、55、69、73、87、91、105、109、123、127、141、145、159、163、177或181中所述之一VH區所組成之群組。
本發明的結合分子之特徵更佳在於該第二結合域可與T細胞CD3受體複合體結合，該複合體所包含之一VL區與一VH區係選自由下列所組成之群組：(a)如WO 2008/119567的序列辨識編號：17或21中所述之一VL區及如WO 2008/119567的序列辨識編號：15或19中所述之一VH區；(b)如WO 2008/119567的序列辨識編號：35或39中所述之一VL區及如WO 2008/119567的序列辨識編號：33或37中所述之一VH區；(c)如WO 2008/119567的序列辨識編號：53或57中所述之一VL區及如WO 2008/119567的序列辨識編號：51或55中所述 之一VH區；(d)如WO 2008/119567的序列辨識編號：71或75中所述之一VL區及如WO 2008/119567的序列辨識編號：69或73中所述之一VH區；(e)如WO 2008/119567的序列辨識編號：89或93中所述之一VL區及如WO 2008/119567的序列辨識編號：87或91中所述之一VH區；(f)如WO 2008/119567的序列辨識編號：107或111中所述之一VL區及如WO 2008/119567的序列辨識編號：105或109中所述之一VH區；(g)如WO 2008/119567的序列辨識編號：125或129中所述之一VL區及如WO 2008/119567的序列辨識編號：123或127中所述之一VH區；(h)如WO 2008/119567的序列辨識編號：143或147中所述之一VL區及如WO 2008/119567的序列辨識編號：141或145中所述之一VH區；(i)如WO 2008/119567的序列辨識編號：161或165中所述之一VL區及如WO 2008/119567的序列辨識編號：159或163中所述之一VH區；及(j)如WO 2008/119567的序列辨識編號：179或183中所述之一VL區及如WO 2008/119567的序列辨識編號：177或181中所述之一VH區。
依據本發明的結合分子之一個較佳實施例，尤其該第二結合域可與T細胞CD3受體複合體結合，該對VH區 與VL區係單鏈抗體(scFv)之格式。VH與VL區係依VH-VL或VL-VH的順序排列。VH區較佳位於一連接子序列的N端。VL區較佳位於連接子序列的C端。
本發明的結合分子之上述較佳實施例之特徵，係在於該第二結合域可與T細胞CD3受體複合體結合，該複合體所包含之一胺基酸序列係選自由WO 2008/119567的序列辨識編號：23、25、41、43、59、61、77、79、95、97、113、115、131、133、149、151、167、169、185或187所組成之群組。
第一結合域對於人類BCMA之親和性係較佳小於或等於15 nM，更佳小於或等於10 nM，甚至更佳小於或等於5 nM，甚至更佳小於或等於1 nM，甚至更佳小於或等於0.5 nM，甚至更佳小於或等於0.1 nM，及最佳小於或等於0.05 nM。第一結合域對於獼猴BCMA之親和性係較佳小於或等於15 nM，更佳小於或等於10 nM，甚至更佳小於或等於5 nM，甚至更佳小於或等於1 nM，甚至更佳小於或等於0.5 nM，甚至更佳小於或等於0.1 nM，及最佳小於或等於0.05 nM或甚至小於或等於0.01 nM。如實例中所述，例如可在畢亞寇(Biacore)分析法中或在斯克伽(Scatchard)分析法中，測量親和性。對於獼猴BCMA相對於人類BCMA的結合作用之親和性差距，係較佳[1：10至1：5]或[5：1至10：1]，更佳[1：5至5：1]，及最佳[1：2至3：1]或甚至[1：1至3：1]。用於測定親和性之其他方法係嫻熟技藝者所熟知。
可依多種方式測量由BCMA/CD3雙特異性結合分子所媒介之細胞毒性。作用細胞例如可為經刺激的富集型(人類)CD8陽性T細胞或未經刺激的(人類)末梢血液單核細胞(PBMC)。若標的細胞係源自獼猴或表現獼猴BCMA或經獼猴BCMA轉染，則作用細胞亦應源自獼猴，諸如一種獼猴T細胞株如4119LnPx。標的細胞應表現BCMA如人類或獼猴BCMA(至少其細胞外域)。標的細胞可為穩定地或暫時地經BCMA如人類或獼猴BCMA轉染之一細胞株(諸如CHO)。任擇地，標的細胞可為一種BCMA陽性的天然表現細胞株，諸如人類多發性骨髓瘤細胞株L363或NCI-H929。在細胞表面上所表現的BCMA水平較高之標的細胞株，通常預期其EC50值較低。作用細胞相對於標的細胞(E：T)之比例通常約為10：1，但亦可改變。可在51-鉻釋出分析法(培養時間約為18小時)或在FACS式細胞毒性分析法(培養時間約為48小時)中，測量BCMA/CD3雙特異性結合分子的細胞毒性活性。也可能修改分析法的培養時間(細胞毒性反應)。嫻熟技藝者亦熟知測量細胞毒性的其他方法，及包括MTT或MTS分析法、包括生物發光分析法在內之ATP式分析法、磺醯羅丹明B(SRB)分析法、WST分析法、細胞群落分析法及ECIS技術。
較佳在一種細胞式細胞毒性分析法中，測量由本發明的BCMA/CD3雙特異性結合分子所媒介之細胞毒性活性。其係由EC50值表示，EC50係對應於半數最大有效濃度(引發基線與最大值之間的中點之細胞毒性反應之結合分子濃 度)。BCMA/CD3雙特異性結合分子的EC50值較佳小於或等於20.000皮克/毫升，更佳小於或等於5000皮克/毫升，甚至更佳小於或等於1000皮克/毫升，甚至更佳小於或等於500皮克/毫升，甚至更佳小於或等於350皮克/毫升，甚至更佳小於或等於320皮克/毫升，甚至更佳小於或等於250皮克/毫升，甚至更佳小於或等於100皮克/毫升，甚至更佳小於或等於50皮克/毫升，甚至更佳小於或等於10皮克/毫升，及最佳小於或等於5皮克/毫升。
上述所示的任一EC50值可與一種細胞式細胞毒性分析法所示的任一情況組合。例如，當使用(人類)CD8陽性T細胞或獼猴T細胞株作為作用細胞時，BCMA/CD3雙特異性結合分子的EC50值較佳小於或等於1000皮克/毫升，更佳小於或等於500皮克/毫升，甚至更佳小於或等於250皮克/毫升，甚至更佳小於或等於100皮克/毫升，甚至更佳小於或等於50皮克/毫升，甚至更佳小於或等於10皮克/毫升，及最佳小於或等於5皮克/毫升。若該分析法中的標的細胞係經(人類或獼猴)BCMA轉染的細胞諸如CHO細胞時，BCMA/CD3雙特異性結合分子的EC50值較佳小於或等於150皮克/毫升，更佳小於或等於100皮克/毫升，甚至更佳小於或等於50皮克/毫升，甚至更佳小於或等於30皮克/毫升，甚至更佳小於或等於10皮克/毫升，及最佳小於或等於5皮克/毫升。
若標的細胞係一種BCMA陽性的天然表現細胞株，則EC50值較佳小於或等於350皮克/毫升，更佳小於或等 於320皮克/毫升，甚至更佳小於或等於250皮克/毫升，甚至更佳小於或等於200皮克/毫升，甚至更佳小於或等於100皮克/毫升，甚至更佳小於或等於150皮克/毫升，甚至更佳小於或等於100皮克/毫升，及最佳小於或等於50皮克/毫升，或更低。
當使用(人類)PBMC作為作用細胞時，BCMA/CD3雙特異性結合分子的EC50值較佳小於或等於1000皮克/毫升，更佳小於或等於750皮克/毫升，更佳小於或等於500皮克/毫升，甚至更佳小於或等於350皮克/毫升，甚至更佳小於或等於320皮克/毫升，甚至更佳小於或等於250皮克/毫升，甚至更佳小於或等於100皮克/毫升，及最佳小於或等於50皮克/毫升，或更低。
在一特佳實施例中，本發明的BCMA/CD3雙特異性結合分子之特徵在於EC50係小於或等於350皮克/毫升或以下，更佳小於或等於320皮克/毫升或以下。在該實施例中，標的細胞係L363細胞及作用細胞係未經刺激的人類PBMC。嫻熟技藝者無需多費周折即知如何測量EC50值。此外，本說明書具有教導如何測量EC50值之具體說明；如參見下列第8.3例。如下係一種適宜的操作程序：
a)藉由菲可(Ficoll)密度梯度離心法從富集型淋巴球製備物(血沉棕黃層)製備人類末梢血液單核細胞(PBMC)
b)選擇性地用杜貝可(Dulbecco)PBS(吉柏柯(Gibco)公司)清洗
c)經由與紅血球溶胞緩衝液(155 mM氯化銨、10 mM碳酸氫 鉀、100 μM EDTA)一起培養，而移除PBMC中的剩餘紅血球
c)在PBMC於100 x g離心之際，經由上清液移除血小板
d)耗竭CD14+細胞與NK細胞
e)使用例如LS管柱(美天旎生技(Miltenyi Biotec)公司之#130-042-401)，分離CD14/CD56陰性細胞
f)在不具有CD14+/CD56+細胞之情況下，在37℃培養箱中培養PBMC直到需用時，如在增補10% FBS(拜爾控股份公司之#S0115)、1x非必需胺基酸(拜爾控股份公司之#K0293)、10 mM Hepes緩衝液(拜爾控股份公司之#L1613)、1 mM丙酮酸鈉(拜爾控股份公司之#L0473)及100單位/毫升的盤尼西林/鏈黴素(拜爾控股份公司之#A2213)的RPMI完全培養基亦即RPMI1640(拜爾控(Biochrom)股份公司之#FG1215)中培養。
g)標記標的細胞
h)將作用細胞與標的細胞混合，較佳以等體積混合，以使得E：T細胞比例為10：1
i)添加結合分子，較佳在一系列稀釋液中
j)在7%二氧化碳的增濕培養箱中進行達48小時
k)如藉由添加最終濃度為1微克/毫升的碘化丙啶(PI)，例如藉由流動式細胞測量術，監測標的細胞的膜完整性
l)如依據下列公式計算EC50：
n=事件數目
使用GraphPad Prism 5軟體(美國加州聖地牙哥的圖墊軟體(Graph Pad Software)公司)，將細胞毒性百分比相對於對應的雙特異性抗體濃度繪圖。可藉由用於評估具固定曲線斜率的S型劑量反應曲線之四參數邏輯迴歸模式，分析劑量反應曲線，及計算EC50值。
如上所述，本發明的結合分子之特徵較佳在於EC50(皮克/毫升)為350或以下，較佳為320或以下。
本發明亦有關於本文中所述的結合分子，其特徵在於EC50(皮克/毫升)係相當於BCMA/CD3雙特異性結合分子即BCMA-83xCD3、BCMA-62xCD3、BCMA-5xCD3、BCMA-98xCD3、BCMA-71xCD3、BCMA-34xCD3、BCMA-74xCD3、BCMA-20xCD3中任一者之EC50(皮克/毫升)。設想使用供測定EC50值之相同分析法，來測定如本文中所述的一種結合分子之EC50是否相當於BCMA-83xCD3、BCMA-62xCD3、BCMA-5xCD3、BCMA-98xCD3、BCMA-71xCD3、BCMA-34xCD3、BCMA-74x CD3、BCMA-20xCD3中任一者之EC50。“相當於”一詞係包括與個別EC50值之偏差為+/-10%，較佳為+/-7.5%，更佳為+/-5%，甚至更佳為+/-2.5%。
在上述分析法中作為“參考”結合分子之BCMA/CD3雙特異性結合分子，即BCMA-83xCD3、BCMA-62x CD3、BCMA-5xCD3、BCMA-98xCD3、BCMA-71xCD3、BCMA-34xCD3、BCMA-74xCD3、BCMA-20xCD3，係較佳在CHO細胞中產生。
個別BCMA/CD3雙特異性結合分子(諸如抗體)的單體與二聚異構體之間的細胞毒性活性差異，係稱作“效力差距”。可用該分子的單體與二聚體形式之EC50值比例之方式，計算該效力差距。本發明的BCMA/CD3雙特異性結合分子之效力差距較佳小於或等於5，更佳小於或等於4，甚至更佳小於或等於3，甚至更佳小於或等於2及最佳小於或等於1。
本發明的BCMA/CD3雙特異性結合分子較佳不與人類BAFF-R及/或人類TACI結合、交互作用、辨識或交叉反應。檢測與人類BAFF-R及/或人類TACI的交叉反應性之方法係揭露於第9例中。
本發明的BCMA/CD3雙特異性結合分子在數次冷凍/解凍循環後，亦較佳呈現非常低的二聚物轉化作用。例如在三次冷凍/解凍循環後，二聚體百分比較佳小於或等於5%，更佳小於或等於4%，甚至更佳小於或等於3%，甚至更佳小於或等於2.5%，甚至更佳小於或等於2%，甚至更佳小於或等於1.5%，及最佳小於或等於1%。可依據第16例進行冷凍-解凍循環及測定二聚體百分比。
本發明的BCMA/CD3雙特異性結合分子(諸如抗體)較佳顯示有利的熱安定性及熔化溫度高於60℃。
為測定BCMA/CD3雙特異性結合分子(諸如抗體)與人類血漿蛋白的潛在交互作用，可進行血漿干擾試驗(如參見第18例)。在一較佳實施例中，在BCMA/CD3雙特異性結合分子的標的結合作用中，因血漿蛋白所媒介之結合作 用的減少並不顯著。相對血漿干擾值較佳小於或等於2。
進一步設想本發明的BCMA/CD3雙特異性結合分子可展現治療功效或抗腫瘤活性。其可在如第19例(晚期人類腫瘤異體移植模式)所揭露的一研究中進行評估。嫻熟技藝者知道如何修改或調整該研究的一些參數，諸如所注射的腫瘤細胞數目、注射位點、所移植的人類T細胞數目、BCMA/CD3雙特異性結合分子的投藥量及期程，而仍可獲得有意義與可再現的結果。腫瘤生長抑制作用T/C[%]較佳為70或60或以下，更佳為50或40或以下，甚至更佳為至少30或20或以下，及最佳為10或以下、5或以下或甚至2.5或以下。
本發明的BCMA/CD3雙特異性結合分子較佳不引發/媒介溶胞作用，或實質上不引發/媒介BCMA陰性細胞諸如HL60、MES-SA及SNU-16的溶胞作用。“不引發溶胞作用”、“實質上不引發溶胞作用”、“不媒介溶胞作用”或“實質上不媒介溶胞作用”等詞，係指當BCMA陽性細胞株諸如NCI-H929、L-363或OPM-2的溶胞作用設定為100%時，本發明的一結合分子所引發或媒介的BCMA陰性細胞之溶胞作用係不超過30%，較佳不超過20%，更佳不超過10%，尤其較佳不超過9%、8%、7%、6%或5%。這適用於至少高達500 nM的結合分子濃度。嫻熟技藝者毋須多費周折即知如何測量細胞溶胞作用。此外，本說明書具有教導如何測量細胞溶胞作用之具體說明；如參見下列第20例。
在一實施例中，第一結合域或第二結合域係一 抗體或衍生自一抗體。在另一實施例中，該二結合域係一抗體或衍生自一抗體。
“抗體”一詞之定義包括諸如單株、嵌合型、單鏈、人化與人類抗體之實施例。除了全長抗體之外，該定義亦包括抗體衍生物與抗體片段，尤其是Fab片段。抗體片段或衍生物進一步包含F(ab')2、Fv、seFv片段；或僅包含可為VHH、VH或VL之一個可變域及與一抗原或抗原決定位特異性結合及獨立於其他V區或域之單域抗體，諸如域抗體或奈米抗體、單一可變域抗體或免疫球蛋白單一可變域；如參見如上文引述之Harlow與Lane(1988年)乙文與(1999年)乙文；施普林格(Springer)公司於2010年出版之Kontermann與Dübel所著“抗體工程(Antibody Engineering)”乙書第二版；及劍橋大學出版社(Cambridge University Press)於2009年出版之Little所著“用於免疫療法之重組抗體(Recombinant Antibodies for Immunotherapy)”乙書。該詞亦包括雙鏈抗體或雙親和性重新標定(DART)抗體。進一步設想(雙特異性)單鏈雙鏈抗體；串聯雙鏈抗體(Tandab)；由如下結構所例示之“微抗體”：(VH-VL-CH3)2、(scFv-CH3)2或(scFv-CH3-scFv)2；“FcDART抗體”與“IgGDART”抗體；及多鏈抗體諸如三鏈抗體。免疫球蛋白單一可變域不僅涵蓋一種分離出的抗體單一可變域多肽，亦涵蓋包含一抗體單一可變域多肽序列的一或多種單體之較大型多肽。
技藝中已知可用於產生該等抗體及/或片段之各種程序。因而，可藉由擬肽類產生(抗體)衍生物。此外， 所述用於產生單鏈抗體之技術(尤其參見第4,946,778號美國專利；如上文引述之Kontermann與Dübel(2010年)乙書；及如上文引述之Little(2009年)乙書)，可適用於產生對於所選擇多肽具特異性之單鏈抗體。另外，可使用基因轉殖動物來表現本發明之對於多肽與融合蛋白具特異性之人化抗體。可使用藉由連續細胞株培養而提供抗體之任何技術，來製備單株抗體。該等技術的實例包括融合瘤技術(Köhler與Milstein於期刊“Nature”第256期(1975年)第495-497頁乙文)、三體融合瘤技術、人類B細胞融合瘤技術(Kozbor於期刊“Immunology Today”第4期(1983年)第72頁乙文)及產生人類單株抗體之EBV融合瘤技術(艾倫‧R‧利斯(Alan R.Lis)有限公司(1985年)出版之Cole等人所著“單株抗體與癌症療法(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)”乙書第77-96頁)。可使用畢亞寇(Biacore)系統中所用之表面電漿共振來增加噬菌體抗體與一標的多肽諸如CD3ε的抗原決定位結合之效率(Schier於期刊“Human Antibodies Hybridomas”第7期(1996年)第97-105頁乙文；Malmborg於期刊“J.Immunol.Methods”第183期(1995年)第7-13頁乙文)。在本發明的上下文中，亦設想“抗體”一詞係包含可在如下文所述的宿主中表現之抗體構築質體，如尤其可經由病毒或質體載體轉染及/或轉導之抗體構築質體。
而且，本文中所用之“抗體”一詞，亦有關於本文中所述抗體的衍生物或變異體及其等展現與所述抗體相同 的特異性。“抗體變異體”之實例包括非人類抗體的人化變異體、“親和性成熟”抗體(如參見Hawkins等人於期刊“J.Mol.Biol”第254期第889-896頁(1992年)乙文及Lowman等人於期刊“Biochemistry”第30期第10832-10837頁(1991年)乙文)及所具有的作用細胞功能已改變之抗體突變體(如參見第5,648,260號美國專利；如上文引述之Kontermann與Dübel(2010年)乙書；及如上文引述之Little(2009年)乙書)。
用於本文中之“抗原結合域”、“抗原結合片段”及“抗體結合區”等詞係指一抗體分子之一部分，及其包含負責抗體與抗原之間的特異性結合作用之胺基酸。經抗體特異性辨識與結合之該抗原部分，係如上文所述稱作“抗原決定位”。如上文所述，一抗原結合域典型地可包含一抗體輕鏈可變區(VL)與一抗體重鏈可變區(VH)；然而，其不必同時包括二者。例如Fd片段具有二個VH區及通常保有完整抗原結合域的部分抗原結合功能。一抗體的抗原結合片段之實例包括：(1)Fab片段，其係一種具有VL、VH、CL及CH1域之單價片段；(2)F(ab')2片段，其係在樞扭區具有由一個雙硫鍵連接的二個Fab片段之一種二價片段；(3)Fd片段，其具有二個VH與CH1域；(4)Fv片段，其具有抗體的一單臂之VL與VH域；(5)dAb片段(Ward等人(1989年)於期刊”Nature”第341期第544-546頁乙文)，其具有一個VH域；(6)分離的互補決定區(CDR)；及(7)單鏈Fv(scFv)，較佳為後者(例如衍生自scFV庫)。雖然Fv片段的二個域即VL與VH係由不同基因所編碼，其等可使用重組方法連接，藉由一種合 成的連接子使其等成為單一蛋白鏈及其中VL與VH區成對形成單價分子(稱作單鏈Fv(scFv)；如參見Huston等人(1988年)於期刊“Proc.Natl.Acad.Sci USA”第85期第5879-5883頁乙文)。該等抗體片段可藉由具本領域技術者所知之習用技術獲得，及依據與完整抗體相同之方式評估該等片段的功能。
如本文所用的“單株抗體”一詞，係指從實質上均質性的抗體族群獲得之一抗體，亦即除了可能少量存在之可能天然發生的突變作用及/或後轉譯改質作用(如異構化作用、醯胺化作用)之外，組成該族群的個別抗體係相同的。單株抗體具有針對單一抗原性位點之高度特異性。而且，相對於典型包括針對不同決定子(抗原決定位)的不同抗體之習用(多株)抗體製劑，各單株抗體係針對抗原上的單一決定子。除了其等的特異性之外，單株抗體的優點在於其等係藉由融合瘤培養作用而合成，而不受到其他免疫球蛋白之污染。修飾詞“單株”係指該抗體的性質，因其係從實質上均質性的抗體族群獲得，而不應解釋為需要藉由任何特定方法來產生抗體。例如，待依據本發明使用之單株抗體可藉由Kohler等人於期刊“Nature”第256期第495頁(1975年)乙文首先述及的融合瘤方法製備，或可藉由重組DNA方法製備(如參見第4,816,567號美國專利)。亦可使用例如Clackson等人於期刊“Nature”第352期第624-628頁(1991年)乙文中及Marks等人於期刊“J.Mol.Biol.”第222期第581-597頁(1991年)乙文中所述之技術，從噬菌體抗體庫分離出 “單株抗體”。
本發明的單株抗體特別包括“嵌合型”抗體(免疫球蛋白)，其中該重鏈及/或輕鏈的一部分係與衍生自一特定物種或屬於一特定抗體類型或子類之抗體中的對應序列相同或同源，而該鏈的剩餘部分係與衍生自另一物種或屬於另一抗體類型或子類之抗體中的對應序列相同或同源，以及包括該等抗體的片段，只要其等展現所欲的生物活性即可(第4,816,567號美國專利；Morrison等人於期刊“Proc.Natl.Acad.Sci.USA”第81期第6851-6855頁(1984年)乙文)。本文中所感興趣的嵌合型抗體包括“靈長類化”抗體，其包含自非人類靈長類動物(如舊大陸猴、猿等)所衍生之可變域抗原結合序列及人類固定區序列。
非人類(如鼠類)抗體的“人化”形式，係大部分為人類序列之嵌合型免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(諸如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2或抗體的其他抗原結合子序列)，其含有極少量之衍生自非人類免疫球蛋白的序列。在大部分情況下，人化抗體係人類免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自受體的一高度可變區(同時CDR)之殘基，係被來自一種非人類物種諸如小鼠、大鼠或兔(供體抗體)之具有所欲特異性、親和性及能力的高度可變區之殘基置換。在一些情況下，人類免疫球蛋白的Fv架構區(FR)殘基係被對應的非人類殘基置換。而且，如本文所用的”人化抗體”亦可包含不存在於受體抗體或供體抗體中之殘基。該等改質作用之進行是為了進一步改善與最佳化抗體性能。人化抗體最佳亦 包含免疫球蛋白固定區(Fc)的至少一部分，典型地是人類免疫球蛋白的至少一部分。有關進一步的細節，請參見Jones等人於期刊“Nature”第321期第522-525頁(1986年)乙文；Reichmann等人於期刊“Nature”第332期第323-329頁(1988年)乙文；及Presta於期刊“Curr.Op.Struct.Biol.”第2期第593-596頁(1992年)乙文。
“人類抗體”一詞包括具有實質上對應於技藝中所知之人類生殖系免疫球蛋白序列的可變區與固定區之抗體，例如包括Kabat等人所述者(參見上文所引述之Kabat等人(1991年)乙文)。本發明的人類抗體可包括並非由人類生殖系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基(如藉由試管中的隨機或特定位點誘突變作用或藉由活體內的體細胞突變所引入的突變作用)，例如在CDR中，及尤其在CDR3中。人類抗體中之至少一個、二個、三個、四個、五個或更多位置，可由並非由人類生殖系免疫球蛋白序列編碼的一胺基酸殘基所置換。
如本文所用之”試管中產生的抗體”，係指其中所有或部分的可變區(如至少一個CDR)係在一種非免疫細胞篩選作用中產生之一抗體(如試管中噬菌體展示技術、蛋白質晶片或可在其中試驗候選序列與一抗原結合的能力之其他任何方法)。因而，該詞較佳排除在一免疫細胞中藉由基因體重排所產生的序列。
“雙特異性”或“雙功能”抗體或免疫球蛋白係一種人工融合抗體或免疫球蛋白，其具有二種不同的重鏈/輕 鏈對及二個不同的結合位點。可藉由多種方法產生雙特異性抗體，包括融合瘤的融合作用或連接Fab’片段。如參見Songsivilai與Lachmann於期刊“Clin.Exp.Immunol.”第79期第315-321頁(1990年)乙文。可使用本領域的嫻熟技術人員所知的多種方法，來獲得抗體或其抗原結合片段。例如，可使用重組DNA方法(第4,816,567號美國專利)產生抗體。亦可依據已知方法，藉由融合瘤生產作用而產生單株抗體(如參見Kohler與Milstein(1975年)於期刊“Nature”第256期第495-499頁乙文)。然後使用標準方法，諸如酵素連結免疫吸附分析法(ELISA)及表面電漿共振(畢亞寇(BIACORE)TM)分析，篩選依該方式所形成的融合瘤，以辨識出產生與一指定抗原特異性結合的一抗體之一或多種融合瘤。可使用該指定抗原的任一形式作為免疫原，如重組抗原、天然存在形式、其任何變異體或片段以及其抗原性肽。”
製備抗體之一例示性方法係包括篩選蛋白質表現庫，如噬菌體或核糖體展示庫。噬菌體展示技術係述於例如Ladner等人的第5,223,409號美國專利中；Smith(1985年)於期刊“Science”第228期第1315-1317頁乙文中；Clackson等人(1991年)於期刊“Nature”第352期第624-628頁乙文中。
除了使用展示庫之外，可使用指定抗原來免疫接種非人類動物如囓齒動物，如小鼠、倉鼠或大鼠。在一實施例中，該非人類動物包括至少一部分的人類免疫球蛋白基因。例如，可能用人類Ig基因座的大型片段，對於在小 鼠抗體生產方面具有缺陷的小鼠品系進行基因工程。可使用融合瘤技術，產生與篩選由具有所欲特異性的基因所衍生之具抗原特異性的單株抗體。如參見XENOMOUSETM、Green等人(1994年)於期刊“Nature Genetics”第7期第13-21頁乙文、US 2003-0070185、WO 96/34096及WO 96/33735。
可從非人類動物獲得單株抗體，然後可使用技藝中所知的重組DNA技術產生改質形式，如人化、去免疫化、嵌合形式。已在文獻中述及用於製備嵌合型抗體的多種方法。如參見Morrison等人於1985年期刊“Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.”第81期第6851頁乙文；Takeda等人於1985年期刊“Nature”第314期第452頁乙文；Cabilly等人之第4,816,567號美國專利；Boss等人之第4,816,397號美國專利；Tanaguchi等人之EP 0171496；EP 0173494，GB 2177096。亦可產生人化抗體，例如使用表現人類重鏈與輕鏈基因但無法表現內源性小鼠免疫球蛋白重鏈與輕鏈基因之基因轉殖小鼠。Winter述及一種例示性CDR移植方法，其可用於製備本文中所述的人化抗體(第5,225,539號美國專利)。可用非人類CDR的至少一部分置換一特定人類抗體的所有CDR，或可用非人類CDR僅僅置換部分的CDR。僅需置換人化抗體與一預定抗原結合所需之CDR數目。
可藉由用來自人類Fv可變域的等效序列置換並非直接涉及抗原結合作用之Fv可變域的序列，而產生人化抗體或其片段。Morrison(1985年)於期刊“Science”第229期第1202-1207頁乙文中；Oi等人(1986年)於期刊 “BioTechniques”第4期第2214頁乙文中；及第5,585,089號美國專利中；第5,693,761號美國專利中；第5,693,762號美國專利中；第5,859,205號美國專利中；及第6,407,213號美國專利中，提供用於產生人化抗體或其片段之例示性方法。該等方法包括分離、操作及表現核酸序列，而該核酸序列係編碼來自重鏈或輕鏈中之至少一者之所有或部分的免疫球蛋白Fv可變域。如上文所述，該等核酸可自產生對抗的一預定標的之一抗體之融合瘤獲得，以及自其他來源獲得。然後可將編碼該人化抗體分子的重組DNA選殖至一適當的表現載體中。
可藉由引入保留性取代作用、共有序列取代作用、生殖系取代作用及/或回復突變作用，而將一人化抗體最佳化。可藉由技藝中所知的數種技術中之任一者，製備該等經改變的免疫球蛋白分子(如Teng等人於1983年期刊“Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A”第80期第7308-7312頁乙文；Kozbor等人於1983年期刊“Immunology Today”第4期第7279頁乙文；Olsson等人於1982年期刊“Meth.Enzymol.”第92期第3-16頁乙文)，及可依據EP 239 400的教導製備。
亦可藉由人類T細胞抗原決定位的特定刪除作用或藉由WO 98/52976與WO 00/34317中所揭露方法之“去免疫化作用”，而將一抗體或其片段改質。簡言之，可針對與第II類MHC結合之肽，分析一抗體的重鏈與輕鏈可變域；該等肽代表潛在的T細胞抗原決定位(如WO 98/52976與WO 00/34317中所界定)。為檢測潛在的T細胞抗原決定 位，可使用稱作“肽線程處理”之一種電腦模式化方法；此外，可在人類第II類MHC結合肽的資料庫中搜尋存在於VH與VL序列中的基序，如WO 98/52976與WO 00/34317中所述。該等基序與18種主要MHC第II類DR異型中之任一者結合，及因而構成潛在的T細胞抗原決定位。可藉由取代可變域中的少數胺基酸殘基，或較佳藉由單一胺基酸取代作用，而將檢測出之潛在的T細胞抗原決定位除去。典型地進行保留性取代作用。通常可使用人類生殖系抗體序列中之一位置所共有的一胺基酸，但不僅限於此。人類生殖系序列係如Tomlinson等人(1992年)於期刊“J.MoI.Biol.”第227期第776-798頁乙文；Cook,G.P.等人(1995年)於期刊“Immunol.Today”第16(5)期第237-242頁乙文；及Tomlinson等人(1995年)於期刊“EMBOJ.”第14期第237-242頁乙文中所揭露。V BASE目錄提供人類免疫球蛋白可變區序列之詳盡目錄(由英國劍橋MRC蛋白工程中心之Tomlinson,LA.等人所彙編)。可使用該等序列作為人類序列的來源，如供架構區與CDR之用。亦可使用共有的人類架構區，如第6,300,064號美國專利中所述。
VH與VL成對及一起形成單一抗原結合位點。將最鄰近VH的CH域指定為CH1。各輕鏈係藉由一個共價雙硫鍵而與一重鏈連接；及依重鏈同型而定，二個重鏈係藉由一或多個雙硫鍵彼此連接。VH與VL域係由稱作架構區之四個相對保留序列區(FR1、FR2、FR3及FR4)所組成，其形成供三個高度可變序列區(互補決定區即CDR)所用之一鷹 架。CDR含有負責抗體與抗原的特異性交互作用之大部分殘基。CDR係稱作CDR1、CDR2及CDR3。因此，重鏈上的CDR組分係稱作H1、H2及H3，而輕鏈上的CDR組分係稱作L1、L2及L3。
“可變”一詞係指免疫球蛋白域中展現序列變異性及涉及決定一特定抗體的特異性與結合親和性之該等部分(亦即“可變域”)。變異性並非均勻地分佈在抗體的整個可變域；其集中在各重鏈與輕鏈可變區的子域中。該等子域係稱作“高度可變”區或“互補決定區”(CDR)。可變域之保留性較高(亦即非高度可變)的部分係稱作“架構”區(FRM)。天然存在的重鏈與輕鏈之可變域各包含四個FRM區，FRM區大體上具有β摺板構型及由三個高度可變區連結，高度可變區形成連結β摺板結構的環及在一些情況下形成部分的β摺板結構。FRM使各鏈中的高度可變區與其他鏈的高度可變區非常接近，而有助於形成抗原結合位點(參見如上文引述之Kabat等人乙文)。固定域並非直接涉及抗原結合作用，但展現各種作用細胞功能，諸如例如抗體依賴性、細胞媒介型細胞毒性及補體活化作用。
就本發明的結合分子而言，第一域與第二域亦較佳形成選自(scFv)2、(單域mAb)2、scFv-單域mAb、雙鏈抗體或其寡聚體之群組之一分子。
“CDR”及其複數“CDRs”等詞係指一互補決定區(CDR)，其中三個CDR(CDRL1、CDRL2與CDRL3)構成一輕鏈可變區的結合性質，及三個CDR(CDRH1、CDRH2與 CDRH3)構成一重鏈可變區的結合性質。CDR有助於一抗體分子的功能活性及由包含鷹架或架構區的胺基酸序列所分隔。確切的定義性CDR邊界與長度係視不同的分類與編號系統而定。因此可由Kabat、Chothia、搭界或其他任何邊界定義，及包括本文中所述的編號系統，來提述CDR。儘管邊界不同，該等系統中之各者在構成可變序列內之所謂的“高度可變區”方面有一定程度的重疊。依據該等系統的CDR定義，因此可能在關於相鄰架構區之長度和邊界區域方面有所不同。例如參見Kabat、Chothia及/或MacCallum(如上文引述之Kabat等人乙文；Chothia等人於1987年期刊“J.Mol.Biol”第196期第901頁乙文；及MacCallum等人於1996年期刊“J.Mol.Biol”第262期第732頁乙文)。然而，以依據所謂Kabat系統之編號為較佳。
“胺基酸”或“胺基酸殘基”一詞典型地係指具有其技藝公認定義之一胺基酸，諸如選自由下列所組成之群組之一胺基酸：丙胺酸(Ala或A)；精胺酸(Arg或R)；天冬醯胺酸(Asn或N)；天門冬胺酸(Asp或D)；半胱胺酸(Cys或C)；麩醯胺(GIn或Q)；麩胺酸(GIu或E)；甘胺酸(GIy或G)；組胺酸(His或H)；異白胺酸(He或I)：白胺酸(Leu或L)；離胺酸(Lys或K)；甲硫胺酸(Met或M)；苯丙胺酸(Phe或F)；脯胺酸(Pro或P)；絲胺酸(Ser或S)；蘇胺酸(Thr或T)；色胺酸(Trp或W)；酪胺酸(Tyr或Y)；及纈胺酸(VaI或V)，雖然可按需要使用改質、合成或罕見的胺基酸。胺基酸一般可分成具有一個非極性側鏈者(如丙胺酸、半胱胺酸、異白胺酸、白胺酸、甲 硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、纈胺酸)；具有一個負電荷側鏈者(如天門冬胺酸、麩胺酸)；具有一個正電荷側鏈者(如精胺酸、組胺酸、離胺酸)；或具有一個不帶電荷的極性側鏈者(如天冬醯胺酸、半胱胺酸、麩醯胺、甘胺酸、組胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸及酪胺酸)。
用於本文中之“高度可變區”一詞(亦稱為“互補決定區”或CDR)係指一抗體的胺基酸殘基，該等胺基酸殘基(通常具有極度序列變異性的三或四個短區)係在形成抗原結合位點及為抗原特異性的主要決定子之一免疫球蛋白的V區。可用於辨識CDR殘基之方法至少有二種：(1)其中一種係基於跨物種序列變異性之方法(亦即如上文引述之Kabat等人乙文)；及(2)另一種係基於抗原抗體複合體的結晶學研究之方法(Chothia,C.等人於期刊“J.Mol.Biol.”第196期第901-917頁(1987年)乙文)。然而，就該二種殘基辨識技術在界定重疊區但非相同區方面而言，可將其等併用而界定一融合CDR。然而，一般而言，較佳依據所謂Kabat(編號)系統來辨識CDR殘基。
“架構區”一詞係指存在於變異度較高(亦即高度可變)的CDR之間之一抗體可變區之本技術領域所公認的部分。典型地將該等架構區稱作架構1至4(FR1、FR2、FR3及FR4)，及其等提供用於在三維空間呈現六個CDR(三個來自重鏈及三個來自輕鏈)之一鷹架，而形成一抗原結合表面。
CDR典型地形成一環結構，該環結構可歸類為正 則結構。“正則結構”一詞係指抗原結合性(CDR)環所具有的主鏈構形。就比較結構研究而言，已發現六個抗原結合性環中的五個僅具有有限的可用構形譜型。各正則結構的特徵可在於多肽主鏈的扭轉角。抗體之間的對應環可能因此具有非常類似的三維結構，儘管在該等環的大部分中具有高度胺基酸序列變異性(Chothia與Lesk於1987年期刊“J.Mol.Biol.”第196期第901頁乙文；Chothia等人於1989年期刊“Nature”第342期第877頁乙文；Martin與Thornton於1996年期刊“J.Mol.Biol.”第263期第800頁乙文，其中各者在此完整地併入本案以為參考資料)。而且，在所具有的環結構與其周圍的胺基酸序列之間存在一種關係。由該環的長度與位於環內以及保留性架構內(亦即在環外)的關鍵位置之胺基酸殘基，測定一特定正則類型的構形。因此可基於該等關鍵胺基酸殘基之存在，來指派一特定正則類型。“正則結構”一詞亦可包括有關抗體的線性序列之考慮因素，例如Kabat所編錄者(如上文引述之Kabat等人乙文)。Kabat編號方案(系統)係以一致方式進行一抗體可變域的胺基酸殘基編號之廣泛採用的標準方式；及如在本文他處亦提及，Kabat編號方案係用於本發明之較佳方案。亦可使用附加的考慮因素，來測定一抗體的正則結構。例如，Kabat編號未能充分反映的該等差異，可由Chothia等人的編號系統說明及/或由其他技術表明，例如繞射結晶法及二維或三維計算模式化。因此，可將一指定抗體序列置於一正則類型，而在其他事項之外，還容許辨識適當的框架序列(如基於渴望 在一庫中包括多種正則結構)。抗體胺基酸序列的Kabat編號與如上文引述之Chothia等人乙文所述的結構考慮因素及其等對於詮釋抗體結構的正則特質之影響，係述於文獻中。
CDR3典型是抗體結合位點內的分子多樣性之最大來源。例如，H3可短至只有二個胺基酸殘基或超過26個胺基酸。不同類型的免疫球蛋白之次單元結構與三維構型係技藝中眾所周知。有關抗體結構之綜合論述，請參見冷泉港(Cold Spring Harbor Press)出版公司於1988年出版及由Harlow所著之“抗體：實驗室手冊(Antibodies：A Laboratory Manual)”乙書。具本領域技藝者將認知到各次單元結構如CH、VH、CL、VL、CDR、FR結構係包含活性片段，如與抗原結合之VH、VL或CDR次單元的部分，亦即抗原結合性片段；抑或如與例如Fc受體及/或補體結合及/或將其活化之CH次單元的部分。CDR典型係指Kabat CDR，如美國衛生與公眾服務部(1991年)出版及由Kabat等人編輯之“具免疫重要性之蛋白序列(Sequence of Proteins of Immunological Interest)”乙書中所述。用於特徵分析抗原結合位點之另一標準，係參照Chothia所述之高度可變性環。如參見Chothia等人(於1987年期刊“J.Mol.Biol.”第227期第799-817頁乙文)；及Tomlinson等人(1995年)於期刊“EMBO J.”第14期第4628-4638頁乙文。又一標準係牛津分子(Oxford Molecular)公司的AbM抗體模式化軟體中所採用的AbM定義。整體參見如“抗體工程實驗室手冊(Antibody Engineering Lab Manual)”乙書(由德國海德堡(Heidelberg)的施普林格 (Springer-Verlag)公司出版及由Duebel,S與Kontermann,R.編輯)中之“抗體可變域之蛋白序列與結構分析”。可任擇地使用針對Chothia高度可變性環或針對AbM所界定的環所述之類似關係，實施針對Kabat CDR所述的實施例。
在組裝與體細胞突變後之抗體基因序列係高度變異，及估計該等變異基因編碼1010種不同的抗體分子(美國加州聖地牙哥之學術出版(Academic Press)公司於1995年出版及由Jonio等人編輯之“免疫球蛋白基因(Immunoglobulin Genes)”乙書第二版)。因此，免疫系統提供一譜型的免疫球蛋白。“譜型”一詞係指全部或部分衍生自編碼至少一種免疫球蛋白的至少一序列之至少一核苷酸序列。該序列可藉由重鏈的V、D及J節段及輕鏈的V與J節段之活體內重排作用產生。任擇地，該序列可由回應所發生的重排作用之一細胞產生，如試管中刺激作用。任擇地，該等序列中之部分或所有者可藉由DNA剪接、核苷酸合成作用、誘突變作用及其他方法獲得，如參見第5,565,332號美國專利。一譜型可僅包括一序列或可包括多個序列，及包括在一基因多樣性集合中之該等序列。
在一實施例中，本發明的結合分子之第一結合域所包含之一VH區係包含CDR-H1、CDR-H2與CDR-H3，及其所包含之一VL區係包含CDR-L1、CDR-L2與CDR-L3，其中CDR-H1、CDR-H2與CDR-H3及CDR-L1、CDR-L2與CDR-L3係選自由下列所組成之群組：(1)如序列辨識編號：1中所述之CDR-H1，如序列辨識編號： 2中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：3中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：4中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：5中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：6中所述之CDR-L3；(2)如序列辨識編號：11中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：12中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：13中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：14中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：15中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：16中所述之CDR-L3；(3)如序列辨識編號：21中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：22中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：23中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：24中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：25中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：26中所述之CDR-L3；(4)如序列辨識編號：31中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：32中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：33中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：34中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：35中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：36中所述之CDR-L3；(5)如序列辨識編號：41中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：42中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：43中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：44中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：45中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：46中所述之CDR-L3；(6)如序列辨識編號：51中所述之CDR-H1，如序列辨識編 號：52中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：53中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：54中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：55中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：56中所述之CDR-L3；(7)如序列辨識編號：61中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：62中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：63中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：64中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：65中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：66中所述之CDR-L3；(8)如序列辨識編號：71中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：72中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：73中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：74中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：75中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：76中所述之CDR-L3；(9)如序列辨識編號：161中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：162中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：163中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：164中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：165中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：166中所述之CDR-L3；(10)如序列辨識編號：171中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：172中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：173中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：174中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：175中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：176中所述之CDR-L3； (11)如序列辨識編號：181中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：182中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：183中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：184中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：185中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：186中所述之CDR-L3；(12)如序列辨識編號：191中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：192中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：193中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：194中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：195中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：196中所述之CDR-L3；(13)如序列辨識編號：201中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：202中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：203中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：204中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：205中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：206中所述之CDR-L3；(14)如序列辨識編號：211中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：212中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：213中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：214中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：215中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：216中所述之CDR-L3；(15)如序列辨識編號：221中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：222中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：223中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：224中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：225中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：226中 所述之CDR-L3；(16)如序列辨識編號：311中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：312中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：313中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：314中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：315中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：316中所述之CDR-L3；(17)如序列辨識編號：321中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：322中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：323中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：324中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：325中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：326中所述之CDR-L3；(18)如序列辨識編號：331中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：332中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：333中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：334中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：335中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：336中所述之CDR-L3；(19)如序列辨識編號：341中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：342中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：343中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：344中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：345中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：346中所述之CDR-L3；(20)如序列辨識編號：351中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：352中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：353中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：354中所述之CDR-L1，如序列 辨識編號：355中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：356中所述之CDR-L3；(21)如序列辨識編號：361中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：362中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：363中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：364中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：365中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：366中所述之CDR-L3；(22)如序列辨識編號：371中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：372中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：373中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：374中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：375中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：376中所述之CDR-L3；(23)如序列辨識編號：381中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：382中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：383中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：384中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：385中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：386中所述之CDR-L3；(24)如序列辨識編號：581中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：582中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：583中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：584中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：585中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：586中所述之CDR-L3；(25)如序列辨識編號：591中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：592中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：593中所述之 CDR-H3，如序列辨識編號：594中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：595中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：596中所述之CDR-L3；(26)如序列辨識編號：601中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：602中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：603中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：604中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：605中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：606中所述之CDR-L3；(27)如序列辨識編號：611中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：612中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：613中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：614中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：615中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：616中所述之CDR-L3；(28)如序列辨識編號：621中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：622中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：623中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：624中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：625中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：626中所述之CDR-L3；(29)如序列辨識編號：631中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：632中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：633中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：634中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：635中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：636中所述之CDR-L3；(30)如序列辨識編號：641中所述之CDR-H1，如序列辨識編 號：642中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：643中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：644中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：645中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：646中所述之CDR-L3；(31)如序列辨識編號：651中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：652中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：653中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：654中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：655中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：656中所述之CDR-L3；(32)如序列辨識編號：661中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：662中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：663中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：664中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：665中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：666中所述之CDR-L3；(33)如序列辨識編號：671中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：672中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：673中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：674中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：675中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：676中所述之CDR-L3；(34)如序列辨識編號：681中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：682中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：683中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：684中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：685中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：686中所述之CDR-L3； (35)如序列辨識編號：691中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：692中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：693中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：694中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：695中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：696中所述之CDR-L3；(36)如序列辨識編號：701中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：702中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：703中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：704中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：705中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：706中所述之CDR-L3；(37)如序列辨識編號：711中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：712中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：713中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：714中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：715中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：716中所述之CDR-L3；(38)如序列辨識編號：721中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：722中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：723中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：724中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：725中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：726中所述之CDR-L3；(39)如序列辨識編號：731中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：732中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：733中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：734中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：735中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：736中 所述之CDR-L3；(40)如序列辨識編號：741中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：742中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：743中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：744中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：745中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：746中所述之CDR-L3；(41)如序列辨識編號：751中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：752中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：753中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：754中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：755中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：756中所述之CDR-L3；(42)如序列辨識編號：761中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：762中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：763中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：764中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：765中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：766中所述之CDR-L3；(43)如序列辨識編號：771中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：772中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：773中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：774中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：775中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：776中所述之CDR-L3；(44)如序列辨識編號：781中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：782中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：783中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：784中所述之CDR-L1，如序列 辨識編號：785中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：786中所述之CDR-L3；(45)如序列辨識編號：791中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：792中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：793中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：794中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：795中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：796中所述之CDR-L3；(46)如序列辨識編號：801中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：802中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：803中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：804中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：805中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：806中所述之CDR-L3；(47)如序列辨識編號：811中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：812中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：813中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：814中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：815中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：816中所述之CDR-L3；(48)如序列辨識編號：821中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：822中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：823中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：824中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：825中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：826中所述之CDR-L3；(49)如序列辨識編號：831中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：832中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：833中所述之 CDR-H3，如序列辨識編號：834中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：835中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：836中所述之CDR-L3；(50)如序列辨識編號：961中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：962中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：963中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：964中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：965中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：966中所述之CDR-L3；(51)如序列辨識編號：971中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：972中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：973中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：974中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：975中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：976中所述之CDR-L3；(52)如序列辨識編號：981中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：982中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：983中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：984中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：985中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：986中所述之CDR-L3；及(53)如序列辨識編號：991中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：992中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：993中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：994中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：995中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：996中所述之CDR-L3。
在又一實施例中，該結合分子的第一結合域係 包含一VH區，其係選自由序列辨識編號：7、序列辨識編號：17、序列辨識編號：27、序列辨識編號：37、序列辨識編號：47、序列辨識編號：57、序列辨識編號：67、序列辨識編號：77、序列辨識編號：167、序列辨識編號：177、序列辨識編號：187、序列辨識編號：197、序列辨識編號：207、序列辨識編號：217、序列辨識編號：227、序列辨識編號：317、序列辨識編號：327、序列辨識編號：337、序列辨識編號：347、序列辨識編號：357、序列辨識編號：367、序列辨識編號：377、序列辨識編號：387、序列辨識編號：587、序列辨識編號：597、序列辨識編號：607、序列辨識編號：617、序列辨識編號：627、序列辨識編號：637、序列辨識編號：647、序列辨識編號：657、序列辨識編號：667、序列辨識編號：677、序列辨識編號：687、序列辨識編號：697、序列辨識編號：707、序列辨識編號：717、序列辨識編號：727、序列辨識編號：737、序列辨識編號：747、序列辨識編號：757、序列辨識編號：767、序列辨識編號：777、序列辨識編號：787、序列辨識編號：797、序列辨識編號：807、序列辨識編號：817、序列辨識編號：827、序列辨識編號：837、序列辨識編號：967、序列辨識編號：977、序列辨識編號：987及序列辨識編號：997中所述之一VH區所組成之群組。
在另一實施例中，該結合分子的第一結合域係包含一VL區，其係選自由序列辨識編號：8、序列辨識編號：18、序列辨識編號：28、序列辨識編號：38、序列辨 識編號：48、序列辨識編號：58、序列辨識編號：68、序列辨識編號：78、序列辨識編號：168、序列辨識編號：178、序列辨識編號：188、序列辨識編號：198、序列辨識編號：208、序列辨識編號：218、序列辨識編號：228、序列辨識編號：318、序列辨識編號：328、序列辨識編號：338、序列辨識編號：348、序列辨識編號：358、序列辨識編號：368、序列辨識編號：378、序列辨識編號：388、序列辨識編號：588、序列辨識編號：598、序列辨識編號：608、序列辨識編號：618、序列辨識編號：628、序列辨識編號：638、序列辨識編號：648、序列辨識編號：658、序列辨識編號：668、序列辨識編號：678、序列辨識編號：688、序列辨識編號：698、序列辨識編號：708、序列辨識編號：718、序列辨識編號：728、序列辨識編號：738、序列辨識編號：748、序列辨識編號：758、序列辨識編號：768、序列辨識編號：778、序列辨識編號：788、序列辨識編號：798、序列辨識編號：808、序列辨識編號：818、序列辨識編號：828、序列辨識編號：838、序列辨識編號：968、序列辨識編號：978、序列辨識編號：988及序列辨識編號：998中所述之一VL區所組成之群組。
在一實施例中，該結合分子的第一結合域係包含選自由下列所組成之群組之一VH區與一VL區：(1)如序列辨識編號：7中所述之一VH區，及如序列辨識編號：8中所述之一VL區；(2)如序列辨識編號：17中所述之一VH區，及如序列辨識 編號：18中所述之一VL區；(3)如序列辨識編號：27中所述之一VH區，及如序列辨識編號：28中所述之一VL區；(4)如序列辨識編號：37中所述之一VH區，及如序列辨識編號：38中所述之一VL區；(5)如序列辨識編號：47中所述之一VH區，及如序列辨識編號：48中所述之一VL區；(6)如序列辨識編號：57中所述之一VH區，及如序列辨識編號：58中所述之一VL區；(7)如序列辨識編號：67中所述之一VH區，及如序列辨識編號：68中所述之一VL區；(8)如序列辨識編號：77中所述之一VH區，及如序列辨識編號：78中所述之一VL區；(9)如序列辨識編號：167中所述之一VH區，及如序列辨識編號：168中所述之一VL區；(10)如序列辨識編號：177中所述之一VH區，及如序列辨識編號：178中所述之一VL區；(11)如序列辨識編號：187中所述之一VH區，及如序列辨識編號：188中所述之一VL區；(12)如序列辨識編號：197中所述之一VH區，及如序列辨識編號：198中所述之一VL區；(13)如序列辨識編號：207中所述之一VH區，及如序列辨識編號：208中所述之一VL區；(14)如序列辨識編號：217中所述之一VH區，及如序列辨識編號：218中所述之一VL區； (15)如序列辨識編號：227中所述之一VH區，及如序列辨識編號：228中所述之一VL區；(16)如序列辨識編號：317中所述之一VH區，及如序列辨識編號：318中所述之一VL區；(17)如序列辨識編號：327中所述之一VH區，及如序列辨識編號：328中所述之一VL區；(18)如序列辨識編號：337中所述之一VH區，及如序列辨識編號：338中所述之一VL區；(19)如序列辨識編號：347中所述之一VH區，及如序列辨識編號：348中所述之一VL區；(20)如序列辨識編號：357中所述之一VH區，及如序列辨識編號：358中所述之一VL區；(21)如序列辨識編號：367中所述之一VH區，及如序列辨識編號：368中所述之一VL區；(22)如序列辨識編號：377中所述之一VH區，及如序列辨識編號：378中所述之一VL區；(23)如序列辨識編號：387中所述之一VH區，及如序列辨識編號：388中所述之一VL區；(24)如序列辨識編號：587中所述之一VH區，及如序列辨識編號：588中所述之一VL區；(25)如序列辨識編號：597中所述之一VH區，及如序列辨識編號：598中所述之一VL區；(26)如序列辨識編號：607中所述之一VH區，及如序列辨識編號：608中所述之一VL區；(27)如序列辨識編號：617中所述之一VH區，及如序列辨 識編號：618中所述之一VL區；(28)如序列辨識編號：627中所述之一VH區，及如序列辨識編號：628中所述之一VL區；(29)如序列辨識編號：637中所述之一VH區，及如序列辨識編號：638中所述之一VL區；(30)如序列辨識編號：647中所述之一VH區，及如序列辨識編號：648中所述之一VL區；(31)如序列辨識編號：657中所述之一VH區，及如序列辨識編號：658中所述之一VL區；(32)如序列辨識編號：667中所述之一VH區，及如序列辨識編號：668中所述之一VL區；(33)如序列辨識編號：677中所述之一VH區，及如序列辨識編號：678中所述之一VL區；(34)如序列辨識編號：687中所述之一VH區，及如序列辨識編號：688中所述之一VL區；(35)如序列辨識編號：697中所述之一VH區，及如序列辨識編號：698中所述之一VL區；(36)如序列辨識編號：707中所述之一VH區，及如序列辨識編號：708中所述之一VL區；(37)如序列辨識編號：717中所述之一VH區，及如序列辨識編號：718中所述之一VL區；(38)如序列辨識編號：727中所述之一VH區，及如序列辨識編號：728中所述之一VL區；(39)如序列辨識編號：737中所述之一VH區，及如序列辨識編號：738中所述之一VL區； (40)如序列辨識編號：747中所述之一VH區，及如序列辨識編號：748中所述之一VL區；(41)如序列辨識編號：757中所述之一VH區，及如序列辨識編號：758中所述之一VL區；(42)如序列辨識編號：767中所述之一VH區，及如序列辨識編號：768中所述之一VL區；(43)如序列辨識編號：777中所述之一VH區，及如序列辨識編號：778中所述之一VL區；(44)如序列辨識編號：787中所述之一VH區，及如序列辨識編號：788中所述之一VL區；(45)如序列辨識編號：797中所述之一VH區，及如序列辨識編號：798中所述之一VL區；(46)如序列辨識編號：807中所述之一VH區，及如序列辨識編號：808中所述之一VL區；(47)如序列辨識編號：817中所述之一VH區，及如序列辨識編號：818中所述之一VL區；(48)如序列辨識編號：827中所述之一VH區，及如序列辨識編號：828中所述之一VL區；(49)如序列辨識編號：837中所述之一VH區，及如序列辨識編號：838中所述之一VL區；(50)如序列辨識編號：967中所述之一VH區，及如序列辨識編號：968中所述之一VL區；(51)如序列辨識編號：977中所述之一VH區，及如序列辨識編號：978中所述之一VL區；(52)如序列辨識編號：987中所述之一VH區，及如序列辨 識編號：988中所述之一VL區；及(53)如序列辨識編號：997中所述之一VH區，及如序列辨識編號：998中所述之一VL區。
在一實例中，第一結合域係包含選自由序列辨識編號：9、序列辨識編號：19、序列辨識編號：29、序列辨識編號：39、序列辨識編號：49、序列辨識編號：59、序列辨識編號：69、序列辨識編號：79、序列辨識編號：169、序列辨識編號：179、序列辨識編號：189、序列辨識編號：199、序列辨識編號：209、序列辨識編號：219、序列辨識編號：229、序列辨識編號：319、序列辨識編號：329、序列辨識編號：339、序列辨識編號：349、序列辨識編號：359、序列辨識編號：369、序列辨識編號：379、序列辨識編號：389、序列辨識編號：589、序列辨識編號：599、序列辨識編號：609、序列辨識編號：619、序列辨識編號：629、序列辨識編號：639、序列辨識編號：649、序列辨識編號：659、序列辨識編號：669、序列辨識編號：679、序列辨識編號：689、序列辨識編號：699、序列辨識編號：709、序列辨識編號：719、序列辨識編號：729、序列辨識編號：739、序列辨識編號：749、序列辨識編號：759、序列辨識編號：769、序列辨識編號：779、序列辨識編號：789、序列辨識編號：799、序列辨識編號：809、序列辨識編號：819、序列辨識編號：829、序列辨識編號：839、序列辨識編號：969、序列辨識編號：979、序列辨識編號：989及序列辨識編號：999所組成之群組之一胺基酸 序列。
本發明的結合分子較佳具有長度為12個胺基酸之一個CDR-H3區，其中酪胺酸(Y)殘基係位於位置3、4及12。較佳的CDR-H3係示於序列辨識編號：43、193、333、613、703、733、823或973中。因此，在一較佳實施例中，本發明的結合分子具有如序列辨識編號：43、193、333、613、703、733、823或973中所示之一CDR-H3。
結合分子較佳具有序列辨識編號：340中所示的胺基酸序列。結合分子亦較佳具有序列辨識編號：980中所示的胺基酸序列。
本發明的結合分子較佳係一種“分離型”結合分子。當“分離型”用於說明本文中所揭露的結合分子時，係指已從其生產環境的一組分中辨識出、分開及/或回收之一種結合分子。該分離型結合分子較佳不與來自其生產環境的其他所有組分結合。其生產環境的污染組分，諸如來自重組型轉染細胞者，係通常干擾該多肽的診斷或治療用途之物質，及可包括酵素、荷爾蒙及其他蛋白質類或非蛋白質類溶質。在較佳實施例中，將結合分子純化至(1)足以藉由使用轉杯式定序儀而獲得N端或內部胺基酸序列的至少15個殘基之程度；或至(2)使用考馬斯藍或較佳銀染及在非還原或還原條件藉由SDS-PAGE達到之均質性。然而，通常藉由至少一個純化步驟製備一分離型抗體。
設想本文中所述的結合分子之胺基酸序列改質作用。例如，增進抗體的結合親和性及/或其他生物性質可 能是可取的。藉由在結合分子核酸中引入適當的核苷酸變化，或藉由肽合成作用，而製備結合分子的胺基酸序列變異體。
該等改質作用例如包括對於結合分子之胺基酸序列內的殘基之刪除作用及/或插入作用及/或取代作用。在最終構築質體具有所欲特徵之前提下，進行刪除作用、插入作用及取代作用之任一組合，而獲得最終構築質體。胺基酸之變化亦可能改變結合分子的後轉譯處理，諸如改變醣化位點的數目或位置。較佳可取代CDR中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸，同時取代架構區(FR)中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或25個胺基酸。取代作用較佳為本文中所述的保留性取代作用。附加地或任擇地，可在各CDR中插入或刪除1、2、3、4、5或6個胺基酸(當然依其等的長度而定)，同時可在各FR插入或刪除1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或25個胺基酸。
用於辨識結合分子的某些殘基或區為較佳的誘突變位置之適用方法，係稱作“丙胺酸掃瞄式誘突變技術”，如Cunningham與Wells於期刊“Science”第244期第1081-1085頁(1989年)乙文中所述。在該技術中，辨識出結合分子內之一殘基或標的殘基之基團(如帶電荷的殘基諸如精胺酸、天門冬胺酸、組胺酸、離胺酸及麩胺酸)，及用一中性或帶負電荷的胺基酸(最佳為丙胺酸或聚丙胺酸)置 換，而影響胺基酸與抗原決定位的交互作用。
然後，藉由引入在取代位點或用於取代位點之進一步變異體或其他變異體，而細部分析對於取代作用展現官能敏感性之該等胺基酸位置。因而，當供引入胺基酸序列變異之位點係預先確定時，突變作用本身的性質不需預先確定。例如，為分析突變作用在一指定位點之表現，而在一標的密碼子或區進行丙胺酸掃瞄或隨機誘突變作用，及針對所欲活性篩選所表現的結合分子變異體。
胺基酸序列插入作用較佳包括長度自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個殘基至含有100個或更多個殘基的多肽之胺基端及/或羧基端融合體，以及單一或多個胺基酸殘基的序列內插入作用。結合分子的插入型變異體包括與抗體N端或C端的融合體或與一酵素的融合體，或與增加該抗體的血清半衰期的一多肽之一融合體。
另一類型的變異體係一種胺基酸取代型變異體。該等變異體較佳係用一種不同殘基置換結合分子中之至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸殘基。最感興趣的取代型誘突變位點包括重鏈及/或輕鏈的CDR，尤其是高度可變區，但亦設想改變重鏈及/或輕鏈中的FR。
例如，若一CDR序列涵蓋6個胺基酸，則設想該等胺基酸中的1個、2個或3個胺基酸被取代。同樣地，若一CDR序列涵蓋15個胺基酸，則設想該等胺基酸中的1、2、3、4、5或6個胺基酸被取代。
一般而言，若重鏈及/或輕鏈之一或多個或所有 CDR中的胺基酸被取代，則所獲得的“經取代”序列與“原本”CDR序列之一致性係較佳至少60%，更佳65%，甚至更佳70%，尤其較佳75%，尤其更佳80%。其係指CDR與“經取代”序列的一致性程度係取決於CDR長度。例如，為了具有至少一個經取代的胺基酸，具有5個胺基酸的CDR與其經取代序列的一致性係較佳為80%。因此，結合分子的各CDR與其等經取代序列的一致性程度可能不同，如CDRL1的一致性可能為80%，而CDRL3的一致性可能為90%。
較佳的取代作用(或置換作用)係保留性取代作用。然而，預期任一取代作用(包括非保留性取代作用或下文表1中所列“例示性取代作用”中之一或多者)，只要該結合分子保有其經由第一結合域與BCMA結合之能力及經由第二結合域與CD3ε結合之能力，及/或其CDR具有與經取代序列之一致性(與“原本”CDR序列之一致性係至少60%，更佳65%，甚至更佳70%，尤其較佳75%，尤其更佳80%)。
保留性取代作用係示於下列標題為“較佳取代作用”之表1中。若該等取代作用造成生物活性之改變，則可能引入較大幅度的變化，即表1稱之為“例示性取代作用”或如下文參照胺基酸類型進一步所述者，及針對所欲特徵篩選產物。
藉由選擇在維持下列各項效應上顯著不同的取代作用，而達成本發明結合分子的生物性質之大幅改質作用：(a)在取代區域的多肽主鏈結構，例如其摺板或螺旋構 形；(b)在標的位點之分子的電荷或疏水性；或(c)側鏈的體積。基於常見的側鏈性質，將天然存在的殘基分成數個群組：(1)疏水性：正白胺酸、甲硫胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸；(2)中性親水性：半胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸；(3)酸性：天門冬胺酸、麩胺酸；(4)鹼性：天冬醯胺酸、麩醯胺、組胺酸、離胺酸、精胺酸；(5)影響鏈取向之殘基：甘胺酸、脯胺酸；及(6)芳族：色胺酸、酪胺酸、苯丙胺酸。
非保留性取代作用係涉及該等類型中之一類型的一成員與另一類型交換。不涉及維持結合分子的正確構形之任一個半胱胺酸殘基可被取代，一般用絲胺酸取代，以增進該分子的氧化安定性及阻止異常的交聯作用。相反地，可在抗體中添加半胱胺酸鍵，以增進其安定性(尤其當抗體係一抗體片段諸如一Fv片段時)。
尤其較佳的取代型變異體類別係涉及取代一親本抗體(如一人化或人類抗體)的一或多個高度可變區殘基。一般而言，經選擇供進一步研發之所得變異體所具有的生物性質，將優於產生其等的親本抗體。用於產生該等取代型變異體之一種簡便方法，係涉及使用噬菌體展示技術之親和性成熟作用。簡言之，在數個高度可變區位點(如6至7個位點)進行突變，而產生在各位點之所有可能的胺基酸取代作用。由此產生的抗體變異體係以來自絲狀噬菌體顆粒的單價方式，以與封裝在各顆粒內之M13的基因III產物之融合體形式展示。然後如本文中所揭露，針對生物活 性(如結合親和性)，篩選噬菌體所展示的變異體。為辨識供改質作用所用之高度可變區的候選位點，可進行丙胺酸掃瞄式誘突變技術，以辨識出顯著有助於抗原結合作用之高度可變區殘基。任擇地或附加地，分析抗原抗體複合體的晶體結構，可能有利於辨識出結合域與例如人類BCMA之間的接觸點。依據本文中所闡述之技術，該等接觸殘基及鄰近殘基可為供進行取代作用的候選殘基。一但產生該等變異體，如本文所述進行該組變異體之篩選，及篩選在一或多種相關分析法中具有優越性質之抗體供進一步研發用。
在本文中設想結合分子的其他改質作用。例如，該結合分子可與多種非蛋白質類聚合物中之一者連接，如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇與聚丙二醇的共聚物。亦可將該結合分子包埋在所製備的微膠囊中，例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合技術(例如分別為羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)；包埋在膠體藥物輸送系統(例如脂質體、白蛋白微球、微乳液、奈米顆粒及奈米膠囊)中；或包埋在粗乳液中。該等技術係揭露於Oslo,A.編輯之“雷明頓製藥學(Remington’s Pharmaceutical Sciences)”乙書第16版(1980年)中。
亦可將本文中所揭露的結合分子配製成免疫脂質體形式。“脂質體”係由不同類型的脂質、磷脂及/或適用於輸送一藥物至哺乳類動物的表面活性劑所組成之小型載體。脂質體的組分通常配置成一種雙層構造，而類似於生 物膜的脂質排列。藉由技藝中所知之方法，諸如Epstein等人於期刊“Proc.Natl.Acad.Sci.USA”第82期第3688頁(1985年)乙文；Hwang等人於期刊“Proc.Natl.Acad.Sci.USA”第77期第4030頁(1980年)乙文；第4,485,045號與第4,544,545號美國專利；及於1997年10月23日發表之W0 97/38731中所述，製備含有抗體之脂質體。在第5,013,556號美國專利中揭露具有增進的循環時間之脂質體。可用包含磷脂醯膽鹼、膽固醇與PEG衍生型磷脂醯乙醇胺(PEG-PE)之一種脂質組成物，藉由逆相蒸發法，產生特別適用的脂質體。將脂質體從具有所界定孔徑的過濾器擠出，而產生所欲直徑的脂質體。如Martin等人於期刊“J.Biol.Chem.”第257期第286-288頁(1982年)乙文中所述，經由一種雙硫鍵互換反應，將本發明抗體的Fab’片段與脂質體複合。在該脂質體內係選擇性地包含一化療藥物。參見Gabizon等人於期刊“J.National Cancer Inst.”第81(19)期第1484頁(1989年)乙文。
當使用重組技術時，結合分子可在細胞內產生、在周質空間中產生或直接分泌至培養基中。若該結合分子係在細胞內產生，則第一步驟係例如藉由離心作用或超過濾作用，將不論是宿主細胞或溶胞片段的顆粒碎片移除。Carter等人於期刊“Bio/Technology”第10期第163-167頁(1992年)乙文中述及用於分離抗體之一程序，其中該抗體係分泌至大腸桿菌(E.coli)的周質空間。
可使用例如羥基磷灰石層析法、凝膠電泳、透析 及親和層析法，純化從細胞所製備之結合分子組成物，其中親和層析法係較佳的純化技術。
在另一方面，本發明係有關於編碼本發明的一結合分子之一核酸序列。“核酸”一詞係嫻熟技藝者所熟知，及涵蓋DNA(諸如cDNA)與RNA(諸如mRNA)。核酸可為雙股與單股、線性及環狀。該核酸分子較佳包含在一載體中，而該載體較佳包含在一宿主細胞中。該宿主細例如經本發明的核酸序列轉形或轉染後，可表現該結合分子。就該目的而言，該核酸分子係以可操作方式與控制序列連接。
載體係作為運送(外來)遺傳物質進入一細胞的載具之一核酸分子。“載體”一詞涵蓋但不限於質體、病毒、黏接質體及人工染色體。一般而言，基因工程載體包含一個複製起點、一個多選殖位點及一個篩選標記。載體本身一般係一核苷酸序列，通常係一DNA序列，其包含一插入(轉殖基因)序列與作為載體“主鏈”之一較大型序列。現代載體除了所插入的轉殖基因與一主鏈之外，可能還涵蓋附加的特徵：啟動子、遺傳標記、抗生素抗性、報導子基因、靶向序列、蛋白純化標籤。特別稱為表現載體(表現作用構築質體)之載體係用於在標的細胞中表現轉殖基因，及一般具有控制序列，諸如驅動轉殖基因表現作用之一啟動子序列。在細菌細胞中，將一載體插入標的細胞之作用通常稱為“轉形作用”；在真核細胞中稱為”轉染作用”；而病毒載體的插入作用亦稱作“轉導作用”。
如本文所用之“宿主細胞”一詞係意欲指一細胞，及在該細胞中藉由轉形作用、轉染作用之類導入編碼本發明的結合分子之一核酸。應當理解該詞不僅係指特定的個體細胞，亦指該細胞的子代或潛在子代。因為在後繼的生產作用中，可能由於突變作用或環境影響而發生改質作用，屆時該子代可能事實上與母細胞不相同，但仍涵蓋於如本文所用之該詞的範圍內。
如本文所用之“表現作用”一詞包括涉及本發明的一結合分子之生產作用的任一步驟，其包括但不限於轉錄作用、後轉錄改質作用、轉譯作用、後轉譯改質作用及分泌作用。
“控制序列”一詞係指在一特定宿主生物體中表現一種以可操作方式連接的編碼序列所需之DNA序列。適用於原核生物的控制序列例如包括啟動子，選擇性地包括操縱子序列及核糖體結合位點。已知真核細胞運用啟動子、多腺苷酸化訊號及增強子。
當核酸與另一核酸序列處於一功能性關係時，則該核酸係“以可操作方式連接”。例如，若前序列或分泌前導的DNA係以參與多肽分泌作用的蛋白前體形式表現，則前序列或分泌前導的DNA係以可操作方式與多肽的DNA連接；若一啟動子或增強子影響該序列的轉錄作用，則該啟動子或增強子係以可操作方式與編碼序列連接；或者若一核糖體結合位點的位置係便於促進一編碼序列的轉譯作用，則該核糖體結合位點係以可操作方式與該一編碼序列 連接。一般而言，“以可操作方式連接”係指所連接的DNA序列係相鄰的，及在分泌前導的情況係相鄰及位於同一讀框中。然而，增強子不一定要相鄰。連接作用係藉由在合宜的限制酶酶切位點之接合作用而完成。若不存在該等位點，則依據習用作法使用合成的寡核苷酸轉接子或連接子。
“宿主細胞”、“標的細胞”或“受體細胞”等詞係意欲包括任一個別細胞或細胞培養物，其可成為或已是載體或外源性核酸分子、聚核苷酸及/或蛋白嵌入作用的受體。亦意欲包括單一細胞的子代，及該子代由於天然、意外或蓄意的突變作用而未必與原本的母細胞完全相同(在形態方面或在基因體或總DNA補體方面)。該等細胞可為原核或真核細胞，及包括但不限於細菌細胞、酵母細胞、動物細胞及哺乳類動物細胞，如鼠類、大鼠、獼猴或人類。
適宜的宿主細胞包括原核生物與真核宿主細胞，及包括酵母、真菌、昆蟲細胞及哺乳類動物細胞。
可在細菌中產生本發明的結合分子。在表現作用後，本發明的結合分子及較佳從位於可溶性部分的大腸桿菌(E.coli)細胞糊狀物中分離出來的該結合分子，可經由如親和層析法及/或尺寸排阻法純化。可進行最終純化作用，其係與用於純化如在CHO細胞中表現的抗體之方法類似。
除了原核生物之外，真核微生物諸如絲狀真菌或酵母係適用於選殖或表現本發明的結合分子之宿主。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或是常見的麵包酵母，係低等真核宿主微生物中最常被使用者。然而，通常可取得其 他的一些屬、物種及品系及其等可用於本文中，諸如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克魯維酵母屬(Kluyveromyces)宿主諸如乳酸克魯維酵母(K.lactis)、脆壁克魯維酵母(K.fragilis)(ATCC 12424)、保加利亞克魯維酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16045)、威克拉姆氏克魯維酵母(K.wickeramii)(ATCC 24178)、瓦特氏克魯維酵母(K.waltii)(ATCC 56500)、果蠅克魯維酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36906)、耐熱克魯維酵母(K.thermotolerans)及馬克斯克魯維酵母(K.marxianus)；耶氏酵母屬(EP 402 226)；巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris)(EP 183 070)；念珠菌屬；瑞氏木黴菌(Trichoderma reesia)(EP 244 234)；紅麵包黴菌(Neurospora crassa)；許旺氏酵母屬諸如西方許旺氏酵母(Schwanniomyces occidentalis)；及絲狀真菌諸如紅黴菌屬、青黴菌屬、彎頸黴屬及麴菌屬宿主諸如小巢狀麴菌(A.nidulans)及黑麴菌(A.niger)。
適用於表現本發明的醣化結合分子及較佳抗體衍生型結合分子之宿主細胞，係衍生自多細胞生物體。無脊椎動物細胞之實例包括植物與昆蟲細胞。已辨識出多種桿狀病毒株與變異體及其等對應之來自宿主的允許昆蟲宿主細胞，該等宿主諸如秋夜盜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛蟲)、埃及斑蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、白線斑蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)(果蠅)及家蠶(Bombyx mori)。用於轉染作用的多種病毒株係可公開取得的，如加州苜蓿夜蛾(Autographa californica)核多 角體病毒的L-1變異體及家蠶(Bombyx mori)核多角體病毒的Bm-5株，及可如本發明使用該等病毒作為本文中之病毒，尤其用於轉染秋夜盜蛾(Spodoptera frugiperda)細胞。
亦可使用棉花、玉米、馬鈴薯、大豆、矮牽牛、番茄、阿拉伯芥屬植物及煙草之植物細胞培養作為宿主。適合在植物細胞培養中生產蛋白之選殖與表現載體，係嫻熟本領域技藝者所知。如參見Hiatt等人(1989年)於期刊“Nature”第342期第76-78頁乙文；Owen等人(1992年)於期刊“Bio/Technology”第10期第790-794頁乙文；Artsaenko等人(1995年)於期刊“Plant J”第8期第745-750頁乙文；及Fecker等人(1996年)於期刊“Plant Mol Biol”第32期第979-986頁乙文。
然而，最感興趣的是脊椎動物細胞，而在培養(組織培養)中增殖脊椎動物細胞已成為一例行程序。適用的哺乳類動物宿主細胞株之實例係由SV40轉形之猴腎CV1株(COS-7，ATCC CRL 1651)；人類胚腎細胞株(經次選殖而供在懸浮培養中生長之293或293細胞，Graham等人於期刊“J.Gen Virol”第36期第59頁(1977年)乙文)；幼倉鼠腎細胞(BHK，ATCC CCL 10)；中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR(CHO，Urlaub等人於期刊“Proc.Natl.Acad.Sci.USA”第77期第4216頁(1980年)乙文)；小鼠足細胞(TM4，Mather於期刊“Biol.Reprod.”第23期第243-251頁(1980年)乙文)；猴腎細胞(CVI ATCC CCL 70)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76，ATCC CRL1587)；人類子宮頸癌細胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬 腎細胞(MDCK，ATCC CCL 34)；水牛鼠肝臟細胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人類肺細胞(W138，ATCC CCL 75)；人類肝臟細胞(Hep G2，1413 8065)；小鼠乳房腫瘤(MMT 060562，ATCC CCL5 1)；TRI細胞(Mather等人於期刊“Annals N.Y Acad.Sci.”第383期第44-68頁(1982年)乙文)；MRC 5細胞；FS4細胞；及人類肝癌細胞株(Hep G2)。
當使用重組技術時，結合分子可在細胞內產生、在周質空間中產生或直接分泌至培養基中。若該結合分子係在細胞內產生，則第一步驟係例如藉由離心作用或超過濾作用，將不論是宿主細胞或溶胞片段的顆粒碎片移除。Carter等人於期刊“Bio/Technology”第10期第163-167頁(1992年)乙文中述及用於分離抗體之一程序，其中該抗體係分泌至大腸桿菌(E.coli)的周質空間。簡言之，細胞糊狀物係在乙酸鈉(pH 3.5)、EDTA及苯甲基磺醯氟(PMSF)存在下解凍約30分鐘。可藉由離心作用移除細胞碎片。當抗體係分泌至培養基中時，一般首先使用一種商購取得的蛋白濃縮過濾器，例如艾美康恩(Amicon)公司或密里博(Millipore)公司的派利康(Pellicon)超過濾單元，濃縮來自表現系統的上清液。可在前述任一步驟中包括一蛋白酶抑制劑諸如PMSF，而抑制蛋白分解作用；及可包括抗生素，而阻止外源污染物之生長。
可使用例如羥基磷灰石層析法、凝膠電泳、透析及親和層析法，純化從宿主細胞所製備之本發明的結合分子，其中親和層析法係較佳的純化技術。
親和性配位體最常連接的基質係瓊脂糖，但亦可取得其他基質。相較於瓊脂糖，機械上安定的基質諸如可控多孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯所達到的流速較快及處理時間較短。當本發明的結合分子包含一個CH3域時，在其純化作用中係適合使用Bakerbond ABXM樹脂(美國紐澤西州菲利普斯堡(Phillipsburg)之J.T.貝克(Baker)公司)。依待回收的抗體而定，亦可使用其他的蛋白質純化技術，諸如在離子交換管柱上的分化技術、乙醇沉澱法、逆相HPLC、在氧化矽上的層析法、在肝素SEPHAROSETM上的層析法、在陰離子或陽離子交換樹脂(諸如聚天門冬胺酸管柱)上的層析法、層析聚焦技術、SDS-PAGE及硫酸銨沉澱技術。
在另一方面，提供用於生產本發明的結合分子之方法，該等方法包含在容許該結合分子表現之條件下，培養本文中所界定的一宿主細胞，及從培養物中回收所產生的結合分子。
“培養”一詞係指在適宜的條件下，培養基中的細胞在試管中維持、分化、生長、增殖及/或繁殖。
在一任擇的實施例中，提供包含本發明的一結合分子或依據本發明的方法所產生的一結合分子之組成物。該組成物較佳為一種藥學組成物。
如本文所用之“藥學組成物”一詞，係有關於用於投藥至一病患及較佳一人類病患之一組成物。本發明的特佳藥學組成物係包含本發明的結合分子。該藥學組成物較 佳包含載劑、安定劑及/或賦形劑之適宜調配物。在一較佳實施例中，該藥學組成物包含供非經腸、經皮膚、管胺內、動脈內、脊椎內及/或鼻內投藥作用或藉由直接注射至組織中之一組成物。尤其設想該組成物係經由輸注或注射作用投藥至一病患。適宜的組成物投藥作用可藉由不同方式達成，如藉由靜脈內、腹膜內、皮下、肌內、局部或皮內投藥作用。尤其，本發明提供該適宜組成物的不間斷式投藥作用。就一個非限制性實例而言，可藉由病患所佩戴用於計量進入病患體內的治療劑流入量之小型幫浦系統，而達成不間斷式亦即連續式投藥作用。可藉由使用該等幫浦系統，來投予包含本發明的結合分子之藥學組成物。該等幫浦系統係技藝中眾所周知，及通常依靠定期更換含有待輸注的治療劑之藥匣。當更換該幫浦系統中的藥匣時，在其他情況下之治療劑不間斷流入病患體內之現象，可能因而發生暫時性中斷。在該情況下，在本發明的藥學方式與方法之意涵內，仍將藥匣更換前的投藥階段與藥匣更換後的投藥階段視為一起構成該治療劑的一種“不間斷式投藥作用”。
可藉由一種流體輸送裝置或小型幫浦系統，其包括用於驅動流體離開儲存器之一流體驅動機制及用於致動該驅動機制之一致動機制，來進行本發明的該等結合分子之靜脈內或皮下的連續或不間斷式投藥作用。用於皮下投藥作用的幫浦系統可包括用於刺入病患皮膚的一針頭或一套管，而將適宜的組成物輸送至病患體內。該幫浦系統可 直接固定或黏貼在病患皮膚上而獨立於靜脈、動脈或血管，以使得該幫浦系統可與病患皮膚直接接觸。該幫浦系統可黏貼在病患皮膚上達24小時至數天。該幫浦系統可能為小型尺寸，及具有一個供小批量用的儲存器。就一個非限制性實例而言，供待投藥的適宜藥學組成物所用之儲存器體積可介於0.1與50毫升之間。
可藉由黏貼在皮膚上的貼片及每隔一段時間更換之方式，進行經皮膚的連續投藥作用。具本領域技藝者知悉適合該用途之用於輸送藥物的貼片系統。值得注意的是經皮膚投藥作用係特別適合不間斷式投藥作用，因為可有利地同時完成用罄的第一貼片之更換及新的第二貼片之放置，例如將第二貼片放置在緊鄰用罄的第一貼片之皮膚表面及緊接著移除用罄的第一貼片。因而不會出現流量中斷或動力電池單元故障之問題。
本發明的組成物可進一步包含一種藥學上可接受的載劑。適宜的藥學載劑之實例係技藝中眾所周知，及包括溶液，如經磷酸鹽緩衝的生理食鹽水、水、乳化液諸如油/水乳化液、各種類型的潤濕劑、無菌溶液、脂質體等。可藉由眾所周知的習用方法配製包含該等載劑的組成物。調配物可包含碳水化合物、緩衝液、胺基酸及/或表面活性劑。碳水化合物可為非還原性糖類，較佳海藻糖、蔗糖、八硫酸酯、山梨糖醇或木糖醇。一般而言，如本文所用之“藥學上可接受的載劑”係指與藥學投藥作用相容的任一及所有溶劑、分散介質、塗料、抗細菌劑與抗真菌劑、等張劑 與吸收延遲劑。用於藥學活性物質之該等介質與作用劑係技藝中眾所周知。可接受的載劑、賦形劑或安定劑在所用的劑量與濃度係對於領受者不具毒性，及包括：附加的緩衝劑；防腐劑；共溶劑；抗氧化劑，包括抗壞血酸與甲硫胺酸；螯合劑諸如EDTA；金屬複合體(如鋅-蛋白複合體)；生物可降解性聚合物，諸如聚酯類；形成鹽類的抗衡離子，諸如鈉、多羥基糖醇類；胺基酸類，諸如丙胺酸、甘胺酸、天冬醯胺酸、2-苯丙胺酸及蘇胺酸；糖類或糖醇類，諸如海藻糖、蔗糖、八硫酸酯、山梨糖醇或木糖醇水蘇糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、肌糖、半乳糖、乳糖醇、核糖醇、肌醣醇、半乳糖醇、丙三醇、環醇(如環己六醇)、聚乙二醇；含硫還原劑，諸如榖胱甘肽、硫辛酸、硫代乙醇酸鈉、硫代丙三醇、[α]-單硫代丙三醇及硫代硫酸鈉；低分子量蛋白，諸如人類血清白蛋白、牛血清白蛋白、明膠或其他免疫球蛋白；及親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮。該等調配物可用於連續投藥作用，其可能是具有及/或不具有幫浦系統之靜脈內或皮下投藥作用。胺基酸可為帶電荷的胺基酸，較佳為離胺酸、乙酸離胺酸、精胺酸、麩胺酸鹽及/或組胺酸。表面活性劑可為分子量較佳大於1.2 KD之清潔劑及/或分子量較佳大於3 KD之聚醚。較佳清潔劑之非限制性實例妥文(Tween)20、妥文40、妥文60、妥文80或妥文85。較佳聚醚之非限制性實例係PEG 3000、PEG 3350、PEG 4000或PEG 5000。用於本發明中的緩衝液系統之pH值較佳為5至9，及可包含檸檬酸鹽、琥珀酸鹽、磷酸鹽、組 胺酸及乙酸鹽。
本發明的組成物可按例如藉由劑量遞增研究所測定的適宜劑量投藥至個體，該研究係對於非黑猩猩靈長類動物例如獼猴投予展現本文中所述的跨物種特異性之本發明多肽的遞增劑量。如上所述，在非黑猩猩靈長類動物的臨床前試驗中，所使用之展現本文中所述的跨物種特異性之本發明的結合分子之形式，可有利地與投予人類的藥物相同。該等組成物亦可與其他蛋白質類與非蛋白質類藥物合併投予。該等藥物可與包含如本文所界定的本發明多肽之組成物同時投藥，或在該多肽投藥之前或之後按所界定的時間間隔與劑量分開投藥。給藥方式將由主治醫師與臨床因子決定。如醫學技藝中眾所周知者，任一病患的劑量將取決於眾多因子，包括病患的身量、體表面積、年齡、待投予的特定化合物、性別、投藥時間與途徑、整體健康狀況及並行投予的其他藥物。
用於非經腸投藥之製劑包括無菌水溶液或非水溶液、懸浮液及乳化液。非水溶劑之實例為丙二醇、聚乙二醇、植物油類諸如橄欖油及可注射性有機酯類諸如油酸乙酯。含水載劑包括水、醇溶液/水溶液、乳化液或懸浮液，包括食鹽水與緩衝型介質。非經腸載劑包括氯化鈉溶液、林格氏(Ringer)右旋糖、右旋糖與氯化鈉、乳酸化林格氏液或不揮發油類。靜脈內載劑包括流體與營養補充劑、電解質補充劑(諸如該等以林格氏右旋糖為基礎者)之類。亦可存在防腐劑與其他添加劑，諸如例如抗微生物劑、抗氧化劑、 螯合劑、惰性氣體之類。另外，本發明的組成物可包含蛋白質類載劑，如血清白蛋白或免疫球蛋白，其等較佳係源自人類。除了本文中所界定之本發明的多肽之外，設想本發明的組成物可依該組成物的預定用途而包含其他生物活性劑。該等作用劑可為技藝中所知之作用在胃腸系統之藥物、作用為細胞抑制劑之藥物、阻止高尿酸血症之藥物、抑制免疫反應之藥物(如皮質類固醇)、調控炎性反應之藥物、作用在循環系統之藥物及/或諸如細胞介素之作用劑。亦設想本發明的結合分子係應用在合併療法中，亦即與另一抗癌藥物併用。
可藉由例如下列實例中、WO 99/54440中或Schlereth等人(於期刊“Cancer Immunol.Immunother.”第20期第1-12頁(2005年))乙文中所述的細胞毒性分析法，測定本文中所界定的藥學組成物之生物活性。如本文所用之“功效”或“活體內功效”係指對於使用本發明的藥學組成物之療法的反應，其係依據例如標準化NCI反應標準。使用本發明的一種藥學組成物之療法的成效或活體內功效，係指該組成物在其預定用途之效用，亦即該組成物導致其所欲效應亦即除去病變細胞如腫瘤細胞之能力。可藉由針對個別疾病實體所建立的標準方法，包括但不限於白血球計數、分類計數、螢光啟動型細胞分選技術、骨髓抽吸，來監測活體內功效。另外，可使用各種疾病特異性臨床化學參數及其他已建立的標準方法。而且，可使用電腦輔助式斷層攝影、X光、核磁共振斷層攝影(如針對以美國國家癌症研 究院標準為基礎之反應評估[NCI所資助之國際工作小組Cheson BD,Horning SJ,Coiffier B,Shipp MA,Fisher RI,Connors JM,Lister TA,Vose J,Grillo-Lopez A,Hagenbeek A,Cabanillas F,Klippensten D,Hiddemann W,Castellino R,Harris NL,Armitage JO,Carter W,Hoppe R,Canellos GP於1999年4月期刊“J Clin Oncol.”第17(4)期第1244頁之“非何杰金氏淋巴瘤的標準化反應標準之國際研討會報導”乙文])、正子發射斷層攝影掃瞄、白血球計數、分類計數、螢光啟動型細胞分選技術、骨髓抽吸、淋巴結活組織檢查/組織學檢查及各種淋巴瘤特異性臨床化學參數(如乳酸去氫酶)及其他已建立的標準方法。
在研發藥物諸如本發明的藥學組成物時所面臨的另一項重大挑戰，係如何以可預測方式調控藥物動力學性質。就此目的而言，可建立候選藥物的藥物動力學廓型，亦即影響一特定藥物治療一指定病況的能力之藥物動力學參數廓型。影響一藥物治療一特定疾病實體的能力之該藥物的藥物動力學參數，係包括但不限於：半衰期、分佈體積、肝臟首渡代謝作用及血清結合程度。上述參數中的各者可影響一指定藥劑的功效。
“半衰期”係指經由生物過程如代謝作用、排泄作用等除去所投予藥物的50%所需之時間。
“肝臟首渡代謝作用”係指一藥物在第一次與肝臟接觸時被代謝之傾向，亦即在其第一次通過肝臟期間。
“分佈體積”係指一藥物在身體各腔室的留置程 度，如細胞內與細胞外空間、組織及器官等，及該藥物在該等腔室內之分佈。
“血清結合程度”係指一藥物與血清蛋白諸如白蛋白交互作用及與其結合而導致該藥物生物活性降低或喪失之傾向。
藥物動力學參數亦包括針對所投予之一指定量的藥物之生物可利用性、滯後時間(Tlag)、Tmax、吸收率、更多起效及/或Cmax。“生物可利用性”係指在血液腔中之一藥物量。“滯後時間”係指在藥物投藥作用與在血液或血漿中可檢測出與可測得藥物之間的時間延遲。
“Tmax”係達到藥物的最大血中濃度所需之時間，而“Cmax”係一指定藥物所獲能得的最大血中濃度。達到該藥物的生物效應所需之血液或組織濃度之時間，係受到所有參數之影響。可在如上文所概述之非黑猩猩靈長類動物的臨床前動物試驗中，測定展現跨物種特異性的雙特異性單鏈抗體之藥物動力學參數，其亦闡明於Schlereth等人文獻(於期刊“Cancer Immunol.Immunother.”第20期第1-12頁(2005年)乙文)中。
如本文所用“毒性”一詞係指一藥物在不良事件或嚴重不良事件中所表現的毒性效應。該等副作用事件可能係指整體對於藥物缺乏可耐受性及/或在投藥作用後缺乏局部耐受性。毒性亦可包括該藥物所引起的致畸胎或致癌效應。
如本文所用之“安全性”、“在活體內安全性”或 “可耐受性”等詞，係界定為一藥物的投藥作用立即在投藥作用後(局部耐受性)及在較長的施用藥物期間不引發嚴重不良事件。可在治療與後續追蹤期間，例如定期地評估“安全性”、“在活體內安全性”或“可耐受性”。測量包括臨床評估，如器官之表現及篩檢實驗室檢查之異常。可進行臨床評估，及依據NCI-CTC及/或MedDRA標準將偏離正常的結果記錄/編碼。器官之表現可包括諸如過敏/免疫學、血液/骨髓、心律不整、凝血功能之類之標準，如“不良事件的通用術語標準(Common Terminology Criteria for Adverse Events)”(CTCAE)第3.0版中所闡述。可進行測試的實驗室檢查參數例如包括血液學、臨床化學、凝血功能廓型及尿液分析，及檢查其他體液諸如血清、血漿、淋巴液或脊髓液、液體之類。因而亦可藉由例如身體檢查、成像技術(亦即超音波、X光、CT掃描、磁振造影(MRI)、其他技術性設備之測量(亦即心電圖)、生命徵象，藉由測量實驗室檢查參數及記錄不良事件，而評估安全性。例如，可藉由病理組織學及/或組織化學方法，檢視如本發明的用途與方法中之非黑猩猩靈長類動物的不良事件。
“有效劑量”或“有效藥量”一詞係界定為足以達成或至少部分達成所欲效應之一量。“治療有效劑量”一詞係界定為在已罹患該疾病的病患中足以治愈或至少部分止息該疾病與其併發症之一量。針對該用途的有效量將依感染的嚴重性與個體本身的免疫系統之整體狀況而定。“病患”一詞係包括領受預防性或治療性治療之人類及其他哺 乳類動物個體。
如本文所用之“有效且無毒性劑量”一詞係指本發明的結合分子之可耐受劑量，其係高至足以除去病變細胞、除去腫瘤、造成腫瘤縮小或疾病穩定，而不具有或實質上不具有重大毒性效應。例如可藉由技藝中所述的劑量遞增研究，測定該等有效且無毒性劑量，及其等應低於引發嚴重不良副作用事件(劑量相關毒性(DLT))之劑量。
例如在1997年7月16日召開的ICH指導委員會會議之ICH三方協和準則(Harmonised Tripartite Guideline)中的生物技術藥物臨床前安全性評估(Preclinical safety evaluation of biotechnology-derived pharmaceuticals)S6中，亦提及上述辭彙。
本發明的結合分子之適當劑量或治療有效量，將依待治療的病況、該病況的嚴重性、先前療法及該病患的臨床病史及對於治療劑的反應而定。可依據主治醫師的判斷調整適當劑量，使得該劑量可一次投予至病患，或以一系列投藥作用投予至病患。該藥學組成物可投予作為唯一的治療劑，或視需要與附加的療法諸如抗癌療法併用。
本發明的藥學組成物係特別適用於非經腸投藥作用，亦即皮下、肌內、靜脈內、關節內及/或滑膜內。可藉由一次全劑量注射或連續輸注方式，進行非經腸投藥作用。
若藥學組成物係經冷凍乾燥，則該冷凍乾燥型物質係首先在適當液體中復水，然後再進行投藥。可在例如 注射用的抑菌水(BWFI)、生理食鹽水、經磷酸鹽緩衝的食鹽水(PBS)或該蛋白在冷凍乾燥前之相同調配物中，進行該冷凍乾燥型物質的復水作用。
本發明的結合分子或藉由本發明的一種方法所產生之結合分子較佳係用於預防、治療或改善選自增生性疾病、腫瘤性疾病或免疫疾患之一疾病。
本發明的一個任擇實施例係提供用於預防、治療或改善選自增生性疾病、腫瘤性疾病或免疫疾患之一疾病之一種方法，其步驟包括對於有需要的一病患投予本發明的結合分子或藉由本發明的一種方法所產生之結合分子。
本文中所述的調配物係適合在有需要的一病患中作為治療、改善及/或預防如本文中所述的病理性醫學病況之藥學組成物。“治療”一詞係同時指治療性治療及預防性或防止性措施。治療係包括對於來自罹患一疾病/疾患、一疾病/疾患的症狀或具有易罹患一疾病/疾患的傾向之病患身體、所分離的組織或細胞，施用或投予該調配物，其目的係治癒、治療、緩解、舒解、改變、補救、改善、增進或影響該疾病、該疾病的症狀或易罹患該疾病的傾向。
該等“需要治療者”係包括該等已罹患該疾患者，以及該等待預防該疾患者。“疾病”一詞係指將受益於本文中所述的蛋白調配物之治療之任一病況。其包括慢性與急性疾患或疾病，及包括促使哺乳類動物易罹患所探討的疾病之該等病理狀況。本文中待治療之疾病/疾患的非限制性實例係包括增生性疾病、腫瘤性疾病或免疫疾患。
本發明的結合分子較佳係用於預防、治療或改善與BCMA(過度)表現作用相關聯的B細胞疾患，諸如漿細胞疾患及/或自體免疫疾病。自體免疫疾病例如全身性紅斑狼瘡或類風濕性關節炎。
本發明亦提供一種方法，其係用於治療或改善與BCMA(過度)表現作用相關聯的B細胞疾患，諸如漿細胞疾患及/或自體免疫疾病，該方法的步驟包括對於有需要的一個體投予本發明的結合分子。自體免疫疾病例如全身性紅斑狼瘡或類風濕性關節炎。
在漿細胞疾患中，一漿細胞株係不受控制地增殖。結果，該株產生大量稱為M蛋白的單一(單株)抗體。在一些情況下，諸如在單株免疫球蛋白增高之情況下，產生不完整的抗體，該等抗體僅由輕鏈或重鏈所組成。該等異常的漿細胞及其等所產生的抗體通常侷限於一類型。漿細胞疾患較佳係選自由多發性骨髓瘤、漿細胞瘤、漿細胞性白血病、巨球蛋白血症、澱粉樣變性病、華氏(Waldenstrom)巨球蛋白血症、骨孤立性漿細胞瘤、骨髓外漿細胞瘤、骨硬化性骨髓瘤、重鏈病、未知臨床意義的單株免疫球蛋白增高及潛伏型多發性骨髓瘤骨髓瘤所組成之群組。
另一方面，提供包含本發明的一結合分子、本發明的一核酸分子、本發明的一載體或本發明的一宿主細胞之套組。該套組可包括含有結合分子的一或多個小瓶及使用說明書。該套組亦可包含用於投予本發明的結合分子之 構件諸如一注射器、幫浦、輸注器之類；用於將本發明的結合分子復水而重新組成之構件；及/或用於稀釋本發明的結合分子之構件。
此外，本發明係有關於BCMA及較佳為人類BCMA的第3簇抗原決定位用於產生一種結合分子及較佳為一抗體之用途，該結合分子可與BCMA結合及較佳可與人類BCMA結合。BCMA的第3簇抗原決定位較佳係對應於序列辨識編號：1002中所述序列的第24至41個胺基酸殘基。
另外，本發明提供一種方法，其係用於產生可與BCMA結合及較佳可與人類BCMA結合的一抗體及較佳為一種雙特異性結合分子，該方法包括：(a)用包含BCMA及較佳為人類BCMA的第3簇抗原決定位之一多肽，進行一動物的免疫接種，其中BCMA的第3簇抗原決定位係對應於序列辨識編號：1002中所述序列的第24至41個胺基酸殘基，(b)獲得該抗體，及(c)選擇性地將該抗體轉化成一種雙特異性結合分子，其可與人類BCMA結合及較佳與T細胞CD3受體複合體結合。
步驟(b)較佳包括按如下方式試驗所獲得的抗體：當用一鼠類BCMA抗原之個別簇的抗原決定位交換人類BCMA蛋白中之個別簇的抗原決定位時(產生包含人類BCMA之一構築質體，其中用鼠類第3簇抗原決定位置換人類第3簇抗原決定位；參見序列辨識編號：1011)，抗體 的結合作用將減少。相較於人類BCMA蛋白中之個別簇的抗原決定位，即人類BCMA蛋白中之個別簇的抗原決定位之結合作用係設定為100%時，該項減少係較佳至少10%、20%、30%、40%、50%；更佳至少60%、70%、80%、90%、95%或甚至100%。設想前述人類BCMA/鼠類BCMA嵌合體係在CHO細胞中表現。亦設想人類BCMA/鼠類BCMA嵌合體係與一種不同的膜結合型蛋白諸如EpCAM的一跨膜域及/或胞質域融合；參見圖2a。
針對與一種非人類(如鼠類)BCMA抗原之個別簇的抗原決定位交換所導致之結合作用下降，其試驗方法係述於所附實例中，尤其述於第1至3例中。
該方法可進一步包括試驗該抗體是否與人類BCMA的第3簇抗原決定位結合，及是否可進一步與獼猴BCMA的第3簇抗原決定位結合，諸如來自恆河獼猴(Macaca mulatta)(序列辨識編號：1017)或馬來猴(Macaca fascicularis)(序列辨識編號：1017)的BCMA。
本發明亦有關於包含至少二個結合域之一種雙特異性結合劑，其包含一個第一結合域與一個第二結合域，其中該第一結合域係與B細胞成熟抗原BCMA結合，及其中該第二結合域係與CD3結合(第1項)，亦包括下列各項：第2項. 如第1項之雙特異性結合劑，其中該第一結合域係與BCMA的細胞外域結合，而該第二結合域係與CD3的ε鏈結合。
第3項. 如第1或2項之雙特異性結合劑，其係一全長抗體或一抗體片段之格式。
第4項. 如第3項之一種全長抗體格式的雙特異性結合劑，其中該第一BCMA結合域係衍生自小鼠，及其中該第二CD3結合域係衍生自大鼠。
第5項. 如第3項之一種雙特異性結合劑，其係具有雙鏈抗體形式的一抗體片段格式，其所包含的一重鏈可變域係與同一多肽鏈上的一輕鏈可變域連結，以使得該二域不配對。
第6項. 如第1或2項之雙特異性結合劑，其係由二個scFv分子所組成的一種雙特異性單鏈抗體之格式，該等scFv分子係經由一連接肽或藉由一人類血清白蛋白分子連結。
第7項. 如第6項之雙特異性結合劑，其中重鏈區(VH)與對應的可變輕鏈區(VL)從N端至C端的排列順序為：VH(BCMA)-VL(BCMA)-VH(CD3)-VL(CD3)，VH(CD3)-VL(CD3)-VH(BCMA)-VL(BCMA)或VHCD3)-VL(CD3)-VL(BCMA)-VH(BCMA)。
第8項. 如第1或2項之雙特異性結合劑，其係選自VHH或VH的單域免疫球蛋白域之格式。
第9項. 如第1或2項之雙特異性結合劑，其係具有四個抗體可變域及至少二個結合域的一種Fv分子之格式，其中至少一個結合域係對於人類BCMA具特異性，及至少一個結合域係對於人類CD3具特異性。
第10項. 如第1或2項之雙特異性結合劑，其係由下列所組成的單鏈結合分子之格式：對於BCMA具特異性之一個第一結合域、位於該第一結合域的C端之一固定次區、位於固定次區的C端之一蠍連接子及位於該固定次區的C端之對於CD3具特異性的一個第二結合域。
第11項. 如第1或2項之雙特異性結合劑，其係一抗體樣分子之格式及經由一抗體或一抗體片段的二個重鏈/輕鏈Fv與BCMA結合，及其係經由經基因工程置入該抗體或抗體片段之重鏈或輕鏈的非CDR環之一結合域而與CD3結合。
第12項. 如第1項之一種雙特異性結合劑，其係一種雙特異性錨蛋白(ankyrin)重複分子之格式。
第13項. 如第1項之一種雙特異性結合劑，其中該第一結合域具有選自如第3至12項中任一項所界定的格式中之一格式，及其中該第二結合域具有選自如第3至12項中任一項所界定的格式中之一個不同格式。
第14項. 如第1項之一種雙特異性結合劑，其係一種雙環肽。
第15項. 一種藥學組成物，其含有如第1至14項中任一項之至少一種雙特異性結合劑。
第16項. 如第1至14項中任一項之一種雙特異性結合劑或如第14項之一種藥學組成物，其係用於治療漿細胞疾患或與BCMA表現作用相關聯的其他B細胞疾患及用於治療自體免疫疾病。
第17項. 如第1至14項中任一項之一種雙特異性結合劑或如第15項之一種藥學組成物，其係用於治療選自漿細胞瘤、漿細胞性白血病、多發性骨髓瘤、巨球蛋白血症、澱粉樣變性病、華氏巨球蛋白血症、骨孤立性漿細胞瘤、骨髓外漿細胞瘤、骨硬化性骨髓瘤、重鏈病、未知臨床意義的單株免疫球蛋白增高、潛伏型多發性骨髓瘤之漿細胞疾患。
上述項目之變化可從EP 10 191 418.2推導，EP 10 191 418.2亦包括在本文中。
應瞭解本文中之本發明不侷限於特定方法論、操作程序或試劑，因這些可能有所不同。本文中所提供的論述與實例僅為了說明具體實施例之目的，而並非意欲限制本發明的範圍，本發明的範圍僅受到所附申請專利範圍之限制。
在本說明書的整個文本中所引用的所有出版物與專利(包括所有專利、專利申請案、科學出版物、製造商的規格、使用說明書等)，不論在上文或下文中，係在此完整地併入本案以為參考資料。本文中的任何內容不應被解釋為承認本發明無權憑藉先前發明而早於該等揭露內容。在所併入以為參考資料之材料係與本說明書相矛盾或是不一致之範圍內，本說明書將取代任一該等材料。
圖式顯示：圖1：人類BCMA(全長蛋白的第1至54個胺基酸殘基) 與鼠類BCMA(全長蛋白的第1至49個胺基酸殘基)的細胞外域(ECD)之序列比對。所突顯者係在嵌合型構築質體中所交換的區(域或胺基酸殘基)，如就抗原決定位簇集所指定者。半胱胺酸係由黑色框所示。顯示出雙硫鍵。
圖2：製作BCMA構築質體的抗原決定位圖譜。如藉由流動式細胞測量術所示之在CHO細胞表面上表現的人類與鼠類BCMA(圖2a)以及七種嵌合型人類-鼠類BCMA構築質體(圖2b)。使用一種單株抗人類BCMA抗體，檢測人類BCMA在CHO上的表現作用。使用一種單株抗鼠類BCMA-抗體，檢測鼠類BCMA的表現作用。使用與藻紅素複合的一種抗大鼠IgG-Fc-γ特異性抗體，檢測結合型單株抗體。
圖3：對於第E3簇抗原決定位具特異性之結合分子實例，其係藉由嵌合型BCMA構築質體的抗原決定位圖譜所檢測(參見第3例)。
圖4：使用畢亞寇(Biacore)系統，測定雙特異性結合分子(抗BCMAx抗CD3)在人類與獼猴BCMA上的結合常數。將低至中等密度(100 RU)的抗原固定在CM5晶片上。讓結合劑的稀釋液漂浮在晶片表面上，及使用BiaEval軟體測定結合作用。個別結合劑的個別解離速率及結合常數(KD)係說明於如下各圖中。
圖5：在18小時的51鉻釋出分析法中所測得之BCMA雙特異性抗體的細胞毒性活性。作用細胞：經刺激的富集型人類CD8T細胞。標的細胞：經人類BCMA轉染的CHO細胞(左圖)及經獼猴BCMA轉染的CHO細胞(右圖)。作用細胞相 對於標的細胞(E：T)之比例為10：1。
圖6：使用畢亞寇(Biacore)系統，測定第E3簇抗原決定位的BCMA/CD3雙特異性抗體在人類與獼猴BCMA上及在人類與獼猴CD3上的結合常數。將低至中等密度(100至200RU)的抗原固定在CM5晶片上。讓雙特異性抗體的稀釋液漂浮在晶片表面上，及使用BiaEval軟體測定結合作用。個別雙特異性抗體的個別結合與解離速率及所得的結合常數(KD)係說明於如下各圖中。
圖7：在所示細胞株上之第E3簇抗原決定位的BCMA/CD3雙特異性抗體之FACS分析：1)經人類BCMA轉染的CHO細胞，2)人類CD3陽性人類T細胞株HBP-ALL，3)經獼猴BCMA轉染的CHO細胞，4)獼猴T細胞株4119 LnPx，5)BCMA-陽性人類多發性骨髓瘤細胞株NCI-H929及6)未經轉染的CHO細胞。負對照組[1)至6)]：檢測不具有先前的BCMA/CD3雙特異性抗體之抗體。
圖8：BCMA/CD3雙特異性抗體在表現BCMA的細胞上之斯克伽(Scatchard)分析。細胞係與濃度遞增直到飽和的單體抗體一起培養。藉由流動式細胞測量術檢測抗體。將三重複的測量數值繪製成雙曲型曲線及S型曲線，以顯示所用的有效濃度範圍。使用斯克伽(Scatchard)評估法測定最大結合作用，及計算個別的KD數值。
圖9：第E3簇抗原決定位的BCMA/CD3雙特異性抗體之細胞毒性活性，其係在針對經人類BCMA轉染的CHO細胞之18小時的51-鉻釋出分析法中測量。作用細胞：經刺激的 富集型人類CD8T細胞。作用細胞相對於標的細胞(E：T)之比例為10：1。
圖10：第E3簇抗原決定位的BCMA/CD3雙特異性抗體之細胞毒性活性，其係在48小時的FACS式細胞毒性分析法中測量。作用細胞：未經刺激的人類PBMC。標的細胞：經人類BCMA轉染的CHO細胞。作用細胞相對於標的細胞(E：T)之比例為10：1。
圖11：第E3簇抗原決定位的BCMA/CD3雙特異性抗體在經BAFF-R與經TACI轉染的CHO細胞上之FACS分析。細胞株：1)經人類BAFF-R轉染的CHO細胞，2)經人類TACI轉染的CHO細胞，3)多發性骨髓瘤細胞株L363；負對照組：檢測不具有先前的BCMA/CD3雙特異性抗體之抗體。正對照組：BAFF-R檢測作用：由抗山羊抗體-PE(傑克森(Jackson)公司之705-116-147；1：50)所檢測之山羊抗人BAFF-R(R&D公司之AF1162；1：20)；TACI-檢測作用：由山羊抗兔抗體PE(西克瑪(Sigma)公司之P9757；1：20)所檢測之兔抗TACI抗體(愛碧康(Abcam)公司之AB 79023；1：100)。
圖12：如在18小時的51-鉻釋出分析法中所測量之BCMA/CD3雙特異性抗體的細胞毒性活性。作用細胞：經刺激的富集型人類CD8T細胞。標的細胞：BCMA-陽性人類多發性骨髓瘤細胞株L363(亦即天然表現者)。作用細胞相對於標的細胞(E：T)之比例為10：1。
圖13：在48小時的FACS式細胞毒性分析法中所測量之BCMA/CD3雙特異性抗體的細胞毒性活性。作用細胞：未 經刺激的人類PBMC。標的細胞：人類多發性骨髓瘤細胞株L363(天然BCMA表現者)。作用細胞相對於標的細胞(E：T)之比例為10：1。
圖14：在48小時的FACS式細胞毒性分析法中所測量之BCMA/CD3雙特異性抗體的細胞毒性活性。作用細胞：未經刺激的人類PBMC。標的細胞：BCMA-陽性人類多發性骨髓瘤細胞株NCI-H929。作用細胞相對於標的細胞(E：T)之比例為10：1。
圖15：在48小時的FACS式細胞毒性分析法中所測量之BCMA/CD3雙特異性抗體的細胞毒性活性。作用細胞：獼猴T細胞株4119LnPx。標的細胞：經獼猴BCMA轉染的CHO細胞。作用細胞相對於標的細胞(E：T)之比例為10：1。
圖16：在晚期NCI-H929異體移植模式中之第E3簇抗原決定位的BCMA/CD3雙特異性抗體之抗腫瘤活性(參見第16例)。
圖17：使用人類多發性骨髓瘤細胞株NCI-H929、L-363及OPM-2作為標的細胞及使用人類PBMC作為作用細胞之FACS式細胞毒性分析法(48小時；E：T=10：1)。該圖說明在第E3簇抗原決定位的BCMA/CD3雙特異性抗體的遞增濃度，針對I1-2、IL-6、IL-10、TNF及IFN-γ所測定之細胞介素水平[皮克/毫升](參見第22例)。
實例：
下列實例係說明本發明。不應將該等實例解釋為限制本發明的範圍。納入該等實例係為了說明之目的，及 本發明僅受到所附申請專利範圍之限制。
第1例
產生表現嵌合型BCMA之CHO細胞
為建構嵌合型抗原決定位圖譜製作分子，將人類BCMA之個別抗原決定位域的胺基酸序列或單一胺基酸殘基變更為鼠類序列。建構下列分子：
‧人類BCMA ECD/E1鼠類(序列辨識編號：1009)嵌合型細胞外BCMA域：人類細胞外BCMA域，其中第1簇抗原決定位(序列辨識編號：1002或1007之第1至7個胺基酸殘基)係由鼠類的個別簇(序列辨識編號：1004或1008之第1至4個胺基酸殘基)所置換
→刪除序列辨識編號：1002或1007中的第1至3個胺基酸殘基及G6Q突變作用
‧人類BCMA ECD/E2鼠類(序列辨識編號：1010)嵌合型細胞外BCMA域：人類細胞外BCMA域，其中第2簇抗原決定位(序列辨識編號：1002或1007之第8至21個胺基酸殘基)係由鼠類的個別簇(序列辨識編號：1004或1008之第5至18個胺基酸殘基)所置換
→序列辨識編號：1002或1007中之S9F、Q10H及N11S突變作用
‧人類BCMA ECD/E3鼠類(序列辨識編號：1011)嵌合型細胞外BCMA域：人類細胞外BCMA域，其中第3簇抗原決定位(序列辨識編號：1002或1007之第24至41個胺基酸殘基)係由鼠類的個別簇(序列辨識編號：1004或1008 之第21至36個胺基酸殘基)所置換
→刪除序列辨識編號：1002或1007中之第31與32個胺基酸殘基及Q25H、S30N、L35A及R39P突變作用
‧人類BCMA ECD/E4鼠類(序列辨識編號：1012)嵌合型細胞外BCMA域：人類細胞外BCMA域，其中第4簇抗原決定位(序列辨識編號：1002或1007之第42至54個胺基酸殘基)係由鼠類的個別簇(序列辨識編號：1004或1008之第37至49個胺基酸殘基)所置換
→序列辨識編號：1002或1007中之N42D、A43P、N47S、N53Y及A54T突變作用
‧人類BCMA ECD/E5鼠類(序列辨識編號：1013)嵌合型細胞外BCMA域：人類細胞外BCMA域，其中序列辨識編號：1002或1007之位置22的胺基酸殘基(異白胺酸)係由序列辨識編號：1004或1008中之其個別的鼠類胺基酸殘基(位置19的離胺酸)所置換
→序列辨識編號：1002或1007中的I22K突變作用
‧人類BCMA ECD/E6鼠類(序列辨識編號：1014)嵌合型細胞外BCMA域：人類細胞外BCMA域，其中序列辨識編號：1002或1007之位置25的胺基酸殘基(麩醯胺)係由序列辨識編號：1004或1008中之其個別的鼠類胺基酸殘基(位置22的組胺酸)所置換
→序列辨識編號：1002或1007中的Q25H突變作用
‧人類BCMA ECD/E7鼠類(序列辨識編號：1015)嵌合型細胞外BCMA域：人類細胞外BCMA域，其中序列 辨識編號：1002或1007之位置39的胺基酸殘基(精胺酸)係由序列辨識編號：1004或1008中之其個別的鼠類胺基酸殘基(位置34的脯胺酸)所置換
→序列辨識編號：1002或1007中的R39P突變作用
A)將cDNA構築質體選殖至哺乳類動物表現載體pEF-DHFR中，及穩定地轉染至CHO細胞中。在使用一單株抗人類BCMA抗體之FACS分析法中，驗證人類BCMA在CHO細胞上的表現作用。用一單株抗小鼠BCMA-抗體證實鼠類BCMA表現作用。位於PBS/2% FCS中的BCMA抗體之所用濃度為10微克/毫升。用一種抗大鼠-IgG-Fcy-PE(在PBS/2% FCS中為1：100；傑克森免疫研究(Jackson-Immuno-Research)公司#112-116-071)，檢測結合型單株抗體。在負對照組中，細胞係與PBS/2% FCS一起培養，而非與第一抗體一起培養。在FACSCanto II儀器(必帝(Becton Dickinson)公司)上，藉由流動式細胞測量術測量試樣，及藉由FlowJo軟體(第7.6版)進行分析。分析經轉染的CHO細胞之人類-鼠類BCMA嵌合體的表面表現作用，及在流動式細胞測量分析法中用不同的抗BCMA抗體進行確認(圖2)。
B)為產生表現人類、獼猴、小鼠及人類/小鼠嵌合型跨膜BCMA的CHO細胞，依據標準操作程序，藉由基因合成作用獲得人類、獼猴、小鼠BCMA及人類-小鼠BCMA嵌合體的編碼序列(如基因資料庫(GenBank)登錄號NM_001192[人類]、NM_011608[小鼠]及XM_001106892[獼猴]所公佈的BCMA序列)。該等基因合成片段經設計而首先含有 供構築質體的真核生物表現用之一個Kozak位點及具19個胺基酸的免疫球蛋白引導肽之編碼序列；在原為與人類序列但被更換為與鼠類序列的個別抗原決定位域之嵌合體之情況下，隨後是同一個讀框中之個別BCMA蛋白的編碼序列。
除了人類BCMA ECD/E4鼠類與人類BCMA構築質體之外，在BCMA蛋白的細胞外域之編碼序列之後，接著是同一個讀框中之一種人工Ser1-Gly4-Ser1-連接子的編碼序列，及隨後是人類EpCAM的細胞內域(第226至314個胺基酸；如基因資料庫(GenBank)登錄號NM_002354之序列所公佈者)。
所有編碼序列後是接著一個終止密碼子。該等基因合成片段也被設計用以引入適宜的限制酶酶切位點。將基因合成片段選殖至稱為pEF-DHFR的質體中(pEF-DHFR係述於Raum等人於期刊“Cancer Immunol Immunother”第50期(2001年)第141-150頁乙文中)。前述所有程序係依據標準操作程序進行(美國紐約冷泉港之冷泉港實驗室(Cold Spring Harbor Laboratory Press)出版公司於2001年出版之Sambrook所著“分子選殖：實驗室手冊(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)乙書第三版)。針對各抗原，將具有經驗證序列的核苷酸序列之一殖株轉染至DHFR缺陷型CHO細胞中，以進行該等構築質體的真核生物表現作用。如Kaufman R.J.(1990年)於期刊“Methods Enzymol.”第185期第537-566頁乙文所述，進行DHFR缺陷型CHO細胞中的真 核生物蛋白表現作用。藉由將甲氨蝶呤(methotrexate)(MTX)的濃度遞增至最終濃度為20 nM MTX，而引發構築質體的基因擴增作用。
第2例
2.1在HEK 293細胞中之暫時性表現
依據製造商的操作程序，在FreeStyle 293表現系統(德國卡爾斯魯(Karlsruhe)的英杰(Invitrogen)有限公司)的轉染作用與蛋白表現作用中，使用具有經驗證序列的核苷酸序列之表現質體的殖株。獲得含有所表現的蛋白之上清液，藉由離心作用移除細胞，及將上清液儲存於-20℃。
2.2在CHO細胞中的穩定表現作用
將具有經驗證序列的核苷酸序列之表現質體的殖株轉染至DHFR缺陷型CHO細胞中，以進行該等構築質體的真核生物表現作用。如Kaufman R.J.(1990年)於期刊“Methods Enzymol.”第185期第537-566頁乙文所述，進行DHFR缺陷型CHO細胞中的真核生物蛋白表現作用。藉由將甲氨蝶呤(methotrexate)(MTX)的濃度遞增至最終濃度為20 nM MTX，而引發構築質體的基因擴增作用。在二個繼代的静置培養後，細胞在具有無核苷HyQ PF CHO液態大豆培養基(具有4.0 mM的L-麩醯胺與0.1%普朗尼克(Pluronic)F-68；海克隆(HyClone)公司)的滾瓶中生長7天，然後進行採集。藉由離心作用移除細胞，及將含有所表現的蛋白之上清液於儲存-20℃。
2.3蛋白純化作用
如下進行可溶性BCMA蛋白的純化作用：在層析法中使用Äkta® Explorer系統(通用醫療保健(GE Healthcare)公司)與Unicorn®軟體。依據製造商所提供的操作程序，使用裝載氯化鋅的弗瑞特凝膠(Fractogel)EMD chelate®(默克(Merck)公司)，進行固定化金屬親和性層析法(“IMAC”)。該管柱係用緩衝液A(pH 7.2的20 mM磷酸鈉緩衝劑、0.1 M氯化鈉)平衡，及按3毫升/分鐘的流速將經過濾(0.2微米)的細胞培養上清液施加至管柱(10毫升)中。用緩衝液A清洗管柱，以移除未結合的試樣。依據下列程序，使用二步驟式的緩衝液B梯度，洗提結合型蛋白(pH 7.2的20 mM磷酸鈉緩衝液、0.1 M氯化鈉、0.5 M咪唑)：
步驟1：6倍管柱體積的10%緩衝液B
步驟2：6倍管柱體積的100%緩衝液B
將步驟2洗提出的蛋白分液彙集及進行進一步純化。所有化學品皆為研究等級，及自西克瑪(Sigma)公司(德國戴森霍芬(Deisenhofen))或默克(Merck)公司(德國達姆施塔特(Darmstadt))構得。
在經平衡緩衝液(供HEK細胞所表現的蛋白所用者為pH 7.2的10 mM檸檬酸鹽、25 mM離胺酸-鹽酸；而供CHO細胞所表現的蛋白所用者為pH 7.4的PBS)平衡的HiLoad 16/60 Superdex200製備等級管柱(通用/安瑪西亞(GE/Amersham)公司)中，進行凝膠過濾層析法。洗提出的蛋白試樣(流速為1毫升/分鐘)係藉由標準SDS-PAGE與西方墨點法進行檢測。在OD280奈米測定蛋白濃度。
經由HEK 293細胞中的暫時性表現作用所獲得的蛋白，係用於免疫接種作用中。經由CHO細胞中的穩定表現作用所獲得的蛋白，係用於篩選結合劑及用於測量結合作用。
第3例
鼠類scFv-片段的抗原決定位簇
經人類或鼠類BCMA或經嵌合型BCMA分子轉染的細胞，係用含有與人類/獼猴BCMA結合的scFv之粗製、未經稀釋的周質萃取物進行染色。用1微克/毫升的一種抗FLAG抗體(西克瑪(Sigma)公司之F1804)與一種經R-PE標記的抗小鼠Fc γ特異性抗體(1：100；迪耶諾瓦(Dianova)公司之#115-116-071)，檢測結合型scFv。所有抗體係在具有2% FCS的PBS中進行稀釋。就負對照組而言，細胞係與PBS/2% FCS一起培養，而非與周質萃取物一起培養。在FACSCanto II儀器(必帝公司)上，藉由流動式細胞測量術測量試樣，及藉由FlowJo軟體(第7.6版)進行分析；參見圖3。
第4例
取得不同重組形式的可溶性人類與獼猴BCMA
A)使用人類與恆河猴BCMA的編碼序列(基因資料庫(GenBank)的登錄號NM_001192[人類]、XM_001106892[恆河猴]所公佈者)及人類白蛋白、人類Fcγ1與鼠類白蛋白的編碼序列，來建構分別編碼人類與獼猴BCMA的可溶性融合蛋白及分別編碼人類白蛋白、人類IgG1Fc與鼠類白蛋白以及編碼僅包含BCMA細胞外域的可溶性蛋白之人工 cDNA序列。為產生用於表現可溶性人類與獼猴BCMA蛋白之構築質體，藉由如上文所述全長式BCMA cDNA的PCR誘突變作用及依據標準操作程序的分子選殖作用，獲得cDNA片段。
就具有人類白蛋白的融合體而言，經改質的cDNA片段之設計係首先含有供該構築質體的真核生物表現用之一個Kozak位點；隨後分別為人類與恆河猴(或恆河獼猴(Macaca mulatta))BCMA蛋白的編碼序列，該等蛋白係包含分別對應於人類與恆河猴BCMA細胞外域之第1至54個及第1至53個胺基酸；隨後是同一個讀框中之一種人工Ser1-Gly4-Ser1-連接子的編碼序列；隨後是同一個讀框中之人類血清白蛋白的編碼序列；隨後是同一個讀框中之一種Flag標籤的編碼序列；隨後是同一個讀框中之一種經改質的組胺酸標籤(SGHHGGHHGGHH)之編碼序列及一個終止密碼子。
就具有鼠類IgG1的融合體而言，經改質的cDNA片段之設計係首先含有供該構築質體的真核生物表現用之一個Kozak位點；隨後分別為人類與獼猴BCMA蛋白之編碼序列，該等蛋白係包含分別對應於人類與恆河猴BCMA細胞外域之第1至54個及第1至53個胺基酸；隨後是同一個讀框中之一種人工Ser1-Gly4-Ser1-連接子的編碼序列；隨後是同一個讀框中之人類IgG1的樞扭與Fc γ部分之編碼序列；隨後是同一個讀框中之一個六組胺酸標籤的編碼序列及一個終止密碼子。
就具有鼠類白蛋白的融合體而言，經改質的cDNA片段之設計係首先含有供該構築質體的真核生物表現用之一個Kozak位點；隨後分別為人類與獼猴BCMA蛋白之編碼序列，該等蛋白係包含分別對應於人類與恆河猴BCMA細胞外域之第1至54個及第1至53個胺基酸；隨後是同一個讀框中之一種人工Ser1-Gly4-Ser1-連接子的編碼序列；隨後是同一個讀框中之鼠類血清白蛋白的編碼序列；隨後是同一個讀框中之一種Flag標籤的編碼序列；隨後是同一個讀框中之一種經改質的組胺酸標籤(SGHHGGHHGGHH)之編碼序列及一個終止密碼子。
就可溶性細胞外域構築質體而言，經改質的cDNA片段之設計係首先含有供該構築質體的真核生物表現用之一個Kozak位點；隨後分別為人類與獼猴BCMA蛋白之編碼序列，該等蛋白係包含分別對應於人類與恆河猴BCMA細胞外域之第1至54個及第1至53個胺基酸；隨後是同一個讀框中之一種人工Ser1-Gly1-連接子的編碼序列；隨後是同一個讀框中之一種Flag標籤的編碼序列；隨後是同一個讀框中之一種經改質的組胺酸標籤(SGHHGGHHGGHH)之編碼序列及一個終止密碼子。
該等cDNA片段之設計亦在片段的開端與末端引入限制酶酶切位點。在下列的選殖程序中，使用所引入的限制酶酶切位點，即5’端的EcoRI與3’端的Sa1I。經由EcoRI與Sa1I將cDNA片段選殖至稱作pEF-DHFR的質體中(pEF-DHFR係述於Raum等人於期刊“Cancer Immunol Immunother”第50期(2001年)第141-150頁乙文)。前述程序皆依據標準操作程序進行(美國紐約冷泉港之冷泉港實驗室(Cold Spring Harbor Laboratory Press)出版公司於2001年出版之Sambrook所著”分子選殖：實驗室手冊(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)乙書第三版)。
B)使用如上文所述的人類與獼猴BCMA之編碼序列及人類白蛋白、人類Fcγ1、鼠類Fcγ1、鼠類Fcγ2a、鼠類白蛋白、大鼠白蛋白、大鼠Fcγ1及大鼠Fcγ2b之編碼序列，來建構分別編碼人類與獼猴BCMA的可溶性融合蛋白及分別編碼人類白蛋白、人類IgG1Fc、鼠類IgG1Fc、鼠類IgG2aFc、鼠類白蛋白、大鼠IgG1Fc、大鼠IgG2b及大鼠白蛋白以及編碼僅包含BCMA細胞外域的可溶性蛋白之人工cDNA序列。為產生用於表現可溶性人類與獼猴BCMA蛋白之構築質體，藉由如上文所述全長式BCMA cDNA的PCR誘突變作用及依據標準操作程序的分子選殖作用，獲得cDNA片段。
就具有白蛋白的融合體而言，經改質的cDNA片段之設計係首先含有供該構築質體的真核生物表現用之一個Kozak位點及一種具19個胺基酸的免疫球蛋白引導肽之編碼序列；隨後是同一個讀框中之個別BCMA蛋白的細胞外域之編碼序列；隨後是同一個讀框中之一種人工Ser1-Gly4-Ser1-連接子的編碼序列；隨後是同一個讀框中之個別血清白蛋白的編碼序列；隨後是同一個讀框中之一種Flag標籤的編碼序列；隨後是同一個讀框中之一種經改質的組 胺酸標籤(SGHHGGHHGGHH)之編碼序列及一個終止密碼子。
就具有IgG Fcs的融合體而言，經改質的cDNA片段之設計係首先含有供該構築質體的真核生物表現用之一個Kozak位點及一種具19個胺基酸的免疫球蛋白引導肽之編碼序列；隨後是同一個讀框中之個別BCMA蛋白的細胞外域之編碼序列；隨後是同一個讀框中之一種人工Ser1-Gly4-Ser1-連接子的編碼序列，除了在人類IgG1 Fc的情況下係使用一種人工Ser1-Gly1-連接子之外；隨後是同一個讀框中之個別IgG的樞扭與Fcγ部分之編碼序列；隨後是同一個讀框中之一種Flag標籤的編碼序列；隨後是同一個讀框中之一種經改質的組胺酸標籤(SGHHGGHHGGHH)之編碼序列及一個終止密碼子。
就可溶性細胞外域構築質體而言，經改質的cDNA片段之設計係首先含有供該構築質體的真核生物表現用之一個Kozak位點及一種具19個胺基酸的免疫球蛋白引導肽之編碼序列；隨後是同一個讀框中之個別BCMA蛋白的細胞外域之編碼序列；隨後是同一個讀框中之一種人工Ser1-Gly1-連接子的編碼序列；隨後是同一個讀框中之一種Flag標籤的編碼序列；隨後是同一個讀框中之一種經改質的組胺酸標籤(SGHHGGHHGGHH)之編碼序列及一個終止密碼子。
為進行構築質體的選殖作用，引入適宜的限制酶酶切位點。所有cDNA片段皆選殖至稱作pEF-DHFR的質體 中(pEF-DHFR係述於Raum等人於2001年乙文)。前述程序皆依據標準操作程序進行(Sambrook於2001年乙書)。
設計下列構築質體，以使得在不同的抗原決定位上進行定位篩選。使用鼠類-人類BCMA嵌合體與鼠類-獼猴BCMA嵌合體的編碼序列(如上文所述的小鼠、人類與獼猴BCMA序列)及鼠類白蛋白與鼠類Fcγ1的編碼序列，來建構分別編碼鼠類-人類與鼠類-獼猴BCMA嵌合體的可溶性融合蛋白及分別編碼鼠類IgG1 Fc與鼠類白蛋白之人工cDNA序列。為產生用於表現可溶性鼠類-人類與鼠類-獼猴BCMA嵌合體之構築質體，依據標準操作程序及藉由基因合成作用，獲得具有分別為人類與獼猴序列所突變的個別抗原決定位域之鼠類BCMA(第1至49個胺基酸)的cDNA片段。如上文所述及依據標準操作程序，進行構築質體的選殖作用(Sambrook於2001年乙書)。
建構下列分子：
‧人類、鼠類IgG1 Fc之第1-4個胺基酸
‧人類、鼠類白蛋白之第1-4個胺基酸
‧恆河猴、鼠類IgG1 Fc之第1-4個胺基酸
‧恆河猴、鼠類白蛋白之第1-4個胺基酸
‧人類、鼠類IgG1 Fc之第5-18個胺基酸
‧人類、鼠類白蛋白之第5-18個胺基酸
‧恆河猴、鼠類IgG1 Fc之第5-18個胺基酸
‧恆河猴、鼠類白蛋白之第5-18個胺基酸
‧人類、鼠類IgG1 Fc之第37-49個胺基酸
‧人類、鼠類白蛋白之第37-49個胺基酸
‧恆河猴、鼠類IgG1 Fc之第37-49個胺基酸
‧恆河猴、鼠類白蛋白之第37-49個胺基酸
第5例
5.1雙特異性抗體對於人類與獼猴BCMA與CD3的親和性 之畢亞寇(Biacore)式測定技術
使用具有人類血清白蛋白(ALB)的重組BCMA融合蛋白，進行畢亞寇(Biacore)分析實驗，而測定BCMA標的結合作用。就CD3親和性之測量而言，使用具有與人類抗體Fc部分融合的CD3ε(CD3e)N端27個胺基酸之重組型融合蛋白。該重組蛋白係以人類CD3e1-27形式及以馬來猴CD3e形式存在，二者皆具有雙特異性抗體中之CD3結合劑的抗原決定位。
細言之，依據製造商使用手册，使用pH 4.5的乙酸鹽緩衝液，在CM5感測晶片(通用醫療保健(GE Healthcare)公司)上固定大約100至150 RU的個別重組抗原。按五種濃度裝載雙特異性抗體試樣：經HBS-EP操作緩衝液(通用醫療保健公司)稀釋之50 nM、25 nM、12.5 nM、6.25 nM及3.13 nM。流速為30至35微升/分鐘及進行3分鐘，然後再度以30至35微升/毫升的流速施加HBS-EP操作緩衝液達8分鐘。使用pH 2.45的10 mM甘胺酸、0.5 M氯化鈉進行晶片再生作用。使用BiaEval軟體分析數據組(參見圖4)。一般進行二個獨立實驗。
5.2對於人類與獼猴BCMA之結合親和性
使用具有小鼠白蛋白(ALB)的重組型BCMA融合蛋白，藉由畢亞寇(Biacore)分析，測定BCMA/CD3雙特異性抗體對於人類與獼猴BCMA之結合親和性。
細言之，依據製造商使用手册，使用pH 4.5的乙酸鹽緩衝液，在CM5感測晶片(通用醫療保健(GE Healthcare)公司)上固定大約150至200 RU的個別重組抗原。按五種濃度裝載雙特異性抗體試樣：經HBS-EP操作緩衝液(通用醫療保健公司)稀釋之50 nM、25 nM、12.5 nM、6.25 nM及3.13 nM。就BCMA親和性測定作用而言，流速為35微升/分鐘及進行3分鐘，然後以35微升/毫升的流速再度施加HBS-EP操作緩衝液達10、30或60分鐘。使用由pH 1.5的10 mM甘胺酸、0.5 M氯化鈉及6 M氯化胍溶液的1：1混合物所組成之緩衝液，進行晶片再生作用。使用BiaEval軟體分析數據組(參見圖6)。一般進行二個獨立實驗。
使用BCMA結合作用所施用的相同濃度，在單一實驗中進行驗證性的人類與獼猴CD3ε結合作用；在10分鐘的解離時間測定解離速率。
第E3簇抗原決定位的所有BCMA/CD3雙特異性抗體在低於奈莫耳的範圍至個位數皮莫耳的範圍，皆顯示對於人類BCMA之高親和性。對於獼猴BCMA之結合作用係均衡的，亦在自個位數奈莫耳的範圍至低於奈莫耳的範圍顯示親和性。BCMA/CD3雙特異性抗體的親和性與親和性差距係示於表2中。
5.3雙特異性抗體對於人類與獼猴BCMA的親和性之畢亞寇(Biacore)式測定技術
藉由畢亞寇(Biacore)式測量，重複進行BCMA/CD3雙特異性抗體對於CM5晶片上的重組型可溶性BCMA之親和性測量，以再次確認KD及尤其在較長解離期間的解離速率(60分鐘而非先前實驗中所採用的10分鐘)。所試驗的所有BCMA/CD3雙特異性抗體皆進行二個獨立的親和性測量，各測量皆按五種不同濃度進行。
第E3簇抗原決定位的BCMA/CD3雙特異性抗體之親和性係顯然自低於奈莫耳至個位數皮莫耳，參見表3中之實例。
第6例
雙特異性結合作用與物種間交叉反應性
為確認與人類及獼猴BCMA與CD3的結合作用，使用分別經人類與獼猴BCMA轉染的CHO細胞、表現天然的人類BCMA之人類多發性骨髓瘤細胞株NCI-H929、表現CD3的人類T細胞白血病細胞株HPB-ALL(德國布倫瑞克(Braunschweig)的DSMZ公司之ACC483)及表現CD3的獼猴T細胞株4119LnPx(Knappe A等人於2000年期刊“Blood”第95期第3256-3261頁乙文)，藉由流動式細胞測量術試驗雙特異性抗體。此外，使用未經轉染的CHO細胞作為負對照組。
就流動式細胞測量術而言，個別細胞株的200,000個細胞係在冰上與50微升之濃度為5微克/毫升的純化雙特異性抗體培養30分鐘。細胞係在PBS/2% FCS中清洗二次，及用一種鼠類五組胺酸(PentaHis)抗體檢測該等構築 質體的結合作用(凱傑(Qiagen)公司；在50微升的PBS/2% FCS中進行1：20的稀釋作用)。在清洗後，用一種與藻紅素複合及在PBS/2% FCS中進行1：100稀釋之Fc γ特異性抗體(迪耶諾瓦(Dianova)公司)檢測結合型五組胺酸(PentaHis)抗體。在FACSCanto II儀器上，藉由流動式細胞測量術測量試樣及藉由FACSDiva軟體進行分析(二者均來自必帝公司)。
第E3簇抗原決定位的BCMA/CD3雙特異性抗體將經人類與獼猴BCMA轉染的CHO細胞、表現人類BCMA的多發性骨髓瘤細胞株NCI-H929以及人類與獼猴T細胞染色。此外，未經轉染的CHO細胞並無染色(參見圖7)。
第7例
雙特異性抗體對於人類與獼猴BCMA的親和性之斯克伽(Scatchard)式測定技術
就斯克伽(Scatchard)分析而言，使用麥可邁特(Micromet)公司所研發的一種單價檢測系統(抗組胺酸Fab/Alexa 488)進行飽和結合實驗，以精確測定雙特異性抗體與個別細胞株之單價結合作用。
個別細胞株(表現人類BCMA的重組型CHO細胞株、表現獼猴BCMA的重組型CHO細胞株)的2x104個細胞，係與從100 nM起始及經三重稀釋系列(八次的1：2稀釋作用)之各50微升的個別BCMA雙特異性抗體一起培養，接著在4℃及攪拌下培養16小時，及進行一個殘餘物清洗步驟。然後，細胞可與30微升的一種抗組胺酸Fab/Alexa488溶液(麥 可邁特(Micromet)公司；30微克/毫升)再培養30分鐘。在一個清洗步驟後，將細胞重新懸浮於150微升之含有3.5%甲醛的FACS緩衝液中，再培養15分鐘，進行離心及重新懸浮於FACS緩衝液中，及使用FACS CantoII機器與FACS Diva軟體進行分析。數據係由二組獨立的實驗產生。將數值繪製成雙曲型結合曲線。計算個別的斯克伽(Scatchard)分析，以外推最大結合作用(Bmax)。測定在最大結合作用半值之雙特異性抗體濃度，及其係反映個別KD。將三重複的測量數值繪製成雙曲型曲線。使用斯克伽(Scatchard)評估技術測定最大結合作用，及計算個別的KD。
藉由斯克伽(Scatchard)分析，其係用於測量人類與獼猴BCMA之間的潛在親和性差距之最可靠方法，測定BCMA/CD3雙特異性抗體對於經人類或獼猴BCMA轉染的CHO細胞之親和性。
表現BCMA抗原的細胞係與濃度遞增直至飽和之個別的單體BCMA/CD3雙特異性抗體一起培養(16小時)。藉由流動式細胞測量術檢測結合型雙特異性抗體。測定在最大結合作用半值之BCMA/CD3雙特異性抗體的濃度，及其係反映個別KD。
將三重複的測量數值繪製成雙曲型曲線與S型曲線，以顯示自最小至最佳結合作用之適當濃度範圍。使用斯克伽(Scatchard)評估技術測定最大結合作用(Bmax)(圖8)，及計算個別的KD。示於表4中之數值係來自針對各BCMA/CD3雙特異性抗體的二個獨立實驗。
細胞式斯克伽(Scatchard)分析係確認第E3簇抗原決定位的BCMA/CD3雙特異性抗體對於人類BCMA之親和性係低於奈莫耳，而物種間的BCMA親和性差距小及係低於5。
第8例
細胞毒性活性
8.1使用經刺激的人類T細胞之鉻釋出分析法
如後述獲得經刺激的T細胞，其係就CD8+ T細胞進行富集。
在37℃，在一培養皿(直徑為145毫米，奥地利之克雷姆斯明斯特(Kremsmünster)的葛萊娜第一生化(GreinerBio-One)股份有限公司)上塗佈最終濃度為1微克/毫升之可商購取得的抗CD3特異性抗體(OKT3，奥多克隆 (Orthoclone))達1小時。藉由使用PBS的清洗步驟移除未結合的蛋白。在預塗佈的培養皿中添加位於具有安定化麩醯胺/10% FCS/20單位/毫升的IL-2(開隆(Chiron)公司之Proleukin®)的120毫升RPMI 1640之3-5x107個人類PBMC，及接受刺激達2天。在第3天，收集細胞及用RPMI 1640清洗一次。添加IL-2直至最終濃度為20單位/毫升，及在如上述之相同細胞培養基中再度培養細胞一天。
依據製造商的操作程序，使用戴諾珠(Dynal-Bead)耗竭CD4+ T細胞與CD56+ NK細胞，而富集CD8+細胞毒性T淋巴球(CTL)。
用PBS清洗經獼猴或人類BCMA轉染的CHO標的細胞二次，及在37℃，在具有50% FCS之最終體積為100微升的RPMI中，用11.1 MBq 51鉻進行標記達60分鐘。之後，用5毫升RPMI清洗經標記的標的細胞三次，然後用於細胞毒性分析中。該分析係在96孔式平皿及總體積為200微升及E：T比例為10：1的增補型RPMI中進行。使用起始濃度為0.01-1微克/毫升的純化雙特異性抗體及其三倍稀釋液。該分析的培養時間為18小時。細胞毒性係按上清液中所釋出的鉻相對於最大溶胞作用(添加曲拉通(Triton)-X)與自發性溶胞作用(不具有作用細胞)的差異之相對數值形式測定。所有測量皆以四重複進行。在Wizard 3” γ射線計數器(德國科隆之珀金埃爾默生物科技(Perkin Elmer Life Sciences)股份有限公司)中，測量上清液中的鉻活性。使用供視窗(Windows)使用的Prism 5(5.0版，美國加州聖地牙哥 的圖墊(GraphPad)軟體有限公司)，進行結果分析。藉由分析程式自S型劑量反應曲線計算所得的EC50值，係用於比較細胞毒性活性(參見圖5)。
8.2重新引導經刺激的人類作用性T細胞對抗經人類BCMA轉染的CHO細胞之效力
在使用經人類BCMA轉染的CHO細胞作為標的細胞及經刺激的富集型人類CD8 T細胞作為作用細胞之51-鉻(51鉻)釋出細胞毒性分析法中，分析BCMA/CD3雙特異性抗體的細胞毒性活性。如第8.1例中所述進行實驗。
第E3簇抗原決定位的所有BCMA/CD3雙特異性抗體皆顯示對抗經人類BCMA轉染的CHO細胞之強力的細胞毒性活性，其EC50值係位於個位數皮克/毫升之範圍或甚至更低(圖9與表5)。因此第E3簇抗原決定位呈現一種非常有利的抗原決定位-活性關係，而支持雙特異性抗體所媒介之非常強的細胞毒性活性。
8.3使用未經刺激的人類PBMC之FACS式細胞毒性分析法作用細胞之分離
藉由菲可(Ficoll)密度梯度離心法，從富集型淋巴球製劑(血沉棕黃層)製備人類末梢血液單核細胞(PBMC)，血沉棕黃層係血庫收集輸血用血時之副產物。血沉棕黃層係由當地血庫所提供，及在採集血液當天製備PBMC。在菲可(Ficoll)密度離心作用及用杜貝可(Dulbecco)PBS(吉柏柯(Gibco)公司)充分清洗後，經由與紅血球溶胞緩衝液(155 mM氯化銨、10 mM碳酸氫鉀、100 μM EDTA)一起培養而移除PBMC中的剩餘紅血球。PBMC係在100 x g進行離心，及經由上清液移除血小板。剩餘的淋巴球主要包括B與T淋巴球、NK細胞及單核白血球。在37℃/5%二氧化碳中，在具有10% FCS(吉柏柯(Gibco)公司)的RPMI培養基(吉柏柯(Gibco)公司)中繼續培養PBMC。
CD14 + 與CD56 + 細胞之耗竭
使用人類CD14微珠(MicroBead)(美天旎生物科技(Milteny Biotec)公司之MACS的#130-050-201)來耗竭CD14+細胞，及使用人類CD56微珠(MACS的#130-050-401)來耗竭NK細胞。計數PBMC，及在室溫以300 x g離心10分鐘。棄置上清液，及將細胞沉澱物重新懸浮於MACS分離緩衝液[80微升/107個細胞；PBS(英傑(Invitrogen)公司之#20012-043)、0.5%(體積/體積)FBS(吉柏柯(Gibco)公司之#10270-106)、2 mM EDTA(西克瑪艾爾迪希(Sigma-Aldrich)公司之#E-6511)]中。添加CD14微珠與CD56微珠(20微升 /107個細胞)，及在4至8℃培養15分鐘。用MACS分離緩衝液(1至2毫升/107個細胞)清洗細胞。在離心(參見上文)後，棄置上清液，及將細胞重新懸浮於MACS分離緩衝液(500微升/108個細胞)中。然後使用LS管柱(美天旎生技公司之#130-042-401)分離CD14/CD56陰性細胞。在37℃的培養箱中，在RPMI完全培養基中，亦即在增補10% FBS(拜爾控股份公司之#S0115)、1x非必需胺基酸(拜爾控股份公司之#K0293)、10 mM Hepes緩衝液(拜爾控股份公司之#L1613)、1 mM丙酮酸鈉(拜爾控股份公司之#L0473)及100單位/毫升的盤尼西林/鏈黴素(拜爾控股份公司之#A2213)的RPMI1640(拜爾控股份公司之#FG1215)中，培養不具有CD14+/CD56+細胞的PBMC直到需用時。
標的細胞之標記法
就流動式細胞測量術分析法中的細胞溶胞分析而言，使用螢光性膜染料DiOC18(DiO)(分子探針(Molecular Probes)公司之#V22886)，來標記作為標的細胞之經人類BCMA或經獼猴BCMA轉染的CHO細胞，及使其等與作用細胞區別開來。簡言之，採集細胞，用PBS清洗一次，及將位於含有2%(體積/體積)FBS與膜染料DiO(5微升/106個細胞)的PBS中之細胞數目調整為106個細胞/毫升。在37℃培養3分鐘後，在完全RPMI培養基中清洗細胞二次，及將細胞數目調整為1.25x105個細胞/毫升。使用0.5%(體積/體積)等張曙紅G溶液(羅斯(Roth)公司之#45380)，測定細胞存活性。
流動式細胞測量術式分析法
該分析法之設計係針對經獼猴或人類BCMA轉染的CHO細胞在BCMA雙特異性抗體的系列稀釋液存在下之溶胞作用進行量化。
將等體積之經DiO標記的標的細胞與作用細胞(亦即不具有CD14+細胞的PBMC)混合，而產生10：1的E：T細胞比例。將160微升的該懸浮液轉移至96孔式平皿的各孔中。添加40微升之BCMA雙特異性抗體的系列稀釋液及一種負對照組雙特異性(辨識一種不相關的標的抗原之一種CD3式雙特異性抗體)或作為附加負對照組的RPMI完全培養基。雙特異性抗體所媒介的細胞毒性反應係在7%二氧化碳的增濕培養箱中進行48小時。然後將細胞轉移至新的96孔式平皿中，及藉由添加最終濃度為1微克/毫升的碘化丙啶(PI)而監測標的細胞膜完整性之喪失。PI係在正常情況下被活細胞排除在外之一種不透膜染料，而死細胞讓其進入及可藉由發出螢光而辨識出。
在FACSCanto II儀器上，藉由流動式細胞測量術測量試樣，及藉由FACSDiva軟體進行分析(二者均來自必帝公司)。
辨識出標的細胞為DiO陽性細胞。將PI陰性標的細胞歸類為活標的細胞。依據下列公式計算細胞毒性百分比：
n=事件數目
使用GraphPad Prism 5軟體(美國加州聖地牙哥的圖墊軟體(Graph Pad Software)公司)，將細胞毒性百分比相對於對應的雙特異性抗體濃度繪圖。可藉由用於評估具固定曲線斜率的S型劑量反應曲線之四參數邏輯迴歸模式，分析劑量反應曲線及計算EC50值。
8.4對抗經人類BCMA轉染的標的細胞之未經刺激的人類PBMC
在使用經人類BCMA轉染的CHO細胞作為標的細胞及未經刺激的人類PBMC作為作用細胞之FACS式細胞毒性分析法中，分析BCMA/CD3雙特異性抗體的細胞毒性活性。如上文(第8.3例)所述進行該分析法。
用未經刺激的人類PBMC作為作用細胞及經人類BCMA轉染的CHO細胞作為標的之FACS式細胞毒性分析法的結果，係示於圖10與表6中。
第9例
9.1排除與BAFF受體之交叉反應性
就流動式細胞測量術而言，個別細胞株的200,000個細胞係在冰上與50微升之濃度為5微克/毫升的純化雙特異性抗體培養30分鐘。在具有2% FCS的PBS中清洗細胞二次，及用一種鼠類五組胺酸(PentaHis)抗體檢測該等構築質體的結合作用(凱傑(Qiagen)公司；在50微升之具有2% FCS的PBS中進行1：20的稀釋作用)。在清洗後，用一種與藻紅素複合及在具有2% FCS的PBS中進行1：100稀釋之Fc γ特異性抗體(迪耶諾瓦(Dianova)公司)，檢測結合型五組胺酸(PentaHis)抗體。在FACSCanto II儀器上，藉由流動式細胞測量術測量試樣，及藉由FACSDiva軟體進行分析(二者均來自必帝公司)。顯示雙特異性結合劑不具有與BAFF受體之交叉反應性。
9.2排除BCMA/CD3雙特異性抗體與人類BAFF受體(BAFF-R)及TACI之交叉反應性
為排除與人類BAFF-R及TACI之結合作用，藉由流動式細胞測量術，使用分別經人類BAFF-R與TACI轉染的CHO細胞，試驗BCMA/CD3雙特異性抗體。此外，使用L363多發性骨髓瘤細胞作為與人類BCMA的結合作用之正對照組。藉由二種正對照組抗體確認BAFF-R與TACI抗原在CHO細胞上的表現作用。如先前實例中所述，進行流動式細胞測量術。
經由流動式細胞測量分析確認，第E3簇抗原決定位的BCMA/CD3雙特異性抗體中並無任一者與人類BAFF-R或人類TACI交叉反應(參見圖11)。
第10例
細胞毒性活性
在五種附加的試管中細胞毒性分析法中，分析人類類型的BCMA雙特異性抗體在重新引導作用性T細胞對抗表現BCMA的標的細胞方面之效力：
1.在一種51-鉻釋出分析法中，測量BCMA雙特異性抗體在重新引導經刺激的人類作用性T細胞對抗一種BCMA陽性(人類)腫瘤細胞株方面之效力。
2.在一種FACS式細胞毒性分析法中，測量BCMA雙特異性抗體在重新引導在未經刺激的人類PBMC中的T細胞對抗經人類BCMA轉染的CHO細胞方面之效力。
3.在一種FACS式細胞毒性分析法中，測量BCMA雙特異性抗體在重新引導在未經刺激的人類PBMC中的T細胞對抗一種BCMA陽性(人類)腫瘤細胞株方面之效力。
4.使用一種獼猴T細胞株作為作用性T細胞，進行一種FACS式細胞毒性分析法，以確認交叉反應性BCMA雙特異性抗體可重新引導獼猴T細胞對抗經獼猴BCMA轉染的CHO細胞。
5.在使用經人類BCMA轉染的CHO細胞作為標的細胞及經刺激的人類T細胞作為作用細胞之一種51-鉻釋出分析法中，測定BCMA雙特異性抗體的單體與二聚體形式之效力 差距。
第11例
對抗BCMA陽性人類多發性骨髓瘤細胞株L363之經刺激的人類T細胞
在使用BCMA陽性人類多發性骨髓瘤細胞株L363(DSMZ公司編號ACC49)作為標的細胞來源及經刺激的富集型人類CD8 T細胞作為作用細胞之一種51-鉻(51鉻)釋出細胞毒性分析法中，分析BCMA/CD3雙特異性抗體的細胞毒性活性。如第8.1例中所述進行該分析法。
依據使用經刺激的富集型人類CD8T淋巴球作為作用細胞及經人類BCMA轉染的CHO細胞作為標的之51-鉻釋出分析法的結果，第E3簇抗原決定位的BCMA/CD3雙特異性抗體在細胞毒性活性方面係非常有效力的(圖12與表7)。
在抗原決定位簇集期間辨識出另一群組的抗體(參見第1與3例)，其可與BCMA的第1與4簇(“E1/E4”)抗原決定位結合。出乎預料地，第E1/E4簇抗原決定位的BCMA/CD3雙特異性抗體雖然在對抗經人類BCMA轉染的CHO細胞之細胞毒性活性方面係強力的，其對抗在細胞表面上以低密度表現天然BCMA之人類多發性骨髓瘤細胞株L363之細胞毒性經證明係相當弱(圖12與表7)。在不希望受理論限制之下，本案發明者認為在天然BCMA表現者上之人類BCMA的E1/E4抗原決定位，可能比在經BCMA轉染的細胞上者更不易接觸到。
第12例
對抗BCMA陽性人類多發性骨髓瘤細胞株L363之未經刺激的人類PBMC
在一種FACS式細胞毒性分析法中，及該分析法係使用BCMA陽性人類多發性骨髓瘤細胞株L363(DSMZ公司之ACC49)作為標的細胞來源及細胞株L363所顯示之天然BCMA的表面表現作用係所試驗的所有標的T細胞株中最弱者，及使用未經刺激的人類PBMC作為作用細胞，而進一步分析BCMA/CD3雙特異性抗體的細胞毒性活性。如上文(第8.3例)所述進行該分析法。
如在使用經刺激的富集型人類CD8T淋巴球對抗人類多發性骨髓瘤細胞株L363之51-鉻釋出分析法中所觀 察，再次證明相對於第E1/E4簇抗原決定位的BCMA/CD3雙特異性抗體在對抗經人類BCMA轉染的CHO細胞時之強效的細胞毒性活性，其在重新引導未經刺激的PBMC對抗在細胞表面上以低密度表現天然BCMA之人類多發性骨髓瘤細胞株L363之細胞毒性活性方面之效力較低。這與上文中所提供的理論相符，亦即在天然BCMA表現者上之人類BCMA的E1/E4抗原決定位，可能比在經BCMA轉染的細胞上者更不易接觸到。在該分析法中，第E3簇抗原決定位的BCMA/CD3雙特異性抗體呈現三位數皮克/毫升的EC50值(參見圖13與表8)。
一如預期，相較於使用富集型經刺激的類CD8 T細胞作為作用細胞之細胞毒性分析法，使用未經刺激的 PBMC之細胞毒性分析法中之EC50值較高。
第13例
對抗BCMA陽性人類多發性骨髓瘤細胞株NCI-H929之未經刺激的人類PBMC
在使用BCMA陽性人類多發性骨髓瘤細胞株NCI-H929(ATCCCRL-9068)作為標的細胞來源及未經刺激的人類PBMC作為作用細胞之一種FACS式細胞毒性分析法中，分析BCMA/CD3雙特異性抗體的細胞毒性活性。如上文(第8.3例)所述進行該分析法。
該分析法係使用在細胞表面上表現天然BCMA之另一種人類多發性骨髓瘤細胞株(亦即NCI-H929)，而其結果證實該等使用人類多發性骨髓瘤細胞株L363所獲得的結果。同樣地，證明相對於第E1/E4簇抗原決定位的BCMA/CD3雙特異性抗體在對抗經人類BCMA轉染的CHO細胞時之強效的細胞毒性活性，其在重新引導未經刺激的PBMC對抗人類多發性骨髓瘤細胞之細胞毒性活性方面之效力較低；及證實在天然BCMA表現者上之人類BCMA的E1/E4抗原決定位，可能比在經BCMA轉染的細胞上者更不易接觸到之理論。在E1/E4結合劑所觀察到之在經BCMA轉染的標的細胞與天然表現者之間的活性差距，並未在E3發現。第E3簇抗原決定位的BCMA/CD3雙特異性抗體呈現2位數至3位數皮克/毫升的EC50值，及因此重新引導未經刺激的PBMC對抗NCI-H929標的細胞及具有非常良好的EC50值(參見圖14與表9)。
正如預期，相較於L363，當使用在細胞表面上的BCMA表現水平較高之人類多發性骨髓瘤細胞株NCI-H929時，其EC50值較低。
第14例
對抗表現獼猴BCMA的標的細胞之獼猴T細胞
最後，在使用經獼猴BCMA轉染的CHO細胞作為標的細胞及一種獼猴T細胞株作為作用細胞來源之一種FACS式細胞毒性分析法中，分析BCMA/CD3雙特異性抗體的細胞毒性活性。
使用獼猴T細胞株4119LnPx(Knappe等人於期刊“Blood”第95期第3256-61頁(2000年)乙文)作為作用細胞來源。經獼猴BCMA轉染的CHO細胞之標的細胞標記法及細胞 毒性活性之流動式細胞測量術式分析法係如上文所述進行。
從細胞株4119LnPx誘導獼猴T細胞，而藉由第E3簇抗原決定位的BCMA/CD3雙特異性抗體有效地殺死經獼猴BCMA轉染的CHO細胞。在該分析法中，該等抗體呈現非常強力之個位數至低二位數皮克/毫升的EC50值，證實該等抗體在獼猴系統中的活性非常高。另一方面，第E1/E4簇抗原決定位的BCMA/CD3雙特異性抗體顯示顯著較弱的效力，其EC50值係位於二位數至三位數皮克/毫升之範圍(參見圖15與表10)。因此E3特異性抗體在獼猴系統中的效力係強約3倍至幾近100倍。
第15例
BCMA/CD3雙特異性抗體單體與二聚體之間之效力差距
為測定個別BCMA/CD3雙特異性抗體的單體與二聚異構體之間之細胞毒性活性差異(稱作效力差距)，用純化BCMA/CD3雙特異性抗體單體與二聚體進行如上文(第8.1例)所述之51-鉻釋出細胞毒性分析法。按雙特異性抗體之單體與二聚體的EC50值之比例，計算效力差距。所試驗之第E3簇抗原決定位的BCMA/CD3雙特異性抗體之的效力差距係介於0.03與1.2之間。因此相較於其個別的單體，二聚體的活性並非實質上更高。
第16例
在三次冷凍/解凍循環後之單體轉化為二聚體之轉化作用
雙特異性BCMA/CD3抗體單體係進行三次冷凍/解凍循環及接著進行高性能SEC，以測定起始單體抗體中已轉化為抗體二聚體之百分比。
用通用緩衝液將15微克的單體抗體的濃度調整為250微克/毫升，然後在-80℃冷凍30分鐘，隨後在室溫解凍30分鐘。在三次冷凍/解凍循環後，藉由HP-SEC測定二聚體含量。就此目的而言，將該抗體的單體異構體之15微克等分試樣解凍，及在原本的SEC緩衝液(10 mM檸檬酸、75 mM鹽酸離胺酸、4%海藻糖及pH 7.2)中均衡至濃度為250微克/毫升，接著在37℃培養7天。將一個高解析SEC管柱TSK Gel G3000 SWXL(日本東京的東曹(Tosoh)株式會社)與配備一個A905自動取樣器之Äkta純化器10 FPLC(通用電氣生命科學(GE Lifesciences)公司)連結。管柱平衡化與域運作緩衝液係由100 mM磷酸二氫鉀、200 mM硫酸鈉所組成，及調整至pH 6.6。在培養7天後，在經平衡的管柱中施用抗體溶 液(15微克的蛋白)，及以0.75毫升/分鐘的流速及7 MPa的最大壓力進行洗提。在280、254及210奈米吸光度監測全程的運作。藉由在Äkta Unicorn軟體運作評估表中所記錄的210奈米訊號之峰值積分，進行分析。藉由將二聚體峰的面積除以單體加上二聚體峰的總面積，而計算二聚體含量。
第E3簇抗原決定位的BCMA/CD3雙特異性抗體在三次冷凍/解凍循環後所呈現的二聚體百分比為0.7至1.1%，其被視為良好。然而，第E1/E4簇抗原決定位的BCMA/CD3雙特異性抗體的二聚體轉化率達到不利的過高數值，其等(分別為4.7%與3.8%)係超過不利的二聚體數值之2.5%閾值，參見表11。
第17例
熱安定性
藉由用於測量BCMA/CD3雙特異性抗體之固有的蛋白生物物理安定性之微差掃描熱量測定法(DSC)，測定高溫熔化曲線。使用微卡(MicroCal)有限責任公司(美國麻州北安普頓(Northampton))的VP-DSC裝置進行該等實驗。記錄含有BCMA/CD3雙特異性抗體的一試樣從20至90℃之能量吸收，及與僅含有該抗體調配緩衝液之一試樣相比較。
細言之，將BCMA/CD3雙特異性抗體在儲存緩衝液中的最終濃度調整為250微克/毫升。將300微升之所製備的蛋白溶液轉置於深孔式平皿，及置入DSC裝置的冷卻式自動取樣器機架位置。在其他孔中加入SEC操作緩衝液作為測量用參考物質。就該測量方法而言，藉由自動取樣器將蛋白溶液轉置入一毛細管中。在另一毛細管中加入SEC操作緩衝液作為參考。針對所有試樣進行加熱作用，及記錄自20至90℃等溫加熱該二毛細管所需的加熱能量。
為記錄個別熔化曲線，逐步增加試樣的整體溫度。在各溫度T，記錄試樣及調配緩衝液參考的能量吸收。將該試樣減去參考之能量吸收Cp(千卡/莫耳/℃)差異，相對於個別溫度繪圖。熔化溫度係界定為首次最大能量吸收發生時之溫度。
所試驗的所有第E3簇抗原決定位的BCMA/CD3雙特異性抗體皆顯示有利的熱安定性，及熔化溫度係高於60℃，更精確地係介於61.62℃與63.05℃之間。
第18例
藉由流動式細胞測量術排除血漿干擾
為測定BCMA/CD3雙特異性抗體與人類血漿蛋白的潛在交互作用，建立一種血漿干擾試驗。就此目的而言，在37℃，在90%人類血漿中培養10微克/毫升的個別BCMA/CD3雙特異性抗體達1小時。之後，藉由流動式細胞測量術，測定與表現人類BCMA的CHO細胞之結合作用。
就流動式細胞測量術而言，個別細胞株的200,000個細胞係在冰上與50微升之濃度為5微克/毫升的純化抗體培養30分鐘。在PBS/2% FCS中清洗細胞二次，及用一種鼠類五組胺酸(PentaHis)抗體檢測該等構築質體的結合作用(凱傑(Qiagen)公司；在50微升的PBS/2% FCS中進行1：20的稀釋作用)。在清洗後，用一種與藻紅素複合及在PBS/2% FCS中進行1：100稀釋之Fc γ特異性抗體(迪耶諾瓦(Dianova)公司)檢測結合型五組胺酸(PentaHis)抗體。在FACSCanto II儀器上，藉由流動式細胞測量術測量試樣，及藉由FACSDiva軟體進行分析(二者均來自必帝公司)。
所獲得的數據係與使用PBS而非人類血漿之對照組分析比較。相對結合作用之計算如下：(PBS試樣之訊號/不具有檢測劑之訊號)/(血漿試樣之訊號/不具有檢測劑之訊號)。
在該實驗中，第E3簇抗原決定位的個別BCMA/CD3雙特異性抗體之標的結合作用，顯而易見地並無血漿蛋白所媒介之顯著降低現象。在所有情況下，相對血漿干擾值係低於2，更精確地係介於1.29±0.25與1.70±0.26之間(數值“2”係視為干擾訊號的較低閾值)。
第19例
BCMA/CD3雙特異性抗體在人類腫瘤異體移植模式中之治療功效
在研究第1天，在雌性NOD/SCID小鼠的右背側面，以皮下方式注射人類癌症細胞株NCI-H929的5x106個細胞。
在第9天，當平均腫瘤體積已達到約100立方毫米時，藉由在動物腹腔注射約2x107個細胞，而將在試管中擴增的人類CD3+T細胞移植至小鼠中。第1載劑對照組的小鼠(n=5)並未領受作用細胞及作為未經移植的對照組而與第2載劑對照組(n=10，領受作用細胞)比較，以監測T細胞本身對於腫瘤生長之影響。
在第13天進行抗體治療，此時平均腫瘤體積已達到約200立方毫米。在治療開始當天，各治療組的平均腫瘤尺寸與其他任何組並非統計上不同(變異數分析)。藉由一次全劑量的靜脈內注射方式，以0.5毫克/公斤/天的BCMA/CD3雙特異性抗體BCMA-98xCD3(第3組及n=7)或BCMA-34xCD3(第4組及n=6)治療小鼠達17天。
在研究期間用卡尺測量腫瘤，及藉由各組間的腫瘤體積(TV)比較而評估進展。藉由依據T/C%=100x(所分析組別的中位數TV)/(第2對照組的中位數TV)計算TV，而測定腫瘤生長抑制作用T/C[%]。結果係示於表12與圖16中。
第20例
排除標的陰性細胞的溶胞作用
依5：1的作用細胞相對於標的細胞之比例及24小時的培養時間，使用BCMA陽性人類多發性骨髓瘤細胞株NCI-H929及純化T細胞，進行試管中溶胞分析法。第E3簇抗原決定位的BCMA/CD3雙特異性抗體(BCMA-34與BCMA-98)顯示在NCI-H929溶胞作用中之高效價與功效。然而，在個別抗體高達500 nM時，仍未在BCMA陰性細胞株HL60(AML/骨髓胚細胞形態)、MES-SA(纖維母細胞形態之子宮肉瘤)及SNU-16(上皮形態之胃癌)中檢測出溶胞作用。
第21例
誘導不同PBMC子集的T細胞活化作用
使用人類多發性骨髓瘤細胞株NCI-H929、L-363 與OPM-2作為標的細胞及人類PBMC的不同子集(CD4+/CD8+/CD25+/CD69+)作為作用細胞，進行FACS式細胞毒性分析法(48小時；E：T為10：1)。結果(參見表13)顯示對於所分析的不同PBMC子集而言，藉由EC50值所測量之活化程度係實質上位於相同範圍。
第22例
誘導細胞介素之釋出
使用人類多發性骨髓瘤細胞株NCI-H929、L-363與OPM-2作為標的細胞及人類PBMC作為作用細胞，進行 FACS式細胞毒性分析法(48小時；E：T為10：1)。在遞增濃度的第E3簇抗原決定位的BCMA/CD3雙特異性抗體，測定細胞介素釋出水平[皮克/毫升]。分析下列細胞介素：I1-2、IL-6、IL-10、TNF及IFN-γ。結果係示於表14與圖17中。

Claims (26)

  1. 一結合分子，其至少具有雙特異性及包含一個第一結合域與一個第二結合域，其中(a)第一結合域可與BCMA的第3簇抗原決定位(CQLRCSSNTPPLTCQRYC)結合；及(b)第二結合域可與T細胞CD3受體複合體結合；及其中BCMA的第3簇抗原決定位係對應於序列辨識編號：1002中所述序列的第24至41個胺基酸殘基。
  2. 如申請專利範圍第1項之結合分子，其中該第一結合域可進一步與獼猴BCMA的第3簇抗原決定位(CQLRCSSTPPLTCQRYC)結合。
  3. 如申請專利範圍如申請專利範圍第1或2項之結合分子，其中該第二結合域可與CD3ε結合。
  4. 如前述申請專利範圍中任一項之結合分子，其中該第二結合域可與人類CD3及與獼猴CD3結合。
  5. 如前述申請專利範圍中任一項之結合分子，其中該第一域及/或第二結合域係衍生自一抗體。
  6. 如申請專利範圍第5項之結合分子，其係選自由(scFv)2、(單域mAb)2、scFv-單域mAb、雙鏈抗體及其寡聚體所組成之群組。
  7. 如前述申請專利範圍中任一項之結合分子，其中該第一結合域所包含之一VH區係包含CDR-H1、CDR-H2與CDR-H3，及其所包含之一VL區係包含CDR-L1、CDR-L2與CDR-L3，其中CDR-H1、CDR-H2與CDR-H3及 CDR-L1、CDR-L2與CDR-L3係選自由下列所組成之群組：(1)如序列辨識編號：1中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：2中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：3中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：4中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：5中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：6中所述之CDR-L3；(2)如序列辨識編號：11中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：12中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：13中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：14中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：15中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：16中所述之CDR-L3；(3)如序列辨識編號：21中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：22中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：23中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：24中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：25中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：26中所述之CDR-L3；(4)如序列辨識編號：31中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：32中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：33中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：34中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：35中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：36中所述之CDR-L3；(5)如序列辨識編號：41中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：42中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：43 中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：44中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：45中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：46中所述之CDR-L3；(6)如序列辨識編號：51中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：52中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：53中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：54中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：55中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：56中所述之CDR-L3；(7)如序列辨識編號：61中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：62中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：63中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：64中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：65中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：66中所述之CDR-L3；(8)如序列辨識編號：71中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：72中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：73中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：74中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：75中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：76中所述之CDR-L3；(9)如序列辨識編號：161中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：162中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：163中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：164中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：165中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：166中所述之CDR-L3；(10)如序列辨識編號：171中所述之CDR-H1，如序 列辨識編號：172中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：173中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：174中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：175中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：176中所述之CDR-L3；(11)如序列辨識編號：181中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：182中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：183中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：184中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：185中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：186中所述之CDR-L3；(12)如序列辨識編號：191中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：192中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：193中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：194中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：195中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：196中所述之CDR-L3；(13)如序列辨識編號：201中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：202中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：203中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：204中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：205中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：206中所述之CDR-L3；(14)如序列辨識編號：211中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：212中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：213中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：214中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：215中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：216中所述之CDR-L3； (15)如序列辨識編號：221中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：222中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：223中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：224中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：225中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：226中所述之CDR-L3；(16)如序列辨識編號：311中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：312中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：313中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：314中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：315中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：316中所述之CDR-L3；(17)如序列辨識編號：321中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：322中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：323中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：324中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：325中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：326中所述之CDR-L3；(18)如序列辨識編號：331中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：332中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：333中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：334中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：335中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：336中所述之CDR-L3；(19)如序列辨識編號：341中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：342中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：343中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：344中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：345中所述之CDR-L2及如 序列辨識編號：346中所述之CDR-L3；(20)如序列辨識編號：351中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：352中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：353中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：354中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：355中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：356中所述之CDR-L3；(21)如序列辨識編號：361中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：362中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：363中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：364中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：365中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：366中所述之CDR-L3；(22)如序列辨識編號：371中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：372中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：373中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：374中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：375中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：376中所述之CDR-L3；(23)如序列辨識編號：381中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：382中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：383中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：384中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：385中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：386中所述之CDR-L3；(24)如序列辨識編號：581中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：582中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：583中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：584中所述之 CDR-L1，如序列辨識編號：585中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：586中所述之CDR-L3；(25)如序列辨識編號：591中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：592中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：593中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：594中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：595中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：596中所述之CDR-L3；(26)如序列辨識編號：601中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：602中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：603中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：604中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：605中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：606中所述之CDR-L3；(27)如序列辨識編號：611中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：612中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：613中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：614中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：615中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：616中所述之CDR-L3；(28)如序列辨識編號：621中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：622中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：623中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：624中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：625中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：626中所述之CDR-L3；(29)如序列辨識編號：631中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：632中所述之CDR-H2，如序列辨識編號： 633中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：634中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：635中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：636中所述之CDR-L3；(30)如序列辨識編號：641中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：642中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：643中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：644中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：645中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：646中所述之CDR-L3；(31)如序列辨識編號：651中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：652中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：653中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：654中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：655中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：656中所述之CDR-L3；(32)如序列辨識編號：661中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：662中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：663中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：664中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：665中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：666中所述之CDR-L3：(33)如序列辨識編號：671中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：672中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：673中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：674中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：675中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：676中所述之CDR-L3；(34)如序列辨識編號：681中所述之CDR-H1，如序 列辨識編號：682中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：683中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：684中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：685中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：686中所述之CDR-L3；(35)如序列辨識編號：691中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：692中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：693中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：694中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：695中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：696中所述之CDR-L3；(36)如序列辨識編號：701中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：702中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：703中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：704中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：705中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：706中所述之CDR-L3；(37)如序列辨識編號：711中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：712中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：713中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：714中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：715中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：716中所述之CDR-L3；(38)如序列辨識編號：721中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：722中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：723中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：724中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：725中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：726中所述之CDR-L3； (39)如序列辨識編號：731中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：732中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：733中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：734中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：735中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：736中所述之CDR-L3；(40)如序列辨識編號：741中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：742中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：743中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：744中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：745中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：746中所述之CDR-L3；(41)如序列辨識編號：751中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：752中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：753中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：754中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：755中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：756中所述之CDR-L3；(42)如序列辨識編號：761中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：762中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：763中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：764中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：765中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：766中所述之CDR-L3；(43)如序列辨識編號：771中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：772中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：773中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：774中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：775中所述之CDR-L2及如 序列辨識編號：776中所述之CDR-L3；(44)如序列辨識編號：781中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：782中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：783中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：784中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：785中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：786中所述之CDR-L3；(45)如序列辨識編號：791中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：792中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：793中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：794中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：795中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：796中所述之CDR-L3；(46)如序列辨識編號：801中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：802中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：803中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：804中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：805中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：806中所述之CDR-L3；(47)如序列辨識編號：811中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：812中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：813中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：814中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：815中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：816中所述之CDR-L3；(48)如序列辨識編號：821中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：822中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：823中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：824中所述之 CDR-L1，如序列辨識編號：825中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：826中所述之CDR-L3；(49)如序列辨識編號：831中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：832中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：833中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：834中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：835中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：836中所述之CDR-L3；(50)如序列辨識編號：961中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：962中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：963中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：964中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：965中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：966中所述之CDR-L3；(51)如序列辨識編號：971中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：972中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：973中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：974中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：975中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：976中所述之CDR-L3；(52)如序列辨識編號：981中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：982中所述之CDR-H2，如序列辨識編號：983中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：984中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：985中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：986中所述之CDR-L3；及(53)如序列辨識編號：991中所述之CDR-H1，如序列辨識編號：992中所述之CDR-H2，如序列辨識編號： 993中所述之CDR-H3，如序列辨識編號：994中所述之CDR-L1，如序列辨識編號：995中所述之CDR-L2及如序列辨識編號：996中所述之CDR-L3。
  8. 如前述申請專利範圍中任一項之結合分子，其中該第一結合域係包含一VH區，其係選自由序列辨識編號：7、序列辨識編號：17、序列辨識編號：27、序列辨識編號：37、序列辨識編號：47、序列辨識編號：57、序列辨識編號：67、序列辨識編號：77、序列辨識編號：167、序列辨識編號：177、序列辨識編號：187、序列辨識編號：197、序列辨識編號：207、序列辨識編號：217、序列辨識編號：227、序列辨識編號：317、序列辨識編號：327、序列辨識編號：337、序列辨識編號：347、序列辨識編號：357、序列辨識編號：367、序列辨識編號：377、序列辨識編號：387、序列辨識編號：587、序列辨識編號：597、序列辨識編號：607、序列辨識編號：617、序列辨識編號：627、序列辨識編號：637、序列辨識編號：647、序列辨識編號：657、序列辨識編號：667、序列辨識編號：677、序列辨識編號：687、序列辨識編號：697、序列辨識編號：707、序列辨識編號：717、序列辨識編號：727、序列辨識編號：737、序列辨識編號：747、序列辨識編號：757、序列辨識編號：767、序列辨識編號：777、序列辨識編號：787、序列辨識編號：797、序列辨識編號：807、序列辨識編號：817、序列辨識編號：827、序列辨識編號：837、 序列辨識編號：967、序列辨識編號：977、序列辨識編號：987及序列辨識編號：997中所述的VH區所組成之群組。
  9. 如前述申請專利範圍中任一項之結合分子，其中該第一結合域係包含一VL區，其係選自由序列辨識編號：8、序列辨識編號：18、序列辨識編號：28、序列辨識編號：38、序列辨識編號：48、序列辨識編號：58、序列辨識編號：68、序列辨識編號：78、序列辨識編號：168、序列辨識編號：178、序列辨識編號：188、序列辨識編號：198、序列辨識編號：208、序列辨識編號：218、序列辨識編號：228、序列辨識編號：318、序列辨識編號：328、序列辨識編號：338、序列辨識編號：348、序列辨識編號：358、序列辨識編號：368、序列辨識編號：378、序列辨識編號：388、序列辨識編號：588、序列辨識編號：598、序列辨識編號：608、序列辨識編號：618、序列辨識編號：628、序列辨識編號：638、序列辨識編號：648、序列辨識編號：658、序列辨識編號：668、序列辨識編號：678、序列辨識編號：688、序列辨識編號：698、序列辨識編號：708、序列辨識編號：718、序列辨識編號：728、序列辨識編號：738、序列辨識編號：748、序列辨識編號：758、序列辨識編號：768、序列辨識編號：778、序列辨識編號：788、序列辨識編號：798、序列辨識編號：808、序列辨識編號：818、序列辨識編號：828、序列辨識編號：838、 序列辨識編號：968、序列辨識編號：978、序列辨識編號：988及序列辨識編號：998中所述的VL區所組成之群組。
  10. 如前述申請專利範圍中任一項之結合分子，其中該第一結合域係包含選自由下列所組成之群組之一VH區與一VL區：(1)如序列辨識編號：7中所述之一VH區，及如序列辨識編號：8中所述之一VL區；(2)如序列辨識編號：17中所述之一VH區，及如序列辨識編號：18中所述之一VL區；(3)如序列辨識編號：27中所述之一VH區，及如序列辨識編號：28中所述之一VL區；(4)如序列辨識編號：37中所述之一VH區，及如序列辨識編號：38中所述之一VL區；(5)如序列辨識編號：47中所述之一VH區，及如序列辨識編號：48中所述之一VL區；(6)如序列辨識編號：57中所述之一VH區，及如序列辨識編號：58中所述之一VL區；(7)如序列辨識編號：67中所述之一VH區，及如序列辨識編號：68中所述之一VL區；(8)如序列辨識編號：77中所述之一VH區，及如序列辨識編號：78中所述之一VL區；(9)如序列辨識編號：167中所述之一VH區，及如序列辨識編號：168中所述之一VL區； (10)如序列辨識編號：177中所述之一VH區，及如序列辨識編號：178中所述之一VL區；(11)如序列辨識編號：187中所述之一VH區，及如序列辨識編號：188中所述之一VL區；(12)如序列辨識編號：197中所述之一VH區，及如序列辨識編號：198中所述之一VL區；(13)如序列辨識編號：207中所述之一VH區，及如序列辨識編號：208中所述之一VL區；(14)如序列辨識編號：217中所述之一VH區，及如序列辨識編號：218中所述之一VL區；(15)如序列辨識編號：227中所述之一VH區，及如序列辨識編號：228中所述之一VL區；(16)如序列辨識編號：317中所述之一VH區，及如序列辨識編號：318中所述之一VL區；(17)如序列辨識編號：327中所述之一VH區，及如序列辨識編號：328中所述之一VL區；(18)如序列辨識編號：337中所述之一VH區，及如序列辨識編號：338中所述之一VL區；(19)如序列辨識編號：347中所述之一VH區，及如序列辨識編號：348中所述之一VL區；(20)如序列辨識編號：357中所述之一VH區，及如序列辨識編號：358中所述之一VL區；(21)如序列辨識編號：367中所述之一VH區，及如序列辨識編號：368中所述之一VL區； (22)如序列辨識編號：377中所述之一VH區，及如序列辨識編號：378中所述之一VL區；(23)如序列辨識編號：387中所述之一VH區，及如序列辨識編號：388中所述之一VL區；(24)如序列辨識編號：587中所述之一VH區，及如序列辨識編號：588中所述之一VL區；(25)如序列辨識編號：597中所述之一VH區，及如序列辨識編號：598中所述之一VL區；(26)如序列辨識編號：607中所述之一VH區，及如序列辨識編號：608中所述之一VL區；(27)如序列辨識編號：617中所述之一VH區，及如序列辨識編號：618中所述之一VL區；(28)如序列辨識編號：627中所述之一VH區，及如序列辨識編號：628中所述之一VL區；(29)如序列辨識編號：637中所述之一VH區，及如序列辨識編號：638中所述之一VL區；(30)如序列辨識編號：647中所述之一VH區，及如序列辨識編號：648中所述之一VL區；(31)如序列辨識編號：657中所述之一VH區，及如序列辨識編號：658中所述之一VL區；(32)如序列辨識編號：667中所述之一VH區，及如序列辨識編號：668中所述之一VL區；(33)如序列辨識編號：677中所述之一VH區，及如序列辨識編號：678中所述之一VL區； (34)如序列辨識編號：687中所述之一VH區，及如序列辨識編號：688中所述之一VL區；(35)如序列辨識編號：697中所述之一VH區，及如序列辨識編號：698中所述之一VL區；(36)如序列辨識編號：707中所述之一VH區，及如序列辨識編號：708中所述之一VL區；(37)如序列辨識編號：717中所述之一VH區，及如序列辨識編號：718中所述之一VL區；(38)如序列辨識編號：727中所述之一VH區，及如序列辨識編號：728中所述之一VL區；(39)如序列辨識編號：737中所述之一VH區，及如序列辨識編號：738中所述之一VL區；(40)如序列辨識編號：747中所述之一VH區，及如序列辨識編號：748中所述之一VL區；(41)如序列辨識編號：757中所述之一VH區，及如序列辨識編號：758中所述之一VL區；(42)如序列辨識編號：767中所述之一VH區，及如序列辨識編號：768中所述之一VL區；(43)如序列辨識編號：777中所述之一VH區，及如序列辨識編號：778中所述之一VL區；(44)如序列辨識編號：787中所述之一VH區，及如序列辨識編號：788中所述之一VL區；(45)如序列辨識編號：797中所述之一VH區，及如序列辨識編號：798中所述之一VL區； (46)如序列辨識編號：807中所述之一VH區，及如序列辨識編號：808中所述之一VL區；(47)如序列辨識編號：817中所述之一VH區，及如序列辨識編號：818中所述之一VL區；(48)如序列辨識編號：827中所述之一VH區，及如序列辨識編號：828中所述之一VL區；(49)如序列辨識編號：837中所述之一VH區，及如序列辨識編號：838中所述之一VL區；(50)如序列辨識編號：967中所述之一VH區，及如序列辨識編號：968中所述之一VL區；(51)如序列辨識編號：977中所述之一VH區，及如序列辨識編號：978中所述之一VL區；(52)如序列辨識編號：987中所述之一VH區，及如序列辨識編號：988中所述之一VL區；及(53)如序列辨識編號：997中所述之一VH區，及如序列辨識編號：998中所述之一VL區。
  11. 如申請專利範圍第10項之結合分子，其中該第一結合域係包含選自由序列辨識編號：9、序列辨識編號：19、序列辨識編號：29、序列辨識編號：39、序列辨識編號：49、序列辨識編號：59、序列辨識編號：69、序列辨識編號：79、序列辨識編號：169、序列辨識編號：179、序列辨識編號：189、序列辨識編號：199、序列辨識編號：209、序列辨識編號：219、序列辨識編號：229、序列辨識編號：319、序列辨識編號：329、序列辨識編 號：339、序列辨識編號：349、序列辨識編號：359、序列辨識編號：369、序列辨識編號：379、序列辨識編號：389、序列辨識編號：589、序列辨識編號：599、序列辨識編號：609、序列辨識編號：619、序列辨識編號：629、序列辨識編號：639、序列辨識編號：649、序列辨識編號：659、序列辨識編號：669、序列辨識編號：679、序列辨識編號：689、序列辨識編號：699、序列辨識編號：709、序列辨識編號：719、序列辨識編號：729、序列辨識編號：739、序列辨識編號：749、序列辨識編號：759、序列辨識編號：769、序列辨識編號：779、序列辨識編號：789、序列辨識編號：799、序列辨識編號：809、序列辨識編號：819、序列辨識編號：829、序列辨識編號：839、序列辨識編號：969、序列辨識編號：979、序列辨識編號：989及序列辨識編號：999所組成之群組之一胺基酸序列。
  12. 如申請專利範圍第1至6項中任一項之結合分子，其具有如序列辨識編號：340或序列辨識編號：980所示之胺基酸序列。
  13. 如前述申請專利範圍中任一項之結合分子，其特徵在於EC50(皮克/毫升)為350或以下，較佳為320或以下。
  14. 如前述申請專利範圍中任一項之結合分子，其特徵在於其EC50(皮克/毫升)係相當於BC E5 33-B11-B8、BC 5G9 92-E10、BC 5G9 91-D2-B10、BC B12 33-A4-B2、BC 3A4 37-A11-G1、BC A7-27 C4-G7、BC C3 33-D7-B1、BC C3 33-F8-E6B1中任一者之EC50(皮克/毫升)。
  15. 一種核酸序列，其係編碼如申請專利範圍第1至14項中任一項所界定之一結合分子。
  16. 一種載體，其係包含如申請專利範圍第15項所界定之一核酸序列。
  17. 一種宿主細胞，其係經如申請專利範圍第15項所界定之核酸序列或經如申請專利範圍第16項所界定之載體轉形或轉染。
  18. 一種用於生產如申請專利範圍第1至14項中任一項之一結合分子之方法，該方法包括在容許如申請專利範圍第1至14項中任一項所界定之結合分子表現之條件下，培養如申請專利範圍第17項所界定之一宿主細胞，及從培養物中回收所產生的結合分子。
  19. 一種藥學組成物，其包含如申請專利範圍第1至14項中任一項之一結合分子或如申請專利範圍第18項之方法所產生之一結合分子。
  20. 如申請專利範圍第1至14項中任一項之結合分子或如申請專利範圍第18項之方法所產生之結合分子，其係用於預防、治療或改善選自由漿細胞疾患、與BCMA表現作用相關聯的其他B細胞疾患及自體免疫疾病所組成之群組之一疾病。
  21. 一種方法，其係用於治療或改善選自由漿細胞疾患、與BCMA表現作用相關聯的其他B細胞疾患及自體免疫疾病所組成之群組之一疾病，該方法之步驟包括對於有需 要的一個體投予如申請專利範圍第1至14項中任一項之結合分子或如申請專利範圍第18項之方法所產生之結合分子。
  22. 如申請專利範圍第21項之方法，其中該漿細胞疾患係選自由多發性骨髓瘤、漿細胞瘤、漿細胞性白血病、巨球蛋白血症、澱粉樣變性病、華氏(Waldenstrom)巨球蛋白血症、骨孤立性漿細胞瘤、骨髓外漿細胞瘤、骨硬化性骨髓瘤、重鏈病、未知臨床意義的單株免疫球蛋白增高及潛伏型多發性骨髓瘤骨髓瘤所組成之群組。
  23. 如申請專利範圍第21項之方法，其中該自體免疫疾病係全身性紅斑狼瘡。
  24. 一種套組，其包含如申請專利範圍第1至14項中任一項所界定之一結合分子、如申請專利範圍第15項所界定之一核酸分子、如申請專利範圍第16項所界定之一載體及/或如申請專利範圍第17項所界定之一宿主細胞。
  25. 一種BCMA的第3簇抗原決定位用於產生可與BCMA結合之一種結合分子及較佳一種抗體之用途，其中BCMA的第3簇抗原決定位係對應於序列辨識編號：1002中所述序列的第24至41個胺基酸殘基。
  26. 一種方法，其係用於產生可與BCMA結合之一抗體及較佳一種雙特異性結合分子，該方法包括(a)用包含BCMA的第3簇抗原決定位之一多肽，進行一動物的免疫接種，其中BCMA的第3簇抗原決定位係對應於序列辨識編號：1002中所述序列的第24至41個 胺基酸殘基，(b)獲得該抗體，及(c)選擇性地將該抗體轉化成一種雙特異性結合分子，其可與人類BCMA結合及較佳與T細胞CD3受體複合體結合。
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