CN102421797A

CN102421797A - Glp-1类似物的衍生物或其可药用盐和用途

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Publication number: CN102421797A
Application number: CN2010800213440A
Authority: CN
Inventors: 王亚里; 吕爱锋; 孙长安; 袁恒立
Original assignee: Jiangsu Hansoh Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Hengrui Medicine Co Ltd
Priority date: 2009-07-30
Filing date: 2010-07-29
Publication date: 2012-04-18
Anticipated expiration: 2030-07-29
Also published as: EP2460825B1; MX2012001186A; BR112012001915B1; ZA201200239B; ES2694394T3; US20120129768A1; PL2460825T3; JP5768048B2; HK1154027A1; RU2012105355A; CN102421797B; CN101987868B; EP2460825A1; AU2010278466A1; CN101987868A; BR112012001915A2; CA2769229C; RU2565536C2; DK2460825T3; EP2460825A4

Abstract

本发明涉及一种含有氨基酸序列为通式(I)的GLP-1类似物的衍生物或其可药用盐。本发明提供的GLP-1类似物的衍生物具有人GLP-1的功能，并且与人GLP-1相比在体内具有更长时间的半衰期。本发明提供的GLP-1类似物的衍生物或其可药用盐或含有GLP-1类似物的衍生物或其可药用盐的药物组合物可在治疗非胰岛素依赖性糖尿病、胰岛素依赖性糖尿病、肥胖症中广泛应用。X₁-X₂-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-X₁₀-Ser-X₁₂-X₁₃-X₁₄-Glu-X₁₆-X₁₇-Ala-X₁₉-X₂₀-X₂₁-Phe-Ile-X₂₄-Trp-Leu-X₂₇-X₂₈-X₂₉-X₃₀-X₃₁-X₃₂-X₃₃-X₃₄-X₃₅-X₃₆-X₃₇-X₃₈-X₃₉-Lys(I)

Description

GLP-1类似物的衍生物或其可药用盐和用途

技术领域

本发明涉及人胰高血糖素样肽 -1 (GLP-1 )类似物的衍生物或其可药用盐，本发明提供的 GLP-1类似物的衍生物具有人 GLP-1的功能，并且与人 GLP-1 相比在体内具有更长时间的半衰期。本发明还涉及 GLP-1类似物的衍生物或其可药用盐或含有 GLP-1类似物的衍生物或其可药用盐的药物组合物用于治疗非胰岛素依赖性糖尿病、胰岛素依赖性糖尿病、肥胖症的用途。背景技术

糖尿病是一种全球性流行病，是由于体内胰岛素绝对或相对不足而导致的葡萄糖、蛋白质、脂质代谢紊乱的综合症（陈睿杰. 糖尿病治疗药物的研究现状. 广东药学院学报， 2001, 7(2): 131-133 ) ，根据发病机理可分为 I型和 II型糖尿病 (Type 2 diabetes mellitus, T2DM, 下同）。在所有确诊的糖尿病患者中， 90-95%病人患有 T2DM, 并且病人往往伴随着肥胖、体能活动不足（physical inactivity) 、年龄偏大、家族糖尿病史、葡萄糖代谢损伤以及有家族糖尿病史等。 T2DM也是一种进行性疾病（progressive disease) 。 2000年，世界卫生组织统计数据估计全球约有 1.71亿人患有糖尿病； 2005年，美国疾病控制和预防中心（Centers for Disease Control and Prevention)估计约有 0.208亿美国人患有糖尿病，约占美国人口的 7%; 2006年据国际糖尿病联盟统计，全球糖尿病患病人数约为 2.46亿（约占全球总人口的 5.9% )并且 46%的患者年龄在 40-59 岁之间。研究表明，正常人和 T2DM患者对葡萄糖反应有着非常重要的区别。正常人在饭后对血糖升高的反应属于早期胰岛素反应（early insulin response ) 。

T2DM特征是胰岛素抑制和胰腺 β-细胞功能损伤，导致胰岛素缺乏禾口高血糖 ( Ferrannini E. Insulin resistance versus insulin deficiency in non-insulin-dependent diabetes mellitus: problems and prospects. Endocr Rev. 1998, 19(4):477^90) 。 T2DM病人一般会出现饭后以及空腹高血糖（空腹血糖〉 125mg/dL) ，而高血糖主要是由于胰腺 β-细胞不能分泌足够的胰岛素来补偿周边组织中的胰岛素抑制造成的（Weyer C, Bogardus C, Mott DM., et al. The natural history of insulin secretory dysfunction and insulin resistance in the pathogenesis of type 2 diabetes mellitus. J. Clin. Invest. 1999, 104(6): 787-794 ) 。

T2DM的主要危险因素是肥胖，它对人类健康具有非常大的危害。患者患上心血管疾病和非正常死亡的危险会变大，同时 T2DM往往与其它一些高危险性疾病如高血压、血脂障碍和肥胖等同时存在； 60%的 T2DM病人伴随着微血管并发症者包括视网膜病（retinopathy) 和神经病变 ( neuropathy ) 以及与 T2DM有关的心血管病状 ( cardiovascular morbidities)如冠状动脉心脏病、心肌梗塞和休克等。在美国，心血管疾病（ cardiovascular disease, CVD )是导致发病和死亡的主要因素，而 T2DM是大血管（ macrovascular ) 并发症如动脉粥样硬化 (atherosclerosis) 、心肌梗塞 (myocardial infarction) 、休克禾口夕卜周血管病的发生的主要危险因素（major risk factor) 。患糖尿病的成人发生心脏病和休克导致死亡的机率是非糖尿病人的 2-4倍，此外，接近 65% 的糖尿病人死于心脏病和休克。

除了对患者生理和身体的伤害之外， T2DM还会给社会造成很大的经济负担，据统计，在美国每年用于治疗糖尿病并发症的费用大约 229 亿美元，每年用于 T2DM及其并发症的总费用接近 571亿美元，不列入预算的花费总额超过 80亿美元。

T2DM 治疗药物向来是人们关注的焦点，从早期的磺酰类、双胍类口服降糖药物到近期的胰岛素增敏剂和 α-糖苷酶抑制剂，从动物胰岛素到人胰岛素及各种新剂型的开发，从单纯的增加胰岛素出发的药物治疗机理到作用于更早产生胰岛素的新途径。体重增加是这类口服或注射降糖药用药后常见的不良反应，这一点可能降低依从性，并且可能增加发生心血管病的风险。因此开发安全性高，病人顺从性好，不良反应低的新型 T2DM治疗药物成为众多研究机构和制药企业争相研制的热点。

早在 100多年前， Moore就提出十二指肠能分泌刺激胰腺分泌的"化学兴奋剂"，并试图注射肠道提取物来治疗糖尿病。随后发现肠道分泌的体液因子能增强胰腺的内分泌功能，无论静脉还是口服葡萄糖所引发的胰岛素分泌，约 50%源于肠道所产生的肽类的刺激作用，为此 Zimz 和 Labarre提出"肠降血糖素 (incretin)"的概念。至今已分离出 2种肠降血糖素，即葡萄糖依赖性胰岛素释放肽 (glucose-dependent insulinotropic polypeptide, GIP)和胰高血糖素样肽 -l(glucagon-like peptide- 1， GLP-1)。 GIP和 GLP-1都是在营养吸收时由特定的肠神经分泌细胞分泌，其中 GIP由十二指肠和邻近空肠 K细胞（proximal jejunal K cells)分泌， GLP-1 则在 L细胞中合成且主要存在于远端小肠和结肠中（Drucker DJ. Enhancing incretin action for the treatment of type 2 diabetes. Diabetes Care. 2003, 26(10):2929-2940) _o

GLP-1在血桨中以 GLP-l(7-37)和 GLP-1 (7-36)酰胺两种生物活性形式存在，这两个多肽仅有一个氨基酸差异，而且它们的生物作用和体内半衰期是相同的 ( Drucker DJ. Enhancing incretin action for the treatment of type 2 diabetes. Diabetes Care. 2003, 26(10):2929-2940 ) 。

通常所说的 GLP-1是对 GLP-l(7-37)和 GLP-1 (7-36)酰胺的统称。

GIP 和 GLP-1 在胃肠道释放出来后会很快被体内的二肽基肽酶 -IV(dipeptidyl peptidase-IV , DPP-IV)降解为没有活性的形式，从而使 GIP和 GLP-1在体内的半衰期非常低（GIP体内半衰期约 5-7min， GLP-1 体内半衰期约 2min) (Drucker DJ. Enhancing incretin action for the treatment of type 2 diabetes. Diabetes Care. 2003, 26(10):2929-2940 ) 。研究表明，大多数降解过程发生在 GIP和 GLP-1进入含有 DPP-IV的血管时发生，少量没有被降解的 GLP-1和 GIP会进入胰腺并跟其结合位点结合而刺激 β-细胞释放胰岛素。与磺酰脲 (sulfonylureas)通过直接促进功能 β-细胞释放胰岛素机制不同，肠促胰岛素效应大部分都是葡萄糖依赖型。此外，一些动物和人体体外试验表明 GLP-1还具有 α-细胞抑制和降低胰高血糖素过度分泌（glucagon hypersecretion) 等作用。

虽然 T2DM患者体内血桨 GIP水平正常但其肠促胰岛素作用显著下降或丧失，而 GLP-1在 T2DM患者体内水平则是降低，因此研究基于 GLP- 1的药物更有助于治疗 T2DM。虽然饭后几 min内 GLP- 1 (7-37)和 GLP-l(7-36)酰胺水平均会提高，但 GLP-l(7-36)酰胺含量更多些，因此内分泌和神经信号传递的双重作用可能在被消化的食物从消化道下端进入小肠和结肠前已经大大提高了 GLP-1的分泌。空腹状态下血桨中 GLP-1水平是很低的（约 5-10pmol/L)，而在进食后其水平迅速增加（达到 15-50pmol/L) 。在 DPP-IV和肾清除双重作用下，体内循环的 GLP-1 水平迅速降低，而其它的酶如人体中性肽链内切酶 24.11 (human neutral endopeptidase 24-11 ) 等是否也对 GLP-1活性的丧失起决定性的作用的研究工作正在进行中。由于 GLP-1在 2位氨基酸是丙氨酸，是 DPP-IV的良好的底物，更容易降解为无活性的肽段。实际上，体内 DPP-IV才是肠促胰岛素活性丧失的主要原因，实验表明 DPP-IV基因被沉默的小鼠体内 GLP-1水平显著提高，增加了胰岛素的分泌。正是在 DPP-IV作用下，体内完整且具有生物活性的 GLP-1仅仅为血桨 GLP-1总含量的 10-20% ( Deacon CF, Nauck MA, Toft-Nielsen M, et al. Both subcutaneously and intravenously administered glucagon-like peptide 1 are rapidly degraded from the NH2-terminus in type 2-diabetic patients and in healthy subjects. Diabetes. 1995, 44(9): 1126-1131 ) 。

GLP-1 和 GIP 通过与结构完全不同的 G-蛋白偶联受体

(G-protein-coupled receptors, GPCRs)结合而发挥各自作用。 GIP受体大部分是由胰岛 β-细胞表达，少部分在脂肪组织和中枢神经系统表达。与此相反， GLP-1受体则主要是在胰岛 α-和 β-细胞以及周缘组织包括中枢和周围神经系统、脑、肾、肺和胃肠道等中表达。两个肠促胰岛素在 β-细胞中的激活会导致 cAMP和胞内钙水平的迅速增加，从而导致其以葡萄糖依赖方式向胞外分泌，持续的肠促胰岛素受体信号传递跟蛋白激酶 A相关，会导致基因转录、增加胰岛素的生物合成并且刺激 β-细胞的增殖 (Gallwitz B. Glucagon-like peptide- 1 -based therapies for the treatment of type 2 diabetes mellitus. Treat Endocrinol. 2005, 4(6):361-370) 。 GLP-1和 GIP受体的激活也可以抑制啮齿目动物和人类胰岛中 β-细胞凋亡同时增加其存活率（Li Y, Hansotia T, Yusta B,et al. Glucagon-like peptide- 1 receptor signaling modulates beta cell apoptosis. J Biol Chem. 2003, 278(1): 471478 ) 。与 GLP-1受体表达相一致的是 GLP-1 也可以抑制胰高血糖素分泌、胃排空和食物摄入，同时通过神经机制 (neural mechanism)增强对葡萄糖的降解。需要注意的是，跟其它胰岛素分泌反应相同， GLP-1 对葡萄糖分泌的作用是胰高血糖素依赖性的，而由于低血糖作用而引起胰高血糖素反调节释放

( counter-regulatory release of glucagon ) 的胰高血糖素作用艮卩使在 GLP-1药理学浓度下仍然得到了完全保留。

内源性 GLP-1和 GIP在葡萄糖体内平衡中发挥的重要生理学作用已经通过使用受体拮抗剂或在基因敲除小鼠中进行了深入研究。急性 GLP-1或 GIP的拮抗作用减少了啮齿目动物体内胰岛素的分泌并且增加了血桨葡萄糖含量。同样， GIP或 GLP-1受体失活突变小鼠同样有缺陷型葡萄糖刺激胰岛素分泌和损伤性葡萄糖耐受性。 GLP-1 还具有空腹血糖调节功能，因为 GLP-1作用的急性拮抗或遗传破坏会导致啮齿目动物空腹葡萄糖水平的提高；同时， GLP-1 是人体内葡萄糖控制的基础，对拮抗 Exendin(9-39)的研究表明 GLP-1作用被破坏后会造成缺陷性葡萄糖刺激胰岛素分泌（defective glucose- stimulated insulin secretion) 、减少葡萄糖清除率、增加胰高血糖素水平和加快胃排空作用。此夕卜， GLP-1的生理作用 (Deacon CF. Therapeutic strategies based on glucagon-like peptide 1. Diabetes. 2004, 53(9):2181-2189 ) 还包括：（1)帮助组织血糖吸收，介导葡萄糖依赖型胰岛素分泌；（抑制餐后胰高血糖素分泌，降低肝糖释放；（调节胃排空，防止食物在肠道吸收时葡萄糖的过度循环；（4)抑制食物摄入（如食欲）。此外动物试验还表明 GLP-1的一个生理学作用是稳定体内胰腺 β-细胞数量。

因为 GLP-1和 GIP在控制血糖等多方面具有良好作用，特别是其不产生低血糖和延缓胃排空控制体重的特点引起了众多科学家的兴趣。人们开始尝试研究基于 GLP-1和 GIP药物治疗 T2DM。众所周知， T2DM病人缺乏或丧失了肠促胰岛素效应，其中一个原因是 T2DM病人体内 GIP的肠促胰岛素作用大大减弱；同时， T2DM患者体内 GLP-1 水平很低，且因饮食刺激产生的 GLP-1水平显著减少（Toft-Nielsen MB, Damholt MB, Madsbad S, et al. Determinants of the impaired secretion of glucagon-like peptide- 1 in type 2 diabetic patients. J Clin Endocrinol Metab. 2001, 86(8):3717-3723 )。因为 T2DM患者体内 GLP-1作用得到了部分保留，旨在增强 T2DM患者体内肠促胰岛素效应的药物研究方向之一就是 GLP-1增效剂。

GLP-1类似物与内源性 GLP或 GIP—样，可以以葡萄糖依赖型的方式刺激体内胰岛素的分泌，同时抑制胰高血糖素的体内释放。此外

GLP-1 类似物对以下症状具有作用：（1)低血糖。与其它促分泌药物不同， GLP-1 类似物由于以一种葡萄糖依赖方式促进体内胰岛素分泌，因此其降血糖作用具有自限性，在大剂量时一般不会引起严重的低血糖。尽管有文献报告 GLP-1可以将血糖降低到正常水平以下，但该效应短暂，而且被认为是 GLP-1促胰岛素分泌作用的自然结果。由于胰岛素的灭活需要一定时间，因此当因血糖浓度降低， GLP-1 的刺激作用减弱而没有新胰岛素分泌的时候，原有的胰岛素仍在起作用。总之， GLP-1 可以使血糖暂时降低到正常水平之下，但不会引起严重和持久的低血糖。（2)对饱食和体重的作用。除了直接降低血糖之外， GLP-1 还可以降低食物的摄入量，这在啮齿类动物和人身上都得到了验证。这样可以通过降低体重间接控制血糖水平。 GLP-1 还有潜在的抑制胃泌素和进食刺激的胃酸分泌的作用，这些效果表明 GLP-1可能还具有预防消化道溃疡的作用。 GLP-1的作用机制使其不但可以成为理想的 2 型糖尿病患者的治疗药物，还可以成为肥胖型糖尿病患者的治疗药物。

GLP-1 可以增强病人的饱食感、减少食物摄入和保持体重或减肥；（维持 β-细胞健康。一些研究提示 GLP-1可以预防由糖耐量异常到糖尿病的转化，还有一些文献报告了 GLP-1类化合物对实验动物胰岛 β细胞的生长和增殖具有直接的作用，而且有实验发现 GLP-1可以促进胰腺干细胞向功能性 β细胞的分化。这些结果暗示 GLP-1具有保护胰岛及延缓糖尿病进展的功能，可以保持 β-细胞的形态和功能，同时减少其凋亡；（4)对餐后高血糖的作用。这一现象代表了 T2DM治疗的一种新方向。由于一些口服药物和外源胰岛素不能抑制或减少 T2DM患者胰高血糖素的过高分泌， GLP-1 类似物可以可能通过直接抑制胰高血糖素释放或因促进胰岛素分泌而产生旁分泌抑制作用而对胰高血糖素高分泌产生影响。通过这两个机制可以有效减少餐后高血糖现象；同时，保持 β-细胞功能也可能对长期控制餐后高血糖有作用。

同时 GLP-1类似物是通过皮下注射服用，不需要计算碳水化合物的量来估计最佳的药物用量，也不需要对血糖进行自行监测，使这类药物的使用比胰岛素更加方便。

天然 GLP-1多种功效的证实为 T2DM的治疗带来了新希望，但是，人体天然的 GLP-1很不稳定，可被二肽基肽酶 IV(DPP-IV)降解，半衰期仅为 l~2min。若采用天然 GLP-1来降低血糖，需持续静脉输注或持续皮下注射，临床可行性较差。面对这种情况，人们不断探索，希望能找到延长 GLP-1作用时间的方法。因此开发长效的 GLP-1类似物或其衍生物，成为医药界关注的重要领域。

Exenatide是合成的 Exendin-4，由礼来公司和 Amylin公司合作开发，商品名 Byetta®, FDA和 EMEA已经批准其上市，用于治疗 T2DM。它在序列上与哺乳动物 GLP-1有 50%同源性且其与 GLP-1受体亲和位点艮 GLP-1 相以 ( Drucker DJ, Nauck MA. The incretin system: glucagon-like peptide- 1 receptor agonists and dipeptidyl peptidase-4 inhibitors in type 2 diabetes. Lancet. 2006, 368(9548): 1696-1705 ) ，由蜥蜴特有的基因编码；与 GLP-1相比， Exenatide将 GLP-1第 2位丙氨酸替换成甘氨酸，有效的抑制了 DPP-IV酶解，在体内半衰期约 60-90min ( Kolterman OG, Kim DD, Shen L, et al. Pharmacokinetics, pharmacodynamics, and safety of exenatide in patients with type 2 diabetes melllitus. Am Health Syst Pharm. 2005, 62(2): 173-181 ) ，单次皮下注射后 Exenatide在体内浓度持续增加， 2h左右可以在血桨中达到最大浓度，可维持 4-6h (Nielsen LL, Baron AD. Pharmacology of exenatide (synthetic exendin-4) for the treatment of type 2 diabetes. Curr Opin Investig Drugs. 2003, 4(4):401-05 ) 。需要注意的是 Exenatide的代谢不发生在肝脏中，而主要经肾小球过滤后经蛋白酶降解。

Exenatide具有特殊的葡萄糖调节活性，包括葡萄糖依赖型增强胰岛素分泌作用、葡萄糖依赖型抑制不正确过高胰高血糖素分泌作用、减缓胃排空和减少食物摄入等作用。体内和体外糖尿病模型研究还发现， Exenatide还具有储存第一阶段（first-phase ) 胰岛素分泌、促进 β- 细胞增殖和胰岛素从其前体细胞再生的作用。

为了达到较好的血糖控制，每天需要两次注射 Exenatide, 这给病人带来了很大的不便。再者 Exenatide还具有轻微至中等反胃（约 40% 病人会有此反应）、腹泻和呕吐（少于 15%的病人会有这两种反应）； Exenatide治疗的病人中约 50%会产生抗体，虽然这些抗体不会影响药效或引起其它临床作用。最近又发现 6例服用 Byetta后发生出血或坏死性胰腺炎症状的情况。

CJC-1131是 ConjuChem Biotechnologies Inc开发的一种肽酶抑制型 GLP-1类似物，将 GLP-1序列中 2位的 Ala替换成了 D-Ala，用以增强抵抗 DPP-IV酶解的能力，其结构中包含一个具有反应活性的链接剂 (reactive linker) 以便于其通过共价（非可逆）方式结合到血清白蛋白上 ( Kim JG, Baggio LL, Bridon DP, et al. Development and characterization of a glucagon-like peptide- 1 albumin conjugate: the ability to activate the glucagon-like peptide 1 receptor in vivo. Diabetes. 2003, 52(3):751-759 )，产生的 GLP-1-血清白蛋白复合物保留了 GLP-1的活性，同时增加了对 DPP-IV酶解的稳定性，延长了体内作用时间，其血桨清除半衰期约 20天。

已经进行的一项研究发现， CJC- 1131 -血清白蛋白复合物与用人类重组胰腺 GLP-1受体转染的中国仓鼠卵巢细胞结合时 Ki约为 12nM (GLP-1的 Ki为 5.2nM) ；同时该复合物活化 cAMP的 EC₅。为 11-13ηΜ， EC₅。与 GLP-1相似。现有文献表明，该结合分子可以降低血糖正常和高血糖小鼠餐后血糖浓度，而且试验表明 CJC-1131的这一活性作用于 GLP- 1某一功能性受体上，同时在小鼠中 CJC- 1131还具有减缓胃排空和抑制食物摄入等作用。

CJC-1131已经完成了部分 II期临床试验。 2005年 9月， ConjuChem 对已有的试验结果分析后认为 CJC-1131可能不适合慢性剂量策略 (chronic dosing regimens) ，因而暂停了 CJC-1131的临床研究。目前 CJC-1131临床试验仍未重新启动。

Albugon ( albumin-GLP-1 ) 是由葛兰素史克在 Human Genome Sciences Inc授权下开发的一种长效 T2DM治疗药物，它是 GLP-1(带增加对 DDP-IV抗性的突变:)和白蛋白的融合体。它在猴子体内的半衰期为 3天。其基本的研发思路是将重组 GLP-1与血清白蛋白偶联后形成一个复合物，这样便显著增加了其体内半衰期。服用 Albugon后有效降低了小鼠血糖水平、增加了胰岛素分泌、减缓了胃排空和减少食物摄入等 ( Baggio LL, Huang Q, Brown TJ, et al. A Recombinant Human Glucagon-Like Peptide (GLP)- 1 -Albumin Protein (Albugon) Mimics Peptidergic Activation of GLP- 1 Receptor-Dependent Pathways Coupled With Satiety, Gastrointestinal Motility, and Glucose Homeostasis. Diabetes. 2004, 53(9):2492- 2500) 。目前 Albugon正在进行 III期临床试验。

WO9808871公开了一种在 GLP-l(7-37)的基础上进行脂肪酸修饰的 GLP-1衍生物，使得 GLP-1在体内的半衰期得到大大增强。 WO9943705公开了一种在 GLP-1的 N端进行化学修饰的衍生物，但是有文献报道在 N端的氨基酸进行修饰会造成整个 GLP-1衍生物的活性大大降低 (J. Med. Chem. 2000, 43, 1664 1669 ) 。另外 CN200680006362、 CN200680006474 、 WO2007113205 、 CN200480004658 、 CN200810152147、 WO2006097538等专利也公开了一系列经化学修饰或氨基酸替换得到的 GLP-1类似物或其衍生物，其中最具有代表性的是诺和诺德公司开发的 liraglutide, 已经完成了 III期临床。 Liraglutide是一种 GLP-1衍生物，其结构中含有序列与人源 GLP-1具有 97%同源性的 GLP- 1类似物，该类似物与棕榈酸共价连接构成了 Liraglutide^[， Liraglutide结构中的棕榈酸以非共价形式连接到血清白蛋白上，这一结构特征决定了它会缓慢的从注射位点释放，在不改变其 GLP-1活性基础上延长了体内循环半衰期；同时结构中的棕榈酸会形成一定空间位阻，从而防止 DPP-IV的降解作用，减少了肾脏清除作用。由于具有以上特性， Liraglutide在通过皮下注射之后在人体内的半衰期约 10-14h，理论上可以一天给药一次，每天剂量为 0.6-1.8mg。 2009年 4月 23日，诺和诺德宣布 EMEA下属的人用药物委员会 (CHMP, Committee for Medicinal products for Human Use)对 Liraglutide评价积极，并且建议批准其上市。诺和诺德期待欧盟委员会可以在两个月以内批准其上市申请。发明内容

本发明的目的在于提供一种活性更高、体内半衰期更长的 GLP-1 类似物的衍生物，本发明提供的 GLP-1类似物的衍生物具有人 GLP-1 的功能，并且与人 GLP-1相比有着较长的体内半衰期。

本发明的另一目的在于提供一种含上述 GLP-1类似物的衍生物或其可药用盐的药物组合物，用于治疗胰岛素依赖性糖尿病、非胰岛素依赖性糖尿病和肥胖病。

本发明的目的是通过以下技术方案来达到的。本发明提供一种含有氨基酸序列通式为（I ) 的 GLP-1类似物的衍生物或其可药用盐，

Xi-X₂-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xio-Ser-X₁₂-X₁₃-X₁₄-Glu-Xi₆-Xi ₇-Ala-X 1₉-X₂o-X2 i-Phe-Ile-X2₄-Trp-Leu-X2₇-X28"X29"X30"X31 -X3₂-X3₃-X₃₄-

X35-X36-X37-X38-X39-LyS

(I )

其中所述 GLP-1 类似物的衍生物具有一个结构通式为 Ri CH^-CO-的亲脂性取代基，选自 CH₃-或者 HOOC- , n为 8-25之间的整数？ Xl、 X2、 Xl0、 Xl2、 Xl3、 Xl4、 Xl6、 Xl7、 Xl9、 20、 21、 X24、 X27、 X28、 X29、 30、 X;31、 X;32、 X;33、 X;34、 X;35、 X;36、 X;37、 38、 X₃₉各自独立的选自任意天然的氨基酸或非天然氨基酸或由其组成的肽段。

所述的 GLP-1类似物是指以人 GLP-K 7-37 )肽为母体，包括 GLP-1 (7-36 )酰胺和 GLP- 1(7-37)，进行部分氨基酸的替换或在 C端的延伸得到新的 GLP-1肽，该 GLP-1肽具备人 GLP-1的功能。

所述的衍生物是指利用亲脂性取代基对 GLP-1类似物的氨基酸残基进行化学修饰，典型的修饰方式为形成酰胺或酯，优选的修饰方式为形成酰胺。

本发明的一个优选的实施方案是结构通式为 R^CH^u-CO-的亲脂性取代基和 GLP-1 类似物的氨基酸残基的氨基通过酰胺键的方式连接，其中选自 C¾-或者 HOOC- , n为 8-25之间的整数。

本发明的另一优选的实施方案是结构通式为 R^CH^u-CO-的亲脂性取代基和 GLP-1类似物 C端 Lys的 ε氨基通过酰胺键的方式连接，其中 Ri选自 CH₃-或者 HOOC- , n为 8-25之间的整数。

本发明的另一优选的实施方案是结构通式为 R^CH^u-CO-的亲脂性取代基和 GLP-1类似物 C端 Lys的 α氨基通过酰胺键的方式连接，其中 Ri选自 CH₃-或者 HOOC- , n为 8-25之间的整数，优选 14。

本发明的另一优选的实施方案是 GLP-1类似物的氨基酸序列中选自 L-His、 D-His; X₂选自 Ala、 D-Ala、 Gly、 Val、 Leu、 Ile、 Lys、 Aib; X₁₀选自 Val、 Leu; X₁₂选自 Ser、 Lys、 Arg; X₁₃选自 Tyr、 Gin; X₁₄选自 Leu、 Met; X₁₆选自 Gly、 Glu、 Aib; X₁₇选自 Gln、 Glu、 Lys、 Arg; X₁₉选自 Ala、 Val; X₂₀选自 Lys、 Glu、 Arg; X₂₁选自 Glu、 Leu; X₂4选自 Val、 Lys; X₂₇选自 Val、 Lys; X₂₈选自 Lys、 Glu、 Asn、 Arg; X₂₉选自 Gly、 Aib; X₃₀选自 Arg、 Gly、 Lys; X₃₁选自 Gly、 Ala, Glu、 Pro. Lys; X₃₂选自 Lys、 Ser; X₃₃选自 Lys、 Ser; X₃₄选自 Gly、 Ala. Sar_; X₃₅选自 Gly、 Ala、 Sar; X₃₆选自 Pro、 Gly; X₃₇选自 Pro、 Gly; X₃₈选自 Pro、 Gly; X₃₉选自 Ser、 Tyr。

更进一步的优选的实施方案是 GLP-1 类似物的氨基酸序列选自 SEQ ID NO 1-120。

本发明的另一优选的实施方案是结构通式为 R^Ci^：) _n-CO-的亲脂性取代基与选自序列如 SEQ ID No: 1-120所示的 GLP-1类似物的氨基酸残基的氨基通过酰胺键的方式连接，其中选自 CH₃ -或者 HOOC- , n为 8-25之间的整数。

更进一步优选的实施方案是结构通式为 R^CH₂：) _n-CO-的亲脂性取代基与选自序列如 SEQ ID No: 1-120所示的 GLP-1类似物的 C端 Lys 的 ε氨基通过酰胺键的方式连接，其中选自 C¾-或者 HOOC- , n 为 8-25之间的整数。

更进一步优选的实施方案是结构通式为 R^CH^u-CO-的亲脂性取代基与选自序列如 SEQ ID No: 1-120所示的 GLP-1类似物的 C端 Lys 的 α氨基通过酰胺键的方式连接，其中选自 CH₃-或者 HOOC- , n 为 8-25之间的整数，优选 n为 8、 10、 12、 14、 16、 18、 20或 22，进一步优选 n为 14。

本发明的另一优选的实施方案是结构通式为 R^CH^u-CO-的亲脂性取代基与选自序列如 SEQ ID No: 1-20所示的 GLP-1类似物的 C端 Lys的 α氨基通过酰胺键的方式连接，其中选自 CH₃-或者 HOOC- , n为 8-25之间的整数，优选 n为 8、 10、 12、 14、 16、 18、 20或 22，进一步优选 n为 14。

本发明的另一优选的实施方案是结构通式为 R^CH^u-CO-的亲脂性取代基与选自序列如 SEQ ID No: 1-8所示的 GLP-1类似物的 C端 Lys 的 α氨基通过酰胺键的方式连接，其中选自 CH₃-， n为 14。

本发明提供的 GLP-1类似物的衍生物属于两性化合物，所属领域技术人员通过公知技术可使用酸性或碱性化合物与之反应成盐，通常采用的形成酸加成盐的酸为：盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、磷酸、对甲苯磺酸、甲磺酸、草酸、对溴苯基磺酸、碳酸、琥珀酸、柠檬酸、苯甲酸、乙酸；盐包括硫酸盐、焦硫酸盐、三氟乙酸盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、磷酸盐、磷酸氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、盐酸盐、溴化物、碘化物、乙酸盐、丙酸盐、辛酸盐、丙烯酸盐、甲酸盐、异丁酸盐、己酸盐、庚酸盐、丙炔酸盐、草酸盐、丙二酸盐、丁二酸盐、辛二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、丁炔一 1， 4一二酸盐、己炔一 1， 6—二酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、苯乙酸盐、苯丙酸盐、苯丁酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、 γ—羟基丁酸盐、甘醇酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、丙磺酸盐、奈一 1一磺酸盐、奈一 2—磺酸盐、扁桃酸盐等，优选三氟乙酸盐。碱性物质也可以和 GLP-1类似物的衍生物成盐，这些碱性物质包括铵，碱金属或碱土金属的氢氧化物，以及碳酸盐、碳酸氢盐，典型的有氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、碳酸钠、碳酸钾等。

根据本发明的含有 GLP-1衍生物的药物组合物可以通过胃肠外给药的方式用于治疗需要这种治疗的病人。胃肠外给药途径可选择皮下注射、肌肉注射或静脉注射。本发明的 GLP-1衍生物还可以选择透皮途径给药，如经贴剂头皮给药，可选择离子透入贴剂；或经透粘膜途径给药。

本发明提供的 GLP-1衍生物的组合物可以使用制药工业常规的技术制备，这些技术包括适当的溶解和混合各组分以得到所需的最终组合物。比如将 GLP-1衍生物溶解于一定量的水中，其中水的量稍小于所制备的组合物的最终体积。按需要加入等渗剂、防腐剂、表面活性剂和缓冲剂，等渗剂例如氯化钠、甘露醇、甘油、丙二醇、糖或糖醇。防腐剂例如苯酚、邻甲酚、对甲酚、间甲酚、甲基对羟基苯甲酸酯、苄醇。适宜的缓冲剂如乙酸钠、碳酸钠、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钠，表面活性剂如泊络沙姆、泊络沙姆 -188、泊络沙姆 -407、吐温 -80、吐温 -20。并在需要时用酸如盐酸、或碱如氢氧化钠水溶液调节溶液的 ρΗ值，最后用水调节溶液体积得到所需的组分浓度。除上述成分外，本发明提供的药物组合物还包括足够量的碱性氨基酸或具有相同作用的碱性试剂用以减少组合物在贮存过程中形成的聚集体，比如赖氨酸、组氨酸、精氨酸、咪唑。

本发明提供的 GLP-1类似物的衍生物采用手工合成的方法，树脂为 HMPA-AM resin,所用的氨基酸衍生物的 α氨基由 Fmoc (芴甲酰羰基）保护，半胱氨酸侧链巯基、谷胺酰胺侧链氨基、组氨酸侧链咪唑基由 Trt (三苯甲基）保护、精氨酸侧链胍基由 Pbf (2,2,4,6,7-五甲基二氢化苯并呋喃一 5—磺酰基）保护，色氨酸侧链吲哚基、赖氨酸侧链氨基由 Boc (叔丁氧羰基）保护，苏氨酸侧链羟基、酪氨酸侧链苯酚基、丝氨酸侧链羟基由 tBu (叔丁基）保护。将所要合成促红细胞生成素模拟肽衍生物单体肽肽链的 C末端氨基酸的羧基以共价键的结构同高分子的不溶性树脂（rink amind resin)相连，然后以此结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组份经过 20%六氢吡啶 /DMF溶液脱去氨基保护基，然后和过量的氨基酸衍生物反应，接长肽链。重复（缩合→洗涤→去保护→洗涤→下一轮缩合）操作，达到所要合成的肽链长度，最后用三氟乙酸:水:乙二硫醇:三异丙基硅垸 = 92.5:2.5:2.5:2.5混合溶液将肽链从树脂上裂解下来，经乙醚沉降得到 GLP-1类似物的衍生物粗品，单体肽粗品使用 C18反相制备柱分离纯化，即得所要的 GLP-1类似物的衍生物。其中缩合和去保护反应步骤的中间控制采取的是茚三酮检测的方法，即当树脂肽链上有游离的氨基时，经茚三酮试剂检测会显蓝色，没有游离氨基时不显色（茚三酮试剂本身为黄色）。因此在进行缩合反应完毕后，通过茚三酮检测，如果显黄色（茚三酮试剂本身的颜色），则说明本步偶合完毕可以进行下一个氨基酸的偶合前的脱保护操作，如果显蓝色，则证明肽链上还有些游离氨基，需进一步的重复偶合或改变现有的缩合剂直至树脂肽经茚三酮检测为黄色。具体实施方式

为了更详细地说明本发明，给出下列实例。但本发明的范围并非限定于此。

实施例一 HS-20001的固相合成方法

1、 Fmoc-Lys(Mtt)-HMP-AM树脂的制备

(DHMP-AM树脂的干燥及溶胀

称量真空干燥 24h的 HMP-AM树脂（0.6mmol/g) 50g (30mmol)g 于 2L鼓泡瓶中，加入 500mL Ν,Ν-二甲基甲酰胺 (DMF)溶胀树脂 30min，抽掉 DMF溶液，加入 DMF洗涤 lmin, 重复洗涤 2次。

(2) Fmoc-Lys(Mtt)-HMP-AM树脂的制备

① Fmoc-Lys(Mtt)-OH与 HMP-AM树脂的偶联

用 500mL DCM洗涤树脂 1次，重复 2次，称取 Fmoc-Lys(Mtt)-OH

56.2g (90mmol)和 DIC11.4g (90mmol)，加入 IL DCM溶解，加入到溶胀后的 HMP-AM树脂中，之后加入 DMAP 366mg(3mmol)，反应 24h;

②树脂的洗涤

反应结束后用 DMF、 IPA交替洗涤树脂肽两次， DMF洗涤 3次； ③羟基的封闭

称取乙酸酐 15.3g (150mmol)和 DIEA 19.4g (150mmol)溶解于 IL DMF中，加入到树脂中，反应 lOmin;

④树脂的洗涤

依次用 1 L 50% MeOH/DMF、50% DCM/DMF洗涤树脂两次， DCM 洗涤树脂 3 次，无水乙醇洗涤 3 次，减压干燥，得 Fmoc-Lys(Mtt)-HMP-AM树脂。

(3) Fmoc-Lys Mtt)-HMP-AM树脂载量测定

精确称量 5~10 mg树脂定容在 lmL 20%六氢吡啶 /DMF中，搅匀 20min后，移液枪取出上清液 50uL溶解在 2.5mL DMF中；

空白样品：移液枪取出 50uL 20%六氢吡啶 /DMF 溶解在 2.5mL

DMF中；

取代度计算公式如下：

Sub=(AX 51)/(7.8 Xm)

其中， A为 301nm紫外吸光值； m为树脂质量，单位 mg。

2、固相合成树脂的干燥及溶胀

称量真空干燥 24h的 Fmoc-Lys(Mtt)-HMPA-AM树脂（0.4mmol/g) 50g (20mmol)置于 2L鼓泡瓶中，加入 500mL Ν,Ν-二甲基甲酰胺 (DMF) 溶胀树脂 30min，抽掉 DMF溶液。

3、 Fmoc-Lys(Mtt)-HMPA-AM树脂脱除 4-甲基三苯甲基 (Mtt)保护基用 200mL DCM 洗涤树脂，重复 1 次，加入 1200mL 1% TFA/DCM(TFA约 8倍过量：)脱除 Mtt保护基，反应时间 lh，用 200mL 5% Ν,Ν-二异丙基乙胺 (DIEA)/DMF和 DMF交叉洗涤 3次， DMF洗涤

3次。

4、棕榈酸的缩合

称量棕榈酸和 3- (二乙氧基磷酰氧基 )-1,2,3-苯并三嗪 -4-酮 (DEPBT) 各 50mmol，加入 400mLDMF溶解，再加入 lOOmmol DIEA室温下搅拌反应 3min，将上述溶液加入到树脂中， 37度水浴下通入 N₂反应 2h。反应结束后抽掉反应液，依次用 DMF、异丙醇 (IPA)和 DMF洗涤树脂。

5、 Fmoc-Lys N-ε-棕榈酸) -HMPA-AM 树脂脱除 9-芴甲氧羰基

(Fmoc)保护基

向装有 Fmoc-Lys Mtt)-HMPA-AM 树脂的鼓泡瓶中加入 200mL 20%哌啶 /DMF溶液，反应 5min后抽出，再加入 200mL 20%哌啶 /DMF 溶液室温反应 20min。反应结束后用 DMF 200mL洗涤树脂 4次。

6、 HS-20001肽链部分的固相合成

①缩合 Fmoc-Ser(tBu)-OH

称量 50mmol Fmoc-Ser(tBu)-OH, 加入 125mL 0.4M 1-羟基苯并三氮唑 (HOBt)/DMF溶解，再加入 125mL 0.4M Ν,Ν'-二异丙基碳二亚胺 (DIC)/DCM室温下活化反应 lOmin; 将上述溶液加入到树脂中，室温下通入 N₂反应，采用茚三酮检测中控反应进行程度。反应结束后抽掉反应液，依次用 DMF、 IPA和 DMF洗涤树脂。

②肽链的延长

按照 HS-20001 肽链部分从氨基端 (N-端：)到羧基端 (C-端：)的顺序 (His-(D)-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Nle-Glu-Gl u-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Gln-Gly-Gly-Pro-Ser-Se r-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser) ，氨基酸和缩合试剂的用量和 Fmoc-Ser(tBu)-OH 相同，保护氨基酸分别是 Fmoc-Ser(tBu)-OH、 Fmoc-Pro-OH , Fmoc-Ala-OH、 Fmoc-Gly-OH、 Fmoc-Gln(Trt)-OH、 Fmoc-Lys(Boc)-OH 、 Fmoc-Leu-OH 、 Fmoc-Trp(Boc)-OH 、 Fmoc-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc-Ile-OH、 Fmoc-Phe-OH、 Fmoc-Arg(Pbf)-OH、 Fmoc-Val-OH、Fmoc-Nle-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、 Fmoc-D-Ala-OH和 Fmoc-His(Trt)-OH，重复缩合和脱保护 2步反应，合成 HS-20001树脂肽。

③ HS-20001树脂肽的后处理

将②所得到的 HS-20001树脂肽依次用 DMF、 IPA和 DMF洗涤树脂，用无水乙醚洗涤 2次后真空干燥，得 HS-20001树脂肽。

④ HS-20001粗品肽的制备

取干燥后的 HS-20001树脂肽，加入新鲜配制的 10mL/(g树脂肽:) 的三氟乙酸 (TFA):三异丙基硅垸 (TIS):水 =95:2.5:2.5(体积比)的裂解液，室温下反应 4h。反应结束后过滤，用 TFA洗涤树脂 2次，收集并合并滤液，旋转蒸发至原体积的 1/3，搅拌下加入到大量冰无水乙醚析出 HS-20001 , 离心后真空干燥得白色 HS-20001粗品。

⑤ HS-20001的反相液相色谱制备

取 HS-20001粗品 10g溶于一定量水中，后经 0.45μηι膜过滤后用反相高效液相色谱 (RP-HPLC)进行分离，流动相为 A 0.1%TFA/H₂O， B 0.1%TFA/乙腈，

其中，色谱柱为 Denali C-18柱 (粒径 8.3μηι， 5x30cm),柱温 45度，检测波长 220nm，流速 120mL/min。收集产物峰，减压浓缩除去大部分乙腈后冻干得 HS-20001成品 2.25g，纯度 98.5%, 收率 22.5%。实施例二 HS-20002的固相合成方法

1、 Fmoc-Lys(Mtt)-HMP-AM树脂的制备

参见实施例一。

2、固相合成树脂的干燥及溶胀

称量真空干燥 24h的 Fmoc-Lys(Mtt)-HMPA-AM树脂（0.4mmol/g) 50g (20mmol)置于 2L鼓泡瓶中，加入 500mL DMF溶胀树脂 30min，抽掉 DMF溶液。

3、 Fmoc-Lys(Mtt)-HMPA-AM树脂脱除 Mtt保护基

用 200mL DCM洗涤树脂，重复一次，加入 1200mL 1% TFA/DCM (TFA 约 8 倍过量:)脱除 Mtt保护基，反应时间 lh，用 200mL 5% DIEA/DMF和 DMF交叉洗涤 3次， DMF洗涤 3次。

4、棕榈酸的缩合称量棕榈酸和 DEPBT各 50mmol，加入 400mLDMF溶解，再加入 lOOmmol DIEA 室温下搅拌反应 3min，将上述溶液加入到树脂中， 37 度水浴下通入 N₂反应 2h。反应结束后抽掉反应液，依次用 DMF、 IPA 和 DMF洗涤树脂。

5、 Fmoc-Lys(N-s-棕榈酸) -HMPA-AM树脂脱除 Fmoc保护基向装有 Fmoc-Lys Mtt)-HMPA-AM 树脂的鼓泡瓶中加入 200mL

20%哌啶 /DMF溶液，反应 5min后抽出，再加入 200mL 20%哌啶 /DMF 溶液室温反应 20min。反应结束后用 DMF 200mL洗涤树脂 4次。

-20002肽链部分的固相合成

称量 50mmol Fmoc-Ser(tBu)-OH, 加入 125mL 0.4M HOBt/DMF溶解，再加入 125mL 0.4M DIC/DCM室温下活化反应 lOmin; 将上述溶液加入到树脂中，室温下通入 N₂反应，采用茚三酮检测中控反应进行程度。反应结束后抽掉反应液，依次用 DMF、 IPA和 DMF洗涤树脂。

②肽链的延长

按照 HS-20002 肽链部分从氨基端 (N-端：)到羧基端 (C-端：)的顺序 (His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Gl u-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gl y-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser), 氨基酸和缩合试剂的用量和 Fmoc-Ser(tBu)-OH 相同，保护氨基酸分别是 Fmoc-Ser(tBu)-OH、 Fmoc-Pro-OH、 Fmoc-Ala-OH、 Fmoc-Gly-OH、 Fmoc-Asn( rt)-OH、 Fmoc-Lys(Boc)-OH、 Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-Trp(Boc)-OH、 Fmoc-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc-Ile-OH、 Fmoc-Phe-OH、 Fmoc-Arg(Pbf)-OH、 Fmoc-Val-OH、 Fmoc-Met-OH、 Fmoc-Gln(Trt)-OH 、 Fmoc-Asp(OtBu)-OH 、 Fmoc-Thr(tBu)-OH 和 Fmoc-His(Trt)-OH, 重复缩合和脱保护两步反应，合成 HS-20002树脂肽。

③ HS-20002树脂肽的后处理

将②所得到的 HS-20002树脂肽依次用 DMF、 IPA和 DMF洗涤树月旨，用无水乙醚洗涤两次后真空干燥，得 HS-20002树脂肽。

④ HS-20002粗品肽的制备取干燥后的 HS-20002树脂肽，加入新鲜配制的 10mL/(g树脂肽:) 的 TFA:TIS:水: 1,2-乙二硫醇 (EDT)=94:1:2.5:2.5(体积比)的裂解液，室温下反应 4h。反应结束后过滤，用 TFA洗涤树脂 2次，收集并合并滤液，旋转蒸发至原体积的 1/3，搅拌下加入到大量冰无水乙醚析出 HS-20002, 离心后真空干燥得白色 HS-20002粗品。

⑤ HS-20002的反相液相色谱制备

取 HS-20002粗品 10g溶于一定量的水中，后经 0.45μηι膜过滤后用反相高效液相色谱 (RP-HPLC)进行分离，流动相为 A 0.1%TFA/H₂O， B 0.1%TFA/乙腈，其中，色谱柱为 Denali C-18柱 (粒径 8.3μηι， 5x30cm), 柱温 45度，检测波长 220nm，流速 120mL/min。收集产物峰，减压浓缩除去大部分乙腈后冻干得 HS-20002 成品 2.1g，纯度 98.%，收率 20.5%。实施例三 HS-20003的固相合成方法

1、 Fmoc-Lys(Mtt)-HMP-AM树脂的制备

参见实施例一。

2、固相合成树脂的干燥及溶胀

称量真空干燥 24h的 Fmoc-Lys(Mtt)-HMPA-AM树脂（0.4mmol/g) 50g (20mmol)置于 2L鼓泡瓶中，加入 500mLDMF溶胀树脂 30min，抽掉 DMF溶液；

3、 Fmoc-Lys(Mtt)-HMPA-AM树脂脱除 Fmoc保护基

4、棕榈酸的缩合

称量棕榈酸和 DEPBT各 50mmol，加入 400mLDMF溶解，再加入 lOOmmol DIEA 室温下搅拌反应 3min，将上述溶液加入到树脂中， 37 度水浴下通入 N₂反应 2h。反应结束后抽掉反应液，依次用 DMF、 IPA 和 DMF洗涤树脂。

5、棕榈酸 -Lys Mt^-HMPA-AM树脂脱除 Mtt保护基用 200mL DCM 洗涤树脂，重复一次，加入 1200mL 1%TFA/DCM(TFA约 8倍过量)脱除 Mtt保护基，反应时间 lh，用 200mL 5%DIEA/DMF和 DMF交叉洗涤 3次， DMF洗涤 3次。

6、 HS-20003肽链部分的固相合成

①缩合 Fmoc-Ser(tBu)-OH

称量 Fmoc-Ser(tBu)-OH和 DEPBT各 50mmol，加入一定量 DMF 溶解，再加入 lOOmmol DIEA室温下活化 3min，将上述溶液加入到树脂中，室温下通入 N₂反应，采用茚三酮检测中控反应进行程度。反应结束后抽掉反应液，依次用 DMF、 IPA和 DMF洗涤树脂。

②肽链的延长

按照 HS-20003 肽链部分从氨基端 (N-端：)到羧基端 (C-端：)的顺序 (His-(D)-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu- Glu-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser- Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser) ，氨基酸和缩合试剂的用量和 Fmoc-Ser(tBu)-OH 相同，保护氨基酸分别是 Fmoc-Ser(tBu)-OH、 Fmoc-Pro-OH , Fmoc-Ala-OH、 Fmoc-Gly-OH、 Fmoc-Arg(Pbf)-OH、 Fmoc-Val-OH、 Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-Trp(Boc)-OH、 Fmoc-Ile-OH、 Fmoc-Phe-OH 、 Fmoc-Glu(OtBu)-OH 、 Fmoc-Lys(Boc)-OH 、 Fmoc-Tyr(tBu)-OH 、 Fmoc-Asp(OtBu)-OH 、 Fmoc-Thr(tBu)-OH 、 Fmoc-D-Ala-OH和 Fmoc-His(Trt)-OH，重复缩合和脱保护两步反应，合成 HS-20003树脂肽。

③ HS-20003树脂肽的后处理

将②所得到的 HS-20003树脂肽依次用 DMF、 IPA和 DMF洗涤树月旨，用无水乙醚洗涤两次后真空干燥，得 HS-20003树脂肽。

④ HS-20003粗品肽的制备

取干燥后的 HS-20003树脂肽，加入新鲜配制的 10mL/(g树脂肽:) 的 TFA:TIS:水 =95:2.5:2.5(体积比)的裂解液，室温下反应 4h。反应结束后过滤，用 TFA洗涤树脂 2次，收集并合并滤液，旋转蒸发至原体积的 1/3，搅拌下加入到大量冰无水乙醚析出 HS-20003 , 离心后真空干燥得白色 HS-20003粗品。

⑤ HS-20003的反相液相色谱制备取 HS-20003粗品 lOg溶于一定量的 20%乙酸 /水中搅拌不少于 4h，后经 0.45μηι膜过滤后用反相高效液相色谱 (RP-HPLC)进行分离，流动相为 A 0.1%TFA/H₂O， B 0.1%TFA/乙腈，其中，色谱柱为 Denali C-18 柱 (粒径 8.3μηι， 5x30cm)，柱温 45度，检测波长 220nm，流速 120mL/min。收集产物峰，减压浓缩除去大部分乙腈后冻干得 HS-20003成品 2.5g，纯度 98.5%, 收率 25%。实施例四 HS-20004的固相合成方法

1、 Fmoc-Lys(Mtt)-HMP-AM树脂的制备

参见实施例一。

2、固相合成树脂的干燥及溶胀

称量真空干燥 24h的 Fmoc-Lys(Mtt)-HMPA-AM树脂（0.4mmol/g) 50g (20mmol)置于 2L鼓泡瓶中，加入 500mL DMF溶胀树脂 30min，抽掉 DMF溶液；

3、 Fmoc-Lys(Mtt)-HMPA-AM树脂脱除 Fmoc保护基

4、棕榈酸的缩合

5、棕榈酸 -Lys Mt^-HMPA-AM树脂脱除 Mtt保护基

用 200mL DCM 洗涤树脂，重复一次，力 B入 1200mL

1%TFA/DCM(TFA约 8倍过量)脱除 Mtt保护基，反应时间 lh，用 200mL 5%DIEA/DMF和 DMF交叉洗涤 3次， DMF洗涤 3次。

6、 HS-20004肽链部分的固相合成

①缩合 Fmoc-Ser(tBu)-OH

②肽链的延长

按照 HS-20004 肽链部分从氨基端 (N-端：)到羧基端 (C-端：)的顺序 (His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Glu -Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly- Ala-Pro-Pro-Pro-Ser) , 氨基酸和缩合试剂的用量和 Fmoc-Ser(tBu)-OH 相同，保护氨基酸分别是 Fmoc-Ser(tBu)-OH、 Fmoc-Pro-OH、 Fmoc-Ala-OH、 Fmoc-Gly-OH、 Fmoc-Arg(Pbf)-OH、 Fmoc-Val-OH、 Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-Trp(Boc)-OH、 Fmoc-Ile-OH、 Fmoc-Phe-OH、 Fmoc-Glu(OtBu)-OH 、 Fmoc-Lys(Boc)-OH 、 Fmoc-Tyr(tBu)-OH 、 Fmoc-Asp(OtBu)-OH 、 Fmoc-Thr(tBu)-OH 、 Fmoc-Aib-OH 和 Fmoc-His(Trt)-OH, 重复缩合和脱保护两步反应，合成 HS-20004树脂肽。

③ HS-20004树脂肽的后处理

将②所得到的 HS-20004树脂肽依次用 DMF、 IPA和 DMF洗涤树月旨，用无水乙醚洗涤两次后真空干燥，得 HS-20004树脂肽。

④ HS-20004粗品肽的制备

取干燥后的 HS-20004树脂肽，加入新鲜配制的 10mL/(g树脂肽:) 的 TFA:TIS:水 =95:2.5:2.5(体积比)的裂解液，室温下反应 4h。反应结束后过滤，用 TFA洗涤树脂 2次，收集并合并滤液，旋转蒸发至原体积的 1/3，搅拌下加入到大量冰无水乙醚析出 HS-20004, 离心后真空干燥得白色 HS-20004粗品。

⑤ HS-20004的反相液相色谱制备

取 HS-20004粗品 10g溶于一定量的 20%乙酸 /水中搅拌不少于 4h，后经 0.45μηι膜过滤后用反相高效液相色谱 (RP-HPLC)进行分离，流动相为 A 0.1%TFA/H₂O， B 0.1%TFA/乙腈，梯度如下：

其中，色谱柱为 Denali C-18柱 (粒径 8.3μηι， 5x30cm),柱温 45度，检测波长 220nm，流速 120mL/min。收集产物峰，减压浓缩除去大部分乙腈后冻干得 HS-20004成品 2.25g，纯度 98.5%, 收率 22.5%。实施例五 HS-20005的固相合成

制备方法同实施例四，不同之处是将氨基酸序列变换为 SEQ ID NO:5，得 HS-20005成品 2.5g，纯度 98.5%, 收率 25%。

实施例六 HS-20006的固相合成

制备方法同实施例四，不同之处是将氨基酸序列变换为 SEQ ID NO:6，得 HS-20006成品 2.25g，纯度 98.5%, 收率 22.5%。

实施例七 HS-20007的固相合成

制备方法同实施例四，不同之处是将氨基酸序列变换为 SEQ ID

NO:7，得 HS-20007成品 2.1g，纯度 98%, 收率 20.5%。

实施例八 HS-20008的固相合成

制备方法同实施例四，不同之处是将氨基酸序列变换为 SEQ ID NO:8，得 HS-20008成品 2.5g，纯度 98.5%, 收率 25%。参考例 Liraglutide的固相合成

1、 Fmoc-Lys(Mtt)-HMP-AM树脂的制备

(DHMP-AM树脂的干燥及溶胀

(2)Fmoc-Lys(Mtt)-HMP-AM树脂的制备

① Fmoc-Lys(Mtt)-OH与 HMP-AM树脂的偶联

用 500mL DCM洗涤树脂 1次，重复 2次，称取 Fmoc-Lys(Mtt)-OH 56.2g (90mmol)和 DIC11.4g (90mmol)，加入 1L DCM溶解，加入到溶胀后的 HMP-AM树脂中，之后加入 DMAP 366mg (3mmol)，反应 24h;

②树脂的洗涤

反应结束后用 DMF、 IPA交替洗涤树脂肽 2次， DMF洗涤 3次；

③羟基的封闭称取乙酸酐 15.3g (150mmol)和 DIEA 19.4g (150mmol)溶解于 1L DMF中，加入到树脂中，反应 lOmin;

④树脂的洗涤

依次用 1 L 50%MeOH/DMF、 50%DCM/DMF洗涤树脂 2次， DCM 洗涤树脂 3 次，无水乙醇洗涤 3 次，减压干燥，得 Fmoc-Lys(Mtt)-HMP-AM树脂。

(3)Fmoc-Lys Mtt)-HMP-AM树脂载量测定

空白样品：移液枪取出 50uL 20%六氢吡啶 /DMF 溶解在 2.5mL

DMF中；

取代度计算公式如下：

Sub=(AX 51)/(7.8 Xm)

其中， A为 301nm紫外吸光值； m为树脂质量，单位 mg。

2、固相合成树脂的干燥及溶胀

称量真空干燥 24h的 Fmoc-Gly-HMP-AM树脂（0.4mmol/g) 50g (20mmol)置于 2L鼓泡瓶中，加入 500mL N,N-二甲基甲酰胺 (DMF)溶胀树脂 30min，抽掉 DMF溶液。

3、 Liraglutide肽链部分的固相合成

①缩合 Fmoc-Arg(Pbf)-OH

称量 50mmol Fmoc-Arg(Pbf)-OH, 加入 125mL 0.4M 1-羟基苯并三氮唑 (HOBt)/DMF溶解，再加入 125mL 0.4M Ν,Ν'-二异丙基碳二亚胺 (DIC)/DCM室温下活化反应 lOmin; 将上述溶液加入到树脂中，室温下通入 N₂反应，采用茚三酮检测中控反应进行程度。反应结束后抽掉反应液，依次用 DMF、 IPA和 DMF洗涤树脂；

②肽链的延长

按照 Liraglutide 肽链部分从羧基端 (C-端:)到氨基端 (N-端：)的顺序 (His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln -Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly)，氨基酸和缩合试剂的用量和 Fmoc-Arg(Pbf)-OH 相同，保护氨基酸分别是 Fmoc-Arg(Pbf)-OH ^ Fmoc-Val-OH、 Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-Trp(Boc)-OH、 Fmoc-Ala-OH、 Fmoc-Ile-OH、 Fmoc-Phe-OH、 Fmoc-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc-Lys(Mtt)-OH 、 Fmoc-Gln(Trt)-OH 、 Fmoc-Tyr(tBu)-OH 、 Fmoc-Ser(tBu)-OH 、 Fmoc-Asp(OtBu)-OH 、 Fmoc-Thr(tBu)-OH 、 Fmoc-His(Trt)-OH, 重复缩合和脱保护两步反应，合成 Liraglutide前体肽；

③ Liraglutide前体肽中 Mtt保护基的脱除

用 200mL DCM 洗涤树脂，重复一次，加入 1200mL 1% TFA/DCM(TFA约 8倍过量：)脱除 Mtt保护基，反应时间 lh，重复 1次，用 200mL 5%N,N-二异丙基乙胺 (DIEA)/DMF和 DMF交叉洗涤 3次， DMF洗涤 3次；

④棕榈酸修饰 Liraglutide前体肽

称量 50mmol Fmoc-Glu-OtBu, 加入 125mL 0.4M 1-羟基苯并三氮唑 (HOBt)/DMF 溶解，再加入 125mL 0.4M Ν,Ν'-二异丙基碳二亚胺 (DIC)/DCM室温下活化反应 lOmin; 将上述溶液加入到树脂中，室温下通入 N₂反应，采用茚三酮检测中控反应进行程度。反应结束后抽掉反应液，依次用 DMF、 IPA和 DMF洗涤树脂；

加入 1 L 20%PIP/DMF脱除 Fmoc保护基 5min，抽干，再加入 1 L

20% PIP/DMF脱除 Fmoc保护基 20min，抽干，用 DMF洗涤树脂 4次；称量棕榈酸和 3- (二乙氧基磷酰氧基 )-1,2,3-苯并三嗪 -4-酮 (DEPBT) 各 50mmol，加入 400mLDMF溶解，再加入 lOOmmol DIEA室温下搅拌反应 3min，将上述溶液加入到树脂中， 37度水浴下通入 N₂反应 2h。反应结束后抽掉反应液。

4、 Liraglutide树脂肽的后处理

将 ( 所得到的 Liraglutide树脂肽依次用 DMF、 IPA和 DMF洗涤，用 DCM洗涤 3次、无水乙醚洗涤 2次后真空干燥，得 Liraglutide树脂肽。

5、 Liraglutide粗品肽的制备

取干燥后的 Liraglutide树脂肽，加入新鲜配制的 lOml^g树脂肽:) 的三氟乙酸 (TFA):三异丙基硅垸 (TIS):水 =95:2.5:2.5(体积比)的裂解液，室温下反应 4h。反应结束后过滤，用 TFA洗涤树脂 2次，收集并合并滤液，旋转蒸发至原体积的 1/3，搅拌下加入到大量冰无水乙醚析出 Liraglutide, 离心后真空干燥得白色 Liraglutide粗品。

6、 Liraglutide的反相液相色谱制备

取 Liraglutide粗品 10g溶于一定量 NH₄HC0₃溶液中，后经 0.45μηι 膜过滤后用反相高效液相色谱 (RP-HPLC)进行分离，流动相为 A 0.1%TFA/H₂O， B 0.1%TFA/乙腈，其中，色谱柱为 Denali C-18柱 (粒径 8.3μηι， 5x30cm), 柱温 45度，检测波长 220nm，流速 120mL/min。收集产物峰，减压浓缩除去大部分乙腈后冻干得 Liraglutide成品 1.25g，纯度 98 %, 收率 12.5%。试验例一：检测化合物对胰高血糖素样肽 1 受体（GLP1R) 的激动活性

GLP1R是与 Gs蛋白偶联的受体，当受体与激动剂结合时会导致细胞内 cAMP浓度升高。本实验在 HEK293细胞中共转染 GLP1R和 cAMP反应元件调控的荧光素酶报告基因质粒，当化合物与受体结合并激活受体时，荧光素酶表达就会增加。通过对荧光素酶活性的检测即可获知化合物对 GLP1R的激活状况。

1. 将稳定转染 GLP1R和 pCRE-Luc质粒的 HEK293细胞以 4 万个 /孔 /100 μΐ的密度种入 96孔板，在 37°C孵育 24h。

2. 加入一定浓度梯度的化合物（每个浓度为 3复孔）或阳性药，在 37°C孵育 5h。溶剂 DMSO为阴性对照。

3. 每孔取出 50μ1培养基，加入 50μ1荧光素酶底物，振荡 10min。

4. 取出 80μ1反应液加入到白色的 96孔板中，在 Invision酶标实验结果：同阳性化合物利拉鲁肽（liraglutide) 相比，本发明化合物 HS-20001与其活性相当，而 HS-20002—— 20008显示了更好的激动活性。表 1. 系列化合物合物 EC_5Q值列表:

95 %可信限最大反应率化合物 EC₅₀ (nM) (nM) ( % )

9.726e-012至

利拉鲁肽 0.014707 2.223e-011 96.84616

7.6757e-012至

HS-20001 0.013552 2.3963e-011 98.11013

1.2036e-012至

HS-20002 0.0014145 1.6623e-012 87.99447

4.9657e-013至

HS-20003 0.00071876 1.0404e-012 87.86082

2.1453e-013至

HS-20004 0.00037259 6.4710e-013 90.81368

7.3567e-012至

HS-20005 0.00023552 2.2346e-011 89.13468

1.3581e-012至

HS-20006 0.00064358 1.4523e-012 87.4281

4.1354e-013至

HS-20007 0.00054921 1.2514e-012 87.0389

2.2436e-013至

HS-20008 0.00021002 6.0245e-013 88.4628 试验例二、体内活性测试

将 2型糖尿病 db/db小鼠根据随机血糖和体重分为 6组，每组 8 只，分别皮下单次注射生理盐水、 3或 lO g/kg HS系列新化合物 (利拉鲁肽、 20001、 20002、 20003、 20004、 2005、 2006、 2007、 2008)。于给药后不同时间测定小鼠随机血糖。

受试动物为 db/db小鼠，引种于美国 Jackson公司，由中国科学院上海药物研究所保种和繁殖，合格证号： SCXK (；沪 )2008-0017，体重： 35-50g，性别：雄性 85只、雌性 86只，经 SPF级动物房饲养，温度： 22— 24°C，湿度： 45 -80%, 光照： 150— 300Lx， 12h昼夜交替。

受试药物为 HS-20001、 HS-20002、 HS-20003、 HS-20004、 HS-20005、 HS-20006, HS-20007, HS-20008, 利拉鲁肽（liraglutide, 诺和诺德公司开发，作为阳性对照）。

配制方法：取 2mg/瓶的化合物 1 瓶，用双蒸水完全溶解，配成 2mg/ml的无色透明溶液，然后用生理盐水（氯化钠注射液，安徽双鹤药业有限责任公司，批号： 080728 6C)稀释至 0.6、 2 g/ml。血糖测定使用罗氏优越型血糖仪 ACCU-CHEK® Advantage

剂量设置与组别

试验 1组：

空白对照组：生理盐水

利拉鲁肽组： 3 g/kg

HS-20001组： 3 g/kg

HS-20002组： 3 g/kg

HS-20003组： 3 g/kg

HS-20004组： 3 g/kg

HS-20005组： 3 g/kg

HS-20006组： 3 g/kg

HS-20007组： 3 g/kg

HS-20008组： 3 g/kg 试验 2组：空白对照组：生理盐水

利拉鲁肽组： lO g/kg

HS-20001组: lO g/kg

HS-20002组: lO g/kg

HS-20003组: lO g/kg

HS-20004组: lO g/kg

HS-20005组: lO g/kg

HS-20006组: lO g/kg

HS-20007组: lO g/kg

HS-20008组: lO g/kg 给药途径和容积：单次皮下注射给药，给药容积为 5ml/kg。

试验方法

2型糖尿病 db/db小鼠的筛选、分组和给药

试验 1组：

171只 db/db小鼠 (；雄性 85只、雌性 86只：)，断奶后单笼饲养，喂以高脂饲料。 db/db小鼠满 7周龄后预测随机和空腹血糖，挑选发病的 80只 db/db小鼠，根据随机血糖、空腹血糖和体重将小鼠分为 10组。分别为模型对照组、利拉鲁肽 -3 g/kg、 HS-20001-3 g/kg、 HS-20002-3 g/kg、 HS-20003-3 g/kg、 HS-20004-3 g/kg、 HS-20005-3 g/kg、 HS-2 0006-3 g/kg、 HS-20007-3 g/kg、 HS-20008-3 g/kg组。

试验 2组：

db/db小鼠预测随机血糖，挑选发病的 80只 db/db小鼠，根据随机血糖、和体重将小鼠分为 10组。分别为模型对照组、利拉鲁肽 -10μ₈/ kg、 HS-20001- lO g/kg HS-20002- 10 g/kg、 HS-20003-l(^g/kg、 HS-20 004-l(^g/kg、 HS-20005- 10 g/kg、 HS-20006- 10 g/kg、 HS-20007- lO g/ kg、 HS-20008- lO g/kg组。每组小鼠 8只，雌雄各半。各组动物分别单次皮下注射给予受试物或溶剂对照，于给药后 1、 2、 4、 8h及 24h测定随机血糖，并计算血糖下降率；血糖下降率 = (对照组血糖一给药组血糖) /对照组血糖 X 100%。

试验结果

试验 1：低剂量新化合物单次给药对 db/db小鼠随机血糖的影响结果见表 2、 3。 db/db小鼠单次皮下注射 3 g/kg HS-20002、 20004、 20005、 20006、 20007或 20008后 lh时，随机血糖值比空白对照组明显下降 (P<0.05)，下降率分别为 24.51%、 15.00%、 14.00%、 14.25%、 13.98%和 13.90%; 给药后 2h和 41！时，随机血糖值保持较低的水平，与空白对照组相比，差异明显 (P<0.05)，至给药后 8h，随机血糖与对照组无显著差别。小鼠皮下注射 3 g/kg HS-20003后 lh，随机血糖值比空白对照组明显下降 (PO.05), 达 17.33%, 给药 2、 4和 8h时，随机血糖与对照组无显著差别。 db/db小鼠单次皮下注射 3 g/kg HS-20001后，随机血糖值与空白对照组相比有所下降，但没有显著性差异。利拉鲁肽组小鼠给药后，随机血糖值未见明显下降。

(mmol/L， X士 s， n=8)

给药后时间 (h)

组别给药前

1 2 4 8 对照 25.14±1.09 23.66+0.73 22.63±0.97 22.00+1.00 25.39+1.08 利拉鲁肽

25.11+2.33 21.78±2.31 23.15+2.62 21.56±1.37 23.93+2.09

-3 g/kg

Η8-20001-3μ

25.21+1.44 20.34+2.29 19.84+1.76 20.74±2.51 24.29+1.60 g/kg

Η8-20002-3μ

25.25±1.57 17.86+1.90* 19.56+0.90* 18.10+0.79** 24.19±1.79 g/kg

Η8-20003-3μ

25.16+1.49 19.56+1.19* 19.44+1.48 19.63±1.12 22.59+1.05 g/kg

Η8-20004-3μ

25.11±1.63 20.11+1.28* 18.81+1.50* 17.98±1.38* 23.30+1.47 g/kg

HS-20005-3 g

25.21+1.56 20.11±1.19* 18.96+1.50* 18.98±1.48* 22.36+1.67

/kg

HS-20006-3 g

25.11+1.49 20.36+1.25* 19.91+1.70* 19.58±1.54* 24.30+1.50

/kg

HS-20007-3 g 25.16±1.63 20.43±1.19* 19.81+1.610* 20.98+2.38* 23.42+1.38 /kg

HS-20008 g

25.11±1.58 20.56+1.30* 20.81+1.70* 19.30+2.02* 22.41+1.51

/kg

P<0.05, P<0.01，与空白对照组相比

给药后时间 (h)

组别

1 2 4 8 利拉鲁肽

7.98% -2.32% 1.99% 5.76%

-3 g/kg

HS-20001 -3

14.05% 12.32% 5.74% 4.33% g/kg

HS-20002-3

24.51% 13.54% 17.73% 4.73% g/kg

HS-20003-3

17.33% 14.09% 10.80% 11.03% g/kg

HS-20004-3

15.00% 16.85% 18.30% 8.22% g/kg

HS-20005-3

14.00% 12.87% 10.53% 8.02% g/kg

HS-20006-3

14.25% 13.12% 10.86% 8.14% g/kg

HS-20007-3

13.98% 11.85% 9.30% 6.54% g/kg

HS-20008-3

13.90% 11.62% 8.90% 6.25%

试验 2: 高剂量新化合物单次给药对 db/db小鼠随机血糖的影响结果见表 4、 5。 db/db小鼠单次皮下注射 lO g/kg HS-20002后 lh 时，随机血糖值比空白对照组明显下降 (P<0.01)，给药后 2、 4和 8h时，随机血糖值保持较低的水平，其中给药后 4h 最为明显，其降幅达 40.67%, 与空白对照组相比，差异明显 (PO.001), 至给药后 24h，随机血糖与对照组相比，仍明显较低。小鼠皮下注射 l(^g/kg HS-20003后 lh, 随机血糖值比空白对照组明显下降 (P<0.01)，达 23.62%, 给药 2、 4和 8h时，随机血糖仍保持在较低的水平，至给药后 24h与对照组无显著差别。 db/db小鼠单次皮下注射 lO g/kg HS-20001后 2h时，随机血糖值与空白对照组相比明显下降，给药后 4和 8h时血糖仍保持在较低的水平，至给药后 24h，随机血糖与空白对照组相比，没有显著性差异。 HS-20004, 20005、 20006、 20007、 20008-l(^g/kg 组小鼠给药后 lh时随机血糖即明显下降，其降幅达 36.20%, 此后的 2、 4和 8h时，

5 血糖仍保持在较低的水平，给药后 24h，随机血糖与空白对照组相比，没有显著性差异。利拉鲁肽组小鼠给药后，随机血糖值未见明显下降。

表 4 : 新化合物单次给药后当天对 db/db 小鼠随机血糖的影响

士 s， n=8)

组别给药前给药后时间 (h)

1 2 4 8 24 对照 23.08±1.37 27.15±1.51 28.49+1.58 30.76±1.15 29.96+0.88 27.75+1.64 利拉鲁肽

23.19±1.35 28.59±1.50 28.89±1.17 28.55±1.31 31.84+0.65 27.78±1.14

-10μ8^_§

HS-20001- 20.94+1.57 20.20±1.78

23.16±1.57 23.90+1.79 23.86+1.87* 24.60+1.92 l(Wkg

HS-20002- 19.74+1.16 20.31+2.01 18.25±1.98

23.15±1.32 22.55+2.20** 22.60+1.46* l(Wkg

HS-20003- 20.74+0.98 21.10+0.80 19.54±1.80

23.20±1.36 22.14+2.16** 24.45+1.55 l(Wkg 组别给药前给药后时间 (h)

1 2 4 8 24

23.08±1.3 28.98士对照 30.76+1.15 30.29+0.98 29.90+0.89 31.04±0.94

7 1.62

HS-20004- 23.18±1.6 19.63+1.81 ** 21.86+1.66** 21.44+1.68* 23.80+1.46** 25.64士 l(Wkg 5 1.85

HS-20005- 23.64±1.3 19.39+1.61 ** 21.56+1.56** 21.49±1.34* 23.46+1.51 25.52士 l(Wkg 5 1.68

HS-20006- 23.54±1.3 19.52+1.72** 21.43+1.49** 21.53±1.67* 23.39±1.55 25.59士 l(Wkg 9 1.74

HS-20007- 23.56+1.4 19.41+1.54** 21.84+1.57** 21.64+1.56* 23.81+1.67** 25.51+ l(Wkg 2 1.53

HS-20008- 23.49+1.4 19.38+1.83** 21.61+1.68 ** 21.72+1.63* 23.56+1.80** 25.72士 l(Wkg 9 1.69

10

Ρ<0·05， Ρ<0·01， PO.001与空白对照组相比表 5 :新化合物单次给药后当天 db/db小鼠随机血糖下降率 ( ;%, n=8) 组别给药后时间 (h)

1 2 4 8 24 利拉鲁肽

-5.29% -1.40% 7.19% -6.26% -0.09% -l(Wkg

HS-20001

11.97% 26.50% 34.34% 20.36% 11.35% -l(Wkg

HS-20002

27.30% 28.71% 40.67% 24.74% 18.56% -l(Wkg

HS-20003

23.62% 25.93% 36.49% 26.12% 11.89% -l(Wkg

HS-20004

36.20% 27.82% 28.30% 23.32% 11.52% -l(Wkg

HS-20005

37.58% 28.32% 29.12% 24.10% 12.46% -l(Wkg

HS-20006

38.12% 27.66% 29.78% 23.72% 13.66% -l(Wkg

HS-20007

36.72% 25.43% 26.54% 23.03% 12.16% -l(Wkg

HS-20008

35.49% 25.79% 27.33% 22.57% 14.58% -l(Wkg

试验结论：

系列化合物单次皮下注射后可明显降低 db/db 小鼠的随机血糖， HS-20002、 20003、 20004、 20005、 20006、 20007、 20008在剂量为 3 g/kg 时即可表现出明显的降低随机血糖作用。其中 HS-20002和 20004表现出较好的降随机血糖作用，单次皮下注射后的降血糖作用维持时间与剂量相关， 3 g/kg 的 HS-20002和 20004的降随机血糖作用可维持 4h 以上，而剂量为 lO g/kg时， HS-20001、 20002、 20003、 20004、 20005、 20006、 20007、 20008的降随机血糖作用均可维持 8h以上。

Claims

权利要求书

1、一种含有氨基酸序列通式为（I) 的 GLP-1类似物的衍生物或其可药用盐：

Xi-X₂-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xio-Ser-X₁₂-X₁₃-X₁₄-Glu-Xi₆-Xi ₇-Ala-X 19-X20-X2 i-Phe-Ile-X2₄-Trp-Leu-X2₇-X28-X29"X3o^_X31 -X32-X33-X34-

X35-X36-X37-X38-X39-LyS

(I)

其特征在于所述 GLP-1 类似物的衍生物具有一个结构通式为 Ri CH^-CO-的亲脂性取代基，选自 CH₃-或者 HOOC-, n为 8-25之间的整数？ Xl、 X2、 Xl0、 Xl2、 Xl3、 Xl4、 Xl6、 Xl7、 Xl9、 20、 21、 24、 X27、 X28、 X29、 X;30、 X;31、 ^32 X3 ^34 ^35 36、 X;37、 ¾8 X39各自独立的选自任意天然的氨基酸或非天然氨基酸或由其组成的肽段。 2、根据权利要求 1 所述的 GLP-1 类似物的衍生物或其可药用盐，其特征在于结构通式为 ^!^^^^的亲脂性取代基和 GLP-1类似物的氨基酸残基的氨基是通过酰胺键的方式连接，其中选自 CH₃ -或者 HOOC-, n为 8-25之间的整数。 3、根据权利要求 2 所述的 GLP-1 类似物的衍生物或其可药用盐，其特征在于结构通式为 ^!^^^^的亲脂性取代基和 GLP-1类似物 C端 1^₈的_£氨基通过酰胺键的方式连接，其中选自 CH₃ -或者 HOOC-, n为 8-25之间的整数。 4、根据权利要求 2 所述的 GLP-1 类似物的衍生物或其可药用盐，其特征在于结构通式为 ^!^^^^的亲脂性取代基和 GLP-1类似物 C端 Lys的 α氨基通过酰胺键的方式连接，其中选自 CH₃ -或者 HOOC-, n为 8-25之间的整数。 5、根据权利要求 4 所述的 GLP-1 类似物的衍生物或其可药用盐，其特征在于选自 CH₃-， n选自整数 8、 10、 12、 14、 16、 18、 20 或 22。 6、根据权利要求 5 所述的 GLP-1 类似物的衍生物或其可药用盐，其特征在于选自 CH₃-， n选自整数 14。

7、根据权利要求 4 所述的 GLP-1 类似物的衍生物或其可药用盐，其特征在于选自 HOOC-, n选自整数 14、 16、 18、 20或 22。

8、根据权利要求 7 所述的 GLP-1 类似物的衍生物或其可药用盐，其特征在于选自 HOOC-, n选自整数 14。

9、根据权利要求 1-8任意一项所述的 GLP-1类似物的衍生物或其可药用盐，其特征在于选自 L-His、 D-His; X₂选自 Ala、 D-Ala、 Gly、 Val、 Leu、 Ile、 Lys、 Aib; X₁₀选自 Val、 Leu; X₁₂选自 Ser、 Lys、 Arg; X₁₃选自 Tyr、 Gin; X₁₄选自 Leu、 Met; X₁₆选自 Gly、 Glu、 Aib; Xi₇选自 Gln、 Glu、 Lys、 Arg; X₁₉选自 Ala、 Val; X₂₀选自 Lys、 Glu、 Arg; X₂₁选自 Glu、 Leu; X₂₄选自 Val、 Lys; X₂₇选自 Val、 Lys; X₂₈选自 Lys、 Glu、 Asn、 Arg; X₂₉选自 Gly、 Aib; X₃₀选自 Arg、 Gly、 Lys; X₃₁ 选自 Gly、 Ala, Glu、 Pro, Lys; X₃₂选自 Lys、 Ser; X₃₃选自 Lys、 Ser; X₃₄选自 Gly、 Ala、 Sar; X₃₅选自 Gly、 Ala、 Sar; X₃₆选自 Pro、 Gly; X₃₇ 选自 Pro、 Gly; X₃₈选自 Pro、 Gly; X₃₉选自 Ser、 Tyr。

10、根据权利要求 9所述的 GLP-1类似物的衍生物或其可药用盐，其特征在于 GLP-1类似物的氨基酸序列选自 SEQ ID NO: 1至 SEQ

11、根据权利要求 10所述的 GLP-1类似物的衍生物或其可药用盐，其特征在于结构通式为 ^!^：) _n-CO-的亲脂性取代基和选自序列如 SEQ ID NO: 1-120所示的 GLP-1类似物的氨基酸残基的氨基是通过酰胺键的方式连接，其中选自 CH₃-或者 HOOC- , n为 8-25之间的整数。

12、根据权利要求 11所述的 GLP-1类似物的衍生物及其可药用盐，其特征在于结构通式为 ^!^：) _n-CO-的亲脂性取代基和选自序列如 SEQ ID NO: 1-120所示的 GLP-1类似物 C端 Lys的 ε氨基通过酰胺键的方式连接，其中选自 CH₃-或者 HOOC-, n为 8-25之间的整数。

13、根据权利要求 12所述的 GLP-1类似物的衍生物及其可药用盐，其特征在于选自 CH₃-或者 HOOC-, n选自整数 8、 10、 12、 14、 16、 18、 20或 22。
14、根据权利要求 12所述的 GLP-1类似物的衍生物及其可药用盐，其特征在于选自 C¾-， n选自整数 14。
15、根据权利要求 14所述的 GLP-1类似物的衍生物或其可药用盐，其特征在于 GLP-1类似物的序列选自 SEQ ID ΝΟ:1 至 SEQ ID NO:20 o

16、根据权利要求 11所述的 GLP-1类似物的衍生物或其可药用盐，其特征在于结构通式为！^^！^：^-^)-的亲脂性取代基和选自序列如 SEQ ID NO 1-20所示的 GLP-1类似物 C端 Lys的 α氨基通过酰胺键的方式连接，其中选自 CH₃-或者 HOOC-, n为 8-25之间的整数。

17、根据权利要求 16所述的 GLP-1类似物的衍生物及其可药用盐，其特征在于选自 CH₃-或者 HOOC-, n选自整数 8、 10、 12、 14、 16、 18、 20或 22。
18、根据权利要求 17所述的 GLP-1类似物的衍生物及其可药用盐，其特征在于选自 C¾-， n选自整数 14。
19、根据权利要求 18所述的 GLP-1类似物的衍生物及其可药用盐，其特征在于 GLP-1类似物的序列选自 SEQ ID ΝΟ:1至 SEQ ID NO:8，其中选自 C¾-， n选自整数 14。
20、根据权利要求 19所述的 GLP-1类似物的衍生物及其可药用盐，其特征在于 GLP-1类似物的序列选自 SEQ ID NO:4。 21、一种药物组合物，包含：

( 1 ) 治疗量的如权利要求 1-20任一项所述的 GLP-1 生物或其可药用盐，和

(2) 药学可接受的赋形剂或药物载体。
22、根据权利要求 1-20任一项所述的 GLP-1的类似物的衍生物或其可药用盐或者根据权利要求 21所述的药物组合物在制备用于治疗非胰岛素依赖性糖尿病、胰岛素依赖性糖尿病或肥胖症的药物中的用途。