CN110684082B - Gip和glp-1双激动多肽化合物及药学上可接受的盐与用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一类GIP和GLP‑1双激动多肽化合物，属于多肽药物化学技术领域。该类GIP和GLP‑1双激动多肽化合物的氨基酸序列为：YXaa¹EGTFTSDYSIXaa²LDKIAQXaa³AFVQWLIAGGPSSGAPPPS，且该类多肽化合物C末端氨基酸作为C末端伯酰胺被酰胺化。本发明该类多肽化合物的制备方法、药学上可接受的盐、药物组合物和药剂。本发明多肽化合物同时具备降糖及减重效果，可以作为有效原料用于制备治疗或者预防糖尿病的药物或者减肥药物。

Description

GIP和GLP-1双激动多肽化合物及药学上可接受的盐与用途

技术领域

本发明涉及多肽化合物领域，具体涉及一种具有双重肠促胰岛素肽类似化合物多肽化合物，其激动人葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(GIP)和胰高血糖素样肽-1(GLP-1)的受体，并且可用于治疗2型糖尿病。本发明还涉及该多肽化合物药学上可接受的盐，多肽药物组合物、药剂制备方法及其用途。

背景技术

代谢综合征的病因是蛋白质、脂肪及碳水化合物等多种物质的代谢异常。营养过剩、体力活动减少等会导致肥胖以及肥胖相关疾病，如糖尿病等。近年来，2型糖尿病、血脂代谢异常的发病率日益增高；2型糖尿病是最常见的糖尿病形式，占所有糖尿病的约90％。2型糖尿病的特征在于由胰岛素抗性引起的高血糖水平。目前的2型糖尿病护理标准包括饮食和运动以及可用的口服和注射降糖药物。尽管如此，许多患有2型糖尿病的患者仍然未得到充分控制。

GIP是一种42个氨基酸的胃肠调节肽，通过在葡萄糖存在下刺激胰腺β细胞分泌胰岛素并保护胰腺β细胞，在葡萄糖体内平衡中发挥生理作用。GLP-1是一种37个氨基酸的肽，可刺激胰岛素分泌，保护胰腺β细胞，抑制胰高血糖素分泌，胃排空和食物摄入，从而导致体重减轻。GIP和GLP-1被称为肠促胰岛素；肠降血糖素受体信号传导对葡萄糖体内平衡起关键作用的生理学相关作用。在正常生理学中，GIP和GLP-1在餐后从肠道分泌，并且这些肠降血糖素增强对食物的生理反应，包括饱腹感，胰岛素分泌和营养处理。2型糖尿病患者的肠促胰岛素反应受损。目前市售的肠降血糖素类似物或二肽基肽酶IV(DPP-IV)抑制剂仅利用单一的作用机制用于血糖控制；如果利用双重作用机制的2型糖尿病化合物，就可以得到降糖活性和减重效果俱佳的多肽化合物。

已经发现GLP-1类似物的剂量受到诸如恶心和呕吐的副作用的限制，并且因此给药通常不能达到血糖控制和体重减轻的完全功效。单独的GIP在2型糖尿病人中具有非常适度的降糖能力。天然GIP和GLP-1均被普遍存在的蛋白酶DPPIV快速灭活，因此，只能用于短期代谢控制。DPP IV属于外肽酶类蛋白水解酶；在序列中引入非天然氨基酸可以增加任何给定肽的蛋白水解稳定性；虽然使用非天然氨基酸有助于肽对DPP IV蛋白水解和其他形式降解的稳定性。

作为本发明的一部分，非天然氨基酸对GIP和GLP-1之间的激动剂活性的平衡产生了积极的影响。例如，脂肪酸通过其白蛋白结合基序可以通过延长半衰期来改善肽的药代动力学。虽然使用脂肪酸可以改善肽的半衰期，但申请人发现，作为本发明的一部分，脂肪酸链的长度，组成和位置以及肽和脂肪酸链之间的连接体可能具有意外对GIP和GLP-1激动剂活性平衡的影响，同时延长了肽的半衰期。某些GIP类似物在WO2013/164483，WO2014/192284和WO2011/119657等专利中表现出GIP和GLP-1活性。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一类利用双重作用机制、具有降糖活性和减重效果的GIP和GLP-1双激动多肽化合物。

本发明的另一个目的是提供了前述GIP和GLP-1双激动多肽化合物的制备方法。

本发明的再一个目的是提供了前述GIP和GLP-1双激动多肽化合物药学上可接受的盐。

本发明的又一个目的是提供了GIP和GLP-1双激动多肽化合物的药物组合物。

本发明的又一个目的是提供了GIP和GLP-1双激动多肽化合物的药剂。

本发明的又一个目的是提供了前述GIP和GLP-1双激动多肽化合物、其药学上可接受的盐、其药物组合物和药剂的用途。

本发明的目的是通过以下的技术方案来实现的。

本发明公开了一类GIP和GLP-1双激动多肽化合物，其特点是，该类GIP和GLP-1双激动多肽化合物的氨基酸序列为：

YXaa¹EGTFTSDYSIXaa²LDKIAQXaa³AFVQWLIAGGPSSGAPPPS，

且该类多肽化合物C末端氨基酸作为C末端伯酰胺被酰胺化；

其中：

Xaa¹取自：v，Aib，A，

Xaa²取自：v，Aib，A，

Xaa¹、Xaa²相同或不同；

Xaa³取自：

或者：

n为自然数5-25。

本发明所述的多肽药物组合物，其进一步优选的技术方案是：所述的n为自然数16或18。

本发明所述的多肽药物组合物，其进一步优选的技术方案是：该类多肽氨基酸序列优选为：

(1)SEQ ID NO：1

YVEGTFTSDYSIVLDKIAQK(HOOC-(CH₂)₁₆-CO-γ-Glu-AEEA-AEEA)AFVQWLIAGGPSSGAPPPS-NH₂

(2)SEQ ID NO：2

YXEGTFTSDYSIXLDKIAQK(HOOC-(CH₂)₁₆-CO-γ-Glu-AEEA-AEEA)AFVQWLIAGGPSSGAPPPS-NH₂

(3)SEQ ID NO：3

YX₁EGTFTSDYSIX₁LDKIAQK(HOOC-(CH₂)₁₆-CO-γ-Glu-AEEA-AEEA)AFVQWLIAGGPSSGAPPPS-NH₂

(4)SEQ ID NO：4

YAEGTFTSDYSIALDKIAQK(HOOC-(CH₂)₁₆-CO-γ-Glu-AEEA-AEEA)AFVQWLIAGGPSSGAPPPS-NH₂

(5)SEQ ID NO：5

YAEGTFTSDYSIAibLDKIAQK(HOOC-(CH₂)₁₆-CO-γ-Glu-AEEA-AEEA)AFVQWLIAGGPSSGAPPPS-NH₂

(6)SEQ ID NO：6

YAibEGTFTSDYSIALDKIAQK(HOOC-(CH₂)₁₆-CO-γ-Glu-AEEA-AEEA)AFVQWLIAGGPSSGAPPPS-NH₂

(7)SEQ ID NO：7

YXEGTFTSDYSIX₂LDKIAQK(HOOC-(CH₂)₁₆-CO-γ-Glu-AEEA-AEEA)AFVQWLIAGGPSSGAPPPS-NH₂

(8)SEQ ID NO：8

YXEGTFTSDYSIX₂LDKIAQK(HOOC-(CH₂)₁₆-CO-γ-Glu-AEEA-AEEA)AFVQWLIAGGPSSGAPPPS-NH₂

(9)SEQ ID NO：9

YX₁EGTFTSDYSIX₂LDKIAQK(HOOC-(CH₂)₁₆-CO-γ-G1u-AEEA-AEEA)AFVQWLIAGGPSSGAPPPS-NH₂

(10)SEQ ID NO：10

YX₂EGTFTSDYSIX1LDKIAQK(HOOC-(CH₂)₁₆-CO-γ-Glu-AEEA-AEEA)AFVQWLIAGGPSSGAPPPS-NH₂

(11)SEQ 1D NO：11

YAibEGTFTSDYSIAibLDKIAQK(γ-Glu-Palmitoyl)AFVQWLIAGGPSSGAPPPS-NH₂

(12)SEQ ID NO：12

YVEGTFTSDYSIVLDKIAQK(γ-Glu-Palmitoyl)AFVQWLIAGGPSSGAPPPS-NH₂

(13)SEQ ID NO：13

YXEGTFTSDYSIXLDKIAQK(γ-Glu-Palmitoyl)AFVQWLIAGGPSSGAPPPS-NH₂

(14)SEQ ID NO：14

YX₁EGTFTSDYSIX1LDKIAQK(γ-Glu-Palmitoyl)AFVQWLIAGGPSSGAPPPS-NH₂

(15)SEQ ID NO：15

YAEGTFTSDYSIALDKIAQK(γ-Glu-Palmitoyl)AFVQWLIAGGPSSGAPPPS-NH₂

(16)SEQ ID NO：16

YAEGTFTSDYSIAibLDKIAQK(γ-Glu-Palmitoyl)AFVQWLIAGGPSSGAPPPS-NH₂

(17)SEQ ID NO：17

YAibEGTFTSDYSIALDKIAQK(γ-Glu-Palmitoyl)AFVQWLIAGGPSSGAPPPS-NH₂

(18)SEQ ID NO：18

YXEGTFTSDYSIX₂LDKIAQK(γ-Glu-Palmitoyl)AFVQWLIAGGPSSGAPPPS-NH₂

(19)SEQ ID NO：19

YX₂EGTFTSDYSIXLDKIAQK(γ-Glu-Palmitoyl)AFVQWLIAGGPSSGAPPPS-NH₂

(20)SEQ ID NO：20

YX₁EGTFTSDYSIX₂LDKIAQK(γ-Glu-Palmitoyl)AFVQWLIAGGPSSGAPPPS-NH₂

(21)SEQ ID NO：21

YX₂EGTFTSDYSIX₁LDKIAQK(γ-Glu-Palmitoyl)AFVQWLIAGGPSSGAPPPS-NH₂

式中：

X₂＝Aib。

本发明还公开了以上所述的GIP和GLP-1双激动多肽化合物的制备方法，其特点是，其步骤如下：

(1)取树脂，活化后，逐步偶联氨基酸，得到肽树脂；

(2)取肽树脂，经侧链拼接、裂解、纯化，得到侧链保护的多肽。

本发明还公开了一类GIP和GLP-1双激动多肽化合物药学上可接受的盐，其特点是：所述的GIP和GLP-1双激动多肽化合物为以上技术方案中所述的多肽化合物，且该类多肽化合物C末端氨基酸作为C末端伯酰胺或其药学上可接受的盐被酰胺化。

本发明所述的GIP和GLP-1双激动多肽化合物药学上可接受的盐，其优选的技术方案是：所述的盐为GIP和GLP-1双激动多肽化合物与下述化合物中的一种所形成的盐：盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、焦硫酸、磷酸、硝酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、甲酸、乙酸、乙酰乙酸、丙酮酸、三氟乙酸、丙酸、丁酸、己酸、庚酸、十一烷酸、月桂酸、苯甲酸、水杨酸、2-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、樟脑酸、肉桂酸、环戊烷丙酸、二葡糖酸、3-羟基-2-萘甲酸、烟酸、扑酸、果胶酯酸、过硫酸、3-苯基丙酸、苦味酸、特戊酸、2-羟基乙磺酸、衣康酸、氨基磺酸、三氟甲磺酸、十二烷基硫酸、2-萘磺酸、萘二磺酸、樟脑磺酸、柠檬酸、酒石酸、硬脂酸、乳酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、肥酸、藻酸、马来酸、富马酸、D-葡糖酸、扁桃酸、抗坏血酸、葡庚酸、甘油磷酸、天冬氨酸、磺基水杨酸、半硫酸或者硫氰酸。

本发明还公开了GIP和GLP-1双激动多肽化合物的药物组合物，其特点是，该药物组合物以上述技术方案中任意一项所述的GIP和GLP-1双激动多肽化合物为有效原料，或者以上述技术方案中任意一项所述的GIP和GLP-1双激动多肽化合物药学上可接受的盐为有效原料，再加上药学上可接受的载体或稀释剂组成。

本发明所述的GIP和GLP-1双激动多肽化合物药学上可接受的盐，以GIP和GLP-1双激动多肽化合物和上述化合物为原料，再采用现有技术中公开的常规方法进行制各。

本发明还公开了上述技术方案中任意一项所述的GIP和GLP-1双激动多肽化合物所制备的药剂，其特点是，所述的药剂是任何一种药剂学上所说的片剂、胶囊、酏剂、糖浆、锭剂、吸入剂、喷雾剂、注射剂、膜剂、贴剂、散剂、颗粒剂、块剂、乳剂、栓剂或者复方制剂，药剂由GIP和GLP-1双激动多肽化合物和药学上可接受的药用辅料、载体或稀释剂组成。本发明所述的药剂，可以按照现有技术常规方法进行制备。

本发明记载的GIP和GLP-1双激动多肽化合物的用途是，它可以作为有效原料用来制备用于治疗或者预防糖尿病的药物，或者用于制备减肥药物。

本发明记载的GIP和GLP-1双激动多肽化合物药学上可接受的用途是，它可以作为有效原料在用来制备治疗或者预防糖尿病的药物，或者用于制备减肥药物。

本发明记载的GIP和GLP-1双激动多肽化合物的药物组合物、药剂，可以用作治疗和预防糖尿病的药物，或者用作减肥药物。

在本说明书全文中，采用以下缩写的含义见下表：

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明公开了一种新的GIP和GLP-1双激动多肽化合物，本发明多肽化合物同时具备降糖及减重效果，可以作为有效原料用于制备治疗或者预防糖尿病的药物或者减肥药物。基于动物能量消耗数据证明，本发明多肽化合物具有在患者中产生体重减轻的作用，同时对GIP和GLP-1受体具有平衡的共激动剂活性和对胰高血糖素和GLP-2受体的选择性，具有低免疫原性特性和支持每周一次给药的药代动力学(PK)特征。适合作为治疗糖尿病、肥胖药物的活性成分。

本发明制备方法所制得的GIP和GLP-1双激动多肽化合物，降糖和减缓体重增加活性好，药效时间长，收率高、合成周期短、粗品纯化容易，生产成本低、易于工业自动化生产。

附图说明

图1和图2为实验中各受试物单次给药对ob/ob小鼠随机血糖和AUC_{0-24h Glu}的影响

图；

图3为实验中各受试物单次给药后对ob/ob小鼠AUC0-24h Glu的影响

图，(图中数据为AUC0-24h Glu下降率)。

具体实施方式

本发明是通过下列实施例来进行说明的，但这些实施例不做任何限制本发明权利的解释。

实施例1，SEQ ID NO：1多肽化合物的合成：

YVEGTFTSDYSIVLDKIAQK(HOOC-(CH₂)₁₆-CO-γ-Glu-AEEA-AEEA)AFVQWLIAGGPSSGAPPPS-NH₂

1.肽链的合成

1.1树脂的溶胀

称取Fmoc-Rink Amide AM Resin 10g(取代度0.35mmol/g)，经DCM 10 0mL溶胀30min，抽滤去DCM，再用DMF 100mL溶胀30min，分别用DMF，DCM 100mL冲洗干净。

1.2Fmoc-Ser(tBu)-Rink Amide AM Resin的合成

将Fmoc-Ser(tBu)-OH(8mmol)，HOBT(16mmol)和DIC(16mmol)溶于DMF 100mL中，再将此溶液加入上一步得到的树脂中反应2小时，结束后滤去反应液，用DCM和DMF各100mL洗涤树脂3次。

1.3Fmoc保护基的脱除

向洗涤后的树脂中加入含0.1M HOBt的25％哌啶/DMF(V/V)溶液脱除Fmoc，反应结束后用DCM和DMF各100mL洗涤树脂3次。

1.4肽链的延长

按照序列，重复上述脱保护和偶合的步骤依次连接上相应的氨基酸，依次连接上相应的氨基酸直至肽链合成完毕，得到肽树脂。

其中：第20位K可采用Fmoc-Lys(Alloc)-OH或Fmoc-Lys(Dde)-OH或Fmoc-Lys(iVdde)-OH或Fmoc-Lys(Mtt)-OH或Fmoc-Lys(Boc)-OH保护策略。本实例中采用Fmoc-Lys(Alloc)-OH保护策略。

1.5侧链的拼接

将上述得到的肽树脂放入反应瓶中，在PhSiH₃作为清除剂的情况下，用Pd(PPh₃)₄，脱除Alloc保护基；采用Fmoc/t-Bu策略合成20位Lys侧链，或Oct(OtBu)-γ-Glu(OtBu)-AEEA-AEEA-Osu片段直接偶联，得到全保护肽树脂。

1.6肽树脂的裂解

量取三氟乙酸至反应器中，冷却至-10～0℃，加入三异丙基硅烷、1，2-乙二硫醇和纯化水，启动搅拌，混合均匀。缓慢加入肽树脂，升温至20～30℃，裂解反应115～125min。反应结束后滤除树脂，滤除的树脂用M×8×20％ml的TFA洗涤，滤除液和洗涤液全部转移到M×8×1.2×4ml的乙醚中，搅拌5～10min，静置沉降15min以上。将沉降悬浊液放入离心机中，离心收集固体；用乙醚洗涤固体6次，每次用不少于5L。将固体于20～35℃、真空干燥6～10h，得粗肽。

1.7粗肽纯化

采用制备液相色谱进行纯化，色谱条件为：C18柱(100mm×250mm，10μm)；流动相A：0.1％TFA/水(V/V)，流动相B：0.1％TFA/乙腈(V/V)；流动相梯度：流动相B 20％～60％，60min；流速为200mL/min检测波长为214nm，收集纯度大于98.0％的馏分，旋蒸浓缩后冷冻干燥得1.36g样品。

实施例2，SEQ ID NO：2多肽化合物的合成：

YXEGTFTSDYSIXLDKIAQK(HOOC-(CH₂)₁₆-CO-γ-Glu-AEEA-AEEA)AFVQWLIAGGPSSGAPPPS-NH₂

合成方法同实施例1，收集的溶液冻干得纯品1.45g。

实施例3，SEQ ID NO：3多肽化合物的合成：

YXEGTFTSDYSIXLDKIAQK(HOOC-(CH₂)₁₆-CO-γ-Glu-AEEA-AEEA)AFVQWLIAGGPSSGAPPPS-NH₂

合成方法同实施例1，收集的溶液冻干得纯品1.51g。

实施例4，SEQ ID NO：4多肽化合物的合成：

YAEGTFTSDYSIALDKIAQK(HOOC-(CH₂)₁₆-CO-γ-Glu-AEEA-AEEA)AFVQWLIAGGPSSGAPPPS-NH₂

合成方法同实施例1，收集的溶液冻干得纯品1.18g。

实施例5，SEQ ID NO：5多肽化合物的合成：

YAEGTFTSDYSIAibLDKIAQK(HOOC-(CH₂)₁₆-CO-γ-Glu-AEEA-AEEA)AFVQWLIAGGPSSGAPPPS-NH₂

合成方法同实施例1，收集的溶液冻干得纯品1.22g。

实施例6，SEQ ID NO：6多肽化合物的合成：

YAibEGTFTSDYSIALDKIAQK(HOOC-(CH₂)₁₆-CO-γ-Glu-AEEA-AEEA)AFVQWLIAGGPSSGAPPPS-NH₂

合成方法同实施例1，收集的溶液冻干得纯品1.97g。

实施例7，SEQ ID NO：7多肽化合物的合成：

YX1EGTFTSDYSIX2LDKIAQK(HOOC-(CH₂)₁₆-CO-γ-Glu-AEEA-AEEA)AFVQWLIAGGPSSGAPPPS-NH₂

X₂＝Aib

合成方法同实施例1，收集的溶液冻干得纯品1.55g。

实施例8，SEQ ID NO：8多肽化合物的合成：

YX₁EGTFTSDYSIX₂LDKIAQK(HOOC-(CH₂)₁₆-CO-γ-Glu-AEEA-AEEA)AFVQWLIAGGPSSGAPPPS-NH₂

X₁＝Aib

合成方法同实施例1，收集的溶液冻干得纯品1.01g。

实施例9，SEQ ID NO：9多肽化合物的合成：

YX₁EGTFTSDYSIX₂LDKIAQK(HOOC-(CH₂)₁₆-CO-γ-Glu-AEEA-AEEA)AFVQWLIAGGPSSGAPPS-NH₂

X₂＝Aib

合成方法同实施例1，收集的溶液冻干得纯品1.64g。

实施例10，SEQ ID NO：10多肽化合物的合成：

YX₁EGTFTSDYSIX₂LDKIAQK(HOOC-(CH₂)₁₆-CO-γ-Glu-AEEA-AEEA)AFVQWLIAGGPSSGAPPPS-NH₂

X₁＝Aib

合成方法同实施例1，收集的溶液冻干得纯品1.81g。

实施例11，SEQ ID NO：11多肽化合物的合成：

YAibEGTFTSDYSIAibLDKIAQK(γ-Glu-Palmitoyl)AFVQWLIAGGPSSGAPPPS-NH₂

合成方法同实施例1，收集的溶液冻干得纯品1.84g。

实施例12，SEQ ID NO：12多肽化合物的合成：

YVEGTFTSDYSIVLDKIAQK(γ-Glu-Palmitoyl)AFVQWLIAGGPSSGAPPPS-NH₂

合成方法同实施例1，收集的溶液冻干得纯品1.12g。

实施例13，SEQ ID NO：13多肽化合物的合成：

YXEGTFTSDYSIXLDKIAQK(γ-Glu-Palmitoyl)AFVQWLIAGGPSSGAPPPS-NH₂

合成方法同实施例1，收集的溶液冻干得纯品1.07g。

实施例14，SEQ ID NO：14多肽化合物的合成：

YXEGTFTSDYSIXLDKIAQK(γ-Glu-Palmitoyl)AFVQWLIAGGPSSGAPPPS-NH₂

合成方法同实施例1，收集的溶液冻干得纯品1.89g。

实施例15，SEQ ID NO：15多肽化合物的合成：

YAEGTFTSDYSIALDKIAQK(γ-Glu-Palmitoyl)AFVQWLIAGGPSSGAPPPS-NH₂

合成方法同实施例1，收集的溶液冻干得纯品1.81g。

实施例16，SEQ ID NO：16多肽化合物的合成：

YAEGTFTSDYSIAibLDKIAQK(γ-Glu-Palmitoyl)AFVQWLIAGGPSSGAPPPS-NH₂

合成方法同实施例1，收集的溶液冻干得纯品1.71g。

实施例17，SEQ ID NO：17多肽化合物的合成：

YAibEGTFTSDYSIALDKIAQK(γ-Glu-Palmitoyl)AFVQWLIAGGPSSGAPPPS-NH₂

合成方法同实施例1，收集的溶液冻干得纯品1.53g。

实施例18，SEQ ID NO：18多肽化合物的合成：

YX1EGTFTSDYSIX2LDKIAQK(γ-Glu-Palmitoyl)AFVQWLIAGGPSSGAPPPS-NH₂

X₂＝Aib

合成方法同实施例1，收集的溶液冻干得纯品1.25g。

实施例19，SEQ ID NO：19多肽化合物的合成：

YX₁EGTFTSDYSIX₂LDKIAQK(γ-Glu-Palmitoyl)AFVQWLIAGGPSSGAPPPS-NH₂

X₁＝Aib

合成方法同实施例1，收集的溶液冻干得纯品0.93g。

实施例20，SEQ ID NO：20多肽化合物的合成：

YX₁EGTFTSDYSIX₂LDKIAQK(γ-Glu-Palmitoyl)AFVQWLIAGGPSSGAPPPS-NH₂

X₂＝Aib

合成方法同实施例1，收集的溶液冻干得纯品0.96g。

实施例21，SEQ ID NO：15多肽化合物的合成：

YX₁EGTFTSDYSIX₂LDKIAQK(γ-Glu-Palmitoyl)AFVQWLIAGGPSSGAPPPS-NH₂

X₁＝Aib

合成方法同实施例1，收集的溶液冻干得纯品1.47g。

实施例22：以下是GIP和GLP-1双激动多肽化合物(下称多肽化合物)的相关药理实验方法以及结果：

1、多肽化合物的GLP-1和GIP受体激动活性

HEK293细胞共转染编码GLP-1R或GIPR的cDNA。测定化合物的试验中，提前2h将细胞种于96孔板中，多肽化合物用DMSO溶解，使用含有0.1％牛血清蛋白的培养基稀释至不同倍数，加入共转染的细胞中。细胞孵化20min后，使用Cisbo公司的ELISA试剂盒，使用酶标仪测定荧光读数，建立标准曲线将荧光读数转化为相应的cAMP数值，使用Graphpad Prism5.0软件的非线性回归计算化合物的EC₅₀数值。

表1多肽化合物对GLP-1R和GIPR激动活性

如表1所示，所有多肽化合物对GLP-1R的激动活性依然保持了较高程度的激动活性，同时对GIPR保持了相当高程度的激动活性，修改后的非天然氨基酸及侧链基团并没有对激动活性造成太大影响。

2、多肽化合物的降血糖实验

雄性ob/ob小鼠断奶后单笼饲养，喂以高脂饲料，6-7周龄后预测血糖，根据随机体重、随机血糖和空腹血糖分为模型对照组、多肽化合物组(选取9个化合物)、阳性对照Liraglutide组以及阳性对照Semaglutide组。各受试物组以及阳性对照组小鼠分别单次皮下注射不同剂量的各受试物或阳性药物Liraglutide和Semaglutide，模型对照组小鼠单次皮下注射PBS缓冲液，各组小鼠于给药前(0小时)和给药后2、4、6、10、24小时测定随机血糖值，之后根据各组小鼠的血糖情况调整延长测定随机血糖的时间至给药后34、48、58或72小时。同时称取各组小鼠给药前(0小时)及给药后24小时的随机体重，之后称取与随机血糖测定情况相对应的小鼠给药后48或72小时的随机体重。按下列公式计算血糖下降率、给药后24小时内血糖曲线下面积(AUC_{0-24 Glu})及其下降率。

血糖下降率＝(模型对照组血糖-给药组血糖)/模型对照组血糖×100％

AUC_{0-24h Glu}(mmol/Lh·r)＝(BG0+BG2)+(BG2+BG4)+(BG4+BG6)+(BG6+BG10)×2+(BG10+BG24)×7

BG0、BG2、BG4、BG6、BG10和BG24分别代表给药前(0h)及给药后2、4、6、10和24h

时的血糖值。

AUC_{o-24h Glu}(mmol/Lh·r)下降率＝(模型对照组AUC_{0-24h Glu}-给药组AUC_{0-24h Glu})/模型对照组AUC_{0-24h Glu}×100％

实验共进行二次，每次实验间隔8-10天，每次实验分23组，实验分组和剂量设置情况详见表2。

表2.实验动物给药前分组情况

如图1-图3所示，降血糖实验结果表明，本发明的多肽化合物给药浓度为100μg/kg时，大多数的降血糖效果与Semaglutide和GIP。的降糖效果相当，尤其SEQ.ID NO：2降糖效果几乎和Semaglutide一致。

3、多肽化合物对ob/ob小鼠随机体重的影响

如表3-5结果显示，100g/kg GIP及100和300g/kg GLP-1单次皮下注射给药后对ob/ob小鼠的随机体重及其变化量没有明显影响。100g/kg Liraglutide和Semaglutide组单次皮下注射给药后24和48h可显著降低ob/ob小鼠的随机体重及其变化量，300g/kgSEQ.ID NO：1～9单次皮下注射给药后24、48和72h可显著降低ob/ob小鼠的随机体重及其变化量。100g/kg SEQ.ID NO：2单次皮下注射给药后24h可显著降低ob/ob小鼠的随机体重变化量，300g/kg SEQ.ID NO：9单次皮下注射给药后24和48h可显著降低ob/ob小鼠的随机体重变化量，且SEQ.ID NO：2与等剂量Semaglutide的作用基本相当。因此，GIP和GLP-1双激动化合物单次皮下注射给药可显著降低2型糖尿病ob/ob小鼠的随机血糖，其中SEQ.ID NO：2与等剂量Semaglutide的作用相当。长期给药后，所有的多肽化合物都表现出了更好的体重控制效果。

序列表

<110> 江苏诺泰澳赛诺生物制药股份有限公司

杭州诺泰澳赛诺医药技术开发有限公司

<120> GIP和GLP-1双激动多肽化合物及药学上可接受的盐与用途

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Xaa Leu Asp Lys

1 5 10 15

Ile Ala Gln Xaa Ala Phe Val Gln Trp Leu Ile Ala Gly Gly Pro Ser

20 25 30

Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser

35

Claims (10)

1.GIP和GLP-1双激动多肽化合物，其特征在于，所述多肽化合物的氨基酸序列为：

YXaa¹EGTFTSDYSIXaa²LDKIAQXaa³AFVQWLIAGGPSSGAPPPS，且该类多肽化合物C末端氨基酸作为C末端伯酰胺被酰胺化；

其中：

Xaa¹为：

；

Xaa²取自：Aib，或

；

Xaa³取自：

或者：

n为自然数5-25。

2.根据权利要求1所述的GIP和GLP-1双激动多肽化合物，其特征在于：所述的n为自然数16或18。

3.根据权利要求1或2所述的GIP和GLP-1双激动多肽化合物，其特征在于，该类多肽化合物的氨基酸序列选自：

(2)SEQ ID NO：2

YXEGTFTSDYSIXLDKIAQK(HOOC-(CH₂) ₁₆-CO-γ-Glu-AEEA-AEEA)AFVQWLIAGGPSSGAPPPS-NH₂；

(7)SEQ ID NO：7

YXEGTFTSDYSIX₂LDKIAQK(HOOC-(CH₂) ₁₆-CO-γ-Glu-AEEA-AEEA)AFVQWLIAGGPSSGAPPPS-NH₂ ；

(13)SEQ ID NO：13

YXEGTFTSDYSIXLDKIAQK(γ-Glu-Palmitoyl)AFVQWLIAGGPSSGAPPPS-NH₂ ；

(18)SEQ ID NO：18

YXEGTFTSDYSIX₂LDKIAQK(γ-Glu-Palmitoyl)AFVQWLIAGGPSSGAPPPS-NH₂ ；

式中：X＝

；X₂＝Aib。

4.权利要求1或2或3所述的GIP和GLP-1双激动多肽化合物的制备方法，其特征在于，其步骤如下：

(1)取树脂，活化后，逐步偶联氨基酸，得到肽树脂；

(2)取肽树脂，经侧链拼接、裂解、纯化，得到侧链保护的多肽。

5.GIP和GLP-1双激动多肽化合物药学上可接受的盐，其特征在于：所述的GIP和GLP-1双激动多肽化合物为权利要求1或2或3所述的多肽化合物，且该多肽化合物C末端氨基酸作为C末端伯酰胺或其药学上可接受的盐被酰胺化。

6.根据权利要求5所述的GIP和GLP-1双激动多肽化合物药学上可接受的盐，其特征在于：所述的盐为GIP和GLP-1双激动多肽化合物与下述化合物中的一种所形成的盐：盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、焦硫酸、磷酸、硝酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、甲酸、乙酸、乙酰乙酸、丙酮酸、三氟乙酸、丙酸、丁酸、己酸、庚酸、十一烷酸、月桂酸、苯甲酸、水杨酸、2-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、樟脑酸、肉桂酸、环戊烷丙酸、二葡糖酸、3-羟基-2-萘甲酸、烟酸、扑酸、果胶酯酸、过硫酸、3-苯基丙酸、苦味酸、特戊酸、2-羟基乙磺酸、衣康酸、氨基磺酸、三氟甲磺酸、十二烷基硫酸、2-萘磺酸、萘二磺酸、樟脑磺酸、柠檬酸、酒石酸、硬脂酸、乳酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、肥酸、藻酸、马来酸、富马酸、D-葡糖酸、扁桃酸、抗坏血酸、葡庚酸、甘油磷酸、天冬氨酸、磺基水杨酸、半硫酸或者硫氰酸。

7.权利要求1－3项中任意一项所述的GIP和GLP-1双激动多肽化合物所制备的药剂，其特征在于，所述的药剂是任何一种药剂学上的片剂、胶囊、酏剂、糖浆、锭剂、吸入剂、喷雾剂、注射剂、膜剂、贴剂、散剂、颗粒剂、块剂、乳剂、栓剂或者复方制剂。

8.GIP和GLP-1双激动多肽化合物的药物组合物，其特征在于，该药物组合物以权利要求1－3中任何一项所述的GIP和GLP-1双激动多肽化合物为有效原料，或者以权利要求4或5所述的GIP和GLP-1双激动多肽化合物药学上可接受的盐为有效原料，再加上药学上可接受的载体或稀释剂组成。

9.权利要求1－3中任意一项所述的GIP和GLP-1双激动多肽化合物或者权利要求4所述制备方法所制得的GIP和GLP-1双激动多肽化合物的用途，其特征在于，所述的用途为GIP和GLP-1双激动多肽化合物作为有效原料在制备用于治疗或者预防糖尿病的药物中的用途，或者用于制备减肥药物中的用途。

10.权利要求5或6所述的GIP和GLP-1双激动多肽化合物药学上可接受的盐或者权利要求7所述的药剂或者权利要求8所述的药物组合物的用途，其特征在于，所述的用途多肽化合物药学上可接受的盐或者药剂或者药物组合物作为有效原料在制备用于治疗或者预防糖尿病的药物中的用途，或者用于制备减肥药物中的用途。

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