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CN110540587B - 一种有效提高合成肽纯化收率的色谱方法 - Google Patents

一种有效提高合成肽纯化收率的色谱方法 Download PDF

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CN110540587B CN201910814215.XA CN201910814215A CN110540587B CN 110540587 B CN110540587 B CN 110540587B CN 201910814215 A CN201910814215 A CN 201910814215A CN 110540587 B CN110540587 B CN 110540587B
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Abstract

本发明属药物制备领域，涉及一种提高合成多肽纯化收率的色谱方法，特别涉及到一种提高利拉鲁肽纯化收率的方法，该方法可有效去理化特性跟目标物差异较小的杂质，如非手性对映体杂质等，特别适合杂质谱复杂的样品纯化；同时还可以解决多肽产品上样量小、单杂大、纯度低、效率低等技术难题问题。

Description

一种有效提高合成肽纯化收率的色谱方法
技术领域
本发明属药物制备领域，特别是一种利拉鲁肽的制备纯化方法。
背景技术
利拉鲁肽(Liraglutide)是一种由丹麦诺和诺德公司开发的第一个长效人胰高糖素样肽-1(GLP-1)类似物，与GLP-1同源性达97％，其肽序列为：H-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(γ-Glu-Palmitoyl)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH；利拉鲁肽具有降低血糖，促进胰岛细胞再生，轻微延长胃排空等多种作用，应用前景广泛。利拉鲁肽作为新一代以肠促胰岛素为基础的降血糖药物，不仅作用时间长，而且充分保留了天然GLP-1的多项生理活性，可安全有效降糖并可能对多种心血管危害因素起保护作用。利拉鲁肽注射剂经皮下注射给药，血药浓度达峰时间为20～14小时，半衰期为11～13小时，每日注射一次，提供24h的血糖控制，其药代动力学特性不受性别或年龄影响。利拉鲁肽绝对是2型糖尿病治疗领域革命性药物。
在反相制备色谱应用领域，高压制备液相系统，动态轴向压缩柱子，柱桶最大高度通常为650mm，通常商业化的反相色谱填料一般正常使用压力不超过100bar，标准填料的装填高度为250mm；在柱床高度一定的情况下，制备色谱方法开发中流动相和洗脱梯度对复杂样品分离可做的工作有限，如果从色谱柱长及填料方面开展工作，往往可以获得较好的效果，如分析上常用2根色谱柱串联使用，以获得更高的柱子长度，来实现对难分离杂质的分离。为此，我们将串联色谱应用理念运用到制备色谱开发中，采用单一或多重梯度洗脱的方法来提高对杂质的分离和去除，以提高纯化收率，同时解决利拉鲁肽在纯化过程中上样量小，纯度低，收率低的技术问题。
发明内容
鉴于此，本发明公开一种有效提高合成肽纯化收率的色谱方法，特别涉及到一种提高利拉鲁肽反相色谱纯化收率的方法，该方法涉及将串联色谱柱分离复杂样品的应用理念，运用到单根色谱中，结合单一或多重梯度洗脱，达到在相同色谱条件下提高除去杂质能力，该方法可有效去理化特性跟目标物差异较小的杂质，如非手性对映体杂质等，特别适合杂质谱复杂的样品纯化。具体实施原则是增加单根色谱柱填料的装填高度，提高单根色谱柱对合成多肽中杂质的分离度，来提高样品纯化收率，同时还可以解决多肽产品上样量小、单杂大、纯度低、效率低等技术难题问题；以上策略适合动态轴向压缩柱。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一种利拉鲁肽的纯化方法，包括以下步骤：
(1)取目标多肽粗品，对样品进行预处理；
(2)第一步HPLC纯化；
(3)第二步HPLC纯化；
所述目标多肽粗品的预处理方法为：将利拉鲁肽样品溶于乙腈水溶液，完全溶解后用0.22μm滤膜过滤，收集过滤后的利拉鲁肽粗肽水溶液备用。
所述第一步HPLC纯化方法为反相高效液相色谱法，其中以十八烷基或辛烷基键合硅胶填料作为固定相。
优选的，所述色谱柱装填柱床高度大于250mm。
优选的，所述色谱柱装填柱床高度为260～400mm。
优选的，所述色谱柱装填柱床高度为280～400mm。
优选的，所述色谱柱装填柱床高度为300～400mm。
优选的，所述色谱柱装填固定相十八烷基或辛烷基键合硅胶尺寸为8-20μm。
优选的，所述流动相A选自磷酸盐、硫酸盐、高氯酸盐、醋酸盐、三氟乙酸盐、Tris中的一种或几种。
优选的，所述流动相B选自乙腈、甲醇、异丙醇、乙醇中的一种或几种。
优选的，所述流动相A为0.1％硫酸铵(pH3.3)，流动相B为乙腈。
优选的，使用的缓冲盐的阳离子选自氢离子、钠离子、钾离子、铵离子、三乙胺离子。
优选的，洗脱步骤为单一梯度洗脱或多重梯度洗脱。
洗脱后收集的含有利拉鲁肽样品的馏分，使用旋转蒸发除去部分乙腈。
优选的，所述使用的旋转蒸发器水浴温度为30～35℃，真空度为-0.09MPa。
所述第二步HPLC纯化方法为反相高效液相色谱法，其中以十八烷基或辛烷基键合硅胶填料作为固定相。
优选的，所述色谱柱装填柱床高度为260～400mm。
优选的，所述色谱柱装填固定相十八烷基或辛烷基键合硅胶尺寸为8-20μm。优选的，所述流动相A选自磷酸盐、硫酸盐、高氯酸盐、醋酸盐、三氟乙酸盐、Tris中的一种或几种。
优选的，所述流动相B选自乙腈、甲醇、异丙醇、乙醇中的一种或几种。
优选的，所述流动相A为0.1％硫酸铵(pH6.5)，流动相B为乙腈，多重梯度洗脱。
优选的，使用的缓冲盐的阳离子选自氢离子、钠离子、钾离子、铵离子、三乙胺离子。
洗脱后收集的含有利拉鲁肽样品的馏分，使用旋转蒸发除去部分乙腈。
优选的，所述使用的旋转蒸发器水浴温度为30～35℃，真空度为-0.09MPa。
所述利拉鲁肽为
H-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(γ-Glu-Palmitoyl)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH；
优选的，上述纯化步骤可以经过，但不限于一次纯化、或两次纯化、或三次纯化。
本发明公开了一种利拉鲁肽和/或索马鲁肽的纯化方法，具体包括以下步骤：
1、利拉鲁肽纯化方法
以十八烷基或辛烷基键合硅胶填料为固定相，色谱柱装填柱床高度为280～400mm进行利拉鲁肽纯化。
(1)将目标多肽粗品溶于乙腈水溶液中得到利拉鲁肽粗肽水溶液。
(2)取利拉鲁肽水溶液用0.22μm滤膜过滤除去不溶性颗粒。收集滤液备用。
(3)以十八烷基或辛烷基键合硅胶填料为固定相(8-20μm)，色谱柱装填柱床高度为：280～400mm；以0.1％硫酸铵(取1000ml水，加1ml硫酸铵，混合均匀，用氨水调节pH值至3.3)为流动相A；以乙腈为流动相B；检测波长为230nm；多重梯度洗脱；收取含有利拉鲁肽样品的馏分。
(4)用旋转蒸发器水浴温度在30～35℃，真空度在-0.09MPa以下除去部分乙腈。得到利拉鲁肽第一步样品溶液，样品溶液为酸性。
(5)取步骤(4)的样品，以十八烷基或辛烷基键合硅胶填料为固定相(8-20μm)，色谱柱装填柱床高度为：280～400mm；以10mmol/L的乙酸铵溶液(氨水调节pH至6.5)为流动相A；以乙腈为流动相B；检测波长为230nm；多重梯度洗脱；收取含有利拉鲁肽样品的馏分。
(6)用旋转蒸发器水浴温度在30～35℃，真空度在-0.09MPa以下除去部分乙腈。得到利拉鲁肽样品溶液，样品溶液为近中性。
2、索马鲁肽纯化方法
以十八烷基或辛烷基键合硅胶填料为固定相，色谱柱装填柱床高度为280～400mm进行索玛鲁肽纯化。
(1)将目标多肽粗品溶于乙腈水溶液中得到索玛鲁肽粗肽水溶液。
(2)取索玛鲁肽水溶液用0.22μm滤膜过滤除去不溶性颗粒。收集滤液备用。
(3)以十八烷基或辛烷基键合硅胶填料为固定相(8-20μm)，色谱柱装填柱床高度为：280～400mm；以0.1％TFA(取1000ml水，用氨水调节pH值至2.3)为流动相A；以乙腈为流动相B；检测波长为230nm；多重梯度洗脱；收取含有索玛鲁肽样品的馏分。
(4)用旋转蒸发器水浴温度在30～35℃，真空度在-0.09MPa以下除去部分乙腈。得到索玛鲁肽第一步样品溶液，样品溶液为酸性。
(5)取步骤(4)的样品，以十八烷基或辛烷基键合硅胶填料为固定相(8-20μm)，色谱柱装填柱床高度为：280～400mm；以0.1％磷酸(取1000ml水，用氨水调节pH值至7.5)；以乙腈为流动相B；检测波长为230nm；多重梯度洗脱；收取含有索玛鲁肽样品的馏分。
用旋转蒸发器水浴温度在30～35℃，真空度在-0.09MPa以下除去部分乙腈。得到索玛鲁肽样品溶液，样品溶液为近中性。
本发明的有益效果在于，本发明使用十八烷基或辛烷基键合硅胶填料为固定相，色谱柱装填柱床高度为：260～400mm，以磷酸盐、或硫酸盐、或高氯酸盐、或氯化盐、或醋酸盐、或三氟乙酸盐、或Tris为流动相A，以乙腈或甲醇或异丙醇或乙醇为流动相B，以单一梯度或多重梯度洗脱，收取含有目标多肽样品的馏分，再经过一次纯化、或两次纯化、或三次纯化，可实现产出高纯目标多肽产品目标，纯度达99.0％以上，最大单杂小于0.10％。随着填料装填柱床高度的增加，相同流动相和梯度的情况下，极大的提高纯化总收率。此外，在收率相同的情况下，可减少纯化步骤，最大纯化收率高达95.0％以上，从而解决了合成多肽粗品经纯化达到高纯(大于99.0％)、低单杂(小于0.10％)时收率低的问题。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为利拉鲁肽粗肽色谱图。
图2为柱床高度300mm利拉鲁肽一次纯化色谱图。
图3为柱床高度300mm利拉鲁肽二次纯化色谱图。
图4为柱床高度350mm利拉鲁肽一次纯化色谱图。
图5为柱床高度350mm利拉鲁肽二次纯化色谱图。
图6为柱床高度400mm利拉鲁肽一次纯化色谱图。
图7为柱床高度400mm利拉鲁肽二次纯化色谱图。
图8为索马鲁肽粗肽色谱图。
图9为柱床高度300mm索玛鲁肽一次纯化色谱图。
图10为柱床高度300mm索玛鲁肽二次纯化色谱图。
图11为柱床高度350mm索玛鲁肽一次纯化色谱图。
图12为柱床高度350mm索玛鲁肽二次纯化色谱图。
图13为柱床高度400mm索玛鲁肽一次纯化色谱图。
图14为柱床高度400mm索玛鲁肽二次纯化色谱图。
图15为收率和固定相高度对应关系的折线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1利拉鲁肽的纯化
1.1柱床高度：300mm
取目标利拉鲁肽粗品
样品处理：将150.0g利拉鲁肽样品溶于乙腈水溶液，完全溶解后用0.22μm滤膜过滤。收集过滤后的利拉鲁肽粗肽水溶液备用。
第一步HPLC纯化
色谱条件：以十八烷基或辛烷基键合硅胶填料固定相(100mm×250mm，8-20μm)为色谱柱；以0.1％硫酸铵(取1000ml水，加1ml硫酸铵，混合均匀，用氨水调节pH值至3.3)为流动相A；以乙腈为流动相B；流速为20mL每分钟，多重梯度洗脱，检测波长为230nm；单针上样量为15.0g。
以下表洗脱梯度进行洗脱。
Figure GDA0002230698790000061
收取纯度大于95.0％的利拉鲁肽样品的馏分。用旋转蒸发器水浴温度在30～35℃，真空度在-0.09MPa以下除去部分乙腈。得到利拉鲁肽第一步样品溶液。
第二步HPLC纯化
色谱条件：以十八烷基或辛烷基键合硅胶填料为固定相(8-20μm)，色谱柱为：100mm×250mm；以10mmol/L的乙酸铵溶液(氨水调节pH至6.5)为流动相A；以乙腈为流动相B；检测波长为230nm；多重梯度洗脱；上样量为15.0g。
以下表洗脱梯度进行洗脱。
Figure GDA0002230698790000062
收取纯度大于99.5％的利拉鲁肽样品的馏分。用旋转蒸发器水浴温度在30～35℃，真空度在-0.09MPa以下除去部分乙腈，溶液经对照品定量含利拉鲁肽120.9g，收率达80.6％。
1.2柱床高度：350mm
取利拉鲁肽粗品
样品处理：将含150.0g利拉鲁肽样品溶于乙腈水溶液，完全溶解后用0.22μm滤膜过滤。收集过滤后的利拉鲁肽粗肽水溶液备用。
第一步HPLC纯化
色谱条件：以十八烷基或辛烷基键合硅胶填料固定相(100mm×350mm，10μm)为色谱柱；以0.1％硫酸铵(取1000ml水，加1ml硫酸铵，混合均匀，用氨水调节pH值至3.3)为流动相A；以乙腈为流动相B；流速为200mL每分钟，多重梯度洗脱，检测波长为230nm；单针上样量为15.0g。
以下表洗脱梯度进行洗脱。
Figure GDA0002230698790000071
收取纯度大于95.0％的利拉鲁肽样品的馏分。用旋转蒸发器水浴温度在30～35℃，真空度在-0.09MPa以下除去部分乙腈。得到利拉鲁肽第一步样品溶液。
第二步HPLC纯化
色谱条件：以十八烷基或辛烷基键合硅胶填料为固定相(10μm)，色谱柱为：100mm×350mm；以10mmol/L的乙酸铵溶液(氨水调节pH至6.5)为流动相A；以乙腈为流动相B；检测波长为230nm；多重梯度洗脱；上样量为15.0g。
以下表洗脱梯度进行洗脱。
Figure GDA0002230698790000072
收取纯度大于99.0％的利拉鲁肽样品的馏分。用旋转蒸发器水浴温度在30～35℃，真空度在-0.09MPa以下除去部分乙腈，溶液经对照品定量含利拉鲁肽137.7g，收率达91.8％。
1.3柱床高度：400mm
取利拉鲁肽粗品
样品处理：将含150.0g利拉鲁肽样品溶于乙腈水溶液，完全溶解后用0.22μm滤膜过滤。收集过滤后的利拉鲁肽粗肽水溶液备用。
第一步HPLC纯化
色谱条件：以十八烷基或辛烷基键合硅胶填料固定相(100mm×400mm，10μm)为色谱柱；以0.1％硫酸铵(取1000ml水，加1ml硫酸铵，混合均匀，用氨水调节pH值至3.3)为流动相A；以乙腈为流动相B；流速为200mL每分钟，多重梯度洗脱，检测波长为230nm；单针上样量为15.0g。
以下表洗脱梯度进行洗脱。
Figure GDA0002230698790000081
收取纯度大于95.0％的利拉鲁肽样品的馏分。用旋转蒸发器水浴温度在30～35℃，真空度在-0.09MPa以下除去部分乙腈。得到利拉鲁肽第一步样品溶液。
第二步HPLC纯化
色谱条件：以十八烷基或辛烷基键合硅胶填料为固定相(10μm)，色谱柱为：100mm×400mm；以10mmol/L的乙酸铵溶液(氨水调节pH至6.5)为流动相A；以乙腈为流动相B；检测波长为230nm；多重梯度洗脱；上样量为15.0g。
以下表洗脱梯度进行洗脱。
Figure GDA0002230698790000082
收取纯度大于99.0％的利拉鲁肽样品的馏分。用旋转蒸发器水浴温度在30～35℃，真空度在-0.09MPa以下除去部分乙腈，溶液经对照品定量含利拉鲁肽143.55g，收率达95.7％。
实施例2索马鲁肽的纯化
2.1柱床高度：300mm
取索玛鲁肽粗品
样品处理：将含12.0g索玛鲁肽样品溶于乙腈水溶液，完全溶解后用0.22μm滤膜过滤。收集过滤后的索玛鲁肽粗肽水溶液备用。
第一步HPLC纯化
色谱条件：以十八烷基或辛烷基键合硅胶填料固定相(50mm×300mm，10μm)为色谱柱；以0.1％TFA(取1000ml水，用氨水调节pH值至2.3)为流动相A；以乙腈为流动相B；流速为20mL每分钟，多重梯度洗脱，检测波长为230nm；单针上样量为3.0g。
以下表洗脱梯度进行洗脱。
Figure GDA0002230698790000091
收取纯度大于90.0％的索玛鲁肽样品的馏分。用旋转蒸发器水浴温度在30～35℃，真空度在-0.09MPa以下除去部分乙腈。得到索玛鲁肽第一步样品溶液。
第二步HPLC纯化
色谱条件：以十八烷基或辛烷基键合硅胶填料固定相(50mm×300mm，10μm)为色谱柱；以0.1％磷酸(取1000ml水，用氨水调节pH值至7.5)为流动相A；以乙腈为流动相B；流速为20mL每分钟，多重梯度洗脱，检测波长为230nm；单针上样量为2.0g。
以下表洗脱梯度进行洗脱。
Figure GDA0002230698790000092
收取纯度大于99.0％的索玛鲁肽样品的馏分。用旋转蒸发器水浴温度在30～35℃，真空度在-0.09MPa以下除去部分乙腈，溶液经对照品定量含索玛鲁肽9.7g，收率达81.2％。
2.2柱床高度：350mm
取索玛鲁肽粗品
样品处理：将含12.0g索玛鲁肽样品溶于乙腈水溶液，完全溶解后用0.22μm滤膜过滤。收集过滤后的索玛鲁肽粗肽水溶液备用。
第一步HPLC纯化
色谱条件：以十八烷基或辛烷基键合硅胶填料固定相(50mm×350mm，10μm)为色谱柱；以0.1％TFA(取1000ml水，用氨水调节pH值至2.3)为流动相A；以乙腈为流动相B；流速为20mL每分钟，多重梯度洗脱，检测波长为230nm；单针上样量为3.0g。
以下表洗脱梯度进行洗脱。
Figure GDA0002230698790000101
收取纯度大于90.0％的索玛鲁肽样品的馏分。用旋转蒸发器水浴温度在30～35℃，真空度在-0.09MPa以下除去部分乙腈。得到索玛鲁肽第一步样品溶液。
第二步HPLC纯化
色谱条件：以十八烷基或辛烷基键合硅胶填料固定相(50mm×350mm，10μm)为色谱柱；以0.1％磷酸(取1000ml水，用氨水调节pH值至7.5)为流动相A；以乙腈为流动相B；流速为20mL每分钟，多重梯度洗脱，检测波长为230nm；单针上样量为2.0g。
以下表洗脱梯度进行洗脱。
Figure GDA0002230698790000102
收取纯度大于99.0％的索玛鲁肽样品的馏分。用旋转蒸发器水浴温度在30～35℃，真空度在-0.09MPa以下除去部分乙腈，溶液经对照品定量含索玛鲁肽10.3g，收率达86.3％。
2.3柱床高度：400mm
取索玛鲁肽粗品
样品处理：将含12.0g索玛鲁肽样品溶于乙腈水溶液，完全溶解后用0.22μm滤膜过滤。收集过滤后的索玛鲁肽粗肽水溶液备用。
第一步HPLC纯化
色谱条件：以十八烷基或辛烷基键合硅胶填料固定相(50mm×400mm，10μm)为色谱柱；以0.1％TFA(取1000ml水，用氨水调节pH值至2.3)为流动相A；以乙腈为流动相B；流速为20mL每分钟，多重梯度洗脱，检测波长为230nm；单针上样量为3.0g。
以下表洗脱梯度进行洗脱。
Figure GDA0002230698790000111
收取纯度大于90.0％的索玛鲁肽样品的馏分。用旋转蒸发器水浴温度在30～35℃，真空度在-0.09MPa以下除去部分乙腈。得到索玛鲁肽第一步样品溶液。
第二步HPLC纯化
色谱条件：以十八烷基或辛烷基键合硅胶填料固定相(50mm×400mm，10μm)为色谱柱；以0.1％磷酸(取1000ml水，用氨水调节pH值至7.5)为流动相A；以乙腈为流动相B；流速为20mL每分钟，多重梯度洗脱，检测波长为230nm；单针上样量为2.0g。
以下表洗脱梯度进行洗脱。
Figure GDA0002230698790000112
收取纯度大于99.0％的索玛鲁肽样品的馏分。用旋转蒸发器水浴温度在30～35℃，真空度在-0.09MPa以下除去部分乙腈，溶液经对照品定量含索玛鲁肽11.1g，收率达92.8％。
由实施例1和实施例2的实验结果可以看出随着柱床的高度增加，相同色谱条件下利拉鲁肽和索玛鲁肽收率随之增加。在实验过程中，随之而来的是柱子压力也会增加，为了进一步探究柱床高度对收率的影响，进一步实施以下实验以获取更详尽的数据，详见实施例3。
实施例3
取利拉鲁肽粗品
样品处理：将150.0g利拉鲁肽样品溶于乙腈水溶液，完全溶解后用0.22μm滤膜过滤。收集过滤后的利拉鲁肽粗肽水溶液备用。
第一步HPLC纯化
色谱条件：以十八烷基或辛烷基键合硅胶填料固定相(100mm×300mm，8-20μm)为色谱柱；以0.1％硫酸铵(取1000ml水，加1ml硫酸铵，混合均匀，用氨水调节pH值至3.3)为流动相A；以乙腈为流动相B；流速为20mL每分钟，多重梯度洗脱，检测波长为230nm；单针上样量为15.0g。
以下表洗脱梯度进行洗脱。
Figure GDA0002230698790000121
收取纯度大于95.0％的利拉鲁肽样品的馏分。用旋转蒸发器水浴温度在30～35℃，真空度在-0.09MPa以下除去部分乙腈。得到利拉鲁肽第一步样品溶液。
第二步HPLC纯化
色谱条件：以十八烷基或辛烷基键合硅胶填料为固定相(8-20μm)，色谱柱为：100mm×300mm；以10mmol/L的乙酸铵溶液(氨水调节pH至6.5)为流动相A；以乙腈为流动相B；检测波长为230nm；多重梯度洗脱；上样量为15.0g。
以下表洗脱梯度进行洗脱。
Figure GDA0002230698790000122
收取纯度大于99.5％的利拉鲁肽样品的馏分。用旋转蒸发器水浴温度在30～35℃，真空度在-0.09MPa以下除去部分乙腈。
固定相高度：260～270mm，收取纯度大于99.0％，单杂小于0.1％的利拉鲁肽样品的馏分。溶液经对照品定量含利拉鲁肽2.1g，收率达14.00％。
固定相高度：270～280mm，收取纯度大于99.0％，单杂小于0.1％的利拉鲁肽样品的馏分。溶液经对照品定量含利拉鲁肽3.2g，收率达21.33％。
固定相高度：280～290mm，收取纯度大于99.0％，单杂小于0.1％的利拉鲁肽样品的馏分。溶液经对照品定量含利拉鲁肽4.5g，收率达30.00％。
固定相高度：290～300mm，收取纯度大于99.0％，单杂小于0.1％的利拉鲁肽样品的馏分。溶液经对照品定量含利拉鲁肽6.1g，收率达40.67％。
固定相高度：300～310mm，收取纯度大于99.0％，单杂小于0.1％的利拉鲁肽样品的馏分。溶液经对照品定量含利拉鲁肽13.1g，收率达87.33％。
固定相高度：310～320mm，收取纯度大于99.0％，单杂小于0.1％的利拉鲁肽样品的馏分。溶液经对照品定量含利拉鲁肽13.2g，收率达88.00％。
固定相高度：320～330mm，收取纯度大于99.0％，单杂小于0.1％的利拉鲁肽样品的馏分。溶液经对照品定量含利拉鲁肽13.3g，收率达88.67％。
固定相高度：330～340mm，收取纯度大于99.0％，单杂小于0.1％的利拉鲁肽样品的馏分。溶液经对照品定量含利拉鲁肽13.4g，收率达89.33％。
固定相高度：340～350mm，收取纯度大于99.0％，单杂小于0.1％的利拉鲁肽样品的馏分。溶液经对照品定量含利拉鲁肽13.3g，收率达88.67％。
固定相高度：350～360mm，收取纯度大于99.0％，单杂小于0.1％的利拉鲁肽样品的馏分。溶液经对照品定量含利拉鲁肽13.6g，收率达90.67％。
固定相高度：360～370mm，收取纯度大于99.0％，单杂小于0.1％的利拉鲁肽样品的馏分。溶液经对照品定量含利拉鲁肽13.8g，收率达92.00％。
固定相高度：370～380mm，收取纯度大于99.0％，单杂小于0.1％的利拉鲁肽样品的馏分。溶液经对照品定量含利拉鲁肽14.1g，收率达94.00％。
固定相高度：380～390mm，收取纯度大于99.0％，单杂小于0.1％的利拉鲁肽样品的馏分。溶液经对照品定量含利拉鲁肽14.2g，收率达94.67％。
固定相高度：390～400mm，收取纯度大于99.0％，单杂小于0.1％的利拉鲁肽样品的馏分。溶液经对照品定量含利拉鲁肽14.3g，收率达95.33％。
整理的具体数据如下表：
固定相高度 上样量 最终合格品标准 收回量 收率
260～270mm 15g 纯度大于99.0％，单杂小于0.1％ 2.1g 14.00％
270～280mm 15g 纯度大于99.0％，单杂小于0.1％ 3.2g 21.33％
280～290mm 15g 纯度大于99.0％，单杂小于0.1％ 4.5g 30.00％
290～300mm 15g 纯度大于99.0％，单杂小于0.1％ 6.1g 40.67％
300～310mm 15g 纯度大于99.0％，单杂小于0.1％ 13.1g 87.33％
310～320mm 15g 纯度大于99.0％，单杂小于0.1％ 13.2g 88.00％
320～330mm 15g 纯度大于99.0％，单杂小于0.1％ 13.3g 88.67％
330～340mm 15g 纯度大于99.0％，单杂小于0.1％ 13.4g 89.33％
340～350mm 15g 纯度大于99.0％，单杂小于0.1％ 13.3g 88.67％
350～360mm 15g 纯度大于99.0％，单杂小于0.1％ 13.6g 90.67％
360～370mm 15g 纯度大于99.0％，单杂小于0.1％ 13.8g 92.00％
370～380mm 15g 纯度大于99.0％，单杂小于0.1％ 14.1g 94.00％
380～390mm 15g 纯度大于99.0％，单杂小于0.1％ 14.2g 94.67％
390～400mm 15g 纯度大于99.0％，单杂小于0.1％ 14.3g 95.33％
收率和固定相高度对应关系的折线图如图15所示。
由实验数据得出:当增加色谱固定相的长度从260～270mm至300～310mm,收率从14.00％增加到87.33％,柱长290mm至300之间收率增加明显，300mm过后收率增长变缓。

Claims (6)

1.一种合成肽的纯化方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：
（1）取目标多肽粗品，进行样品预处理；
（2）第一步HPLC纯化，所述第一步HPLC纯化方法为反相高效液相色谱法，其中以十八烷基或辛烷基键合硅胶填料作为固定相，色谱柱为单根且装填柱床高度为350~400mm，色谱柱装填固定相十八烷基或辛烷基键合硅胶尺寸为8~20μm；
（3）第二步HPLC纯化，所述第二步HPLC纯化方法为反相高效液相色谱法，其中以十八烷基或辛烷基键合硅胶填料作为固定相，色谱柱装填柱床高度为350~400mm，色谱柱装填固定相十八烷基或辛烷基键合硅胶尺寸为8-20μm；
所述多肽为利拉鲁肽或索马鲁肽；
第一步HPLC纯化和第二步HPLC纯化中：
流动相B选自乙腈、甲醇、异丙醇、乙醇中的一种或几种；
纯化利拉鲁肽时，第一步HPLC纯化方法中流动相A为硫酸铵，pH3.3；第二步HPLC纯化方法中流动相A为乙酸铵，pH6.5；
纯化索马鲁肽时，第一步HPLC纯化方法中流动相A为三氟乙酸，pH2.3；第二步HPLC纯化方法中流动相A为磷酸，pH7.5。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述目标多肽粗品的预处理方法为：将多肽样品溶于乙腈水溶液，完全溶解后用0.22μm滤膜过滤，收集过滤后的利拉鲁肽粗肽水溶液备用。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述第一步HPLC纯化方法中流动相A为0.1%硫酸铵，pH3.3。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述第一步HPLC纯化和第二步HPLC纯化中，洗脱步骤为单一梯度洗脱或多重梯度洗脱。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述第一步HPLC纯化和第二步HPLC纯化中，洗脱后收集的含有利拉鲁肽样品的馏分，使用旋转蒸发除去部分乙腈，旋转蒸发器水浴温度为30~35℃，真空度为-0.09MPa。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述第二步HPLC纯化方法中流动相A为10mmol/L乙酸铵，pH6.5。
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