CN109806386A - Fxr激动剂与glp-1类似物的药物组合物和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及FXR激动剂与GLP‑1类似物的药物组合物和用途。具体而言，本发明涉及一种FXR激动剂与GLP‑1类似物联合在制备治疗和/或预防非酒精性脂肪性肝病的药物中的用途。

Description

FXR激动剂与GLP-1类似物的药物组合物和用途

技术领域

本发明属于涉及一种FXR激动剂与GLP-1类似物联合用药，以及其在制备治疗和/或预防非酒精性脂肪性肝病的药物中的用途。

背景技术

法尼醇X受体(farnesoid X receptor,FXR)主要分布于肝脏，通过抑制固醇调节元件结合蛋白-1c(SREBP-1c)，抑制脂肪酸的从头合成(de novo lipogenesis,DNL)，减少肝脏的脂肪含量。由于细胞色素7A1(CYP7A1)是胆酸生物合成的限速酶，而FXR激动剂通过活化FXR，间接抑制CYP7A1的基因表达，抑制肝脏的胆汁酸合成，缓解胆汁酸过多对肝细胞的毒性。目前，FXR激动剂已获批治疗原发性胆汁性胆管炎(PBC)。WO02072598公开了一种FXR激动剂——奥贝胆酸(obeticholic acid,OCA)，其是一种鹅脱氧胆酸衍生物，化学名为3α，7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷-24酸，结构如下所示。奥贝胆酸可以抑制胆酸合成，用于治疗胆管闭锁、胆汁淤积性肝病、慢性肝病、原发性胆性肝硬化、酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪肝病等肝病。

胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)是一种30个氨基酸的多肽激素，它能以葡萄糖浓度依赖性方式促进胰岛β细胞分泌胰岛素，并减少胰岛α细胞分泌胰高血糖素(glucagon)，从而降低血糖和减肥。CN101987868B公开了一种GLP-1类似物，其结构如下所示。该GLP-1类似物较内源性GLP-1具有更高的活性和更长的体内半衰期，可用于治疗胰岛素依赖性糖尿病、非胰岛素依赖性糖尿病、肥胖等疾病。

非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)是非酒精性脂肪肝的一种极端发展形式，定义为伴随有炎症及肝细胞损伤的脂肪变性现象的出现。NASH可导致晚期肝脏纤维化、肝硬化、肝衰竭及肝脏肿瘤的产生。在过去的20年里，NAFLD发病数已翻倍，现已成为西方国家中最为常见的肝脏疾病。导致NASH的主要危险因素包括肥胖、2型糖尿病(T2DM)及血脂异常与代谢综合征。在美国，非酒精性脂肪肝病(Nonalcoholic fattyliver disease,NAFLD)的发病率约占总人口的10-46％，其中约10-30％的患者会发展成为NASH。肝脏病理诊断是判断NASH的唯一标准。NAFLD活动度评分(NAS)，其中脂肪变性3分、炎症3分、气球样变2分。当总分≥5分，且每个类别至少1分，判断为NASH病人。目前，NASH相关的肝硬化是美国肝移植的第三大常见原因，预计在2020年将成为主要原因。

尽管医疗需求迫切，然而迄今为止FDA尚未批准任何药物用于NASH治疗。虽然早期临床研究发现FXR激动剂或GLP-1类似物单用对非酒精性脂肪性肝炎，特别是对肝脏脂肪含量有一定疗效，但仍不能达到理想的治疗效果，并且，FXR激动剂存在升高低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)和严重瘙痒的不良反应，因此通过药物联用增加药效，减少不良反应具有非常重要的意义。

发明内容

本发明提供一种FXR激动剂与GLP-1类似物联合在制备治疗和/或预防非酒精性脂肪性肝病的药物中的用途，所述联合用药具有协同作用。

在本发明所述的联合给药方式选自同时给药或先后给药。

在本发明的一个方案中，所述FXR激动剂选自奥贝胆酸或其可药用盐。所述奥贝胆酸可药用盐可通过奥贝胆酸与碱性物质成盐获得，这些碱性物质包括铵、碱金属或碱土金属的氢氧化物，以及碳酸盐、碳酸氢盐，典型的有氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、碳酸钠、碳酸钾等。

在本发明的一个方案中，所述GLP-1类似物选自结构如下所示的化合物或其可药用盐。

本发明所述的GLP-1类似物属于两性化合物，所属领域技术人员通过公知技术可使用酸性或碱性化合物与之反应成盐，通常采用的形成酸加成盐的酸为：盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、磷酸、对甲苯磺酸、甲磺酸、草酸、对溴苯基磺酸、碳酸、琥珀酸、柠檬酸、苯甲酸、乙酸；盐包括硫酸盐、焦硫酸盐、三氟乙酸盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、磷酸盐、磷酸氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、盐酸盐、溴化物、碘化物、乙酸盐、丙酸盐、辛酸盐、丙烯酸盐、甲酸盐、异丁酸盐、己酸盐、庚酸盐、丙炔酸盐、草酸盐、丙二酸盐、丁二酸盐、辛二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、丁炔-1，4-二酸盐、己炔-1，6-二酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、苯乙酸盐、苯丙酸盐、苯丁酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、γ-羟基丁酸盐、甘醇酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、丙磺酸盐、奈-1-磺酸盐、奈-2-磺酸盐、扁桃酸盐等。碱性物质也可以和GLP-1类似物成盐，这些碱性物质包括铵、碱金属或碱土金属的氢氧化物，以及碳酸盐、碳酸氢盐，典型的有氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、碳酸钠、碳酸钾等。

在本发明的一个方案中，所述非酒精性脂肪性肝病选自非酒精性单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎及其相关肝硬化或肝细胞癌。

本发明所述的用途，其中，所述FXR激动剂的给药剂量为0.1至100mg，优选1mg、2mg、5mg、10mg、15mg、20mg、25mg、30mg、40mg、50mg、70mg或90mg。

本发明所述的用途，其中，所述GLP-1类似物的给药剂量为0.1至50mg，优选0.5mg、1mg、1.5mg、2mg、2.25mg、2.5mg、2.75mg、3mg、3.25mg、3.5mg、3.75mg、4mg、4.5mg、5mg、10mg、15mg、20mg、25mg、30mg或40mg。

在本发明的一个方案中，所述FXR激动剂与GLP-1类似物的给药剂量的质量比例为100:1至1:10，优选10:1至1:1，最优选7:1、6.7:1、5:1、4:1、3:1、2.7:1、2.5:1、2:1、1.7:1、1.5:1或1.3:1。

在本发明的一个方案中，所述FXR激动剂推荐一天给药一次或一天给药两次，优选一天给药一次。

在本发明的一个方案中，所述GLP-1类似物推荐一天给药一次或一天给药两次，优选一天给药一次。

在本发明的一个优选方案中，所述FXR激动剂与GLP-1类似物均为一天给药一次。

本发明的还涉及一种FXR激动剂与GLP-1类似物的药物组合物，包含任选的一种或多种药用载体、赋形剂和/或稀释剂。所述药物组合物可以制成药学上可接受的任一剂型。例如，FXR激动剂与GLP-1类似物的药物制剂可以配制为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂、注射剂(包括注射液、注射用无菌粉末与注射用浓溶液)、栓剂、吸入剂或喷雾剂。

此外，本发明的所述药物组合物还可以以任何合适的给药方式，例如口服、肠胃外、直肠、经肺或局部给药等方式施用于需要这种治疗的患者或受试者。当用于口服给药时，所述药物组合物可制成口服制剂，例如口服固体制剂，如片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂等；或口服液体制剂，如口服溶液剂、口服混悬剂、糖浆剂等。当制成口服制剂时，所述药物制剂还可包含适宜的填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂等。

本发明所述的“联合”是一种给药方式，是指一定时间期限内给予至少一种剂量的FXR激动剂与GLP-1类似物。所述的时间期限可以是一个给药周期内，优选4周内，3周内，2周内，1周内，或24小时以内。可以同时或依次给予FXR激动剂与GLP-1类似物。这种期限包括这样的治疗，其中通过相同给药途径或不同给药途径给予免FXR激动剂与GLP-1类似物。本发明所述联合的给药方式选自同时给药、独立地配制并共给药或独立地配制并相继给药。

本发明还提供了一种治疗非酒精性脂肪性肝病的方法，包括向癌症患者给予前述的FXR激动剂与GLP-1类似物。

附图说明

图1.肝组织NAS评分

图2.肝细胞脂肪变性评分

图3.肝脏中TC检测值

图4.肝脏中TG检测值

图5.动物外周血ALT检测值

图6.动物外周血AST检测值

图7.动物外周血TC检测值

图8.动物外周血TG检测值

图9.动物外周血HDL检测值

图10.动物外周血LDL检测值

具体实施方式

以下提供本发明的组合物在非酒精性脂肪性肝病医药用途中的示例性试验方案，以显示本发明组合物的有利活性或有益技术效果。但是应当理解，下述试验方案仅仅是对本发明内容的示例，而不是对本发明范围的限制。本领域技术人员在本说明书的教导下，能够对本发明的技术方案进行适当的修改或改变，而不背离本发明的精神和范围。

实施例1：本发明组合物在HFD+CHOL诱导的C57bl/6雄性小鼠NASH模型的疗效试验

实验材料

供试品：

奥贝胆酸(OCA)可按照WO02072598中公开的方法制备获得；GLP-1类似物(结构如下所示)可按照专利CN101987868B中公开的方法制备获得；GLP-1类似物颗粒由GLP-1类似物、SNAC和常规药用辅料组成，所述颗粒可通过常规制粒方法制备，例如，将GLP-1类似物、SNAC和其他辅料混合后，通过干法制粒、整粒、总混等步骤制备。空白颗粒中不含GLP-1类似物，其他药用辅料及制剂工艺同GLP-1类似物颗粒。

实验动物：

C57BL/6雄性SPF级小鼠，体重26-30克，购自上海灵畅生物科技有限公司，饲养于凯斯艾生物科技(苏州)有限公司(KCI)动物中心，动物合格证号：2013001816031，动物使用许可证：SYXK(苏)2017-0041。

造模饲料：

HFD+HCOL(高脂60％+胆固醇1.25％)，购自南通特罗菲饲料科技有限公司，苏饲证(2014)06092。

受试化合物和阳性对照品配制方案：

组-1：给予动物OCA的溶媒+pH6.8磷酸盐缓冲液配置的GLP-1类似物空白颗粒。

组-2：给予动物OCA的溶媒+pH6.8磷酸盐缓冲液配置的GLP-1类似物空白颗粒。

组-3：用1％羟丙基甲基纤维素(HPMC)作为溶媒，加入称量量的OCA在1％HPMC中研磨均匀，再加入1％HPMC至所需量，超声15分钟后可给药，保存于4℃，4天配置一次。

组-4：加入预先配制好的pH6.8磷酸盐缓冲液中，磁力搅拌器搅拌至少15分钟，配至所需体积后用磁力搅拌器搅拌均匀。然后定容至所需体积。配制好的药液存放在4℃条件下，直至给药结束，药物需避光配制，并存放在棕色容量瓶内。供试品每天配制一次。

组-5：用1％HPMC作为溶媒，加入称量量的OCA在1％HPMC中研磨均匀，再加入1％HPMC至所需量，超声15分钟后可给药，保存于4℃，4天配置一次。

组-6：用0.1％HPMC作为溶媒，加入称量量的OCA在1％HPMC中研磨均匀，再加入1％HPMC至所需量，超声15分钟后可给药，保存于4℃，4天配置一次。加入预先配制好的pH6.8磷酸盐缓冲液中，磁力搅拌器搅拌至少15分钟，配至所需体积后用磁力搅拌器搅拌均匀。然后定容至所需体积。配制好的药液存放在4℃条件下，直至给药结束，药物需避光配制，并存放在棕色容量瓶内。供试品每天配制一次。

实验仪器：

全自动血生化分析仪：日本株式会社日立高新技术，型号：7060

体重秤：JJ500,G&G,江苏,中国

小鼠灌胃器：#8灌胃针

组织脱水机：HistoCore Pearl,Leica

包埋机：HistoCore Arcadia,Leica

切片机：RM2235,Leica

自动染色机：LEICA Autostainer ST5020

切片扫描仪：NanoZoomer Digital Pathology(S210)(滨松，日本)

移液枪和枪头：RAININ(2μl,10μl,20μl,100μl,200μl,1000μl)

移液枪：RAININ

超低温冰箱：SANYO UITRA LOW；MDF-382E

实验方法

模型建立：

在KCI动物实验操作SOP指导原则下实施本实验所涉及到的一切操作。动物在屏障内适应一周后进入实验。以动物体重为基准按照蛇形曲线随机分组，开始饲喂相关实验用动物饲料(正常动物标准饲料饲喂，模型动物与给要动物高脂+高胆固醇饲料饲喂)，连续10周。每日测量动物采食量，每两天测量一次动物体重，持续10周。

实验分组和给药：

实验分6组，正常动物组(组-1，n＝3)，模型组(组-2，n＝8)，OCA-30mpk组(组-3，n＝8)，GLP-1类似物颗粒30mpk组(组-4，n＝8)，OCA-20mpk组(组-5，n＝8)，GLP-1类似物颗粒30mpk+OCA-20mpk组(组-6，n＝8)。造模第五周开始口服给药。模型组给与化合物溶媒。给药途径为口服给药，给药体积10mL/kg，每天一次，连续42天(表1)。

表1、实验分组及给药信息

实验终点：

末次给药后24小时开始动物禁食6小时，根据KCI动物安乐死标准SOP将所有动物执行安乐死，采集血样，制备血清，冷冻保存。动物经磷酸盐缓冲液全身灌注，收集肝脏，称重，采集肝脏大体照片。部分肝组织液氮速冻，负80℃保存，其余肝组织固定于10％中性福尔马林溶液中进行后续组织病理相关检测。

血生化检测

采用全自动生化仪检测禁食后血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)等血生化指标。检测单位重量肝脏组织内甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)。

肝脏中甘油三酯和胆固醇检测

称取适量的冰冻肝组织，以肝重(g)：溶媒(mL)＝1:9比例加入溶媒，匀浆(冰浴)；2500rpm低温离心10min，收集上清液，吸取一定量上清液，稀释至50倍(即：肝组织匀浆液浓度2％)，用日立7060生化仪检测TC和TG含量。

组织病理学检测

按照KCI病理标准SOP进行肝脏组织脱水，石蜡块制作，石蜡切片，片厚3μm。遵循KCI病理标准染色SOP进行HE染色、天狼猩红染色，并通过NanoZoomer Digital Pathology(S210)(滨松，日本)切片扫描仪进行天狼猩红染色切片整片扫描。采用双盲法通过两名病理学家对HE染色切片进行肝损伤病理分析和评分(表2)；对天狼星红染色切片进行肝纤维化面积计算，肝纤维化％＝纤维化面积/总计算面积×100。

表2、肝损伤病理评分标准

数据分析

使用graphpad prism 5.0软件，计算mean±sd和mean±sem，差异显著性检验使用t-test和One-way ANOVA检验；P<0.05时两组之间具有统计学意义。

实验结果

给药期间动物基本生理观察

实验期间动物临床观察无明显异常变化。

试验期间动物体重变化

实验期间所有动物经过高脂高胆固醇饲料饲养体重呈现增长趋势，给予受试物后体重增长趋于平缓，各实验组之间体重均值无明显统计学差异。

肝重和肝体比变化

各组肝组织表面光滑，模型组较正常对照组肝重有增长趋势，同时，与模型组相比，各受试物处理组肝重有降低趋势，但无统计学意义。肝重/体重比变化与肝脏重量变化一致，各组间无统计学差异。

组织病理学检测

HE染色肝组织学观察可见高脂高胆固醇诱导的不同程度的肝细胞弥漫性肝细胞脂肪变性，散在多灶性炎细胞浸润，分布于肝组织的不同区域。NAS总评分可见OCA与受试物各个组与模型组相比均有下降趋势，且GLP-1类似物颗粒和OCA联合用药组与模型组相比显著性降低(P<0.01)，具有统计学意义(图1，##p<0.001vs.正常对照组；**p<0.01vs.模型组)。OCA治疗组可见肝细胞脂肪变性减轻，炎细胞浸润减少。受试化合物组治疗后可见不同程度的肝细胞脂肪变性、坏死以及炎细胞浸润的减少。GLP-1类似物颗粒以及GLP-1类似物颗粒与OCA的联合用药组与模型组相比，肝细胞脂肪变性显著性降低(P<0.05)(图2，#p<0.05vs.正常对照组；*p<0.001vs.模型组；T-test：$p<0.05vs.模型组)。

肝组织中总胆固醇TC、总甘油三酯TG检测

肝组织中TC、TG检测结果显示模型组明显高于正常对照组，且各用药组肝脏中TC含量显著低于模型组，具有统计学意义(p<0.05)，肝组中TG各用药组与模型组相比有下降趋势，且在OCA-30mg/kg/d和GLP-1类似物颗粒与OCA-20mg/kg/d联合用药治疗时与模型组相比显著性降低(p<0.05)(图3，**p<0.01；***p<0.001vs.模型组；#p<0.05vs.正常对照组、图4)。

外周血血清生化检测

模型动物血清谷草转氨酶AST、丙氨酸转氨酶ALT、总胆固醇TC、总甘油三酯TG、高密度脂蛋白HDL、低密度脂蛋白LDL值明显著升高，动物经OCA和供试品治疗后血清AST、ALT、TC、HDL、LDL值较模型组有明显的降低趋势。受试化合物GLP-1类似物以及GLP-1类似物颗粒和OCA的联合用药组ALT和AST明显低于模型组，但统计学分析均未见显示显著性差异。TC、HDL以及LDL值与模型组相比显著性降低，如图5至图10所示(图5，***p<0.001vs.正常对照组；图6，*p<0.05，**p<0.01vs.模型组；图7，###P<0.001vs.正常对照组；**p<0.01vs.模型组；***p<0.001vs.模型组；图9，###P<0.001vs.正常对照组；*p<0.05vs.模型组；***p<0.001vs.模型组；图10，###P<0.001vs.正常对照组；**p<0.01vs.模型组；***p<0.001vs.模型组)。

结论

本实验结果显示GLP-1类似物单药使用或与OCA联合用药与模型组相比对高脂高胆固醇诱导的小鼠NASH进程均表现出显著性治疗作用，特别是GLP-1类似物和OCA联合应用显著性优于受试化合物单药使用，同时优于OCA单药的疗效。

Claims (9)

1.一种FXR激动剂与GLP-1类似物联合在制备治疗和/或预防非酒精性脂肪性肝病的药物中的用途。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述FXR激动剂选自奥贝胆酸或其可药用盐。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述GLP-1类似物选自结构如下所示的化合物或其可药用盐：

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述非酒精性脂肪性肝病选自非酒精性单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎及其相关肝硬化或肝细胞癌。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的用途，其特征在于，所述联合具有协同药效作用。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的用途，其特征在于，所述FXR激动剂与GLP-1类似物的质量比例为100:1至1:10，优选10:1至1:1，最优选7:1、6.7:1、5:1、4:1、3:1、2.7:1、2.5:1、2:1、1.7:1、1.5:1或1.3:1。

7.根据权利要求1-5中任一项所述的用途，其特征在于，所述FXR激动剂的给药剂量为0.1至100mg，优选1mg、2mg、5mg、10mg、15mg、20mg、25mg、30mg、40mg、50mg、70mg或90mg。

8.根据权利要求1-5中任一项所述的用途，其特征在于，所述GLP-1类似物的给药剂量为0.1至50mg，优选0.5mg、1mg、1.5mg、2mg、2.25mg、2.5mg、2.75mg、3mg、3.25mg、3.5mg、3.75mg、4mg、4.5mg、5mg、10mg、15mg、20mg、25mg、30mg或40mg。

9.含有权利要求1-8中任一项所述的FXR激动剂与GLP-1类似物的药物组合物，其特征在于，包含一种或多种可药用的赋形剂、稀释剂或载体。