[go: up one dir, main page]

CN101534846B - 显示生理学溶解性和稳定性的胰高血糖素类似物 - Google Patents

显示生理学溶解性和稳定性的胰高血糖素类似物 Download PDF

Info

Publication number
CN101534846B
CN101534846B CN200680050578.1A CN200680050578A CN101534846B CN 101534846 B CN101534846 B CN 101534846B CN 200680050578 A CN200680050578 A CN 200680050578A CN 101534846 B CN101534846 B CN 101534846B
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
glucagon
peptide
amino acid
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN200680050578.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101534846A (zh
Inventor
R·D·迪马奇
D·L·斯米利
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Indiana University Research and Technology Corp
Original Assignee
Indiana University Research and Technology Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Indiana University Research and Technology Corp filed Critical Indiana University Research and Technology Corp
Publication of CN101534846A publication Critical patent/CN101534846A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101534846B publication Critical patent/CN101534846B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/26—Glucagons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/605—Glucagons
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

公开了具有改善的溶解性和稳定性的经修饰的胰高血糖素肽，其中天然胰高血糖素肽已通过下述进行修饰：聚乙二醇化，或添加选自SEQID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21的羧基末端肽，或两者。

Description

显示生理学溶解性和稳定性的胰高血糖素类似物
背景
低血糖症在血糖水平下降得太低而不能提供关于身体的活动的足够能量时发生。在成人或大于10岁的儿童中，低血糖症是罕见的，除了作为糖尿病治疗的副作用，但它可以起因于其他药疗法或疾病、激素或酶缺陷、或肿瘤。当血糖开始降低时，由胰产生的激素胰高血糖素给肝发信号以分解糖原且释放葡萄糖，从而引起血糖水平朝向正常水平上升。然而，对于糖尿病患者，响应低血糖症的这种胰高血糖素可能是受损的，从而使得葡萄糖水平难以返回正常范围。
低血糖症是需要立即的医学关注的危及生命的事件。胰高血糖素的施用是用于治疗急性低血糖症的确定的药疗法，并且它可以在施用的数分钟内恢复葡萄糖的正常水平。当胰高血糖素在低血糖症的急性医学治疗中使用时，结晶形式的胰高血糖素用稀酸缓冲液溶解并且该溶液进行肌内注射。尽管这种治疗是有效的，但该方法对于半意识的某人是麻烦和危险的。因此，需要这样的胰高血糖素类似物，其维持亲本分子的生物学性能，但在相关的生理状况下充分可溶和稳定，并且可以预配制为溶液，备用于注射。
此外，糖尿病患者被鼓励维持接近正常血糖水平以延迟或防止微血管并发症。这个目标的达到通常需要加强的胰岛素治疗。在达到这个目标的努力中，医师已遇到其糖尿病患者的低血糖症的频率与严重性中的相当大增加。因此，需要比目前的胰岛素治疗更不可能诱导低血糖症的改良药物和方法用于治疗糖尿病。
如本文所描述的，提供了显示增强的生物物理学稳定性和水溶解性的高效力胰高血糖素激动剂。这些化合物可以依照一个实施方案用于制备备用于注射的预配制溶液以治疗低血糖症。可替代地，胰高血糖素激动剂可以与胰岛素共施用，以缓冲胰岛素的作用以允许血糖水平更稳定的维持。此外，包含本文公开的经修饰的胰高血糖素肽的组合物的其他有利用途在下文详细描述。
概述
依照一个实施方案，提供了相对于天然胰高血糖素肽，具有改善的溶解性和稳定性以及类似的生物活性的胰高血糖素类似物，所述生物活性包括对胰高血糖素和GLP-1受体类似的或更高的效力和选择性。在一个实施方案中，胰高血糖素类似物具有如天然胰高血糖素至少75％的活性，或至少85％的活性。在一个实施方案中，本发明的胰高血糖素类似物具有超过胰高血糖素的效力。
依照一个实施方案，提供了包含SEQ ID NO：45的胰高血糖素肽或SEQ ID NO：45的胰高血糖素激动剂衍生物的胰高血糖素激动剂，其中所述胰高血糖素肽的位置21或24上的氨基酸残基的侧链进一步包含与氨基酸残基共价结合的亲水性部分。依照一个实施方案，提供了包含选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的胰高血糖素肽，以及SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的胰高血糖素激动剂衍生物的胰高血糖素激动剂，其中所述胰高血糖素肽的位置21或24上的氨基酸残基的侧链进一步包含与氨基酸残基共价结合的亲水性部分。本发明进一步包含所述胰高血糖素激动剂的药学上可接受的盐。依照一个实施方案，胰高血糖素肽选自SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18，且亲水性部分是具有选自约500-约40,000道尔顿的分子量的聚乙二醇链。在一个实施方案中，聚乙二醇链具有选自约500-约5,000道尔顿的分子量。在另一个实施方案中，聚乙二醇链具有至少约20,000道尔顿的分子量。
在另一个实施方案中，提供了包含胰高血糖素肽和聚乙二醇链的胰高血糖素激动剂，其中聚乙二醇链与胰高血糖素肽的残基16、17、20、21、24或29共价结合。本发明还包含所述胰高血糖素激动剂的药学上可接受的盐。在一个实施方案中，聚乙二醇链与胰高血糖素肽的位置21或24共价连接，并且具有选自约500-约40,000道尔顿的分子量。在一个实施方案中，聚乙二醇链与胰高血糖素肽的位置21或24共价连接，并且具有选自约500-约5,000道尔顿的分子量。在另一个实施方案中，聚乙二醇链具有至少约20,000道尔顿的分子量。在一个实施方案中，胰高血糖素肽包含选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18及其胰高血糖素激动剂衍生物的肽。
依照一个实施方案，本文公开的胰高血糖素肽通过给胰高血糖素肽的羧基末端添加第二种肽进行修饰。在一个实施方案中，胰高血糖素肽通过肽键与第二种肽共价结合，其中第二种肽包含选自SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21的序列。在一个实施方案中，经修饰的胰高血糖素肽包含选自SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ IDNO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ IDNO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ IDNO：40和SEQ ID NO：41的肽，其中聚乙二醇链在SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：40的位置21上结合，或在SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：41的位置24上结合，并且具有选自约500-约40,000道尔顿的分子量。
依照一个实施方案，提供了包含本文公开的新型胰高血糖素肽的药物组合物。在一个实施方案中，药物组合物包含灭菌的且包含在各种包装内的溶液。药物组合物可以进一步作为试剂盒的部分包装，所述试剂盒包含用于给患者施用组合物的一次性设备。
依照一个实施方案，提供了使用预配制的水性组合物快速治疗低血糖症的方法。该方法包括施用有效量的水溶液的步骤，所述水溶液包含本公开内容的新型经修饰的胰高血糖素肽。在一个实施方案中，胰高血糖素肽在胰高血糖素肽的位置21或24上进行聚乙二醇化(pegylated)，且PEG链具有约500-约5,000道尔顿的分子量。在一个实施方案中，经修饰的胰高血糖素溶液预包装在设备中，所述设备用于给患有低血糖症的患者施用组合物。
依照一个实施方案，提供了调节胰岛素依赖性患者中的血糖水平的改良方法。该方法包括下述步骤：以对于控制糖尿病治疗上有效的量施用胰岛素，和以对于预防低血糖症治疗上有效的量施用本公开内容的新型经修饰的胰高血糖素肽，其中所述施用步骤在彼此的12小时内进行。在一个实施方案中，胰高血糖素肽和胰岛素作为单一组合物共施用，其中胰高血糖素肽用具有选自约5,000-约40,000道尔顿的分子量的PEG链进行聚乙二醇化。
在另一个实施方案中，提供了用于诱导肠道暂时麻痹的方法。该方法包括给患者施用本文公开的一种或多种聚乙二醇化的胰高血糖素肽的步骤。
在一个实施方案中，提供了减少重量增长或诱导重量减轻的方法。该方法包括施用有效量的包含胰高血糖素激动剂的组合物，其中所述胰高血糖素激动剂包含选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18的胰高血糖素肽，其中胰高血糖素肽的氨基酸29通过肽键与第二种肽结合，且所述第二种肽包含SEQ IDNO：19、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21的序列。在一个实施方案中，胰高血糖素肽是聚乙二醇化的。在一个实施方案中，该方法包括施用包含SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：33的序列的肽的步骤，其中聚乙烯链与SEQ ID NO：24或25的氨基酸位置21，或者在SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：33的位置24上共价连接。
附图简述
图1是表示于37℃分别温育24、48、72、96、144和166小时的胰高血糖素Cys21-马来酰亚胺PEG5K的稳定性的条形图。
图2表示由在pH 5下于37℃分别温育24、72或144小时的胰高血糖素Cys21-马来酰亚胺PEG5K的HPLC分析产生的数据。
详述
定义
在本发明的描述和要求保护中，下述术语将依照下文阐述的定义来使用。
如本文所使用的，术语“药学上可接受的载体”包括标准药学载体中的任何一种，例如磷酸缓冲盐水溶液、水、乳剂如油/水或水/油乳剂、和各种类型的湿润剂。该术语还包含由美国联邦政府的管理机构批准的或在美国药典中列出用于在动物包括人中使用的试剂中的任何一种。
如本文所使用的，术语“药学上可接受的盐”指保留亲本化合物的生物活性，且并非生物学或其他方面不合需要的化合物的盐。由于氨基和/或羧基或与其类似的基团的存在，本文公开的许多化合物能够形成酸式和/或碱式盐。
药学上可接受的碱加成盐可以由无机和有机碱制备。衍生自无机碱的盐包括仅作为例子，钠、钾、锂、铵、钙和镁盐。衍生自有机碱的盐包括但不限于，伯、仲和叔胺的盐。
药学上可接受的酸加成盐可以由无机和有机酸制备。衍生自无机酸的盐包括盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等。衍生自有机酸的盐包括乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、延胡索酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等。
如本文所使用的，术语“治疗”包括特异性病症或状况的预防，或与特异性病症或状况相关的症状的减轻和/或预防或消除所述症状。
如本文所使用的，胰高血糖素肽的“有效”量或“治疗有效量”指肽提供所需作用的无毒但足够的量。例如一个需要的作用将是低血糖症的预防或治疗。“有效的”量将从受试者到受试者而变化，这依赖于个体的年龄和一般状况、施用模式等。因此，并非一直能指定准确的“有效量”。然而，在任何个别情况下合适的“有效”量可以通过本领域普通技术人员使用常规实验进行确定。
术语“肠胃外”意指不通过消化道而是经由某一其他途径如皮下、肌内、脊柱内或静脉内。
如本文所使用的，“胰高血糖素肽”包括如使用实施例13中描述的测定通过cAMP生产测量的，刺激胰高血糖素或GLP-1受体活性的任何肽，其包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列，或SEQ ID NO：1的氨基酸序列的任何衍生物，包括氨基酸置换，或肽的翻译后修饰(例如，甲基化、酰化、遍在蛋白化等)。
术语“胰高血糖素激动剂”指包含胰高血糖素肽的复合物。
如本文所使用的，“胰高血糖素激动剂衍生物”是已进行修饰以包括在位置2、5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、24、27、28或29中的一个或多个上的一个或多个保守氨基酸置换的胰高血糖素肽。
如本文所使用的，氨基酸“置换”指用不同的氨基酸残基替换一个氨基酸残基。
如本文所使用的，术语“保守氨基酸置换”在本文中定义为下述5组之一内的交换：
I.小脂族、非极性或轻微极性残基：
Ala，Ser，Thr，Pro，Gly；
II.极性、带负电荷残基及其酰胺：
Asp，Asn，Glu，Gln；
III.极性、带正电荷残基：
His，Arg，Lys；鸟氨酸(Orn)
IV.大的、脂族、非极性残基：
Met，Leu，Ile，Val，Cys，正亮氨酸(Nle)，高半胱氨酸
V.大的、芳族残基：
Phe，Tyr，Trp，乙酰苯丙氨酸
如本文所使用的，一般术语“聚乙二醇”或“PEG”指由通式H(OCH2CH2)nOH表示的，支链或直链，环氧乙烷和水的缩聚物的混合物，其中n为至少9。不存在任何进一步的表征，该术语意欲包括具有选自500-40,000道尔顿的平均总分子量的乙二醇聚合物。“聚乙二醇”或“PEG”与数字后缀组合使用以指示其近似平均分子量。例如，PEG-5,000指具有约5,000的总分子量平均值的聚乙二醇。
如本文所使用的，术语“聚乙二醇化的”等术语指已通过使聚乙二醇聚合物与化合物连接从其天然状态进行修饰的化合物。“聚乙二醇化的胰高血糖素肽”是具有与胰高血糖素肽共价结合的PEG链的胰高血糖素肽。
如本文所使用的，一般提及肽意欲包含具有经修饰的氨基和羧基末端的肽。例如，包含酰胺基代替末端羧酸的氨基酸链意欲被指定标准氨基酸的氨基酸序列包含。
如本文所使用的，“接头”是使2个分开实体彼此结合的键、分子或分子组。接头可以提供2个实体的最佳间隔，或可以进一步供应允许2个实体彼此分开的不稳定键。不稳定键包括可光致断裂的基团、对酸敏感的部分、对碱敏感的部分和酶可切割的基团。
如本文所使用的，“二聚体”是包含经由接头彼此共价结合的2个亚单位的复合物。当不存在任何限定语言的情况下使用时，术语二聚体包含同二聚体和异二聚体。同二聚体包含2个相同的亚单位，而异二聚体包含不同的2个亚单位，尽管2个亚单位基本上彼此相似。
实施方案
本发明的一个实施方案涉及这样的胰高血糖素激动剂，其相对于His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr(SEQ ID NO：1)的野生型肽已进行修饰，以改善在生理学pH下在水溶液中肽的溶解性和稳定性，同时保留天然肽的生物活性。依照一个实施方案，申请人已发现在天然肽的位置16、17、20、21、24和29上引入亲水基团可以改善所得到的胰高血糖素类似物在具有生理学pH的溶液中的溶解性和稳定性。更具体而言，在一个实施方案中，胰高血糖素肽进行修饰，以包含与胰高血糖素肽的位置21和24上存在的氨基酸的侧链共价连接的一个或多个亲水基团，且在一个实施方案中，亲水基团是PEG。在一个实施方案中，胰高血糖素肽包含选自SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：45的胰高血糖素激动剂衍生物的序列，但须当位置21上的氨基酸是Asp时，位置24上的氨基酸不是Gln，且当位置24上的氨基酸是Gln时，位置21上的氨基酸不是Asp，其中一个或多个亲水基团与胰高血糖素肽的位置21和24上存在的氨基酸的侧链共价连接，且在一个实施方案中，亲水基团是PEG。
依照一个实施方案，SEQ ID NO：1的天然胰高血糖素肽进行修饰以包含在位置16、17、20、21、24和/或29上的一个或多个氨基酸置换，其中天然氨基酸用具有适合于与亲水性部分包括例如PEG交联的侧链的氨基酸置换。天然肽可以用天然存在的氨基酸或合成的(非天然存在的)氨基酸置换。合成的或非天然存在的氨基酸指在体内非天然存在但仍可以掺入本文描述的肽结构内的氨基酸。
在一个实施方案中，提供了胰高血糖素激动剂，其中天然的胰高血糖素肽序列已进行修饰，以包含在天然序列的位置16、17、20、21、24和29中至少一个上的天然存在的或合成的氨基酸，其中氨基酸取代物进一步包含亲水性部分。在一个实施方案中，天然肽的位置16、17、20、21、24和29上的一个或多个氨基酸用选自赖氨酸、半胱氨酸、鸟氨酸、高半胱氨酸和乙酰苯丙氨酸的氨基酸置换，其中置换氨基酸进一步包含与氨基酸的侧链共价结合的亲水性部分。在一个实施方案中，置换在位置21或24上，且在进一步的实施方案中，亲水性部分是PEG链。
在一个实施方案中，天然的胰高血糖素肽用至少一个半胱氨酸残基置换，其中半胱氨酸残基的侧链用硫醇反应试剂进一步修饰，所述硫醇反应试剂包括例如马来酰亚胺、乙烯砜、2-吡啶硫、卤烷基和卤酰基。这些硫醇反应试剂可以包含羧基、酮、羟基和醚基团以及其他亲水性部分如聚乙二醇单位。在可替代的实施方案中，天然的胰高血糖素肽用赖氨酸置换，且置换赖氨酸残基的侧链使用胺反应试剂如羧酸的活性酯(琥珀酰亚胺基、酐等)或亲水性部分如聚乙二醇的醛进一步修饰。
已报道天然胰高血糖素肽的某些位置可以进行修饰，同时保留亲本肽的至少一些活性。因此，位于SEQ ID NO：1的肽的位置2、5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、24、27、28或29上的一个或多个氨基酸可以用与天然胰高血糖素肽中存在的那种不同的氨基酸进行置换，并且仍保留天然胰高血糖素的生物活性。依照一个实施方案，天然肽的位置12上的赖氨酸残基用精氨酸置换，且对于位置16、17、20、21、24或29上存在的氨基酸插入单个赖氨酸置换。在另一个实施方案中，天然肽的位置27上存在的甲硫氨酸残基变成亮氨酸或正亮氨酸以防止肽的氧化降解。
在一个实施方案中，提供了胰高血糖素肽，其包含与位置16、17、20、21、24或29上存在的氨基酸的侧链共价结合的聚乙二醇链，其中胰高血糖素肽进一步包含在选自位置2、5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、24、27、28或29的位置上的1个、2个或3个氨基酸置换。在一个实施方案中，在位置2、5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、27、28或29上的置换是保守氨基酸置换。在一个实施方案中，天然肽的位置16、17、20、21、24或29上存在的氨基酸用半胱氨酸或赖氨酸置换。然而，在一个实施方案中，氨基酸置换(使用天然的或合成的氨基酸)在位置16、17、20、21、24或29上进行，其中置换氨基酸允许PEG链与氨基酸侧链的共价附着。在一个实施方案中，置换在位置21和/或24上进行。
在一个实施方案中，提供在生理学pH下在水溶液中具有优良的稳定性和溶解性的改良的胰高血糖素激动剂。在这个实施方案中，胰高血糖素肽进行修饰，以包含与位于天然肽的位置2、5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、27、28或29上的氨基酸的氨基酸侧链连接的聚乙二醇链。更具体而言，在一个实施方案中，聚乙二醇链与胰高血糖素肽的位置16、17、20、21、24或29上的氨基酸侧链共价结合，在一个实施方案中，聚乙二醇链与位置16、21或24上的氨基酸侧链结合，且在一个实施方案中，聚乙二醇链与氨基酸21或24的侧链共价结合。
聚乙二醇链可以是直链的形式或它可以是分支的。依照一个实施方案，聚乙二醇链具有选自约500-约10,000道尔顿的平均分子量。在一个实施方案中，聚乙二醇链具有选自约1,000-约5,000道尔顿的平均分子量。在一个实施方案中，聚乙二醇链具有选自约2,000-约5,000道尔顿的平均分子量。在一个实施方案中，聚乙二醇链具有选自约4,000-约5,000道尔顿的平均分子量。
依照一个实施方案，经修饰的胰高血糖素肽包含与胰高血糖素肽共价结合的2条或更多聚乙烯链，其中胰高血糖素链的总分子量为约1,000-约5,000道尔顿。在一个实施方案中，聚乙二醇化的胰高血糖素激动剂包含选自SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23的肽，或SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：23的胰高血糖素激动剂衍生物，其中PEG链与位置21上和位置24上的氨基酸残基共价连接，且其中2条PEG链的组合分子量为约1,000-约5,000道尔顿。
依照一个实施方案，提供了包含选自下述的经修饰的胰高血糖素肽的胰高血糖素激动剂：
NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Leu-Asn-Thr(SEQ ID NO：5)
NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Nle-Asn-Thr(SEQ ID NO：44)
NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Xaa-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Xaa-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Xaa-Asn-Thr-R(SEQ ID NO：2)，
NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Xaa-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Xaa-Trp-Leu-Xaa-Asn-Thr-R(SEQ ID NO：3)和
NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Xaa-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Xaa-Phe-Val-Xaa-Trp-Leu-Xaa-Asn-Thr-R(SEQ ID NO：4)，其中位置12上的Xaa＝Lys或Arg，位置21和24上的Xaa独立地选自Lys、Cys、Orn、高半胱氨酸和乙酰苯丙氨酸，位置27上的Xaa＝Met、Leu或Nle，且R是COOH或CONH2，其中肽在关于SEQ ID NO：2的位置21、关于SEQ ID NO：3的位置24、和SEQ ID NO：4的位置21和24上聚乙二醇化。依照一个实施方案，关于SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：3和SEQ ID NO：4的位置27上的Xaa是Leu或Nle。依照一个实施方案，肽包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3。依照一个实施方案，肽包含选自SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ IDNO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17和SEQ IDNO：18的序列，其中肽在关于SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：13、SEQID NO：15和SEQ ID NO：17的位置21上聚乙二醇化，且在关于SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：18的位置24上聚乙二醇化。在一个实施方案中，胰高血糖素激动剂包含SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9的肽。在一个实施方案中，本发明的胰高血糖素肽的末端氨基酸具有酰胺基代替天然氨基酸上存在的羧酸基团。
如实施例中详细描述的，本发明的胰高血糖素激动剂具有增强的生物物理学稳定性和水溶解性，同时保持天然肽的生物活性，就对于胰高血糖素和GLP-1受体的效力和选择性而言。因此，本发明的胰高血糖素激动剂被认为适合于先前已对于天然胰高血糖素肽描述的任何用途。因此，本文描述的经修饰的胰高血糖素肽可以用于治疗低血糖症，诱导肠的暂时麻痹用于放射性用途，减少且维持体重，或治疗起因于胰高血糖素的低血液水平的其他代谢疾病。
本公开内容的一个方面涉及本文公开的胰高血糖素激动剂的预配制的水溶液用于在治疗低血糖症中的用途。本文描述的激动剂组合物的改善的稳定性和溶解性允许制备胰高血糖素预配制的水溶液用于快速施用和治疗低血糖症。在一个实施方案中，提供了包含聚乙二醇化的胰高血糖素激动剂的溶液用于给患有低血糖症的患者施用，其中与聚乙二醇化的胰高血糖素激动剂连接的PEG链的总分子量为约500-约5,000道尔顿。在一个实施方案中，聚乙二醇化的胰高血糖素激动剂包含选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的肽，以及SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的胰高血糖素激动剂衍生物，其中所述胰高血糖素肽的位置21和/或24上的氨基酸残基的侧链与聚乙二醇链共价结合。在一个实施方案中，聚乙二醇化的胰高血糖素激动剂包含SEQ ID NO：2的肽，其中肽的位置21上的氨基酸残基与聚乙二醇共价连接。在一个实施方案中，聚乙二醇化的胰高血糖素激动剂包含SEQ IDNO：3的肽，其中肽的位置24上的氨基酸残基与聚乙二醇共价连接。在另一个实施方案中，聚乙二醇化的胰高血糖素激动剂包含SEQ IDNO：7或SEQ ID NO：8的肽。在进一步的实施方案中，聚乙二醇化的胰高血糖素激动剂包含SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：23的肽，其中PEG链与位置21上和位置24上的氨基酸残基共价连接，其中2条PEG链的组合分子量为约1,000-约5,000道尔顿。
依照本发明治疗低血糖症的方法包括使用任何标准施用途径给患者施用本文公开的胰高血糖素激动剂的步骤，所述施用途径包括肠胃外，例如静脉内、皮下或肌内、经皮、直肠、经口、鼻或经由吸入。在一个实施方案中，该组合物皮下或肌内施用。在一个实施方案中，该组合物肠胃外施用且胰高血糖素组合物预包装在注射器中。在一个实施方案中，待施用以治疗患有低血糖症的个体的胰高血糖素组合物作为2种分开的溶液提供。第一种溶液包含在约4.5-约5.5的pH下在水溶液中的胰高血糖素激动剂。在一个实施方案中，第一种溶液具有约5.0的pH。第二种水溶液在大于7.0的pH下，从而使得当第一种溶液与第二种溶液混合时，所得到的混合物的pH大约在生理学pH下。在一个实施方案中，第一种和第二种溶液混合后，所得到的混合物的pH为约7.4。在一个实施方案中，第一种和第二种溶液包含在注射容器内且经由阀或封闭器彼此分开，其中在阀打开，或封闭器破坏后，2种溶液混合以提供包含胰高血糖素肽和药学上可接受的载体的组合物，其中组合物的pH在生理学可接受的pH下。以这种方式包含2种溶液的容器可以长时间段贮存。在需要时，2种溶液可以进行混合且快速施用于患者。
令人惊讶地，申请人已发现可以制备保留亲本肽的生物活性和特异性的聚乙二醇化的胰高血糖素肽。然而，增加PEG链的长度，或使多条PEG链与肽附着，从而使得连接的PEG的总分子量大于5,000道尔顿，开始延迟经修饰的胰高血糖素的时间作用。依照一个实施方案，提供了胰高血糖素肽，其中肽包含一条或多条聚乙二醇链，其中连接的PEG的总分子量大于5,000道尔顿，且在一个实施方案中，大于10,000道尔顿。此种经修饰的胰高血糖素肽具有延迟时间的活性，而不丧失生物活性。因此，此种化合物可以预防地施用以延长施用的胰高血糖素肽的作用。
在一个实施方案中，聚乙二醇化的胰高血糖素激动剂包含选自SEQID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的肽，以及SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的胰高血糖素激动剂衍生物，其中所述胰高血糖素肽的位置21和/或24上的氨基酸残基的侧链与具有大于约10,000道尔顿的组合分子量的一条或多条聚乙二醇链共价结合，且在一个实施方案中，一条或多条PEG链的分子量大于10,000且小于或等于40,000道尔顿。在一个实施方案中，聚乙二醇化的胰高血糖素激动剂包含SEQ ID NO：2的肽，其中在肽的位置21上的氨基酸残基与具有选自约10,000-约40,000道尔顿的分子量的聚乙二醇链共价连接。在一个实施方案中，聚乙二醇化的胰高血糖素激动剂包含SEQ ID NO：3的肽，且其中在肽的位置24上的氨基酸残基与具有选自约10,000-约40,000道尔顿的分子量的聚乙二醇链共价连接。在另一个实施方案中，聚乙二醇化的胰高血糖素激动剂包含SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的肽，其中共价连接的PEG链具有至少约10,000道尔顿的分子量，且在一个实施方案中，PEG的分子量选自约20,000-约40,000道尔顿。在另一个实施方案中，聚乙二醇化的胰高血糖素激动剂包含SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：23的肽，其中PEG链与位置21上和位置24上的氨基酸残基共价连接，其中2条PEG链的组合分子量为至少约10,000道尔顿。
已进行修饰以与具有大于10,000道尔顿的分子量的PEG链共价结合的胰高血糖素肽可以与胰岛素结合施用，以缓冲胰岛素的作用且帮助维持糖尿病患者中的稳定血糖水平。本公开内容的经修饰的胰高血糖素肽可以作为单一组合物与胰岛素共施用，作为分开的溶液同时施用，或可替代地，胰岛素和经修饰的胰高血糖素肽可以在相对于彼此的不同时间施用。在一个实施方案中，包含胰岛素的组合物和包含经修饰的胰高血糖素肽的组合物在彼此的12小时内施用。经修饰的胰高血糖素肽相对于施用的胰岛素的确切比率将部分依赖于测定患者的胰高血糖素水平，且可以通过常规实验进行测定。
依照一个实施方案，提供了包含胰岛素和经修饰的胰高血糖素肽的水溶液，其中胰高血糖素肽包含与位置16、17、20、21、24或29上的氨基酸侧链共价结合的聚乙二醇链。在一个实施方案中，经修饰的胰高血糖素肽的PEG链的分子量大于10,000道尔顿。在一个实施方案中，聚乙二醇化的胰高血糖素肽包含选自SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的肽，其中所述胰高血糖素肽的位置21或24上的氨基酸残基的侧链与聚乙二醇链共价结合。在一个实施方案中，聚乙二醇化的胰高血糖素激动剂包含SEQ ID NO：2的肽，其中肽的位置21上的氨基酸残基与具有约10,000-约40,000的分子量的聚乙二醇链共价连接。在一个实施方案中，聚乙二醇化的胰高血糖素激动剂包含SEQ ID NO：3的肽，其中肽的位置24上的氨基酸残基与具有约10,000-约40,000的分子量的聚乙二醇链共价连接。在另一个实施方案中，聚乙二醇化的胰高血糖素激动剂包含SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的肽。
本公开内容还包含其中第二种肽已与胰高血糖素肽的C末端融合的胰高血糖素融合肽。更具体而言，融合胰高血糖素肽可以包含SEQ IDNO：1的胰高血糖素激动剂衍生物，其进一步包含与胰高血糖素肽的氨基酸29连接的SEQ ID NO：19(GPSSGAPPPS)、SEQ ID NO：20(KRNRNNIA)或SEQ ID NO：21(KRNR)的氨基酸序列。在一个实施方案中，SEQ ID NO：19(GPSSGAPPPS)、SEQ ID NO：20(KRNRNNIA)或SEQ ID NO：21(KRNR)的氨基酸序列通过肽键与胰高血糖素肽的氨基酸29结合。在一个实施方案中，胰高血糖素融合肽的胰高血糖素肽部分选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18，其中PEG链当存在时选自500-40,000道尔顿。更具体而言，在一个实施方案中，胰高血糖素肽片段选自SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8，其中PEG链选自500-5,000。在一个实施方案中，胰高血糖素融合肽包含SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：23的序列。在一个实施方案中，胰高血糖素融合肽包含SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：33的序列，其中约500-5,000道尔顿的聚乙烯链与SEQ ID NO：24或25的氨基酸位置21，或在SEQ IDNO：32或SEQ ID NO：33的位置24上共价连接。
在一个实施方案中，提供胰高血糖素融合肽，其包含与SEQ ID NO：19(GPSSGAPPPS)或SEQ ID NO：21的序列共价连接的选自下述的序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID N O：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ IDNO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ IDNO：17和SEQ ID NO：18，其中PEG链当存在时选自500-40,000道尔顿。在一个实施方案中，融合肽包含与SEQ ID NO：19(GPSSGAPPPS)或SEQ ID NO：21的序列共价连接的选自下述的胰高血糖素肽：SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18。在另一个实施方案中，融合肽包含与SEQ ID NO：19(GPSSGAPPPS)或SEQ ID NO：21的序列共价连接的选自下述的胰高血糖素肽：SEQ ID NO：7和SEQID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：17和SEQID NO：18。
在一个实施方案中，组合物包含与SEQ ID NO：20(KRNRNNIA)的序列共价连接的选自下述的序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18。在一个实施方案中，融合肽包含与SEQ ID NO：20(KRNRNNIA)的序列共价连接的选自下述的胰高血糖素肽：SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18。在另一个实施方案中，融合肽包含与SEQ ID NO：20(KRNRNNIA)的序列共价连接的选自下述的胰高血糖素肽：SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：17和SEQ IDNO：18。
依照一个实施方案，本文公开的经修饰的胰高血糖素肽用于诱导肠道暂时麻痹。这种方法具有用于放射性目的的效用，并且包括施用有效量的药物组合物的步骤，所述药物组合物包含聚乙二醇化的胰高血糖素肽，包含c-末端突出的胰高血糖素肽或此种肽的二聚体。在一个实施方案中，胰高血糖素肽包含选自下述的序列：SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ IDNO：17和SEQ ID NO：18，其中约1,000-40,000道尔顿的PEG链与位置21或24上的氨基酸残基共价结合。在一个实施方案中，胰高血糖素肽选自SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18。在一个实施方案中，PEG链具有约500-约5,000道尔顿的分子量。
在进一步的实施方案中，用于诱导肠道暂时麻痹的组合物包含第一种经修饰的胰高血糖素肽和第二种经修饰的胰高血糖素肽，其中第一种经修饰的肽包含约500-约5,000道尔顿的共价连接的PEG链，且第二种肽包含约10,000-约40,000道尔顿的共价连接的PEG链。在这个实施方案中，每种肽的PEG链与各自肽的位置21或24上的氨基酸残基共价结合，且不依赖彼此。
在小肠中发现的天然存在的消化激素-泌酸调节肽已报道当施用于大鼠或人时引起重量减轻(参见Diabetes 2005；54：2390-2395)。泌酸调节肽是37氨基酸肽，其包含胰高血糖素(即SEQ ID NO：1)的29氨基酸序列，随后为SEQ ID NO：20的8氨基酸羧基末端突出(KRNRNNIA)。因此，申请人认为通过用本文公开的经修饰的胰高血糖素肽代替泌酸调节肽的胰高血糖素肽部分，可以保留泌酸调节肽的生物活性(即食欲抑制和诱导重量减轻/重量维持)，同时改善化合物的溶解性和稳定性且改善药物代谢动力学。此外，申请人还认为去除了末端4个氨基酸的截短的泌酸调节肽分子在抑制食欲和诱导重量减轻/重量维持方面也是有效的。
因此，本发明还包含本发明的经修饰的胰高血糖素肽，其具有SEQID NO：20(KRNRNNIA)或SEQ ID NO：21的羧基末端突出。依照一个实施方案，将SEQ ID NO：1的胰高血糖素激动剂衍生物施用于个体，以诱导体重减轻或阻止重量增长，所述胰高血糖素激动剂衍生物进一步包含与胰高血糖素肽的氨基酸29连接的SEQ ID NO：20(KRNRNNIA)或SEQ ID NO：21的氨基酸序列。在另一个实施方案中，在个体中减少重量增长或诱导重量减轻的方法包括施用有效量的包含胰高血糖素激动剂的组合物，所述胰高血糖素激动剂包含选自SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：3或SEQ ID NO：4的胰高血糖素肽，其中胰高血糖素肽的氨基酸29通过肽键与第二种肽结合，且所述第二种肽包含SEQ ID NO：20(KRNRNNIA)或SEQ ID NO：21的序列。在一个实施方案中，胰高血糖素激动剂的胰高血糖素肽片段选自SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18，其中约1,000-40,000道尔顿的PEG链与位置21或24上的氨基酸残基共价结合。在一个实施方案中，胰高血糖素肽片段选自SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18，其中PEG链的分子量选自1,000-40,000道尔顿。更具体而言，在一个实施方案中，胰高血糖素融合肽的胰高血糖素肽片段选自SEQ ID NO：7和SEQ IDNO：8，其中PEG链的分子量选自1,000-40,000。在另一个实施方案中，通过施用药物组合物将组合物施用于患者，以抑制食欲、阻止重量增长和/或诱导体重减轻，所述药物组合物包含选自下述的胰高血糖素肽：SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：35。在一个实施方案中，选自SEQID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQID NO：34和SEQ ID NO：35的胰高血糖素肽进一步修饰，以包含与氨基酸位置21或24共价结合的PEG链。在一个实施方案中，PEG链的分子量选自500-5,000道尔顿，且在另一个实施方案中，胰高血糖素肽选自SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：35，其中PEG链的分子量选自10,000-40,000道尔顿。
毒蜥外泌肽-4是由39个氨基酸构成的肽。它是称为GLP-1的受体的有力刺激物。这种肽还报道抑制食欲且诱导重量减轻。申请人已发现毒蜥外泌肽-4的末端序列当在胰高血糖素的羧基末端处添加时，改善胰高血糖素的溶解性和稳定性而不损害胰高血糖素的生物活性。在一个实施方案中，毒蜥外泌肽-4的末端10个氨基酸(即SEQ ID NO：19(GPSSGAPPPS)的序列)与本公开内容的胰高血糖素肽的羧基末端连接。这些融合蛋白预期具有用于抑制食欲且诱导重量减轻/重量维持的药理学活性。在一个实施方案中，SEQ ID NO：19延长的末端氨基酸包含酰胺基代替羧基。
在一个实施方案中，在个体中减少重量增长或诱导重量减轻的方法包括施用有效量的包含胰高血糖素激动剂的组合物，所述胰高血糖素激动剂包含选自下述的胰高血糖素肽：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17和SEQ IDNO：18，其中胰高血糖素肽的氨基酸29通过肽键与第二种肽结合，且所述第二种肽包含SEQ ID NO：19(GPSSGAPPPS)的序列。在一个实施方案中，胰高血糖素激动剂的胰高血糖素肽选自SEQ ID NO：1、SEQID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18，其中当存在时PEG链的分子量选自500-40,000道尔顿。在另一个实施方案中，融合肽的胰高血糖素肽部分包含SEQ IDNO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ IDNO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18，其中约1,000-40,000道尔顿的PEG链与位置21或24上的氨基酸残基共价结合。在一个实施方案中，胰高血糖素肽片段选自SEQ ID NO：7、SEQID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：17和SEQID NO：18，其中当存在时PEG链的分子量选自500-40,000道尔顿。更具体而言，在一个实施方案中，胰高血糖素肽选自SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8，其中PEG链的分子量选自1,000-5,000。
在另一个实施方案中，通过施用药物组合物将组合物施用于患者，以抑制食欲、阻止重量增长和/或诱导体重减轻，所述药物组合物包含第一种聚乙二醇化的胰高血糖素肽和第二种聚乙二醇化的胰高血糖素肽，其中第一种和第二种肽是包含c-末端肽突出的融合肽，所述c-末端肽突出包含SEQ ID NO：19(GPSSGAPPPS)。第一种聚乙二醇化的胰高血糖素肽包含约500-约10,000道尔顿的共价连接的PEG，且第二种聚乙二醇化的胰高血糖素肽包含约10,000-约40,000道尔顿的共价连接的PEG链。
依照一个实施方案，提供了胰高血糖素类似物，其中血浆蛋白质已与胰高血糖素肽的氨基酸侧链共价连接，以改善胰高血糖素肽的溶解性、稳定性和/或药物代谢动力学。例如，血清清蛋白可以与本发明的胰高血糖素或胰高血糖素类似物共价结合。在一个实施方案中，质粒蛋白质与位置16、17、2021、24或29共价结合，且更具体而言，在一个实施方案中，质粒蛋白质在胰高血糖素肽的位置21或24上结合。在一个实施方案中，胰高血糖素肽选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：41。在一个实施方案中，胰高血糖素肽选自SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：41。在一个实施方案中，胰高血糖素肽选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：41。在一个实施方案中，胰高血糖素类似物包含选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的胰高血糖素肽，其中胰高血糖素肽的氨基酸29通过肽键与第二种肽结合，所述第二种肽包含SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21的序列，且血浆蛋白质与位于位置21或24上的氨基酸的侧链结合。
本公开内容还包含本文公开的经修饰的胰高血糖素肽的多聚体。2个或更多经修饰的胰高血糖素肽可以使用本领域技术人员已知的标准连接试剂和程序连接在一起。例如，通过使用双功能硫醇交联剂和双功能胺交联剂，可以在2个经修饰的胰高血糖素肽之间形成二聚体，特别是对于已用半胱氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、高半胱氨酸或乙酰苯丙氨酸残基置换的胰高血糖素肽(例如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3)。二聚体可以是同二聚体或可选择地可以是异二聚体。在一个实施方案中，二聚体包含胰高血糖素融合肽的同二聚体，其中胰高血糖素肽部分包含SEQ ID NO：1的激动剂衍生物，且第二种肽包含与胰高血糖素肽的氨基酸29连接的SEQ ID NO：19(GPSSGAPPPS)、SEQ ID NO：20(KRNRNNIA)或SEQ ID NO：21(KRNR)的氨基酸序列。在另一个实施方案中，二聚体包含SEQ ID NO：1的胰高血糖素激动剂衍生物的同二聚体，其中胰高血糖素肽进一步包含与胰高血糖素肽的位置21或24共价结合的聚乙二醇链。
依照一个实施方案，提供包含经由接头与第二种胰高血糖素肽结合的第一种胰高血糖素肽的二聚体，其中所述第一种胰高血糖素肽选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9，且第二种胰高血糖素肽独立地选自SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9，以及所述胰高血糖素多肽的药学上可接受的盐。在一个实施方案中，第一种胰高血糖素肽选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18，且第二种胰高血糖素肽独立地选自SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18。在一个实施方案中，第一种胰高血糖素肽选自SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8，且第二种胰高血糖素肽独立地选自SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8。
依照一个实施方案，本发明的经修饰的胰高血糖素肽可以作为试剂盒的部分提供。在一个实施方案中，提供了用于给有此需要的患者施用胰高血糖素激动剂的试剂盒，其中试剂盒包含选自下述的经修饰的胰高血糖素肽：1)聚乙二醇化的胰高血糖素肽，其中PEG链与胰高血糖素肽的位置16、17、20、21、24或29共价结合，且PEG链具有约500-约40,000道尔顿的分子量；2)胰高血糖素融合肽，其包含SEQ ID NO：1的胰高血糖素激动剂衍生物，和与胰高血糖素肽的氨基酸29连接的SEQ ID NO：19(GPSSGAPPPS)、SEQ ID NO：20(KRNRNNIA)或SEQ ID NO：21(KRNR)的氨基酸序列；和3)聚乙二醇化的胰高血糖素肽，其进一步包含与胰高血糖素肽的氨基酸29连接的SEQ ID NO：19(GPSSGAPPPS)、SEQ ID NO：20(KRNRNNIA)或SEQ ID NO：21(KRNR)的氨基酸序列，其中与位置16、17、20、21、24或29共价结合的PEG链具有约500-约40,000道尔顿的分子量。在一个实施方案中，试剂盒与用于给患者施用胰高血糖素组合物的设备一起提供。试剂盒可以进一步包括多种容器，例如，小瓶、管、瓶等。优选地，试剂盒还将包括使用说明书。依照一个实施方案，试剂盒的设备是气溶胶分配设备，其中组合物预包装在气溶胶设备内。在另一个实施方案中，试剂盒包含注射器和针，且在一个实施方案中，胰高血糖素组合物预包装在注射器内。
本发明的化合物可以通过标准合成法、重组DNA技术、或制备肽和融合蛋白的任何其他方法进行制备。尽管某些非天然氨基酸不能通过标准重组DNA技术进行表达，但关于其制备的技术是本领域已知的。除了可应用的标准肽化学反应外，包含非肽部分的本发明的化合物可以通过标准有机化学反应来合成。
实施例
一般的合成规程：
使用从0.2毫摩尔Boc Thr(OBzl)Pam树脂开始的HBTU激活的“Fast Boc”单一偶联，在改良的Applied Biosystem 430A肽合成仪上合成胰高血糖素类似物。Boc氨基酸和HBTU得自Midwest Biotech(Fishers、IN)。使用的侧链保护基团是：Arg(Tos)、Asn(Xan)、Asp(OcHex)、Cys(pMeBzl)、His(Bom)、Lys(2Cl-Z)、Ser(OBzl)、Thr(OBzl)、Tyr(2Br-Z)和Trp(CHO)。N末端His上的侧链保护基团是Boc。
每种完成的肽基树脂用溶于二甲基甲酰胺的20％哌啶(piperdine)溶液进行处理，以去除来自色氨酸的甲酰基。液态氟化氢切割在对甲酚和二甲硫的存在下进行。切割在冰浴中使用HF装置(Penninsula Labs)进行1小时。HF蒸发后，将残渣重悬浮于二乙醚中，且过滤固体材料。将每种肽萃取到30-70ml含水乙酸内，且稀释的等分试样通过HPLC[Beckman System Gold，0.46×5cm Zorbax C8，1ml/分钟，45C，214nm，A缓冲液＝0.1％TFA，B＝0.1％TFA/90％乙腈，10％-80％B经过10分钟的梯度]进行分析。
纯化在FPLC上经过2.2×25cm Kromasil C18柱来进行，同时监控214nm处的UV且收集5分钟级分。将均质级分组合且冻干以产生纯度＞95％的产物。正确的分子量和纯度使用MALDI质谱分析加以证实。一般的聚乙二醇化规程：(Cys-马来酰亚胺)
一般地，使胰高血糖素Cys类似物溶解于磷酸缓冲盐水(5-10mg/ml)中，且添加0.01M乙二胺四乙酸(总体积的10-15％)。添加过量的(2倍)马来酰亚胺甲氧基PEG试剂(Nektar)并在室温下搅拌反应物，同时通过HPLC监控反应进展。8-24小时后，使反应混合物酸化且装载到制备型反相柱上用于使用0.1％TFA/乙腈梯度纯化。将合适的级分组合且冻干以产生所需聚乙二醇化的衍生物。
实施例1
胰高血糖素Cys17(1-29)和相似的MonoCys类似物的合成
加入在60ml反应容器中的0.2毫摩尔Boc Thr(OBzl)Pam树脂(SynChem Inc)和下述序列，且使用FastBoc HBTU激活的单一偶联在改良的Applied Biosystems 430A肽合成仪上运行。
HSQGTFTSDYSKYLDSCRAQDFVQWLMNT(SEQ ID NO：28)
使用下述侧链保护基团：Arg(Tos)、Asp(OcHex)、Asn(Xan)、Cys(pMeBzl)、Glu(OcHex)、His(Boc)、Lys(2Cl-Z)、Ser(Bzl)、Thr(Bzl)、Trp(CHO)和Tyr(Br-Z)。完成的肽基树脂用20％哌啶/二甲基甲酰胺进行处理以去除Trp甲酰基保护，随后转移至HF反应容器且在真空中进行干燥。连同磁性搅动棒添加1.0ml对甲酚和0.5ml二甲硫。使容器与HF装置(Pennisula Labs)附着、在干冰/甲醇浴中冷却、抽真空且压缩入约10ml液态氟化氢。使反应在冰浴中搅动1小时，随后在真空中去除HF。将残渣悬浮于乙醚中；过滤固体，用醚洗涤，且将肽萃取到50ml含水乙酸内。使用切割萃取物的小样品运行分析型HPLC[0.46×5cm Zorbax C8，1ml/分钟，45C，214nm，A缓冲液0.1％TFA，B缓冲液0.1％TFA/90％ACN，梯度＝10％B-80％B经过10分钟]。将剩余萃取物装载到2.2×25cm Kromasil C18制备型反相柱上，并且使用Pharmacia FPLC系统运行乙腈梯度。收集5分钟级分同时监控214nm(2.0A)处的UV。A＝0.1％TFA，B＝0.1％TFA/50％乙腈。梯度＝30％B-100％B经过450分钟。
将包含最纯产物(48-52)的级分组合，冷冻且冻干以产生30.1mg。产物的HPLC分析证实＞90％的纯度，且MALDI质谱分析证实3429.7的所需质量。类似地制备胰高血糖素Cys21、胰高血糖素Cys24和胰高血糖素Cys29。
实施例2
胰高血糖素-Cex和其他C末端延长类似物的合成。
将285mg(0.2毫摩尔)甲氧基二苯甲基胺树脂(Midwest Biotech)置于60ml反应容器中且加入下述序列，并且使用FastBoc HBTU激活的单一偶联在改良的Applied Biosystems 430A肽合成仪上运行。
HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTGPSSGAPPPS(SEQ ID NO：29)
使用下述侧链保护基团：Arg(Tos)、Asp(OcHex)、Asn(Xan)、Cys(pMeBzl)、Glu(OcHex)、His(Boc)、Lys(2Cl-Z)、Ser(Bzl)、Thr(Bzl)、Trp(CHO)和Tyr(Br-Z)。完成的肽基树脂用20％哌啶/二甲基甲酰胺进行处理以去除Trp甲酰基保护，随后转移至HF反应容器且在真空中进行干燥。连同磁性搅动棒添加1.0ml对甲酚和0.5ml二甲硫。使容器与HF装置(Pennisula Labs)附着、在干冰/甲醇浴中冷却、抽真空且压缩入约10ml液态氟化氢。使反应在冰浴中搅动1小时，随后在真空中去除HF。将残渣悬浮于乙醚中；过滤固体，用醚洗涤，且将肽萃取到50ml含水乙酸内。对切割萃取物的等分试样运行分析型HPLC[0.46×5cm Zorbax C8，1ml/分钟，45C，214nm，A缓冲液0.1％TFA，B缓冲液0.1％TFA/90％ACN，梯度＝10％B-80％B经过10分钟]。将萃取物装载到2.2×25cm Kromasil C18制备型反相柱上，并且使用Pharmacia FPLC系统运行乙腈梯度用于洗脱。收集5分钟级分同时监控214nm(2.0A)处的UV。A＝0.1％TFA，B＝0.1％TFA/50％乙腈。梯度＝30％B-100％B经过450分钟。将级分58-65组合，冷冻且冻干以产生198.1mg。
产物的HPLC分析显示大于95％的纯度。MALDI质谱分析显示4316.7的所需理论质量的存在，其中产物作为C末端酰胺。从适当装载的PAM-树脂开始将泌酸调节肽和泌酸调节肽-KRNR类似地制备为C末端羧酸。
实施例3
胰高血糖素Cys17Mal-PEG-5K
使15.1mg胰高血糖素Cys17(1-29)和27.3mg平均分子量(avg.M.W.)5000的甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺(mPEG-Mal-5000，NektarTherapeutics)溶解于3.5ml磷酸缓冲盐水(PBS)中，且添加0.5ml 0.01M乙二胺四乙酸(EDTA)。使反应物在室温下搅拌，且通过HPLC分析[0.46×5cm Zorbax C8，1ml/分钟，45C，214nm(0.5A)，A＝0.1％TFA，B＝0.1％TFA/90％ACN，梯度＝10％B-80％B经过10分钟]监控反应进展。
5小时后，将反应混合物装载到2.2×25cm Kromasil C18制备型反相柱上。在Pharmacia FPLC上运行乙腈梯度，同时监控214nm处的UV波长且收集5分钟级分。A＝0.1％TFA，B＝0.1％TFA/50％乙腈，梯度＝30％B-100％B经过450分钟。将对应于产物的级分组合，冷冻且冻干以产生25.9mg。
这种产物在HPLC[0.46×5cm Zorbax C8，1ml/分钟，45C，214nm(0.5A)，A＝0.1％TFA，B＝0.1％TFA/90％ACN，梯度＝10％B-80％B经过10分钟]上进行分析，这显示约90％的纯度。MALDI(基质辅助激光解吸电离)质谱分析显示8700-9500的宽质量范围(一般的PEG衍生物)。这显示约5,000a.m.u.的起始胰高血糖素肽(3429)的质量的添加。
实施例4
胰高血糖素Cys21Mal-PEG-5K
使21.6mg胰高血糖素Cys21(1-29)和24mg mPEG-MAL-5000(NektarTherapeutics)溶解于3.5ml磷酸缓冲盐水(PBS)中，且添加0.5ml 0.01M乙二胺四乙酸(EDTA)。使反应物在室温下搅拌。2小时后，添加另外12.7mg mPEG-MAL-5000。8小时后，将反应混合物装载到2.2×25cmVydac C18制备型反相柱上，并且在Pharmacia FPLC上以4ml/分钟运行乙腈梯度，同时收集5分钟级分。A＝0.1％TFA，B＝0.1％TFA/50％ACN。梯度＝20％-80％B经过450分钟。
将对应于产物外观的级分组合，冷冻且冻干以产生34mg。通过分析型HPLC[0.46×5cm Zorbax C8，1ml/分钟，45C，214nm(0.5A)，A＝0.1％TFA，B＝0.1％TFA/90％ACN，梯度＝10％B-80％B经过10分钟]的产物分析显示与起始胰高血糖素肽不同的均质产物。MALDI(基质辅助激光解吸电离)质谱分析显示8700-9700的宽质量范围(一般的PEG衍生物)。这显示约5,000a.m.u.的起始胰高血糖素肽(3470)的质量的添加。
实施例5
胰高血糖素Cys24Mal-PEG-5K
伴随搅动使20.1mg胰高血糖素C24(1-29)和39.5mg mPEG-Mal-5000(Nektar Therapeutics)溶解于3.5ml PBS中，且添加0.5ml 0.01M EDTA。使反应物在室温下搅拌7小时，随后添加另外40mg mPEG-Mal-5000。约15小时后，将反应混合物装载到2.2×25cm Vydac C18制备型反相柱上，并且使用Pharmacia FPLC运行乙腈梯度。收集5分钟级分同时监控214nm(2.0A)处的UV。A缓冲液＝0.1％TFA，B缓冲液＝0.1％TFA/50％ACN，梯度＝30％B-100％B经过450分钟。将对应于产物的级分组合，冷冻且冻干以产生45.8mg。MALDI质谱分析显示具有在9175.2处的最大值的一般PEG宽信号，这比胰高血糖素C24(3457.8)多约5,000a.m.u.。
实施例6
胰高血糖素Cys24Mal-PEG-20K
伴随搅动在室温下使25.7mg胰高血糖素Cys24(1-29)和40.7mgmPEG-Mal-20K(Nektar Therapeutics)溶解于3.5ml PBS中，且添加0.5ml0.01M EDTA。6小时后，如通过HPLC测定的，原材料与产物的比为约60∶40。添加另外25.1mg mPEG-Mal-20K且允许反应物搅动另外16小时。产物比无显著改善，因此将反应混合物装载到2.2×25cm KromasilC18制备型反相柱上，并且在Pharmacia FPLC上使用30％B-100％B经过450分钟的梯度进行纯化。A缓冲液＝0.1％TFA，B缓冲液＝0.1％TFA/50％ACN，流速＝4ml/分钟，并且收集5分钟级分同时监控214nm(2.0A)处的UV。将包含均质产物的级分组合，冷冻且冻干以产生25.7mg。如通过分析型HPLC测定的，纯度为～90％。MALDI质谱分析显示23,000-27,000的宽峰，这比起始胰高血糖素C24(3457.8)多约20,000a.m.u.。
实施例7
胰高血糖素Cys29Mal-PEG-5K
伴随搅动在室温下使20.0mg胰高血糖素Cys29(1-29)和24.7mgmPEG-Mal-5000(Nektar Therapeutics)溶解于3.5ml PBS中，且添加0.5ml0.01M EDTA。4小时后，添加另外15.6mg mPEG-Mal-5000以驱动反应完成。8小时后，将反应混合物装载到2.2×25cm Vydac C18制备型反相柱上，并且在Pharmacia FPLC系统上运行乙腈梯度。收集5分钟级分同时监控214nm(2.0A)处的UV。A＝0.1％TFA，B＝0.1％TFA/50％ACN。将级分75-97组合，冷冻且冻干以产生40.0mg产物，所述产物不同于在HPLC上回收的原材料(级分58-63)。通过分析型HPLC[0.46×5cmZorbax C8，1ml/分钟，45C，214nm(0.5A)，A＝0.1％TFA，B＝0.1％TFA/90％ACN，梯度＝10％B-80％B经过10分钟]的产物分析显示大于95％的纯度。MALDI质谱分析显示具有8,000-10,000(最大值为9025.3)的质量范围的PEG组分的存在，这比原材料(3484.8)多5,540a.m.u.。
实施例8
胰高血糖素Cys24(2-丁内酯)
向24.7mg胰高血糖素Cys24(1-29)中添加4ml 0.05M碳酸氢铵/50％乙腈和5.5ul 2-溴-4-羟丁酸-γ-内酯溶液(溶于900ul乙腈中的100ul)。在室温下搅动3小时后，向反应混合物中添加另外105ul内酯溶液，将所述反应混合物搅动另外15小时。用10％含水乙酸将反应混合物稀释至10ml且装载到2.2×25cm Kromasil C18制备型反相柱上。在Pharmacia FPLC上运行乙腈梯度(20％B-80％B经过450分钟)，同时收集5分钟级分且监控214nm(2.0A)处的UV。流速＝4ml/分钟，A＝0.1％TFA，B＝0.1％TFA/50％ACN。将级分74-77组合，冷冻且冻干以产生7.5mg。HPLC分析显示95％的纯度，且MALDI质谱分析显示3540.7的质量或超过原材料的84质量单位。这个结果与单个丁内酯部分的添加一致。
分子量＝3541.91 SEQIDNO：30
精确质量＝3536
分子式＝C155H226N42O50S2
实施例9
胰高血糖素Cys24(S-羧甲基)
使18.1mg胰高血糖素Cys24(1-29)溶解于9.4ml 0.1M磷酸钠缓冲液(pH＝9.2)中，且添加0.6ml溴乙酸溶液(溶于乙腈的1.3mg/ml)。使反应物在室温下搅动且通过分析型HPLC跟踪反应进展。1小时后，添加另外0.1ml溴乙酸溶液。使反应物搅动另外60分钟，随后用含水乙酸进行酸化且装载到2.2×25cm Kromasil C18制备型反相柱上用于纯化。在Pharmacia FPLC上运行乙腈梯度(流速＝4ml/分钟)，同时收集5分钟级分且监控214nm(2.0A)处的UV。A＝0.1％TFA，B＝0.1％TFA/50％ACN。将级分26-29组合，冷冻且冻干以产生几mg产物。分析型HPLC显示90％的纯度，且MALDI质谱分析证实关于所需产物3515的质量。
分子量＝3515.87
SEQ ID NO：31
精确质量＝3512
分子式＝C153H224N42O50S2
实施例10
胰高血糖素Cys24马来酰亚胺，PEG-3.4K-二聚体
使16mg胰高血糖素Cys24和1.02mg Mal-PEG-Mal-3400，平均分子量3400的聚乙二醇-双-马来酰亚胺(Nektar Therapeutics)溶解于3.5磷酸缓冲盐水中，且添加0.5ml 0.01M EDTA，并且使反应物在室温下搅拌。16小时后，添加另外16mg胰高血糖素Cys24且继续搅动。约40小时后，将反应混合物装载到Pharmcia PepRPC 16/10柱上，且在Pharmacia FPLC上运行乙腈梯度，同时收集2分钟级分且监控214nm(2.0A)处的UV。流速＝2ml/分钟，A＝0.1％TFA，B＝0.1％TFA/50％ACN。将级分69-74组合，冷冻且冻干以产生10.4mg。分析型HPLC显示90％的纯度，且MALDI质谱分析显示9500-11,000范围中的组分，这与所需二聚体一致。
实施例11
胰高血糖素溶解性测定：
在0.01N HCl中制备胰高血糖素(或类似物)溶液(1mg/ml或3mg/ml)。用0.01N HCl将100ul母液稀释至1ml，且测定UV吸光度(276nm)。使用200-250ul 0.1M Na2HPO4(pH9.2)将剩余母液的pH调整至pH7。允许该溶液于4℃静置过夜随后进行离心。随后用0.01NHCl将100ul上清液稀释至1ml，且测定UV吸光度(一式两份)。
起始吸光度读数补偿体积中的增加并且下述计算用于确立溶解性百分比：
结果显示于表1中，其中胰高血糖素-Cex代表野生型胰高血糖素(SEQ ID NO：1)加SEQ ID NO：19的羧基末端添加，且胰高血糖素-Cex R12代表SEQ ID NO：43加SEQ ID NO：19的羧基末端添加。
表1关于胰高血糖素类似物的溶解性数据
类似物 百分比可溶
胰高血糖素 16
胰高血糖素-Cex，R12 104
胰高血糖素-Cex 87
泌酸调节肽 104
胰高血糖素，Cys17PEG5K 94
胰高血糖素，Cys21PEG5K 105
胰高血糖素，Cys24PEG5K 133
实施例12
胰高血糖素受体结合测定
肽与胰高血糖素受体的亲和力使用闪烁亲近测定技术在竞争结合测定中进行测量。在闪烁亲近测定缓冲液(0.05M Tris-HCl，pH 7.5，0.15M NaCl，0.1％w/v牛血清清蛋白)中制备的肽的系列3倍稀释物在96孔白/清洁底部板(Corning Inc.，Acton，MA)中与下述混合：0.05nM(3-[125I]-碘酪氨酰)Tyr10胰高血糖素(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)，1-6微克/孔，由超表达人胰高血糖素受体的细胞制备的质膜碎片，和1mg/孔聚乙烯亚胺处理的麦胚凝集素A型闪烁亲近测定珠(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)。在旋转振荡器上在800rpm下振荡5分钟后，使板在室温下温育12小时，随后在MicroBeta1450液体闪烁计数器(Perkin-Elmer，Wellesley，MA)上进行读数。非特异性结合的(NSB)放射性在“冷”天然配体的浓度为测试样品中的最高浓度的4倍的孔中进行测量，并且总结合放射性在无竞争剂的孔中进行检测。百分比特异性结合计算如下：特异性结合％＝((结合的-NSB)/(总结合的-NSB))X 100。IC50值通过使用Origin软件(OriginLab，Northampton，MA)进行测定。
实施例13
功能测定-cAMP合成
胰高血糖素类似物诱导cAMP的能力在基于萤火虫萤光素酶的报道分子测定中进行测量。用胰高血糖素或GLP-1受体和与cAMP应答元件连接的萤光素酶基因共转染的HEK293细胞通过在补加有0.25％牛生长血清(HyClone，Logan，UT)的DMEM(Invitrogen，Carlsbad，CA)中培养16小时进行血清除尽，且随后与胰高血糖素、GLP-1或新型胰高血糖素类似物的系列稀释物在37℃、5％CO2下在96孔聚-D-赖氨酸包被的“Biocoat”板(BD Biosciences，San Jose，CA)中温育5小时。温育结束时，向每个孔中加入100微升LucLite发光底物试剂(Perkin-Elmer，Wellesley，MA)。使板简短振荡，在黑暗中温育10分钟，并且在MicroBeta-1450液体闪烁计数器(Perkin-Elmer，Wellesley，MA)上测量光输出。有效50％浓度通过使用Origin软件(OriginLab，Northampton，MA)进行计算。结果显示于表2和3中。
表2
经由具有C-末端突出的胰高血糖素类似物的cAMP诱导
*-实验数目
表3
经由聚乙二醇化的胰高血糖素类似物的cAMP诱导
*-实验数目
实施例14
关于胰高血糖素Cys-马来酰亚胺PEG类似物的稳定性测定
使每种胰高血糖素类似物溶解于水或PBS中，且进行初始HPLC分析。调整pH(4、5、6、7)后，样品于37℃温育经过指定时间段，且通过HPLC再分析以测定肽的完整性。测定特定目的肽的浓度且计算相对于初始分析保持完整的百分比。关于胰高血糖素Cys21-马来酰亚胺PEG5K的结果显示于图1和2中。

Claims (10)

1.由SEQ ID NO：6、7、8或9的序列组成的肽。
2.由两个肽组成的二聚体，其中每个肽由SEQ ID NO：3的序列组成，其中第12位的氨基酸是Lys，第24位的氨基酸是Cys，并且第27位的氨基酸是Met。
3.由SEQ ID NO：1的序列组成的肽，其共价连接到由SEQ ID NO：19或21的序列组成的第二种肽。
4.由SEQ ID NO：43的序列组成的肽。
5.由SEQ ID NO：43的序列组成的肽，其共价连接到由SEQ ID NO：19的序列组成的第二种肽。
6.由SEQ ID NO：1的序列组成的肽，其中存在于SEQ ID NO：1的天然C-末端氨基酸上的羧酸基被酰胺基替代。
7.由SEQ ID NO：39的序列组成的肽，其中第27位的氨基酸是Met。
8.由SEQ ID NO：39的序列组成的肽，其通过第24位的Cys的侧链共价连接到聚乙二醇，其中第27位的氨基酸是Met。
9.由SEQ ID NO：45的序列组成的肽，其中第12位的氨基酸是Arg，第21位的氨基酸是Asp，第24位的氨基酸是Lys，并且第27位的氨基酸是Met。
10.由SEQ ID NO：43的序列组成的肽，其中第20位或第29位的氨基酸被Lys替换。
CN200680050578.1A 2005-11-07 2006-11-06 显示生理学溶解性和稳定性的胰高血糖素类似物 Expired - Fee Related CN101534846B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US73430705P 2005-11-07 2005-11-07
US60/734,307 2005-11-07
PCT/US2006/043334 WO2007056362A2 (en) 2005-11-07 2006-11-06 Glucagon analogs exhibiting physiological solubility and stability

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101534846A CN101534846A (zh) 2009-09-16
CN101534846B true CN101534846B (zh) 2014-11-05

Family

ID=38023925

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200680050578.1A Expired - Fee Related CN101534846B (zh) 2005-11-07 2006-11-06 显示生理学溶解性和稳定性的胰高血糖素类似物

Country Status (7)

Country Link
US (2) US8338368B2 (zh)
EP (2) EP1959986B1 (zh)
CN (1) CN101534846B (zh)
CA (2) CA2628241C (zh)
ES (2) ES2572952T3 (zh)
HK (1) HK1121688A1 (zh)
WO (1) WO2007056362A2 (zh)

Families Citing this family (87)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL160983A0 (en) 2001-09-24 2004-08-31 Imp College Innovations Ltd Use of pyy for preparation of a medicament for modification of feeding behavior
GB0300571D0 (en) 2003-01-10 2003-02-12 Imp College Innovations Ltd Modification of feeding behaviour
EP1959986B1 (en) 2005-11-07 2014-07-23 Indiana University Research and Technology Corporation Glucagon analogs exhibiting physiological solubility and stability
EP2471811B1 (en) 2006-02-22 2015-09-16 Merck Sharp & Dohme Corp. Oxyntomodulin derivatives
TWI428346B (zh) * 2006-12-13 2014-03-01 Imp Innovations Ltd 新穎化合物及其等對進食行為影響
MX2009006564A (es) * 2007-01-05 2009-06-26 Univ Indiana Res & Tech Corp Analogos de glucagon que muestran solubilidad potenciada en amortiguadores a ph fisiologico.
JP6017754B2 (ja) * 2007-02-15 2016-11-02 インディアナ ユニバーシティー リサーチ アンド テクノロジー コーポレーションＩｎｄｉａｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ グルカゴン／ｇｌｐ−１受容体コアゴニスト
EP2217701B9 (en) * 2007-10-30 2015-02-18 Indiana University Research and Technology Corporation Glucagon antagonists
WO2009058734A1 (en) * 2007-10-30 2009-05-07 Indiana University Research And Technology Corporation Compounds exhibiting glucagon antagonist and glp-1 agonist activity
CA2713348C (en) * 2008-01-30 2018-10-09 Indiana University Research And Technology Corporation Ester-based peptide prodrugs
CN103641907A (zh) 2008-06-17 2014-03-19 印第安纳大学研究及科技有限公司 胰高血糖素/glp-1受体共激动剂
KR20110039230A (ko) * 2008-06-17 2011-04-15 인디애나 유니버시티 리서치 앤드 테크놀로지 코퍼레이션 생리학적 ｐＨ 완충액에서 강화된 용해도 및 안정성을 나타내는 글루카곤 유사체
CN104945500B (zh) * 2008-06-17 2019-07-09 印第安纳大学研究及科技有限公司 基于gip的混合激动剂用于治疗代谢紊乱和肥胖症
WO2010070255A1 (en) * 2008-12-15 2010-06-24 Zealand Pharma A/S Glucagon analogues
DK2370461T3 (da) 2008-12-15 2013-12-16 Zealand Pharma As Glucagonanaloger
EA020520B1 (ru) 2008-12-15 2014-11-28 Зилэнд Фарма А/С Аналоги глюкагона
KR20150116912A (ko) * 2008-12-15 2015-10-16 질랜드 파마 에이/에스 글루카곤 유사체
WO2010071807A1 (en) 2008-12-19 2010-06-24 Indiana University Research And Technology Corporation Amide based glucagon superfamily peptide prodrugs
CA2765026A1 (en) * 2009-06-16 2010-12-23 Indiana University Research And Technology Corporation Gip receptor-active glucagon compounds
EA022816B1 (ru) 2009-07-13 2016-03-31 Зилэнд Фарма А/С Ацилированные аналоги глюкагона
EP2512503A4 (en) 2009-12-18 2013-08-21 Univ Indiana Res & Tech Corp COAGONISTS OF GLUCAGON / GLP-1 RECEPTOR
AR079345A1 (es) 2009-12-22 2012-01-18 Lilly Co Eli Analogo peptidico de oxintomodulina
AR079344A1 (es) 2009-12-22 2012-01-18 Lilly Co Eli Analogo peptidico de oxintomodulina, composicion farmaceutica que lo comprende y uso para preparar un medicamento util para tratar diabetes no insulinodependiente y/u obesidad
EP2528618A4 (en) 2010-01-27 2015-05-27 Univ Indiana Res & Tech Corp GLUCAGON ANTAGONISTE AND GIP AGONISTS CONJUGATES AND COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF METABOLISM DISEASES AND ADIPOSITAS
EP2552950A1 (en) 2010-03-26 2013-02-06 Novo Nordisk A/S Novel glucagon analogues
US20130053310A1 (en) 2010-03-26 2013-02-28 Novo Nordisk A/S Novel glucagon analogues
KR20130062931A (ko) 2010-05-13 2013-06-13 인디애나 유니버시티 리서치 앤드 테크놀로지 코퍼레이션 핵 호르몬 수용체 활성을 나타내는 글루카곤 슈퍼패밀리 펩티드
EP2568993A4 (en) 2010-05-13 2014-02-19 Univ Indiana Res & Tech Corp GLUCAGON SUPERFAMILY PEPTIDES WITH G-PROTEIN-COUPLED RECEPTOR ACTIVITY
UY33462A (es) 2010-06-23 2012-01-31 Zealand Pharma As Analogos de glucagon
EP2585482B1 (en) 2010-06-24 2019-03-27 Zealand Pharma A/S Glucagon analogues
WO2011163012A2 (en) 2010-06-24 2011-12-29 Indiana University Research And Technology Corporation Amide based glucagon superfamily peptide prodrugs
CA2816114C (en) 2010-11-03 2019-02-12 Jan Jezek Novel composition comprising glucagon
MX2013006304A (es) 2010-12-22 2013-07-02 Univ Indiana Res & Tech Corp Analogos de glucagon que exhiben actividad del receptor gip.
AU2012234276A1 (en) 2011-03-28 2013-08-29 Novo Nordisk A/S Novel glucagon analogues
CN103857408B (zh) 2011-06-22 2017-04-12 印第安那大学科技研究公司 胰高血糖素/glp‑1受体协同激动剂
RU2014101697A (ru) 2011-06-22 2015-07-27 Индиана Юниверсити Рисерч Энд Текнолоджи Корпорейшн Коагонисты рецепторов глюкагона/glp-1
EP2729493B1 (en) 2011-07-04 2020-06-10 IP2IPO Innovations Limited Novel compounds and their effects on feeding behaviour
TWI596110B (zh) 2011-09-23 2017-08-21 諾佛 儂迪克股份有限公司 新穎升糖素類似物
KR20140097151A (ko) 2011-11-17 2014-08-06 인디애나 유니버시티 리서치 앤드 테크놀로지 코퍼레이션 글루코코르티코이드 수용체 활성을 나타내는 글루카곤 슈퍼패밀리 펩티드
TWI689515B (zh) 2012-05-03 2020-04-01 丹麥商西蘭製藥公司 Ｇｉｐ-ｇｌｐ-１雙重促效劑化合物及方法
TWI599575B (zh) 2012-06-21 2017-09-21 印第安納大學科技研究公司 表現ｇｉｐ受體活性之胰高血糖素類似物
AU2013295035B2 (en) * 2012-07-23 2017-08-03 Zealand Pharma A/S Glucagon analogues
GB2505941A (en) * 2012-09-17 2014-03-19 Imp Innovations Ltd Peptide analogues of glucagon for the treatment of obesity and diabetes
US9546205B2 (en) 2012-09-17 2017-01-17 Imperial Innovations Limited Peptide analogues of glucagon and GLP1
TWI608013B (zh) 2012-09-17 2017-12-11 西蘭製藥公司 升糖素類似物
UA116217C2 (uk) 2012-10-09 2018-02-26 Санофі Пептидна сполука як подвійний агоніст рецепторів glp1-1 та глюкагону
EP2934566B1 (en) 2012-12-21 2017-06-21 Sanofi Exendin-4 derivatives as dual glp1/gip or trigonal glp1/gip/glucagon agonists
CA2904332A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 Indiana University Research And Technology Corporation Insulin-incretin conjugates
RS59124B1 (sr) 2013-04-18 2019-09-30 Novo Nordisk As Stabilni, produženi koagonisti glp-1/glukagonskih receptora za medicinsku upotrebu
CN103333238A (zh) * 2013-06-18 2013-10-02 华东师范大学 一种mPEG-MAL-aGLP-1复合物
WO2014205617A1 (en) * 2013-06-24 2014-12-31 Shandong University Lanthanide labeled peptide and use thereof
KR102394515B1 (ko) 2013-10-17 2022-05-09 질랜드 파마 에이/에스 아실화된 글루카곤 유사체
US9988429B2 (en) 2013-10-17 2018-06-05 Zealand Pharma A/S Glucagon analogues
KR102310392B1 (ko) 2013-11-06 2021-10-13 질랜드 파마 에이/에스 글루카곤-ｇｌｐ-1-ｇｉｐ 삼원 효능제 화합물
CA2929459C (en) 2013-11-06 2022-05-03 Zealand Pharma A/S Gip-glp-1 dual agonist compounds and methods
EP3080149A1 (en) 2013-12-13 2016-10-19 Sanofi Dual glp-1/glucagon receptor agonists
WO2015086729A1 (en) 2013-12-13 2015-06-18 Sanofi Dual glp-1/gip receptor agonists
WO2015086730A1 (en) 2013-12-13 2015-06-18 Sanofi Non-acylated exendin-4 peptide analogues
WO2015086728A1 (en) 2013-12-13 2015-06-18 Sanofi Exendin-4 peptide analogues as dual glp-1/gip receptor agonists
US9963496B2 (en) 2014-02-18 2018-05-08 Novo Nordisk A/S Stable glucagon analogues and use for treatment of hypoglycaemia
TW201625669A (zh) 2014-04-07 2016-07-16 賽諾菲公司 衍生自艾塞那肽－４（Ｅｘｅｎｄｉｎ－４）之肽類雙重ＧＬＰ－１／升糖素受體促效劑
TW201625668A (zh) 2014-04-07 2016-07-16 賽諾菲公司 作為胜肽性雙重ｇｌｐ－１／昇糖素受體激動劑之艾塞那肽－４衍生物
TW201625670A (zh) 2014-04-07 2016-07-16 賽諾菲公司 衍生自ｅｘｅｎｄｉｎ－４之雙重ｇｌｐ－１／升糖素受體促效劑
EP3151852A1 (en) 2014-06-04 2017-04-12 Novo Nordisk A/S Glp-1/glucagon receptor co-agonists for medical use
US9932381B2 (en) 2014-06-18 2018-04-03 Sanofi Exendin-4 derivatives as selective glucagon receptor agonists
CN108271356A (zh) 2014-09-24 2018-07-10 印第安纳大学研究及科技有限公司 肠降血糖素-胰岛素缀合物
CR20170164A (es) 2014-10-24 2017-08-29 Merck Sharp & Dohme Coagonistas de los receptores de glucagón y de glp-1
DK3212218T3 (da) 2014-10-29 2021-08-30 Zealand Pharma As GIP-agonistforbindelser og fremgangsmåder
US10046058B2 (en) 2014-12-02 2018-08-14 Rezolute, Inc. Use of hydrophobic organic acids to increase hydrophobicity of proteins and protein conjugates
PL3283507T3 (pl) 2015-04-16 2020-05-18 Zealand Pharma A/S Acylowany analog glukagonu
KR20180015131A (ko) 2015-06-04 2018-02-12 안트리아바이오 인크. 부위-특이적 단백질 콘쥬게이트의 제조를 위한 아민 페길화 방법
AR105319A1 (es) 2015-06-05 2017-09-27 Sanofi Sa Profármacos que comprenden un conjugado agonista dual de glp-1 / glucagón conector ácido hialurónico
EP3310373A4 (en) 2015-06-22 2019-02-13 University of Utah Research Foundation Thiol-ene based peptide stapling and uses thereof
AR105284A1 (es) 2015-07-10 2017-09-20 Sanofi Sa Derivados de exendina-4 como agonistas peptídicos duales específicos de los receptores de glp-1 / glucagón
CN113546159B (zh) * 2015-12-29 2023-09-08 派格生物医药(苏州)股份有限公司 包含glp-1受体激动剂和胰高血糖素受体激动剂的组合物及其用途
GB201611077D0 (en) 2016-06-24 2016-08-10 Arecor Ltd Novel composition
WO2018017485A1 (en) 2016-07-17 2018-01-25 University Of Utah Research Foundation Thiol-yne based peptide stapling and uses thereof
TW201832783A (zh) 2016-12-02 2018-09-16 法商賽諾菲公司 包含ｇｌｐ－１／胰高血糖素雙重激動劑、連接子和透明質酸的接合物
JP7046990B2 (ja) * 2017-06-29 2022-04-04 ユレカ・ソシエテ・ア・レスポンサビリテ・リミテ 医薬的特性が改善されたプロドラッグペプチド
CN109836488B (zh) * 2017-11-24 2022-08-23 浙江道尔生物科技有限公司 一种治疗代谢疾病的胰高血糖素类似物
JP2018090636A (ja) * 2018-03-15 2018-06-14 インペリアル・イノベイションズ・リミテッド 新規化合物及び摂食行動に対するそれらの効果
JP2022526716A (ja) * 2019-03-15 2022-05-26 パーデュー・リサーチ・ファウンデーション 耐酸化性を有する修飾グルカゴン分子および製剤、ならびにそれらを使用する方法およびキット
CN114853908B (zh) 2019-05-16 2024-06-07 浙江道尔生物科技有限公司 一种治疗代谢疾病的融合蛋白
CN110845601B (zh) * 2019-10-12 2021-01-19 广东药科大学 不同构型的glp-1类似肽修饰二聚体及其制备方法在治疗ii型糖尿病中的应用
EP4329812A1 (en) 2021-04-27 2024-03-06 Aardvark Therapeutics Inc. Combination of bitter receptor agonist and gut-signaling compound
GB202109087D0 (en) 2021-06-24 2021-08-11 Norwegian Univ Sci & Tech Ntnu Therapeutic methods and devices
CN115634285A (zh) * 2021-07-20 2023-01-24 派格生物医药(苏州)股份有限公司 多肽缀合物在制备治疗糖代谢相关疾病的药物中的应用

Family Cites Families (121)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4275152A (en) * 1977-02-03 1981-06-23 Eastman Kodak Company Hydrolysis of protein-bound cholesterol esters
PT83613B (en) 1985-10-28 1988-11-21 Lilly Co Eli Process for the selective chemical removal of a protein amino-terminal residue
ES2075196T3 (es) 1989-02-17 1995-10-01 Chiron Mimotopes Pty Ltd Metodo para el uso y la sintesis de peptidos.
US5545618A (en) 1990-01-24 1996-08-13 Buckley; Douglas I. GLP-1 analogs useful for diabetes treatment
DK0512042T3 (da) 1990-01-24 1998-05-11 Douglas I Buckley GLP-1-analoger anvendelige ved diabetesbehandling
CA2024855C (en) 1990-09-07 1997-12-09 Boehringer Ingelheim (Canada) Ltd./ Boehringer Ingelheim (Canada) Ltee Process and intermediates for producing glucagon
JPH04145099A (ja) 1990-10-05 1992-05-19 Sanwa Kagaku Kenkyusho Co Ltd Ｇｉｐ様活性を有するポリペプチド誘導体及びその用途
US5510459A (en) * 1991-01-17 1996-04-23 Zymogenetics, Inc. Glucagon antagonists
US5359030A (en) * 1993-05-10 1994-10-25 Protein Delivery, Inc. Conjugation-stabilized polypeptide compositions, therapeutic delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same
US5480867A (en) * 1993-12-29 1996-01-02 The Rockefeller University Glucagon analogs with serine replacements
GB9410469D0 (en) * 1994-05-25 1994-07-13 Erba Farmitalia Imidazolylalkyl derivatives of imidazo (5,1-c) (1,4) benzoxazin-1-one and process for their preparation
US5512549A (en) * 1994-10-18 1996-04-30 Eli Lilly And Company Glucagon-like insulinotropic peptide analogs, compositions, and methods of use
US5869602A (en) * 1995-03-17 1999-02-09 Novo Nordisk A/S Peptide derivatives
DE19530865A1 (de) 1995-08-22 1997-02-27 Michael Dr Med Nauck Wirkstoff sowie Mittel zur parenteralen Ernährung
EP0879279A4 (en) 1996-02-06 2000-07-12 Lilly Co Eli DIABETE TREATMENT
US6767887B1 (en) 1996-06-05 2004-07-27 Roche Diagnostics Gmbh Exendin analogues, processes for their preparation and medicaments containing them
KR20000036015A (ko) 1996-09-09 2000-06-26 스타이니스 에바 알파-히드록시산 링커를 함유하는 펩티드 프로드럭
UA65549C2 (uk) * 1996-11-05 2004-04-15 Елі Ліллі Енд Компані Спосіб регулювання ожиріння шляхом периферійного введення аналогів та похідних glp-1 (варіанти) та фармацевтична композиція
AU5518798A (en) 1996-12-03 1998-06-29 Trustees Of Boston University Specific antagonists for glucose-dependent insulinotropic polypeptide (gip)
CA2321026A1 (en) 1998-03-09 1999-09-16 Zealand Pharmaceuticals A/S Pharmacologically active peptide conjugates having a reduced tendency towards enzymatic hydrolysis
DE19828113A1 (de) 1998-06-24 2000-01-05 Probiodrug Ges Fuer Arzneim Prodrugs von Inhibitoren der Dipeptidyl Peptidase IV
US20030236190A1 (en) * 1998-09-02 2003-12-25 Renuka Pillutla Isulin and IGF-1 receptor agonists and antagonists
EP1119625B1 (en) 1998-10-07 2005-06-29 Medical College Of Georgia Research Institute, Inc. Glucose-dependent insulinotropic peptide for use as an osteotropic hormone
JP3702181B2 (ja) 1998-12-07 2005-10-05 ソシエテ・ドゥ・コンセイユ・ドゥ・ルシェルシュ・エ・ダプリカーション・シャンティフィック・エス・ア・エス Ｇｌｐ−１の類似体
AU3033500A (en) 1999-01-15 2000-08-01 Agouron Pharmaceuticals, Inc. Non-peptide glp-1 agonists
ES2225107T3 (es) 1999-03-29 2005-03-16 Uutech Limited Analogos del peptido inhibidor gastrico y su uso para el tratamiento de la diabetes.
GB0404124D0 (en) 2004-02-25 2004-03-31 Univ Ulster Antagonists of GIP
US6458493B2 (en) * 1999-06-04 2002-10-01 International Business Machines Corporation Method to control nested to isolated line printing
WO2001081919A2 (en) 2000-04-27 2001-11-01 Bionebraska, Inc. Gastric inhibitory polypeptide diagnostic test for detecting susceptibility to type-2 diabetes, impaired glucose tolerance, or impaired fasting glucose
US6677136B2 (en) 2000-05-03 2004-01-13 Amgen Inc. Glucagon antagonists
US20030021795A1 (en) * 2000-06-14 2003-01-30 Houston Michael E. Use of coiled-coil structural scaffold to generate structure-specific peptides
DK1695983T3 (da) 2000-06-16 2009-05-18 Lilly Co Eli Glucagon-lignende peptid-1 analoger
EP1305338A2 (en) * 2000-08-02 2003-05-02 Theratechnologies Inc. Modified peptides with increased potency
US6528520B2 (en) 2000-08-15 2003-03-04 Cpd, Llc Method of treating the syndrome of coronary heart disease risk factors in humans
US20020045572A1 (en) 2000-08-15 2002-04-18 Cpd, Llc Method of treating the syndrome of type 2 diabetes in humans
US6846831B2 (en) 2000-08-15 2005-01-25 Cpd, Llc Method of treating the syndrome of lipodystrophy
US6262062B1 (en) 2000-08-15 2001-07-17 Cpd, Llc Method of treating the syndrome of coronary heart disease risk factors in humans
EP1324779B1 (en) * 2000-09-29 2011-07-20 Schering Corporation Pegylated interleukin-10
US7199217B2 (en) 2000-12-13 2007-04-03 Eli Lilly And Company Amidated glucagon-like peptide-1
DE60228972D1 (de) 2001-07-31 2008-10-30 Us Gov Health & Human Serv Glp 1 exendin 4 peptidanaloga und deren verwendungen
JP2005509409A (ja) * 2001-08-08 2005-04-14 ジェンザイム・コーポレーション 糖尿病および他の血糖疾患の治療方法
WO2003020201A2 (en) 2001-08-28 2003-03-13 Eli Lilly And Company Pre-mixes of glp-1 and basal insulin
GB0121709D0 (en) * 2001-09-07 2001-10-31 Imp College Innovations Ltd Food inhibition agent
AR036711A1 (es) * 2001-10-05 2004-09-29 Bayer Corp Peptidos que actuan como agonistas del receptor del glp-1 y como antagonistas del receptor del glucagon y sus metodos de uso farmacologico
US7041646B2 (en) 2001-10-05 2006-05-09 Bayer Pharmaceuticals Corporation Methods of treating type 2 diabetes with peptides acting as both GLP-1 receptor agonists and glucagon receptor antagonists
RU2353625C2 (ru) 2001-10-18 2009-04-27 Бристол-Маерс Сквибб Компани Миметики человеческого глюканоподобного пептида-1 и их применение в лечении диабета и родственных состояний
US7179788B2 (en) 2001-10-19 2007-02-20 Eli Lilly And Company Biphasic mixtures of GLP-1 and insulin
WO2003059378A2 (en) 2001-12-29 2003-07-24 Novo Nordisk A/S Combined use of a glp-1 compound and another drug for treating dyslipidemia
JP4282485B2 (ja) 2002-01-08 2009-06-24 イーライ リリー アンド カンパニー 伸長グルカゴン様ペプチド−１アナログ
US20030232761A1 (en) 2002-03-28 2003-12-18 Hinke Simon A. Novel analogues of glucose-dependent insulinotropic polypeptide
US20060252916A1 (en) * 2002-06-04 2006-11-09 Eli Lilly And Company Modified glucagon-like peptide-1 analogs
AU2003237933A1 (en) 2002-06-11 2003-12-22 Cellartis Ab Use of compounds having gip activity for the treatment of disorders associated with abnormal loss of cells and/or for the treatment of obesity
CA2489323A1 (en) 2002-06-15 2003-12-24 Enteromed, Inc. Treatment of non-alcoholic fatty liver disease
EP1539210A4 (en) * 2002-09-06 2006-06-07 Bayer Pharmaceuticals Corp GLP-1 RECEPTOR MODIFIED AGONISTS AND THEIR PHARMACOLOGICAL METHODS OF USE
US7192922B2 (en) * 2002-11-19 2007-03-20 Allegheny-Singer Research Institute Method of treating left ventricular dysfunction
EP1578437A4 (en) * 2002-12-27 2006-08-09 Diobex Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR PREVENTING AND REDUCING INSULIN-INDUCED HYPOGLYCEMIA
US20050059605A1 (en) 2003-01-31 2005-03-17 Krishna Peri Chemically modified metabolites of regulatory peptides and methods of producing and using same
EP1626981A4 (en) 2003-03-04 2006-11-22 Biorexis Pharmaceutical Corp PROTEINS PROTECTED AGAINST DIPEPTIDYLPEPTIDASE
MXPA05009940A (es) 2003-03-19 2005-12-05 Lilly Co Eli Compuestos de glp-1 de enlace de glicol polietilenico.
WO2004089280A2 (en) * 2003-04-08 2004-10-21 Yeda Research And Development Co. Ltd. Reversible pegylated drugs
EP1633384B1 (en) 2003-05-15 2012-03-14 Trustees Of Tufts College Stable analogs of glp-1
EP1633391B1 (en) 2003-06-03 2011-10-19 Novo Nordisk A/S Stabilized pharmaceutical peptide compositions
MXPA05013048A (es) 2003-06-03 2006-03-02 Novo Nordisk As Composiciones peptodicas farmaceuticas estabilizadas.
AU2004251145C1 (en) * 2003-06-12 2011-04-14 Eli Lilly And Company GLP-1 analog fusion proteins
WO2004111078A2 (en) * 2003-06-18 2004-12-23 Theratechnologies Inc. Compounds that modulate the glucagon response and uses thereof
AU2004273573B2 (en) * 2003-09-19 2010-04-22 Novo Nordisk A/S Albumin-binding derivatives of therapeutic peptides
US7364875B2 (en) * 2003-10-30 2008-04-29 Cresent Innovations, Inc. Method for producing medical and commercial grade poly-gamma-glutamic acid of high molecular weight
KR20060135661A (ko) * 2003-12-18 2006-12-29 노보 노르디스크 에이/에스 신규 ｇｌｐ-1 화합물
US20060286129A1 (en) * 2003-12-19 2006-12-21 Emisphere Technologies, Inc. Oral GLP-1 formulations
US20080318837A1 (en) * 2003-12-26 2008-12-25 Nastech Pharmaceutical Company Inc. Pharmaceutical Formation For Increased Epithelial Permeability of Glucose-Regulating Peptide
US7442682B2 (en) 2004-10-19 2008-10-28 Nitto Denko Corporation Transepithelial delivery of peptides with incretin hormone activities
US8263545B2 (en) 2005-02-11 2012-09-11 Amylin Pharmaceuticals, Inc. GIP analog and hybrid polypeptides with selectable properties
SG159551A1 (en) * 2005-02-11 2010-03-30 Amylin Pharmaceuticals Inc Gip analog and hybrid polypeptides with selectable properties
WO2006097536A2 (en) * 2005-03-18 2006-09-21 Novo Nordisk A/S Dimeric peptide agonists of the glp-1 receptor
WO2006121904A1 (en) 2005-05-06 2006-11-16 Bayer Pharmaceuticals Corporation Glucose-dependent insulinotropic polypeptide (gip) receptor agonists and their pharmacological methods of use
EA012442B1 (ru) 2005-05-13 2009-10-30 Эли Лилли Энд Компани Пегилированные соединения glp-1
PT1891105E (pt) 2005-06-13 2012-06-27 Imp Innovations Ltd Análogos de oxintomodulina e seus efeitos sobre o comportamento da alimentação
EP1922336B1 (en) 2005-08-11 2012-11-21 Amylin Pharmaceuticals, LLC Hybrid polypeptides with selectable properties
WO2007028632A2 (en) 2005-09-08 2007-03-15 Uutech Limited Analogs of gastric inhibitory polypeptide as a treatment for age related decreased pancreatic beta cell function
CA2622069A1 (en) 2005-09-08 2007-03-15 Uutech Limited Treatment of diabetes related obesity
EP1959986B1 (en) 2005-11-07 2014-07-23 Indiana University Research and Technology Corporation Glucagon analogs exhibiting physiological solubility and stability
EP2471811B1 (en) 2006-02-22 2015-09-16 Merck Sharp & Dohme Corp. Oxyntomodulin derivatives
JP5312054B2 (ja) * 2006-03-15 2013-10-09 ノボ・ノルデイスク・エー／エス アミリンとインスリンの混合物
JP5412273B2 (ja) 2006-03-21 2014-02-12 アミリン・ファーマシューティカルズ，リミテッド・ライアビリティ・カンパニー ペプチド−ぺプチダーゼ阻害剤及びその使用
CA2648936C (en) 2006-04-20 2013-07-09 Amgen Inc. Glp-1 compounds
WO2008022015A2 (en) 2006-08-11 2008-02-21 Trustees Of Tufts College Retro-inverso incretin analogues, and methods of use thereof
CA2660835A1 (en) 2006-08-17 2008-02-21 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Dpp-iv resistant gip hybrid polypeptides with selectable propperties
US20090318353A1 (en) 2006-08-25 2009-12-24 Novo Nordisk A/S Acylated Exendin-4 Compounds
EP2615108B1 (en) 2006-09-08 2016-10-26 Ambrx, Inc. Modified human plasma polypeptide or fc scaffolds and thier uses
WO2008076933A2 (en) 2006-12-14 2008-06-26 Bolder Biotechnology, Inc. Long acting proteins and peptides and methods of making and using the same
MX2009006564A (es) * 2007-01-05 2009-06-26 Univ Indiana Res & Tech Corp Analogos de glucagon que muestran solubilidad potenciada en amortiguadores a ph fisiologico.
JP6017754B2 (ja) 2007-02-15 2016-11-02 インディアナ ユニバーシティー リサーチ アンド テクノロジー コーポレーションＩｎｄｉａｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ グルカゴン／ｇｌｐ−１受容体コアゴニスト
EP2158214B1 (en) 2007-06-15 2011-08-17 Zealand Pharma A/S Glucagon analogues
WO2009030774A1 (en) 2007-09-05 2009-03-12 Novo Nordisk A/S Truncated glp-1 derivatives and their therapeutical use
WO2009030738A1 (en) 2007-09-05 2009-03-12 Novo Nordisk A/S Glucagon-like peptide-1 derivatives and their pharmaceutical use
EP2650006A1 (en) 2007-09-07 2013-10-16 Ipsen Pharma S.A.S. Analogues of exendin-4 and exendin-3
EP2036923A1 (en) 2007-09-11 2009-03-18 Novo Nordisk A/S Improved derivates of amylin
CN101854948A (zh) 2007-09-11 2010-10-06 诺沃-诺迪斯克有限公司 含有胰岛淀粉样多肽类和长效胰岛素的合剂
EP2036539A1 (en) 2007-09-11 2009-03-18 Novo Nordisk A/S Stable formulations of amylin and its analogues
WO2009058734A1 (en) * 2007-10-30 2009-05-07 Indiana University Research And Technology Corporation Compounds exhibiting glucagon antagonist and glp-1 agonist activity
EP2217701B9 (en) 2007-10-30 2015-02-18 Indiana University Research and Technology Corporation Glucagon antagonists
JP2011503000A (ja) 2007-11-02 2011-01-27 セントコア・オーソ・バイオテツク・インコーポレーテツド 半合成ＧＬＰ−１ペプチド−Ｆｃ融合コンストラクト、その方法及び使用
CA2713348C (en) 2008-01-30 2018-10-09 Indiana University Research And Technology Corporation Ester-based peptide prodrugs
WO2009095479A2 (en) 2008-02-01 2009-08-06 Ascendis Pharma As Prodrug comprising a self-cleavable linker
CN104945500B (zh) 2008-06-17 2019-07-09 印第安纳大学研究及科技有限公司 基于gip的混合激动剂用于治疗代谢紊乱和肥胖症
KR20110039230A (ko) 2008-06-17 2011-04-15 인디애나 유니버시티 리서치 앤드 테크놀로지 코퍼레이션 생리학적 ｐＨ 완충액에서 강화된 용해도 및 안정성을 나타내는 글루카곤 유사체
CN103641907A (zh) * 2008-06-17 2014-03-19 印第安纳大学研究及科技有限公司 胰高血糖素/glp-1受体共激动剂
MX2011006527A (es) 2008-12-19 2011-08-17 Univ Indiana Res & Tech Corp Agentes medicinales unidos a dipeptido.
WO2010071807A1 (en) * 2008-12-19 2010-06-24 Indiana University Research And Technology Corporation Amide based glucagon superfamily peptide prodrugs
WO2010096052A1 (en) 2009-02-19 2010-08-26 Merck Sharp & Dohme Corp. Oxyntomodulin analogs
CA2753121A1 (en) 2009-02-20 2010-08-26 Cdg Therapeutics, Inc. Compositions and methods to prevent and/or treat cancer with pa-card
CA2765026A1 (en) 2009-06-16 2010-12-23 Indiana University Research And Technology Corporation Gip receptor-active glucagon compounds
EP2512503A4 (en) 2009-12-18 2013-08-21 Univ Indiana Res & Tech Corp COAGONISTS OF GLUCAGON / GLP-1 RECEPTOR
AR079344A1 (es) 2009-12-22 2012-01-18 Lilly Co Eli Analogo peptidico de oxintomodulina, composicion farmaceutica que lo comprende y uso para preparar un medicamento util para tratar diabetes no insulinodependiente y/u obesidad
AR079345A1 (es) 2009-12-22 2012-01-18 Lilly Co Eli Analogo peptidico de oxintomodulina
EP2528618A4 (en) 2010-01-27 2015-05-27 Univ Indiana Res & Tech Corp GLUCAGON ANTAGONISTE AND GIP AGONISTS CONJUGATES AND COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF METABOLISM DISEASES AND ADIPOSITAS
AR080592A1 (es) 2010-03-26 2012-04-18 Lilly Co Eli Peptido con actividad para el gip-r y glp-1-r, formulacion famaceutica que lo comprende, su uso para preparar un medicamento util para el tratamiento de diabetes mellitus y para inducir la perdida de peso
KR20130062931A (ko) 2010-05-13 2013-06-13 인디애나 유니버시티 리서치 앤드 테크놀로지 코퍼레이션 핵 호르몬 수용체 활성을 나타내는 글루카곤 슈퍼패밀리 펩티드
EP2568993A4 (en) 2010-05-13 2014-02-19 Univ Indiana Res & Tech Corp GLUCAGON SUPERFAMILY PEPTIDES WITH G-PROTEIN-COUPLED RECEPTOR ACTIVITY
WO2011163012A2 (en) 2010-06-24 2011-12-29 Indiana University Research And Technology Corporation Amide based glucagon superfamily peptide prodrugs
WO2011163473A1 (en) 2010-06-25 2011-12-29 Indiana University Research And Technology Corporation Glucagon analogs exhibiting enhanced solubility and stability in physiological ph buffers

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Sang-Heon Lee et al.Synthesis, Characterization, and Pharmacokinetic Studies of PEGylated Glucagon-like Peptide-1.《Bioconjugate Chem》.2005,第16卷377-382. *

Also Published As

Publication number Publication date
US20090137456A1 (en) 2009-05-28
EP1959986A4 (en) 2010-02-10
WO2007056362A3 (en) 2009-04-23
WO2007056362A2 (en) 2007-05-18
CA2628241A1 (en) 2007-05-18
CN101534846A (zh) 2009-09-16
CA2628241C (en) 2016-02-02
EP1959986B1 (en) 2014-07-23
US20120196804A1 (en) 2012-08-02
CA2913805A1 (en) 2007-05-18
HK1121688A1 (zh) 2009-04-30
EP2570133B1 (en) 2016-03-23
US9018164B2 (en) 2015-04-28
US8338368B2 (en) 2012-12-25
EP1959986A2 (en) 2008-08-27
ES2572952T3 (es) 2016-06-03
ES2507098T3 (es) 2014-10-14
EP2570133A1 (en) 2013-03-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101534846B (zh) 显示生理学溶解性和稳定性的胰高血糖素类似物
EP2124974B1 (en) Glucagon analogs exhibiting enhanced solubility in physiological ph buffers
AU2008216265B2 (en) Glucagon/GLP-1 receptor co-agonists
TWI474832B (zh) 胰高血糖素／ｇｌｐ-１受體共同激動劑
CN102459325B (zh) 胃抑胜肽受体活化的胰高血糖素化合物
AU2009260301A1 (en) Glucagon analogs exhibiting enhanced solubility and stability in physiological pH buffers
KR20130093693A (ko) 포도당 의존적인 인슐린 분비 자극성 폴리펩타이드의 절단형 유사체
AU2013204126A1 (en) Glucagon/GLP-1 receptor co-agonists
AU2015264817A1 (en) Glucagon analogs exhibiting enhanced solubility and stability in physiological pH buffers

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20141105

Termination date: 20191106