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CN115634285A - 多肽缀合物在制备治疗糖代谢相关疾病的药物中的应用 - Google Patents

多肽缀合物在制备治疗糖代谢相关疾病的药物中的应用 Download PDF

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CN115634285A
CN115634285A CN202110819329.0A CN202110819329A CN115634285A CN 115634285 A CN115634285 A CN 115634285A CN 202110819329 A CN202110819329 A CN 202110819329A CN 115634285 A CN115634285 A CN 115634285A
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徐敏
孙杲
张映辉
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Parker Biomedical Suzhou Co ltd
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Parker Biomedical Suzhou Co ltd
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Abstract

本发明属于医药领域，具体来说，本发明涉及一种多肽缀合物及多肽缀合物在制备治疗糖代谢相关疾病的药物中的应用。本发明的多肽缀合物由胰高血糖素突变体与一个或多个聚乙二醇缀合形成，该多肽缀合物能够迅速提升体内血糖水平，并且长效维持体内血糖水平稳定，适用于对先天性高胰岛素血症及各类低血糖病症的治疗。

Description

多肽缀合物在制备治疗糖代谢相关疾病的药物中的应用
技术领域
本发明属于医药领域，具体来说，本发明涉及一种多肽缀合物及多肽缀合物在制备治疗糖代谢相关疾病的药物中的应用。
背景技术
低血糖症状的诱发因素复杂，可能伴随多种疾病发生。先天性高胰岛素血症(congenital hyperinsulinism，CHI)是由于各种先天病因导致胰岛素过量分泌而出现低血糖的病症，是导致新生儿和儿童严重。据统计，活产婴儿中CHI的发病率为1/30000～1/50000，而在相对封闭环境内通婚比较高的国家和地区(如阿拉伯地区)CHI的发病率可高至1/2500[1]。持续性和复发性的低血糖、低血糖状态下不恰当的胰岛素分泌为CHI的重要临床特征。由于CHI患者反复发生低血糖，可导致不可逆的中枢神经系统损伤甚至死亡，故早期识别、诊断和合理治疗十分重要。
低血糖也可能是由于医源性胰岛素过多、磺脲类降糖药等的不当使用导致，或伴随妊娠、术后、肿瘤、肝病等因素发生。当发生低血糖时，脑细胞主要用到的葡萄糖、酮、乳糖等的水平无法维持，并且来自体内蛋白质和脂肪的能量供给受阻，导致脑细胞损伤。因此，本领域亟需针对低血糖相关疾病开发及时有效且能长效维持血糖水平的治疗方法。
CHI的形态学具有多样性，最常见的两种组织学类型是局灶型和弥散型。其中，局灶型病变是一种增生腺瘤，通常病变范围小，病灶中心的异常胰岛β细胞的核比较大，胞浆丰富且形态不规则，异常的胰岛β细胞极度活跃，导致整个病灶的胰岛素分泌水平极度增高。弥漫型病变影响胰岛的所有β，胰岛β细胞普遍拥有较大的细胞核及较多的细胞浆，分泌胰岛素功能旺盛。遗传学方面，参与调控胰岛素分泌的关键基因突变是导致CHI的关键病因，ABCC8、KCNJ11、CLUD1、GCK、HADH、SLC16A1、HNF4A等基因的突变已确认与CHI有关，其中，弥漫型CHI最常见于KATP通道编码基因(ABCC8、KCNJ11)隐性突变所致，约占到40～45％[2]。
婴幼儿期CHI的治疗目标是减少低血糖对中枢神经系统的损害。外科手术是可选的治疗手段，对于局灶型CHI，直接切除病灶即可；对于弥散型CHI，面临的情况则较为复杂，局部切除手术很难达到完全治愈，大部分病例需要进行胰腺次全切除术(切除95％～98％的胰腺)，这种手术具有发展为胰腺外分泌功能不全和糖尿病的高风险，需要终身胰酶替代和胰岛素治疗，糖尿病可能在手术后立刻发生，也可能在术后随访时发现[3]。同时，胰腺次全切除术中，虽然切除了95％～98％的胰腺，部分患儿仍然会表现出高胰岛素血症低血糖[4]。
药物治疗方面，KATP通道开放剂二氮嗪(Diazoxide)是国外长期治疗CHI的一线用药，二氮嗪通过与KATP通道的Sur1亚基结合产生生物学效应，故要求KATP通道功能完整，而相当一部分KATP通道编码基因突变(如ABCC8、KCNJ11突变的弥漫型CHI)的患者对二氮嗪治疗无反应，再加上目前二氮嗪并未在国内上市，药物的可及性存在问题。二氮嗪治疗无反应的CHI患儿可选用二线治疗药物奥曲肽(Octreotide)，奥曲肽是一种人工合成的长效生长抑素类似物，通过与生长抑素受体2和5(SSTR2和5)结合来抑制胰岛素分泌，多数患儿使用奥曲肽的初期治疗效果较好，但常于给药后不久引发快速耐受性，使其长期应用受到限制[5]，此外奥曲肽还存在各种副作用，包括胃肠道反应、胆囊扩张伴胆结石以及生长发育减缓等[6]。
人前胰高血糖素原(preproglucagon)是158个氨基酸的前体多肽，其在组织中被差异性加工而形成多种结构上相关的胰高血糖素原衍生肽，包括胰高血糖素(Glucagon或GCG)、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、胰高血糖素样肽-2(GLP-2)和胃泌酸调节素(OXM)。这些分子参与多种生理功能，包括葡萄糖内稳态、胰岛素分泌、胃排空和肠生长，以及食物摄取调节。其中，胰高血糖素是包含29个氨基酸的多肽，对应于前胰高血糖素原的53至81位氨基酸。胰高血糖素帮助维持血液中的葡萄糖水平，这通过与肝细胞上的胰高血糖素受体结合并经由糖原分解而使肝释放以糖原形式储存的葡萄糖来实现。随着这些储存的耗尽，胰高血糖素还刺激肝通过糖异生合成额外的葡萄糖。
由于胰高血糖素本身较差的理化稳定性和很短的半衰期，胰高血糖素目前主要被用于低血糖发作的急救[7]，药物作用维持时间短，不适宜长期应用。Zealand开发的胰高血糖素类似物Dasiglucagon目前正在进行针对CHI的临床试验，其虽然部分克服了理化稳定性的问题，但药物作用时间仍然较短，需要使用特制的灌注泵对患儿进行持续的灌注(Infusion)，用药不够方便且成本较高。
引用文献：
[1]Dillon PA,Curr Opin Pediatr,2013,25(3):357-361.
[2]Bellanne-Chantelot C,J Med Genet,2010,47(11):752-759.
[3]Arya VB,Plos One,2014,9:e98054.
[4]Beltrand J,Diabetes Care,2012,35:198-203.
[5]Demirbilek,J Clin Endocrinol,2014,99(10):3660-3667.
[6]Levy-Khademi F,J Pediatr Endocrinol Metab,2015,28:449-451；Celik N,Horm Res Paediatr,2013,80:299-303.
[7]Hussain K,Horm Res,2008,69:2-13.
发明内容
发明要解决的问题
鉴于现有技术中存在的问题，例如，胰高血糖素类药物的稳定性差，药物作用时间短，仅限于短期内提升患者的血糖值，无法长效使用的缺陷。为此，本发明提供了一种胰高血糖素突变体与聚乙二醇基团缀合形成的多肽缀合物，该多肽缀合物能长时间维持哺乳动物体内的血糖水平稳定，满足对先天性高胰岛素血症等疾病的治疗需求。
用于解决问题的方案
第一方面，本发明提供了多肽缀合物在制备治疗糖代谢相关疾病的药物中的应用，所述多肽缀合物由胰高血糖素突变体与一个或多个聚乙二醇缀合形成；
其中，所述胰高血糖素突变体在SEQ ID NO：1所示序列的一个或多个位置处具有氨基酸的替换、添加或修饰，使至少一个氨基酸的侧链含有巯基，所述聚乙二醇通过所述巯基缀合于所述胰高血糖素突变体。
在一些实施方式中，根据本发明所述的应用，其中，所述氨基酸的替换、添加或修饰包括如下(a)和(b)中的至少一项：
(a)将SEQ ID NO：1所示序列的一个或多个位置处的氨基酸替换为半胱氨酸，
(b)在SEQ ID NO：1所示序列的一个或多个位置处添加一个或多个半胱氨酸。
在一些实施方式中，根据本发明所述的应用，其中，所述氨基酸的替换、添加或修饰为在SEQ ID NO：1所示序列的一个或多个位置处的氨基酸的侧链上连接含有巯基的基团；
优选包括如下(c)-(g)中的至少一项：
(c)第3位谷氨酰胺的侧链上连接含有巯基的基团，
(d)第12位赖氨酸的侧链上连接含有巯基的基团，
(e)第20位谷氨酰胺的侧链上连接含有巯基的基团，
(f)第24位的谷氨酰胺的侧链上连接含有巯基的基团，
(g)第28位的天冬酰胺的侧链上连接含有巯基的基团；
更优选为在SEQ ID NO：1所示序列的第24位的谷氨酰胺的侧链上连接含有巯基的基团。
在一些实施方式中，根据本发明所述的应用，其中，所述含有巯基的基团选自-C(＝O)-Z1-SH或-Z1-SH，Z1为未取代的或氨基取代的C1-4的烷基，所述含有巯基的基团的非巯基一侧与所述氨基酸的侧链中的氨基连接；所述含有巯基的基团优选自-C(＝O)-CH(NH2)-CH2-SH、-CH2-SH、-CH2-CH2-SH或-CH2-CH2-CH2-SH；所述含有巯基的基团更优选为-CH2-CH2-SH。
在一些实施方式中，根据本发明所述的应用，其中，所述胰高血糖素突变体具有如下任一项所示的序列：
H-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln(-CH2-CH2-SH)-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-OH(SEQ ID NO:2)，
H-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln(-CH2-CH2-SH)-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ IDNO:3)，
H-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys(-C(＝O)-CH(NH2)-CH2-SH)-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-OH(SEQ ID NO:4)，
H-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys(-C(＝O)-CH(NH2)-CH2-SH)-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ ID NO:5)，
H-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Cys-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-OH(SEQ ID NO:6)，
H-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Cys-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ ID NO:7)，
H-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Cys-OH(SEQ ID NO:8)，
H-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Cys-NH2(SEQ ID NO:9)。
在一些实施方式中，根据本发明所述的应用，其中，所述聚乙二醇的分子量为1-60KDa，更优选5-50KDa，更优选10-40KDa，更优选15-30KDa，最优选21-29KDa。
在一些实施方式中，根据本发明所述的应用，其中，所述多肽缀合物具有式(I-1)或(I-1’)所示的结构：
Figure BDA0003171463610000031
Figure BDA0003171463610000041
在一些实施方式中，根据本发明所述的应用，其中，所述糖代谢相关疾病为低血糖。
在一些实施方式中，根据本发明所述的应用，其中，所述低血糖选自如下的任一种：先天性高胰岛素血症低血糖、糖尿病性低血糖、非糖尿病性低血糖、反应性低血糖、空腹低血糖、妊娠性低血糖、药物诱发的低血糖、手术诱发的低血糖和肿瘤诱发的低血糖。
在一些实施方式中，根据本发明所述的应用，其中，所述糖代谢相关疾病为先天性高胰岛素血症。
第二方面，本发明提供了多肽缀合物在制备用于治疗患有糖代谢相关疾病的受试者的药物中的应用，所述多肽缀合物及糖代谢相关疾病的具体类型如本发明第一方面中所定义；优选地，所述多肽缀合物或包含所述多肽缀合物的组合物被施用于受试者体内；可选地，所述组合物还包括一种或多种药学上可接受的载体。
第三方面，本发明提供了一种多肽缀合物，其用于治疗糖代谢相关疾病，所述多肽缀合物如本发明第一方面中所定义；
优选地，所述多肽缀合物用于治疗患有糖代谢相关疾病的受试者；
优选地，所述糖代谢相关疾病为先天性高胰岛素血症；
可选地，所述糖代谢相关疾病为低血糖，所述低血糖选自如下的任一种：先天性高胰岛素血症低血糖、糖尿病性低血糖、非糖尿病性低血糖、反应性低血糖、空腹低血糖、妊娠性低血糖、药物诱发的低血糖、手术诱发的低血糖和肿瘤诱发的低血糖。
第四方面，本发明提供了一种治疗糖代谢相关疾病的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的多肽缀合物，所述多肽缀合物如本发明第一方面中所定义；
优选地，所述糖代谢相关疾病为先天性高胰岛素血症；
可选地，所述糖代谢相关疾病为低血糖，所述低血糖选自如下的任一种：先天性高胰岛素血症低血糖、糖尿病性低血糖、非糖尿病性低血糖、反应性低血糖、空腹低血糖、妊娠性低血糖、药物诱发的低血糖、手术诱发的低血糖和肿瘤诱发的低血糖。
发明的效果
本发明提供的多肽缀合物中，胰高血糖素突变体多肽虽然经过了聚乙二醇化修饰，但仍能够保持高的胰高血糖素的生物活性，该多肽缀合物能够在短时间内迅速提升血糖，并且在不同的哺乳动物低血糖模型中均能发挥长效稳定血糖的作用。该类多肽缀合物能够适用于对先天性高胰岛素血症及各类低血糖病症的治疗。
在一些实施方式中，本发明提供的如式I-1所示的多肽缀合物，具有高的胰高血糖素活性，能够在短时间内提升血糖至安全值，并维持低血糖动物模型体内血糖水平的长期稳定，药物作用时间长，适合对多因素诱发的与低血糖相关的疾病的治疗，特别是适合对先天性高胰岛素血症的治疗。
附图说明
图1示出了小鼠注射多肽缀合物I-1及其前体胰高血糖素突变体Q-1后的血糖变化情况。
图2示出了多肽缀合物I-1对格列美脲低血糖小鼠模型的升糖效果。
图3示出了多肽缀合物I-1对高胰岛素血症低血糖模型大鼠的升糖效果。
具体实施方式
定义
除非有相反陈述，否则在本发明中所使用的术语具有下述含义。
在本发明的权利要求和/或说明书中，词语“一(a)”或“一(an)”或“一(the)”可以指“一个”，但也可以指“一个或多个”、“至少一个”以及“一个或多于一个”。
如在权利要求和说明书中所使用的，词语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是指包括在内的或开放式的，并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。与此同时，“包含”、“具有”、“包括”或“含有”也可以表示封闭式的，排除额外的、未引述的元件或方法步骤。
在整个申请文件中，术语“约”表示：一个值包括测定该值所使用的装置或方法的误差的标准偏差。用以界定本发明的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因前述测试方法或装置所致的标准偏差。因此，除非另有明确的说明，应当理解本公开所用的所有范围、数量、数值与百分比均经过“约”的修饰。在此处，“约”通常是指实际数值在一特定数值或范围的正负10％、5％、1％或0.5％之内。
术语“多肽”、“蛋白”可互换地指通过共价键(例如肽键)相互连接的一串至少两个氨基酸残基，可以是重组多肽、天然多肽或合成多肽。多肽可以是线形或分支的，它可以包含修饰的氨基酸，并且它可以由非氨基酸隔断。该术语也包括已经被修饰(例如，二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作，如以标记组分缀合)的氨基酸聚合物。
术语“氨基酸”包括天然氨基酸、非天然氨基酸、氨基酸类似物以及所有它们的D和L立体异构体。
本发明中氨基酸及缩写和英文简称如下所示：
组氨酸(His，H)；丝氨酸(Ser，S)；谷氨酰胺(Gln，Q)；Gly(甘氨酸，G)；苏氨酸(Thr，T)；苯丙氨酸(Phe，F)；天冬氨酸(Asp，D)；酪氨酸(Tyr，Y)；亮氨酸(Leu，L)；精氨酸(Arg，R)；丙氨酸(Ala，A)；谷氨酰胺(Gln，Q)；缬氨酸(Val，V)；色氨酸(Trp，W)；亮氨酸(Leu，L)；甲硫氨酸(Met，M)；天冬酰胺(Asn，N)；半胱氨酸(Cys，C)；赖氨酸(Lys，K)。
术语“突变体”“多肽的突变体”、“多肽突变体”“多肽变体”是指相对于“野生型”，或者“相比较的”多肽，在一个或多个(例如，若干个)位置处包含改变(即，替换、插入、缺失和/或修饰)的多肽。突变体可以是完全功能性突变体，缺乏一种或多种活性，或一种或多种活性增强的功能性突变体。在一些实施方式中，多肽的突变体为胰高血糖素突变体。
如无特别的说明或标记，本发明所述“多肽”、“突变体”或其同义物的N端和C端可各自独立为修饰或未修饰的状态；其中N端可以为裸露的(H-)，也可以是被化学修饰的，所述修饰基团包括但不限于：C1-4烷基、乙酰基、甲酰基、苯甲酰基、三氟乙酰基等；C端可以为裸露的(-OH)，也可以是被化学修饰的，所述修饰包括但不限于酰胺化(-NH2)。
在一些实施方式中，“多肽的突变体”包含替换、添加和/或修饰的一个或多个氨基酸。替换是指用不同氨基酸置换占用一个位置的氨基酸。缺失是指去除占据某一位置的氨基酸。添加是指在邻接并且紧随占据位置的氨基酸之后添加氨基酸。修饰可以包括对天然序列的修饰，例如官能团的修饰、分子内共价键合(例如，侧链之间成环)、甲基化、酰基化、泛素化(ubiquitination)、磷酸化、氨基己烷化(aminohexanation)、生物素化等；还可以包括取代形成非天然化合物，和/或一个或多个氨基酸被添加至天然序列中氨基酸的羧基端和/或氨基端。
术语“多肽缀合物”是指将多肽或多肽的突变体中的一个或多个氨基酸与修饰基团经共价连接或非共价连接得到的产物。修饰方式包括但不限于PEG化修饰、磷酸化修饰、甲基化修饰、糖基化修饰、生物素化修饰、酰基化修饰等等。在一些实施方式中，修饰基团为聚乙二醇基团。
术语“各自独立地”是指结构中存在的取值范围相同或相近的至少两个基团(或环系)可以在特定情形下具有相同或不同的含义。例如，取代基X和取代基Y各自独立地为氢、羟基、烷基或芳基，则当取代基X为氢时，取代基Y既可以为氢，也可以为羟基、烷基或芳基；同理，当取代基Y为氢时，取代基X既可以为氢，也可以为羟基、烷基或芳基。
术语“烷基”包括直链、支链或环状的饱和烷基。例如，烷基包括但不限于甲基、乙基、丙基、环丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、环丁基、正戊基、环已基等类似基团。示例性的，“C1-6烷基”中的“C1-6”是指包含有1、2、3、4、5或6个碳原子的直链、支链或环状形式排列的基团。
术语“芳基”在本文中是指未取代或取代的包括碳原子的单环或多环芳基团6至10元全碳单环或稠合多环(即共享相邻碳原子对的环)基团。例如，杂芳基包括但不限于苯基、1-萘基、2-萘基等类似基团。
本发明上下文中使用的术语“治疗”是指：在罹患疾病之后，使受试者接触(例如给药)本发明的化合物或其药学上可接受的盐、酯、溶剂合物、光学异构体、互变异构体、同位素标记物、前药或含者有其的药物组合物(以下也称为“本发明的药物组合物”)，从而与不接触时相比使该疾病的症状减轻，并不意味着必需完全抑制疾病的症状。罹患疾病是指：身体出现了疾病症状。
本发明上下文中使用的术语“个体”、“患者”或“受试者”包括哺乳动物。哺乳动物包括但不限于，家养动物(例如，牛，羊，猫，狗和马)，灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物如猴)，兔，以及啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。
本发明上下文中使用的术语“治疗有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现所需治疗结果的量。本发明的化合物或药物组合物的治疗有效量可以根据多种因素如疾病状态、个体的年龄、性别和重量和免疫佐剂或药物组合物在个体中激发所需反应的能力而变动。
本发明上下文中使用的术语“药物组合物”是指可供药用的组合物，其包含多肽缀合物或其药学上可接受的形式(例如盐、水合物、溶剂化物、立体异构体、互变异构体、代谢产物、前药等)，以及其他组分(例如药学上可接受的辅料)。
本发明上下文中使用的术语“药学上可接受的辅料”或“药物学可接受的载体”是指在药物生产领域中广泛采用的辅助物料。使用辅料的主要目的在于提供一种使用安全、性质稳定和/或具有特定功能性的药物组合物，还在于提供一种方法，以便在为受试者施用药物之后，活性成分能够以所期望的速率溶出，或者促进活性成分在接受给药的受试者体内得到有效吸收。药学上可接受的辅料可以是具有惰性的填充剂，也可以是为药用组合物提供某种功能(例如稳定组合物的整体pH值或防止组合物中活性成分的降解)的功效成分。药学上可接受的辅料的非限制性实例包括但不限于粘合剂、助悬剂、乳化剂、稀释剂(或填充剂)、成粒剂、胶粘剂、崩解剂、润滑剂、抗粘着剂、助流剂、润湿剂、胶凝剂、吸收延迟剂、溶解抑制剂、增强剂、吸附剂、缓冲剂、螯合剂、防腐剂、着色剂、矫味剂、甜味剂等。
本发明中的药物组合物可以使用本领域技术人员已知的任何方法来制备。例如，常规混合、溶解、造粒、乳化、磨细、包封、包埋和/或冻干工艺。
术语“低血糖”指代血糖水平低于正常人的健康状态，低血糖常在患者使用口服低血糖剂或胰岛素后因食入少于平时或进行多于平时的活动或锻炼时被引起。此外，低血糖可因饮酒、使用降低的葡萄糖水平药物、严重身体疾病、激素如肾上腺皮质激素和胰高血糖素缺乏、产胰岛素胰腺中的肿瘤、胰岛素自身免疫疾病、胃切除术患者、碳水化合物代谢障碍的先天性差错等而发生。具体的低血糖类型可以是先天性高胰岛素血症低血糖、糖尿病性低血糖、非糖尿病性低血糖、反应性低血糖、空腹低血糖、妊娠性低血糖、药物诱发的低血糖、手术诱发的低血糖或肿瘤诱发的低血糖，这些病症可以但并不必须是分开的或相互排斥的。
以下将结合具体实施例来阐述本发明的技术方案，下列实施例的提供旨在进一步说明本发明，而非用于限制本发明的范围。对本领域技术人员而言，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，针对本发明的具体实施方式进行各种变化和改进将是显而易见的。
本发明的化合物的制备可以通过本领域技术人员所熟知的合成方法来实现，包括但不限于下面列举的具体实施方式、其与其他化学合成方法相结合而形成的实施方式以及本领域技术人员所熟知的等同替换方式，优选的实施方式包括但不限于本发明的实施例。本发明中所使用的已知的起始原料可以提供本领域已知的方法来合成，或者通过常规的商业手段来购买。
多肽缀合物
本发明的多肽缀合物由胰高血糖素突变体与一个或多个聚乙二醇缀合形成；其中，所述胰高血糖素突变体在SEQ ID NO：1所示序列的一个或多个位置处具有氨基酸的替换、添加或修饰，使至少一个氨基酸的侧链含有巯基，所述聚乙二醇通过所述巯基缀合于所述突变体。
本领域技术人员普遍知晓，在缀合了聚合物基团的生物活性分子(例如，活性多肽)中，随着聚合物基团分子量的增加，该缀合物分子的生物活性会降低[8]，胰高血糖素变体PEG缀合物的体外测试结果再次印证了上述结论(参见中国专利申请CN201511017796.2)。然而本发明意外发现，在胰高血糖素突变体与聚乙二醇缀合后，反而表现出提高的体内活性，多肽缀合物提升血糖的速率和峰值均优于未缀合的突变体，具有更为明显的升血糖效果，强劲的体内活性使得该多肽缀合物能够抵御高浓度胰岛素的拮抗作用，具备了用于治疗先天性高胰岛素血症的潜力。并且，多肽缀合物还能实现长效稳定血糖的效果，与胰高血糖素、胰高血糖素的多肽变体相比具有更长的药物作用时间，可充分满足先天性高胰岛素血症及各类型低血糖患者的临床需求。
<胰高血糖素突变体>
本发明中胰高血糖素突变体与SEQ ID NO：1所示序列的野生型胰高血糖素相比，在SEQ ID NO：1所示序列的一个或多个位置处具有突变的氨基酸。氨基酸的突变方式包括但不限于替换、添加或修饰，在一些实施方式中，氨基酸的突变方式选自替换、添加、修饰中的一种；在另外一些实施方式中，氨基酸的突变方式选自替换、添加、修饰中的两种及以上的组合。
进一步的，胰高血糖素突变体在SEQ ID NO：1所示序列的1个、2个、3个、4个、5个或更多位置处具有突变的氨基酸。并且，每个突变的氨基酸可以独立地位于SEQ ID NO：1所示序列的N末端、C末端或内部，每个位置处的氨基酸的突变方式可以独立地选自替换、添加或修饰。
通过一个或多个位置处的氨基酸的替换、添加或修饰，使胰高血糖素突变体中的一个或多个氨基酸的侧链中含有巯基，为聚乙二醇的缀合提供缀合位点。
在本发明中，氨基酸的替换包括将SEQ ID NO：1所示序列的一个或多个位置处的氨基酸替换为半胱氨酸。在一些实施方式中，氨基酸的替换包括第12位的赖氨酸替换为半胱氨酸、第24位的谷氨酰胺替换为半胱氨酸。在另外一些实施方式中，氨基酸的替换是将其它任意位置处的氨基酸替换为半胱氨酸。
在本发明中，氨基酸的添加包括在SEQ ID NO：1所示序列的一个或多个位置处添加一个或多个半胱氨酸。在一些实施方式中，氨基酸的添加包括在SEQ ID NO：1所示序列的C末端添加的1个、2个、3个、4个或更多的半胱氨酸。在另外一些实施方式中，氨基酸的添加还包括在SEQ ID NO：1所示序列的N末端，或N末端与C末端中间的任意位置处添加的一个或多个半胱氨酸。
在本发明中，氨基酸的修饰包括在SEQ ID NO：1所示序列的一个或多个位置处的氨基酸的侧链上连接含有巯基的基团。示例性地，氨基酸的修饰包括对一个或多个侧链中含有氨基的氨基酸的修饰，修饰方式包括将氨基酸的侧链中的氨基与含有巯基的基团的非巯基端相连接。
在一些实施方式中，氨基酸的修饰包括如下(c)-(g)中的至少一项：(c)第3位谷氨酰胺的侧链上连接含有巯基的基团，(d)第12位赖氨酸的侧链上连接含有巯基的基团，(e)第20位谷氨酰胺的侧链上连接含有巯基的基团，(f)第24位的谷氨酰胺的侧链上连接含有巯基的基团，(g)第28位的天冬酰胺的侧链上连接含有巯基的基团。在一些优选地实施方式中，氨基酸的修饰为在第24位的谷氨酰胺的侧链上连接含有巯基的基团。
在一些更为具体的实施方式中，所述含有巯基的基团选自-C(＝O)-Z1-SH或-Z1-SH，其中，Z1为未取代的或氨基取代的C1-4的烷基，所述基团的非巯基一侧与所述氨基酸的侧链中的氨基连接。示例性地，Z1为甲基、乙基、丙基、丁基、氨基取代的乙基等等。
在一些优选的实施方式中，所述含有巯基的基团选自-C(＝O)-CH(NH2)-CH2-SH、-CH2-SH、-CH2-CH2-SH或-CH2-CH2-CH2-SH。在一些更为优选的实施方式中，所述含有巯基的基团为-CH2-CH2-SH。
在一些实施方式中，“突变的氨基酸”还可以包含在SEQ ID NO：1所示序列的一个或几个位置处不影响蛋白活性的添加、缺失或替换的氨基酸。众所周知，在多肽的某些区域，例如非重要区域改变少数氨基酸残基基本上不会改变生物活性，例如，适当替换、添加或缺失某些氨基酸得到的序列并不会影响其活性。
在本发明中，胰高血糖素突变体的C末端和N末端可以彼此独立地为修饰的或是未修饰的基团。示例性地，修饰基团包括但不限于氨基、C1-4烷基、乙酰基、甲酰基、苯甲酰基、三氟乙酰基、β-羟基咪唑丙酰基、4-咪唑乙酰基、β-羧基咪唑丙酰基。在一些实施方式中，胰高血糖素突变体的C末端基团为-OH，N末端基团为-H。在一些实施方式中，胰高血糖素突变体的C末端基团为-NH2，N末端基团为-H。
在一些优选的实施方式中，胰高血糖素突变体具有如SEQ ID NO：2～9任一项所示的序列，SEQ ID NO：2～9的具体序列如下所示：
H-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln(-CH2-CH2-SH)-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-OH(SEQ ID NO:2)，
H-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln(-CH2-CH2-SH)-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ IDNO:3)，
H-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys(-C(＝O)-CH(NH2)-CH2-SH)-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-OH(SEQ ID NO:4)，
H-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys(-C(＝O)-CH(NH2)-CH2-SH)-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ ID NO:5)，
H-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Cys-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-OH(SEQ ID NO:6)，
H-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Cys-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ ID NO:7)，
H-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Cys-OH(SEQ ID NO:8)，
H-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Cys-NH2(SEQ ID NO:9)。
<聚乙二醇>
本发明的聚乙二醇通过硫醚键与胰高血糖素突变体进行缀合，得到体内药物活性显著增强的多肽缀合物，实现长效稳定血糖的效果。聚乙二醇中包含具有高反应性的活化基团，用于与胰高血糖素突变体的缀合。在一些实施方式中，聚乙二醇中含有马来酰亚胺基团，马来酰亚胺基团的烯基与胰高血糖素突变体的巯基之间的连接形成硫醚键，得到一个或多个聚乙二醇与胰高血糖素突变体相缀合的多肽缀合物。在另外一些实施方式中，聚乙二醇中还可以包含卤素、乙烯基砜、二硫键、巯基、醛基、羰基、O-取代羟氨、活性酯、烯基、炔基、叠氮基或其他具有高化学反应活性的活化基团，通过活化基团与胰高血糖素突变体的巯基之间反应形成硫醚键，得到多肽缀合物。
本发明中聚乙二醇(PEG)不具有特别限定的结构，PEG分子可以是线性的、分枝的或是分叉的。PEG既包括末端基团为羟基，也包括末端基团为其他基团的类型。示例性地，末端的其它基团包括但不限于烷氧基、环烷基氧基、环烷基烷基氧基、烯基、芳氧基或芳烷基氧基。这些PEG分子类型都是现有技术中已知的，并且在多肽修饰中常规使用。
本发明中聚乙二醇(PEG)可以具有任意所需的聚合链长度，由于聚合物是由一定分布范围内的不同聚合度的分子构成，一般用平均分子量表示聚合物的分子量。具体来说可以是数均分子量，或重均分子量。尽管在聚合物的聚合度差异较大时，数均分子量和重均分子量可能有一些偏差，但是对于分布范围较窄的聚合物来说，二者趋于相等。对于本发明的聚乙二醇，在提及其分子量时，既可以是重均分子量，也可以是数均分子量，优选数均分子量。需要说明的是，当多肽缀合物中包含多个聚乙二醇分子时，计算的是多个聚乙二醇的分子量的总和。
在一些实施方式中，所述聚乙二醇的分子量为1-60KDa，更优选5-50KDa，更优选10-40KDa，更优选15-30KDa，最优选21-29KDa。
在一些具体实施方式中，聚乙二醇的分子量可以为15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39和40KDa，以及它们任意两者之间的数值范围。
在一些可选地实施方式中，聚乙二醇的结构为
Figure BDA0003171463610000091
其中，R1可选自如下任一所示的结构：
Figure BDA0003171463610000092
Figure BDA0003171463610000101
在一些优选地实施方式中，R1具有如下所示结构：
Figure BDA0003171463610000102
其中，每一个n独立地选自任意的自然数，使聚乙二醇的分子量落入目标的范围内。
在一些优选的实施方式中，多肽缀合物具有式(I-1)或(I-1’)所示的结构：
Figure BDA0003171463610000103
Figure BDA0003171463610000111
组合物
本发明的组合物包含本发明提供的多肽缀合物，在体内表现出明显增强的胰高血糖素的生物活性，可有效提升血糖，并能发挥长效稳定血糖的药物效果，适于各类与低血糖症状相关的疾病的长效治疗。
在一些实施方式中，组合物中还包括一种或多种药学上可接受的载体。在本发明中，使用组合物的目的在于促进针对生物体的给药，有利于活性成分的吸收，进而发挥生物活性。本发明的组合物可以通过任何形式给药，包括注射(动脉内、静脉内、肌肉内、腹膜内、皮下)、粘膜、口服(口服固体制剂、口服液体制剂)、直肠、吸入、植入、局部(例如眼部)给药等。口服固体制剂的非限制性实例包括但不限于散剂、胶囊剂、锭剂、颗粒剂、片剂等。口服或粘膜给药的液体制剂的非限制性实例包括但不限于混悬剂、酊剂、酏剂、溶液剂等。局部给药制剂的非限制性实例包括但不限于乳剂、凝胶剂、软膏剂、乳膏剂、贴剂、糊剂、泡沫剂、洗剂、滴剂或血清制剂。胃肠外给药制剂的非限制性实例包括但不限于注射用溶液剂、注射用干粉剂、注射用悬浮液、注射用乳剂等。本发明的组合物还可以制成控制释放或延迟释放剂型(例如脂质体或微球)。
在本发明中，施用途经能够以任何适用的方式进行变化或调整，以满足药物的性质、患者和医务人员的便利以及其它相关因素的需求。
多肽缀合物或组合物的医药用途
本发明的多肽缀合物或包含多肽缀合物的组合物用于治疗糖代谢相关疾病，或制备治疗糖代谢相关疾病的药物。
在一些实施方式中，糖代谢相关疾病为低血糖。具体而言，糖代谢相关疾病为表现有低血糖症状的各类疾病。
受各类因素的诱导，机体表现出低血糖症状，本发明的多肽缀合物或包含多肽缀合物的组合物具有提升体内血糖水平，和长效稳定血糖的体内药物活性，适于治疗各类表现有低血糖症状的疾病。示例性地，低血糖选自如下的任一种：先天性高胰岛素血症低血糖、糖尿病性低血糖、非糖尿病性低血糖、反应性低血糖、空腹低血糖、妊娠性低血糖、药物诱发的低血糖、手术诱发的低血糖和肿瘤诱发的低血糖。
在一些实施方式中，糖代谢相关疾病为先天性高胰岛素血症。受遗传因素等因素的影响，先天性高胰岛素血症缺少长期有效的治疗药物，严重影响婴幼儿的健康发育，甚至威胁生命。本发明的多肽缀合物或包含多肽缀合物的组合物，能够长效稳定受试者体内的血糖水平，为先天性高胰岛素血症的治疗提供了极具临床应用潜力的治疗药物。
在一些实施方式中，多肽缀合物在制备用于治疗患有糖代谢相关疾病的受试者的药物中的应用。在一些实施方式中，多肽缀合物或包含多肽缀合物组合物被适用于受试者体内。受到体内复杂生理环境的影响，很多在细胞水平中表现有胰高血糖素活性的药物，不具有明显的体内药物活性，并且无法长效发挥胰高血糖素的药物作用时间。本发明意外地发现，本发明中的多肽缀合物，在将胰高血糖素突变体与聚乙二醇缀合后，在受试者体内表现出明显增强的体内药物活性和长效药物作用时间，其提升血糖的速率、峰值均获得提升，能够长效稳定受试者体内的血糖水平，特别适合施用于患有糖代谢相关疾病的受试者体内，发挥长效维持血糖稳定的临床治疗效果。
实施例
本公开的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得明显。但是，应当理解的是，详细描述和具体实施例(虽然表示本公开的具体实施方式)仅为解释性目的而给出，因为在阅读该详细说明后，在本公开的精神和范围内所作出的各种改变和修饰，对于本领域技术人员来说将变得显而易见。
除非有特别说明，否则本发明中采用的所有试剂和原料均可以通过商业渠道购买。
实施例1：固相合成胰高血糖素突变体
胰高血糖素突变体的结构如下所示：
Figure BDA0003171463610000121
胰高血糖素突变体Q-1的合成步骤如下：
步骤1：Fmoc-Thr(tBu)-CTC树脂的溶胀
取Fmoc-Thr(tBu)-CTC树脂在DMF中浸泡2-5小时而溶胀。溶胀后，树脂用DMF洗涤数次。
步骤2：Fmoc的脱保护
用含20％(V/V)哌啶溶液除去Fmoc-Thr(tBu)-CTC树脂的Fmoc保护基。脱保护后，用DMF清洗树脂，然后排空。用茚三酮对树脂进行取样和测试，测试结果应为阳性。
步骤3：偶联氨基酸
按照目标突变体的氨基酸序列，依次偶联28号至1号的氨基酸：
1)对于28号氨基酸(Fmoc-L-Asn(Trt)-OH)
3.0eq Fmoc-L-Asn(Trt)-OH、2.85eq TDBTU和DMF溶剂加到脱保护的树脂中。再加入6.0eq DIPEA后在20-30℃下反应60-120min。用茚三酮试验监测偶联反应，测试结果应为阴性。偶联完成后采用步骤2中的方法脱去Fmoc保护剂，并用茚三酮进行取样和测试。
2)对于2-23，25-27号氨基酸
制备包含3eq Fmoc氨基酸、3eq HOBt的DMF溶液，冰浴，然后加入3eq DIC反应10-15分钟。随后，将活化的氨基酸溶液加入到脱保护的树脂中反应60-120min，用茚三酮试验监测偶联反应，测试结果应为阴性。偶联完成后采用步骤2中的方法脱去Fmoc保护剂，并用茚三酮进行取样和测试。
3)对于24号氨基酸(Fmoc-L-Glu(NHCH2CH2STrt)-OH)
制备包含1.5eq Fmoc-L-Glu(NHCH2CH2STrt)-OH和1.5eq HOAt的DMF溶液，冰浴，然后加入1.5eq DIC反应10-15分钟。随后，将活化的氨基酸溶液加入到脱保护的树脂中反应60-90min，之后向反应混合液中添加0.5eq的PyAOP和1.0eq的DIPEA，并使其再反应60-90min，用茚三酮试验监测偶联反应，测试结果应为阴性。偶联完成后采用步骤2中的方法脱去Fmoc保护剂，并用茚三酮进行取样和测试。
4)对于1号氨基酸(Fmoc-L-His(Trt)-OH)
将5.0eq Fmoc-L-His(Trt)-OH、4.75eq TDBTU和DMF添加到含有脱保护树脂的反应器中，然后加入10eq DIPEA并在20-30℃下反应120min-180min，用茚三酮试验监测偶联反应，如反应结果为阴性，说明反应完成。Fmoc-L-His(Trt)-OH偶联后脱除N端Fmoc保护，茚三酮试验阳性后进行4次甲醇洗涤。
步骤4：裂解及纯化
洗涤后，将多肽树脂减压干燥至恒重，之后加入预冷的裂解液，搅拌2.5-3.5h，从树脂上裂解得到完全组装的多肽，去除氨基酸侧链保护基。
通过过滤去除多余的树脂，滤液加入到预冷的乙醚中获得沉淀产物，然后用乙醚洗涤、干燥，得到粗品。
使用Luna C18(3)树脂对粗品进行两级纯化，得到最终产品，纯化条件如下表1所示：
表1
Figure BDA0003171463610000131
*在用流动相A和B洗脱之前，产物在二级纯化中用32g/L醋酸铵进行盐交换。.
实施例2：合成多肽缀合物I-1
多肽缀合物I-1(PEG分子量约为23KDa)具有如下所示结构：
Figure BDA0003171463610000132
多肽缀合物I-1的合成步骤如下：
步骤1：PEG化
制备含有70％缓冲溶液(Na2HPO4+NaH2PO4，pH 6.5)和30％乙腈的溶液，将1.1eqα-[3-(3-马来酰亚胺基-1-氧代丙基)胺基]丙基-ω-甲氧基聚乙二醇-23KDa加入到溶液中，搅拌5-10min。再加入胰高血糖素突变体Q-1，反应液氮气保护，室温下搅拌1-2h，反应重点通过HPLC确定，残留胰高血糖素突变体Q-1不超过0.5％。
步骤2：纯化
反应完全后，用水稀释反应液，并用调节pH至4.0，再进行离子交换柱层析，纯化参数如下。经离子交换纯化后，经脱盐-浓缩-超滤的工艺处理，冻干得到多肽缀合物I-1产品。
表2
Figure BDA0003171463610000141
实验例1：体内升血糖效果的评估
将20只4-5周龄的C57BL/6j雄性小鼠依照体重随机分为4组，每组5只。所有动物在提前1周的隔离检疫期内每天上下午分两次注射生理盐水(0.2ml/只)，并在试验前1-2h撤去动物饲料(禁食不禁水)，各组给药情况为：溶媒组(缓冲溶液)、多肽缀合物I-1低剂量组(30nmol/kg)、多肽缀合物I-1高剂量组(90nmol/kg)、胰高血糖素突变体Q-1高剂量组(90nmol/kg)。每只动物给药前及给药后10min、20min、30min、40min、60min、2h、4h、6h测量血糖，试验结果如图1所示。
结果显示，多肽缀合物I-1与胰高血糖素突变体Q-1均能引起血糖明显的上升，PEG化的多肽缀合物I-1急性升血糖效果更为明显，低剂量(30nmol/kg)多肽缀合物I-1的升血糖速率和峰值远高于高剂量(90nmol/kg)的胰高血糖素突变体Q-1。
实验例2：多次给药对格列美脲低血糖小鼠模型的升糖效果评估
格列美脲(glimepiride，CAS：93479-97-1)是一种磺酰脲类降糖药，已有文献报道口服格列美脲可引起实验动物低血糖[9]。在此，参考文献剂量，通过口服格列美脲构建低血糖小鼠模型，将20只4-5周龄的C57BL/6j雄性小鼠依照体重随机分为6组，每组5只。模型组、阳性对照组、化合物(I-1)各组口服灌胃给与10mg/kg的格列美脲，每天上下午各一次，共7天，溶媒组给与等体积的0.5％CMC-NA溶液。每天上午灌胃格列美脲后1h，皮下注射化合物(I-1)或灌胃阳性药二氮嗪，共6天，各组给药情况为：阳性对照组(二氮嗪，20mg/kg)，模型组(缓冲溶液)、多肽缀合物I-1低剂量组(3nmol/kg)、多肽缀合物I-1中剂量组(10nmol/kg)、多肽缀合物I-1高剂量组(30nmol/kg)。于第1天造模前、第1天造模后1h，第1、3-7天给药后1小时分别动物尾尖采血测血糖值。试验结果如图2所示。
实验结果显示，低频次注射中高剂量的多肽缀合物I-1可在长时间内逆转模型小鼠的低血糖状况。
实验例3：多次给药对高胰岛素血症低血糖大鼠模型的升糖效果评估
将40只体重220g～280g的雄性SD大鼠分成5组，每组8只，分别为假手术组、模型组、多肽缀合物I-1低剂量组、多肽缀合物I-1中剂量组和多肽缀合物I-1高剂量组。实验第1天，使用异氟烷将所有动物麻醉，随后在大鼠后背临近髂骨处划出小切口，将一个缓释泵植入到模型组和给药组大鼠的后背中，再将伤口缝合。手术后，连续3天给予每只大鼠0.2ml美洛昔康进行镇痛。缓释泵以2.5ul/hr的速率释放胰岛素以造成低血糖(总剂量80nmol/kg)，假手术组动物同样进行切开及缝合，但未植入缓释泵。
实验第2-6天，每天早上9:30测量各组动物的随机血糖；实验第7天开始，给药组每天1次皮下注射给药，其中：多肽缀合物I-1低剂量组(10nmol/kg，I-1-10)、多肽缀合物I-1中剂量组(30nmol/kg，I-1-30)、多肽缀合物I-1高剂量组(60nmol/kg，I-1-60)，假手术组和模型组注射等体积的缓冲溶液。每次给药完成后4h，测量各实验动物的血糖。结果如图3所示。
结果显示，长期、低频次注射多肽缀合物I-1可有效治疗高胰岛素血症，尤其是中等剂量的多肽缀合物I-1可以使高胰岛素血症患者的血糖值恢复至正常水平。
引用文献：
[8]Bailon,Bioconjugate Chem,2001,12:195-202；Bowen,ExperimentalHematology,1999,27:425-432；Bailon,Expert Opin Deliv,2009,6:1-16.
[9]Wu,Antidiabetics,2009,59(11):550-556；Ladriere,European Journal ofPharmacology,1997,335:227-234；Murthy,Ther Adv Eedocrinol,2013,4(5):133-138.
本说明书公开的所有技术特征都可以任何组合方式进行组合。本说明所公开的每个特征也可以被其它具有相同、相等或相似作用的特征所替换。因此，除非特殊说明，所公开的每一特征仅仅是一系列相等或相似特征的实例。
此外，从上述描述中，本领域技术人员可从本发明中很容易清楚本发明的关键特征，在不脱离本发明的精神及范围的情况下，可对发明进行很多修改以适应各种不同的使用目的及条件，因此这类修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。
序列表
<110> 派格生物医药（苏州）股份有限公司
<120> 多肽缀合物在制备治疗糖代谢相关疾病的药物中的应用
<130> 6C40-2163086I-SU
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 胰高血糖素序列
<400> 1
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 2
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> MOD_RES
<222> (24)..(24)
<223> -CH2-CH2-SH
<220>
<223> 胰高血糖素突变体序列
<400> 2
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 3
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> MOD_RES
<222> (24)..(24)
<223> -CH2-CH2-SH
<220>
<221> AMIDATION
<222> (29)..(29)
<223> -NH2
<220>
<223> 胰高血糖素突变体序列
<400> 3
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 4
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> -C(=O)-CH(NH2)-CH2-SH
<220>
<223> 胰高血糖素突变体序列
<400> 4
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 5
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> -C(=O)-CH(NH2)-CH2-SH
<220>
<221> AMIDATION
<222> (29)..(29)
<223> -NH2
<220>
<223> 胰高血糖素突变体序列
<400> 5
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 6
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 胰高血糖素突变体序列
<400> 6
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Cys Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 7
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> AMIDATION
<222> (29)..(29)
<223> -NH2
<220>
<223> 胰高血糖素突变体序列
<400> 7
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Cys Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 8
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 胰高血糖素突变体序列
<400> 8
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Cys
20 25 30
<210> 9
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> AMIDATION
<222> (30)..(30)
<223> -NH2
<220>
<223> 胰高血糖素突变体序列
<400> 9
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Cys
20 25 30

Claims (13)

1.多肽缀合物在制备治疗糖代谢相关疾病的药物中的应用，所述多肽缀合物由胰高血糖素突变体与一个或多个聚乙二醇缀合形成；
其中，所述胰高血糖素突变体在SEQ ID NO：1所示序列的一个或多个位置处具有氨基酸的替换、添加或修饰，使至少一个氨基酸的侧链含有巯基，所述聚乙二醇通过所述巯基缀合于所述突变体。
2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述氨基酸的替换、添加或修饰包括如下(a)和(b)中的至少一项：
(a)将SEQ ID NO：1所示序列的一个或多个位置处的氨基酸替换为半胱氨酸，
(b)在SEQ ID NO：1所示序列的一个或多个位置处添加一个或多个半胱氨酸。
3.根据权利要求1所述的应用，其中，所述氨基酸的替换、添加或修饰为在SEQ ID NO：1所示序列的一个或多个位置处的氨基酸的侧链上连接含有巯基的基团；
优选包括如下(c)-(g)中的至少一项：
(c)第3位谷氨酰胺的侧链上连接含有巯基的基团，
(d)第12位赖氨酸的侧链上连接含有巯基的基团，
(e)第20位谷氨酰胺的侧链上连接含有巯基的基团，
(f)第24位的谷氨酰胺的侧链上连接含有巯基的基团，
(g)第28位的天冬酰胺的侧链上连接含有巯基的基团；
更优选为在SEQ ID NO：1所示序列的第24位的谷氨酰胺的侧链上连接含有巯基的基团。
4.根据权利要求3所述的应用，其中，所述含有巯基的基团选自-C(＝O)-Z1-SH或-Z1-SH，Z1为未取代的或氨基取代的C1-4的烷基，所述含有巯基的基团的非巯基一侧与所述氨基酸的侧链中的氨基连接；所述含有巯基的基团优选自-C(＝O)-CH(NH2)-CH2-SH、-CH2-SH、-CH2-CH2-SH或-CH2-CH2-CH2-SH；所述含有巯基的基团更优选为-CH2-CH2-SH。
5.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其中，所述胰高血糖素突变体具有如下任一项所示的序列：
H-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln(-CH2-CH2-SH)-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-OH(SEQ ID NO:2)，
H-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln(-CH2-CH2-SH)-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ ID NO:3)，
H-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys(-C(＝O)-CH(NH2)-CH2-SH)-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-OH(SEQ IDNO:4)，
H-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys(-C(＝O)-CH(NH2)-CH2-SH)-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQID NO:5)，
H-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Cys-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-OH(SEQ ID NO:6)，
H-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Cys-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ ID NO:7)，
H-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Cys-OH(SEQ ID NO:8)，
H-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Cys-NH2(SEQ ID NO:9)。
6.根据权利要求1-5任一项所述的应用，其中，所述聚乙二醇的分子量为1-60KDa，更优选5-50KDa，更优选10-40KDa，更优选15-30KDa，最优选21-29KDa。
7.根据权利要求1-6任一项所述的应用，其中，所述多肽缀合物具有式(I-1)或(I-1’)所示的结构：
Figure FDA0003171463600000021
8.根据权利要求1-7任一项所述的应用，其中，所述糖代谢相关疾病为低血糖。
9.根据权利要求8所述的应用，其中，所述低血糖选自如下的任一种：先天性高胰岛素血症低血糖、糖尿病性低血糖、非糖尿病性低血糖、反应性低血糖、空腹低血糖、妊娠性低血糖、药物诱发的低血糖、手术诱发的低血糖和肿瘤诱发的低血糖。
10.根据权利要求1-7任一项所述的应用，其中，所述糖代谢相关疾病为先天性高胰岛素血症。
11.多肽缀合物在制备用于治疗患有糖代谢相关疾病的受试者的药物中的应用，所述多肽缀合物如权利要求1-7任一项中所定义，所述糖代谢相关疾病如权利要求8-10任一项中所定义；优选地，所述多肽缀合物或包含所述多肽缀合物的组合物被施用于受试者体内；可选地，所述组合物还包括一种或多种药学上可接受的载体。
12.一种多肽缀合物，其用于治疗糖代谢相关疾病，所述多肽缀合物如权利要求1-7任一项中所定义；
优选地，所述多肽缀合物用于治疗患有糖代谢相关疾病的受试者；
优选地，所述糖代谢相关疾病为先天性高胰岛素血症；
可选地，所述糖代谢相关疾病为低血糖，所述低血糖选自如下的任一种：先天性高胰岛素血症低血糖、糖尿病性低血糖、非糖尿病性低血糖、反应性低血糖、空腹低血糖、妊娠性低血糖、药物诱发的低血糖、手术诱发的低血糖和肿瘤诱发的低血糖。
13.一种治疗糖代谢相关疾病的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的多肽缀合物，所述多肽缀合物如权利要求1-7任一项中所定义；
优选地，所述糖代谢相关疾病为先天性高胰岛素血症；
可选地，所述糖代谢相关疾病为低血糖，所述低血糖选自如下的任一种：先天性高胰岛素血症低血糖、糖尿病性低血糖、非糖尿病性低血糖、反应性低血糖、空腹低血糖、妊娠性低血糖、药物诱发的低血糖、手术诱发的低血糖和肿瘤诱发的低血糖。
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