CN100528869C - 一类水飞蓟宾类黄酮木脂素及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种具有抗自由基氧化、保肝护肝、防治老年性痴呆症、抗衰老活性的水飞蓟宾类黄酮木脂素化合物及其可药用盐或溶剂化物。本发明还涉及制备式(1)化合物的制备方法包括其重要中间体及其药物组合物和医药用途。本发明的化合物对SD新生大鼠原代旰细胞有抗氧化损伤保护作用，可以预期作为防止肝脏损伤类药物用途；本发明的化合物具有清除超氧阴离子自由基和二苯基苦基苯肼自由基、抑制自由基诱导之脂过氧化物生成的活性，以及很强的对抗自由基引起的PC12细胞损伤作用，因此可以预期成为治疗由自由基引起的各种疾病之药物。
Description
发明领域
本发明属于有机化学和药物化学领域，具体而言，本发明涉及一类新型的水飞蓟宾类黄酮木脂素的制备方法和用途，该类化合物通过全合成的方法得到。本发明的化合物及其中间体对SD新生大鼠原代肝细胞有抗氧化损伤保护作用，且在同一浓度下，其对细胞抗氧化损伤能力比阳性对照槲皮素还要高出许多，可以预期作为防止肝脏损伤类药物用途；本发明又对该类化合物抗氧自由基活性进行了测试，发现其具有体外清除超氧阴离子自由基、清除二苯基苦基苯肼自由基、抑制自由基诱导之脂过氧化物生成的活性，以上活性表明该类水飞蓟宾类黄酮木脂素可以预期用于制备预防或治疗急性慢性肝损伤类疾病以及由氧自由基引起或与氧自由基有关的其他生理改变或疾病的药物；该类化合物还表现出很强的对抗自由基引起的PC12细胞损伤作用，即对模拟脑神经细胞的PC12细胞有抗氧化损伤保护作用，而且在同一浓度下，其清除自由基保护细胞的能力比阳性对照槲皮素还高，说明其对保护脑神经抗氧化、防治老年性痴呆症有积极作用；以上活性表明该类水飞蓟宾类黄酮木脂素可以预期用于制备预防或治疗急性慢性肝损伤类疾病以及由氧自由基引起或与氧自由基有关的其他生理改变或疾病的药物。
背景技术
水飞蓟宾作为最早发现的一类黄酮木脂素，存在于菊科植物水飞蓟的种子中。在众多抗自由基天然产物中，水飞蓟是少数几个在临床上广泛应用的药物之一。三十多年的临床实验证明该药具有确切的疗效和低毒性(参阅Flora K.等人，Am.J.Gastroenterol，1998，93，139-143；Saller R.等人，Drugs，2001，61(14)，2035-2063)。水飞蓟中水飞蓟宾含量最多，活性也最高。该药作用主要有以下几点。(一)抗自由基活性：水飞蓟素对于由CCl4，半乳糖胺、醇类和其他肝毒素造成的肝损害具有保护作用。1990年Lotteron等人报道了在小鼠肝微粒体内，水飞蓟素能减少由CCl4代谢引起的体外脂质过氧化及由还原型辅酶单独引起的过氧化作用这些都表明水飞蓟素为链中断抗氧化剂或为自由基清除剂。(二)保护肝细胞膜：通过抗脂质过氧化反应维持细胞膜的流动性，保护肝细胞膜。还能阻断真菌毒素鬼笔毒环肽和α-鹅膏蕈碱等与肝细胞上特异受体的结合，抑制其对肝细胞的攻击及跨膜转运，中断其肝肠循环，从而增强肝细胞膜对于多种损害因素的抵抗力。(三)促进肝细胞的修复和再生：水飞蓟宾进入细胞后可以与雌二醇受体结合，并使之激活，活化的受体可以增强肝细胞核内RNA聚合酶1的活性，使RNA转录增强，促进酶及蛋白质的合成，并间接促进DNA的合成，有利于肝细胞的修复和再生；(四)抗肿瘤作用：各种活性氧能氧化鸟嘌呤形成8-羟基鸟嘌呤，造成DNA损伤，进而引起肿瘤，水飞蓟宾作为一个有效的抗自由基物质也显示了预防和治疗肿瘤的作用。此外，水飞蓟宾还可作用于pGp偶联蛋白，作为肿瘤耐药抑制剂以及抗菌耐药抑制剂(Maitrejean等，Bioorganic Medinical Chemitry Letters，(2000)，10，157-160；Guz等，Journal of Medinical Chemitry，(2001)，44，261-268)。因此，以水飞蓟宾为代表的黄酮木脂素类化合物引起了越来越多的关注。
水飞蓟宾类化合物具有确切的疗效，但是由于其水溶性和生物利用度上的一些不足限制了该药物的市场。故寻找水飞蓟宾类新的衍生物，使其能够具有更高或者更新的药理活性，以期获取自主知识产权的新药，实属必要。据此我们设计并制备出一类新的烷氧基取代黄酮木脂素类化合物，并对其多项重要的生物活性进行了测试。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有清除自由基活性、抑制自由基诱导之脂过氧化物生成、保护肝脏细胞损伤、治疗急性慢性肝损伤类疾病以及由氧自由基引起或与氧自由基有关的其他生理改变或疾病以及保护脑神经抗氧化、防治老年性痴呆症的活性化合物。具体而言，本发明提供了一种式(1)所示B环上含有烷氧基取代水飞蓟宾类黄酮木脂素类化合物及其可药用盐或其溶剂化物。
式(1)
其中：R1为氢或1-8个碳的直链或支链烷基；R2为氢、1-3个碳的烷氧基、卤素、烯丙基、羟甲基、芳环上取代或未取代的苄氧基、硝基、氨基；R3为氢或1-8个碳的烷氧基；当R2、R3分别为甲氧基和氢时，R1不为甲基；式(1)中2、3、10、11位的立体构型分别是或同时是R或S构型；式(1)化合物包括经柱层析、重结晶等方法纯化后的光学活性化合物，也包括未经纯化而具有立体异构的混合物。
同时，本发明还提供了一种式(1-5)所示的B环上三连氧取代的二氢黄酮醇类化合物及其可药用盐或其溶剂化物：
其中：R1为含2-8个碳的直链或支链烷基。式(1-5)中2、3位的立体构型分别是或同时是R或S构型；式(1-5)化合物包括经柱层析、重结晶等方法纯化后的光学活性化合物，也包括未经纯化而具有立体异构的混合物；该类化合物为合成式(1)化合物的重要中间体。
具体而言，本发明提供了一种式(1)所示的B环上含有烷氧基取代黄酮木脂素类化合物及其可药用盐或其溶剂化物。
其中：R1为氢或1-8个碳的直链或支链烷基；R2为氢、1-3个碳的烷氧基、卤素、烯丙基、羟甲基、芳环上取代或未取代的苄氧基、硝基、氨基；R3为氢或1-8个碳的烷氧基。当R2、R3分别为甲氧基和氢时，R1不为甲基；式(1)中2、3、10、11位的立体构型分别是或同时是R或S构型；式(1)化合物包括经柱层析、重结晶等方法纯化后的光学活性化合物，也包括未经纯化而具有立体异构的混合物。
本发明优选的式(1)化合物包括：
化合物1-a：2-[2，3-二氢-3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-2-羟甲基-8-乙氧基-1，4-苯并二氧六环-6-]-2，3-二氢-3，5，7-三羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮；
化合物1-b：2-[2，3-二氢-3-(4-羟基苯基)-2-羟甲基-8-乙氧基-1，4-苯并二氧六环-6-]-2，3-二氢-3，5，7-三羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮；
化合物1-c：2-[2，3-二氢-3-(4-羟基-3，5-二甲氧基苯基)-2-羟甲基-8-乙氧基-1，4-苯并二氧六环-6-]-2，3-二氢-3，5，7-三羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮；
化合物1-d：2-[2，3-二氢-3-(4-羟基苯基)-2-羟甲基-8-甲氧基-1，4-苯并二氧六环-6-]-2，3-二氢-3，5，7-三羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮；
化合物1-e：2-[2，3-二氢-3-(4-羟基-3，5-二甲氧基苯基)-2-羟甲基-8-甲氧基-1，4-苯并二氧六环-6-]-2，3-二氢-3，5，7-三羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮；
化合物1-f：2-[2，3-二氢-3-(3-苄氧基-4-羟基苯基)-2-羟甲基-8-甲氧基-1，4-苯并二氧六环-6-]-2，3-二氢-3，5，7-三羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮；
化合物1-g：2-[2，3-二氢-3-(3-烯丙基-4-羟基苯基)-2-羟甲基-8-甲氧基-1，4-苯并二氧六环-6-]-2，3-二氢-3，5，7-三羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮；
化合物1-h：2-[2，3-二氢-3-(3-烯丙基-4-羟基-5-甲氧基苯基)-2-羟甲基-8-甲氧基-1，4-苯并二氧六环-6-]-2，3-二氢-3，5，7-三羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮。
同时，本发明提供了一种式(1-5)所示的黄酮类化合物及其可药用盐或其溶剂化物：
其中：R1为含2-8个碳的直链或支链烷基。式(1-5)中2、3位的立体构型分别是或同时是R或S构型；式(1-5)化合物包括经柱层析、重结晶等方法纯化后的光学活性化合物，也包括未经纯化而具有立体异构的混合物。
本发明优选的式(1-5)化合物为：5′-乙氧基-3，5，7，3′，4′-五羟基二氢黄酮(化合物1-5-1)。
本发明的另一目的是提供了式(1)化合物的全合成方法，该方法的合成工艺路线特征是：以化合物2，4，6-三甲氧甲氧基苯乙酮(1-1)和3-烷氧基-4，5-甲氧甲氧基苯甲醛(1-2)为起始原料，在有机溶剂和碱水溶液中缩合得到查耳酮(1-3)，在碱性过氧化氢的作用下环氧化得到环氧查耳酮(1-4)，(1-4)在酸性有机溶剂中环合得到二氢黄酮醇(1-5)；在催化剂存在下，(1-5)与松柏醇类似物(1-6)进行自由基偶联反应生成化合物(1)，具体流程如下所示：
其中R1，R2，R3的定义与式(1)化合物定义相同。
本发明的另一个目的是提供了式(1)化合物用于防治肝脏细胞损伤、保肝护肝的用途。
本发明的再一个目的是提供了一种含有式(1)化合物的用于防治肝脏细胞损伤、保肝护肝的药物或药物组合物。
本发明的另一个目的是提供了一种式(1)化合物用于抗氧化、抗衰老、防治早老性痴呆症的用途。
本发明的再一个目的是提供了一种含有式(1)化合物的用于制备基于抗氧化自由基机制的抗衰老药物、防治早老性痴呆症的药物或药物组合物。
本发明的又一目的是提供了式(1)化合物的用于制备由氧自由基引起或与氧自由基有关的生理改变或疾病特别是心血管及脑血管病变药物的用途。
本发明的再一个目的是提供了一种含有式(1)化合物的用于制备由氧自由基引起或与氧自由基有关的生理改变或疾病特别是心血管及脑血管病变药物或药物组合物。
具体实施方式
为了更好地理解本发明的实质，下面分别用实施例的形式说明化合物制备的过程，实施例给出了代表性化合物的部分物理和化学及波谱学数据。必须说明，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。
实施例1：化合物1-3-1(1-(2，4，6-三甲氧甲氧基苯基)-3-(3，4-二甲氧甲氧基-5-甲氧基苯基)丙烯酮)的制备：
3克3-甲氧基-4，5-二甲氧甲氧基苯甲醛和3.5克2，4，6-三甲氧甲氧基苯乙酮溶解于40mL乙醇中，加入溶解有10g氢氧化钾的20mL水液，于室温搅拌15小时。减压蒸去乙醇，加入30mL水，乙酸乙酯提取(3×20mL)。合并有机相后，依次用饱和亚硫酸氢钠(40mL)和饱和食盐水(40mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤浓缩，经柱层析得化合物1-3-1黄色油状物4.4g，收率70％。
Rf(PET/EtOAc＝2∶1)0.36；UV(MeOH)λmax＝208,321nm；1H NMR(400MHz，氘代氯仿)δ：3.34(s，6H，OCH3)，3.43(s，3H，OCH3)，3.46(s，3H，OCH3)，3.56(s，3H，OCH3)，3.90(s，3H，OCH3)，5.06(s，4H，OCH2O)，5.11(s，4H，OCH2O)，5.14(s，2H，OCH2O)，6.51(s，2H，H-3′，5′)，6.74(d，J＝1.6Hz，1H，H-2)，6.80(d，J＝16.0Hz，1H，H-α)，6.91(d，J＝1.6Hz，1H，H-6)，7.17(d，J＝16.0Hz，1H，H-β)；ESI-MS：539(M+1)+。
根据实施例1相同的方法制备化合物1-3-2：
实施例2：化合物1-3-2(1-(2，4，6-三甲氧甲氧基苯基)-3-(3，4-二甲氧甲氧基-5-乙氧基苯基)丙烯酮)的制备：
Rf(PET/EtOAc＝2∶1)0.40；UV(MeOH)λmax＝210,325nm；1H NMR(400MHz，氘代氯仿)δ：1.39(t，J＝7.2Hz，3H，CH3)，3.34(s，6H，OCH3)，3.43(s，3H，OCH3)，3.46(s，3H，OCH3)，3.56(s，3H，OCH3)，4.02(q，J＝7.2Hz，2H，CH2)，5.06(s，4H，OCH2O)，5.11(s，4H，OCH2O)，5.14(s，2H，OCH2O)，6.51(s，2H，H-3′，5′)，6.74(d，J＝1.6Hz，1H，H-2)，6.80(d，J＝16.0Hz，1H，H-α)，6.91(d，J＝1.6Hz，1H，H-6)，7.17(d，J＝16.0Hz，1H，H-β)；ESI-MS：553(M+1)+。
实施例3：化合物1-4-1(1-(2，4，6-三甲氧甲氧基苯基)-3-(3-甲氧基-4，5-二甲氧甲氧基苯基)环氧丙酮)的制备：
3克化合物1-3-1溶解于50毫升甲醇中，于搅拌状态下加入2N氢氧化钠4mL，30％过氧化氢4mL，于室温搅拌10小时，减压蒸去溶剂，加入50mL水，乙酸乙酯提取(3×30mL)。合并有机相后用饱和食盐水(40mL)洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤，浓缩得黄色油状物2.6克，收率85％，可直接用于下一步反应。
Rf(PET/EtOAc＝2∶1)0.37；UV(MeOH)λmax＝205,278nm；1H NMR(400MHz，氘代氯仿)δ：3.34(s，6H，OCH3)，3.43(s，3H，OCH3)，3.46(s，3H，OCH3)，3.56(s，3H，OCH3)，3.87(s，3H，OCH3)，3.89(d，J＝1.6Hz，1H，H-β)，3.93(d，J＝1.6Hz，1H，H-α)，5.06(s，4H，OCH2O)，5.11(s，4H，OCH2O)，5.14(s，2H，OCH2O)，6.51(s，2H，H-3′，5′)，6.74(d，J＝1.6Hz，1H，H-2)，6.91(d，J＝1.6Hz，1H，H-6)；ESI-MS：555(M+1)+。
根据实施例3相同的方法制备化合物1-4-2：
实施例4：化合物1-4-2(1-(2，4，6-三甲氧甲氧基苯基)-3-(3-乙氧基-4，5-二甲氧甲氧基苯基)环氧丙酮)的制备：
Rf(PET/EtOAc＝2∶1)0.40；UV(MeOH)λmax＝206,281nm；1H NMR(400MHz，氘代氯仿)δ：1.39(t，J＝7.2Hz，3H，CH3)，3.34(s，6H，OCH3)，3.43(s，3H，OCH3)，3.46(s，3H，OCH3)，3.56(s，3H，OCH3)，3.91(d，J＝1.6Hz，1H，H-β)，3.94(d，J＝1.6Hz，1H，H-α)，4.03(q，J＝7.2Hz，2H，CH2)，5.06(s，4H，OCH2O)，5.11(s，4H，OCH2O)，5.14(s，2H，OCH2O)，6.51(s，2H，H-3′，5′)，6.74(d，J＝1.6Hz，1H，H-2)，6.91(d，J＝1.6Hz，1H，H-6)；ESI-MS：569(M+1)+。
实施例5：化合物1-5-1(5′-乙氧基-3，5，7，3′，4′-五羟基二氢黄酮)的制备：
2.8克化合物1-4-2溶解于35mL甲醇和15mL四氢呋喃中，向其中滴加5mL浓盐酸，于50-55℃搅拌30分钟，减压蒸去溶剂，乙酸乙酯提取(3×30mL)，合并有机相后用饱和食盐水(40mL)洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤，浓缩，经柱层析得黄色粉末0.75克，收率45％。
Rf(CHCl3/MeOH＝10∶1)0.15；1H NMR(400MHz，氘代丙酮)δ：1.33(t，J＝7.2Hz，3H，CH3)，4.08(q，2H，J＝7.2Hz，CH2)，4.62(dd，J＝12.0，4.0Hz，1H，H-3)，4.68(d，J＝4.0Hz，1H，3-OH)，4.97(d，J＝12.0Hz，1H，H-2)，5.93(d，J＝2.0Hz，1H，H-6)，5.97(d，J＝2.0Hz，1H，H-8)，6.71(d，J＝2.0Hz，1H，H-2′)，6.73(d，J＝2.0Hz，1H，H-6′)，11.71(s，1H，5-OH)；ESI-MS：349(M+1)+。
实施例6：化合物1-a：{2-[2，3-二氢-3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-2-羟甲基-乙氧基-1，4-苯并二氧六环-6-]-2，3-二氢-3，5，7-三羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮}的制备：
在干燥氮气保护的反应瓶中加入0.6克化合物1-5-1和化合物1-6-1(松柏醇)0.75克，用无水丙酮40mL和无水苯120mL溶解，再加入1.5克碳酸银，于55-60℃搅拌20分钟，过滤，母液浓缩，经柱层析得浅黄色粉末0.32克，收率27％。
Rf(CHCl3/MeOH/EtOAc/acetone/HCOOH＝11∶0.5∶1∶1∶0.1)0.25；1H NMR(400MHz，氘代丙酮)δ：1.35(t，J＝7.2Hz，3H，CH3)，3.51(m，1H，H-23a)，3.81(s，3H，OCH3)，3.87(q，J＝7.2Hz，2H，CH2)，4.07(m，1H，H-23b)，4.17(m，1H，H-10)，4.68(d，J＝12.0Hz，1H，H-3)，4.95(d，J＝8.0Hz，1H，H-11)，5.03(d，J＝12.0Hz，1H，H-2)，5.92(d，J＝2.0Hz，1H，H-6)，5.96(d，J＝2.0Hz，1H，H-8)，6.76-6.85(m，5H，Ar-H)，11.67(s，1H，5-OH)；ESI-MS：527(M+1)+。
根据实施例6相同的方法制备得到以下表一中所列化合物：
表一.
实施例7：化合物1-b{2-[2，3-二氢-3-(4-羟基苯基)-2-羟甲基-8-乙氧基-1，4-苯并二氧六环-6-]-2，3-二氢-3，5，7-三羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮}：Rf(CHCl3/MeOH/EtOAc/acetone/HCOOH＝11∶0.5∶1∶1∶0.1)0.15；1H NMR(400MHz，氘代丙酮)δ：1.33(t，J＝7.2Hz，3H，CH3)，3.51(m，1H，H-23a)，3.98(q，J＝7.2Hz，2H，CH2)，4.03(m，1H，H-23b)，4.17(m，1H，H-10)，4.68(d，J＝12.0Hz，1H，H-3)，4.95(d，J＝8.0Hz，1H，H-11)，5.03(d，J＝12.0Hz，1H，H-2)，5.93(d，J＝2.0Hz，1H，H-6)，5.97(d，J＝2.0Hz，1H，H-8)，6.73-6.88(m，6H，Ar-H)，11.67(s，1H，5-OH)；ESI-MS：497(M+1)+。
实施例8：化合物1-c{2-[2，3-二氢-3-(4-羟基-3，5-二甲氧基苯基)-2-羟甲基-8-乙氧基-1，4-苯并二氧六环-6-]-2，3-二氢-3，5，7-三羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮}：Rf(CHCl3/MeOH/EtOAc/acetone/HCOOH＝11∶0.5∶1∶1∶0.1)0.27；1H NMR(400MHz，氘代丙酮)δ：1.34(t，J＝7.2Hz，3H，CH3)，3.51(m，1H，H-23a)，3.83(s，6H，OCH3)，3.99(q，J＝7.2Hz，2H，CH2)，4.06(m，1H，H-23b)，4.17(m，1H，H-10)，4.68(d，J＝12.0Hz，1H，H-3)，4.95(d，J＝8.0Hz，1H，H-11)，5.03(d，J＝12.0Hz，1H，H-2)，5.93(d，J＝2.0Hz，1H，H-6)，5.97(d，J＝2.0Hz，1H，H-8)，6.75-6.89(m，4H，Ar-H)，11.67(s，1H，5-OH)；ESI-MS：557(M+1)+。
实施例9：化合物1-d{2-[2，3-二氢-3-(4-羟基苯基)-2-羟甲基-8-甲氧基-1 苯并二氧六环-6-]-2，3-二氢-3，5，7-三羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮}：Rf(CHCl3/MeOH/EtOAc/acetone/HCOOH＝11∶0.5∶1∶1∶0.1)0.19；1H NMR(400MHz，氘代丙酮)δ：3.51(m，1H，H-23a)，3.91(s，3H，OCH3)，4.06(m，1H，H-23b)，4.17(m，1H，H-10)，4.68(d，J＝12.0Hz，1H，H-3)，4.95(d，J＝8.0Hz，1H，H-11)，5.03(d，J＝12.0Hz，1H，H-2)，5.93(d，J＝2.0Hz，1H，H-6)，5.95(d，J＝2.0Hz，1H，H-8)，6.76-6.85(m，6H，Ar-H)，11.67(s，1H，5-OH)；ESI-MS：483(M+1)+。
实施例10：化合物1-e{2-[2，3-二氢-3-(4-羟基-3，5-二甲氧基苯基)-2-羟甲基-8-甲氧基-1，4-苯并二氧六环-6-]-2，3-二氢-3，5，7-三羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮}：Rf(CHCl3/MeOH/EtOAc/acetone/HCOOH＝11∶0.5∶1∶1∶0.1)0.27；1H NMR(400MHz，氘代丙酮)δ：3.51(m，1H，H-23a)，3.85(s，6H，OCH3)，3.99(s，3H，OCH3)，4.06(m，1H，H-23b)，4.17(m，1H，H-10)，4.63(d，J＝12.0Hz，1H，H-3)，4.94(d，J＝8.0Hz，1H，H-11)，5.01(d，J＝12.0Hz，1H，H-2)，5.90(d，J＝2.0Hz，1H，H-6)，5.97(d，J＝2.0Hz，1H，H-8)，6.75-6.89(m，4H，Ar-H)，11.67(s，1H，5-OH)；ESI-MS：543(M+1)+。
实施例11：化合物1-f{2-[2，3-二氢-3-(3-苄氧基-4-羟基苯基)-2-羟甲基-8-甲氧基-1，4-苯并二氧六环-6-]-2，3-二氢-3，5，7-三羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮}：Rf(CHCl3/MeOH/EtOAc/acetone/HCOOH＝11∶0.5∶1∶1∶0.1)0.16；1H NMR(400Mhz，氘代丙酮)δ：3.51(m，1H，H-23a)，3.91(s，3H，OCH3)，4.06(m，1H，H-23b)，4.17(m，1H，H-10)，4.68(d，J＝12.0Hz，1H，H-3)，4.95(d，J＝8.0Hz，1H，H-11)，5.03(d，J＝12.0Hz，1H，H-2)，5.19(s，2H，CH2)，5.93(d，J＝2.0Hz，1H，H-6)，5.95(d，J＝2.0Hz，1H，H-8)，6.76-7.35(m，10H，Ar-H)，11.67(s，1H，5-OH)；ESI-MS：589(M+1)+。
实施例12：化合物1-g{2-[2，3-二氢-3-(3-烯丙基-4-羟基苯基)-2-羟甲基-8-甲氧基-1，4-苯并二氧六环-6-]-2，3-二氢-3，5，7-三羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮}：Rf(CHCl3/MeOH/EtOAc/acetone/HCOOH＝11∶0.5∶1∶1∶0.1)0.17；1H NMR(400MHz，氘代丙酮)δ：3.40(d，J＝6.4Hz，2H，CHCH＝CH2)，3.51(m，1H，H-23a)，3.91(s，3H，OCH3)，4.06(m，1H，H-23b)，4.17(m，1H，H-10)，4.68(d，J＝12.0Hz，1H，H-3)，4.95(d，J＝8.0Hz，1H，H-11)，5.03(d，J＝12.0Hz，1H，H-2)，5.15(m，2H，CHCH＝CH2)，5.93(d，J＝2.0Hz，1H，H-6)，5.95(d，J＝2.0Hz，1H，H-8)，6.01(m，1H，CHCH＝CH2)，6.76-6.84(m，5H，Ar-H)，11.67(s，1H，5-OH)；ESI-MS：523(M+1)+。
实施例13：化合物1-h{2-[2，3-二氢-3-(3-烯丙基-4-羟基-5-甲氧基苯基)-2-羟甲基-8-甲氧基-1，4-苯并二氧六环-6-]-2，3-二氢-3，5，7-三羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮}：Rf(CHCl3/MeOH/EtOAc/acetone/HCOOH＝11∶0.5∶1∶1∶0.1)0.19；1H NMR(400MHz，氘代丙酮)δ：3.40(d，J＝6.4Hz，2H，CHCH＝CH2)，3.51(m，1H，H-23a)，3.89(s，3H，OCH3)，3.91(s，3H，OCH3)，4.06(m，1H，H-23b)，4.17(m，1H，H-10)，4.68(d，J＝12.0Hz，1H，H-3)，4.95(d，J＝8.0Hz，1H，H-11)，5.03(d，J＝12.0Hz，1H，H-2)，5.15(m，2H，CHCH＝CH2)，5.93(d，J＝2.0Hz，1H，H-6)，5.95(d，J＝2.0Hz，1H，H-8)，6.01(m，1H，CHCH＝CH2)，6.73-6.89(m，4H，Ar-H)，11.67(s，1H，5-OH)；ESI-MS：553(M+1)+。
式(1)所示的B环上含有烷氧基取代水飞蓟宾类黄酮木脂素类化合物具有多种重要的生物活性，本发明将该系列化合物对过氧化氢致大鼠乳鼠原代肝细胞损伤体外模型进行了肝细胞损伤保护活性筛选。该类B环上含有烷氧基取代水飞蓟宾类黄酮木脂素类化合物被发现具有保护肝细胞和促进肝细胞修复的作用。本发明又对该类化合物抗氧自由基活性进行了测试，发现其具有体外清除超氧阴离子自由基、清除二苯基苦基苯肼自由基、抑制自由基诱导之脂过氧化物生成的活性。以上活性表明该类化合物可以预期用于制备预防或治疗急性慢性肝损伤类疾病以及由氧自由基引起或与氧自由基有关的其他生理改变或疾病的药物。该类化合物还表现出很强的对抗自由基引起的PC12细胞损伤作用，即对模拟脑神经细胞的PC12细胞有抗氧化损伤保护作用，而且在同一浓度下，其清除自由基保护细胞的能力比阳性对照槲皮素还高，说明其对保护脑神经抗氧化、防治老年性痴呆症有积极作用。
本发明的式(1)化合物或其可药用盐及其溶剂化物可以与药学上常用的辐料或载体结合，制备得到具有保护肝细胞急性和慢性损伤活性从而可以用于预防以及治疗肝脏疾病的药物组合物或者保健品。上述各类药物组合物或者保健品可以采用注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、外用搽剂、软膏剂等剂型药物。
本发明的式(1)化合物或其或药用盐及其溶剂化物还可以与现已上市的肝脏保护及肝病治疗药物药物如联苯双酯、水飞蓟素、水飞蓟宾葡甲胺、齐墩果酸、二氯乙酸二异丙胺、原卟啉钠(protoporphyrin disodium)、马洛替酯(malotilate)、熊去氧胆酸等联合使用，制备得到具有保护肝脏活性的组合物，可用于治疗急慢性病毒性肝炎、慢性肝炎、早期肝硬化、脂肪肝及中毒性肝损伤疾病药品或者保健品。上述各类药物组合物或者保健品可以采用注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、外用搽剂、软膏剂等剂型药物。
本发明的式(1)化合物或其可药用盐及其溶剂化物可以与现已上市的抗自由基氧化剂药物如超氧化物歧化酶(SOD)等联合使用，制备得到具有防御自由基引起的损害活性的抗氧化药物组合物或者保健品，用于治疗上述疾病。上述各类药物组合物或者保健品可以采用注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、外用搽剂、软膏剂等剂型药物。
氧压是由机体细胞产生和清除自由基之间的失调所引起的，可诱发多种疾病。氧压可引起神经系统疾病，如中风，帕金森氏病，阿尔茨海默病。另外它还跟其它疾病的病理途径有关，如心脏病、自身免疫性疾病、肿瘤、病毒性疾病(如AIDS、肝炎)。因此寻找新的抗氧化剂成为治疗由氧压引起的各种疾病的有效途径。为了更好地理解本发明的实质，下面分别用药理实施例的形式对化合物体外清除阴离子超氧化自由基的活性试验；体外清除二苯基苦基苯肼自由基(1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)的活性试验；测定化合物对双氧水H2O2所致PC12(大鼠肾上嗜铬细胞瘤)细胞损伤的保护作用；化合物抑制自由基诱导之脂过氧化物生成等试验说明本发明权利要求中化合物的抗氧化活性。本发明还用过氧化氢致SD大鼠乳鼠原代肝细胞损伤体外模型的肝细胞损伤保护活性的药理实验结果，共同说明其在制药领域中的新用途。药理实施例给出了代表性化合物的部分活性数据。同样必须说明，本发明的药理实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。
药理实施例1化合物I-a体外清除超氧阴离子自由基的活性试验
化合物I-a清除超氧阴离子自由基能力的检测乃使用吩嗪-N甲硫酸盐-NADH(phenazine methosulfate-NADH)系统，用四唑氮蓝(nitroblue tetrazolium)还原方法检定。用3毫升含有78μM的NADH、50μM四唑氮蓝和10μM吩嗪-N 甲硫酸盐在pH值为8.0的16mM Tris-HCl缓冲液中产生出超氧阴离子自由基，在不同浓度的化合物I-a检测其活性。超氧阴离子自由基和四唑氮蓝反应生成物的颜色用分光光度计在560nm波长下监测，槲皮素被用作阳性对照药物。试验结果见表二。
表二
试验结果表明，化合物I-a具有一定的超氧阴离子自由基清除作用，但是在同一浓度下，其清除能力没有槲皮素高。结论：该类B环上含有烷氧基取代水飞蓟宾类黄酮木脂素类化合物属于具有一定清除超氧阴离子自由基的抗氧化物质。
药理实施例2化合物I-c体外清除二苯基苦基苯肼自由基(1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)的活性试验
DPPH的甲醇溶液在517nm有强吸收值，其被抗氧化物还原时，吸收值下降，吸光度越低，其抗氧化作用越强。在250μL反应体系中含有各种不同浓度的化合物I-c25μL，DPPH(0.4mg/mL)的甲醇溶液40μL及甲醇溶液185μL，37℃水浴反应30分钟后，在517nm处测定吸光度。DPPH的甲醇液和槲皮素分别作为阴性、阳性对照，实验结果见表三。
表三
试验结果表明，化合物I-c具有一定的DPPH自由基清除作用，但是在同一浓度下，其清除能力没有槲皮素高。结论：该类B环上含有烷氧基取代水飞蓟宾类黄酮木脂素类化合物属于具有一定清除DPPH自由基的抗氧化物质。
药理实施例3化合物I-c对双氧水H2O2所致PC12细胞损伤的保护作用活性试验
H2O2是一种主要的活性自由基的前体，它可引起中枢神经系统细胞的凋亡，PC12细胞(大鼠肾上嗜铬细胞瘤)可模拟脑神经细胞，因此常用它来作为研究药物与神经细胞之间关系的模型，用MTT测细胞的存活率，如果待测化合物有清除由H2O2引起的自由基，保护神经细胞的作用，OD值高，细胞存活率就高，反之就低。对唐希灿所报道的方法(Xiaoqiu Xiao等，Neurosci Letter，1999，275：73-76)加以改进测定化合物的保护作用。PC12细胞用DMEM培养基培养，培养基中含10％胎牛血清，100U/mL青霉素和100U/mL链霉素。细胞以每孔6000个的密度加到96孔板中，在37℃，50％CO2潮湿空气的培养箱中培养36小时。细胞存活率用倒置显微镜观观察和改良的MTT法。细胞经36小时的孵育后，分别加新配的化合物I-c的二甲亚砜溶液以浓度梯度加入到各孔中。作用2小时后加入新配的H2O2(终浓度为500μmol/L)作用3小时，显微镜观察记录，弃去原培养液，加入新的培养液100μL，然后加入MTT 10μL，3小时后，小心吸去培养液，加入150μL DMSO溶解甲臜，于570nm处读数，用槲皮素作阳性对照，实验结果见表四。
表四化合物I-c及阳性对照槲皮素对双氧水损伤PC12细胞保护率
试验结果表明，化合物I-c具有很强的对抗自由基引起的PC12细胞损伤作用，即对模拟脑神经细胞的PC12细胞有抗氧化损伤保护作用。而且在同一浓度下，其清除自由基保护细胞的能力比阳性对照槲皮素还高。结论：该类B环上含有烷氧基取代水飞蓟宾类黄酮木脂素类化合物属于具有强效保护模拟脑神经细胞的PC12细胞作用的抗氧化物质。
测定化合物对H2O2所致PC12细胞损伤的保护作用可作为初步探讨其保护中枢脑神经细胞的作用机理。故该类B环上含有烷氧基取代水飞蓟宾类黄酮木脂素类化合物表现出对双氧水损伤所致PC12细胞的保护作用，说明其对老年性痴呆证的治疗有积极作用。
药理实施例4化合物I-b抑制自由基诱导之脂过氧化物生成的活性试验
1.实验原理：脂质过氧化是自由基作用于多不饱和脂肪酸的产物，含量与自由基的生成正相关，由于机体有抗氧化的酶系及非酶系的保护作用，使自由基不断产生又不断被清除。随着年龄的增长，体内的抗氧化剂不断下降，清除自由基的能力逐渐减弱，脂质过氧化作用则增强，脂质过氧化产物增多。因此，测定样品抗脂质过氧化作用，是筛选抗氧化，抗衰老药物的重要指标之一。
2.化合物I-b抑制自由基诱导之脂过氧化物生成乃通过鼠肝微粒体检测。(1)肝微粒体的制备：实验大鼠断头处死，迅速取出肝脏，用超速离心法制备肝微粒体。(2)样品对鼠肝脂质过氧化的抑制作用：在含FeSO4(4μmol/L)与Vc(50μmol/L)的1mL缓冲液中加入200μg/mL微粒体中，以诱导产生脂质过氧化，同时加入不同浓度的I-b样品，37℃孵育30分钟后加入1mL三氯醋酸(20％)中止反应加入1.5mL硫代巴比妥酸(0.76％)，100℃沸水浴20分钟，离心去除蛋白沉淀，在532nm波长下测定上清吸光度。脂质过氧化以反应中生成的丙二醛表示，实验以槲皮素作为阳性对照。试验结果见表五。
表五.样品对大鼠肝微粒体脂质过氧化的抑制作用
试验结果表明，化合物I-b具有较强的抑制自由基诱导之脂过氧化物生成能力，即对细胞有抗氧化损伤保护作用。但在同一浓度下，其对细胞抗氧化损伤能力比阳性弱。结论：该类B环上含有烷氧基取代水飞蓟宾类黄酮木脂素类化合物属于具有有效保护细胞脂质过氧化物质；提示其具有抗氧化、抗衰老的作用。
药理实施例5化合物I-5-1对SD新生大鼠原代肝细胞双氧水损伤模型的保护作用试验
无菌取出SD大鼠新生乳鼠(5日龄内)肝脏，剪碎，用0.25％的胰蛋白酶消化，制成肝细胞悬液。将肝细胞悬液收集在锥形瓶中，用200目双层尼龙过滤，再用清洗液清洗，离心3次，以培养液重悬，即可得到大部分为肝实质细胞的悬液。
用1640培养液(内含10％小牛血清，105U/L青霉素，100mg/L链霉素10mg/L胰岛素)稀释纯化的肝细胞悬液，每毫升含1.0×106个肝细胞。将上述肝细胞悬液加入96孔(每孔0.1ml)培养板中，置5％CO2培养箱中，在37℃下培养12h后，吸弃上清，加入0.6mmol/L的H2O2。作用1h后，分别加入高、中、低3种不同浓度的I-5-1样品试验药液，每一浓度至少设3个复孔，同时设溶剂和阳性对照组。继续培养48h后，吸弃上清，收集肝细胞样品，570nm波长下用酶标仪计算保护率和增生指数，结果见表六。
表六.样品和槲皮素对SD新生大鼠原代肝细胞双氧水损伤模型的保护作用
试验结果表明：化合物I-5-1具有非常强的保护SD新生大鼠原代肝细胞免受双氧水损伤模型的能力，即对SD新生大鼠原代肝细胞有抗氧化损伤保护作用；且在同一浓度下，其对细胞抗氧化损伤能力比阳性对照槲皮素还要高出许多；结论：该类B环上含有烷氧基取代水飞蓟宾类黄酮木脂素类化合物及其中间体属于具有强效保护细胞抗氧化物质，提示其具有保肝护肝功效以及预期用于制备预防或治疗急性慢性肝损伤类疾病的作用。
Claims (15)
1.一种式(1)所示的B环上含有烷氧基取代水飞蓟宾类黄酮木脂素类化合物或其药用盐：
式(1)
其中：R1为氢或1-8个碳的直链或支链烷基；R2为氢、1-3个碳的烷氧基、卤素、烯丙基、羟甲基、苄氧基、氨基；R3为氢或1-8个碳的烷氧基；当R2、R3分别为甲氧基和氢时，R1不为甲基；式(1)中2、3、10、11位的立体构型分别是或同时是R或S构型。
2.具有式(1)所示的B环上含有烷氧基取代水飞蓟宾类黄酮木脂类化合物或基药用盐，它们是：
化合物1-a：2-[2，3-二氢-3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-2-羟甲基-8-乙氧基-1，4-苯并二氧六环-6-]-2，3-二氢-3，5，7-三羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮；
化合物1-b：2-[2，3-二氢-3-(4-羟基苯基)-2-羟甲基-8-乙氧基-1，4-苯并二氧六环-6-]-2，3-二氢-3，5，7-三羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮；
化合物1-c：2-[2，3-二氢-3-(4-羟基-3，5-二甲氧基苯基)-2-羟甲基-8-乙氧基-1，4-苯并二氧六环-6-]-2，3-二氢-3，5，7-三羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮；
化合物1-d：2-[2，3-二氢-3-(4-羟基苯基)-2-羟甲基-8-甲氧基-1，4-苯并二氧六环-6-]-2，3-二氢-3，5，7-三羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮；
化合物1-e：2-[2，3-二氢-3-(4-羟基-3，5-二甲氧基苯基)-2-羟甲基-8-甲氧基-1，4-苯并二氧六环-6-]-2，3-二氢-3，5，7-三羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮；
化合物1-f：2-[2，3-二氢-3-(3-苄氧基-4-羟基苯基)-2-羟甲基-8-甲氧基-1，4-苯并二氧六环-6-]-2，3-二氢-3，5，7-三羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮；
化合物1-g：2-[2，3-二氢-3-(3-烯丙基-4-羟基苯基)-2-羟甲基-8-甲氧基-1，4-苯并二氧六环-6-]-2，3-二氢-3，5，7-三羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮；
化合物1-h：2-[2，3-二氢-3-(3-烯丙基-4-羟基-5-甲氧基苯基)-2-羟甲基-8-甲氧基-1，4-苯并二氧六环-6-]-2，3-二氢-3，5，7-三羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮。
3.权利要求1中式(1)化合物的制备方法，包括将式(1-5)化合物与式(1-6)化合物在催化剂存在下进行自由基偶联反应得到式(1)化合物：
其中R1，R2，R3的定义如权利要求1；当R2、R3分别为甲氧基和氢时，R1不为甲基；反应式中催化剂为碳酸银，氧化银，六氰合铁酸钾，辣根过氧化酶；溶剂为单独的苯或为苯与甲醇、乙醇、丙酮、四氢呋喃中的任一种溶剂组成的混合溶剂；反应温度为20-80℃。
4.根据权利要求3的制备方法，其中催化剂为碳酸银。
5.根据权利要求3的制备方法，其中溶剂为体积比3∶1的苯与丙酮组成的混合溶剂。
6.根据权利要求3的制备方法，其中式(1-5)化合物由式(1-4)化合物酸化环合而制得：
其中R1的定义如权利要求1；
反应式中的酸为盐酸，硫酸或冰乙酸；反应中的溶剂为甲醇，乙醇，丙醇，四氢呋喃或任意两种所组成的混合溶剂；反应温度为20-80℃。
7.根据权利要求6的制备方法，其中酸为盐酸。
8.根据权利要求6的制备方法，其中式(1-4)化合物由式(1-3)化合物在碱催化下，由过氧化氢环氧化制备而得：
其中R1的定义如权利要求1；反应式中的碱为氢氧化钠，氢氧化钾；溶剂为甲醇，乙醇，丙醇，四氢呋喃或任意两种所组成的混合溶剂；反应温度为0-50℃。
9.根据权利要求8的制备方法，其中溶剂为甲醇。
10.根据权利要求8的制备方法，其中式(1-3)化合物由式(1-1)化合物和式(1-2)化合物缩合而制得：
其中R1的定义如权利要求1；反应式中的碱为氢氧化钠，氢氧化钾；溶剂为甲醇，乙醇，丙醇或任意两种所组成的混合溶剂；反应温度为0-50℃。
11.根据权利要求10的制备方法，其中溶剂为甲醇。
12.根据权利要求3和6的式(1-5)所示的二氢黄酮醇类化合物：
其中：R1为含2-8个碳的直链或支链烷基；
式(1-5)中2、3位的立体构型分别是或同时是R或S构型。
13.根据权利要求12的式(1-5)所示的二氢黄酮醇类化合物，它是：
化合物1-5-1：3’-乙氧基-3，5，7，4’，5’-五羟基二氢黄酮。
14.一种用于预防或治疗急性慢性肝损伤疾病以及由氧自由基引起或与氧自由基有关的基他生理改变引起的疾病之药物组合物，其含有作为活性成分的治疗有效量的权利要求1、2、12、13所述的B环上含有烷氧基取代水飞蓟宾类黄酮木脂素类化合物及其中间体或其可药用盐或者它们的混合物和可药用辅料。
15.根据权利要求14的药物组合物，其中所述由氧自由基引起或与氧自由基有关的其他生理改变引起的疾病选自炎症疾病、自身免度性疾病、老年性痴呆、肿瘤、心肌缺血、心肌肥厚、衰老、变态反应和动脉粥样硬化疾病。
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