CN101475576B - 一类黄酮木质素类化合物及其制备方法和药物用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一类黄酮木质素类化合物及其制备方法和药物用途，具体而言，本发明涉及一类具有抑制黄嘌呤氧化酶活性、对脑神经细胞有抗氧化损伤保护作用、防治老年性痴呆症的A环二氧六环的黄酮木质素类化合物的制备方法及其医药用途。该类化合物具有强效抑制黄嘌呤氧化酶活性，可以预期发展成为防治由黄嘌呤氧化酶引起的疾病包括痛风病的药物或药物组合物。该类化合物还对模拟脑神经细胞的PC12细胞有强效抗氧化损伤保护作用，可以预期发展成为保护脑神经抗氧化、防治老年性痴呆症的药物或药物组合物。

Description

一类黄酮木质素类化合物及其制备方法和药物用途

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体而言，本发明涉及具有抑制黄嘌呤氧化酶、对脑神经细胞有抗氧化损伤保护作用、防治老年性痴呆症的一类A环二氧六环的黄酮木质素类化合物的制备方法及其医药用途。本发明中所实施的药理学试验表明：该类化合物具有强效抑制黄嘌呤氧化酶活性，可以预期发展成为防治由黄嘌呤氧化酶引起的疾病包括痛风病的药物。此外，该化合物还表现出很强的对抗自由基引起的大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞PC12细胞损伤作用，即对模拟脑神经细胞的PC12细胞有抗氧化损伤保护作用，说明其对保护脑细胞组织抗氧化和脑神经抗氧化、防治老年性痴呆症有积极作用，可以预期用于制备该类药物的用途。

背景技术

黄嘌呤氧化酶(EC1.2.3.2，简称为XO)是嘌呤分解代谢过程中的一种很重要的酶，催化由黄嘌呤形成尿酸以及次黄嘌呤形成黄嘌呤的氧化过程。它是一种含钼的黄素蛋白，也能催化醛类的氧化反应，与多种疾病如痛风、肾脏疾病如肾石症等密切相关。近期研究还证实其与肝炎等肝脏疾病也有强的关联[赵远红等，黄嘌呤氧化酶与肝病的关系的探讨，中西医结合肝病杂志，2005年3期]。

痛风是一种慢性代谢紊乱疾病，它的主要特点是体内尿酸盐生成过多或肾脏排泄尿酸减少，从而引起血液中尿酸盐浓度升高，临床上称为高尿酸血症。尿酸是嘌呤代谢的终末产物，而嘌呤是由人体细胞分解代谢产生的。血尿酸升高到一定程度后就会在组织，尤其是关节及肾脏中沉积而引起关节炎的反复发作。严重者会造成关节活动障碍或畸形，临床上称为痛风性关节炎。尿酸在肾脏沉积后形成尿酸性肾结石及肾实质损害，临床上称为尿酸性肾病，又叫痛风性肾病，可引起肾绞痛发作、血尿、肾盂积水及肾功能损害，严重者可发生肾功能衰竭及尿毒症，是导致痛风病人死亡的主要原因之一。在治疗上，秋水仙碱有显效，但毒副作用也较大；甾体类抗炎药物如保泰松及羟基保泰松虽能抗炎并促进尿酸排出，但同时也对胃肠和白细胞以及肝肾功能等造成损害。中医常见用当归拈痛汤、痛风丸、白虎加桂枝汤或四妙丸等进行治疗，但也无法取得非常满意的疗效。

现代医学理论证实：痛风病的重要致病因素之一便是黄嘌呤氧化酶。此酶是体内核酸代谢的一个重要酶，能催化次黄嘌呤和黄嘌呤生成尿酸和超氧阴离子，若机体不能及时清除产生的尿酸，使尿酸结晶盐在关节处沉积，就会引起痛风；产生过多的超氧阴离子也可引起多组织受损，因此测定化合物对黄嘌呤氧化酶XO的作用对发现新的黄嘌呤氧化酶XO抑制剂和其抗氧化作用有重要意义。由此机制研发出的药物便属别嘌醇(allopurinol)。此药能抑制黄嘌呤氧化酶XO，使次黄嘌呤及黄嘌呤不能转化成尿酸，其本身则在人体中逐渐氧化并生成可以顺利通过尿排出的水溶性的异黄嘌呤，故可迅速降低血尿酸浓度，抑制痛风石及肾尿酸结石形成，并促进痛风石溶解。因其副作用较低而被列为治疗痛风病一线用药。

由此可见，从天然产物以及其衍生物中发现新型黄嘌呤氧化酶抑制剂先导化合物也是开发治疗痛风病新药的重要任务[尚雁君，朱大元等，迷迭香酸对黄嘌呤氧化酶的抑制作用，第二军医大学学报，2006年，2期][汪峰，赵昱等，“Preparation of Ferulic Acid Derivatives and Evaluation of Their Xanthine OxidaseInhibition Activity”，Natural Product Research，2007，21(3)，196-202]。

众多研究表明：自由基与神经系统疾病如老年性痴呆症(阿兹海莫症，AD)、帕金森症、脑卒中等密切相关。其原因主要与脑组织代谢特点有关。脑组织耗氧量大，脂肪含量高，而各种抗氧化酶的含量相对于其它组织而言偏少，易受自由基损伤[Gilgun-Sherki，Y.等，Antioxidant therapy in acute centralnervous system injury：current state，Pharmacol.Rev.，2002，54，271-284]。因而，目前认为自由基参与了AD患者的病理过程。自由基引起β淀粉样蛋白沉积，与细胞膜产生反应，导致细胞内氧化损伤。因此，研发抗脑中枢神经系统氧化剂是治疗老年性痴呆的有效途径之一，近年来褪黑素(Melatonin)的热卖也基于此[Green，K.N.等，Melatonin，aging，and age-related diseases：perspectives forprevention，intervention，and therapy.J.Physiol(Lond)，2002，541(3)：1013-1023]。因此，寻找新型有效抑制脑细胞氧化损伤的先导化合物或药物既有巨大的社会效益又有显著的经济效益。近年来，国际医药界持续不断地投入了大量的人力、物力、财力，努力寻找抗氧化作用显著、具有强效神经细胞保护作用的抗氧化剂先导化合物。

目前比较肯定的用于研究老年性痴呆症(主要是胆碱能神经系统)的体外细胞模型主要有3种：原代培养的海马、皮层、基底前脑神经细胞、PC12细胞和海马HT22细胞株。本试验采用的PC12细胞以其在培养过程中的易获得性和细胞均一性成为神经科学离体研究中的重要工具细胞，并已成功用于研究多种神经系统疾病，如老年痴呆症、帕金森病等[王健，陈沙维，调心方对H₂O₂氧化损伤PC12细胞的保护作用研究，中华医药杂志，2004年4卷7期][崔旭等，复方益智散对PC12细胞增值和抗凋亡作用，中华老年心脑血管杂志，2006，8(3)，198-201][徐鹰等，大豆苷元对氧自由基所致PC12细胞细胞毒作用的影响，中药药理与临床，2007，5期]。

黄酮木质素类化合物是一类具备众多药效学活性的杂木质素类化合物，其来源于由一分子苯丙素和一分子黄酮结合而成的一类含有C6-C3-C6-C3-C6结构单元的天然产物。其代表性化合物当属存在于菊科植物水飞蓟的种子中的水飞蓟宾。水飞蓟已在临床上广泛应用，在市场上其商品名为利肝隆(Legalon^TM或Flavobion^TM)。三十多年的临床实验证明该药具有确切的疗效和低毒性(参阅Flora K.等人，Am.J.Gastroenterol，1998，93，139-143；Saller R.等人，Drugs，2001，61(14)，2035-2063)。水飞蓟中水飞蓟宾含量最多，活性也相对最高。故关于水飞蓟宾之药效学研究最为广泛。国家药品监督管理局制订的国家药品标准水飞蓟素一栏中，要求含水飞蓟素以水飞蓟宾计算，不得少于68％。该药作用主要有以下几点：(一)抗自由基活性：水飞蓟素对于由四氯化碳、半乳糖胺、醇类和其他肝毒素造成的肝损害具有保护作用。(二)保护肝细胞膜：通过抗脂质过氧化反应维持细胞膜的流动性，保护肝细胞膜。(三)促进肝细胞的修复和再生。(四)抗肿瘤作用：各种活性氧能氧化鸟嘌呤形成8-羟基鸟嘌呤，造成DNA损伤，进而引起肿瘤，水飞蓟宾作为一个有效的抗自由基物质也显示了预防和治疗肿瘤的作用。

水飞蓟宾类化合物具有确切的疗效，但是由于其水溶性和生物利用度上的一些不足限制了该药物的市场。故寻找水飞蓟宾类新的衍生物、包括寻找结构上跨度更大的黄酮木质素类衍生物，使其能够具有更高或者更新的药理活性，以期获取自主知识产权的新药，实属必要。红景天(Rhodiola rosea L.)是景天科红景天属的多年生草本植物，主要分布于海拔2600-4800米的高寒地带。该药用植物历史悠久，传统藏医用其作为治疗肺病、神经麻痹症及妇科用药等。现代药理学试验表明：红景天相关制剂有抗忧郁、抗癌、心血管保护及增进神经系统功能等效果。1982年以来，Zapesochnaya等人陆续从红景天、高山红景天和大花红景天、长鞭红景天的根茎提取物中分离得到同一个黄酮木质素，命名为Rhodiolin。国外研究指出：该黄酮木质素化合物被认为是红景天产生刺激及抗压效果的主要成分之一，试验还表明其具有显著的清除DPPH自由基能力[Zapesochnaya，GG et al，Chemistry of Natural Compounds，1983，19(1)，21-29；Linh，PT et al，Archives of Pharmacol.Research，2000，23(4)，349-352]。

1991年，Kikuchi等人从黄芩属植物Scutellaria prostrate的根部也分离得到了另外一种新颖结构的黄酮木质素化合物，命名为Scutellaprostin A。该化合物与红景天中分到的Rhodiolin结构极其类似，仅于B环上比Rhodiolin少一个酚羟基以及3位少一个烯醇羟基。二者都属于A环7，8位羟基与一个木质素单位偶联形成的黄酮木质素化合物。

以上结果引起了发明人的兴趣，本发明根据此线索，合成了黄酮木质素Scutellaprostin A的类似物，并以对模拟脑神经细胞的PC12细胞之抗氧化损伤保护作用作为药效学筛选模型对其清除由双氧水H₂O₂引起的自由基、保护神经细胞的效能进行评估，以期筛选出能够有效抑制或减缓中枢神经系统细胞的凋亡、保护脑神经抗氧化、防治老年性痴呆症的先导化合物。本发明还测试了化合物对黄嘌呤氧化酶XO的抑制作用，对发现新的XO抑制剂有重要意义。

综上所述，本发明涉及一类黄酮木质素Scutellaprostin A类似物的制备及其多种药效学活性和它们用于制备防治相关疾病药物的用途，药效学试验结果显示：该类化合物具有抑制黄嘌呤氧化酶活性、对脑神经细胞有抗氧化损伤保护作用，从而可以预期发展成为防治老年性痴呆症的药物或药物组合物，还可预期发展成为防治由黄嘌呤氧化酶引起的疾病包括痛风病的药物或药物组合物。由此完成了本发明。

发明内容

本发明提供了一种具有式(I)所示的黄酮木质素Scutellaprostin A类似物或其可药用盐：

式(I)

其中R₁和R₂相同或不同，选自氢、溴或甲氧基；其条件是：当R₁、R₂中的一个为氢原子时，另一个不能为甲氧基；二氧六环上C-7″和C-8″二取代基互为反式构型。

优选的式(I)化合物为：

化合物I-a：(±)-trans-6-羟基-2-羟甲基-3-(4-羟基苯基)-9-苯基-2，3-二氢-[1，4]二氧六环[2，3-h]苯并吡喃-7-酮；

化合物I-b：(±)-trans-6-羟基-2-羟甲基-3-(3-溴-4-羟基-5-甲氧基苯基)-9-苯基-2，3-二氢-[1，4]二氧六环[2，3-h]苯并吡喃7-酮。

本发明的又一目的是提供了一种制备式(I)所示的黄酮木质素ScutellaprostinA类似物的方法，其特征是：5，7-二羟基黄酮白杨素在冷的碱液中与过硫酸钾发生Elbs氧化，酸水解得到5，7，8-三羟基黄酮即去甲汉黄芩素，再与取代或未取代的对羟基肉桂醇在碳酸银或氧化银作用下发生氧化偶联而得；其中碱是指有机碱或无机碱，酸是指有机酸或无机酸；

其中R₁和R₂的定义与式(I)中的相同。

具体而言，本发明的目的之一是提供了上述黄酮木质素Scutellaprostin A类似物或其可药用盐用于制备一种基于对脑神经细胞有抗氧化损伤保护作用机制的防治老年性痴呆症的药物用途。

本发明的再一个目的是提供了一种基于对脑神经细胞有抗氧化损伤保护作用机制的防治老年性痴呆症的药物或药物组合物，其中含有治疗有效量的式(I)所示的Scutellaprostin A类似物或其可药用盐和药用辅料。

本发明的另一目的是提供了黄酮木质素Scutellaprostin A类似物或其可药用盐用于制备防治由黄嘌呤氧化酶引起的疾病包括痛风病等疾病的药物或药物组合物的用途。

本发明的又一目的是提供了一种防治由黄嘌呤氧化酶引起的疾病包括痛风病的药物或药物组合物，其中含有治疗有效量的式(I)所示的ScutellaprostinA类似物或其可药用盐和药用辅料。

本发明的有益之处在于：用简便的合成方法制备了黄酮木质素Scutellaprostin A类似物，并用药理实验证实了其在新药开发中的应用。其对于开发抗老年性痴呆症和治疗痛风病这两种常见病及多发病之创新型药物提供了新的物质基础，因而使得本发明具有潜在的巨大社会效益和显著经济效益。本发明之再一特点是：该类黄酮木质素化合物制备步骤简便，原料来源充足易得，成本低，污染小，利于大规模生产。

具体实施方式

为了更好地理解本发明的实质，下面首先用实施例的形式说明化合物制备的过程，实施例给出了化合物的部分物理和化学及波谱学数据。必须说明，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。

实施例1：化合物I-a即(±)-trans-6-羟基-2-羟甲基-3-(4-羟基苯基)-9-苯基-2，3-二氢-[1，4]二氧六环[2，3-h]苯并吡喃-7-酮的制备

1.1在干燥氮气保护的反应瓶中投入2.28克5，7-二羟基黄酮，使之溶于3.15克氢氧化钾水溶液中，加入0.322克四丁基溴化铵，冰浴冷却下滴加溶有3克过硫酸钾的90毫升水溶液，滴加完毕后，搅拌2小时，撤去冰浴，室温放置过夜。用1N盐酸调pH值为5，搅拌，过滤析出的土黄色固体，滤液加入22.5毫升浓盐酸，2.25克亚硫酸钠，加热煮沸10分钟，静置冷却，过滤，滤饼水洗至中性，干燥，得棕黄色粗品1.07克，经无水乙醇重结晶，得到5，7，8-三羟基黄酮黄色晶体0.55克。测其紫外光谱谱图UV(MeOH)λmax：281，364nm；UV(NaOAc/H₃BO₃)λmax：287nm，提示邻二酚羟基结构的存在。

1.2在干燥氮气保护的反应瓶中投入0.22克5，7，8-三羟基黄酮，0.245克4-羟基-肉桂醇和0.56克氧化银，注入8毫升无水丙酮和24毫升无水苯，50-60℃之间保温15小时，过滤，母液浓缩，硅胶(200-300目，20克)柱层析分离(氯仿/甲醇＝9∶1～2∶1)，得浅黄色针状晶体0.17克，收率50％。

(±)-trans-6-羟基-2-羟甲基-3-(4-羟基苯基)-9-苯基-2，3-二氢-[1，4]二氧六环[2，3-h]苯并吡喃-7-酮(I-a)：R_f(氯仿/甲醇/醋酸乙酯/丙酮/乙酸＝22∶05∶1∶1∶0.1)：0.24；核磁共振氢谱¹H NMR(400MHz，氘代丙酮)δ：3.43(双双峰，J＝12.0，4.0Hz，1H，H-9″a)，3.68(双双峰，J＝12.0，1.6Hz，1H，H-9″b)，4.25(多重峰，1H，H-8″)，5.17(双峰，J＝8.0Hz，1H，H-7″)，6.40(单峰，1H，H-6)，6.82(双峰，J＝8.0Hz，2H，H-2″，6″)，7.04(单峰，1H，H-3)，7.29(双峰，J＝8.0Hz，2H，H-3″，5″)，7.62(多重峰，3H，H-3′，4′，5′)，8.12(多重峰，2H，H-2′，6′)，9.58(单峰，1H，4′-OH)，12.24(单峰，1H，5-OH)；电喷雾质谱ESI-MS：417(M-1)⁺。

实施例2：化合物I-b即(±)-trans-6-羟基-2-羟甲基-3-(3-溴-4-羟基-5-甲氧基苯基)-9-苯基-2，3-二氢-[1，4]二氧六环[2，3-h]苯并吡喃7-酮的制备

2.15，7，8-三羟基黄酮的制备，方法同实施例1中1.1所述。

2.2在干燥氮气保护的反应瓶中投入0.22克5，7，8-三羟基黄酮，0.423克3-溴-4-羟基-5-甲氧基-肉桂醇和0.56克氧化银，注入8毫升无水丙酮和24毫升无水苯，50-60℃之间保温15小时，过滤，母液浓缩，硅胶(200-300目，20克)柱层析分离(氯仿/甲醇＝9∶1～2∶1)，得浅黄色针状晶体0.193克，收率45％。

(±)-trans-6-羟基-2-羟甲基-3-(3-溴-4-羟基-5-甲氧基苯基)-9-苯基-2，3-二氢-[1，4]二氧六环[2，3-h]苯并吡喃-7-酮(I-b)：R_f(氯仿/甲醇/醋酸乙酯/丙酮/乙酸＝22∶05∶1∶1∶0.1)：0.15；核磁共振氢谱¹H NMR(400MHz，氘代丙酮)δ：3.48(多重峰，1H，H-9″a)，3.48(双峰，J＝8.4Hz，1H，H-9″b)，3.86(单峰，3H，OCH₃)，4.34(多重峰，1H，H-8″)，5.04(单峰，1H，9-OH)，5.19(双峰，J＝8.0Hz，1H，H-7″)，6.45(单峰，1H，H-6)，7.06(单峰，1H，H-6″)，7.11(单峰，1H，H-3)，7.23(单峰，1H，H-2″)，7.61～7.65(多重峰，3H，H-3′，4′，5′)，8.12(双峰，J＝7.6Hz，2H，H-2′，6′)，12.24(单峰，1H，5-OH)；电喷雾质谱ESI-MS：526(M-1)⁺。

本发明中所涉及的Scutellaprostin A类似物及其可药用盐具有多种重要的生理活性，该类化合物被发现具有抑制黄嘌呤氧化酶活性的作用，因而可以预期作为治疗痛风类疾病的药物。此外，该类化合物还表现出很强的对抗自由基引起的PC12细胞损伤作用，即对模拟脑神经细胞的PC12细胞有抗氧化损伤保护作用。说明其对保护脑神经抗氧化、防治老年性痴呆症有积极作用，可以用于制备保护脑神经抗氧化、防治老年性痴呆症药物的用途。

本发明的Scutellaprostin A类似物或其可药用盐可以与药学上常用的辅料或载体结合，制备得到抑制黄嘌呤氧化酶、可用于治疗痛风类疾病的药物。此外，该类化合物还可以与药学上常用的辅料或载体结合，制备得到抗氧化损伤、保护脑神经细胞的组合物，可以用于制备保护脑神经抗氧化、防治老年性痴呆症等疾病的药物组合物。上述各类药物或药物组合物可以采用注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、外用搽剂等剂型。

本发明的Scutellaprostin A类似物或其可药用盐还可以与现已上市的其他保护脑神经抗氧化、防治老年性痴呆症药物联合使用，得到抗老年性痴呆药物组合物。本发明的化合物或其可药用盐还可以与现已上市的治疗痛风病药物如黄嘌呤氧化酶抑制剂别嘌醇等联合使用，制备得到治疗痛风病的药物组合物，用于痛风病的临床治疗。上述各类药物或药物组合物可以采用注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、外用搽剂等剂型。

本发明中所述剂型如片剂、胶囊剂、注射剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂和外用搽剂以及各种缓释、控释剂型都可以根据现已公认的药剂学常识经由常规制备而得，在这些公知知识和技术基础上制备出的含有本发明权利要求化合物或其可药用盐的药物或药物组合物之其他剂型都在本发明的保护范围内。

为了更好地理解本发明的实质，下面分别用药理相关实施例的形式列举化合物Scutellaprostin A类似物对黄嘌呤氧化酶XO的抑制作用试验以及对双氧水H₂O₂所致PC12细胞损伤的保护作用试验之结果，说明其在制药领域中的用途以及用于制备防治其相关疾病药物的根据。药理相关实施例给出了化合物的部分活性数据。同样必须说明，本发明列举的这些实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。

实施例3：化合物I-b即(±)-trans-6-羟基-2-羟甲基-3-(3-溴-4-羟基-5-甲氧基苯基)-9-苯基-2，3-二氢-[1，4]二氧六环[2，3-h]苯并吡喃-7-酮对双氧水H₂O₂所致PC12细胞损伤的保护作用

3.1实验材料与样品

3.1.1细胞：大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞(PC12)购自中科院上海细胞所。

3.1.2实验试剂：

3.1.2.1双氧水(hydrogen peroxide，H₂O₂)、硝基四氮唑兰(nitroblue tetrazolium，NBT)、菲咯嗪(ferrozine)购自Sigma公司；

3.1.2.2槲皮素(quercetin)由浙江大学药学院中药与天然药物研究室实验室提供(纯度为99％)；水飞蓟宾(Silybin)购自辽宁盘锦天缘药业有限公司，HPLC检测纯度98％。

3.1.2.3Tris碱，DMEM培养基购自Gibco公司；

3.1.2.43-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)购自Amresco公司；

3.1.2.5小牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；

3.1.2.6青霉素和链霉素由石家庄制药集团有限公司生产；

3.1.2.7其它试剂均为国产分析纯，购自杭州华东医药试剂有限公司。

3.1.3仪器：

3.1.3.1酶标仪：Synergy-HT型，BIO-TEK公司；

3.1.3.2立式自动电热压力蒸汽灭菌器：LDZX-40BI型，上海申安医疗器材厂；

3.1.3.3紫外分光光度计：UV-1201型，北京瑞利分析仪器公司；

3.1.3.4超纯水系统：UPWS-I-60D型，杭州永洁达净化科技有限公司；

3.1.3.5除菌过滤器：Sterifil500型，Millipore公司；

3.1.3.6气浴恒温振荡器：THZ-C，江苏省金坛市医疗仪器厂；

3.1.3.7CO₂细胞培养箱：MMM，德国公司；

3.1.3.8倒置显微镜：XD-2型，重庆光电仪器有限公司。

3.2实验原理：

H₂O₂是一种主要的活性自由基的前体，它可引起中枢神经系统细胞的凋亡，PC12细胞(大鼠肾上嗜铬细胞瘤)可模拟脑神经细胞，因此常用它来作为研究药物与神经细胞之间关系的模型，用MTT测细胞的存活率，如果待测化合物有清除由H₂O₂引起的自由基、保护神经细胞的作用，则细胞存活率就高，其OD值也就高，反之就低。本发明人采用了对唐希灿所报道的方法(Xiaoqiu Xiao等，Neurosci Letter，1999，275：73-76.)加以改进的实验方法，测定本发明所制备得到的化合物对PC12细胞的保护作用。

3.3细胞培养：

PC12细胞用含10％小牛血清，100U/ml青霉素和100微克/毫升链霉素的DMEM培养基培养，于37℃、5％CO₂细胞培养箱中孵育，常规方法传代培养。

3.4实验方法：

3.4.1细胞毒性的测定：首先用改良的MTT法测定了待测化合物对PC12细胞增殖的作用。PC12细胞用胰酶-EDTA消化液消化，收集细胞，计数，用含10％小牛血清的DMEM培养基稀释至8000个/毫升的密度，然后接种于96孔细胞板中，细胞培养箱中继续培养，24小时后，分别将新配的待测的二甲亚砜溶液以浓度梯度加入到各孔中，使孔中化合物I-b的最终浓度分别为16、8和4微克/毫升。72小时后，加入10微升MTT(5毫克/毫升)的生理盐水溶液，继续在37℃，5％CO₂潮湿空气的培养箱中培养3小时，弃去原液，每孔中加入150微升二甲亚砜，振荡溶解生成的MTT晶体甲臜，用酶标仪在570nm波长下比色，细胞生长抑制率计算公式如下：

％细胞生长抑制率＝(OD_溶剂对照-OD_样品)/OD_溶剂对照×100％。

3.4.2化合物I-b对H₂O₂所致PC12细胞损伤的保护作用的测定

PC12细胞用DMEM培养基培养，培养基中含10％牛血清，100U/毫升青霉素和100U/毫升链霉素。细胞以每孔8000个的密度加到96孔板中，在37℃，50％CO₂潮湿空气的培养箱中培养36小时。用倒置显微镜观察细胞的形态变化以及用MTT法测定细胞的存活率。细胞经36小时的孵育后，分别将新配的化合物I-b的二甲亚砜溶液以浓度梯度加入到各孔中。作用2小时后加入新配的H₂O₂(终浓度为600μM)作用3小时，显微镜观察记录，弃去原培养液，加入新的培养液100微升，然后加入MTT 10微升，3小时后，小心吸去培养液，加入150微升DMSO溶解甲臜，于570nm处读数。采用槲皮素和水飞蓟宾为阳性对照药物。

3.4.3试验结果：见表一。

表一化合物I-b及对照组对双氧水损伤PC12细胞保护作用比较

3.5结论：试验结果表明，I-b具有较强的对抗自由基引起的PC12细胞损伤作用，即对模拟脑神经细胞的PC12细胞有确切的抗氧化损伤保护作用。在同一浓度下，其清除自由基保护细胞的能力比阳性对照槲皮素弱，但高于另一阳性对照水飞蓟宾，说明该Scutellaprostin A类似物属于具有一定效果的保护模拟脑神经细胞的PC12细胞作用的抗氧化物质。

测定化合物对H₂O₂所致PC12细胞损伤的保护作用可作为初步探讨其保护中枢脑神经细胞的作用机理。故该化合物表现出对双氧水损伤所致PC12细胞的保护作用，说明该类Scutellaprostin A类似物对老年性痴呆症的治疗有积极作用。

实施例4：化合物I-b即(±)-trans-6-羟基-2-羟甲基-3-(3-溴-4-羟基-5-甲氧基苯基)-9-苯基-2，3-二氢-[1，4]二氧六环[2，3-h]苯并吡喃-7-酮对黄嘌呤氧化酶XO的抑制作用试验

4.1实验材料与样品

4.1.1试验动物：SD(sprague-dawley)大鼠于浙江大学实验动物中心购得。合格证号：SCXK(浙2007-0029)。

4.1.2实验试剂：

4.1.2.1吩嗪硫酸甲酯(phenazine methosulfate，PMS)、硝基四氮唑兰(nitrobluetetrazolium，NBT)、黄嘌呤、菲咯嗪(ferrozine)购自Sigma公司；

4.1.2.2Triton X-100购自Gibco公司；

4.1.2.3阳性对照药物：别嘌醇：泰州美通药业有限公司；

4.1.2.4磷酸二氢钾、磷酸氢二钾及其它试剂均为国产分析纯(杭州华东试剂公司)。

4.1.3仪器：

4.1.3.1酶标仪：Synergy-HT型，BIO-TEK公司；

4.1.3.2立式自动电热压力蒸汽灭菌器：LDZX-40BI型，上海申安医疗器材厂；

4.1.3.3紫外分光光度计：UV-1201型，北京瑞利分析仪器公司；

4.1.3.4超纯水系统：UPWS-I-60D型，杭州永洁达净化科技有限公司；

4.1.3.5除菌过滤器：Sterifil500型，Millipore公司；

4.1.3.6气浴恒温振荡器：THZ-C，江苏省金坛市医疗仪器厂；

4.1.3.7玻璃匀浆器：国产。

4.2实验方法：

4.2.1取SD大鼠，断头处死，迅速取出肝脏至预冷的磷酸缓冲液(100毫摩尔，pH 8.75)中，去除血管，剪碎后用磷酸缓冲液1∶1(w/v)稀释后在冰上直接匀浆，于-20℃保存，用前用磷酸缓冲液(1∶7)稀释，4℃条件下离心(8000rpm/10分钟)，取上清作为酶原。

4.2.2化合物I-b对XO的抑制作用测定采用酶联免疫ELISA法。样品孔中加入底物黄嘌呤(0.1毫克/毫升，600微升)，酶(30微升)，化合物I-b用二甲亚砜溶解，用磷酸缓冲液稀释，每孔30微升，使其终浓度为40微克/毫升、20微克/毫升和10微克/毫升，加入硝基兰四氮唑和吩嗪甲硫酸酯(30微升)，最后加入Triton X-100(0.4％，10微升)，在37℃中水浴保温2小时，于550nm波长下比色测定。化合物I-b对黄嘌呤氧化酶抑制率由样品OD值对于空白和对照OD值计算。

黄嘌呤氧化酶抑制率(％)＝[(OD_标准管-OD_空白管)-(OD_样品管-OD_空白管)]/(OD_{标 准管}-OD_空白管)×100％。

4.3实验结果：

化合物I-b在40微克/毫升时对黄嘌呤氧化酶抑制率为61.65％，其半数抑制浓度IC₅₀＝5.64×10^-5摩尔/升；阳性对照别嘌醇40微克/毫升时抑制率为89.2％，半数抑制浓度IC₅₀＝3.34×10^-5摩尔/升。

4.4结论：化合物I-b对黄嘌呤氧化酶有强效的抑制活性，其抑制活性与阳性药物别嘌醇十分接近，说明该化合物可预期进一步发展成为疗效确切的黄嘌呤氧化酶抑制剂。

实施例5：化合物I-a即(±)-trans-6-羟基-2-羟甲基-3-(4-羟基苯基)-9-苯基-2，3-二氢-[1，4]二氧六环[2，3-h]苯并吡喃-7-酮对黄嘌呤氧化酶XO的抑制作用试验

5.1实验材料与样品

5.1.1试验动物：SD(sprague-dawley)大鼠于浙江大学实验动物中心购得。合格证号：SCXK(浙2007-0029)。

5.1.2实验试剂：

5.1.2.1吩嗪硫酸甲酯(phenazine methosulfate，PMS)、硝基四氮唑兰(nitrobluetetrazolium，NBT)、黄嘌呤、菲咯嗪(ferrozine)购自Sigma公司；

5.1.2.2Triton X-100购自Gibco公司；

5.1.2.3阳性对照药物：别嘌醇：泰州美通药业有限公司；

5.1.2.4磷酸二氢钾、磷酸氢二钾及其它试剂均为国产分析纯(杭州华东试剂公司)。

5.1.3仪器：

5.1.3.1酶标仪：Synergy-HT型，BIO-TEK公司；

5.1.3.2立式自动电热压力蒸汽灭菌器：LDZX-40BI型，上海申安医疗器材厂；

5.1.3.3紫外分光光度计：UV-1201型，北京瑞利分析仪器公司；

5.1.3.4超纯水系统：UPWS-I-60D型，杭州永洁达净化科技有限公司；

5.1.3.5除菌过滤器：Sterifil500型，Millipore公司；

5.1.3.6气浴恒温振荡器：THZ-C，江苏省金坛市医疗仪器厂；

5.1.3.7玻璃匀浆器：国产。

5.2实验方法：

5.2.1取SD大鼠，如实施例4方法制备酶原。

5.2.2化合物I-a对XO的抑制作用测定采用酶联免疫ELISA法。实际操作方法同实施例4。化合物对黄嘌呤氧化酶抑制率由样品OD值对于空白和对照OD值计算。

黄嘌呤氧化酶抑制率(％)＝[(OD_标准管-OD_空白管)-(OD_样品管-OD_空白管)]/(OD_{标 准管}-OD_空白管)×100％。

5.3实验结果：

化合物I-a在40微克/毫升时对黄嘌呤氧化酶抑制率为40.58％，在20微克/毫升时对黄嘌呤氧化酶抑制率为30.32％，在4微克/毫升时对黄嘌呤氧化酶抑制率为14.59％，而阳性对照别嘌醇40微克/毫升时抑制率为89.2％，半数抑制浓度IC₅₀＝3.34×10^-5摩尔/升。

5.4结论：虽然其抑制活性没有阳性药物别嘌醇高，化合物I-a仍表现出对黄嘌呤氧化酶有十分显著的抑制活性，且其抑制活性呈量效关系。说明该类Scutellaprostin A类似物具有进一步发展成为疗效确切的黄嘌呤氧化酶抑制剂的潜能。

在上述说明书阐述本发明时，同时提供了实施例和药理相关实施例的目的是举例说明本发明的实际操作过程和本发明的意义。在进入本发明权利要求和其等同物范围内时，本发明的实际应用包括所有一般变化、配合，或改进。

Claims (2)

1.一类具有式(I)所示的黄酮木质素Scutellaprostin A类似物或其可药用盐用于制备防治由黄嘌呤氧化酶引起的痛风病药物的用途：

式(I)

其中，R₁和R₂相同或不同，选自氢、溴或甲氧基；其条件是：当R₁、R₂中的一个为氢原子时，另一个不能为甲氧基；二氧六环上C-7″和C-8″二取代基互为反式构型。

2.根据权利要求1的式(I)化合物的用途，其特征为式(I)化合物是选自下列结构：

化合物I-a：(±)-trans-6-羟基2-羟甲基-3-(4-羟基苯基)-9-苯基-2，3-二氢-[1，4]二氧六环[2，3-h]苯并吡喃-7-酮；

化合物I-b：(±)-trans-6-羟基-2-羟甲基-3-(3-溴4-羟基-5-甲氧基苯基)-9-苯基-2，3-二氢-[1，4]二氧六环[2，3-h]苯并吡喃-7-酮。