CN100596299C

CN100596299C - 一类脱氢水飞蓟宾双酯类衍生物及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN100596299C
Application number: CN200610099016A
Authority: CN
Inventors: 赵昱; 龚景旭; 汪峰; 冯玉冰; 白骅
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2006-07-14
Filing date: 2006-07-14
Publication date: 2010-03-31
Anticipated expiration: 2026-07-14
Also published as: CN101104616A

Abstract

本发明涉及一种具有抗自由基氧化、保肝护肝、防治老年性痴呆症、抗衰老活性的脱氢水飞蓟宾双酯类衍生物及其可药用盐或溶剂化物。本发明还涉及制备式I化合物的方法及其药物组合物和医药用途。本发明的化合物对大鼠肝细胞损伤体外模型具有保护肝细胞的作用，可以预期作为防止肝脏损伤类药物用途；本发明的化合物具有体外清除超氧阴离子自由基和二苯基苦基苯肼自由基、抑制自由基诱导之脂过氧化物生成等生物活性，该类化合物还表现出很强的对抗自由基引起的PC12细胞损伤作用，因此可以预期成为防治由自由基引起的各种疾病之药物。

Description

一类脱氢水飞蓟宾双酯类衍生物及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于有机化学和药物化学领域，具体而言，本发明涉及一类脱氢水飞蓟宾双酯类衍生物的制备方法和用途。该类化合物通过全合成和半合成的方法得到。本发明将该系列化合物对过氧化氢致大鼠乳鼠原代肝细胞损伤体外模型进行了肝细胞损伤保护活性筛选。该类化合物被发现具有保护肝细胞和促进肝细胞修复的作用。本发明又对该类化合物抗氧自由基活性进行了测试，发现其具有体外清除超氧阴离子自由基、清除二苯基苦基苯肼自由基、抑制自由基诱导之脂过氧化物生成的活性。以上活性表明该类化合物可以预期用于制备预防或治疗急性慢性肝损伤类疾病以及由氧自由基引起或与氧自由基有关的其他生理改变或疾病的药物。该类化合物还表现出很强的对抗自由基引起的PC12细胞损伤作用，即对模拟脑神经细胞的PC12细胞有抗氧化损伤保护作用。而且在同一浓度下，其清除自由基保护细胞的能力比阳性对照槲皮素还强。说明其对保护脑神经抗氧化、防治老年性痴呆症有积极作用。上述活性又表明该类化合物可以预期用于制备预防早老性痴呆和其他与脑神经氧化受损相关的脑部病变的药物。

技术背景

很有疾病由氧化引起。氧压是由机体细胞产生和清除自由基之间的失调所引起的，可诱发多种疾病。氧压可引起神经系统疾病，如中风，帕金森氏病，阿尔茨海默病。另外它还跟其它疾病的病理途径有关，如心脏病、自身免疫性疾病、肿瘤、病毒性疾病(如AIDS、肝炎)。因此寻找新的抗氧化剂成为治疗由氧压引起的各种疾病的有效途径，因此抗氧化剂的研究将是下一世纪的治疗疾病延长生命的重要方向之一。迅速筛选出高效低毒的抗氧化剂，尤其是天然产物或者以天然产物为骨架的衍生物，是开发抗氧化作用机制新药的一条捷径。

在众多抗自由基天然产物中，水飞蓟是少数几个在临床上广泛应用的药物之一。三十多年的临床实验证明该药具有确切的疗效和低毒性(参阅Flora K.等人，Am.J.Gastroenterol.1998，93，139-143页；Saller，R.等人，Drugs，2001，61(14)，2035-2063页)。水飞蓟中水飞蓟宾含量最多，活性也最高。该药作用主要有以下几点。(一)抗自由基活性：水飞蓟素对于由CCl₄，半乳糖胺、醇类和其他肝毒素造成的肝损害具有保护作用。1990年Lotteron等人报道了在小鼠肝微粒体内，水飞蓟素能减少由CCl₄代谢引起的体外脂质过氧化及由还原型辅酶单独引起的过氧化作用这些都表明水飞蓟素为链中断抗氧化剂或为自由基清除剂。(二)保护肝细胞膜：通过抗脂质过氧化反应维持细胞膜的流动性，保护肝细胞膜。还能阻断真菌毒素鬼笔毒环肽和α-鹅膏蕈碱等与肝细胞上特异受体的结合，抑制其对肝细胞的攻击及跨膜转运，中断其肝肠循环，从而增强肝细胞膜对于多种损害因素的抵抗力。(三)促进肝细胞的修复和再生：水飞蓟宾进入细胞后可以与雌二醇受体结合，并使之激活，活化的受体可以增强肝细胞核内RNA聚合酶1的活性，使RNA转录增强，促进酶及蛋白质的合成，并间接促进DNA的合成，有利于肝细胞的修复和再生。(四)抗肿瘤作用：各种活性氧能氧化鸟嘌呤形成8-羟基鸟嘌呤，造成DNA损伤，进而引起肿瘤，水飞蓟宾作为一个有效的抗自由基物质也显示了预防和治疗肿瘤的作用。

水飞蓟宾类化合物具有确切的疗效，但是由于其水溶性和生物利用度上的一些不足限制了该药物的市场。故寻找水飞蓟宾类新的衍生物，使其能够具有更高或者更新的药理活性，以期获取自主知识产权的新药，实属必要。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有抗氧化、清除自由基活性、保护肝脏细胞及肝脏器质性损伤、治疗早老性痴呆症、抗衰老的脱氢水飞蓟宾双酯活性化合物。具体而言，本发明提供了一种式I所示的脱氢水飞蓟宾双酯类衍生物及其可药用盐或其溶剂化物。

其中，n＝1-5；X为氮或氧，R₁、R₂为氢、烷基、环烷基、取代或未取代的芳基，式I中的7′，8′的立体构型分别是或同时是R构型或S构型。

本发明优选的式I化合物包括：

化合物I-1：2-[2，3-二氢-3-(4-N，N-二乙基胺基甲酰甲氧基-3-甲氧基苯基)-2-羟甲基-1，4-苯并二氧六环-6-]-7-(4-N，N-二乙基胺基甲酰甲氧基-3-甲氧基苯基)-3，5，-二羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮；

化合物I-2：2-[2，3-二氢-3-(4-吡咯烷基甲酰甲氧基-3-甲氧基苯基)-2-羟甲基-1，4-苯并二氧六环-6-]-7-(4-吡咯烷基甲酰甲氧基-3-甲氧基苯基)-3，5，-二羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮；

化合物I-3：2-[2，3-二氢-3-(4-N-苯胺基甲酰甲氧基-3-甲氧基苯基)-2-羟甲基-1，4-苯并二氧六环-6-]-7-(4-N-苯胺基甲酰甲氧基-3-甲氧基苯基)-3，5，-二羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮；

化合物I-4：2-[2，3-二氢-3-(4-N-对氯苯胺基甲酰甲氧基-3-甲氧基苯基)-2-羟甲基-1，4-苯并二氧六环-6-]-7-(4-N-对氯苯胺基甲酰甲氧基-3-甲氧基苯基)-3，5，-二羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮；

化合物I-5：2-[2，3-二氢-3-(4-N-对甲氧基苯胺基甲酰甲氧基-3-甲氧基苯基)-2-羟甲基-1，4-苯并二氧六环-6-]-7-(4-N-对甲氧基苯胺基甲酰甲氧基-3-甲氧基苯基)-3，5，-二羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮；

化合物I-6：2-[2，3-二氢-3-(4-N-对甲基苯胺基甲酰甲氧基-3-甲氧基苯基)-2-羟甲基-1，4-苯并二氧六环-6-]-7-(4-N-对甲基苯胺基甲酰甲氧基-3-甲氧基苯基)-3，5，-二羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮；

化合物I-7：2-[2，3-二氢-3-(4-N-2，4-二氯苯胺基甲酰甲氧基-3-甲氧基苯基)-2-羟甲基-1，4-苯并二氧六环-6-]-二氢-7-(4-N-2，4-二氯苯胺基甲酰甲氧基-3-甲氧基苯基)-3，5，-二羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮；

化合物I-8：2-[2，3-二氢-3-(4-乙氧甲酰甲氧基-3-甲氧基苯基)-2-羟甲基-1，4-苯并二氧六环-6-]-7-(4-乙氧甲酰甲氧基-3-甲氧基苯基)-3，5，-二羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮；

本发明的另一个目的是提供一种式I所示的脱氢水飞蓟宾双酯类衍生物的制备方法。式I化合物的制备方法是：

其中，n＝1-5；X为氮或氧，R₁、R₂为氢、烷基、环烷基、取代或未取代的芳基，X₁为卤素，碱为碳酸钾，碳酸氢钠，碳酸钠，氢氧化钾，氢氧化钠。反应溶剂为四氢呋喃，N，N-二甲基甲酰胺，二甲亚砜。反应温度为室温至回流，反应时间为0.5-20小时。其中I-a包括天然的或者合成的水飞蓟宾(silybin)以及其光学异构体。

本发明的另一个目的是提供了式I化合物用于防治肝脏细胞及肝脏器质性损伤及其相关的肝炎疾病的用途。

本发明的再一个目的是提供了一种含有式I化合物的用于防治肝脏细胞及肝脏器质性损伤及其相关的肝炎疾病的药物组合物。

本发明的另一个目的是提供了一种含有式I化合物的用于制备基于抗氧化自由基机制的抗衰老、防治早老性疾呆症药物的用途。

本发明的再一个目的是提供了一种含有式I化合物的用于制备基于抗氧化自由基机制的抗衰老、防治早老性痴呆症的药物和药物组合物。

本发明的双一目的是提供了式I化合物的用于制备由氧自由基引起或与氧自由基有关的生理改变或疾病特别是心血管及脑血管病变药物的用途；

本发明的再一个目的是提供了一种含有式I化合物的用于制备由氧自由基引起或与氧自由基有关的生理改变或疾病特别是心血管及脑血管病变药物的药物组合物。

具体实施方式

为了更好地理解本发明的实质，下面分别用实施例的形式说明化合物制备的过程，实施例给出了代表性化合物的部分物理和化学及波谱学数据。必须说明，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。

实施例1：化合物I-1(2-[2，3-二氢-3-(4-N，N-二乙基氨基甲酰甲氧基-3-甲氢基苯基)-2-羟甲基-1，4-苯并二氧六环-6-]-7-(4-N，N-二乙基氨基甲酰甲氧基-3-甲氧基苯基)-3，5，-二羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮)的制备：

2.2克化合物I-a(水飞蓟宾)溶解于15毫升N，N-二甲基甲酰胺中，加入1克碳酸钾，0.15克碘化钾，搅拌下加入0.67克N，N-二乙基氯乙酰胺，于室温搅拌过夜，反应物倒入30毫升冰水中，析出黄包沉淀，用乙酸乙酯提取，合并提取液后用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得黄色固体，经柱层析得到黄色粉末1.2克，收率60％。

Rf(氯仿∶甲醇＝50∶1)＝0.1；¹H NMR(400MHz，氘代二甲亚砜)：1.02(t，J＝7.0Hz，3H，CH3)，1.06(t，J＝7.0Hz，3H，CH3)，1.17(t，J＝7.0Hz，3H，CH3)，1.224(t，J＝7.0Hz，3H，CH3)，3.32(q，J＝7.0Hz，2H NCH2)，3.37(q，J＝7.0Hz，2H，NCH2)，3.42(q，J＝7.0Hz，2H，NOH2)，3.44(q，J＝7.0Hz，2H，NCH2)，3.53(m，1H，H-9′a)，3.79(m，1H，H-9′b)，3.88(s，3H，OCH3)，4.25(m，1H，H-8′)，4.95(s，2H，OCH2CO)，4.96(s，2H，OCH2CO)，5.02(d，J＝8.0Hz，1H，H-7′)，6.34(s，1H，H-6)，6.73(s，1H，H-8)，6.89-7.94(m，6H，Ar-H)，12.61(s，1H，5-OH)；ESI-MS 707[M+1]⁺。

根据实施例1相同的方法制备表一中实施例2-7所示化合物：

表一：

各化合物理化数据：

化合物I-2(2-[2，3-二氢-3-(4-吡咯烷基甲酰甲氧基-3-甲氧基苯基)-2-羟甲基-1，4-苯并二氧六环-6-]-4-(4-吡咯烷基甲酰甲氧基-3-甲氧基苯基)-3，5，-二羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮)：Rf(氯仿∶甲醇＝50∶1)＝0.10；¹H NMR(400MHz，氘代二甲亚砜)：1.53(m，12H，CH2)，3.46(m，9H，NCH2，9′a)，3.75(m，1H，H-9′b)，3.86(s，3H，OCH3)，4.20(m，1H，H-8′)，4.93(s，2H，OCH2CO)，4.95(s，2H，OCH2CO)，5.00(d，J＝8.0Hz，1H，H-7′)，6.30(s，J＝2.0Hz，1H，H-6)，6.32(d，J＝2.0Hz，1H，H-8)，6.86-7.13(m，6H，Ar-H)，12.05(s，1H，5-OH)；ESI-MS 703[M+1]⁺。

化合物I-3(2-[2，3-二氢-3-(4-N-苯胺基甲酰甲氧基-3-甲氧基苯基)-2-羟甲基-1，4-苯并二氧六环-6-]-7-(4-N-苯胺基甲酰甲氧基-3-甲氧基苯基)-3，5，-二羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮)：Rf(氯仿∶甲醇＝50∶1)＝0.10；¹H NMR(400MHz，氘代二甲亚砜)：1.53(m，12H，CH2)，3.40(m，1H，9′a)，3.46(t，8H，NCH2)，3.56(m，1H，H-9′b)，3.86(s，3H，OCH3)，4.20(m，1H，8′)，4.93(s，2H，OCH2CO)，4.95(s，2H，OCH2CO)，5.00(d，J＝8.0Hz，1H，H-7′)，6.30(s，J＝2.0Hz，1H，H-6)，6.32(d，J＝2.0Hz，1H，H-8)，6.86-7.13(m，16H，Ar-H)，12.05(s，1H，5-OH)；ESI-MS 747[M+1]⁺。

化合物I-4(2-[2，3-二氢-3-(4-N-对氯苯胺基甲酰甲氧基-3-甲氧基苯基)-2-羟甲基-1，4-苯并二氧六环-6-]-7-(4-N-对氯苯胺基甲酰甲氧基-3-甲氧基苯基)-3，5，-二羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮)：Rf(氯仿∶甲醇＝50∶1)＝0.13；¹H NMR(400MHz，氘代二甲亚砜)：3.40(m，1H，9′a)，3.58(m，1H，H-9′b)，3.78(s，3H，OCH3)，4.26(m，1H，8′)，4.67(s，2H，OCH2CO)，4.85(s，2H，OCH2CO)，5.01(d，J＝8.0Hz，1H，H-7′)，6.50(s，J＝2.0Hz，1H，H-6)，7.02(d，J＝2.0Hz，1H，H-8)，6.80-7.77(m，14H，Ar-H)，12.05(s，1H，5-OH)；ESI-MS815[M+1]⁺。

化合物I-5(2-[2，3-二氢-3-(4-N-对甲氧基苯胺基甲酰甲氧基-3-甲氧基苯基)-2-羟甲基-1，4-苯并二氧六环-6-]-7-(4-N-对甲氧基苯胺基甲酰甲氧基-3-甲氧基苯基)-3，5，-二羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮)：Rf(氯仿∶甲醇＝50∶1)＝0.16；¹H NMR(400MHz，氘代二甲亚砜)：3.40(m，1H，9′a)，3.59(m，1H，H-9′b)，3.75(s，6H，OCH3)，3.77(s，6H，OCH3)，4.27(m，1H-8′)，4.62(s，2H，OCH2CO)，4.80(s，2H，OCH2CO)，4.95(d，J＝8.0Hz，1H，H-7′)，6.51(s，J＝2.0Hz，1H，H-6)，7.02(d，J＝2.0Hz，1H，H-8)，6.86-7.13(m，14H，Ar-H)，12.38(s，1H，5-OH)；ESI-MS 809[M+1]⁺。

化合物I-6(2-[2，3-二氢-3-(4-N-对甲基苯胺基甲酰甲氧基-3-甲氧基苯基)-2-羟甲基-1，4-苯并二氧六环-6-]-7-(4-N-对甲基苯胺基甲酰甲氧基-3-甲氧基苯基)-3，5，-二羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮)：Rf(氯仿∶甲醇＝50∶1)＝0.13；¹H NMR(400MHz，氘代二甲亚砜)：2.27(s，6H，CH3)，3.40(m，1H，H-9′a)，3.59(m，1H，H-9′b)，3.78(s，3H，OCH3)，4.28(m，1H，H-8′)，4.65(s，2H，OCH2CO)，4.83(s，2H，OCH2CO)，4.96(d，J＝8.0Hz，1H，H-7′)，6.52(s，J＝2.0Hz，1H，H-6)，7.03(d，J＝2.0Hz，1H，H-8)，6.86-7.13(m，14H，Ar-H)，12.40(s，1H，5-OH)；ESI-MS 775[M+1]⁺。

化合物I-7：(2-[2，3-二氢-3-(4-N-2，4-二氯苯胺基甲酰甲氧基-3-甲氧基苯基)-2-羟甲基-1，4-苯并二氧六环-6-]-二氢-7-(4-N-2，4-二氯苯胺基甲酰甲氧基-3-甲氧基苯基)-3，5，-二羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮)：Rf(氯仿∶甲醇＝50∶1)＝0.21；1H NMR(400MHz，氘代二甲亚砜)：3.40(m，1H，H-9′a)，3.60(m，1H，H-9′b)，3.79(s，3H，OCH3)，4.29(m，1H，H-8′)，4.75(s，2H，OCH2CO)，4.95(s，2H，OCH2CO)，4.97(d，J＝8.0Hz，1H，H-7′)，6.53(d，J＝2.0Hz，1H，H-6)，7.03(d，J＝2.0Hz，1H，H-8)，6.86-7.13(m，12H，Ar-H)，12.36(s，1H，5-OH)；ESI-MS 885[M+1]⁺。

实施例8：化合物I-8([2-[2，3-二氢-3-(4-乙氧甲酰甲氧基-3-甲氧基苯基)-2-羟甲基-1，4-苯并二氧六环-6-]-2，3-二氢-7-(4-乙氧甲酰甲氧基-3-甲氧基苯基)-3，5，-二羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮])的制备：

根据实施例1相同的方法，用原料氯乙酸乙酯代替N，N-二乙基氯乙酰胺，得到化合物I-8：Rf(氯仿∶乙酸乙酯∶甲酸＝25∶1∶0.25)＝0.10；¹H NMR(400MHz，氘代二甲亚砜)：1.23(t，J＝7.2Hz，3H，CH3)，1.31(t，J＝7.2Hz，3H，CH3)，3.58(m，1H，9′a)，3.86(m，1H，H-9′b)，4.13(m，1H，H-8′)，4.20(q，J＝7.2Hz，2H，CH2CH3)，4.28(q，J＝7.2Hz，2H，CH2CH3)，4.28(m，1H，H-8′)，4.67(s，2H，H-9)，4.82(s，2H，OCH2CO)，5.99(d，J＝8.0Hz，1H，OCH2CO)，6.35(s，1H，H-6)，6.41(s，1H，H-8)，6.96-8.01(m，6H，Ar-H)，12.50(s，1H，5-OH)；ESI-MS 653[M+1]⁺。

式I化合物具有多种重要的生物活性，本发明将该系列化合物对过氧化氢致大鼠乳鼠原代肝细胞损伤体外模型进行了肝细胞损伤保护活性筛选，该类化合物被发现具有保护肝细胞和促进肝细胞修复的作用；本发明又对该类化合物抗氧自由基活性进行了测试，发现其具有体外清除超氧阴离子自由基、清除二苯基苦基苯肼自由基、抑制自由基诱导之脂过氧化物生成的活性，以上活性表明该类化合物可以预期用于制备预防或治疗急性慢性肝损伤类疾病以及由氧自由基引起或与氧自由基有关的其他生理改变或疾病的药物；该类化合物还表现出很强的对抗自由基引起的PC12细胞损伤作用，即对模拟脑神经细胞的PC12细胞有抗氧化损伤保护作用，而且在同一浓度下，其清除自由基保护细胞的能力比阳性对照槲皮素更为有效，说明该类脱氢水飞蓟宾双酯类衍生物对保护脑神经抗氧化、防治老年性痴呆症有积极作用。

本发明的式I化合物或其可药用盐及其溶剂化物可以与药学上常用的辐料或载体结合，制备得到具有保护肝细胞急性和慢性损伤活性从而可以用于预防以及治疗肝脏疾病的药物组合物或者保健品。上述各类药物组合物或者保健品可以采用注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、外用搽剂、软膏剂等剂型药物。

本发明的式I化合物或其可药用盐及其溶剂化物还可以与现已上市的肝脏保护及肝病治疗药物药物如联苯双酯、水飞蓟素、水飞蓟宾葡甲胺、齐墩果酸、二氯乙酸二异丙胺、原卟啉钠(protoporphyrin disodium)、马洛替酯(malotilate)、熊去氧胆酸等联合使用，制备得到具有保护肝脏活性的组合物，可预期用于治疗急慢性病毒性肝炎、慢性肝炎、早期肝硬化、脂肪肝及中毒性肝损伤疾病药品或者保健品。上述各类药物组合物或者保健品可以采用注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂等剂型药物，包括采用现已公认的药剂学常识常规制备而得的各种缓释、控释剂型或纳米制剂。

本发明的式I化合物或其可药用盐及其溶剂化物可以与现已上市的抗自由基氧化剂药物如超氧化物歧化酶(SOD)等联合使用，制备得到具有防御自由基引起的损害活性的抗氧化药物组合物或者保健品，用于治疗超氧阴离子自由基或其他类型自由基引起或与自由基异常相关的其他生理改变或疾病包括炎症、自身免疫性疾病、肿瘤、心肌缺血、心肌肥厚、衰老、变态反应、动脉粥样硬化等疾病。上述各类药物组合物或者保健品可以采用注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂等剂型药物，包括采用现已公认的药剂学常识常规制备而得的各种缓释、控释剂型或纳米制剂。

本发明的式I化合物或其可药用盐及其溶剂化物还可以与现已上市的抗早老性痴呆药物及促智药物如他可林、多奈哌齐、斯地哥明、加兰他敏、黄皮酰胺、石杉碱甲等联合使用，制备得到具有防御自由基引起的损害、保护脑神经活性的抗氧化药物组合物或者保健品，用于防治老年性痴呆症以及其相关的智力障碍疾病。上述各类药物组合物或者保健品可以采用注射剂、片剂、透皮吸收贴片或植埋剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、外用搽剂、软膏剂等剂型药物，包括采用现已公认的药剂学常识常规制备而得的各种缓释、控释剂型或纳米制剂。

氧压是由机体细胞产生和清除自由基之间的失调所引起的，可诱发多种疾病。氧压可引起神经系统疾病，如中风，帕金森氏病，阿尔茨海默病。另外它还跟其它疾病的病理途径有关，如心脏病、自身免疫性疾病、肿瘤、病毒性疾病(如AIDS、肝炎)。因此寻找新的抗氧化剂成为治疗由氧压引起的各种疾病的有效途径。本发明用体外清除阴离子超氧化自由基的活性试验；体外清除二苯基苦基苯肼自由基(1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)的活性试验；测定化合物对双氧水H₂O₂所致PC12(大鼠肾上嗜铬细胞瘤)细胞损伤的保护作用；化合物抑制自由基诱导之脂过氧化物生成等试验说明本发明权利要求中化合物的抗氧化活性。

为了更好地理解本发明的实质和本发明所述化合物在药物开发上的应用前景，下面以药理实施例形式分别用本发明中制备出的化合物对过氧化氢致大鼠乳鼠原代肝细胞损伤体外模型的肝细胞损伤保护活性、体外清除超氧阴离子自由基、清除DPPH自由基活性、抑制自由基诱导的脂过氧化物生成活性以及对由双氧水H₂O₂所致PC12(大鼠肾上嗜铬细胞瘤)细胞损伤的保护作用的药理实验结果，说明其在制药领域中的新用途。药理实施例给出了代表性化合物的部分活性数据。必须说明，本发明的药理实施例及所采用的药效学模型是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进，以及在本发明实施例所涵盖的病因基础上的简易扩充的其他适应症都属于本发明要求保护的范围。

药理实施例1：化合物I-1体外清除超氧阴离子自由基的活性试验

化合物I-1清除超氧阴离子自由基能力的检测乃使用吩嗪-N甲硫酸盐-NADH(phenazine methosulfate-NADH)系统，用四唑氮蓝(nitroblue tetrazolium)还原方法检定。用3毫升含有78μM的NADH、50μM四唑氮蓝和10μM吩嗪-N甲硫酸盐在pH值为8.0的16mM Tris-HCl缓冲液中产生出超氧阴离子自由基，在不同浓度的化合物I-1检测其活性。超氧阴离子自由基和四唑氮蓝反应生成物的颜色用分光光度计在560nm波长下监测，槲皮素被用作阳性对照药物。试验结果见表二。

表二

试验结果表明，化合物I-1具有一定的超氧阴离子自由基清除作用，但是在同一浓度下，其清除能力没有槲皮素高。结论：该类脱氢水飞蓟宾双酯类化合物属于具有一定清除超氧阴离子自由基能力的抗氧化物质。

药理实施例2：化合物I-2体外清除二苯基苦基苯肼自由基(1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)的活性试验

DPPH的甲醇溶液在517nm有强吸收值，其被抗氧化物还原时，吸收值下降，吸光度越低，其抗氧化作用越强。在250μL反应体系中含有25μL的浓度为40μg/mL的化合物I-2，DPPH(0.4mg/mL)的甲醇溶液40μL及甲醇溶液185μL，37℃水浴反应30分钟后，在517nm处测定吸光度。DPPH的甲醇液和相同浓度的槲皮素分别作为阴性、阳性对照。试验结果见表三。

表三

试验结果表明，化合物I-2具有一定的DPPH自由基清除作用，但是在同一浓度下，其清除能力没有槲皮素高。结论：该类脱氢水飞蓟宾双酯类化合物属于具有一定清除DPPH自由基能力的抗氧化物质。

药理实施例3：化合物I-1对双氧水H₂O₂所致PC12细胞损伤的保护作用活性试验

H₂O₂是一种主要的活性自由基的前体，它可引起中枢神经系统细胞的凋亡，PC12细胞(大鼠肾上嗜铬细胞瘤)可模拟脑神经细胞，因此常用它来作为研究药物与神经细胞之间关系的模型，用MTT测细胞的存活率，如果待测化合物有清除由H₂O₂引起的自由基暨保护神经细胞的作用，OD值高，细胞存活率就高，反之就低。对唐希灿所报道的方法(Xiaoqiu Xiao等，Neurosci Lett.199，275：73-76)加以改进测定化合物的保护作用。PC12细胞用DMEM培养基培养，培养基中含10％胎牛血清，100U/mL青霉素和100U/mL链霉素。细胞以每孔6000个的密度加到96孔板中，在37℃，50％CO₂潮湿空气的培养箱中培养36小时。细胞存活率淫倒置显微镜观观察和改良的MTT法。细胞经36小时的孵育后，分别加新配的化合物I-1的二甲亚砜溶液以浓度梯度加入到各孔中。作用2小时后加入新配的H₂O₂(终浓度为500μmol/L)作用3小时，显微镜观察记录，弃去原培养液，加入新的培养液100μL，然后加入MTT 10μL，3小时后，小心吸去培养液，加入150μLDMSO溶解甲臜，于570nm处读数；用槲皮素作阳性对照，试验结果见表四。

表四

试验结果表明，化合物I-1具有很强的对抗羟基自由基引起的PC12细胞损伤作用，即对模拟脑神经细胞的PC12细胞有抗氧化损伤保护作用。而且在同一浓度下，其清除自由基保护细胞的能力比阳性对照槲皮素还高。结论：该类脱氢水飞蓟宾双酯类化合物属于具有强效保护模拟脑神经细胞的PC12细胞作用的抗氧化物质。

测定化合物对H₂O₂所致PC12细胞损伤的保护作用可作为初步探讨其保护中枢脑神经细胞的作用机理。故该类化合物表现出对双氧水损伤所致PC12细胞的保护作用，说明其对老年性痴呆证的治疗有积极作用。

药理实施例4：化合物I-2抑制自由基诱导之脂过氧化物生成的活性试验

1.实验原理：脂质过氧化是自由基作用于多不饱和脂肪酸的产物，含量与自由基的生成正相关，由于机体有抗氧化的酶系及非酶系的保护作用，使自由基不断产生又不断被清除。随着年龄的增长，体内的抗氧化剂不断下降，清除自由基的能力逐渐减弱，脂质过氧化作用则增强，脂质过氧化产物增多。因此，测定样品抗脂质过氧化作用，是筛选抗氧化，抗衰老药物的重要指标之一。

2.化合物I-2抑制自由基诱导之脂过氧化物生成乃通过鼠肝微粒体检测：(1)肝微粒体制备：实验大鼠断头处死，迅速取出肝脏，用超速离心法制备肝微粒体。(2)样品对鼠肝脂质过氧化的抑制作用：在含FeSO₄(4μmol/L)与维生素C Vc(50μmol/L)的1毫升缓冲液中加入200μg/mL微粒体中，以诱导产生脂质过氧化，同时加入不同浓度的I-2样品，加入1毫升三氯醋酸中止反应。加入1.5毫升硫代巴比妥酸100℃沸水浴20分钟，离心，在532nm波长下测定上清吸光度。脂质过氧化以反应中生成的丙二醛表示，实验以槲皮素作为阳性对照。试验结果见表五。

表五

试验结果表明，化合物I-2具有很强的抑制自由基诱导之脂过氧化物生成能力，即对细胞有抗氧化损伤保护作用。而且在同一浓度下，其对细胞抗氧化损伤能力比阳性对照槲皮素还强。结论：该类脱氢水飞蓟宾双酯类化合物属于具有强效保护细胞抗氧化物质。提示其具有抗氧化、抗衰老以及预期用于制备抗氧化抗衰老类疾病的作用。

药理实施例5：化合物I-8对SD新生大鼠原代肝细胞双氧水损伤模型的保护作用试验

取SD大鼠新生乳鼠肝脏，制成肝细胞悬液，离心3次，以培养液重悬，即可得到大部分为肝实质细胞的悬液。将上述肝细胞悬液加入96孔(每孔0.1毫升)培养板中，置5％CO₂培养箱中，在37℃下培养12小时后，吸弃上清，加入0.6mmol/L的H₂O₂。作用1小时后，分别加入高、中、低3种不同浓度的I-8样品试验药液，同时设溶剂和阳性对照组。培养结束后，吸弃上清，收集肝细胞样品，570nm波长下用酶标仪计算保护率，结果见表六。

表六

试验结果表明：化合物I-8具有一定的保护SD新生大鼠原代肝细胞免受双氧水损伤的能力，即对SD新生大鼠原代肝细胞有抗氧化损伤保护作用。但在同一浓度下，其对细胞抗氧化损伤保护能力比阳性对照槲皮素低；结论：该类脱氢水飞蓟宾双酯类化合物属于具有有效保护新生大鼠原代肝细胞抗氧化损伤物质。提示其具有保肝护肝以及预期用于制备预防或治疗急性慢性肝损伤类疾病的作用。

Claims

1.一种式I所示的脱氢水飞蓟宾双酯类衍生物及其可药用盐；

式I

其中，n＝1-5；X为氮或氧，R₁、R₂为氢、烷基、环烷基、芳基，式I中的7′，8′的立体构型分别是或同时是R构型或S构型。

2.根据权利要求1的式I化合物，他们是：

化合物I-1：2-[2，3-二氢-3-(4-N，N-二乙基胺基甲酰甲氧基-3-甲氧基苯基)2-羟甲基-1，4-苯并二氧六环-6-]7-(4-N，N-二乙基胺基甲酰甲氧基-3-甲氧基苯基)-3，5，-二羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮；

化合物I-3：2-[2，3-二氢-3-(4-N-苯胺基甲酰甲氧基-3-甲氧基苯基)-2-羟甲基-1，4-苯并二氧六环-6-]7-(4-N-苯胺基甲酰甲氧基-3-甲氧基苯基)-3，5，-二羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮；

化合物I-4：2-[2，3-二氢-3-(4-N-对氯苯胺基甲酰甲氧基-3-甲氧基苯基)-2-羟甲基-1，4-苯并二氧六环6-]-7-(4-N-对氯苯胺基甲酰甲氧基-3-甲氧基苯基)-3，5，-二羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮；

化合物I-6：2-[2，3-二氢-3-(4-N-对甲基苯胺基甲酰甲氧基-3-甲氧基苯基)2-羟甲基-1，4-苯并二氧六环-6-]7-(4-N-对甲基苯胺基甲酰甲氧基-3-甲氧基苯基)-3，5，-二羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮；

化合物I-8：2-[2，3-二氢-3-(4-乙氧甲酰甲氧基-3-甲氧基苯基)2-羟甲基-1，4-苯并二氧六环-6-]-7-(4-乙氧甲酰甲氧基-3-甲氧基苯基)-3，5，-二羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮。

3.权利要求1中式I化合物的制备方法，包括将式I-a和式I-b经过酯化得到式I化合物：

其中n，R₁，R₂，X的定义同权利要求1中的式I；X₁为卤素，碱为碳酸钾，碳酸氢钢，碳酸钠，氢氧化钾，氢氧化钠；反应溶剂为四氢呋喃，N，N-二甲基甲酰胺，二甲亚砜，反应温度为室温至回流，反应时间为0.5-20小时；I-a中2，3位和7′，8′的立体构型分别是或同时是R构型或S构型。

4.根据权利要求1～2任一项所述之脱氢水飞蓟宾双酯类式I化合物用于制备预防或治疗急性慢性肝损伤类疾病、保肝护肝类药物的用途；用于制备防治炎症、自身免疫性疾病、肿瘤、心肌缺血、心肌肥厚、衰老、变态反应或动脉粥样硬化的药物的用途；或者用于制备保护脑神经、防治老年性痴呆症的药物用途。

5.一种用于清除自由基、抗氧化、保护肝细胞损伤及急慢性肝损伤、保护脑神经细胞损伤的药物组合物，其含有作为活性成分的治疗有效量的权利要求1～2任一项所述之化合物I或其可药用盐或溶剂化物或者它们的混合物和可药用辅料。

6.根据权利要求5的药物组合物，其是保肝护肝药、防治老年性疾呆药物、治疗心血管及脑血管病变药物、抗衰老药物和/或抗肿瘤药物。

7.根据权利要求5～6任一的药物或花物组合物，其是片剂、胶囊剂、注射剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、贴片剂、皮下植埋剂、外用搽剂、口服液或软膏剂，或者为控释或缓释剂型或纳米制剂。