CN109134486B - 香豆素并木脂素及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一类香豆素并木脂素及其制备方法和用途。所述的香豆素并木脂素具体为6个从山乌桕(Sapium discolor(Champ.ex Benth.)Muell.Arg.)中分离得到的化合物。申请人的试验表明，本发明所述化合物在不影响BV2小胶质细胞存活率的情况下，能够显著抑制LPS刺激的BV2小胶质细胞NO释放，其中化合物2a的抑制作用稍强于临床常用药米诺环素，具有较好的潜在药用价值，有望用于神经退行性病症药物的制备。

Description

香豆素并木脂素及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及从植物中提取分离的活性成分，具体涉及从山乌桕中提取分离的香豆素并木脂素及其制备方法和用途。

背景技术

神经退行性疾病是影响人类健康的一类疾病的总称，它是一组以神经元退行性病变为特征的慢性、进行性神经系统疾病。每种神经退行性疾病都有其特定的诱发原因，虽然诱发这些疾病的病因不尽相同，但是神经炎症的出现是此类疾病的共同特征。

在参与神经炎症介导的神经退行性病变的几种细胞中，小胶质细胞是最重要的一种。小胶质细胞是中枢神经系统中的常驻免疫细胞。正常情况下，静息的小胶质细胞起免疫监视作用，维持神经系统的正常功能。在病理条件下，小胶质细胞可被激活，它的适度激活将在一定程度上保护神经元，但其过度活化则会产生慢性炎症反应，释放多种炎症因子和细胞毒因子。这些炎症因子的持续大量释放，会直接损伤神经元，并进一步激活小胶质细胞的过度活化形成恶性循环，最终导致神经元逐渐退行性改变或死亡而发生神经退行性疾病。基于神经退行性疾病发病的神经炎症理论，目前对于减轻患者脑内炎症反应、延缓病情发展的药物主要集中在非甾体抗炎药(NSAIDs)和四环素类抗生素等，但其临床疗效并不乐观。

传统的天然药物具有使用历史悠久、毒副作用相对较小的优点，从中寻找安全性高、结构新颖的神经炎症抑制剂，成为近年来神经退行性疾病药物研发的新着眼点。山乌桕(Sapium discolor(Champ.ex Benth.)Muell.Arg.)又名红乌桕，为大戟科乌桕属植物，分布于我国广西、广东、云南、贵州、江西、浙江、福建及台湾诸省，民间将其作为一种药用植物，取其叶茎根入药，主治毒蛇咬伤、痈肿、皮肤湿痒等症。目前尚未见有从山乌桕中提取香豆素并木脂素及其抗神经炎症活性的相关报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一类结构新颖的香豆素并木脂素及其制备方法，以及它们的应用。

本发明所述的香豆素并木脂素为具有下述式1a-3a和1b-3b所示结构的香豆素并木脂素及其药效学上可接受的盐：

本发明还提供上述香豆素并木脂素的制备方法，它们来源于山乌桕茎和/或叶。具体的制备方法包括以下步骤：

1)获取山乌桕茎和/或叶的醇提物；

2)将醇提物加水混悬，依次用石油醚和乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯萃取部位，浓缩，得到乙酸乙酯萃取物；

3)将乙酸乙酯萃取物上硅胶柱层析，依次用第一洗脱剂和第二洗脱剂洗脱，利用薄层层析检识合并流份，分别得到A-G共7个流份；其中，第一洗脱剂为由石油醚和丙酮，或者是由石油醚和乙酸乙酯按100：1-1：1的体积比组成的混合溶剂；第二洗脱剂为由二氯甲烷和甲醇，或者是由氯仿和甲醇按100：1-1：1的体积比组成的混合溶剂；

4)将E流份上MCI柱层析，用第三洗脱剂洗脱，利用薄层层析检识合并流份，分别得到E1-E11共11个流份；所述第三洗脱剂为由甲醇和水按10:90-100:0的体积比组成的混合溶剂；

5)将E7流份上C18反相色谱柱层析，用第四洗脱剂洗脱，利用薄层层析检识合并流份，分别得到E7a-E7i共9个流份；所述第四洗脱剂为由甲醇和水按10:90-100:0的体积比组成的混合溶剂；

6)将E7e流份上凝胶柱层析，用甲醇洗脱，收集洗脱液上半制备型高效液相色谱仪或制备型高效液相色谱仪，以由甲醇和水，或者是由乙腈和水按10:90-100:0的体积比组成的混合溶剂作为流动相进行分离，得到化合物3；

7)将E7f流份上半制备型高效液相色谱仪或制备型高效液相色谱仪，以由乙腈和水，或者是由甲醇和水按10:90-100:0的体积比组成的混合溶剂作为流动相进行分离，分别得到化合物1和化合物2；

8)将前述所得的化合物1、化合物2和化合物3分别进行手性拆分，以由乙醇和正己烷组成的混合溶剂作为流动相，分别得到三对手性异构体，即化合物1a和化合物1b、化合物2a和化合物2b、化合物3a和化合物3b。

上述制备方法的步骤1)中，通常是以山乌桕茎和/或叶为原料，以醇类物质为溶媒，在加热条件下进行提取，从而获得山乌桕茎和/或叶的醇提物。在提取时所述醇类物质的浓度优选为80-100v/v％，进一步优选为90-100v/v％。所述醇类物质具体可以是甲醇或乙醇，还可以是甲醇和乙醇的组合物。提取的次数、提取方式、每次提取时溶媒的用量、提取时间等参数均与现有技术相同。优选地，提取方式采用回流提取，提取的次数为2-3次，每次提取时溶媒的用量为原料重量的3-6倍，每次提取1-3h。

上述制备方法的步骤2)中，在用石油醚萃取之后，收集水相再用乙酸乙酯进行萃取。

上述制备方法的步骤3)中，所述第一洗脱剂的组成中，石油醚和丙酮或乙酸乙酯的体积比优选为50：1-1：1，更进一步优选为10：1-1：1；在第二洗脱剂的组成中，二氯甲烷或氯仿和甲醇的体积比优选为50：1-1：1，更进一步优选为6：1-2：1。

上述制备方法的步骤4)中，在第三洗脱剂的组成中，甲醇和水的体积比优选为30：70-100：0。

上述制备方法的步骤5)中，在第四洗脱剂的组成中，甲醇和水的体积比优选为30：70-70：30。

上述制备方法步骤6)中所述流动相的组成中，乙腈和水，或者是甲醇和水的体积比优选为30：70-100：0，最优选地，所述流动相由甲醇和水按40：60的体积比组成。

上述制备方法步骤7)中所述流动相的组成中，乙腈和水，或者是甲醇和水的体积比优选为20：80-100：0，最优选地，所述流动相由乙腈和水按25：75的体积比组成。

上述制备方法的步骤8)中，采用现有常规方法(如手性色谱法等)对化合物1、化合物2和化合物3分别用进行手性拆分，优选采用大赛璐CHIRALPAKAD-H或CHIRALPAK ID手性色谱柱对前述化合物进行手性拆分，具体地，在对化合物1进行手性拆分时，优选是以由乙醇和正己烷按20：80-70：30的体积比组成的混合溶剂作为流动相，更为优选的，乙醇和正己烷的体积比为38：62；在对化合物2进行手性拆分时，优选是以由乙醇和正己烷按20：80-70：30的体积比组成的混合溶剂作为流动相，更为优选的，乙醇和正己烷的体积比为32：68；在对化合物3进行手性拆分时，优选是以由乙醇和正己烷按20：80-70：30的体积比组成的混合溶剂作为流动相，更为优选的，乙醇和正己烷的体积比为50：50。

上述制备方法的步骤6)-8)中，当流动相的组成不是具体的配比时，需要采用薄层层析和高效液相色谱检识合并流份，之后再确定是否为目标化合物。

本发明还包括上述式1a-3a和1b-3b中任一化合物及其药效学上可接受的盐在制备抗炎药物中的应用。具体来说是在制备预防和治疗神经炎症药物中的应用，更进一步地，是在制备预防和治疗神经退行性疾病药物中的应用。

本发明进一步包括一种药物组合物，它含有治疗上有效剂量的上述式1a-3a和1b-3b中任一化合物或其药效学上可接受的盐。

本发明所述药物组合物的给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重、性格及个体反应，给药途径、给药次数、治疗目的，因此本发明所述药物的治疗剂量可以有较大范围的变化。具体可以根据本发明药物组合物中最后的制剂中所含有的实际有效成分含量，加以适当的调整，以达到其治疗有效量的要求，完成本发明的预防或治疗目的。本发明所述药物组合物日剂量以式1a-3a和1b-3b中任一化合物计，范围为0.001-10mg/Kg体重，分2-4次服用。本发明所述式1a-3a和1b-3b中任一化合物或含有它们的药物组合物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用并调整剂量。

为了解决药物的成型等问题，本发明所述药物组合物进一步还可包括药学上可接受的载体，具体可以是下述选择中的一种或两种以上的选择：稀释剂(如水等)、赋形剂(如水等)、填充剂(如淀粉或蔗糖等)、黏合剂(如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶或聚乙烯吡咯烷酮等)、湿润剂(如甘油等)、崩解剂(如琼脂、碳酸钙或碳酸氢钠等)、吸收促进剂(如季铵化合物等)、表面活性剂(如十六烷醇等)、吸附载体(如高岭土或皂黏土等)、润滑剂(如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁或聚乙二醇等)等，还可以进一步添加本领域常规的着色剂、防腐剂、香料、矫味剂或甜味剂等辅料。

上述药物组合物可以通过口服、鼻吸入、直肠或肠胃外给药的方式施用于需要这种治疗的患者，并可根据不同的给药方式制作成药学上可接受的剂型，如液体剂型、固体剂型或半固体剂型。如用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、粒剂、胶囊等，制成液体制剂如水或油悬浮剂或其他液体制剂如糖浆、酊剂等；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、水或油性悬浮剂等。

与现有技术相比，本发明提供了三对结构新颖的香豆素并木脂素手性异构体以及它们的制备方法，申请人的试验表明，本发明所述化合物在不影响BV2小胶质细胞存活率的情况下，能够显著抑制LPS刺激的BV2小胶质细胞NO释放，其中化合物2a的抑制作用稍强于临床常用药米诺环素，具有较好的潜在药用价值，有望用于神经退行性病症药物的制备。

附图说明

图1为本发明实施例1步骤8)制得的香豆素并木脂素手性异构体(化合物1a和1b)的ECD实测和计算图；

图2为本发明实施例1步骤9)制得的香豆素并木脂素手性异构体(化合物2a和2b)的ECD实测和计算图；

图3为本发明实施例1步骤10)制得的香豆素并木脂素手性异构体(化合物3a和3b)的ECD实测和计算图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详述，以更好地理解本发明的内容，但本发明并不限于以下实施例。

以下各实施例或实验例中出现的术语所代表的意思如下：

ECD：电子圆二色谱。

TDDFT：时密度泛函理论。

HMBC：异核多键相关(一种测定分子中远程氢碳连接关系的二维核磁共振谱)。

HPLC：高效液相色谱。

HRESI-MS：高分辨电喷雾质谱。

HSQC：异核单量子相关(一种测定分子中氢碳直接相连关系的二维核磁共振谱)。

IC₅₀：半数抑制剂量。

IR：红外光谱。

NMR：核磁共振。

NOESY：核欧沃豪斯增益谱(一种测定分子中氢原子空间位置临近关系的二维核磁共振谱)。

UV：紫外光谱。

实施例1：化合物1a-3a及1b-3b的制备及结构表征

1)取山乌桕茎和叶20kg，粉碎，用95v/v％乙醇(100L)回流提取3次，每次3小时，合并提取液，减压浓缩得到浸膏1.6kg；

2)所得浸膏加水(8L)混悬，依次用等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，收集乙酸乙酯萃取液，减压浓缩，得到乙酸乙酯萃取物168.3g。

3)将乙酸乙酯萃取物上硅胶柱层析，依次用第一洗脱剂和第二洗脱剂梯度洗脱，利用薄层层析检识合并流份，分别得到A-G共7个流份；其中，第一洗脱剂为由石油醚和丙酮按10：1-1：1的体积比组成的混合溶剂，第二洗脱剂为由二氯甲烷和甲醇按6：1-2：1的体积比组成的混合溶剂；

4)将E流份(16.7g)上MCI柱层析，用第三洗脱剂梯度洗脱，利用薄层层析检识合并流份，分别得到E1-E11共11个流份；所述第三洗脱剂为由甲醇和水按30：70-100：0的体积比组成的混合溶剂；

5)将E7流份(3.3g)上RP-C18反相色谱柱层析，用第四洗脱剂梯度洗脱，利用薄层层析检识合并流份，分别得到E7a-E7i共9个流份；所述第四洗脱剂为由甲醇和水按30：70-70：30的体积比组成的混合溶剂；

6)将E7e流份(250.0mg)上葡聚糖凝胶柱层析，用甲醇洗脱，收集洗脱液上半制备型高效液相色谱仪(创新通恒LC3000型HPLC，YMC-pack ODS-A色谱柱(250×20mm，5μm)，下同)，以由甲醇和水按40：60的体积比组成的混合溶剂作为流动相(流速为6mL/min)进行分离，得到化合物3(17.2mg，t_R＝50.3min)；

7)将E7f流份(162.0mg)上半制备型高效液相色谱仪，以由乙腈和水按25：75的体积比组成的混合溶剂作为流动相(流速为8mL/min)进行分离，利用薄层层析结合高效液相色谱检识合并流份，得到化合物1(8.7mg，t_R＝37.5min)和化合物2(11.2mg，t_R＝39.8min)；

8)将前述步骤7)所得的化合物1经手性HPLC(大赛璐CHIRALPAK AD-H手性柱)，以由乙醇和正己烷按38：62的体积比组成的混合溶剂作为流动相(流速为1mL/min)作为流动相进行分离，得到化合物1a(1.72mg，t_R＝8.6min)和1b(1.96mg，t_R＝11.5min)；

9)将前述步骤7)所得的化合物2经手性HPLC(大赛璐CHIRALPAK ID手性柱)，以由乙醇和正己烷按32：68的体积比组成的混合溶剂作为流动相(流速为1mL/min)作为流动相进行分离，得到化合物2a(1.95mg，t_R＝9.0min)和2b(1.95mg，t_R＝12.1min)；

10)将前述步骤6)所得的化合物3经手性HPLC(大赛璐CHIRALPAK ID手性色谱柱)，以由乙醇和正己烷按50：50的体积比组成的混合溶剂作为流动相(流速为1mL/min)作为流动相进行分离，得到化合物3a(3.14mg，t_R＝6.7min)和3b(3.70mg，t_R＝9.2min)。

本实施例步骤6)和7)所得的化合物1-3的结构式及鉴定方法如下：

化合物1-3的波谱数据和理化性质

化合物1Sapiumin A

白色无定型粉末；UV(MeOH)λ_max(logε)230(4.36),261(3.79),289(4.01),344(4.06)nm；IR(KBr)ν_max 3449,1725,1628,1563,1440,1296,1153,1029,832cm^-1；¹H and ¹³CNMR数据见下述表1；(-)HR-ESIMS m/z 341.0668[M-H]^-,计算值C₁₈H₁₃O₇,341.0667)。

化合物2Sapiumin B

白色无定型粉末；UV(MeOH)λ_max(logε)231(4.44),306(4.08)nm；IR(KBr)ν_max3430,1698,1615,1570,1490,1415,1310,1093,1052,820cm^-1；¹H and ¹³C NMR数据见下述表1；(-)HR-ESIMS m/z 371.0779[M-H]^-,计算值C₁₉H₁₅O₈,371.0772)。

化合物3Sapiumin C

白色无定型粉末；UV(MeOH)λ_max(logε)229(4.31),260(3.73),289(3.97),343(4.04)nm；IR(KBr)ν_max 3437,1690,1627,1566,1446,1399,1301,1152,824cm^-1；¹H and ¹³CNMR数据见下述表1；(-)HR-ESIMS m/z 341.0668[M-H]^-,计算值C₁₈H₁₃O₇,341.0667)。

表1化合物1-3的¹H NMR(500MHz)和¹³C NMR(125MHz)数据(DMSO-d₆)

^aSignal overlapped by solvent peaks.

本实施例步骤8)-10)所得的化合物1a-3a及1b-3b的结构式及相关波谱数据如下：

化合物1a，(7′S,8′S)-Sapiumin A：

(c 0.1,MeOH)；ECD(MeOH)λ_max(Δε)288(-1.66)nm。

化合物1b，(7′R,8′R)-Sapiumin A：

(c 0.1,MeOH)；ECD(MeOH)λ_max(Δε)296(+1.12)nm。

化合物2a，(7′S,8′S)-Sapiumin B：

(c 0.1,MeOH)；ECD(MeOH)λ_max(Δε)314(-0.55)nm。

化合物2b，(7′R,8′R)-Sapiumin B：

(c 0.1,MeOH)；ECD(MeOH)λ_max(Δε)314(+0.43)nm。

化合物3a，(7′S,8′S)-Sapiumin C：

(c 0.1,MeOH)；ECD(MeOH)λ_max(Δε)298(+0.24)nm。

化合物3b，(7′R,8′R)-Sapiumin C：

(c 0.1,MeOH)；ECD(MeOH)λ_max(Δε)284(-0.39)nm。

对上述三对手性异构体(1a/1b-3a/3b)的绝对构型通过运用TDDFT方法进行ECD计算确定，将实验测出的ECD谱图与计算得到的ECD谱图进行比较，1a-3a的实测谱图与7′S,8′S计算谱图相吻合，1b-3b的实测谱图与7′R,8′R计算谱图相吻合。因此，确定化合物1a-3a的绝对构型均为7′S,8′S，1b-3b的绝对构型均为7′R,8′R。三对香豆素并木脂素(1a/1b-3a/3b)的ECD实测和计算图分别如图1-3所示。

实施例2：化合物1a-3a及1b-3b的制备

重复实施例1，不同的是：步骤1)中，采用80v/v％甲醇进行提取。

对最后分离得到的化合物1a-3a及1b-3b采用与实施例1相同的方法进行表征，确定为本发明目标化合物1a-3a及1b-3b。

实施例3：化合物1a-3a及1b-3b的制备

重复实施例1，不同的是：

步骤1)中，采用80v/v％乙醇进行提取；

步骤6)中，所述流动相的组成中，用乙腈代替其中的甲醇；

步骤7)中，所述流动相的组成中，用甲醇代替其中的乙腈。

对最后分离得到的化合物1a-3a及1b-3b采用与实施例1相同的方法进行表征，确定为本发明目标化合物1a-3a及1b-3b。

实施例4：化合物1a-3a及1b-3b的制备

重复实施例1，不同的是：

步骤3)中，在第一洗脱剂的组成中，用乙酸乙酯代替其中的丙酮；在第二洗脱剂的组成中，用氯仿代替其中的二氯甲烷；

步骤4)中，所述第三洗脱剂为由甲醇和水按10：90-100：0的体积比组成的混合溶剂；

步骤5)中，所述第四洗脱剂为由甲醇和水按10：90-100：0的体积比组成的混合溶剂；

步骤6)和7)中，用制备型高效液相色谱仪代替半制备型高效液相色谱仪；

步骤8)中，用大赛璐CHIRALPAK ID手性色谱柱代替大赛璐CHIRALPAK AD-H手性色谱柱；

步骤9)-10)中，用大赛璐CHIRALPAK AD-H手性色谱柱代替大赛璐CHIRALPAK ID手性色谱柱。

对最后分离得到的化合物1a-3a及1b-3b采用与实施例1相同的方法进行表征，确定为本发明目标化合物1a-3a及1b-3b。

实验例：本发明所述化例物抑制小胶质细胞过度活化活性测试

(1)实验原理：小胶质细胞活化介导的慢性炎症反应是神经退行性疾病的发生、发展过程中的重要环节，抑制小胶质细胞的激活可能成为药物发现的一个新的靶点。LPS激活小胶质细胞释放NO、促炎症细胞因子和活性氧等。本实验通过建立体外LPS激活BV2小胶质细胞异常活化的筛选模型，以激活小胶质细胞释放NO为指标，评价三对新的香豆素并木脂素手性异构体(化合物1a/1b-3a/3b，按实施例1所述方法分离所得)的体外抗神经炎症活性。

(2)实验方法：

①小鼠小胶质细胞系BV2的培养

细胞培养和模型建立中使用的所有玻璃器皿及金属器械(培养瓶，移液管，溶液瓶等)，均经过121℃高压灭菌30min，以彻底去除污染的LPS。以DMEM培养基作为基础配制成内含10％胎牛血清的细胞培养液。小胶质细胞以约2.0×10⁵cells/mL的浓度在5％CO₂，37℃培养瓶中传代培养，至第三天贴壁细胞约占培养瓶底面积70-80％，以胰酶消化贴壁细胞，传代至另一培养瓶。以-80℃超低温冰箱冻存复苏后的BV2作为第一代，选择第3-8代BV2细胞进行实验。

②药物配制方法

6种化合物均为粉末状，用DMSO溶解。配成母液，浓度为100mM，储存于-20℃。临用时用DMEM培养液将其进行稀释，依次稀释为100μM、30μM、10μM、1μM。DMSO终浓度<1‰。

③Griess法检测化合物对LPS激活小胶质细胞的抑制作用

取对数生长期的BV2小胶质细胞，用含10％胎牛血清的新鲜DMEM培养基将细胞密度调至2.0×10⁵cells/mL，接种于96孔板内，100μL/well，于37℃，5％CO₂的培养箱内培养。细胞贴壁培养24h后换成无血清的新鲜培养液，同时进行加药处理。6种化合物设剂量100μM、30μM、10μM、1μM与LPS共同作用。同时设空白对照。各给药组中LPS终浓度为100ng/mL。细胞加药后继续培养24h后，收集上清液，Griess比色法检测上清液中NO₂ ^-含量。

④MTT法检测化合物对小胶质细胞细胞成活率的影响

取对数生长期培养的BV2小胶质细胞，用含10％胎牛血清的新鲜DMEM培养基将细胞密度调至2.0×10⁵cells/mL，接种于96孔板内，100μL/well，于37℃，5％CO₂的培养箱内培养。细胞贴壁培养24h后换成新鲜培养液，同时进行加药处理。6种化合物设剂量100μM、30μM、10μM、1μM与LPS共同作用。同时设空白对照。各给药组中LPS终浓度为100ng/mL。细胞加药后继续培养24h，然后向细胞液中加入MTT溶液，10μL/well，将细胞与0.25mg/mLMTT于37℃下共同孵育3h，吸除培养液，然后加入150μL的DMSO溶液，测定其光密度OD值。数据处理，利用酶标仪相应软件进行数据处理，计算每一种样品3个孔OD值的平均值，利用平均值按如下公式计算细胞成活率(cell viability，CV％)。

细胞成活率％＝样品组OD值的平均值/空白对照组OD值的平均值×100％

⑤统计方法

全部资料采用SPSS(13.0)统计软件包进行检验分析。结果用平均值±标准误表示，评价整体性差异，组间均数采用One-Way ANOVA分析法进行方差齐性分析，并结合Dunnett’s test分析方法进行组间比较。多样本方差齐性检验采用Levene检验，当p>0.05，方差是齐的，采用Dunnett’s双侧T检验多组间均数的差异，当p<0.05，方差不齐，采用Dunnett T3检验多组间均数的差异。

⑥IC₅₀的计算方法

将各剂量和抑制率等参数用非线性回归拟合计算IC₅₀。

(3)实验结果：见表2

表2化合物1a/1b-3a/3b抑制小胶质细胞活化作用实验结果

实验结果表明，三对新的香豆素并木脂素手性异构体(化合物1a/1b-3a/3b)在不影响小胶质细胞BV2存活率的情况下，能够显著抑制LPS刺激的BV2小胶质细胞NO释放，化合物2a的作用强度略强于阳性对照药米诺环素。因此，从山乌桕中分离得到的这6个新香豆素并木脂素可能具有减轻小胶质细胞活化介导的神经系统疾病(如神经退行性疾病)的潜在作用。

Claims (10)

1.具有下述式2a-3a和2b-3b所示结构的香豆素并木脂素及其药效学上可接受的盐：

2.下述式1a-3a和1b-3b所示结构的香豆素并木脂素的制备方法，包括以下步骤：

1)获取山乌桕茎和/或叶的醇提物；

2)将醇提物加水混悬，依次用石油醚和乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯萃取部位，浓缩，得到乙酸乙酯萃取物；

3)将乙酸乙酯萃取物上硅胶柱层析，依次用第一洗脱剂和第二洗脱剂洗脱，利用薄层层析检识合并流份，分别得到A-G共7个流份；其中，第一洗脱剂为由石油醚和丙酮，或者是由石油醚和乙酸乙酯按100：1-1：1的体积比组成的混合溶剂；第二洗脱剂为由二氯甲烷和甲醇，或者是由氯仿和甲醇按100：1-1：1的体积比组成的混合溶剂；

4)将E流份上MCI柱层析，用第三洗脱剂洗脱，利用薄层层析检识合并流份，分别得到E1-E11共11个流份；所述第三洗脱剂为由甲醇和水按10:90-100:0的体积比组成的混合溶剂；

5)将E7流份上C18反相色谱柱层析，用第四洗脱剂洗脱，利用薄层层析检识合并流份，分别得到E7a-E7i共9个流份；所述第四洗脱剂为由甲醇和水按10:90-100:0的体积比组成的混合溶剂；

6)将E7e流份上凝胶柱层析，用甲醇洗脱，收集洗脱液上半制备型高效液相色谱仪或制备型高效液相色谱仪，以由甲醇和水，或者是由乙腈和水按10:90-100:0的体积比组成的混合溶剂作为流动相进行分离，得到化合物3；

7)将E7f流份上半制备型高效液相色谱仪或制备型高效液相色谱仪，以由乙腈和水，或者是由甲醇和水按10:90-100:0的体积比组成的混合溶剂作为流动相进行分离，分别得到化合物1和化合物2；

8)将前述所得的化合物1、化合物2和化合物3分别进行手性拆分，以由乙醇和正己烷组成的混合溶剂作为流动相，分别得到三对手性异构体，即化合物1a和化合物1b、化合物2a和化合物2b、化合物3a和化合物3b；

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤1)中，以山乌桕茎和/或叶为原料，以醇类物质为溶媒，在加热条件下进行提取，以获得醇提物；所述醇类物质的浓度为80-100v/v％。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述的醇类物质为甲醇和/或乙醇。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤8)中，

在对化合物1进行手性拆分时，以由乙醇和正己烷按20：80-70：30的体积比组成的混合溶剂作为流动相；

在对化合物2进行手性拆分时，以由乙醇和正己烷按20：80-70：30的体积比组成的混合溶剂作为流动相；

在对化合物3进行手性拆分时，以由乙醇和正己烷按20：80-70：30的体积比组成的混合溶剂作为流动相。

6.下述式1a-3a和1b-3b所示结构的香豆素并木脂素中任一化合物或其药效学上可接受的盐在制备抗炎药物中的应用；

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：是在制备预防和治疗神经炎症药物中的应用。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：是在制备预防和治疗神经退行性疾病药物中的应用。

9.一种药物组合物，含有治疗上有效剂量的权利要求1中任一化合物或其药效学上可接受的盐。

10.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物的剂型为药学上可接受的剂型。

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