CN105061533B - 六甲氧基二氢黄酮‑鼠李糖基‑鼠李糖苷及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属医药技术领域，涉及六甲氧基二氢黄酮‑鼠李糖基‑鼠李糖苷及其应用。本发明是将九里香经溶剂提取和萃取分离，然后采用硅胶柱分离，并利用半制备色谱进一步分离，浓缩冷冻干燥得成品六甲氧基二氢黄酮‑鼠李糖基‑鼠李糖苷。本发明通过抗肿瘤活性评价发现，六甲氧基二氢黄酮‑鼠李糖基‑鼠李糖苷细胞毒性不大；对结肠癌细胞HT‑29与Fn（粘连蛋白）粘附，以及与HUVECs细胞的粘附有明显抑制作用；对HT‑29迁移能力（划痕愈合实验）和侵袭能力有明显抑制作用；对小鼠体内B16‑F10肺转移有明显抑制作用。因此，六甲氧基二氢黄酮‑鼠李糖基‑鼠李糖苷具有抑制肿瘤转移活性，能用于制备抗癌药物，具有良好的开发应用前景。

Description

六甲氧基二氢黄酮-鼠李糖基-鼠李糖苷及其应用

技术领域

本发明属医药技术领域，具体涉及一种六甲氧基二氢黄酮-鼠李糖基-鼠李糖苷及其应用。

背景技术

肿瘤的转移是一个多步骤和多因素参与的特别复杂的过程，这个全过程会受到多种因素的影响，比如：肿瘤本身和宿主环境等。转移是癌症中最可怕的一面，它是指细胞从原发性肿瘤扩散到远处器官，并且不间断地持续增长。目前，尽管在诊断、外科技术、病人护理和局部与全身辅助治疗方面已有显著改善，但是病人常常由于癌症转移而导致死亡。原发性肿瘤手术后的“亚健康人”体内残留的循环肿瘤细胞（Circulating tumor cells,CTCs）是未来肿瘤转移的致命根源。

原发性肿瘤多为器官局部性疾病，但许多病人在手术后，其体内的CTCs会通过血流传播到其它组织器官形成转移，这是导致肿瘤患者死亡的主要原因。CTCs 可在如骨髓、淋巴系统等循环系统中长期以休眠或低活性状态存在。由于其休眠（或低活性），所以化疗药物对其不敏感；也由于其在手术后的亚健康人体内含量非常低，因此化疗药物对其都不起作用。与正常血液细胞相比，CTCs具有抗原特性，因为它的表面存在丰富的生物标记物，如SialyLewis、上皮细胞粘附分子（EpCAM）、兔抗人增殖细胞核核抗原单克隆抗体（Ki-67）、人类表皮生长因子受体（HER2）、CD44+和叶酸受体（Folate Receptor）等，这些物质在正常细胞表面不表达或低表达，但是它们在肿瘤细胞表面可以高度表达。

外科手术可以切除早期肿瘤，成功率可以达到95%以上。但是如果一旦肿瘤转移发生了，外科手术就没有办法一一切除全身的转移的肿瘤，这时使用“抗癌药”一样无效；化疗药物不能预防肿瘤转移。尽管“抗癌药”已经显示出了一些作用，但是仍然没有显著性的降低癌症的死亡率，因为手术后病人体内循环肿瘤细胞的数量急剧减少且绝大多数处于静止状态，而化疗药物只对迅速增长和分裂的肿瘤细胞起作用，反而使用化疗药物却严重地打击了病人自身的免疫系统，使得病人自身的平衡沿着不利方面倾斜。因此，我们认为，如果能够药物干预CTCs对内皮细胞的粘附这一重要的肿瘤转移的源头步骤，甚至综合控制几个关键位点，就有可能有效地预防与CTCs有关的肿瘤手术后的再转移。因此术后预防肿瘤转移的低毒药物的开发成为亟需解决的任务。

九里香(Murraya exotica (L.))为芸香科九里香属植物。与大多数天然植物一样，九里香中的化学成分也很复杂，以黄酮类、香豆素类和生物碱类等为主。

其中黄酮类化合物已经被大量实验证明有抗多种肿瘤转移的活性，包括甲状腺、结肠、口腔、宫颈，肺和肝脏等癌症。例如：槲皮黄酮可以抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的迁移和侵袭。南方医科大学黎春华等研究发现芹菜素可以抑制结直肠癌的生长与转移。肝细胞生长因子（HGF）和它的受体c-Met的激活在各种各样的肿瘤细胞的癌症的侵袭和转移中都起着重要作用，在对肝癌HepG2的研究中通过细胞粘附和Transwell迁移侵袭试验发现川陈皮素可以显著地抑制由HGF诱导的粘附、侵袭和迁移的能力。

在进行了一系列相关研究后，我们发现了一种有效的可能具有抗肿瘤转移的九里香黄酮糖苷单一化合物的提取、分离方法，并据此完成了本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供化合物六甲氧基二氢黄酮-鼠李糖基-鼠李糖苷及其应用。

六甲氧基二氢黄酮-鼠李糖基-鼠李糖苷，其结构式为：

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所述六甲氧基二氢黄酮-鼠李糖基-鼠李糖苷制备方法包括以下步骤：

(1)取干燥的九里香药材（嫩枝）4.2 Kg粉碎， 5 L 75%的乙醇中回流提取3次，每次3小时。过滤，合并滤液；

(2)将（1）中得到的滤液减压浓缩，得到糖浆状总浸膏。总浸膏用水超声悬浮，悬浮液用二氯甲烷萃取，萃取体积比例为1:1，萃取4次，减压浓缩溶剂部分得九里香粗提物；

（3）粗提取物于硅胶柱上以乙酸乙酯-石油醚进行梯度层析分离，收集乙酸乙酯洗脱部分，旋转蒸发除去溶剂，得到九里香黄酮组分，其收率为0.05-0.1%；

（4）采用半制备高效液相色谱将（3）中组分进行分离，得到九里香黄酮糖苷单体提取物；经鉴别，结构为：六甲氧基二氢黄酮-鼠李糖基-鼠李糖苷。

步骤（4）中的制备液相分离条件为，色谱柱：Agela Venusil XBP C18；流速：1-4mL /min；柱温：35°C；检测荧光激发波长352 nm、发射波长458nm；流动相为甲醇和纯水混合液，甲醇和纯水的体积比例9:11，等度洗脱。

所述的六甲氧基二氢黄酮-鼠李糖基-鼠李糖苷在肿瘤转移预防药物上的应用。

本发明的优点在于：六甲氧基二氢黄酮-鼠李糖基-鼠李糖苷该单体化合物在低毒浓度下具有以下优点：1.明显的抗肿瘤细胞与基质成分Fn（粘连蛋白）的粘附及其与内皮细胞HUVECs粘附；2.明显的抗肿瘤细胞迁移与侵袭能力；3.促进肿瘤细胞凋亡。

附图说明

图1九里香黄酮糖苷粗提取物的紫外-可见吸收光谱图。

图2九里香黄酮糖苷粗提取物的荧光发射光谱图。

图3九里香黄酮组分的半制备HPLC色谱图，内插为制备得到的单体HPLC分析图。

图4 六甲氧基二氢黄酮-鼠李糖基-鼠李糖苷的质谱图。

图5A六甲氧基二氢黄酮离子示意图。

图5B六甲氧基二氢黄酮-鼠李糖苷裂解离子示意图。

图6六甲氧基二氢黄酮-鼠李糖基-鼠李糖苷的核磁共振碳谱图。

图7六甲氧基二氢黄酮-鼠李糖基-鼠李糖苷的核磁共振氢谱图。

图8六甲氧基二氢黄酮-鼠李糖基-鼠李糖苷对结肠癌细胞HT-29细胞活性的影响。

图9 采用MTT法检测六甲氧基二氢黄酮-鼠李糖基-鼠李糖苷对结肠癌细胞HT-29与Fn（粘连蛋白）粘附能力的影响（**p＜0.01）。

图10六甲氧基二氢黄酮-鼠李糖基-鼠李糖苷（1，10，30 μg/mL）对结肠癌细胞HT-29与HUVECs细胞的粘附率的影响（**p＜0.01）。

图11六甲氧基二氢黄酮-鼠李糖基-鼠李糖苷对结肠癌细胞HT-29迁移能力（划痕愈合实验）的影响（*p＜0.05，**p＜0.01）。

图12 六甲氧基二氢黄酮-鼠李糖基-鼠李糖苷（1，10，30 μg/mL）对结肠癌细胞HT-29侵袭能力的影响（**p＜0.01）。

图13六甲氧基二氢黄酮-鼠李糖基-鼠李糖苷对C57BL/6小鼠体内B16-F10肺转移的作用及肺组织形态的影响的典型照片(A)。六甲氧基二氢黄酮-鼠李糖基-鼠李糖苷对小鼠体内B16-F10转移的影响的柱状图（B）。

具体实施方式

本发明提供了所述黄酮类提取物的研究和单体新化合物的分离纯化方法，该研究及方法包括以下步骤。预分离工序为：

(1)取干燥的九里香药材（嫩枝）4.2 Kg粉碎，在5 L 75%的乙醇中加热回流煮沸，提取3次，每次3小时。过滤，合并滤液；

(2)将（1）中得到的滤液减压浓缩，得到糖浆状总浸膏。总浸膏用水超声悬浮，悬浮液用二氯甲烷萃取，萃取体积比例为1:1，萃取4次，减压浓缩溶剂部分得九里香粗提物；

（3）粗提取物于硅胶柱上以乙酸乙酯-石油醚进行梯度层析分离，收集乙酸乙酯洗脱部分，旋转蒸发除去溶剂，得到九里香黄酮组分，其收率约为0.09%；

（4）采用半制备高效液相色谱将（3）中组分进行分离，得到九里香黄酮糖苷单体提取物；经质谱鉴别，结构为：六甲氧基二氢黄酮-鼠李糖基-鼠李糖苷。

所述步骤（4）中的制备液相分离条件为，色谱柱：Agela Venusil XBP C18；流速：1-4 ml/min；柱温：35°C；检测荧光激发波长352 nm、发射波长458 nm ，等度洗脱，流动相为甲醇和纯水混合液，甲醇和纯水的体积比例9：11。进样量200μL,20 mg/mL的样品用甲醇溶剂来配制。

所述步骤（4）中的质谱仪操作条件为，离子源：大气压电喷雾离子源（ESI）；扫描模式：正离子模式全扫描；扫面范围：150-800m/z； 喷雾电压（spray voltage）：4.0 kV；鞘气流量（sheath gas flow rate）：35 Arb；辅助气流量（aux gas flow rate）：5 Arb；离子传输管温度（capillary temperature）：350℃；管径电压（tube lens）：60.00 V。

实施例1九里香有效成分的提取方法

取干燥的九里香药材（嫩枝）4.2 Kg粉碎，在5L 75%的乙醇中回流提取，每批次药材提取3次，每次3小时。合并回流提取液，减压浓缩乙醇，得到糖浆状总浸膏。总浸膏用水超声悬浮，悬浮液用二氯甲烷萃取，萃取比例为1:1 （v:v），萃取4次，合并及减压浓缩，所得粗提取物在硅胶柱上，以乙酸乙酯-石油醚进行梯度层析分离，收集乙酸乙酯洗脱部分，旋转蒸发除去溶剂，得到目标组分，其收率约为0.09%。将提取物溶于等量的甲醇中，在紫外-可见吸收光谱仪和荧光光谱仪下测其紫外吸收光谱（图1）和荧光光谱（图2）。

实施例2 半制备色谱

条件为，仪器：Waters2695；检测器：Waters2475 FLR；色谱柱：Agela Venusil XBPC18（10 mm×250 mm，5μm）；流速：3mL/min；柱温：35°C；检测波长：λex=352 nm, λem=458nm；等度洗脱且甲醇和纯水按照9:11的比例。进样200μl 20mg/mL的样品，收集的23-27min的组分，如图3。

实施例3核磁共振谱确定单体化合物结构

我们利用ESI-MS，¹³C-NMR和¹H-NMR对目标化合物的结构进行了表征，对其氢原子和碳原子进行了指认归属。推导出产物结构为六甲氧基二氢黄酮-鼠李糖基-鼠李糖苷（hexamethoxy flavanone-o-[rhamnopyranosyl-(1→4)-rhamnopyranoside]），分子式是C₃₃H₄₄O₁₇，相对分子量为712.26。化学结构式为：

。

如图4所示， ESI-MS图中能看到黄酮苷元的离子峰信号；如图5A、5B所示，六甲氧基黄酮对应为[M+H]⁺：405.15， [M+Na]⁺：427.14；二氢黄酮容易开环转为异构体查耳酮，进而裂解得到一系列碎片分子离子峰，得到包括m/z=374.12，362.32，347.09，331.11的离子峰。

图6所示，¹³C-NMR给出了33个碳信号峰；δ=110.58(C-4’’)，108.56(C-1’’’)，105.95(C-4’’’)，104.28(C-5’’)，92.06(C-2’’)，90.76(C-1’’)，78.94(C-3’’’)，76.83(C-3’’)，60.84(C-2’’’)，60.47(C-5’’’)，是鼠李糖上十个碳原子信号，δ 26.05，δ 25.09，是鼠李糖上甲基的碳原子信号。还有15个属于黄酮母核的芳香碳信号，¹³C-NMR δ=188.6(C-4)，162.03(C-3’)，161.01(C-5’)，158.81(C-5)，157.73(C-7)，156.01(C-9)，155.51(C-6)，154.18(C-4’)，153.39(C-1’)，139.46(C-8)，137.8(C-10)，135.2(C-6’)，130.5(C-2’)，72.39(C-2)， 45.31(C-3)。其中δ=188.6是黄酮C-4的特征信号，根据C2-C3系统推断其是二氢黄酮，δ=56.40，56.44，56.61，56.74，56.80是黄酮上甲氧基上的碳信号。分子结构式如下：

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如图7、表1所示，根据¹H-NMR化学位移，峰型和积分面积，进一步证实目标化合物的结构。¹H-NMR (400 MHz，DMSO) δ =1.14(3H)和δ=1.24(3H)是典型的鼠李糖甲基的质子引起的化学位移。δ 3.6-4.0有典型的甲氧基上的质子信号，且分成六组，说明黄酮苷元上有6个甲氧基。其中，δ=0 ppm是对照品四甲氧基硅烷（TMS）峰，δ=2.5 ppm是氘代二甲亚砜峰，δ=3.4 ppm是氘代二甲亚砜的水峰。

表1 HMFRR的核磁共振氢谱分析

实施例4MTT法检测目标药物对结肠癌细胞HT-29增殖抑制作用

方法：选取处于对数生长期且状态良好的细胞，胰酶消化，用血球计数板计数，培养基稀释制得8×10⁴~1×10⁵个/mL的细胞悬液，然后在96孔板中每孔加入100 µL稀释液，于37 ℃、5 % CO₂培养箱中培养24 h；目标药物用DMSO溶解，并经过0.22 μm的滤膜过滤除菌。用DMSO将一级母液稀释成不同浓度梯度的二级母液，再用培养基将二级母液稀释100倍得到加药终浓度。溶液中DMSO的浓度为1 wt%；去除旧的培养基，每孔加入100 µL含不同浓度目标药物的培养基，设置空白对照组，溶剂对照组，每组设6个复孔，培养箱中继续孵育24h；移除含药培养基，每孔加入100 µL无血清无酚红的RPMI 1640培养基与10 µL 5mg/mL的MTT溶液，培养箱中继续培养4 h；吸去各孔上清液并加入100 µL DMSO，摇匀20 min，充分溶解，用酶标仪于570 nm波长处测定每孔的OD值，并计算细胞的存活率和药物作用的IC50值。存活率（%）=（实验组光吸收值-溶剂对照组光吸收值）/（空白对照组光吸收值-溶剂对照组光吸收值）×100％。

如图8所示，随着目标药物浓度的增加对HT-29的活性有所下降，可以得知，目标药物抑制肿瘤细胞的增殖。浓度在60 μg/mL内HT-29细胞活性均在80%以上，说明目标药物细胞毒性较低。

实施例5MTT法检测目标药物对结肠癌细胞HT-29与基质成分Fn（粘连蛋白）粘附的影响

方法：包被基质膜：将Fn溶液用无血清培养液稀释为10 μg/mL的工作液，于96孔板中每孔加入包被液100 μL，在37 ℃、5 % CO₂（V/V）的培养箱中继续培养24 h； BSA封闭：吸出培养板中工作液，将要测试孔每孔加入100 μL 1 wt% BSA溶液，置于37 ℃、5 % CO₂（V/V）的培养箱中封阻1 h后，用无菌PBS溶液清洗3次，彻底吸弃PBS；接种细胞：取对数生长期HT-29细胞，消化后并调整细胞浓度为2×10⁵ / ml，与目标药物混合使之终浓度分别为1、10、30 μg/mL，在已经包被过Fn的96孔培养板中，每个孔分别加入100 µL，另设空白对照组、溶剂对照组，每组设6个复孔，在常规培养箱中培养1 h； MTT比色法检测：小心吸弃培养液，PBS清洗3次，除去未粘附细胞，于96孔板中每孔加入含10 µL 5 mg/mL MTT的无血清无酚红培养液100 µL，继续孵育4 h，弃去上清，每孔加入100 µL DMSO，振荡摇匀20 min，溶解后使用酶标仪检测570 nm处的OD值。相对粘附率（%）=用药组OD值/空白对照组OD值×100%。

如图9所示，目标药物在浓度30 μg/mL范围内，随着浓度的增加，对结肠癌细胞HT-29与Fn粘附的抑制率逐渐增大。因此，目标药物可以阻断细胞外基质与癌细胞表面整合素的结合和粘附。

实施例6荧光显微镜拍照法考察目标药物对结肠癌细胞HT-29与HUVECs粘附的影响

方法：取医院健康产妇分娩后新生婴儿的脐带，迅速放于生物安全柜内，无菌条件下将其放入提前装有预热的PBS培养皿中；找出脐静脉用预热的PBS冲洗3次以上，后灌入预热好的0.1wt％Ⅱ型胶原酶溶液，后将其浸于事先温好的双蒸水的无菌烧杯中，消化20-30min，使胶原酶溶液缓慢流入装有含10wt%标准胎牛血清的20 mL M-199培养基的50 mL离心管里；离心，弃上清，加入 M-199培养基并转移至细胞培养瓶，置于37 ℃、5 % CO₂（V/V）的培养箱中培养；培养4-5 h后换液处理，洗去未贴壁细胞；待细胞生长融合成单层细胞后，弃去培养液，用PBS冲洗2-3次，用胰酶消化后传代培养。选取处于对数生长期且状态良好的人脐静脉内皮细胞，经胰蛋白酶消化后，配成细胞悬液。于每孔500 µL接种到24孔板，置于37℃，5 % CO₂（V/V）培养箱中培养，使其生长到覆盖率达到80%-90%以上时，去除旧的培养基，用无菌PBS溶液洗涤一次，再于每孔中加入500 µL含刺激因子IL-1β浓度为1 ng/mL的培养基，以增加其粘附癌细胞的能力，另设空白对照组，培养箱中继续孵育4 h，以激活内皮细胞；在这期间将结肠癌细胞HT-29用胰酶溶液消化后，配成细胞悬液。1000 rpm离心5min，吸弃上清液，取1 mL PBS溶液吹打均匀，避光条件下加入10 µL罗丹明-123溶液充分混匀，室温避光染色15 min；1000 rpm 离心5 min，弃去上清后，用PBS洗涤细胞两次，取1 mL无酚红RPMI 1640培养基将细胞沉淀吹打均匀，计数，并稀释为细胞密度为3×10⁶ 个/mL；目标药物用无酚红RPMI 1640培养基分别稀释为1、10、30 μg/mL，去掉旧培养基，于24孔板内每孔分别加入450 µL含目标药物的培养基和50 µL已稀释好的HT-29细胞悬液，设置空白对照组，培养箱内继续孵育1 h，整个过程避光操作；缓慢吸弃含药培养基，用PBS轻柔漂洗细胞2次以去除未粘附的细胞，于每孔中加入500 µL无酚红的RPMI 1640培养基，使用荧光倒置显微镜10倍镜拍照。每孔选取10个视野，统计平均粘附细胞数，按下述公式计算相对粘附率。

如图10所示，与对照组荧光图相比，在30 μg/mL浓度范围之内，粘附在HUVECs上的HT-29细胞数目随着浓度增加逐渐减少，呈现剂量依赖性降低。随着目标药物浓度的增加，相对粘附率逐渐降低，浓度越大，相对粘附率越小。因此，目标药物可以显著抑制肿瘤细胞与HUVECs的粘附。

实施例7细胞划痕实验检测目标药物对结肠癌细胞HT-29迁移能力的影响

方法：于超净工作台内用记号笔在24孔板背后，均匀地划三道横线。胰蛋白酶消化细胞制得细胞悬液，每孔中加入1 mL含3×10⁵个细胞的细胞悬液，在条件为37 ℃、5 % CO₂（V/V）的培养箱中培养过夜；用20μL枪头垂直于24孔板背后的横线划痕； PBS轻柔漂洗3次，除去划下的细胞，目标药物与含2wt

%胎牛的无血清培养基混合使之终浓度分别为1、10、30 μg/mL，每孔分别加入1mL，每个浓度重复三个孔，后在同样条件下放于培养中培养24 h，停止培养； 0 h与24 h时，分别于荧光倒置显微镜明场下观察24孔板每个孔并拍照，每孔至少拍3个视野，药物作用24h后，加药细胞组的迁移距离与空白对照组的迁移距离作比较。

如图11所示，细胞划痕实验证明不同浓度的目标药物作用24 h后，随着药物浓度的增加，相对于空白组细胞迁移的距离逐渐减小。在浓度为30 μg/mL范围之内，随着浓度的逐渐增加，目标药物加药组的迁移率相对于空白组（0 μg/mL）逐渐减小，且呈现剂量依赖性。因此，目标药物可以显著阻止结肠癌细胞HT-29的迁移。

实施例8 Transwell实验检测目标药物对结肠癌细胞HT-29侵袭能力的影响

方法：基质胶准备：将冻存于-80℃冰箱的BD matrigel 4℃过夜，变成液态；取200μL无血清培养基，在4℃条件下，加入50μL matrigel，混匀，各个上室加入50μL（4个室）；培养箱中（37℃、5 % CO₂（V/V））培养4-5 h，取出小室，吸出培养基，倒置风干；在下室（即24孔板底部）加入含20%胎牛血清的培养基，750 μL/孔；消化长势良好的HT-29细胞，用无血清培养基洗3次，计数，配成细胞悬液浓度为1.5×10⁵个/mL，离心后，用0.1wt% BSA的无血清无酚红培养基悬浮，小室加入含相应药物浓度的200 μL细胞悬浮液；相同条件下培养箱中培养24 h；取出Tanswell小室，弃去孔中培养液，用PBS洗2遍，甲醇固定20 min；弃去甲醇，将小室适当风干，室温条件下，用0.1%结晶紫染色30 min，后用PBS清洗2遍，用湿棉签轻轻擦掉小室上表面细胞；显微镜下取随机取5个视野计数，计算侵袭过去的细胞个数。

如图12所示，Transwell侵袭实验证明浓度在30 μg/mL范围之内，随着浓度的增加，目标药物加药组穿过小室matrigel基质胶的细胞个数逐渐减少，呈现剂量依赖性。空白组（0 μg/mL）穿过的细胞个数为106个，当浓度为1、10、30 μg/mL时，穿过的细胞个数分别为86、58和28个。因此，目标药物可以显著降低结肠癌细胞HT-29的侵袭能力。

实施例9动物模型检测目标药物对体内肿瘤转移的作用

方法：取6-8周健康雌性C57BL/6小鼠，平均重量每只计20 g，随机分成2组，每组6只小鼠，标记为空白组与加药组；加药组灌胃剂量为100 mg/kg，灌胃溶剂为羧甲基纤维素钠（CMCNa），连续灌胃给药四天，相同条件下空白组灌胃等体积CMCNa；用胰蛋白酶消化B16-F10细胞，每只小鼠分别尾静脉注射B16-F10细胞5×10⁴个；加药组与空白组的小鼠在同样的条件下正常饲养，并每天按照加药组剂量100 mg/kg进行灌胃给药，连续给药31天，相同条件下空白组灌胃等体积CMCNa；处死小鼠，解剖观察B16-F10黑色素瘤在小鼠肺部转移情况，记录肺组织的重量和转移结节数，并对转移的组织做切片观察。

实验结果如图13所示，可见肺部转移的黑色素瘤的瘤体积和结节数目相对于空白对照组明显减少。肺组织形态学可以观察到加药组的形态学没有构成明显的微转移灶，瘤组织较松散；而空白组形成了明显的微转移灶，瘤组织较密集，相对于空白组而言加药组瘤组织显示了显著的瘤细胞坏死和凋亡。加药组肿瘤转移后的肺部重量相对于空白对照组减少，空白组肺平均重量为0.25 g，加药组肺平均重量仅为0.18 g，与空白组相比具有极显著性差异（p＜0.01）；而肺部肿瘤转移的结节数相对于空白组也明显减少，空白组肺部肿瘤转移的平均结节数目为3个，而加药组部肿瘤转移的平均结节数为2个。因此目标药物可以显著抑制小鼠体内黑色素瘤的转移。

综上所述，本发明的六甲氧基二氢黄酮-鼠李糖基-鼠李糖苷在低毒浓度下具有以下优点：1.明显的抗肿瘤细胞与基质成分Fn（粘连蛋白）的粘附及其与内皮细胞HUVECs粘附；2.明显的抗肿瘤细胞迁移与侵袭能力；3.促进肿瘤细胞凋亡。因此，六甲氧基二氢黄酮-鼠李糖基-鼠李糖苷可以作为肿瘤转移预防的药物，为开发利用天然植物资源提供了科学依据。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (3)

1.六甲氧基二氢黄酮-鼠李糖基-鼠李糖苷的提取方法，其特征在于：

包括如下步骤：

(1)取干燥的九里香药材4.2 Kg粉碎，在5 L 75%的乙醇中加热回流提取3次，每次3小时，过滤，合并滤液；

(2)将（1）中得到的滤液减压浓缩，得到糖浆状总浸膏，总浸膏用水超声悬浮，悬浮液用二氯甲烷萃取，萃取体积比例为1:1，萃取4次，减压浓缩溶剂部分得九里香粗提物；

（3）粗提取物于硅胶柱上以乙酸乙酯-石油醚进行梯度层析分离，收集乙酸乙酯洗脱部分，旋转蒸发除去溶剂，得到九里香黄酮组分，其收率为0.05-0.1%；

（4）采用半制备高效液相色谱将（3）中组分进行分离，得到九里香黄酮糖苷单体提取物；经鉴别，结构为：六甲氧基二氢黄酮-鼠李糖基-鼠李糖苷；

化学结构式如下：

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2.根据权利要求1所述的六甲氧基二氢黄酮-鼠李糖基-鼠李糖苷的提取方法，其特征在于：步骤（4）中的制备液相分离条件为，色谱柱：Agela Venusil XBP C18；流速：1-4 mL /min；柱温：35℃；检测荧光激发波长352 nm、发射波长458nm；流动相为甲醇和纯水混合液，甲醇和纯水的体积比例9:11，等度洗脱。

3.一种如权利要求1所述制备方法制得的六甲氧基二氢黄酮-鼠李糖基-鼠李糖苷在制备肿瘤转移预防药物上的应用。