CN1846695A

CN1846695A - 3，5，7，3'，4'，5'－六羟基－2，3－二氢黄酮在制药中的应用

Info

Publication number: CN1846695A
Application number: CNA2006100337754A
Authority: CN
Inventors: 朱邦豪; 刘德育
Original assignee: Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen University
Priority date: 2006-02-21
Filing date: 2006-02-21
Publication date: 2006-10-18

Abstract

本发明涉及3，5，7，3’，4’，5’－六羟基－2，3－二氢黄酮在制药中的新用途，即该物质在制备糖化终产物抑制剂、抗氧化剂和二酰基甘油蛋白激酶C抑制剂药物中的应用。

Description

3，5，7，3’，4’，5’-六羟基-2，3-二氢黄酮在制药中的应用

技术领域

本发明涉及3，5，7，3’，4’，5’-六羟基-2，3-二氢黄酮(以下简称：ZL2004)在制药中的应用，尤其涉及在制备糖化终产物抑制剂、抗氧化剂和二酰基甘油蛋白激酶C抑制剂药物中的应用。

背景技术

ZL2004化学结构式为：

分子式为C₁₅H₁₂O₈，微黄色粉末或白色针状结晶，相对分子质量为320.2，mp 246-247℃，易溶于热水、热乙醇，溶于甲醇、乙醇、丙酮，微溶于水、乙酸乙酯，难溶于氯仿、石油醚。

该化合物首次由Kotake和Kubota于1940年从葡萄科蛇葡萄属植物福建茶即楝叶玉葡萄(A.Meliaefolia)的叶中分离到，命名为福建茶素(ampeloptin)[Ann，1940，544：253]，后又有命名二氢杨梅黄素(dihydromyricetin)及蛇葡萄素(ampelopsin)[The Merck Index，12ed，1996，97]。该化合物广泛存在于松柏类植物和木材中，如松属(pinus)和雪松属(cedrus)树皮中，也存在于木本被子植物，如杜娟花科植物砂杜娟(Rhodendroncinnabariunm)叶、连香树科植物连香树(Cercidiphyllumjaponicus)木材中。该植物存在于杨梅科、杜娟科、藤黄科、大戟科等植物中，具抗癌、利胆和抗炎作用。从目前研究情况表明，该化合物大量存在于葡萄科植物中，如显齿蛇葡萄(Agrossedentata)、粤蛇葡萄(Cantoniensis)、羽叶蛇葡萄(Achaffanjoni)、蛇葡萄(Asinica)、东北蛇葡萄(Abrevipedunculate)、光叶蛇葡萄(Asinicavarhancei)等，尤其是在蛇葡萄属植物中更是大量存在，如广泛分布于我国的广东、广西、云南、湖南、湖北、江西等省区的显齿蛇葡萄和粤蛇葡萄植物的幼嫩茎叶中含量达20％～30％。粤蛇葡萄(《中药大词典》称无莿根)和显齿蛇葡萄(又称藤茶，为粤蛇葡萄的变种)这两种植物的干制品历来是民间作清凉解毒的代茶饮品，具有清热解毒、祛风除湿、散瘀破结、利尿、消炎等功效，治肺痈、风湿、痈症肿痛、跌打、烫伤、慢性肾炎、肝炎、小便涩痛、胃热呕吐、感冒、咽喉肿痛等。

据报道，ZL2004具有抗癌作用、防治艾滋病作用及抗病毒作用。

发明内容

本发明的目的在于提供ZL2004在制备糖化终产物抑制剂、抗氧化剂和二酰基甘油蛋白激酶C抑制剂药物的应用。

为了更好的理解本发明的实质，采用ZL2004的药理实验及结果来说明其在制药领域中的新用途。

本发明以维生素C作阳性对照，来比较ZL2004对氧自由基的清除作用及对大鼠脑组织中丙二醛(MDA)的清除作用，结果表明效果均优于阳性对照药维生素C。

抑制糖化终产物(AGEs)形成的作用试验：通过体外糖化终产物AGEs形成的模型，根据AGEs形成的速度来评价抑制AGEs形成的作用。结果表明：ZL2004具有明显的预防体外非酶糖基化终产物形成的作用，效果优于阳性对照药氨基胍(AG)。

对PKC的抑制作用试验为，PepTag^C1肽是带有特异荧光的一种短肽，组织中PKC可使其磷酸化，磷酸化的底物肽带有负电荷，非磷酸化的底物带有正电荷，在琼脂糖凝胶上表现为向两极电泳。如果正极方向上荧光弱，表明磷酸化底物少，即PKC被抑制，半定量试验表明，ZL2004对正常大鼠脑组织PKC的抑制作用接近阳性对照药Staurospoine。

小白鼠的急性毒性实验为：取昆明小白鼠，按常规药理学试验方法试验，结果表明ZL2004毒性属低毒～无毒级，腹腔给药无毒剂量达到1000mg/kg小鼠。

从以上的结果可说明本发明的优点在于：

(1)本发明对已知的化合物ZL2004发掘了新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域。

(2)本发明的ZL2004原料来源丰富，可做成口服剂型、注射剂型、片剂等，使用方便。

(3)由于本发明的物质配制成的药物具有显著抑制糖化终产物形成的作用，因此可用于治疗糖尿病、抗衰老、动脉粥样硬化。

(4)由于本发明的物质配制成的药物具有显著抑制蛋白激酶C磷酸化的作用，因此可用于治疗糖尿病、抗癌、抗中枢神经系统疾病(脊髓神经痛等)。

(5)由于本发明的物质配制成的药物具有显著地清除自由基、抑制丙二醛(MDA)生成的作用，因此可用于治疗糖尿病、抗癌、抗衰老、动脉粥样硬化、抗炎、抗高血压高胆固醇、抗中枢神经系统疾病(帕金森氏病等)。

将ZL2004采用药学上可接受的辅料按常规生产方法制备成药剂学上所说的任何剂型包括口服剂型如片剂、冲剂、胶囊、口服液等，也可制备成注射剂型，如注射用粉针剂、注射剂等；也可以制成靶向制剂，如脂质体等。

本发明的药物剂型中含有重量比为1-99％的ZL2004。

本发明的药物的用量可根据用药途径、患者的年龄、体重、肿瘤类型而改变。其剂量可以是0.5-1g，可以皮下或肌肉注射，或静脉内注射或滴注，也可以口服用药。

附图说明

图1为ZL2004对羟基和超氧离子的清除作用结果图。说明在两种不同的产生羟基和超氧离子的体系中观察ZL2004的清除作用。纵坐标表示清除率，横坐标表示浓度。数据来自六次试验的平均值和标准误。

图2为ZL2004及维生素C对大鼠脑组织中丙二醛(MDA)的抑制结果图。

图3为ZL2004、氨基胍抑制AGEs形成的速度图。

图4为ZL2004对PKC的抑制作用试验的电泳结果图。其中control：PKC实验对照，Hom：SD大鼠脑组织匀浆(胞浆部分蛋白激酶C)，Stau：PKC抑制剂Staurospoine，Negative：阴性对照。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，这些实施例是对本发明的应用的进一步说明，绝非构成对本发明的限制。

实施例1从粤蛇葡萄中提取ZL2004。

取葡萄科蛇葡萄属植物粤蛇葡萄的干燥全株或嫩叶或根，原料药经粉碎后，先用10倍体积量的95％酒精浸泡过夜，滤过。药渣再用8倍体积量的95％酒精回流提取3次。滤过。合并滤液。回收酒精至有固体析出，加入适量水，加热使固体溶解。乘热加入溶液总量1％-2％的粉末活性炭，煮沸10分钟，乘热过滤。滤液再如上法经静置、析晶、水溶解、活性碳除杂质及重结晶，共3次。最后收集结晶，真空40℃干燥后，得微黄色粉末或白色针状结晶。

取上述提取的ZL2004 100克，溶解于适量2％的吐温-80中，再加入适量甘露醇，经冻干，制成皮下或肌注注射用粉针剂。

实施例2从显齿蛇葡萄中提取ZL2004，并制成片剂。

取显齿蛇葡萄的干燥的全株或嫩叶或根，原料药经粉碎后，先用8倍体积量的药用酒精(50％)浸泡过夜，滤过。药渣再用8倍体积量的50％酒精回流提取3次。滤过。合并滤液。回收酒精至有固体析出，加入适量水，加热使固体溶解。乘热加入溶液总量2％-4％的粉末活性炭，煮沸10分钟，趁热过滤。滤液再如上法经静置、析晶、水溶解、活性碳除杂质及重结晶，共4次。最后收集结晶，真空40℃干燥后，得微黄色粉末或白色针状结晶。

取上述提取的ZL2004，加淀粉制粒，加滑石粉、硬脂酸镁压片，制成ZL2004片剂。

实施例3将实施例2中的显齿蛇葡萄，换成小叶蛇葡萄，其提取方法同实施例2。取上述提取的ZL2004，用含适量乙醇20％的丙二醇溶解，再加入甘露醇，制成ZL2004供静脉注射用粉针剂。

实施例4将实施例1中的粤蛇葡萄换成蛇葡萄，其提取方法同实施例1，按常规方法制成胶囊。

实施例5将实施例1中的粤蛇葡萄换成光叶蛇葡萄，回流提取的酒精浓度换为50％，其提取工艺同实施例1，按常规方法制成口服液。

实施例6ZL2004抗氧化作用试验

实施例6、7、8的ZL2004采用该化合物的标准品，制备成1mg/ml的水溶液。

1、对氧自由基的清除作用

·OH清除剂可以抑制邻二氮菲-Fe²⁺氧化体系中A₅₃₆的降低，并可通过A₅₃₆值比较·OH清除剂的清除能力。在实验条件下，观察A₅₃₆值变化，反应·OH氧化作用及ZL2004对·OH的清除效率。结果表明，ZL2004可浓度依赖性地清除·OH(图1)，ED₅₀为29.4μM。同样，ZL2004对O₂ ^·-也具有一定的清除能力(图1)。O₂ ^·-清除剂可抑制邻苯三酚自氧化过程，使体系的A322特征吸收峰减弱。ZL2004清除O₂ ^·-的ED₅₀为88.9μM。150μM VitC对·OH的清除率43.07±4.11％，低于40μM的ZL2004(59.09±4.97％，p＜0.01)；对O₂ ^·-的清除率为30.53±3.03％，低于80μM的ZL2004(48.96±6.21％，p＜0.01)。

2、ZL2004对丙二醛(MDA)的清除作用。

1、匀浆制备：取组织块(0.2-1g)在冰冷的生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸试干，称重，放入5或10毫升的小烧杯中。匀浆介质的体积总量应该是组织块重量的9倍，移液器取总量2/3的匀浆介质或生理盐水于烧杯中，用眼科剪尽快剪碎组织块(冰上操作)。

2、实验方法：先将药物与匀浆放入37℃温育1h，药物的终浓度均为1mg/ml，按照试剂盒说明加样，将样品用漩涡混匀器混匀，试管口用保险膜扎紧，95℃水浴80分钟，取出后流水冷却，然后3500-4000转/分，离心10分钟，取上清，532nm处，1cm光径，蒸馏水调零，测定各管吸光度值。

从图2可见ZL2004(1mg/ml)对大鼠脑组织中MDA具有抑制作用，且效果由于阳性对照药维生素C(1mg/ml)(物质B、Q系阳性对照物与本专利申请无关)。

实施例7ZL2004抑制糖化终产物(AGEs)形成的作用。

1.试剂和药物：牛血清白蛋白(Bovine albumin serumV，BSA)Amresco分装，葡萄糖(Glucose，GLU)，sigma公司，氨基胍(AminoguanidineHydrochloride，AG，lot：219-956-7，Sigma)。

2.实验方法及步骤：称取0.991g葡萄糖及0.1g BSA，加入ZL2004(1mg/ml)及氨基胍盐酸盐(1mg/ml)，溶解于PBS中，定容至10ml，同时设有GLU+BSA，0.22μm滤膜过滤除菌。放入37℃培养箱中温育。分别于温育第0、7、14、28d测定荧光值，每组每次从温育管中取出1ml测定。以激发波长370nm，发射波长440nm，测定荧光值。根据每次所测荧光值减去第一次基础荧光值所得的值对时间作图，以此来评价药物对体外蛋白非酶糖基化的影响。抑制AGEs形成的作用根据AGEs形成的速度来评价，即用AGEs相关荧光值的单位时间变化速度来表示。

3.实验结果：通过体外AGEs形成的模型，根据AGEs形成的速度来评价抑制AGEs形成的作用。即用AGEs相关荧光值的单位变化速度，结果见图3，来表示。从AGEs荧光值的单位时间变化率可以看出：ZL2004(1mg/ml)具有明显的预防体外非酶糖基化终产物形成的作用，效果优于阳性对照药氨基胍(AG，1mg/ml)。.

实施例8 ZL2004对二酰基甘油蛋白激酶C(PKC)的抑制作用。

1、试剂：由PKC检测试剂盒(Promega公司)提供，Staurosporine，Sigma公司。

2、蛋白激酶C半纯化：取200g左右SD大鼠，断头处死，取出脑组织，用PKC抽提液(4℃)洗涤，滤纸擦干，1g脑组织加入5ml抽提液，电动匀浆机匀浆(15秒×5次)，匀浆105000×g离心1h分离可溶性和结合性酶，上清为胞浆部分蛋白激酶C。

3、试验方法：将反应体系PKC Reaction 5×Buffer(5μl)，C1Peptide(0.4g/μl)(5μl)，PKC Activator 5×Solution(5μl)，PeptideProtection Solution(可选)(1μl)放入37℃温育箱中反应2min。加入药物与匀浆及PKC(control)37℃温育30min，95℃水育10min终止反应。将样品放入4℃冰箱，注意避光。将样品与1μl 80％甘油混合，0.8％琼脂糖凝胶电泳100V 15分钟。见条带清晰分离后，将凝胶放到凝胶成像系统UV灯下，可见清晰条带。用手术刀将胶切下，尽量使其体积接近250μl，将其放入一个1.5ml带有刻度的离心管中，95℃加热至胶溶解。若胶的体积不够250μl，用水补足。取125μl热琼脂糖，与75μl胶溶解液(已预热至室温，并被充分混匀)和50μl冰醋酸混合，迅速混匀。取250μl置于96孔板中。570nm读取吸收率。空白组为液体琼脂糖。

4.实验步骤：

(1)将PKC标准品用PKC稀释液稀释至2.5μg/ml。

(2)将PKC Activator 5×Solution超声20-30秒或至液体变暖。

(3)按照以下比例在0.5mL离心管内混合试剂及样品，在加样之前，保持操作在冰上进行。

阳性对照

PKC Reaction 5×Buffer 5μl

C1 Peptide(0.4g/μl) 5μl

PKC Activator 5×Solution(超声后) 5μl

Peptide Protection Solution(可选) 1μl

PKC(2.5μg/ml) 4μl

加去离子水至 25μl

样品对照

PKC Reaction 5×Buffer 5μl

C1 Peptide(0.4g/μl) 5μl

PKC Activator 5×Solution(超声后) 5μl

Peptide Protection Solution(可选) 1μl

匀浆 4μl

加去离子水至 25μl

阴性对照

PKC Reaction 5×Buffer 5μl

C1 Peptide(0.4 g/μl) 5μl

PKC Activator 5×Solution(超声后) 5μl

Peptide Protection Solution(可选) 1μl

加去离子水至 25μl

Standerd PKC assay

PKC Reaction 5×Buffer 5μl

C1 Peptide(0.4g/μl) 5μl

PKC Activator 5×Solution(超声后) 5μl

Peptide Protection Solution(可选) 1μl

ZL2004 (Staurospoine) 4μl

加去离子水至 25μl

(ZL2004浓度为1mg/ml，Staurospoine浓度为1×10^-5mol/l)

将反应体系放入37℃温育箱中反应2min。加入药物与匀浆及PKC(control)37℃温育30min，95℃水育10min终止反应。将样品放入4℃冰箱，注意避光。将样品与1μl 80％甘油混合，0.8％琼脂糖凝胶电泳100V 15分钟。见条带清晰分离后，将凝胶放到凝胶成像系统UV灯下，可见清晰条带。用手术刀将胶切下，尽量使其体积接近250μl，将其放入一个1.5ml带有刻度的离心管中，95℃加热至胶溶解。若胶的体积不够250μl，用水补足。取125μl热琼脂糖，与75μl胶溶解液(已预热至室温，并被充分混匀)和50μl冰醋酸混合，迅速混匀。取250μl置于96孔板中。570nm读取吸收率。空白组为液体琼脂糖。

5.试验结果：

PepTag^C1肽是带有特异荧光的一种短肽，组织中PKC可使其磷酸化，磷酸化的底物肽带有负电荷，非磷酸化的底物带有正电荷，在琼脂糖凝胶上表现为向两极电泳。如果正极方向上荧光弱，表明磷酸化底物少，即PKC被抑制，从图4可见ZL2004(1mg/ml)对正常大鼠脑组织PKC的抑制作用接近阳性对照药Staurospoine(1×10^-5mol/l)。此为半定量实验。

Claims

1、3，5，7，3’，4’，5’-六羟基-2，3-二氢黄酮在制备糖化终产物抑制剂药物中的应用。

2、根据权利要求1所述的3，5，7，3’，4’，5’-六羟基-2，3-二氢黄酮在制备糖化终产物抑制剂药物中的应用，其特征在于采用药学上可接受的辅料制备成的注射剂。

3、根据权利要求1所述的3，5，7，3’，4’，5’-六羟基-2，3-二氢黄酮在制备糖化终产物抑制剂药物中的应用，其特征在于采用药学上可接受的辅料制备成的口服剂型。

4、3，5，7，3’，4’，5’-六羟基-2，3-二氢黄酮在制备抗氧化剂药物中的应用。

5、根据权利要求4所述的3，5，7，3’，4’，5’-六羟基-2，3-二氢黄酮在制备糖化终产物抑制剂药物中的应用，其特征在于采用药学上可接受的辅料制备成的注射剂。

6、根据权利要求4所述的3，5，7，3’，4’，5’-六羟基-2，3-二氢黄酮在制备糖化终产物抑制剂药物中的应用，其特征在于采用药学上可接受的辅料制备成的口服剂型。

7、3，5，7，3’，4’，5’-六羟基-2，3-二氢黄酮在制备二酰基甘油蛋白激酶C抑制剂药物中的应用。

8、根据权利要求7所述的3，5，7，3’，4’，5’-六羟基-2，3-二氢黄酮在制备糖化终产物抑制剂药物中的应用，其特征在于采用药学上可接受的辅料制备成的注射剂。

9、根据权利要求7所述的3，5，7，3’，4’，5’-六羟基-2，3-二氢黄酮在制备糖化终产物抑制剂药物中的应用，其特征在于采用药学上可接受的辅料制备成的口服剂型。

10、根据权利要求7所述的3，5，7，3’，4’，5’-六羟基-2，3-二氢黄酮在制备糖化终产物抑制剂药物中的应用，其特征在于采用药学上可接受的辅料制备成的靶向制剂。