BRPI0502582B1

BRPI0502582B1 - Molécula de ácido nucleico isolado compreendendo pelo menos uma sequência de junção de nucleotídeos do evento de milho mir604, amplicon, par de iniciadores de polinucleotídeos, método de detecção da sequência de dna em uma amostra e kit para detecção de a presença de dna do evento de milho mir604 em uma amostra biológica, bem como métodos de detecção da sequência de dna em uma amostra, de detecção da presença de dna que corresponde ao evento mir604, de detecção da presença de dna do evento de milho mir604 em uma amostra biológica e para produção de uma planta de milho resistente a pelo menos lagarta da raiz do milho

Info

Publication number: BRPI0502582B1
Application number: BRPI0502582-6A
Authority: BR
Inventors: Henry-York Steiner; Eric Chen; Moez Meghji
Original assignee: Syngenta Participations Ag
Priority date: 2004-03-25
Filing date: 2005-03-28
Publication date: 2024-01-16
Also published as: PT2281447T; EP1737290B1; RU2351122C2; NZ549466A; EP2289311A3; AR089141A2; US8354519B2; AU2005235963B2; ES2568896T3; EP2289311A2; EP2281447A2; CA2559481C; US20120185973A1; US8884102B2; JP2007530036A; US7897748B2; ES2596317T3; KR20130025447A; KR101268897B1; US20050216970A1

Abstract

"milho transgênico designado mir604". é revelado um novo evento de milho transgênico designado mir604. a invenção se relaciona a seqüências de dna das construções recombinantes inseridas no genoma do milho e de seqüências genômicas que flanqueiam o sítio de inserção que resultou no evento mir604. a invenção também se relaciona a ensaios para detecção da presença das seqüências de dna de mir604, a plantas de milho e sementes de milho que compreendem o genótipo de mir604 e a métodos para produção da planta de milho por cruzamento da planta de milho que compreende o genótipo mir604 com si própria ou com uma outra variedade de milho.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção está relacionada, de forma geral, ao campo da biologia molecular de plantas, transformação de plantas, e reprodução de plantas. Mais especificamente, a invenção se relaciona a plantas de milho transgênicas resistentes a insetos que compreendem um novo genótipo transgênico e a métodos de detecção da presença do DNA da planta de milho em uma amostra e composições da mesma.

FUNDAMENTO

[0002] Pragas de inseto são um fator importante na perda das safras agrícolas mundiais mais importantes. Cerca de 8 bilhões de dólares são perdidos a cada ano apenas nos Estados Unidos pelas infestações de pragas de não mamíferos que incluem insetos. Espécies de lagarta da raiz (rootworm) do milho são consideradas as mais destrutivas pragas de milho. Espécies importantes de pragas de lagarta da raiz incluem Diabrotica virgifera virgifera, a lagarta da raiz do milho do oeste; D. longicornis barberi, a lagarta da raiz do milho do norte, D. undecimpunctata howardi, a lagarta da raiz do milho do sul, e D. virgifera zeae, a lagarta da raiz do milho do México.

[0003] A lagarta da raiz do milho é controlada principalmente por aplicações intensivas de pesticidas químicos. Assim, um bom controle de lagarta da raiz do milho pode ser atingido, porém esses produtos químicos podem também, algumas vezes, afetar organismos benéficos. Um outro problema que resulta do uso amplo de pesticidas químicos é o surgimento de variedades de insetos resistentes. Isso tem sido parcialmente aliviado por várias práticas de controle de resistência, porém há uma necessidade crescente por estratégias alternativas de controle de pragas. Uma alternativa inclui a expressão de genes estranhos que codificam proteínas inseticidas em plantas transgênicas. Essa abordagem provê um meio eficiente de proteção contra pragas de insetos selecionadas, e plantas transgênicas que expressam toxinas inseticidas têm sido comercializadas, permitindo que os plantadores reduzam as aplicações de inseticidas químicos.

[0004] A expressão de genes estranhos em plantas pode ser influenciada por sua posição cromossômica, talvez pela estrutura da cromatina ou pela proximidade de elementos de regulação de transcrição próximos ao sítio de integração (veja por exemplo, Weising e cols., 1988, “Foreign Genes in plants.” Ann. Rev. Genet. 22:421-477). Portanto, é comum produzir centenas de diferentes eventos e escolher dentre esses eventos um único evento que tenha níveis de expressão desejados de transgene e padrões para objetivos comerciais. Um evento que tem níveis desejados ou padrões de expressão de transgene é útil para introduzir o transgene em outros fundamentos genéticos por cruzamento sexual usando métodos convencionais de reprodução. A prole de tais cruzamentos mantém as características da expressão de transgene do transformante original. Essa estratégia é usada para assegurar expressão confiável de gene em inúmeras variedades que são bem adaptadas às condições locais de crescimento.

[0005] Seria vantajosa a detecção da presença de um evento particular a fim de determinar se a prole de um cruzamento sexual contém um transgene de interesse. Adicionalmente, um método para detecção de um evento particular seria útil para cumprir regulamentos que requerem a aprovação pré-mercado e rotulagem de alimentos derivados de plantas de safras recombinantes, por exemplo. É possível detectar a presença de um transgene por qualquer método de detecção de ácido nucleico bem conhecido incluindo, mas não limitados a amplificação térmica (reação em cadeia de polimerase (PCR)) usando iniciadores de polinucleotídeo ou hibridização de DNA com o uso de sondas de ácido nucleico. Tipicamente, com a finalidade de simplificar a uniformidade dos reagentes e metodologias para uso na detecção de uma construção de DNA particular que foi usada para transformação de inúmeras variedades de plantas, esses métodos de detecção geralmente focalizam elementos genéticos frequentemente usados, por exemplo, promotores, terminadores, e genes marcadores, porque para várias construções de DNA, a região de sequência codificadora é intercambiável. Como um resultado, tais métodos podem não ser úteis para discriminação entre construções que diferem apenas com referência à sequência codificadora. Além disso, tais métodos podem não ser úteis para discriminação entre diferentes eventos, particularmente aqueles produzidos usando a mesma construção de DNA a menos que a sequência de DNA cromossômico adjacente ao DNA heterólogo inserido (“DNA de flanqueamento”) seja desconhecida.

[0006] A presente invenção inclui um evento de milho transgênicoresistente a insetos que tem um gene cry3A055 incorporado em seu genoma, revelado na Publicação Internacional No. WO 03/018810, publicada em 6 de março de 2003, que está aqui incorporada por referência, que codifica uma toxina inseticida Cry3A055, útil no controle de pragas de insetos por Diabrotica spp. O evento de milho transgênico também incorporou um gene pmi em seu genoma, que codifica uma enzima fosfomanose isomerase (PMI), revelada na Patente US No. 5.767.378, que está aqui incorporada por referência, útil como um marcador selecionável, que permite que a planta utilize manose como uma fonte de carbono. A presente invenção também inclui novas sequências de ácido nucleico isoladas que são únicas para o evento de milho transgênico, úteis para identificação do evento de milho transgênico e para detecção de ácidos nucleicos do evento de milho transgênico em uma amostra biológica, assim como kits que compreendem os reagentes necessários para uso na detecção desses ácidos nucleicos em uma amostra biológica.

SUMÁRIO

[0007] A presente invenção é dirigida a um evento de milho transgênico, designado MIR604, que compreende um novo genótipo transgênico que compreende um gene cry3A055 e um gene pmi que confere resistência a insetos e a capacidade de utilizar manose como uma fonte de carbono, respectivamente, para o evento de milho MIR604 e prole desse. A invenção também fornece plantas de milho transgênicas que compreendem o genótipo da invenção, sementes das plantas de milho transgênicas que compreendem o genótipo da invenção, e métodos para produção de uma planta de milho transgênico que compreende o genótipo da invenção por cruzamento de uma linhagem de milho que compreende o genótipo da invenção com si próprio ou com uma outra linhagem de milho de um genótipo diferente. As plantas de milho transgênicas da invenção podem ter essencialmente todas as características morfológicas e fisiológicas da planta de milho correspondente não transgênica isogênica em adição àquelas conferidas na planta de milho pelo novo genótipo da invenção. A presente invenção também fornece composições e métodos para detecção da presença de ácidos nucleicos do evento MIR604 baseado na sequência de DNA dos cassetes de expressão recombinantes inseridos no genoma de milho que resultou no evento MIR604 e das sequências genômicas que flanqueiam o sítio de inserção. O evento MIR604 também pode ser caracterizado por análise dos níveis de expressão de Cry3A055 e proteína PMI assim como por teste da eficácia contra lagarta da raiz do milho.

[0008] De acordo com um aspecto, a presente invenção fornece uma molécula de ácido nucleico isolado que compreende pelo menos 10 nucleotídeos contíguos de uma sequência de DNA heterólogo inserida no genoma da planta de milho do evento de milho MIR604 e pelo menos 10 nucleotídeos contíguos de um DNA do genoma da planta de milho que flanqueia o ponto de inserção da sequência de DNA heterólogo inserida no genoma da planta de milho do evento de milho MIR604. A molécula de ácido nucleico isolada de acordo com esse aspecto pode compreender pelo menos 20 ou pelo menos 50 nucleotídeos contíguos da sequência de DNA heterólogo inserida no genoma da planta de milho do evento de milho MIR604 e pelo menos 20 ou pelo menos 50 nucleotídeos contíguos de um DNA do genoma da planta de milho que flanqueia o ponto de inserção da sequência de DNA heterólogo inserida no genoma da planta de milho do evento de milho MIR604.

[0009] De acordo com um outro aspecto, a presente invenção fornece uma molécula de ácido nucleico isolado que compreende uma sequência de nucleotídeos que compreende pelo menos uma sequência de junção do evento MIR604 selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2, e complementos dessas. Uma sequência de junção transpõe a junção entre o DNA heterólogo que compreende os cassetes de expressão inseridos no genoma do milho e DNA do genoma do milho que flanqueia o sítio de inserção e é diagnóstico para o evento MIR604.

[00010] De acordo com um outro aspecto, a presente invenção fornece um ácido nucleico isolado que liga uma molécula de DNA heterólogo ao genoma da planta de milho no evento de milho MIR604 que compreende a sequência de cerca de 11 a cerca de 20 nucleotídeos contíguos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, e complementos dessas.

[00011] De acordo com um outro aspecto, a presente invenção fornece uma molécula de ácido nucleico isolado que compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, e complementos dessas.

[00012] De acordo com um outro aspecto da invenção, é fornecido um amplicon que compreende a molécula de ácido nucleico da invenção.

[00013] Ainda de acordo com um outro aspecto da invenção, são fornecidos iniciadores de sequência flanqueadora para detecção do evento MIR604. Tais iniciadores de sequência flanqueadora compreendem uma sequência de ácidos nucleicos isolada que compreende pelo menos 10-15 nucleotídeos contíguos dos nucleotídeos 1-801 como apresentada em SEQ ID NO: 3 (aqui designada arbitrariamente como a sequência flanqueadora 5’), ou os complementos dessa. Em uma modalidade desse aspecto os iniciadores de sequência flanqueadora são selecionados do grupo que consiste em SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, e complementos dessas.

[00014] Em um outro aspecto da invenção, os iniciadores de sequências flanqueadoras compreendem uma sequência de ácidos nucleicos isolada que compreende pelo menos 10-15 nucleotídeos contíguos dos nucleotídeos 507-1570 como apresentada em SEQ ID NO: 4 (aqui designada arbitrariamente como a sequência flanqueadora 3’), ou os complementos dessa. Em uma modalidade desse aspecto os iniciadores de sequência flanqueadora são selecionados do grupo que consiste em SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, e complementos dessas.

[00015] De acordo com um outro aspecto da invenção, são fornecidos pares de iniciador que são úteis para amplificação de ácido nucleico, por exemplo. Tais pares de iniciador compreendem um primeiro iniciador que compreende uma sequência de nucleotídeos de pelo menos 10-15 nucleotídeos contíguos em comprimento que é ou está complementar a uma das sequências flanqueadoras genômicas acima descritas (SEQ ID NO: 3, ou SEQ ID NO: 4) e um segundo iniciador que compreende uma sequência de nucleotídeos de pelo menos 10-15 nucleotídeos contíguos de DNA heterólogo inserido no genoma do evento MIR604. O segundo iniciador preferivelmente compreende uma sequência de nucleotídeos que é ou está complementar à sequência de inserção adjacente à sequência de DNA flanqueadora genômica de planta como apresentada em SEQ ID NO: 3 da posição de nucleotídeo 802 até 1310 e em SEQ ID NO: 4 da posição de nucleotídeo 1 até 506.

[00016] De acordo com um outro aspecto da invenção, são fornecidos métodos de detecção da presença de DNA que correspondem ao evento MIR604 em uma amostra biológica. Tais métodos compreendem: (a) contato da amostra que compreende o DNA com um par de iniciadores que, quando usados em uma reação de amplificação de ácido nucleico com DNA genômico do evento de milho MIR604, produz um amplicon que é diagnóstico para o evento MIR604; (b) realização de uma reação de amplificação de ácido nucleico, dessa forma produzindo o amplicon; e (c) detecção do amplicon. Em uma modalidade desse aspecto, o amplicon compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, e SEQ ID NO: 4, e complementos dessas.

[00017] De acordo com um outro aspecto, a invenção fornece métodos de detecção da presença de um DNA que corresponde ao evento MIR604 em uma amostra biológica. Tais métodos compreendem: (a) contato da amostra que compreende o DNA com uma sonda que hibridiza sob condições de alta estringência com DNA genômico do evento de milho MIR604 e não hibridiza sob condições de alta estringência com DNA de uma planta de milho controle; (b) submeter a amostra e sonda a condições de hibridização de alta estringência; e (c) detecção da hibridização da sonda ao DNA.

[00018] De acordo com um outro aspecto da invenção, é fornecido um kit para a detecção de ácidos nucleicos do evento MIR604 em uma amostra biológica. O kit inclui pelo menos uma sequência de DNA que compreende um comprimento suficiente de polinucleotídeos que é ou está complementar a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, ou SEQ ID NO: 4, onde as sequências de DNA são úteis como iniciadores ou sondas que hibridizam ao DNA isolado do evento MIR604, e que, sob amplificação da ou hibridização à sequência de ácidos nucleicos em uma amostra seguida por detecção do amplicon ou hibridização à sequência de alvo, são diagnósticos para a presença de sequências de ácido nucleico do evento MIR604 na amostra. O kit também inclui outros materiais necessários para permitir métodos de hibridização ou amplificação de ácido nucleico.

[00019] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um método de detecção de proteína do evento de milho MIR604 em uma amostra biológica que compreende: (a) a extração da proteína de uma amostra de tecido do evento de milho MIR604; (b) análise da proteína extraída usando um método imunológico que compreende anticorpo específico para a proteína inseticida ou de marcador selecionável produzida pelo evento MIR604; e (c) detecção da ligação do referido anticorpo à proteína inseticida ou marcadora selecionável.

[00020] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece uma amostra biológica derivada de um evento MIR604 de planta, tecido ou semente de milho, onde a amostra compreende uma sequência de nucleotídeos que é ou está complementar à sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2, e onde a sequência é detectável na amostra usando um método de hibridização ou de amplificação de ácido nucleico. Em uma modalidade desse aspecto, a amostra é selecionada do grupo que consiste em farinha de milho, fubá, xarope de milho, óleo de milho, amido de milho, e cereais manufaturados no todo ou em parte para conter subprodutos de milho.

[00021] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um extrato derivado de um evento MIR604 de planta, tecido ou semente de milho que compreende uma sequência de nucleotídeos que é ou está complementar a uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2. Em uma modalidade desse aspecto, a sequência é detectável no extrato usando um método de hibridização ou de amplificação de ácido nucleico. Em uma outra modalidade desse aspecto, a amostra é selecionada do grupo que consiste em farinha de milho, fubá, xarope de milho, óleo de milho, amido de milho, e cereais manufaturados no todo ou em parte para conter subprodutos de milho.

[00022] De acordo com um outro aspecto da invenção, são fornecidas plantas de milho e sementes que compreendem a molécula de ácido nucleicos da invenção.

[00023] De acordo com um outro aspecto, a presente invenção fornece um método para produção de uma planta de milho resistente a pelo menos infestação por lagarta da raiz do milho compreende: (a) cruzamento sexual de uma primeira planta de milho parente com uma segunda planta de milho parente, onde a referida primeira ou segunda planta de milho parente compreendo evento de milho MIR604 DNA, dessa forma produzindo uma pluralidade de proles de planta de primeira geração; (b) seleção de planta de prole de primeira geração que é resistente a pelo menos infestação por lagarta da raiz do milho; (c) autopolinização da planta de prole de primeira geração, dessa forma produzindo uma pluralidade de proles de planta de segunda geração; (d) seleção das proles de planta de segunda geração, uma planta que é pelo menos resistente a infestação por lagarta da raiz do milho; onde as proles de planta de segunda geração compreendem uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2.

[00024] Ainda de acordo com um outro aspecto, a presente invenção fornece um método para produzir semente de milho que compreende cruzamento de uma primeira planta de milho parente com uma segunda planta de milho parente e colheita da primeira semente de milho de primeira geração resultante, onde a primeira ou segunda planta de milho parente é uma linhagem de planta de milho da invenção.

[00025] De acordo com um outro aspecto, a presente invenção fornece um método de produção de sementes híbridas de milho que compreende as etapas de: (a) plantação das sementes de uma primeira linhagem autofecundada de milho de acordo com a invenção e semente de uma segunda linhagem autofecundada de milho que tem um genótipo diferente; (b) cultivo das plantas de milho que resultam da referida plantação até o tempo de floração; (c) emasculação das flores de plantas de milho de uma das linhagens autofecundadas de milho; (d) permitir que ocorra a polinização da outra linhagem autofecundada, e (e) coleta da semente híbrida produzida dessa forma.

[00026] Os aspectos anteriores e outros da invenção se tornarão mais aparentes a partir da descrição detalhada a seguir. DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS NA LISTAGEM DE SEQUÊNCIA SEQ ID NO: 1 é a junção genoma-inserção de 5’. SEQ ID NO: 2 é a junção inserção-junção de 3’. SEQ ID NO: 3 é a sequência de genoma + inserção de 5’. SEQ ID NO: 4 é a sequência de inserção + genoma de 3’. SEQ ID NO: 5 é o genoma do milho que flanqueia 5’ para inserção. SEQ ID NO: 6 é o genoma do milho que flanqueia 3’ para inserção. SEQ ID NOs: 7-15 são iniciadores de sequência flanqueadora 5’ úteis na presente invenção. SEQ ID NOs: 16-20 são iniciadores de sequência promotora úteis na presente invenção. SEQ ID NOs: 21-28 são iniciadores de sequência cry3A055 úteis na presente invenção. SEQ ID NOs: 29-30 são iniciadores de sequência ZmUbiInt úteis na presente invenção. SEQ ID NOs: 31-37 são iniciadores de sequência pmi úteis na presente invenção. SEQ ID NO: 38 é um iniciador de sequência NOS útil na presente invenção. SEQ ID NO: 39-46 são iniciadores de sequência flanqueadora 3’ úteis na presente invenção. SEQ ID NOs: 47-49 são iniciadores e sondas cry3A055 TAQMAN. SEQ ID NOs: 50-52 são iniciadores e sonda pmi TAQMAN. SEQ ID NO: 53-55 são iniciadores e sonda ZmADH TAQMAN. SEQ ID NO: 56 é uma sonda MIR604 útil na presente invenção. SEQ ID NO: 57 é a sequência para a região de limite direita. SEQ ID NO: 58 é a sequência do promotor MTL. SEQ ID NO: 59 é a sequência do gene cry3A055. SEQ ID NO: 60 é a sequência do terminador NOS. SEQ ID NO: 61 é a sequência do promotor ZmUbInt. SEQ ID NO: 62 é a sequência do gene pmi. SEQ ID NO: 63 é a sequência da região de limite esquerda.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00027] A Figura 1 ilustra um vetor de expressão de planta designado pZM26. Map identifica sítio de restrição KpnI usado para a análise Southern.

[00028] A Figura 2 é um mapa gráfico que ilustra a organização dos elementos que compreendem as sequências de ácido nucleico heterólogas inseridas no genoma do evento de milho MIR604 e apresenta as posições relativas nas quais as sequências de ácido nucleico inseridas são ligadas às sequências de DNA genômicas de milho que flanqueiam as extremidades das sequências de DNA heterólogas inseridas. 1= genoma de planta que flanqueia 5’ (SEQ ID NO: 5); 2= região de limite direita (SEQ ID NO: 57); 3= promotor MTL (SEQ ID NO: 58); 4= gene cry3A055 (SEQ ID NO: 59); 5= terminador NOS (SEQ ID NO: 60); 6 = promotor ZmUbINT (SEQ ID NO: 61); 7 = gene pmi (SEQ ID NO: 62); 8 = terminador NOS (SEQ ID NO: 60); 9 = região de limite esquerda (SEQ ID NO: 63); e 10 = genoma de planta que flanqueia 3’ (SEQ ID NO: 6).

DEFINIÇÕES

[00029] As definições e métodos a seguir são fornecidos para definir melhor a presente invenção e para guiar aqueles de habilidade comum na técnica na prática da presente invenção. A menos que apontado de outro modo, os termos aqui usados devem ser compreendidos de acordo com o uso convencional por aqueles de habilidade comum na técnica relevante. As definições de termos comuns em biologia molecular também podem ser encontrado em Rieger e cols., Glossary of Genetics: Classical and Molecular, 5a edição, Springer-Verlag: New York, 1994.

[00030] Como aqui usado, o termo “amplificado” significa a construção de múltiplas cópias da molécula de ácido nucleico ou múltiplas cópias complementares à molécula de ácido nucleico pelo uso de pelo menos uma das moléculas de ácido nucleicos como um modelo. Os sistemas de amplificação incluem o sistema de reação em cadeia de polimerase (PCR), sistema de reação de cadeia de ligase (LCR), amplificação baseada em sequência de ácidos nucleicos (NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario), sistemas Q-Beta Replicase, sistema de amplificação baseado em transcrição (TAS), e amplificação de deslocamento de filamento (SDA). Veja, por exemplo, Diagnostic Molecular Microbiology: Principles and Applications, D. H. Persing e cols., Ed., American Society for Microbiology, Washington, D.C. (1993). O produto de amplificação é denominado um amplicon.

[00031] Uma “sequência codificadora” é uma sequência de ácidos nucleicos que é transcrita em RNA tal como mRNA, rRNA, tRNA, snRNA, RNA senso ou RNA antissenso. Preferivelmente o RNA é então traduzido em um organismo para produzir uma proteína.

[00032] “Kit de detecção” como aqui usado se refere a um kit usado para detectar a presença ou ausência de DNA de plantas MIR604 em uma amostra que compreende sondas e iniciadores de ácido nucleico da presente invenção, que hibridizam especificamente sob condições de alta estringência a uma sequência de DNA alvo, e outros materiais necessários para permitir os métodos de hibridização ou amplificação de ácido nucleico.

[00033] Como aqui usado o termo “evento” transgênico se refere a uma planta recombinante produzida por transformação e regeneração de uma única célula de planta com DNA heterólogo, por exemplo, um cassete de expressão que inclui um gene de interesse. O termo “evento” se refere ao transformante original e/ou prole do transformante que inclui o DNA heterólogo. O termo “evento” também se refere a prole produzida por um cruzamento sexual entre o transformante e uma outra linhagem de milho. Mesmo depois de retrocruzamentos repetidos a um parente recorrente, o DNA inserido e o DNA flanqueador do parente transformado está presente na prole do cruzamento na mesma localização cromossômica. Normalmente, uma transformação de tecido de planta produz múltiplos eventos, cada um representando a inserção de uma construção de DNA em uma localização diferente no genoma de uma célula de planta. Baseado na expressão do transgene ou outras características desejadas, um evento particular é selecionado. Portanto, o “evento MIR604”, “MIR604” ou “MIR604 evento” como aqui usado, significa o transformante original MIR604 e/ou prole do transformante MIR604.

[00034] “Cassete de expressão” como aqui usado significa uma sequência de ácidos nucleicos capaz de direcionar a expressão de uma sequência de nucleotídeos particular em uma célula hospedeira adequada, que compreende um promotor operacionalmente ligado a uma sequência de nucleotídeos de interesse que é operacionalmente ligada a sinais de terminação. Ele também compreende tipicamente sequências necessárias para a tradução adequada da sequência de nucleotídeos. O cassete de expressão também pode compreender sequências não necessárias na expressão direta de uma sequência de nucleotídeos de interesse mas que estão presentes devido a sítios de restrição convenientes para a remoção do cassete de um vetor de expressão. O cassete de expressão que compreende a sequência de nucleotídeos de interesse pode ser quimérico, o que significa que pelo menos um de seus componentes é heterólogo com relação a pelo menos um de seus outros componentes. O cassete de expressão também pode ser um que é de ocorrência natural mas que foi obtido em uma forma recombinante útil para expressão heteróloga. Tipicamente, no entanto, o cassete de expressão é heterólogo com relação ao hospedeiro, ou seja, a sequência de ácidos nucleicos particular do cassete de expressão não ocorre naturalmente na célula hospedeira e deve ter sido introduzida na célula hospedeira ou um ancestral da célula hospedeira por um processo de transformação conhecido na técnica. A expressão da sequência de nucleotídeos no cassete de expressão pode estar sob o controle de um promotor constitutivo ou de um promotor indutível que inicia a transcrição apenas quando a célula hospedeira á exposta a algum estímulo externo particular. No caso de um organismo multicelular, tal como uma planta, o promotor também pode ser específico para um tecido particular, ou órgão, ou estágio de desenvolvimento. Um cassete de expressão, ou fragmento desses, pode ser referido como “sequência inserida” ou “sequência de inserção” quando transformada em uma planta.

[00035] Um “gene” é uma região definida que está localizada no genoma e que, além da sequência de ácidos nucleicos codificadora acima mencionada, compreende outras sequências de ácidos nucleicos primariamente reguladoras, responsáveis pelo controle da expressão, ou seja, a transcrição e tradução, da porção codificadora. Um gene também pode compreender outras sequências não traduzidas 5’ e 3’ e sequências de terminação. Elementos adicionais que podem estar presentes são, por exemplo, íntrons.

[00036] “Gene de interesse” se refere a qualquer gene que, quando transferido a uma planta, confere à planta uma característica desejada tal como resistência a antibiótico, resistência a vírus, resistência a insetos, resistência a doenças, ou resistência a outras pragas, tolerância a herbicidas, valor nutricional melhorado, melhor performance em um processo industrial ou capacidade reprodutiva alterada. O “gene de interesse” pode também ser um que seja transferido a plantas para a produção de enzimas comercialmente valiosas ou metabólitos na planta.

[00037] “Genótipo” como aqui usado é um material genético herdado de plantas de milho parentes cujo material não é todo necessariamente expresso nas plantas de milho descendentes. O genótipo MIR604 se refere ao material genético heterólogo transformado no genoma de uma planta assim como o material genético que flanqueia a sequência inserida.

[00038] Uma sequência de ácidos nucleicos “heteróloga” é uma sequência de ácidos nucleicos não naturalmente associada com a célula hospedeira na qual ela é introduzida, incluindo múltiplas cópias de ocorrência não natural de uma sequência de ácidos nucleicos de ocorrência natural.

[00039] Uma sequência de ácidos nucleicos “homóloga” é uma sequência de ácidos nucleicos naturalmente associada com a célula hospedeira na qual ela é introduzida.

[00040] “Operacionalmente ligado” se refere à associação de sequências de ácido nucleico em um único fragmento de ácido nucleico de forma que a função de um afeta a função do outro. Por exemplo, um promotor é operacionalmente ligado com uma sequência codificadora ou RNA funcional quando ele é capaz de afetar a expressão daquela sequência codificadora ou RNA funcional (ou seja, que a sequência codificadora ou RNA funcional está sob o controle de transcrição do promotor). Sequências codificadoras em orientação senso ou antissenso podem ser operacionalmente ligadas a sequências reguladoras.

[00041] “Iniciadores” como aqui usado são ácidos nucleicos isolados que são enrijecidos a um filamento de DNA alvo complementar por hibridização de ácido nucleico para formar um híbrido entre o iniciador e o filamento de DNA alvo, assim se estendendo ao longo do filamento de DNA alvo por uma polimerase, tal como DNA polimerase. Pares de iniciador ou conjuntos podem ser usados para amplificação da molécula de ácido nucleico, por exemplo, pela reação de cadeia de polimerase (PCR) ou outros métodos convencionais de amplificação de ácido nucleico.

[00042] Uma “sonda” é um ácido nucleico isolado ao qual é anexado um rótulo detectável convencional ou molécula repórter, tal como um isótopo radioativo, ligante, agente quimioluminescente, ou enzima. Tal sonda é complementar a um filamento de um ácido nucleico alvo, no caso da presente invenção, a um filamento do DNA genômico do evento de milho, MIR604. O DNA genômico de MIR604 pode ser de uma planta de milho ou de uma amostra que inclui DNA do evento. Sondas de acordo com a presente invenção incluem não apenas ácidos desoxirribonucleicos ou ribonucleicos, mas também poliamidas e outros materiais de sonda que se ligam especificamente a uma sequência de DNA alvo e podem ser usados para detectar a presença daquela sequência de DNA alvo.

[00043] Iniciadores e sondas têm geralmente entre 10 e 15 nucleotídeos ou mais de comprimento, iniciadores e sondas também podem ter pelo menos 20 nucleotídeos ou mais de comprimento, ou pelo menos 25 nucleotídeos ou mais, ou pelo menos 30 nucleotídeos ou mais de comprimento. Tais iniciadores e sondas hibridizam especificamente a uma sequência alvo sob condições de hibridização de alta estringência. Iniciadores e sondas de acordo com a presente invenção podem ter complementaridade de sequência completa com a sequência alvo, embora as sondas que diferem da sequência alvo e que retém a habilidade de hibridizar a sequência alvos possam ser projetados por métodos convencionais.

[00044] “Condições estringentes” ou “condições de hibridização de alta estringência” incluem referência a condições sob as quais uma sonda irá hibridizar para sua sequência alvo em um grau passível de detecção maior do que outras sequências. Condições estringentes são dependentes de sequência alvo e serão diferentes dependendo da estrutura do polinucleotídeo. Controlando-se a estringência da hibridização e/ou as condições de lavagem, podem ser identificadas sequências alvo que são 100% complementares a sonda (marcação homóloga). Alternativamente, as condições de estringência podem ser ajustadas para permitir alguma não combinação nas sequências de forma que graus menores de similaridade sejam detectados (marcação heteróloga). Sequências mais longas hibridizam especificamente em temperaturas mais altas. Um guia extensivo para a hibridização de ácidos nucleicos é encontrado em Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes parte I capítulo 2 “Overview of principles of hibridização and the strategy of nucleic acid probe assays” Elsevier, New York. e Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Ausubel e cols., Eds., Greene Publishing e Wiley-Interscience: New York (1995), e também Sambrook e cols. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (5th Ed. Cols Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).

[00045] A especificidade é tipicamente a função de lavagens pós- hibridização, os fatores críticos sendo a força iônica e temperatura da solução de lavagem final. Geralmente as condições de hibridização e de lavagem de alta estringência são selecionadas como sendo cerca de 5°C menores que o ponto térmico de fusão (Tm) para a sequência específica em uma força iônica e pH definidos. A Tm é a temperatura (sob força iônica e pH definidos) na qual 50% da sequência alvo complementar hibridiza para uma sonda que combina perfeitamente. Tipicamente, sob condições de alta estringência uma sonda irá hibridizar a sua subsequência alvo, mas a nenhuma outra sequência.

[00046] Um exemplo condições de hibridização de alta estringência para hibridização de ácido nucleicos complementares que têm mais que 100 resíduos complementares em um filtro em um Southern ou Northern blot é 50% formamida com 1 mg de heparina a 42°C, com a hibridização sendo realizada de um dia para o outro. Um exemplo de condições de lavagem de alta estringência é 0,15 M NaCl a 72°C por cerca de 15 minutos. Um exemplo de condições de lavagem de alta estringência é uma lavagem de 0,2 x SSC a 65°C por 15 minutos (veja, Sambrook, infra, para uma descrição do tampão SSC).

[00047] Condições de hibridização de exemplo para a presente invenção incluem hibridização em 7% SDS, 0,25 M NaPO4 pH 7,2 a 67oC de um dia para o outro, seguida por duas lavagens em 5% SDS, 0,20 M NaPO4 pH 7,2 a 65oC por 30 minutos cada lavagem, e duas lavagens em 1% SDS, 0,20 M NaPO4 pH 7,2 a 65oC por 30 minutos cada lavagem. Uma lavagem de exemplo de média estringência para uma dupla de, por exemplo, mais que 100 nucleotídeos, é de 1x SSC a 45°C por 15 minutos. Um exemplo de lavagem de baixa estringência para uma dupla de, por exemplo, mais que 100 nucleotídeos, é 4-6x SSC a 40°C por 15 minutos.

[00048] Para sondas de cerca de 10 a 50 nucleotídeos, as condições de alta estringência tipicamente envolvem concentrações de sal de menos que cerca de 1,0 M de íon Na, tipicamente cerca de 0,01 a 1.0 M de concentração de íon Na (ou outros sais) em pH 7,0 a 8,3, e a temperatura é tipicamente de pelo menos cerca de 30°C. Condições de alta estringência também podem ser atingidas com a adição de agentes de desestabilização tal como formamida. Em geral, um sinal para proporção de 2x (ou mais) que aquele observado para uma sonda não selecionada no ensaio de hibridização particular indica detecção de uma hibridização específica. Ácidos nucleicos que não hibridizam um ao outro sob condições de alta estringência são ainda substancialmente idênticos se as proteínas que eles codificam são substancialmente idênticas. Isso ocorre, por exemplo, quando uma cópia de um ácido nucleico é criada usando a degeneração máxima de códon permitida pelo código genético.

[00049] Os seguintes são exemplos de conjuntos de condições de hibridização/lavagem que podem ser usados para hibridizar sequência de nucleotídeos que são substancialmente idênticas à sequência de nucleotídeos de referência da presente invenção: a sequência de nucleotídeos de referência preferivelmente hibridiza à sequência de nucleotídeos de referência em 7% de dodecil sulfato de sódio (SDS), 0,5 M NaPO4, 1 mM EDTA a 50°C com lavagem em 2 X SSC, 0,1% SDS a 50°C, mais desejavelmente em 7% de dodecil sulfato de sódio (SDS), 0,5 M NaPO4, 1 mM EDTA a 50°C com lavagem em 1 X SSC, 0,1% SDS a 50°C, mais desejavelmente ainda em 7% de dodecil sulfato de sódio (SDS), 0,5 M NaPO4, 1 mM EDTA a 50°C com lavagem em 0,5 X SSC, 0,1% SDS a 50°C, preferivelmente em 7% de dodecil sulfato de sódio (SDS), 0,5 M NaPO4, 1 mM EDTA a 50°C com lavagem em 0,1X SSC, 0,1% SDS a 50°C, mais preferivelmente em 7% de dodecil sulfato de sódio (SDS), 0,5 M NaPO4, 1 mM EDTA a 50°C com lavagem em 0,1 X SSC, 0,1% SDS a 65°C. As sequências da presente invenção podem ser detectadas usando todas as condições acima. Para os objetivos de definição da invenção, as condições de alta estringência são usadas.

[00050] “Transformação” é um processo para introdução de ácido nucleico heterólogo na célula hospedeira ou organismo. Em particular, “transformação” significa a integração estável de uma molécula de DNA no genoma de um organismo de interesse.

[00051] "Transformado/transgênico/recombinante" se refere a um organismo hospedeiro tal como uma bactéria ou uma planta na qual uma molécula de ácido nucleico heterólogo foi introduzida. A molécula de ácido nucleico pode ser integrada de forma estável no genoma do hospedeiro ou a molécula de ácido nucleico pode estar presente como uma molécula extracromossômica. Tal molécula extracromossômica pode ser de auto-replicação. Células, tecidos, ou plantas transformadas são entendidos como englobando não apenas o produto final do processo de transformação, mas também a prole transgênica desses. Um hospedeiro "não-transformado", "não-transgênico", ou "não recombinante" se refere a um organismo de tipo selvagem, por exemplo, uma bactéria ou planta, que não contém a molécula de ácido nucleico heterólogo. Como aqui usado, “transgênico” se refere a uma planta, célula de planta, ou várias células de plantas estruturadas ou não estruturadas tendo integrada, por meio de técnicas bem conhecidas de manipulação genética e de inserção de gene, a sequência de ácido nucleico que representa um gene de interesse no genoma da planta, e tipicamente em um cromossomo do núcleo da célula, mitocôndria ou outra organela que contém cromossomos, em um lócus diferente, ou em inúmeras cópias maiores, que normalmente se apresentam na planta nativa ou célula de planta. Plantas transgênicas resultam da manipulação e inserção de tais sequências de ácido nucleico, como oposto a mutações de ocorrência natural, para produzir uma planta de ocorrência não natural ou uma planta com um genótipo de ocorrência não natural. Técnicas para transformação de plantas e célula de plantas são bem conhecidas na técnica e podem compreender por exemplo eletroporação, micro-injeção, transformação mediada por Agrobacterium e transformação balística.

[00052] A nomenclatura para bases de DNA e aminoácidos como apresentada em 37 C.F.R. § 1.822 é aqui usada.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[00053] Essa invenção se relaciona a uma linhagem geneticamente melhorada de milho que produz a proteína de controle de insetos, Cry3A055, e uma enzima fosfomanose isomerase (PMI) que permite que a planta utilize manose como uma fonte de carbono. A invenção é particularmente dirigida a um evento de milho transgênico designado MIR604 que compreende um novo genótipo, assim como as composições e métodos para detecção de ácidos nucleicos desse evento em uma amostra biológica. A invenção é também dirigida a plantas de milho que compreendem o genótipo MIR604, a semente transgênica das plantas de milho, e a métodos para produção da planta de milho que compreende o genótipo MIR604 por cruzamento de uma linhagem de milho que compreende o genótipo MIR604 com si próprio ou uma outra linhagem de milho. Plantas de milho que compreendem o genótipo MIR604 da invenção são úteis no controle de pragas de insetos por coleóptero que incluem Diabrotica virgifera virgifera, a lagarta da raiz do milho do oeste, D. virgifera zeae, a lagarta da raiz do milho do México, e D. longicornis barberi, a lagarta da raiz do milho do norte. Plantas de milho que compreendem o genótipo MIR604 da invenção também são capazes de utilizar manose como uma fonte de carbono. \\

[00054] Em uma modalidade, a presente invenção engloba uma molécula de ácido nucleico isolado que compreende pelo menos 10 ou mais (por exemplo 15, 20, 25, ou 50) nucleotídeos contíguos da sequência de DNA heterólogo inserida no genoma da planta de milho do evento de milho MIR604 e pelo menos 10 ou mais (por exemplo 15, 20, 25, ou 50) nucleotídeos contíguos de um DNA do genoma da planta de milho que flanqueia o ponto de inserção da sequência de DNA heterólogo inserida no genoma da planta de milho do evento de milho MIR604. Também estão incluídas as sequências de nucleotídeos que compreendem 10 ou mais nucleotídeos de sequência de inserção contígua do evento MIR604 pelo menos um nucleotídeo do DNA que flanqueia do evento MIR604 adjacente à sequência de inserção. Tais sequências de nucleotídeos são diagnósticos para o evento MIR604. A amplificação de ácido nucleico de DNA genômico do evento MIR604 produz um amplicon que compreende tais sequências de nucleotídeos diagnósticas.

[00055] Em uma outra modalidade, a invenção engloba uma molécula de ácido nucleico isolado que compreende uma sequência de nucleotídeos que compreende pelo menos uma sequência de junção do evento MIR604 selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, e complementos dessas, onde uma sequência de junção transpõe a junção entre um cassete de expressão heterólogo inserido no genoma do milho e DNA do genoma do milho que flanqueia o sítio de inserção e é diagnóstico para o evento.

[00056] Em uma outra modalidade, a presente invenção engloba um ácido nucleico isolado que liga uma molécula de DNA heterólogo ao genoma da planta de milho no evento de milho MIR604 que compreende a sequência de cerca de 11 a cerca de 20 nucleotídeos contíguos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, e os complementos dessa.

[00057] Em uma outra modalidade, a invenção engloba uma molécula de ácido nucleico isolado que compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, e complementos dessas.

[00058] Em uma modalidade da presente invenção, é fornecido um amplicon que compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, e os complementos dessa.

[00059] Em uma outra modalidade, a presente invenção engloba iniciadores de sequência flanqueadora para detecção do evento MIR604. Tais iniciadores de sequência flanqueadora compreendem uma sequência de ácidos nucleicos isolada que compreende pelo menos 10-15 nucleotídeos contíguos dos nucleotídeos 1-801 de SEQ ID NO: 3 (aqui designada arbitrariamente como a sequência flanqueadora 5’), ou os complementos dessa. Em um aspecto dessa modalidade os iniciadores de sequência flanqueadora são selecionados do grupo que consiste em SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, e complementos dessas.

[00060] Em uma outra modalidade, a presente invenção engloba iniciadores de sequência flanqueadora que compreendem pelo menos 10-15 nucleotídeos contíguos dos nucleotídeos 507-1570 de SEQ ID NO: 4 (aqui designada arbitrariamente como a sequência flanqueadora 3’), ou os complementos dessa. Em um aspecto dessa modalidade os iniciadores de sequência flanqueadora são selecionados do grupo que consiste em SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, e complementos dessas.

[00061] Ainda em uma outra modalidade, a presente invenção engloba um par de iniciadores de polinucleotídeo que compreende um primeiro iniciador de polinucleotídeo e um segundo iniciador de polinucleotídeo que funcionam juntos na presença de um modelo de DNA do evento de milho MIR604 em uma amostra para produzir um diagnóstico de amplicon para o evento de milho MIR604, onde a primeira sequência de iniciador é ou está complementar ao genoma da planta de milho que flanqueia o ponto de inserção da sequência de DNA heterólogo inserida no genoma da planta de milho do evento de milho MIR604, e a segunda sequência de polinucleotídeos de iniciador é ou está complementar à sequência de DNA heterólogo inserida no genoma da planta de milho do evento de milho MIR604.

[00062] Em um aspecto dessa modalidade o primeiro iniciador de polinucleotídeo compreende pelo menos 10 nucleotídeos contíguos da posição 1-801 de SEQ ID NO: 3 ou complementos desses. Em um aspecto adicional dessa modalidade, o primeiro iniciador de polinucleotídeo compreende a sequência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, ou os complementos dessa. Em um outro aspecto dessa modalidade o primeiro iniciador de polinucleotídeo de pelo menos 10 nucleotídeos contíguos da posição 507-1570 de SEQ ID NO: 4 ou complementos desses. Em um outro aspecto dessa modalidade, o primeiro iniciador de polinucleotídeo compreende a sequência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, ou os complementos dessa. Ainda em um outro aspecto dessa modalidade, o segundo iniciador de polinucleotídeo compreende pelo menos 10 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, ou os complementos dessa. Ainda em um aspecto adicional dessa modalidade, o segundo iniciador de polinucleotídeo compreende a sequência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 16 a SEQ ID NO: 38, ou os complementos dessa.

[00063] Em um outro aspecto dessa modalidade, o primeiro iniciador de polinucleotídeo, que é apresentado em SEQ ID NO: 15, e o segundo iniciador de polinucleotídeo que é apresentado em SEQ ID NO: 28, funcionam juntos na presença de um modelo de DNA do evento de milho MIR604 em uma amostra para produzir um diagnóstico de amplicon para o evento de milho MIR604 como descrito no Exemplo 4. Em um outro aspecto dessa modalidade, o primeiro iniciador de polinucleotídeo, que é apresentada em SEQ ID NO: 45, e o segundo iniciador de polinucleotídeo que é apresentada em SEQ ID NO: 27, funcionam juntos na presença de um modelo de DNA do evento de milho MIR604 em uma amostra para produzir um diagnóstico de amplicon para o evento de milho MIR604 como descrito no Exemplo 4.

[00064] De fato, está dentro da habilidade da técnica a obtenção de sequência adicional no genoma da sequência que flanqueia cada uma das extremidades da sequência de DNA heterólogo inserida para uso como uma sequência de iniciador que pode ser usada em tais pares de iniciador para amplificação das sequências que são diagnósticas para o evento MIR604. Para os objetivos dessa revelação, a frase “no genoma da sequência que flanqueia cada uma das extremidades da sequência de DNA heterólogo” se refere especificamente a um movimento sequencial fora das extremidades da sequência de DNA heterólogo inserida, os pontos nos quais as sequências de DNA inseridas são adjacentes a sequência de DNA nativa genômica, e no DNA genômico do cromossomo particular no qual as sequências de DNA heterólogo foram inseridas. Preferivelmente, a sequência de iniciador corresponde ou é complementar a uma parte da sequência de inserção deve iniciar a extensão de transcrição de um filamento nascente de DNA ou RNA na direção da junção da sequência que flanqueia mais próxima. Consequentemente, a sequência de iniciador que corresponde ou é complementar a uma parte da sequência genômica que flanqueia deve iniciar a extensão de transcrição de um filamento nascente de DNA ou RNA na direção da junção da sequência que flanqueia mais próxima. A sequência de iniciador pode ser, ou pode ser complementar a uma sequência de DNA heterólogo inserida no cromossomo da planta, ou a sequência genômica que flanqueia. Uma pessoa habilitada na técnica reconhecerá facilmente o benefício do fato da sequência de iniciador necessitar ser, ou necessitaria ser complementar à sequência como apresentado na sequência de DNA heterólogo inserida ou como apresentada em SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4 dependendo da natureza do produto desejado a ser obtido através do uso do conjunto abrigado de iniciadores visado para uso na amplificação de um sequência flanqueadora particular que contém a junção entre a sequência de DNA genômica e a sequência de DNA heterólogo inserida.

[00065] Em uma outra modalidade, a presente invenção engloba um método de detecção da presença de DNA que corresponde ao evento MIR604 em uma amostra biológica, onde o método compreende: (a) contato da amostra que compreende o DNA com uma sonda que hibridiza sob condições de alta estringência com DNA genômico do evento de milho MIR604 e não hibridiza sob condições de alta estringência com DNA de uma planta de milho controle; (b) submeter a amostra e sonda a condições de hibridização de alta estringência; e (c) detecção da hibridização da sonda ao DNA. Em um aspecto dessa modalidade o amplicon compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, e complementos dessas.

[00066] Em uma outra modalidade, a presente invenção engloba um método de detecção da presença de um DNA que corresponde ao evento MIR604 em uma amostra biológica, onde o método compreende: (a) contato da amostra que compreende o DNA com uma sonda que hibridiza sob condições de alta estringência com DNA genômico do evento de milho MIR604 e não hibridiza sob condições de alta estringência com DNA de uma planta de milho controle; (b) submeter a amostra e sonda a condições de hibridização de alta estringência; e (c) detecção da hibridização da sonda ao DNA. A detecção pode ser por qualquer meio conhecido na técnica incluindo, mas não limitados a fluorescente, quimioluminescente, radiológica, imunológica ou qualquer outra. No caso no qual a hibridização pretende ser usada como um meio para amplificação de uma sequência particular para produzir um amplicon que é diagnóstico para o evento de milho MIR604, a produção e detecção por qualquer meio bem conhecido na técnica do amplicon pretende ser indicativa da hibridização pretendida a uma sequência alvo quando uma sonda ou iniciador é utilizado, ou sequências onde dois ou mais sondas ou iniciadores são utilizados. O termo “amostra biológica” pretende compreender uma amostra que contém ou é suspeita de conter um ácido nucleico que compreende entre cinco e dez nucleotídeos em cada um dos lados do ponto no qual uma ou a outra de duas extremidades terminais da sequência de DNA heterólogo inserida faz contato com a sequência de DNA genômica no cromossomo no qual a sequência de DNA heterólogo foi inserida, aqui também conhecida como as sequências de junção. Além disso, a sequência de junção compreende tão pouco quanto dois nucleotídeos: esses sendo o primeiro nucleotídeo no DNA genômico que flanqueia adjacente e ligado de forma covalente ao primeiro nucleotídeo na sequência de DNA heterólogo inserida.

[00067] Ainda em uma outra modalidade, a presente invenção engloba um kit para detecção da presença de MIR604 ácidos nucleicos em uma amostra biológica, onde o kit compreende pelo menos uma molécula de ácido nucleico de comprimento suficiente dos nucleotídeos contíguos homólogos ou complementares a uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, e SEQ ID NO: 4, que funciona como um DNA iniciador ou sonda específico para o evento MIR604, e outros materiais necessários para permitir a hibridização ou amplificação de ácido nucleico. Vários métodos de detecção podem ser usados incluindo TAQMAN (Perkin Elmer), amplificação térmica, reação de cadeia de ligase, hibridização por Southern Blot, métodos de ELISA e métodos de detecção colorimétricos e fluorescentes. Em particular a presente invenção fornece kits para detecção da presença da sequência alvo, ou seja, pelo menos uma das junções do DNA de inserção com o DNA genômico da planta de milho em MIR604, em uma amostra que contém o ácido nucleico genômico de MIR604. O kit compreende pelo menos um polinucleotídeo capaz de se ligar ao sítio de alvo ou substancialmente adjacente ao sítio de alvo e pelo menos um meio para detecção da ligação do polinucleotídeo ao sítio de alvo. O meio de detecção pode ser fluorescente, quimioluminescente, colorimétrico, ou isotópico e pode ser unido pelo menos com métodos imunológicos para detecção da ligação. Também é idealizado um kit que possa detectar a presença do sítio alvo em uma amostra, ou seja, pelo menos uma das junções do DNA de inserção com o DNA genômico da planta de milho em MIR604, tendo a vantagem de duas ou mais sequências de polinucleotídeos que juntas são capazes de se ligar a sequências de nucleotídeos adjacentes ou em cerca de 100 pares de base, ou em cerca de 200 pares de base, ou em cerca de 500 pares de base ou em cerca de 1.000 pares de base da sequência alvo e que pode ser estendida na direção uma da outra para formar um amplicon que contém pelo menos o sítio alvo.

[00068] Em uma outra modalidade, a presente invenção engloba um método para detecção da proteína do evento MIR604 em uma amostra biológica, o método compreendendo: (a) a extração da proteína de uma amostra de tecido do evento de milho MIR604; (b) análise da proteína extraída pelo uso de um método imunológico que compreende anticorpo específico para a proteína inseticida ou marcadora selecionável produzido pelo evento MIR604; e (c) detecção da ligação do referido anticorpo à proteína inseticida ou marcadora selecionável.

[00069] Uma outra modalidade da presente invenção engloba a planta de milho, ou partes dessa, que compreendem o genótipo do evento transgênico MIR604, onde o genótipo compreende a sequência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, ou os complementos dessa. Em um aspecto dessa modalidade, a planta de milho é das linhagens autofecundadas de milho CG5NA58, CG5NA58A, CG3ND97, CG5NA01, CG5NF22, CG4NU15, CG00685, CG00526, CG00716, NP904, NP948, NP934, NP982, NP991, NP993, NP2010, NP2013, NP2015, NP2017, NP2029,NP2031, NP2034, NP2045, NP2052, NP2138, NP2151, NP2166, NP2161, NP2171, NP2174, NP2208, NP2213, NP2222, NP2275,NP2276, NP2316, BCTT609, AF031, H8431, 894, BUTT201, R327H, 2044BT, e 2070BT. Uma pessoa habilitada na técnica reconhecerá que o genótipo MIR604 pode ser introduzida em qualquer variedade de planta que pode ser reproduzida com o milho, incluindo espécies selvagens de milho, e assim a as linhagens autofecundadas preferidas dessa modalidade não pretendem ser limitantes.

[00070] Em uma outra modalidade, a presente invenção engloba a planta de milho que compreende pelo menos uma primeira e uma segunda sequência de DNA ligadas juntas para formar a sequência de nucleotídeos contígua, onde a primeira sequência de DNA está em uma sequência de junção e compreende pelo menos cerca de 11 nucleotídeos contíguos selecionada do grupo que consiste em nucleotídeos 792-811 de SEQ ID NO: 3; nucleotídeos 497-516 de SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 6; e complementos dessas, onde a segunda sequência de DNA está na sequência de DNA de inserção heteróloga selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, e complementos dessas; e onde a primeira e a segunda sequências de DNA são úteis como iniciadores ou sondas de nucleotídeo para detecção da presença de sequências de ácido nucleico do evento de milho MIR604 em uma amostra biológica. Em um aspecto dessa modalidade, os iniciadores de nucleotídeo são usados em um Método de amplificação de DNA para amplificar uma sequência alvo de DNA do DNA de modelo extraído da planta de milho e a planta de milho é identificável de outras plantas de milho pela produção de um amplicon que corresponde à sequência de DNA que compreende SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2

[00071] As plantas de milho da invenção podem ser também caracterizadas pela digestão do DNA genômico da planta com a endonuclease de restrição KpnI que resulta em uma banda de hibridização única cry3A055 usando marcador específico de cry3A055 sob condições de alta estringência. Está aqui exemplificado um marcador cry3A055 que compreende uma sequência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 56 ou Id. de Seq. 59.

[00072] As plantas de milho da invenção podem ser também caracterizadas pela digestão do DNA genômico da planta com a endonuclease de restrição KpnI que resulta em uma banda de hibridização única pmi usando um marcador específico de pmi sob condições de alta estringência. Está aqui exemplificado um marcador pmi que compreende uma sequência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 62.

[00073] Em uma modalidade, a presente invenção fornece a planta de milho, na qual o genótipo MIR604 confere na planta de milho resistência a insetos ou a capacidade de utilizar manose. Em um aspecto dessa modalidade, o genótipo que confere resistência a insetos na planta de milho compreende um gene cry3A055. Em um outro aspecto dessa modalidade, o genótipo conferido à planta de milho a capacidade de utilizar manose compreende um gene pmi.

[00074] Em uma modalidade, a presente invenção fornece uma amostra biológica derivada de um evento MIR604 planta, tecido ou semente de milho, na qual a amostra compreende uma sequência de nucleotídeos que é ou está complementar à sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2, e na qual a sequência é detectável na amostra usando um método de hibridização ou de amplificação de ácido nucleico. Em um aspecto dessa modalidade, a amostra é selecionada de farinha de milho, xarope de milho, óleo de milho, amido de milho, e cereais manufaturados no todo ou em parte para conter os produtos do milho.

[00075] Em uma outra modalidade, a presente invenção fornece um extrato derivada de um evento MIR604 planta, tecido ou semente de milho que compreende uma sequência de nucleotídeos que é ou está complementar a uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2. Em um aspecto dessa modalidade, a sequência é detectada no extrato usando um método de hibridização ou de amplificação de ácido nucleico. Em um outro aspecto dessa modalidade, a amostra é selecionada de farinha de milho, xarope de milho, óleo de milho, amido de milho, e cereais manufaturados no todo ou em parte para conter os produtos do milho.

[00076] Ainda em uma outra modalidade, a presente invenção fornece um método para produção de a planta de milho resistente a pelo menos infestação por lagarta da raiz do milho que compreende: (a) cruzamento sexual de uma primeira planta de milho parente com uma segunda planta de milho parente, na qual a referida primeira ou segunda planta de milho parente compreende DNA do evento de milho MIR604, assim produzindo várias proles de planta de primeira geração; (b) seleção da planta de prole de primeira geração que é resistente a pelo menos infestação por lagarta da raiz do milho; (c) autopolinização da planta de prole de primeira geração, assim produzindo várias proles de planta de segunda geração; e (d) seleção das proles de planta de segunda geração, uma planta que é pelo menos resistente a infestação por lagarta da raiz do milho; na qual as proles de planta de segunda geração compreendem uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2.

[00077] Em uma outra modalidade, a presente invenção fornece um método de produção de sementes híbridas de milho que compreendem: (a) plantio das sementes de uma primeira linhagem autofecundada de milho que compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, e SEQ ID NO: 4, e sementes de uma segunda linhagem autofecundada de milho tendo um genótipo diferente; (b) cultivo das plantas de milho que resultam do referido plantio até o tempo de floração; (c) emasculação das referidas flores de plantas de uma faz linhagem autofecundada de milho; (d) cruzamento sexual das duas linhagem autofecundada de milho diferentes uma com a outra; e (e) coleta da semente híbrida produzida dessa forma. Em um aspecto dessa modalidade, a primeira linhagem autofecundada de milho fornece as parentes fêmeas. Em um outro aspecto dessa modalidade, a primeira linhagem autofecundada de milho fornece os parentes machos. A presente invenção também engloba a semente híbrida produzida pelo método incorporado e plantas híbridas que crescem da semente.

[00078] Uma pessoa habilitada na técnica reconhecerá que o genótipo transgênico da presente invenção pode ser introduzido por reprodução em outras linhas de milho que compreende diferentes genótipos transgênicos. Por exemplo, uma linhagem de milho que compreende o genótipo transgênico da presente invenção pode ser cruzado com uma linhagem de milho que compreende o genótipo transgênico do evento Bt11 resistente a lepidóptero, que é conhecido na técnica, assim produzindo semente de milho que compreende ambos, genótipo transgênico da invenção e o genótipo transgênico Bt11. Exemplos de outros eventos transgênicos que podem ser cruzados com uma linhagem da presente invenção incluem, os eventos GA21 e NK603 tolerantes a glifosato, o evento MON802 tolerante a glifosato/resistente a inseto lepidóptero, o evento DBT418 resistente a lepidóptero, o evento DAS-06275-8 resistente a lepidóptero, o evento MS3 estéril masculino, o evento B16 tolerante de fosfinotricina, o evento MON 80100 resistente a inseto lepidóptero, os eventos T14 e T25 tolerantes a fosfinotricina, o evento 176 resistente a inseto lepidóptero e o evento MON863 resistente a coleóptero, todos conhecidos na técnica.Será também reconhecido que outras combinações podem ser feitas com o genótipo transgênico da invenção e assim esses exemplos não devem ser vistos como limitantes.

[00079] Uma pessoa habilitada na técnica também reconhecerá que semente de milho transgênica que compreende o genótipo transgênico da presente invenção pode ser tratada com várias substâncias químicas de tratamento de semente, que incluem inseticidas, para aumentar ou sinergizar a atividade inseticida da proteína Cry3A055. Por exemplo, a semente de milho transgênica da presente invenção pode ser tratada com o inseticida comercial Cruiser®. Tal combinação pode ser usada para aumentar o espectro de atividade e para aumentar a eficácia da proteína expressão e dos químicos.

Reprodução

[00080] O genótipo transgênico da presente invenção pode ser introduzido em qualquer linhagem de milho ou híbrido pelo uso de técnicas de reprodução reconhecidas. O objetivo da reprodução de plantas é o de combinar em uma única variedade ou híbrido vários traços desejados. Para safras de campo, esses traços podem incluir resistência a insetos e doenças, tolerância a herbicidas, tolerância a calor e seca, redução do tempo para a maturidade da safra, maior rendimento, e melhor qualidade agronômica. Com coleta mecânica de várias safras, a uniformidade das características da planta tais como germinação e estabelecimento vertical, taxa de crescimento, maturidade, e altura da planta e da espiga, é importante.

[00081] Safras de campo são reproduzidas através de técnicas que tiram vantagem do método de polinização da planta. A planta é autopolinizada se o pólen de uma flor é transferido para a mesma ou outra flor da mesma planta. Uma planta é polinizada de forma cruzada se o pólen vem de uma flor em uma planta diferente.

[00082] Plantas que foram autopolinizadas e selecionadas por tipo por várias gerações se tornam homozigóticas em quase todos os loci de genes e produzem uma população uniforme de prole de reprodução verdadeira. Um cruzamento entre duas linhas homozigóticas diferentes produz uma população uniforme de plantas híbridas que podem ser heterozigóticas para vários loci de genes. Um cruzamento de duas plantas, cada uma heterozigótica em um número de loci de genes produzirá uma população de plantas híbridas que diferem geneticamente e não serão uniformes.

[00083] O milho pode ser reproduzido pela técnica de autopolinização e de polinização cruzada. O milho tem flores macho e fêmeas separadas na mesma planta, localizadas na franja e espiga, respectivamente. A polinização natural ocorre no milho quando o vento assopra o pólen das franjas para as franjas que se projetam dos topos das espigas.

[00084] Um método de controle confiável da fertilidade masculina em plantas oferece a oportunidade para melhor reprodução de plantas. Isso é especialmente verdadeiro para o desenvolvimento de híbridos de milho, que se baseiam no mesmo tipo de sistema de esterilidade masculina. Há várias opções para controle da fertilidade masculina disponíveis aos produtores, tais como: emasculação manual ou mecânica (ou desfranjamento), esterilidade masculina citoplasmática, esterilidade masculina genética, gametócitos e semelhantes.

[00085] A semente de milho híbrida é tipicamente produzida por um sistema de esterilidade masculina que incorpora desfranjamento manual ou mecânico. Tiras alternadas de duas linhagens de milho são plantadas em um campo, e as franjas que carregam pólen são removidas de uma das linhagens (fêmea). Desde que haja isolamento suficiente das fontes de pólen estranho de milho, as espigas da linhagem desfranjada serão fertilizadas apenas da outra linhagem (macho), e a semente resultante é, portanto, híbrida formará plantas híbridas.

[00086] O processo de desfranjamento laborioso, e ocasionalmente não confiável, pode ser evitado pelo uso de um de quaisquer métodos para conferir esterilidade masculina genética na técnica, cada um com seus próprios benefícios e inconvenientes. Esses métodos usam uma variedade de abordagens tais como liberação na planta de um gene que codifica uma substância citotóxica associada com um promotor específico de tecido masculino ou um sistema antissenso no qual um gene crítico para fertilidade é identificado e um antissenso para aquele gene é inserido na planta (veja: Fabinjanski, e cols. EPO 89/3010153.8 publicação no. 329,308 e pedido PCT PCT/CA90/00037 publicado como WO 90/08828).

Desenvolvimento de Linhagens de milho autofecundadas

[00087] O uso de linhagens estéreis de macho é um fator na produção de híbridos de milho. As técnicas de reprodução de plantas conhecidas e usadas em um programa de reprodução de plantas de milho incluem, mas não se limitam a, seleção recorrente, retrocruzamento, reprodução de genealogia, seleção melhorada de polimorfismo de restrição de comprimento, seleção melhorada de marcador genético e transformação. O desenvolvimento de híbridos de milho em um programa de reprodução de plantas de milho requer, em geral, o desenvolvimento de linhagens autofecundadas homozigóticas, o cruzamento dessas linhagens e a avaliação dos cruzamentos. A reprodução de genealogia e métodos de reprodução de seleção recorrente são usados para desenvolver linhagens autofecundadas das populações de reprodução. Programas de reprodução de plantas de milho combinam os fundamentos genéticos de duas ou mais linhagens autofecundadas ou de várias outras fontes de germoplasma nos conjuntos de reprodução dos quais novas linhagens autofecundadas são desenvolvidas por autopolinização e seleção de fenótipos desejados. As novas linhagens são cruzadas com outras linhagens autofecundadas e os híbridos desses cruzamentos são avaliados para determinar qual desses tem potencial comercial. A reprodução de plantas e desenvolvimento de híbridos, como praticado em um programa de reprodução de planta de milho, são processos caros e consomem muito tempo.

[00088] A reprodução de genealogia inicia com o cruzamento de dois genótipos, cada um podendo ter uma ou mais características desejáveis que estão ausentes no outro ou que complementam o outro. Se dois parentes originais não fornecem todas as características desejadas, outras fontes podem ser incluídas na população de reprodução. No método de genealogia, as plantas superiores são autopolinizadas e selecionadas em gerações sucessivas. Nas gerações bem-sucedidas a condição heterozigótica abre caminho para linhagens homogêneas como um resultado da autopolinização e seleção. Tipicamente no método de reprodução de genealogia cinco ou mais gerações de autopolinização e seleção são praticadas: Fi ^ F2; F2 ^ F3; F3 ->F4; F4 ^F.5; etc.

[00089] Reprodução de seleção recorrente, retrocruzamento por exemplo, pode ser usada para melhorar uma linhagem autofecundada e um híbrido que é feito usando aquelas linhagens. Retrocruzamento pode ser usado para transferir uma característica específica desejável de uma linhagem ou fonte para uma linhagem que é desprovida daquela característica ou traço. Isso pode ser realizado, por exemplo, por cruzamento primeiramente de uma linhagem superior (parente recorrente) para uma linhagem doadora (parente não recorrente), que carrega o gene(s) adequado para a característica em questão. A prole desse cruzamento é então cruzada ao parente recorrente superior seguida por seleção na prole resultante para a característica desejada a ser transferida do parente não recorrente. Depois de cinco ou mais gerações de retrocruzamento com seleção para a característica desejada, a prole será homozigótica para o lócus que controla a característica que está sendo transferida, mas será como o parente superior para essencialmente todos os outros genes. A última geração de retrocruzamento é então autopolinizada para gerar a prole de reprodução pura para o gene(s) que está sendo transferido. Um híbrido desenvolvido de linhagens que contêm o gene(s) transferido é essencialmente o mesmo que o híbrido desenvolvido das mesmas linhagens sem o gene(s) transferido.

[00090] Linhagens autofecundadas de elite, ou seja, linhagens autofecundadas homozigóticas, de reprodução pura, também podem ser usadas como materiais de iniciação para a reprodução ou populações de fonte das quais se desenvolvem outras linhagens autofecundadas. Essas linhagens autofecundadas derivadas das linhagens autofecundadas de elite podem ser desenvolvidas pelo uso de reprodução de genealogia e métodos de reprodução de seleção recorrente descritos anteriormente. Como um exemplo, quando a reprodução por retrocruzamento é usada para criar essas linhagens derivada sem um programa de reprodução de planta de milho, linhagens de elite podem ser usadas como uma linhagem parental ou material de iniciação ou população de fonte e podem servir como o parente doador ou recorrente.

Desenvolvimento de híbridos de milho

[00091] Um híbrido de milho de cruzamento único resulta do cruzamento de duas linhagens autofecundadas, cada uma tem o genótipo que complementa o genótipo da outra. A prole do híbrido da primeira geração é designada F1. No desenvolvimento de híbridos comerciais nos programas de reprodução de planta de milho, apenas as plantas híbridas F1 são buscadas. Híbridos F1 preferidos são mais vigorosos que as suas linhagens parentes. Esse vigor de híbrido, ou heterose, pode ser manifestado em várias características poligênicas, incluindo crescimento vegetativo aumentado e rendimento aumentado.

[00092] O desenvolvimento de um híbrido de milho em programas de reprodução de plantas de milho envolve três etapas: (1) a seleção de plantas de vários conjuntos de germoplasma para cruzamentos de reprodução inicial; (2) a autopolinização de plantas selecionadas dos cruzamentos de reprodução por várias gerações para produzir uma série de linhagens autofecundadas, que, embora diferentes uma da outra, se cruzam verdadeiramente e são altamente uniformes; e (3) cruzamento de linhagens autofecundadas selecionadas com diferentes linhagens autofecundadas para produzir a prole híbrida (F1). Durante o processo de autofecundação em milho, o vigor das linhagens diminui. O vigor é restabelecido quando duas linhagens autofecundadas diferentes são cruzadas para produzir a prole híbrida (F1). Uma importante consequência da homozigose e homogeneidade das linhagens autofecundadas é que o híbrido entre um par definido de linhagens será sempre o mesmo. Uma vez que linhagens que geram um híbrido superior tenham sido identificadas, a semente híbrida pode ser reproduzida de forma indefinida pelo tempo que a homogeneidade das linhagens parentes for mantida. Muito do vigor do híbrido exibido pelos híbridos F1 é perdido na próxima geração (F2). Consequentemente, semente de híbridos não é usada para estoque de plantação.

[00093] A produção de semente híbrida requer a eliminação ou inativação do pólen produzido pelo parente fêmea. A remoção incompleta ou inativação do pólen fornece o potencial para autopolinização. Essa semente autopoliniza de forma inadvertida pode ser colhida de forma não intencional e empacotada com semente híbrida.

[00094] Quando a semente é plantada, é possível identificar e selecionar essas plantas autopolinizadas. Essas plantas autopolinizadas serão geneticamente equivalentes às linhagens autofecundadas fêmeas usadas para produzir o híbrido.

[00095] Como é evidente para uma pessoa habilitada na técnica, os antecedentes são apenas algumas das várias formas pelas quais a linhagem da presente invenção pode ser obtida por aqueles que visando introduzir o genótipo transgênico da invenção em outras linhagens de milho. Outros meios são disponíveis, e os exemplos acima são apenas ilustrativos.

EXEMPLOS

[00096] A invenção será também descrita por referência aos seguintes exemplos detalhados. Esses exemplos são fornecidos apenas para objetivos de ilustração e não pretendem ser limitantes a menos que especificado de outro modo. Técnicas padrão de DNA recombinante e clonagem molecular usadas são bem conhecidas na técnica e são descritas por Ausubel (ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley e Sons, Inc. (1994); J. Sambrook, e cols., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d Ed., Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001); e por Silhavy, M.L. Berman, e L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984).

Exemplo 1. Transformação e Seleção do Evento MIR604

[00097] O evento MIR604 foi produzido por transformação mediada por Agrobacterium da linhagem autofecundada de milho (Zea mays) A188. Calo embriogênico de tipo I foi transformado essencialmente como descrito em Negrotto e cols. (Plant Cell Reports 19: 798-803, 2000), aqui incorporado por referência, usando um fragmento de DNA do plasmídeo pZM26 (Figura 1). pZM26 contém uma sequência de nucleotídeos que compreende cassetes de expressão tandem. O primeiro cassete de expressão compreende uma sequência promotora MTL (Patente US 6.018.099) operacionalmente ligado a uma sequência codificadora cry3A055 também operacionalmente ligada a uma de sequência de poliadenilação e de terminação de transcrição de extremidade 3’ da nopalina sintase. O segundo cassete de expressão compreende um promotor de ubiquitina de milho (ZmUbiInt) (Christensen e cols. 1992 PMB 18: 675) operacionalmente ligado a uma sequência codificadora pmi também operacionalmente ligada a uma sequência de poliadenilação e de terminação de transcrição de extremidade 3’ da nopalina sintase.

[00098] Embriões imaturos foram retirados de espigas com 8-12 dias e enxaguadas com meio fresco na preparação para a transformação. Os embriões foram misturados com a suspensão de células de Agrobacterium que abrigam o vetor de transformação pZM26, vortexado por 30 segundos, e deixados para incubar por mais 5 minutos. A solução em excesso de Agrobacterium foi aspirada e os embriões foram então movidos para placas que contêm um meio de cultura não seletivo. Os embriões foram cultivados com o Agrobacterium restante a 22°C por 23 dias no escuro. Os embriões foram transferidos para meio de cultura suplementado com ticarcilina (100 mg/mL) e nitrato de prata (1,6 mg/l) e incubados no escuro por 10 dias. A produção de embriões do calo embriogênico foi transferida para meio de cultura de células contendo manose.

[00099] Plantas regeneradas foram testadas por análise de PCR TAQMAN® (veja o Exemplo 2) para a presença de ambos os genes pmi e cry3A055, assim como para a ausência do gene de resistência ao antibiótico espectinomicina (spec). Plantas positivas para ambos os transgenes, e negativas para o gene spec, foram transferidas para a estufa para propagação posterior. Eventos positivos foram identificados e classificados usando bioensaios de inseto contra lagarta da raiz do milho. Eventos inseticidas foram caracterizados para número de cópia por análise TAQMAN. MIR604 foi escolhido para análise posterior baseada na obtenção de uma única cópia dos transgenes, boa expressão de proteína como identificado por ELISA, e boa atividade inseticida contra lagarta da raiz do milho.

[000100] O MIR604 T0 foi retrocruzado à linhagem autofecundada de milho CG00526, criando a população T1. As plantas T1 foram autopolinizadas para criar a geração T2, e esse processo foi repetido para criar uma geração T3. A testagem da prole das plantas T3 foi empregada para identificar famílias homozigóticas (convertidas). A linhagem CG00526 convertida por MIR604 foi cruzada a outras linhagens autofecundadas de elite para criar híbridos usados em estudos posteriores.

Exemplo 2. Detecção de MIR604 por PCR TAQMAN

[000101] A análise TAQMAN foi realizada essencialmente como descrito em Ingham e cols. (Biotechniques, 31:132-140, 2001) aqui incorporado por referência. Em resumo, DNA genômico foi isolado de folhas de plantas de milho transgênicas e não transgênicas usando o Kit de extração de DNA genômico Puregene® (Gentra Systems, Minneapolis, MN) essencialmente de acordo com as instruções do fabricante, exceto pelo fato de que todas as etapas foram conduzidas em placas de 1,2 ml de 96 cavidades. O pélete seco de DNA foi ressuspenso em tampão TE (10 Mm Tris-HCl, pH 8,0, 1mM EDTA).

[000102] Reações de PCR TAQMAN foram realizadas em pacas de 96 cavidades. Para o controle do gene endógeno de milho, iniciadores e sondas foram desenhados específicos para o gene de álcool desidrogenase de Zea mays (adh) (n° de acesso Genbank AF044295). Será reconhecido pela pessoa habilitada que outros genes de milho podem ser usados como controles endógenos. As reações foram diversificadas para amplificar simultaneamente cry3A055 e adh ou pmi e adh. Para cada amostra, uma mistura principal foi gerada por combinação de 20 μL de DNA genômico com 35 μL de 2x TAQMAN Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) suplementado com iniciadores até uma concentração final de 900 nM cada, sondas até uma concentração final de 100 nM cada, e água até um volume final de 70 μL. Essa mistura foi distribuída em três réplicas de 20 μL cada em placas de amplificação de 96 cavidades e seladas com filme de selagem oticamente transparente (Marsh Bio Products). PCR foi realizada no instrumento ABI Prism 7700 usando os seguintes parâmetros de amplificação: 2 min a 50oC e 10 min a 95oC, seguido por 35 ciclos de 15 s a 95oC e 1 min a 60oC.

[000103] Os resultados da análise TAQMAN demonstraram que o evento MIR604 tinha uma cópia do gene cry3A055 e uma cópia do gene pmi.

[000104] Exemplos de combinações adequadas de sequência de iniciador/sonda que foram usadas foram:

Exemplo 3. Detecção de MIR604 por Southern Blot

[000105] DNA genômico usado para análise Southern Blot foi isolado de tecido de folha de dez plantas que representam a geração seis de retrocruzamento (BC6) de MIR604 usando essencialmente o método de Thomas e cols. (Theor. Appl. Genet. 86:173-180, 1993), aqui incorporado por referência. Todas as plantas usadas para isolar DNA foram analisadas individualmente usando PCR TAQMAN (como descrito no Exemplo 2) para confirmar a presença de uma única cópia do gene cry3A055 e do gene pmi. Para os controles segregantes negativos, o DNA foi isolado de tecido de folha de cinco plantas que representam a geração BC4 do evento MIR604. Essas plantas segregantes negativas foram analisadas individualmente usando PCR TAQMAN e os ensaios foram negativos para a presença do gene cry3A055 e do gene pmi gene, mas foram, como esperado, positivos para o controle interno de ensaio, o gene adh de milho endógeno.

[000106] A análise Southern foi realizada usando técnicas convencionais de biologia molecular. DNA genômico (7,5 μg) foi digerido com enzima de restrição KpnI, que tem um único sítio de reconhecimento em MIR604 T-DNA inserção do plasmídeo pZM26 (Figura 1). Essa abordagem permite a determinação do número de cópias dos elementos, que corresponde a sonda específica usada para cada Southern Blot, que foi incorporada em MIR604. Isso resulta em uma banda de hibridização por cópia do elemento presente em MIR604. Depois de eletroforese em gel de agarose e transferência alcalina para uma membrana a Nytran®, as hibridizações foram realizadas usando sondas específicas para elemento gerados por PCR de comprimento total. A sonda marcadora usada em Southern blots de cry3A055 e pmi compreende as sequências de nucleotídeos apresentadas em SEQ ID NO: 58 e SEQ ID NO: 61, respectivamente. As sondas foram rotuladas com 32P via iniciação randômica usando o sistema Rediprime™ II (Amersham Biosciences, Cat. No. RPN1633).

[000107] As seguintes condições de hibridização de alta estringência foram usadas: 1-2 milhões cpm/mL são adicionadas a PerfectHyb (Sigma) suplementado com 100 μg/mL DNA de timo de bezerro (Invitrogen) pré-aquecido a 65oC. Pré-hibridização ocorre na mesma solução como acima, na mesma temperatura de um dia para o outro ou por pelo menos uma hora. A hibridização foi realizada a 65oC por 3 horas seguida por lavagem 2X em 2X SSC, 0,1% SDS por 20 minutos a 65oC e 2X em 0,1X SSC, 0,1% SDS por 20 minutos a 65oC.

[000108] Estavam incluídas em cada Southern três amostras controle: (1) DNA de um segregante negativo (não transformado) usado para identificar quaisquer sequências endógenas de Zea mays que possam hibridizar de forma cruzada com a sonda específica de elemento; (2) DNA de um segregante negativo no qual é introduzida uma quantidade de pZM26 digerido por KpnI que é igual a um número de cópia baseado no comprimento da sonda, para demonstrar a sensibilidade do experimento na detecção de uma única cópia de gene no genoma de Zea mays; e (3) plasmídeo pZM26 digerido por KpnI que é igual a um número de cópia baseado no comprimento da sonda, como um controle positivo para hibridização assim como para demonstrar a sensibilidade do experimento.

[000109] Os dados da hibridização fornecem evidência confirmatória que sustenta a análise de PCR TAQMAN de que MIR604 contém uma única cópia dos genes cry3A055 e pmi, e que MIR604 não contém quaisquer das sequências de estrutura de vetor presentes em pZM26. Como esperado para ambas as sondas cry3A055 e pmi, a digestão KpnI resultou em uma única banda de hibridização do tamanho correto, que demonstra que uma única cópia de cada gene está presente no evento MIR604. Adicionalmente, para a sonda de estrutura a ausência de hibridização demonstra a ausência de quaisquer sequências de estrutura de vetor pZM26 sendo incorporadas em MIR604 durante o processo de transformação.

Exemplo 4. Sequenciamento de Inserção de T-DNA

[000110] A sequência de nucleotídeos da inserção de DNA de transgene inteira presente no evento MIR604 foi determinada para demonstrar a integridade geral da inserção, contiguidade dos elementos funcionais e para detectar quaisquer mudanças individuais de pares de base. A inserção de MIR604 foi amplificada por PCR de DNA derivado da geração BC5 como dois fragmentos individuais de sobreposição. Cada fragmento foi amplificado usando um iniciador de polinucleotídeo homólogo a sequências genômicas de planta que flanqueiam a inserção MIR604 e um iniciador de polinucleotídeo homólogo ao gene cry3A055. Para gerar o fragmento 5’, um primeiro iniciador de polinucleotídeo homólogo à sequência flanqueadora 5’, 5’S1 (SEQ ID NO: 15), foi combinado com um segundo iniciador de polinucleotídeo homólogo ao DNA inserido no gene cry3A055, 5’AS1 (SEQ ID NO: 28). Para gerar o fragmento 3’, um primeiro iniciador de polinucleotídeo homólogo à sequência flanqueadora 3’, 9268AS (SEQ ID NO: 45), foi combinado com um segundo iniciador de polinucleotídeo homólogo ao DNA inserido no gene cry3A055, 5161S (SEQ ID NO: 27).

[000111] Amplificação por PCR foi realizada usando o sistema de PCR Expand High Fidelity (Roche, Cat. No. 1732650) e os seguintes parâmetros de amplificação: 2 min a 94oC por 1 ciclo, seguido por 10 ciclos de 15 s a 94oC, 30s a 55-65oC e 5 min a 68oC, seguido por 20 ciclos de 15s 94oC, 30s a 55-65oC, e 5 min+5s/ciclo de 72oC, seguido por 1 ciclo de 7 min a 72oC.

[000112] O amplicon que resulta da amplificação por PCR usando SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 28 compreende sequência de junção 5’ (SEQ ID NO: 1). O amplicon que resulta da amplificação por PCR usando SEQ ID NO: 45 e SEQ ID NO: 27 compreende a sequência de junção 3’ (SEQ ID NO: 2). Cada fragmento de sequenciamento foi individualmente clonado em vetor PCR® -XL-TOPO (Invitrogen, Cat. No. K4700-20) e três clones separados para cada fragmento foram identificados e sequenciados. O sequenciamento foi realizado usando o analisador ABI3730XL usando química de ABI BigDye® 1,1 ou Big Dye 3,1 dGTP (para modelos ricos GC). A análise de sequência foi feita usando o pacote Phred, Phrap, e Consed da “University of Washington” e foi realizado em uma taxa de erro de menos que 1 em 10.000 bases (Ewing e Green, 1998). A sequência de consenso final foi determinada por combinação dos dados da sequência de seis clones individuais (três para cada fragmento de sequenciamento) para gerar uma sequência de consenso da inserção MIR604. Para também validar qualquer discrepância de par de base individual entre a inserção de MIR604 e o plasmídeo pZM26, pequenos produtos de PCR (aproximadamente 300500 bp) específicos para quaisquer regiões onde uma discrepância de par de base foi observada na sequência de consenso inicial foram amplificados usando a mesma metodologia acima. Para todas as discrepâncias de pares de base supostas na inserção MIR604, o sequenciamento de produto de PCR direto resultou em picos únicos claros em todos os pares de base em questão, que indica que essas discrepâncias estão provavelmente presentes na inserção MIR604. o alinhamento foi realizado usando o progrma ClustalW com os seguintes parâmetros: matriz de pontuação blosum55, penalidade de intervalo aberto 15, penalidade de extensão de intervalo 6,66 (Thompson e cols., 1994, Nucleic Acids Research, 22, 4673-4680).

[000113] Os dados da sequência de consenso para a inserção MIR604 T-DNA demonstram que a integridade geral da inserção e contiguidade dos elementos funcionais na inserção como pretendido em pZM26 foram mantidos. A análise de sequência revelou que algum truncamento ocorreu nas extremidades da borda direita (RB) (SEQ ID NO: 57) e borda esquerda (LB) (SEQ ID NO: 62) da inserção T-DNA durante o processo de transformação que resultou no evento MIR604. a porção RB da inserção T-DNA foi truncada por 44bp e a extremidade LB da inserção T-DNA foi truncada por 43 bp. Esses apagamentos não possuem qualquer efeito sobre a eficácia da inserção T-DNA e esse fenômeno tem sido previamente observado na transformação por Agrobacterium (Tinland & Hohn, 1995. Genetic Engineering, 17: 209229). Adicionalmente, três mudanças de pares de base foram notadas na inserção T-DNA de MIR604. Uma discrepância ocorreu no promotor MTL, uma região reguladora que não codifica a proteína. As duas discrepâncias restantes ocorreram na sequência codificadora de pmi e resultaram em duas mudanças de aminoácido; valina na posição 61 foi substituída por alanina (V61A) e glutamina na posição 210 foi substituída por histidina (Q210H). Alanina e valina são ambos aminoácidos alifáticos que resulta em uma substituição conservadora. A substituição de glutamina com histidina resulta na substituição de um resíduo ácido por um resíduo básico.

Exemplo 5. Análise de Sequência de DNA flaqueadora

[000114] A sequência de DNA do genoma do milho que flanqueia o DNA heterólogo inserida no genoma da planta de milho do evento MIR604 foi obtida usando OmniPlex™ Technology essencialmente como descrito em Kamberov e cols. (Proceedings of SPIE, Tools for Molecular Analysis e High-Throughput Screening, 4626:1-12, 2002), aqui incorporado por referência.

[000115] As sequências flanqueadoras 5’ e 3’ e sequências de junção foram confirmadas usando procedimentos padrão de PCR. A sequências flanqueadora 5’ e sequências de junção foram confirmadas usando um primeiro iniciador de polinucleotídeo apresentada em SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 13 combinado com uma segunda iniciador de polinucleotídeo apresentada em SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 17. A sequências flanqueadora 3’ e sequências de junção foram confirmadas usando um primeiro iniciador de polinucleotídeo apresentada em SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43 ou SEQ ID NO: 44 combinado com uma segunda iniciador de polinucleotídeo apresentada em SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 ou SEQ ID NO: 36. Será reconhecido pela pessoa habilitada que outras sequências de iniciador podem ser usadas para confirmar as sequências flanqueadoras e sequências de junção.

[000116] Descobriu-se que a inserção MIR604 é flanqueada na borda direita (sequência flanqueadora 5’) pela sequência genômica do milho mostrada em SEQ ID NO: 5 e flanqueada na borda esquerda (sequência flanqueadora 3’) pela sequência genômica do milho mostrada em SEQ ID NO: 6. A sequência de junção 5’ é apresentada em SEQ ID NO: 1. A sequência de junção 3’ é apresentada em SEQ ID NO: 2.

Exemplo 6. Detecção de proteína MIR604 via ELISA

[000117] Para caracterizar a escala de expressão de proteínas Cry3A055 (o princípio inseticida ativo) e fosfomanose isomerase (PMI) (o marcador selecionável) em plantas MIR604, as concentrações de proteína Cry3A055 e PMI foram determinadas por ELISA em vários tecidos de planta e plantas inteiras em quatro estágios de crescimento (espiral, antese, maturidade da semente e senescência) em dois híbridos (MIR604-B e MIR604-C) e uma linhagem (MIR604-A). Os híbridos eram hemizigóticos para os transgenes no evento MIR604, enquanto a linhagem era homozigótica para os transgenes.

[000118] Plantas inteiras e partes individuais (exceto pólen) foram reduzidos a um pó fino por processamento usando um moedor de café, misturador, moedor Grindomix™ (Brinkmann Instruments; Westbury, NY, USA), pilão ou moinho, ou uma combinação desses dispositivos.Todo o processamento foi feito na presença de gelo seco ou nitrogênio líquido. As amostras foram bem misturadas para assegurar a homogeneidade. A amostra de tecido de planta, ou uma sub-amostra representativa, foi retida para análise, mantendo um tamanho de amostra suficiente para estocagem de arquivo de amostras de tecido de planta de reserva. O peso seco percentual de cada amostra foi determinado e as amostras processadas foram estocadas a cerca de - 80°C até a liofilização.

[000119] Tecido fresco (exceto pólen e forragem) e amostras de planta inteira foram extraídos. Para cada amostra analisada, uma alíquota de 1,0 g do material em pó fresco foi pesada em um tubo de 15-ml de polipropileno, suspensa em 3 ml de tampão de extração [50 mM CAPS, 0,1 M NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM ditiotreitol, 1 mM 4-(1- aminoetil)benzenossulfonil fluoreto HCl, 1 mM leupeptina, pH 10], e extraída usando um homogenizador Autogizer® (Tomtek; Hamden, CT, USA). Após centrifugação por 15 min a 10,000 x g a 4°C, o sobrenadante foi usado para análise de Cry3A055 e PMI por ELISA. Após tratamento com iodoacetamida como descrito por Hill e Straka (1988), a proteína total nos extratos foi quantificada usando o reagente de ensaio de proteína BCA™ (Pierce; Rockford, IL, USA).

[000120] Os extratos de pólen foram preparados por suspensão do pólen 1:30 (w/v) em tampão de extração. Depois de 30 min em gelo, as suspensões de pólen foram rompidas por três passagens através de uma prensa Francesa (“French Press”) em cerca de 103,42 MPa, seguido por centrifugação a 14.000 x g por 5 min a 4°C. As análises de Cry3A055 e PMI por ELISA foram realizadas nos sobrenadantes como descrito abaixo. A proteína total foi quantificada como descrito abaixo.

[000121] Extratos de forragem foram preparados por suspensão de forragem 1:25 (w/v) em 2X tampão de extração. Depois de 30 minutos em gelo, as suspensões de forragem foram extraídas usando um homogenizador Brinkmann Polytron® (Brinkmann; Westbury, NY, USA). Após centrifugação por 15 min a 10.000 x g a 4°C, o sobrenadante foi usado para análise de Cry3A055 e PMI por ELISA. A proteína total foi quantificada como descrito acima.

Quantificação de Cry3A055

[000122] Os extratos preparados como acima descrito foram analisados quantitativamente para Cry3A055 por ELISA (Tijssen, 1985) usando anticorpos policlonais anti-Cry3A055 de coelho purificados por imunoafinidade e anticorpos policlonais anti-Btt de cabra purificados por imunoafinidade (Cry3A nativo de Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis). O limite inferior de quantificação do ELISA de duplo sanduíche foi estimado baseado na concentração inferior de proteína de referência pura situada na porção linear da curva padrão, o volume máximo de um extrato controle que pode ser analisado sem interferência de fundo, e o peso correspondente da amostra que a alíquota representou.

[000123] Níveis quantificáveis de proteína Cry3A055 foram detectados em todos os tecidos de planta derivados de MIR604 analisados exceto pólen. Na maioria dos casos, os resultados são apresentados como médias das cinco amostras de tecido de réplica. Para forragem, uma amostra foi analisada; portanto, não pode ser calculada uma média. Os níveis de amostra controle foram abaixo do limite de quantificação para todos os estágios e tecidos.

[000124] Por todos os estágios de crescimento, os níveis médios de Cry3A055 medidos em folhas, raízes e plantas inteiras variaram de cerca de 3 - 23 μg/g de peso fresco (4 - 94 μg/g de peso seco), cerca de 2 - 14 μg/g de peso fresco (7 - 62 μg/g de peso seco), e cerca de 0,9 - 11 μg/g de peso fresco (3 - 28 μg/g de peso seco), respectivamente. Níveis médios de Cry3A055 medidos nos grãos na maturidade da semente e na senescência variaram de cerca de 0,6 - 1,4 μg/g de peso fresco (0,8 - 2,0 μg/g de peso seco). Níveis médios de Cry3A055 medidos em tecido das franjas em antese foram abaixo do limite inferior de quantificação (LOQ), <0,1 μg/g de peso fresco (<1,0 μg/g de peso seco). Níveis médios de Cry3A055 medidos em tecido das franjas na maturidade das sementes variaram de cerca de 0,6 - 1,9 μg/g de peso fresco (1 - 3 μg/g de peso seco). Nenhuma proteína Cry3A055 foi detectável no pólen da linhagem MIR604-A ou híbridos MIR604-B e MIR604-C [limite de detecção (LOD) = 0,07 μg/g de peso fresco, 0,15 μg/g de peso seco].

[000125] Os níveis de Cry3A055 foram geralmente similares entre híbridos para cada tipo de tecido em cada ponto de tempo. Para as linhagens autofecundadas, a expressão de Cry3A055 foi geralmente mais alta nos híbridos em folhas, raízes e plantas inteiras em estágios de espiral e de antese, e em raízes na maturidade de semente. Os níveis medidos de Cry3A055 em tecidos de forragem foram em média 2,5 μg/g de peso fresco (7,3 μg/g de peso seco) por 15, 29 e 75 dias. Por comparação, o nível de Cry3A055 medido no material cortado de planta antes da ensilagem (Dia 0 pré-silagem) foi de cerca de 8 μg/g de peso fresco (20 μg/g de peso seco).

Quantificação de PMI

[000126] Os extratos preparados como acima descrito foram analisados quantitativamente para PMI por ELISA (Tjissen, 1985) usando anticorpos policlonais de cabra purificados por imunoafinidade e anticorpos policlonais de coelho purificados por Proteína A específicos para PMI. O limite inferior de quantificação do ELISA de duplo sanduíche foi estimado baseado na concentração inferior de proteína de referência pura situada na porção linear da curva padrão, o volume máximo de um extrato controle que pode ser analisado sem interferência de fundo, e o peso correspondente da amostra que a alíquota representou.

[000127] A proteína PMI foi detectada na maioria dos tecidos de planta derivados de MIR604 analisados, embora em níveis baixos. Na maioria dos casos, os resultados são apresentados como médias das cinco amostras de tecido de réplica. Para forragem, uma réplica foi analisada; portanto, não pode ser calculada uma média. Os níveis de amostra controle foram abaixo do limite de quantificação para todos os estágios e tecidos.

[000128] Por todos os estágios da planta, os níveis médios de PMI medidos em folhas, raízes e plantas inteiras variaram de não detectável ND) a ca. 0,4 μg/g de peso fresco (ND - 2,1 μg/g peso seco), abaixo do LOQ (<0,03 μg/g de peso fresco) a cerca de 0,2 μg/g de peso fresco (<0,1 - 1,0 μg/g de peso seco), e abaixo do LOQ (<0,02 μg/g de peso fresco) a cerca de 0,3 μg/g de peso fresco (<0,04 - 2 μg/g de peso seco), respectivamente. Níveis médios de PMI medidos nos grãos na maturidade da semente e na senescência variaram de cerca abaixo do LOQ (<0,06 μg/g peso fresco) a cerca de 0,4 μg/g peso fresco (<0,07 - 0,5 μg/g peso seco). Níveis médios de PMI medidos em tecido das franjas em antese e na maturidade das sementes variaram de abaixo do LOQ (<0,1 μg/g de peso fresco) a cerca de 0,8 μg/g de peso fresco (<0,2 - 6,8 μg/g peso seco). PMI no pólen variou de cerca de 1,9 - 2,6 μg/g peso fresco (3,9 - 5,2 μg/g peso seco).

[000129] Os níveis de PMI foram geralmente similares entre a linhagem e genótipos híbridos para cada tipo de tecido em cada ponto de tempo. PMI não foi detectável em forragem em todos os três pontos de amostragem (dia 15, 29 e 75), enquanto o nível medido no material de folhas cortadas antes da ensilagem (Dia 0 pré-silagem) foi de cerca de 0,3 μg/g de peso fresco (0,7 μg/g de peso seco).Níveis estimados de proteína Cry3A055 total por acre e por hectare

[000130] Para a linhagem autofecundada (MIR604-A) e ambos híbridos (MIR604-B e MIR604-C), as plantas atingiram sua mais alta biomassa na maturidade da semente. As plantas também atingiram seus níveis médios de Cry3A055 estimados mais altos em uma base por acre (e por hectare) na maturidade da semente e estimou-se conterem cerca de 78, 141 e 240 g Cry3A055/acre (193, 348 e 592 g/hectare) para MIR604-A, MIR604-B e MIR604-C, respectivamente. Na estação de crescimento e nos genótipos, as estimativas de Cry3A055 em plantas derivadas de MIR604 variaram dos níveis médios de cerca de 8 g Cry3A055/acre (21 g Cry3A055/hectare) no estágio de senescência a cerca de 240 g Cry3A055/acre (592 g Cry3A055/hectare) na maturidade da semente, assumindo uma densidade de plantação de 26.500 plantas por acre (65.500 plantas/hectare).

Exemplo 7. Eficácia de campo de MIR604 Lagarta da raiz do milho do oeste e do norte

[000131] Plantas MIR604 foram testadas para eficácia contra lagarta da raiz do milho do oeste e do norte em 12 localizações nos Estados Unidos. MIR604 foi testado com e sem a adição do tratamento inseticida da semente Crusier®. Grupos controle consistiram em semente tratada com duas taxas diferentes de Cruiser® e um parte não tratada. Os tratamentos consistiram em quatro réplicas de duas fileiras de 5,3-6 metros espaçadas 0,76 m no centro desenhado em um bloco completo randomizado. Dez plantas por tratamento foram escolhidas randomicamente e avaliadas para eficácia usando uma escala de 0-3 onde 0 = nenhum dano de alimentação (a menor pontuação que pode ser dada); 1 = um nodo (círculo de raízes), ou o equivalente de um nodo inteiro comido sem aproximadamente cinco cm do caule (linha do solo no 7° nodo); 2 = dois nodos completos comidos; 3 = três ou mais nodos comidos (a maior pontuação que pode ser dada). O dano entre o nodo inteiro, comido foi notado como a percentagem ausente do nodo, ou seja, 1,50 = 1^ nodos comidos, 0,25 = % de um nodo comido.

[000132] Os resultados, mostrados na tabela 1, demonstram que as raízes de duas linhagens irmãs de MIR604, 3-11 e 3-12, sustentaram danos de alimentação significativamente menores que as raízes de tratamento com Cruiser® ou das raízes não tratadas controle. MIR04-3- 11 e MIR604-3-12 tinham pontuações de dano à raiz de 0,44 e 0,42, respectivamente, comparadas aos 0,25 e 1,25 mgA/semente de tratamento com Cruiser®s, que tinham taxas de danos de 1,6 e 0,9, respectivamente, e a linhagem controle com uma taxa de danos de 2,14. Houve uma tendência na direção de menores pontuações de dano à raiz nas plantas MIR604 cujas sementes foram tratadas com Cruiser®, o que sugere que Crusier® aumentou a proteína Cry3A055 ou que houve uma possível sinergia entre Crusier® e Cry3A055. Isso foi particularmente evidente em 1,0 e 1,25 mgA/MIR604 de tratamentos de semente com pontuações de dano à raiz de 0,33 e 0,29, respectivamente.Tabela 1. Eficácia de MIR604 com e sem tratamento de semente com Crusier®.

[000133] A eficácia de MIR604 foi comparada com padrões inseticidas granulares comerciais aplicados em sulcos do arado. O desenho experimental foi como descrito acima. Os resultados na tabela 2 demonstram que a eficácia de MIR604 foi comparável a dos padrões comerciais na proteção de plantas contra danos de alimentação por lagarta da raiz do milho.Tabela 2. Comparação da eficácia de MIR604 inseticidas comerciais aplicados em sulcos do arado.

Lagarta da raiz do milho do México

[000134] Plantas MIR604 foram avaliadas para resistência aa lagarta da raiz do milho do México nas localizações do Texas. O desenho experimental foi essencialmente o mesmo como descrito acima.

[000135] Os resultados mostrados na tabela 3 demonstram que irmãs MIR604 sustentaram menos dano de alimentação que os controles não tratados. Houve uma resposta positiva para o controle de lagarta da raiz do milho do México quando o Cruiser foi adicionado à semente MIR604. Uma clara taxa de resposta foi evidente. Os resultados mostrados na tabela 4 demonstram que eficácia de MIR604 foi comparável aos padrões comerciais na proteção de plantas contra danos de alimentação pela lagarta da raiz do milho do México.Tabela 3. Eficácia de MIR604 com e sem tratamento de semente com Cruiser contra lagarta da raiz do milho do México.Tabela 4. Eficácia de MIR604 comparada com inseticidas comerciais aplicados em sulcos de arado contra lagarta da raiz do milho do México.

[000136] Todas as publicações e aplicações de patente mencionadas na especificação são indicativas do nível daqueles com habilidade na técnica aos quais essa invenção pertence. Todas as publicações e aplicações de patente são aqui incorporadas por referência na mesma extensão como se cada publicação ou aplicação de patente individual fosse especifica e individualmente indicada para ser incorporada por referência.

[000137] Embora a invenção precedente tenha sido descrita em algum detalhe como forma de ilustração e exemplo para fins de clareza de compreensão, será óbvio que certas mudanças e modificações podem ser praticadas dentro do escopo da presente invenção.

Claims

1. Molécula de ácido nucleico isolado compreendendo pelo menos uma sequência de junção de nucleotídeos do evento de milho MIR604, caracterizada pela SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4 e complementos completos dessas.

2. Molécula de ácido nucleico. caracterizada pelo fato de que consiste em uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, ou complementos completos dessas.

3. Ácido nucleico isolado que liga uma molécula de DNA heterólogo ao genoma da planta de milho no evento de milho MIR604 caracterizado pelo fato de que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, e complementos completos dessas.

4. Amplicon, caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.

5. Par de iniciadores de polinucleotídeos compreendendo um primeiro iniciador de polinucleotídeo e um segundo iniciador de polinucleotídeo que funcionam juntos em presença de um modelo de DNA do evento de milho MIR604, caracterizado pela SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2, em uma amostra para produzir um diagnóstico de amplicon para o evento de milho MIR604, em que o primeiro iniciador de polinucleotídeo consiste na sequência de nucleotídeo selecionada do grupo consistindo na SEQ ID NO: 7 a SEQ ID NO: 15, e os complementos completos dessas, e o segundo iniciador de polinucleotídeo consiste na sequência de nucleotídeo selecionada do grupo consistindo na SEQ ID NO: 16 a SEQ ID NO: 55, e os complementos completos dessas.

6. Par de iniciador de polinucleotídeos, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o primeiro iniciador de polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 39 a SEQ ID NO: 46, e complementos completos dessas.

7. Par de iniciador de polinucleotídeos, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o segundo iniciador de polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 16 a SEQ ID NO: 38, e complementos completo dessas.

8. Par de iniciador de polinucleotídeos, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o primeiro iniciador de polinucleotídeo é definido na SEQ ID NO: 15 e o segundo iniciador de polinucleotídeo é definido na SEQ ID NO: 28.

9. Par de iniciador de polinucleotídeos, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o primeiro iniciador de polinucleotídeo é definido na SEQ ID NO: 45 e o segundo iniciador de polinucleotídeo é definido na SEQ ID NO: 27.

10. Método de detecção da sequência de DNA em uma amostra, caracterizado pelo fato de que compreende: a) contato da amostra com um par de iniciadores como definidos em qualquer uma das reivindicações 5 a 9 que, quando usados em uma reação de amplificação de ácido nucleico com DNA do evento de milho MIR604, produz um amplicon que é diagnóstico para o evento MIR604, o qual é definido pela a SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2; b) realização de uma reação de amplificação de ácido nucleico, dessa forma produzindo o amplicon; e c) detecção do amplicon, em que o referido amplicon compreende uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4, e um complemento completo das mesmas.

11. Método de detecção da presença de DNA que corresponde ao evento MIR604 compreendendo a SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2, em uma amostra, o referido método caracterizado pelo fato de que compreende: a) o contato da amostra com uma sonda que compreendendo a SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 que hibridiza sob condições de alta estringência com DNA genômico do evento de milho MIR604 e não hibridiza sob condições de alta estringência com DNA de uma planta de milho controle; b)submeter a amostra e a sonda a condições de hibridização de alta estringência; e c) detecção da hibridização da sonda ao DNA.

12. Kit para detecção da presença de ácidos nucleicos de MIR604, compreendendo a SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2, em uma amostra biológica, o referido kit caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos uma molécula de DNA que compreende um comprimento suficiente de nucleotídeos contíguos que é ou é complementar a SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 que funciona como uma sonda de DNA específica para evento de milho MIR604.

13. Kit para detecção de a presença de DNA do evento de milho MIR604 em uma amostra biológica, caracterizado pelo fato de que compreende uma primeira molécula de sonda que compreende pelo menos 11 nucleotídeos contíguos que é ou é complementar a uma sequência de nucleotídeos do grupo que consiste em SEQ ID NO: 3 da posição de nucleotídeo 792 até a posição de nucleotídeo 811 e uma segunda molécula de sonda que compreende pelo menos 11 nucleotídeos contíguos que é ou é complementar a uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 4 da posição de nucleotídeo 497 até a posição de nucleotídeo 516, em que a referida molécula hibridiza especificamente a uma sequência de nucleotídeos sob condições de hibridização de alta estringência.

14. Método de detecção da presença de DNA do evento de milho MIR604 em uma amostra biológica, caracterizado pelo fato de que compreende: a) o contato da amostra com um par de iniciadores como definidos em qualquer uma das reivindicações 5 a 9, em que o referido par de iniciadores funciona juntos na reação de amplificação de ácido nucleico na presença de um modelo de DNA do evento de milho MIR604, compreendendo a SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2, para produzir um diagnóstico de amplicon para o evento de milho; b) realização de uma reação de amplificação de ácido nucleico, dessa forma produzindo o amplicon; e c) detecção do amplicon, em que o referido amplicon compreende uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4, e os complementos completos das mesmas.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o amplicon compreende a SEQ ID NO: 1, onde a sequência do primeiro iniciador de polinucleotídeo é selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 7 a SEQ ID NO: 15, e complementos dessas, e onde a segunda sequência de iniciador de polinucleotídeos é selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 16 a SEQ ID NO: 38, e complementos completos dessas.

16. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o amplicon compreende SEQ ID NO: 2, em que a sequência do primeiro iniciador de polinucleotídeo é selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 39 a SEQ ID NO: 46, e complementos dessas, e onde a segunda sequência de iniciador de polinucleotídeos é selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 16 a SEQ ID NO: 38, e complementos completos dessas.

17. Método de detecção de DNA do evento de milho MIR604 em uma amostra biológica, caracterizado pelo fato de que compreende: a) contato de uma amostra que compreende o DNA com uma sonda de polinucleotídeo, compreendendo a SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2, que hibridiza sob condições de hibridização e de lavagem de alta estringência com o MIR604 DNA e que não hibridiza sob condições de hibridização e de lavagem de alta estringência com DNA da planta de milho exceto MIR604; b) submeter a amostra e a sonda às condições de hibridização e de lavagem de alta estringência; e c) detecção de hibridização da sonda ao DNA do evento MIR604.

18. Método para produção de uma planta de milho resistente a pelo menos lagarta da raiz do milho, caracterizado pelo fato de que compreende: a) cruzamento sexual de uma primeira planta de milho parental com uma segunda planta de milho parental, onde a referida primeira ou segunda planta de milho parental compreende DNA do evento de milho MIR604, compreendendo a SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2, dessa forma produzindo uma pluralidade de plantas de prole de primeira geração; b) seleção da planta de prole de primeira geração que é resistente a pelo menos infestação por lagarta da raiz do milho; c) autopolinização da planta de prole de primeira geração, assim produzindo várias proles de planta de segunda geração; d) seleção das proles de planta de segunda geração, uma planta que é pelo menos resistente a infestação por lagarta da raiz do milho; em que as plantas de prole de segunda geração compreendem a SEQ ID NO: 1, e SEQ ID NO: 2.