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WO2005035756A1 - 機能蛋白質を代替する二種特異性抗体 - Google Patents

機能蛋白質を代替する二種特異性抗体 Download PDF

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WO2005035756A1
WO2005035756A1 PCT/JP2004/014911 JP2004014911W WO2005035756A1 WO 2005035756 A1 WO2005035756 A1 WO 2005035756A1 JP 2004014911 W JP2004014911 W JP 2004014911W WO 2005035756 A1 WO2005035756 A1 WO 2005035756A1
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WO
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antibody
seq
amino acid
acid sequence
blood coagulation
Prior art date
Application number
PCT/JP2004/014911
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Kunihiro Hattori
Tetsuo Kojima
Taro Miyazaki
Tetsuhiro Soeda
Original Assignee
Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
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Publication date
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Priority to AT04792180T priority patent/ATE518952T1/de
Priority to JP2005514610A priority patent/JP5438880B2/ja
Priority to NO20160762A priority patent/NO345624B1/no
Priority to CA2541671A priority patent/CA2541671C/en
Priority to KR1020127033128A priority patent/KR101361437B1/ko
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Priority to MXPA06003831A priority patent/MXPA06003831A/es
Priority to PL16162353T priority patent/PL3085783T3/pl
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    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)

Definitions

  • the present invention relates to a bispecific antibody that substitutes for the action of a cofactor that enhances an enzymatic reaction, and a pharmaceutical composition containing the antibody as an active ingredient.
  • Antibodies have attracted attention as pharmaceuticals because of their high stability in blood and low antigenicity. Among them are bispecific antibodies that can recognize two kinds of antigens simultaneously. Bispecific antibodies have been proposed for a long time. However, only antibodies that simply link two types of antigens, such as for the purpose of retargeting NK cells, macrophages, and T cells, have been reported (Non-Patent Document 7). For example, MDX-210, which is undergoing clinical trials, is a bispecific antibody that expresses Fcy RI, expresses monocytes and the like, expresses HER-2 / neu, and retargets them to cancer cells. Not just. Thus, to date, bispecific antibodies have been used as alternatives to cofactors that enhance enzymatic reactions.
  • tissue factor for example, tissue factor (TF), blood coagulation factor V (FV), activated blood coagulation factor V (Fv a), blood coagulation vm factor (F.vm), activity I Dani blood coagulation factor vm (TF), blood coagulation factor V (FV), activated blood coagulation factor V (Fv a), blood coagulation vm factor (F.vm), activity I Dani blood coagulation factor vm (TF), blood coagulation factor V (FV), activated blood coagulation factor V (Fv a), blood coagulation vm factor (F.vm), activity I Dani blood coagulation factor vm (TF), blood coagulation factor V (FV), activated blood coagulation factor V (Fv a), blood coagulation vm factor (F.vm), activity I Dani blood coagulation factor vm (TF), blood coagulation factor V (FV), activated blood coagulation factor V (Fv a), blood coagulation vm factor
  • TM Thrombomodulin
  • PS Protein S
  • PZ Protein Z
  • Heparin Heparin
  • Complement C4b Complement Regulatory Factor H
  • MCP Membrane Cofactor Protein
  • CR1 Complement Receptor 1
  • F.VIII / F.VIIIa is a cofactor necessary for the active expression of activated blood coagulation factor IX (F.IXa).
  • FXa activated blood coagulation factor X
  • Scheiflinger F and colleagues show that certain anti-F.IX / F.IXa antibodies have an effect in chromogenic assays to promote F.IXa-induced blood coagulation factor X (FX) activation.
  • FX blood coagulation factor X
  • F.VIIIa is known to interact not only with F.IXa but also with F.X
  • Patent Document 1 International Publication No. 01/19992
  • Patent Document 2 U.S. Pat.No. 4,474,893
  • Patent Document 3 EP404,097
  • Patent Document 4 WO 93/11161
  • Patent Document 5 Japanese Patent Application No. 2002-112369
  • Patent Document 6 Japanese Patent Application No. 2003-012648
  • Patent Document 7 JP-A-5-304992
  • Patent Document 8 JP-A-2-145187
  • Patent Document 9 JP-A-5-213775
  • Patent Document 10 JP-A-10-165184
  • Patent Document 11 JP-A-11-71288
  • Patent Document 12 Japanese Patent Publication No. 2002-518041
  • Patent Document 13 Japanese Patent Publication No. 11-506310
  • Patent Document 14 JP-A-5-199894
  • Patent Document 15 Japanese Patent Publication No. 10-511085
  • Patent Document 16 JP-A-5-184383
  • Non-Patent Document l Nilsson IM et al., ⁇ J. Intern.Med. '', 1992, Vol.235, p.25-32
  • Non-Patent Document 2 Lofqvist T et al., ⁇ J. Intern.Med. '', 1997, Vol.241, p.395-400 Cfe, "o" in "Lofqvist T” is an umlauts
  • Non-Patent Document 3 24th Annual Meeting of the Japanese Society of Thrombosis and Hemostasis Minimal Symposium on Standardization of Hemophilia Subcommittee, 2001, http://www.jsth.org
  • Non-Patent Document 4 Medical Bulletin # 193 1994
  • Non-Patent Document 5 Mertens K et al., “Thromb. Haemost.”, 1999, Vol.82, p.209-217
  • Non-Patent Document 6 Lapan KA et al., “Thromb. Haemost.”, 1998, Vol. .80, p.418-422
  • Non-Patent Document 7 Segal DM et al., “Journal of Immunological Methods", 2001, Vol.248, p.1-6
  • Non-Patent Document 8 Bos R and Nieuwenhuitzen W, ⁇ Hybridoma '', 1992, Vol. 11, No. 1, p. 41-51
  • Non-Patent Document 9 Brennan M et al., ⁇ Science '', 198 ⁇ , Vol.229, No. 1708, p.81-3
  • Non-Patent Document 10 Karpovsky B et al., ⁇ J. Exp.Med. '', 1984 Year, Vol.160, No.6, p.1686-701
  • Non-patent literature ll Suresh MR et al., "Methods Enzymol.”, 1986, Vol. 121, p. 210-28
  • Non-patent literature 12 Massimo YS et al., "J. Immunol. Methods", 1997, Vol. .201, p.57-66
  • Non-Patent Document 13 Brennan M et al., ⁇ Science '', 1985, Vol.229, p.81
  • Non-patent Document 14 Shalaby MR et al., ⁇ J. Exp.Med. '', 1992, Vol. 175, p. 217-25
  • Non-Patent Document 15 Holliner P et al., ⁇ Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, Vol. 90, p.
  • Non-Patent Document 16 Ridgway JB et al., ⁇ Protein Eng.J, 1996, Vol. 9, p. 617-21
  • Non-Patent Document 17 Hammerling U et al., ⁇ J. Exp.Med. '', 1968, Vol.128, p.1461-73
  • Non-Patent Document 18 KurokawaT et al., ⁇ Bio / Technology '', 1989, Vol. 7, p.1163
  • Non-Patent Document 19 Link BK et al., ⁇ Blood '', 1993 , Vol.81, p.3343
  • Non-Patent Document 20 Nitta T et al., ⁇ Lancet '', 1990, Vol.335, p.368-71
  • Patent Document 21 deLeij L et al., ⁇ Foundation Nationale de Translusion Sanguine, Les
  • Non-Patent Document 22 Le Doussal JM et al., ⁇ J. Nucl.Med. '', 1993, Vol.34, p.1662-71
  • Non-Patent Document 23 Stickney DR et al., ⁇ Cancer Res.J, 1991 Vol. 5 K p. 6650-5
  • Non-Patent Document 24 Weiner LM et al., ⁇ Cancer Res. '', 1993, Vol. 53, p. 94-100
  • Non-Patent Document 25 Kroesen BJ et al., ⁇ Br J. Cancer, 1994, Vol. 70, p. 652-61
  • Non-Patent Document 26 Weiner GJ et al., "J. Immunol.”, 1994, Vol. 152, p. 2385.
  • Non-Patent Document 27 Suresh MR et al., ⁇ Pro Natl. Acad. Sci. USA '', 1986, Vol. 83, p. 7989-93
  • Non-Patent Document 28 Milstein C and Cuello AC, ⁇ Nature '', 1983, Vol. 305, p. 537
  • Non-Patent Document 29 Xiang J et al., ⁇ Mol. Immunol. '', 1990, Vol. 27, p. 809
  • Non-Patent Document 30 Bebbington CR et al., ⁇ Bio / Technology '', 1992, Vol. 10, p. 169
  • Non-Patent Document 31 Huse WD et al., "Science", 1989, Vol. 246, p. 1275
  • Non-Patent Document 33 Kang AS et al., ⁇ Proc. Natl. Acad. Sci. USA '', 1991, Vol. 88, p.
  • An object of the present invention is to provide a bispecific antibody that substitutes for the function of a cofactor that enhances an enzymatic reaction.
  • the inventors of the present invention have conducted intensive studies, and as a result, specifically bind to both F.IX / F.IXa and FX, and act as a cofactor of F. Villa, ie, FX activity by F.IXa. Have succeeded in finding a bispecific antibody that substitutes for the action that promotes anti-inflammatory activity. That is, the present inventors have succeeded in producing a bispecific antibody that recognizes both an enzyme and a substrate of the enzyme and can substitute for the function of a cofactor of the enzyme.
  • the present invention relates to a bispecific antibody that substitutes for the function of a cofactor that enhances an enzyme reaction, and more specifically,
  • the enzyme of blood coagulation / fibrinolysis-related factor is blood coagulation factor IX and / or activated coagulation factor IX
  • the substrate is blood coagulation factor X
  • the cofactor is blood coagulation factor VIII and VIII.
  • Or is an active dani blood coagulation factor VIII, the antibody according to (3),
  • a blood coagulation factor X antibody comprising a complementarity-determining region comprising the amino acid sequence of CDR3 described in any of the following (bl) to (b9) or a complementarity-determining region functionally equivalent thereto: 1) the antibody according to any one of [ 4 ],
  • H chain CDR3 is SEQ ID NO: 28: described: amino: no acid sequence
  • H chain CDR3 is SEQ ID NO: 36: Amino acid described: SEQ ID NO: 36
  • H chain CDR3 is SEQ ID NO: 52: Amino acid described:: No acid sequence
  • a complementarity-determining region comprising the amino acid sequence of the following (al) or (a2) CDR of an anti-coagulation factor IX / IXa antibody or a functionally equivalent complementarity-determining region;
  • a factor X antibody comprising a complementarity-determining region comprising the amino acid sequence of the CDR according to any one of the following (bl) to (b9) or a functionally equivalent complementarity-determining region: ( 4 ) the antibody according to any of ( 4 ),
  • (b3) the heavy chain CDR1, 2, 3 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30, 31, 32.
  • H chain CDR1, 2, 3 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38, 39, 40
  • H chain CDR1, 2, 3 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42, 43, 44
  • the heavy chain CDR1, 2, 3 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 46, 47, 48
  • the heavy chain CDRs 1, 2, and 3 have the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 50, 51, and 52
  • composition comprising the antibody according to any one of (1) to (6) and a pharmaceutically acceptable carrier
  • composition according to (7) which is a pharmaceutical composition used for prevention and / or treatment of bleeding, a disease associated with bleeding, or a disease caused by bleeding;
  • composition according to [9] which is a disease power which develops and / or progresses due to a decrease or deficiency in the activity of blood coagulation factor VIII and / or blood coagulation factor VIII.
  • Blood coagulation factor VIII and / or activity A disease power that develops and / or progresses due to a decrease or deficiency in the activity of blood coagulation factor VIII blood coagulation factor VIII and / or active coagulation factor VIII
  • the composition according to (9), wherein an inhibitor against the disease has appeared.
  • composition according to [9] which is a disease that develops and / or progresses due to a decrease or deficiency in the activity of blood coagulation factor VIII and / or blood coagulation factor VIII, and is acquired hemophilia.
  • bleeding comprising a step of administering the antibody according to any one of [1]-[6] or the composition according to any one of [7]-[13].
  • FIG. 1 is a view showing an insertion region of pcDNA4-g4H.
  • FIG. 2 is a view showing insertion regions of pcDNA4-g4L and pIND-g4L.
  • FIG. 3 is a view showing an insertion region of pIND-g4H.
  • Figure 4 shows the anti-F.IXa / anti-FX bispecific antibodies prepared using anti-F.IXa antibody XB12 and anti-FX antibodies SB04, SB21, SB42, SB38, SB30, SB07, SB05, SB06, and SB34.
  • the figure shows the results of measuring F.VIIIa-like activity.
  • the concentration of the antibody solution is 10 g / mL (final concentration 1 ⁇ g / mL).
  • bispecific antibodies showed an increase in F.VIIIa-like activity, XB12 / SB04, XB12 / SB21, XB12 / SB42, XB12 / SB38, XB12 / SB30, XB12 / SB07, XB12 / SB05, The activity was strong in the order of XB12 / SB06, XB12 / SB34.
  • FIG. 5 shows anti-F.IXa / anti-FX bispecific antibodies or anti-F.IXa / anti-FX antibodies prepared using anti-F.IXa antibody XT04 and anti-FX antibodies SB04, SB21, SB42, SB38, SB30, SB07, SB05, SB06, SB34.
  • FIG. 10 shows the results of measuring F.VIIIa-like activity of the XT04 antibody.
  • the concentration of the antibody solution is 10 g / mL (final concentration 1 ⁇ g / mL).
  • XT04 / SB04, XT04 / SB21, XT04 / SB42, XT04 / SB38, XT04 / SB30, XT04 / SB07, XT04 / SB05, XT04 / SB06, and XT04 / SB34 showed an increase in F.VIIIa-like activity.
  • FIG. 6 shows the results of measuring the F.VIIIa-like activity of XB12 / SB04 having the highest activity in FIG. 4 at various concentrations. As a result, XB12 / SB04 showed a concentration-dependent increase in F.VIIIa-like activity.
  • Figure 7 shows plasma coagulation time in the presence of XB12 / SB04, XB12 / SB21, XB12 / SB42, XB12 / SB38, XB12 / SB30, XB12 / SB07, XB12 / SB05, XB12 / SB06, and XB12 / SB34.
  • the results of measuring (APTT) are shown.
  • the concentration after mixing the antibody solution and F.VIII-deficient plasma is 1.7 ⁇ g / mL for XB12 / SB06, and 10 ⁇ g / mL for the others.
  • FIG. 8 shows plasma coagulation time in the presence of XT04 / SB04, XT04 / SB21, XT04 / SB42, XT04 / SB38, XT04 / SB30, XT04 / SB07, XT04 / SB05, XT04 / SB06, XT04 / SB34.
  • the result of measuring (APTT) is shown.
  • the concentration after mixing the antibody solution and F.VIII-deficient plasma is 5 ⁇ g / mL for XT04 / SB06, and 10 ⁇ g / mL for the others.
  • XT04 / SB04, XT04 / SB21, XT04 / SB42, XT04 / SB38, XT04 / SB30, XT04 / SB07, XT04 / SB05, XT04 / SB06 have a shorter coagulation time effect than in the absence of antibody. Indicated.
  • FIG. 9 shows the results of measuring the coagulation time at various concentrations for XB12 / SB04, which had the highest effect of shortening the coagulation time (APTT) in FIG. 7 and FIG. As a result,
  • XB12 / SB04 showed a coagulation time shortening effect in a concentration-dependent manner.
  • the antibody concentration in the figure represents the value after mixing the antibody solution and F.VIII-deficient plasma.
  • FIG. 10 shows the results of GST-AP western blotting of SB04 or SB06.
  • the transcribed GST-AP was reacted with SB04, 2 with SB06, and 3 with a sample containing no antibody.
  • a binding reaction with GST-AP was detected only in SB04.
  • FIG. 11 is a diagram showing a pELBGlacI vector.
  • ColElori ColEl-based plasmid replication initiation region
  • flori fl phage replication initiation region
  • lad ratatose repressor protein coding region
  • P ratatose promoter
  • pelBss E. coli PelB protein signal sequence
  • ScFv single-chain antibody molecule coding region
  • gene III fl phage Genelll protein coding region
  • Amp 1 " ampicillin resistance gene
  • Sfi I restriction enzyme Sfi I cleavage site.
  • Figure 12 shows anti-F.IXa antibodies (A19, A25, A31, A38, A39, A40, A41, A44, A50, A69, XB12) and anti-F.X antibodies
  • FIG. 13 shows anti-F.IXa antibodies (A19, A25, A31, A38, A39, A40, A41, A44, A50, A69, XB12) and anti-FX antibodies (B2, B5, B9, B10, B11). , B12, B13, B14, B15, B16, B18, B19, B20
  • FIG. 14 shows the results of measuring the coagulation time at various concentrations for A44 / B26, which had a high effect of shortening the coagulation time (APTT) in FIG.
  • the coagulation time without antibody addition is 113 seconds.
  • A44 / B26 showed a coagulation time shortening effect in a concentration-dependent manner
  • the antibody concentration in the figure indicates the value after mixing the antibody solution and F.VIII-deficient plasma.
  • FIG. 15 shows the results of measuring the coagulation time at various concentrations for A69 / B26, which had a high effect of shortening the coagulation time (APTT) in FIG.
  • the coagulation time without antibody addition is 109.6 seconds.
  • A69 / B26 showed a coagulation time shortening effect in a concentration-dependent manner.
  • the antibody concentration in the figure indicates the value after mixing the antibody solution and F.VIII-deficient plasma.
  • Figure 16 shows plasma coagulation time in the coexistence of A44 / B26 or XB12 / SB04 and F.VIII
  • FIG. 17 shows the results of measuring the clotting time (APTT) in inhibitor plasma in the presence of A44 / B26 or XB12 / SB04.
  • A44 / B26 or XB12 / SB04 showed an effect of shortening the coagulation time as compared with the absence of the antibody.
  • FIG. 18 shows the results of measuring the coagulation time at various concentrations for XB12 / SB04 and humanized XB12 / humanized SB04.
  • the coagulation time without antibody addition is 111.3 seconds.
  • Hitoi-Dani XB12 / Hitani-Dani SB04 showed the same effect of shortening the coagulation time as XB12 / SB04.
  • the antibody concentration in the figure indicates the value after mixing the antibody solution and F.VIII-deficient plasma.
  • BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION [0012]
  • the bispecific antibody (bispedfic antibody) in the present invention is a molecule comprising two types of antibodies or antibody fragments having specificities for different antigens. Bispecific antibodies are not particularly limited, but are preferably monoclonal.
  • the bispecific antibody of the present invention is preferably a recombinant antibody produced using a gene recombination technique.
  • a gene recombination technique for example, Borrebaeck CAK and Larrick JW, THER
  • Recombinant antibodies are produced by cloning the DNA encoding them into hybridomas or antibody-producing cells such as sensitized lymphocytes that produce the antibodies, incorporating them into an appropriate vector, and introducing them into a host. Can be obtained by
  • the antibody of the present invention may be an antibody fragment or a modified antibody thereof!
  • Antibody fragments include diabodies (diabodies; Db), linear antibodies, single-chain antibody (hereinafter also referred to as scFv) molecules, and the like.
  • Db diabodies
  • scFv single-chain antibody
  • the “Fv” fragment is the smallest antibody fragment and contains a complete antigen recognition and binding site.
  • the “FV” fragment contains one heavy (H) chain variable region (V) and one light (L)
  • V Chain variable region
  • CDRs complementarity determining regions
  • the Fab fragment (also called F (ab)) further contains a constant region of an L chain and a constant region (CH1) of an H chain.
  • Fab ′ fragments differ from Fab fragments by having additional few residues from the carboxy terminus of the heavy chain CH1 region including one or more cystine from the antibody hinge region.
  • Fab'-SH refers to Fab 'in which one or more cysteine residues in the constant region have a free thiol group.
  • F (ab ') fragment is digested with F (ab') pepsin
  • Diapod refers to a bivalent antibody fragment constructed by gene fusion. (Holliger P et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993), EP404,097, W093 / 11161, etc.).
  • a diabody is a dimer that is also composed of two polypeptide chain forces, each of which has an L chain variable region (V) and an H chain variable region (V) in the same chain.
  • V and V encoded on the same polypeptide chain are single-chain due to the short linker between them
  • the diapody will have two antigen binding sites.
  • the single-chain antibody or scFv antibody fragment contains the V and V regions of the antibody.
  • Fv polypeptides will additionally have V and
  • the linker in the present invention is not particularly limited as long as it does not inhibit the expression of the antibody variable regions linked to both ends thereof.
  • the IgG type bispecific antibody can be secreted by a hybrid hybridoma (quadroma) produced by fusing two hybridomas producing IgG antibodies (Milstein C et al. Nature 1983, 305: 537- 540).
  • secretion can be achieved by co-expressing the genes of the L chain and H chain constituting the two types of desired IgG by introducing the genes into a total of four genes.
  • Bispecific antibodies can also be prepared by cross-linking Fas in a strange manner. For example, Fab 'prepared from one antibody is maleimidated with 0-PDM (ortho-phenylenedi-maleimide), and the other antibody is reacted with the prepared Fa's. Cross-linking can produce bispecific F (a) (Keler T et al.
  • leucine zippers derived from Fos, Jun, and the like can be used.
  • Bispecific F (a) can be formed by mixing and reacting the monomer Fab'-Fos and Fab'-Jun reduced under mild conditions (Kostelny SA et al. J of
  • Bispecific antibodies can also be prepared in diapody.
  • the bispecific diabody is a heterodimer of two cross-over scFv fragments.
  • V (A) -V (B) produced by linking V and V derived from the two antibodies ⁇ , ⁇ with a relatively short linker of about 5 residues, This can be achieved by constructing a heterodimer using V (B) -V (A) (Holliger P et al.
  • sc (Fv) which can be produced by linking two types of scFvs with a flexible and relatively long linker of about 15 residues, can also be a bispecific antibody (Mallender WD et al. J of Biological
  • modified antibody examples include an antibody bound to various molecules such as polyethylene glycol (PEG).
  • PEG polyethylene glycol
  • the substance to be bound is not limited.
  • Such a modified antibody can be obtained by subjecting the obtained antibody to chemical modification.
  • the origin of the antibody of the present invention is not limited, such as a human antibody, a mouse antibody, and a rat antibody.
  • a target human antibody can be obtained by immunizing a transgenic animal having the entire repertoire of human antibody genes with a target antigen.
  • WO 93/12227 See International Patent Application Publication Nos. WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096, WO 96/33735.
  • a chimeric antibody is, for example, an antibody having the variable regions of the H chain and L chain of an antibody of an immunized animal and the constant region of the H chain and L chain of a human antibody.
  • a chimeric antibody can be obtained by ligating DNA encoding the variable region of an antibody derived from an immunized animal to DNA encoding the constant region of a human antibody, inserting the DNA into an expression vector, and introducing into a host to produce the antibody. it can.
  • a humanized antibody is a modified antibody also called a reshaped human antibody.
  • a humanized antibody is constructed by grafting the CDR of an antibody derived from an immunized animal into the complementarity determining region of a human antibody. Its general genetic recombination technique is also known. [0031] Specifically, a CDR of a mouse antibody and a framework region of a human antibody (framework region;
  • the DNA sequence designed to ligate FR is also synthesized by PCR using several oligonucleotides created to have overlapping portions at the ends.
  • the obtained DNA is ligated to DNA encoding the constant region of a human antibody, then inserted into an expression vector, and introduced into a host to produce it (European Patent Application Publication No. EP 239400, International Patent Application Publication No. WO 96/02576).
  • the human antibody FR linked via CDR is selected so that the complementarity-determining region forms a favorable antigen-binding site.
  • amino acids in the framework regions in the variable region of the antibody may be substituted so that the complementarity determining region of the reshaped human antibody forms an appropriate antigen-binding site (Sato K et al, Cancer Research 1993). , 53: 851-856). Further, it may be replaced with a framework region derived from various human antibodies (see International Patent Application Publication No. WO 99/51743).
  • the present invention provides a bispecific antibody that substitutes for the function of a cofactor that recognizes both an enzyme and a substrate for the enzyme.
  • the cofactor in the present invention is not particularly limited as long as it can act on the enzyme and enhance the enzyme reaction.
  • Examples of the cofactor in the present invention include a cofactor for a protease.
  • Specific examples of cofactors for proteolytic enzymes include cofactors (F.VIII / F.VIIIa, FV / F.Va, PZ, TM, TM / PS system) in blood coagulation / fibrinolysis-related factors, and complement reaction.
  • Cofactors (C4b, MCP, CR1, H factor) and the like can be mentioned.
  • the cofactor F.VIIIa enhances FX activation by F.IXa by binding to both F.IXa and FX.
  • Some of the bispecific antibodies that recognize both the enzyme RIXa and the substrate FX have an effect of enhancing the activity of FX. It is thought that some of these antibodies have a function to replace the function and function of cofactor F.VIII / F.VIIIa.
  • B Example 2 of cofactor in blood coagulation / fibrinolysis-related factors
  • the cofactor PZ enhances the F.Xa inhibitory activity of the ZPI by binding to the serpin family ZPI and the activated coagulation factor X (F.Xa). In other words, it is considered that among the bispecific antibodies that recognize both ZPI and F.X / F.Xa, those that have the function of substituting the function of PZ exist.
  • Cofactor TM enhances TAFI activation by thrombin. That is, it is considered that among the bispecific antibodies recognizing both thrombin and TAFI, those having an action of substituting the function of TM exist.
  • the TM / PS system enhances the activation of PC by thrombin.
  • some bispecific antibodies that recognize both thrombin and PC may substitute for the function of the TM / PS system.
  • the cofactor F.Va binds to both F.Xa and prothrombin, thereby promoting F.Xa Enhances the activity of rothrombin.
  • bispecific antibodies that recognize both the enzyme F.Xa and the substrate prothrombin, there are those that have an action of enhancing prothrombin activation. It is considered that some of these antibodies have an action that substitutes for the action function of the cofactor FV / F.Va.
  • C4b has the effect of promoting the decomposition of C2 by Cls. That is, it is considered that some bispecific antibodies that recognize both Cls and C2 substitute for the function of C4b.
  • M-P Complement Regulatory Factor H Membrane Cofactor Protein
  • Complement Regulatory Factor H, MCP and CRl have the effect of promoting C3b decomposition by Complement Regulatory Factor I. That is, it is considered that among the bispecific antibodies that recognize both Complement Regulatory Factor I and C3b, those that substitute for the functions of Complement Regulatory Factor H, MCP, and CRl exist.
  • F.VIII / F.VIIIa is particularly preferred.
  • F.VIII / F.VIIIa is subject to limited degradation by proteolytic enzymes such as thrombin, but in any form as long as it has F.VIII / F.VIIIa cofactor activity.
  • mutations of F.VIII / F.VIIIa and F.VIII / F.VIIIa artificially modified by genetic recombination technology are also available as long as they have the F.VIII / F.VIIIa cofactor activity. Included in F.VIII / F.VIIIa.
  • the method for obtaining the bispecific antibody alternative to the cofactor function of the present invention is not particularly limited, and may be obtained by any method.
  • bispecific antibodies that substitute for cofactor function for enzyme A and substrate B immunize animals with enzyme A and substrate B, respectively, Obtain antibodies and anti-substrate B antibodies.
  • a bispecific antibody containing the H chain and L chain of the anti-enzyme A antibody and the H chain and L chain of the anti-substrate B antibody is prepared.
  • a plurality of types of anti-enzyme A antibodies and anti-substrate B antibodies are obtained, respectively, and it is preferable to use as many combinations as possible to produce bispecific antibodies.
  • an antibody having a cofactor function-substituting activity is selected.
  • An antibody against an enzyme or a substrate can be obtained by a method known to those skilled in the art.
  • the antigen can be prepared by immunizing an immunized animal with an antigen.
  • Antigens that immunize animals include intact antigens that are immunogenic and incomplete antigens that are not immunogenic (including haptens).
  • an enzyme or a substrate which is considered to act as a cofactor by the cofactor function-substituting antibody of the present invention is used as the antigen (immunogen).
  • an animal to be immunized for example, a mouse, a rat, a mouse, a muster, a guinea pig, a rabbit, a rabbit, a monkey or the like can be used. Immunization of these animals with an antigen can be carried out by those skilled in the art by well-known methods.
  • variable regions of the L chain and the H chain of the immunized animal or the cell antibody of the animal are collected.
  • This operation can be performed by those skilled in the art using generally known techniques.
  • Animals immunized with an antigen express antibodies specifically to the antigen in spleen cells. Therefore, for example, mRNA can be prepared from spleen cells of an immunized animal, and the variable regions of the L and H chains can be recovered by RT-PCR using primers corresponding to the variable region of the animal.
  • an animal is immunized with each of an enzyme and a substrate.
  • the enzyme or substrate used as an immunogen may be the entire protein or a partial peptide of the protein.
  • an immunogen used for immunizing an animal an antigen that can be an antigen may be bound to another molecule to provide a soluble antigen, or a fragment thereof may be used in some cases.
  • Spleen strength of immunized mouse Splenocytes are isolated and fused with mouse myeloma cells to produce a hybridoma.
  • Hybridomas that bind to the antigen are selected, and the variable regions of the L and H chains can be recovered by RT-PCR using primers corresponding to the variable regions.
  • spleen cell mRNA of the immunized animal is extracted, and the cDNA of the L chain and H chain variable region is recovered by RT-PCR using primers corresponding to the vicinity of the variable region.
  • lymphocytes can be immunized in vitro.
  • a library displaying scFv or Fab is constructed.
  • the antigen-binding antibody clone is enriched and cloned by Panjung to obtain a variable region.
  • An antibody expression vector is prepared using the variable region.
  • a bispecific antibody can be obtained by introducing an anti-enzyme antibody expression vector and an anti-substrate antibody expression vector into the same cell and expressing the antibody.
  • Selection of an antibody having a cofactor function-substituting activity can be performed, for example, by the following method.
  • the enzyme is selected by using a reaction system containing the substrate and using the increase in the enzyme activity (substrate resolution) caused by adding the antibody as an index.
  • the obtained antibody can be purified to homogeneity.
  • the separation and purification of the antibody may be performed by the separation and purification methods used for ordinary proteins. For example, if appropriate selection and combination of chromatography columns, filters, ultrafiltration, salting-out, dialysis, SDS polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing, etc. (Ant3 ⁇ 4odies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Columns used for affinity chromatography include a protein A column and a protein G column.
  • the bispecific antibody of the present invention can be obtained, for example, when the alternative cofactor is F.VIII / F.VIIIa, that is, the combined power of an enzyme and a substrate.
  • the alternative cofactor is F.VIII / F.VIIIa
  • it preferably has a structure including a variable region in an anti-F.IXa antibody and a variable region in an anti-FX antibody.
  • the F.VIII / F.VIIIa function-substituted bispecific antibody of the present invention was prepared by the following method. Mice were immunized subcutaneously with commercially available F.IXa and F.X, respectively. Spleen strength of immunized mice with increased antibody titer Splenocytes were isolated and fused with mouse myeloma cells to produce hybridomas. Hybridomas that bind to the antigen (F.IXa, F.X) were selected, and the variable regions of the L and H chains were recovered by RT-PCR using primers corresponding to the variable regions.
  • the L chain variable region should be a C-containing L chain expression vector
  • the H chain variable region should be a H chain expression region containing a H chain constant region.
  • the measurement also includes F.XIa (F.IX-activating enzyme), a synthetic substrate of F.IX, FX, F.Xa (S-2222), and phospholipid power.
  • F.XIa F.IX-activating enzyme
  • the system was evaluated for its activity to replace F.VIII / F.VIIIa (a cofactor for FX activation by F.IXa).
  • F.VIII / F.VIIIa a cofactor for FX activation by F.IXa
  • the F.VIIIa-like activity referred to here is the change in the absorbance of the antibody solution or antibody-expressing culture supernatant for 30 or 60 minutes from the change in the absorbance of the solvent or antibody-free culture supernatant for 30 or 60 minutes. This is the value obtained by subtracting the value.
  • the coagulation recovery ability was measured using a coagulation time measurement system using F.VIII-deficient human plasma.
  • a bispecific antibody having a shorter clotting time than that when no antibody was added was obtained.
  • the clotting time is, as shown in Example 7, a value obtained by measuring the activated thrombus thromboplastin time using F.VIII-deficient human plasma.
  • a preferred bispecific antibody is 10 seconds or more, and a more preferred bispecific antibody is 20 seconds or more.
  • the bispecific antibody was more preferred than 40 seconds, and the bispecific antibody was capable of shortening the coagulation time of 50 seconds or more.
  • the H chain CDR3 of the antibody of the present invention is not particularly limited, but specifically, ⁇ 12, ⁇ 04, ⁇ 19, ⁇ 25, ⁇ 31, ⁇ 38, ⁇ 39, ⁇ 40, ⁇ 41, ⁇ 44, described in Examples described later. ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ 50 or ⁇ 69 ⁇ chain CDR3 sequence (SEQ ID NO: 16, 20, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92 or 96), the complementarity of amino acid sequence Having a decision region or a complementarity-determining region functionally equivalent thereto and having SB04, SB05, SB06, SB07, SB21, SB30, SB34, SB38, SB42, B2, B5, B9, B10, Bll, B12, H3 CDR3 sequence of B13, B14, B15, B16, B18, B19, B20, B21, B23, B25, B26, B27, B31, B34-1, B34-2, B35, B
  • the above-mentioned antibody of the present invention specifically includes, for example, ⁇ 12, ⁇ 04, ⁇ 19, ⁇ 25, ⁇ 31, ⁇ 38, ⁇ 39, ⁇ 40, ⁇ 41, ⁇ 44, ⁇ 50, or ⁇ 69 (SEQ ID NOS: 14-16, 18- 20, 58--60, 62-64, 66-68, 70-72, 74-76, 78-80, 82-84, 86-88, 90-92 or 94-96) Or having a complementarity-determining region consisting of any of the following amino acid sequences or a functionally equivalent complementarity-determining region: SB04, SB05, SB06, SB07, SB21, SB30, SB34, SB38, SB42, B2, B5, B9, B10, Bll, B12, B13, B14, B15, B16, B18, B19, B20, B21, B23, B25, B26, B27, B31, B34—1, B34
  • amino acid sequence of the light chain variable region of A44, B26, XB12, and SB04 according to the present invention is SEQ ID NO:
  • L chain CDR sequences of A44, B26, XB12, and SB04 are represented by SEQ ID NOs: 206-208, 210-212, 214-216, 218-220.
  • nucleotide sequences of the heavy chain CDRs of XB12, SB04, A44 and B26 are shown in SEQ ID NOs: 221 (222), 223 (224), 225 (226), 233 (234), 235 (236), 237 (238), 245 (246), 247 (248), 249 (250), 257 (258), 259 (260), 261 (262), L
  • the nucleotide sequences of the chain CDRs are represented by SEQ ID NOs: 227 (228), 229 (230), 231 (232), 239 (240), 241 (242), 243 (244), 251 (252), 253 (25 4 ), 255 (256), 263 (264), 265 (266), and 267 (268).
  • SEQ ID NO: 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 1 16, 120, 124, 128, 132, 136, 140, 144 , 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 226, 232, 238, 244, 250, 256, 262, 268 represent CDR3.
  • the antibody of the present invention is not particularly limited, but is preferably an antibody having the same or close epitopes as the above-mentioned antibodies, and includes bispecific antibodies in combination with an anti-Factor IXa antibody and an anti-Factor X antibody.
  • the antibody having the same or nearby epitope refers to, for example, an antibody whose binding is antagonized by competitive ELISA or the like.
  • the method of this competitive ELISA is not particularly limited, but Factor IX / IXa or Factor X is immobilized on a 96-well microwell plate, and the appropriately labeled antibody and the antibody to be evaluated are simultaneously added. The bound antibody is detected using the label.
  • the label is not particularly limited, and examples thereof include alkaline phosphatase label, peroxidase label, streptavidin-linked enzyme having a biotin label (such as alkaline phosphatase and peroxidase), and FITC.
  • Epitope overlap is present if there is at least 50% competition for the antibody at concentrations up to a 100,000-fold excess of the antibody to be evaluated.
  • the constant region is not particularly limited, and a constant region known to those skilled in the art can be used.
  • proteins of immunological interest (1991), Ub Department of Health and Human Services.Public Health Service National Institutes of Health, An efficient route to human bispecific IgG, (1998) .Nature Biotechnology vol. 16, 677-681, etc.
  • the constant region described in can be used.
  • the antibody of the present invention since the antibody of the present invention has an action of substituting the function of a cofactor, the antibody of the present invention can be used for a disease caused by reduced activity (function) of the cofactor. Therefore, it is expected to be an effective drug.
  • the cofactor that substitutes for the antibody of the present invention is a blood coagulation / fibrinolysis-related factor
  • examples of the disease include bleeding, diseases associated with bleeding, and diseases caused by bleeding.
  • F.VIII / F.VIIIa examples of the disease include bleeding, diseases associated with bleeding, and diseases caused by bleeding.
  • F.IX / F.IXa and F.XI / F.XIa is known to cause a bleeding disorder called hemophilia.
  • hemophilia a bleeding abnormality due to congenital F.VIII / F.VIIIa hypofunction or deficiency is called hemophilia A. If hemophilia A bleeds, F.VIII replacement therapy is given It is. Also, on the day of intense exercise or excursion, if joint bleeding occurs frequently, or if the patient is classified as severe hemophilia, prophylactic administration of an F.VIII preparation may be performed (Non-Patent Documents 1 and 2). 2). In recent years, this prophylactic administration of F.VIII preparations has become widespread in order to drastically reduce bleeding episodes in patients with hemophilia A.
  • the F.VIII preparation is administered intravenously.
  • an antibody against F.VIII called an inhibitor may develop in a hemophilia A patient, particularly in a severe hemophilia A patient. If an inhibitor develops, the potency of the F.VIII preparation will be hampered by the S inhibitor. As a result, hemostasis management for patients becomes very difficult.
  • bleeding disorders related to F.VIII / F.VIIIa include hemophilia, acquired hemophilia having anti-F.VIII autoantibodies, and abnormal or defective vWF function.
  • Vonville brand disease is known.
  • vWF forms a complex with F.VIII that is not only necessary for normal adhesion to the subendothelial tissue at the site of injury to the vascular wall, but also to maintain normal F.VIII levels in plasma. is necessary. In patients with von Willebrand disease, these functions are impaired, leading to abnormal hemostasis.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition containing the antibody of the present invention as an active ingredient.
  • the antibody of the present invention is an antibody that recognizes both F.IX or F.IXa and FX, and that substitutes for the function of F.VIIIa
  • the antibody can prevent bleeding and bleeding. It is expected to be a drug (pharmaceutical composition) or drug for the prevention or treatment of associated diseases or diseases caused by bleeding.
  • the antibody substitutes for the function of F.Va the antibody may be caused by bleeding, a disease involving bleeding, or bleeding. It is expected to be a drug (pharmaceutical composition) or drug for the prevention or treatment of the disease.
  • an antibody that binds to ZPI and FX and substitutes for the function of PZ is a drug (pharmaceutical composition) or drug having an antithrombotic action, or an antibody that binds to thrombin and TAFI to substitute for the function of TM.
  • the body is a drug (pharmaceutical composition) or drug that promotes hemostasis
  • an antibody that binds to thrombin and PC and replaces the function of the PS / TM system is a drug (pharmaceutical composition) or drug that has a coagulation regulating action It is expected.
  • an antibody that substitutes for the action of C4b is expected to be a drug (pharmaceutical composition) or drug having an SLE onset suppression effect. Is done. Since deficiency of factor H causes diarrhea infection and autoimmune glomerulonephritis, an antibody that substitutes for the action of factor H has a drug (pharmaceutical composition) or drug that has an action to suppress the onset of these diseases Is expected.
  • compositions containing the antibody of the present invention as an active ingredient and used for therapeutic or prophylactic purposes may, if necessary, contain suitable pharmaceutically acceptable carriers and media which are inactive against them. And can be formulated into a formulation. For example, sterile water or saline, stabilizers, excipients, antioxidants (ascorbic acid, etc.), buffers (phosphoric acid, citric acid, other organic acids, etc.), preservatives, surfactants (PEG , Tween, etc.), chelating agents (EDTA, etc.), binders and the like.
  • polypeptides such as serum albumin, gelatin and immunoglobulin, amino acids such as glycine, glutamine, asparagine, arginine and lysine, sugars such as polysaccharides and monosaccharides, carbohydrates, mannitol and sorbitol And the like.
  • aqueous solution for injection for example, physiological saline
  • isotonic solution containing glucose and other auxiliary agents for example, D-sorbitol, D-mannose, D -man-tol, sodium salt and sodium salt
  • auxiliary agents for example, D-sorbitol, D-mannose, D -man-tol, sodium salt and sodium salt
  • a suitable solubilizing agent such as alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, propylene glycol, PEG), and a nonionic surfactant (eg, polysorbate 80, HCO-50).
  • the antibody of the present invention may be encapsulated in microcapsules (microcapsules such as hydroxymethylcellulose, gelatin, polymethylmethacrylic acid), or may be used in a colloid drug delivery system (ribosome, albumin microsphere, microcapsule). Emulsions, nanoparticles, nanocapsules, etc.) (see “Remington's Pharmaceutical Science 16th edition", Oslo Ed. (1980), etc.).
  • a method for making a drug a sustained-release drug is also publicly available. And is applicable to the antibodies of the present invention (Langer et al., J. Biomed. Mater.Res. 15:
  • the antibody or pharmaceutical composition of the present invention can be used in combination with blood coagulation factor vm.
  • the antibody or the pharmaceutical composition of the present invention may be administered simultaneously with blood coagulation factor vm, or may be administered staggered.
  • the kit may be implemented as a kit in which the antibody or the pharmaceutical composition of the present invention is combined with blood coagulation factor VIII.
  • the dose of each can be reduced as desired, as compared with the case where any of them is used alone. .
  • the dose of the pharmaceutical composition of the present invention is ultimately determined by a physician in consideration of the type of dosage form, the administration method, the age and weight of the patient, the symptoms of the patient, the type of disease, and the degree of progress. Power that can be appropriately determined according to the judgment in general In general, for adults, 0.1 to 2000 mg per day can be administered in several divided doses. More preferably, it is 110 mg / day, even more preferably 50 to 500 mgZ days, most preferably 100 to 300 mgZ days. These dosages vary depending on the patient's body weight, age, administration method, and the like, but those skilled in the art can appropriately select appropriate dosages.
  • the administration period is also preferably determined appropriately according to the healing process of the patient.
  • the administration methods include direct administration using naked plasmid, and various methods such as retrovirus vector, adenovirus vector, vaccinia virus vector, box virus vector, adenovirus-related vector, HVJ vector, etc. It can be administered as a viral vector (see Adolph "Virus Genome Method", CRC Press, Florid (1996)), or coated on a bead carrier such as colloidal gold particles (WO93 / 17706, etc.).
  • the antibody may be administered by any method as long as the antibody is expressed in the living body while exerting the action and the action can be exerted.
  • injection, infusion, or gas-induced particle bombardment via a suitable non-transparent P route intravenous, intraperitoneal, subcutaneous, intradermal, adipose tissue, adipose tissue, (Electron gun Etc.), a method via a mucosal route such as a nasal drop, etc.
  • the present invention is achieved by ex vivo administration to blood cells and bone marrow-derived cells using ribosome transfection, particle bombardment (US Pat. No. 4,945,050), or viral infection, and reintroducing the cells into animals. May be administered.
  • any gene encoding the antibody of the present invention can be used, and examples thereof include the genes containing the nucleotide sequences of the aforementioned CDRs of XB12, SB04, A44 and B26.
  • the present invention also provides a method for preventing and / or treating bleeding, a disease associated with bleeding, or a disease caused by bleeding, comprising a step of administering the antibody or the composition of the present invention.
  • Administration of the antibody or the composition can be performed, for example, by the method described above.
  • the present invention also relates to the use of the antibody of the present invention for producing the (pharmaceutical) composition of the present invention.
  • the present invention further provides a kit for use in the above method, comprising at least the antibody or the composition of the present invention.
  • the kit may be packaged with a syringe, a needle, a pharmaceutically acceptable medium, an alcohol swab, an adhesive bandage, or instructions describing the method of use.
  • Factor IXa ⁇ emulsified with FIA Factor IXa ⁇ emulsified with FIA (Freund's incomplete adjunction (Difco laboratories)) was subcutaneously administered at 40 ⁇ g / head. Thereafter, booster immunizations were performed 3 to 7 times at weekly intervals. After confirming the increase in serum antibody titer against Factor IXa by ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay) shown in 1-2, Factor diluted in PBS (-) (phosphate buffered saline without calcium and magnesium ions) as final immunity IXa ⁇ was administered intravenously at 40 ⁇ g / head.
  • ELISA Enzyme linked immunosorbent assay
  • the spleen of the mouse was excised, a part of which was used in Example 10-2, and the remaining spleen cells and mouse myeloma cells P3X63Ag8U.l (P3Ul, ATCC CRL-1597) were added to PEG 1500
  • the cells were fused according to a conventional method using (Roche Diagnostics).
  • the fused cells suspended in RPMI1640 medium (Invitrogen) containing 10% FBS (Invitrogen) (hereinafter referred to as 10% FBS / RPMI1640) were seeded on a 96-well culture plate, and 1, 2, 3, and 5 days after fusion.
  • HAT selection medium (10% FBS / RPMI1640 / 2% HAT 50x concentrate (Dainippon Pharmaceutical) / 5%
  • hybridomas By substituting with BM-Condimed HI (Roche's Diagnostics), selective culture of hybridomas was performed. Using the culture supernatant collected on the 8th or 9th day after the fusion, the binding activity to Factor IXa was measured by the ELISA shown in 1-2 to select a hybridoma having Factor IXa binding activity. Subsequently, the neutralizing activity on the enzyme activity of Factor IXa was measured by the method described in 1-3, and a hybridoma having no neutralizing activity on Factor IXa was selected. The hybridomas were cloned by limiting dilution twice by inoculating one cell per well in a 96-well culture plate.
  • the cells confirmed to be a single colony by microscopic observation were subjected to ELISA and neutralization activity measurement shown in 1-2 and 1-3, and clones were selected. According to the method described in 1-4, ascites of the cloned antibody was prepared, and the antibody was purified from the ascites. It was confirmed by the method shown in 1-5 that the purified antibody did not prolong APTT (active thrombopartial thromboplastin time).
  • the plate was blocked with Tween (R) 20, 0.02% sodium azide) at room temperature for 2 hours. After removing the buffer, 100 ⁇ L / well of the mouse antiserum or hybridoma culture supernatant diluted with the diluent buffer was added to the plate and incubated at room temperature for 1 hour. After the plate was washed three times, 100 ⁇ l / well of alkaline phosphatase-labeled goat anti-mouse IgG (H + L) (Zymed Laboratories) diluted 1/2000 with a diluent buffer was added, and incubated at room temperature for 1 hour.
  • Phospholipid (Sigma-Aldrich) was dissolved in distilled water for injection and subjected to ultrasonic treatment to prepare a 400 g / mL phospholipid solution.
  • the ascites of the established hybridoma was prepared according to a conventional method.
  • 2 ⁇ 10 6 Ibridomas cultivated in vitro were bred into Pristane ( BALB / c mice to which 2,6,10,14-tetramethylpentadecane (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was intraperitoneally administered twice (male, 5-7 weeks old at the start of the experiment, Nippon Chillers' Riva-1)
  • BALB / c nude mice female, 5-6 weeks old at the start of the experiment, Nippon Chillers' Liver and Clea Japan
  • ascites was also collected from the mouse whose abdomen was enlarged.
  • APTT was measured by KClOA (Amelung) connected to CR-A (Amelung).
  • the coagulation reaction was started by adding ⁇ L to the same mixture, and the coagulation time was measured.
  • Factor X diluted in PBS (-) was intravenously administered at 20 or 40 ⁇ g / head as final immunity.
  • the spleen of the mouse was excised, a part of which was used in Example 10-2, and the remaining spleen cells and mouse myeloma cells P3U1 were subjected to a conventional method using PEG1500. Cells were fused according to the procedure described above.
  • the hybridoma cells were seeded in a 96-well culture plate and suspended in 10% FBS / RPMI1640 medium.After 1, 2, 3, and 5 days after the fusion, the hybridoma was selectively cultured by replacing with a HAT selection medium. . Using the culture supernatant collected on day 8 after the fusion, the binding activity to Factor X was measured by ELISA shown in 2-2. Hybridomas having Factor X binding activity were selected, and the neutralizing activity of Factor Xa on enzyme activity was measured by the method described in 2-3. Hybridomas without neutralizing activity against Factor Xa were cloned by performing two limiting dilutions. According to the method described in 1-4, ascites of the cloned antibody was prepared, and the antibody was purified from the ascites. It was confirmed by the method shown in 2-5 that the purified antibody did not extend APTT.
  • Factor X was dispensed into Nunc-Immuno plate at 100 ⁇ L / well and incubated at 4 ° C. After washing three times with PBS (-) containing Tween (R) 20, the plate was blocked with a diluent buffer at room temperature for 2 hours. After removing the Buffer, the plate was supplemented with mouse antiserum or hybridoma culture supernatant diluted with diluent buffer, and incubated at room temperature for 1 hour.
  • Substrate (Kirkegaad & Perry Laboratories) was added with 100 ⁇ L / well, and incubated at room temperature for 20 minutes. After adding 100 ⁇ L / well of Blue-Phos Stop Solution (Kirkegaad & Perry Laboratories), the absorbance at 595 nm was measured with Microplate Reader Model 3550 (Bio-Rad Laboratories).
  • TBCP (2.78 mM CaCl, 22.2 ⁇ M phospholipid containing 10 ⁇ L of the hybridoma culture supernatant diluted 1/5 with TBSB and 40 ⁇ L of 250 pg / mL Factor Xa (Enzyme Research Laboratories)
  • RNA was extracted according to the method of instructions described using QIAGEN (R) RNeasy (R) Mini Kit (QIAGEN). Total RNA was dissolved in 40 ⁇ L of sterile water. A single-stranded cDNA was synthesized by RT-PCR using 1-2 ⁇ g of the purified RNA in the form of ⁇ using a Superscript cDNA synthesis system (Invitrogen) according to the method described in the instruction manual.
  • PCR is a thermal cycler
  • condition A After heating at 98 ° C for 3 minutes, 98 ° C 20 seconds, 58 ° C 20 seconds, 72 ° C 32 cycles of a reaction consisting of 30 seconds as one cycle) or Condition B (heating at 94 ° C for 3 minutes, followed by a reaction of 94 ° C for 20 seconds, 46 ° C for 20 seconds, and 68 ° C for 30 seconds as one cycle) 5 cycles, and 30 cycles of a reaction consisting of 94 ° C for 20 seconds, 58 ° C for 20 seconds, and 72 ° C for 30 seconds). After PCR, the reaction solution was subjected to 1% agarose gel electrophoresis.
  • the amplified fragment of the desired size (about 400 bp) was purified using the QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN) according to the method described in the attached instruction manual, and eluted with sterile water 301. Use the BigDye Terminator and the Ycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) to determine the base sequence of each DNA fragment.Use the ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) with the DNA Determined according to the law. The sequence groups determined by this method were compared and analyzed using the analysis software GENETYX-SV / RC Version 6.1 (Genetyx), and those having different sequences were selected.
  • the following operation was performed in order to add a restriction enzyme SfiI cleavage site for cloning to both ends of the amplified fragment of the antibody variable region.
  • PCR was carried out using a thermal cycler GeneAmp PCR system 9700 (Parkin Elmer) according to the efficiency of fragment amplification according to condition A (heating at 98 ° C for 3 minutes, 98 ° C for 20 seconds, and 58 ° C for 20 seconds.
  • the amplified fragment of the target size (about 400 bp) was purified using a QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN) according to the method described in the attached instruction manual, and eluted with 30 ⁇ L of sterile water.
  • QIAGEN QIAquick Gel Extraction Kit
  • DNA polymerase KODplus 0.75 units DNA polymerase KODplus (Toyobo) was prepared. PCR was performed using a thermal cycler GeneAmp PCR system 9700 (Parkin Elmer), after heating at 94 ° C for 3 minutes, 94 ° C for 20 seconds, 46 ° C for 20 seconds, and 68 ° C according to the efficiency of fragment amplification. 5 cycles of a reaction consisting of 30 seconds per 1 cycle, and 1 cycle of a reaction consisting of 94 ° C 20 seconds, 58 ° C 20 seconds, and 72 ° C 30 seconds The cycle was performed under the condition of 30 cycles. After PCR, the reaction solution was subjected to 1% agarose gel electrophoresis.
  • the amplified fragment of the target size (about 400 bp) was purified using a QIAqucick Gel Extractio Kit (QIAGEN) according to the method described in the attached instruction manual, and eluted with 30 L of sterile water.
  • the fragment has a (Gly4Ser) 3-linker sequence derived from the primer LF added to its C-terminal.
  • the (Gly4Ser) 3-linker sequence of primer LF was changed to a sequence having an SfiI cleavage site (SEQ ID NO: 6) (primer VL -3 'end).
  • PCR was performed at 94 ° C for 3 minutes using a thermal cycler GeneAmp PCR system 9700 (Parkin Elmer), followed by one cycle of a reaction consisting of 94 ° C for 20 seconds, 46 ° C for 20 seconds, and 68 ° C for 30 seconds. The reaction was performed under the conditions of 5 cycles, and a cycle of 94 ° C for 20 seconds, 58 ° C for 20 seconds, and 72 ° C for 30 seconds as one cycle. After PCR, the reaction solution was subjected to 1% agarose gel electrophoresis. Amplified fragment of desired size (approx. 400 bp) with QIAquick Gel
  • HL molecule one arm of each specific antibody molecule (referred to as HL molecule) is expressed separately, and corresponding to each HL molecule in order to efficiently produce the target bispecific IgG antibody in the cell.
  • the expression vector used was a different drug with an inducing force of S.
  • the tetracycline-inducible vector p C DNA4 (Invitrogen) was used for the respective regions of the H chain! (Fig. 2), that is, an appropriate mouse antibody variable region (VH or VL) and a human HgG4 ya constant region downstream of the animal cell signal sequence (IL3ss) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984; 81: 1075).
  • IL3ss animal cell signal sequence
  • pcDNA4 was digested with restriction sites Eco RV and Not 1 (Takara Bio) present in the multicloning site.
  • a chimeric bispecific antibody having an appropriate antibody variable region, a right arm H chain and an L chain expression unit (each about 1.6 kb to about 1.0 kb, respectively) were digested with Xho1 (Takara Bio), and then QIAquick
  • the product was purified using the PCR Purification Kit (QIAGEN) according to the method described in the attached manual, and allowed to react with DNA polymerase KOD (Toyobo) in the reaction solution composition described in the attached manual at 72 ° C for 10 minutes to blunt the ends. .
  • the blunt-ended fragment was purified using the QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN) according to the method described in the attached instruction manual, and digested with Not 1 (Takara Bio).
  • the Not I-blunt fragment (each about 1.6 kb to 1.0 kb) and pcDNA4 digested with the Eco RV-Not I were ligated using Ligation High (Toyobo) according to the method described in the attached instruction manual.
  • Escherichia coli DH5 ⁇ strain (Competent high DH5a (Toyobo)) was transformed with the reaction solution. Plasmid DNA was isolated from each of the ampicillin metastatic clones using QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN).
  • the other arm (referred to as the left arm HL molecule for the sake of convenience) is connected to the etadysone analog-inducible vector pIND (Invitrogen) by each of the H or L chains ( Figures 2 and 3), ie, the signal for animal cells.
  • pIND etadysone analog-inducible vector
  • Figures 2 and 3 the signal for animal cells.
  • a suitable mouse antibody variable region (VH or VL) and a human IgG4 yb constant region (SEQ ID NO: 9) downstream of the sequence (IL3ss) (EMBO. J. 1987; 6: 2939) (SEQ ID NO: 8) were incorporated (pIND-g4H! And pIND-g4L) according to the method described above, and each plasmid DNA was isolated.
  • 3-5 Construction of bispecific antibody expression vector
  • the tetracycline-inducible expression plasmid (PCDNA4-g4H or pcDNA4-g4L) prepared in 3-4 was digested with SfiI, and the reaction solution was subjected to 1% agarose gel electrophoresis. Using the QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN), a fragment (about 5 kb) from which the antibody variable region portion (VH and VL (see FIGS. 1 and 2)) was originally removed was used. Purified by the method described in the attached manual, and eluted with 30 L of sterilized water.
  • PCR was performed at 96 ° C for 1 minute using a thermal cycler GeneAmp PCR system 9700 (Parkin Elmer), followed by one cycle of a reaction consisting of 96 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 10 seconds, and 72 ° C for 30 seconds. The reaction was performed under the conditions of 30 cycles of reaction. After PCR, subject the reaction solution to 1% agarose gel electrophoresis, The clone from which the amplified fragment was obtained was selected. The PCR product was subjected to excess primer and inactivation of dNTPs using ExoSAP-IT (Amersham Biosciences) according to the attached instructions.
  • the nucleotide sequence of each DNA fragment was determined using a BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) and a DNA sequencer ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) according to the method described in the attached manual.
  • the sequence groups determined by this method are analyzed with the analysis software GENETYX-SV / RC Version 6.1 (Genetyx), and the target clone containing no insertion / deletion mutation for VH and the hybridoma for VL are used.
  • the target clone was selected, which had insertion deletion mutations and the like and had a V ⁇ .
  • Plasmid DNAs were isolated from the target clones using the QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN), and dissolved in 100 L of sterilized water.
  • Anti-F.IXa antibody chimeric H chain expression vector, anti-F.IXa antibody chimeric L chain expression vector, anti-FX antibody chimeric H chain expression vector, and anti-FX antibody chimeric L chain expression vector respectively, pcDNA4-g4IXaHn, pcDNA4-g4IXaLn , PIND-g4XHn and pIND-g4XLn. Each plasmid solution was stored at 4 ° C until use.
  • Antibody right arm HL molecule expression vectors (pcDNA4-g4IXaHn and pcDNA4-g4IXaLn) are induced by tetracycline. In the absence of tetracycline, plasmid pcDNA6 / TR (Invitrogen) encoding the Tet repressor is required to completely suppress expression under certain circumstances.
  • the expression of the HL molecule expression vector (pIND_g4XHn and PIND-g4XLn) for the left arm of the antibody is induced by an etadysone analog (ponasterone A), which is an insect hormone.
  • a plasmid pVgRXR (Invitrogen) encoding an etadysone receptor which reacts with and induces bonasterone A and a retinoid X receptor is required. Accordingly, a total of six types of plasmid DNA mixtures were prepared for transfection of animal cells. For 1 mL of cell culture, 218.8 ng each of pcDNA4-g4IXaHn, pcDNA4-g4IXaLn, pIND-g4XHn and pIND-g4XLn, and 1312.5 ng each of pcDNA6 / TR and pVgRXR were used.
  • CHO-S-SFM-II medium After washing with CHO-S-SFM-II medium, add 1 mL CHO-S-SFM-II medium containing 5 ⁇ of ponasterone A (Invitrogen), and incubate in a CO incubator (37 ° C
  • the secondary expression of the HL molecule on the left arm of the antibody was induced, and the bispecific IgG antibody was secreted into the medium.
  • the culture supernatant was collected, centrifuged (approximately 2000 g, 5 min, room temperature) to remove the cells, was concentrated as necessary by Microcon (R) YM- 50 (Millipore ). The samples were stored at 4 ° C until use.
  • the F.VIIIa-like activity of the bispecific antibody was evaluated using the following enzyme assay. The following reactions were all performed at room temperature. A mixture of 40 ⁇ L of 3.75 ⁇ g / mL Factor IX (Enzyme Research Laboratories) and 10 ⁇ L of the antibody solution was incubated in a 96-well plate for 1 hour. Furthermore, 10 ng / mL of Factor XIa (Enzyme Research Laboratories) 10 ⁇ L, 50 ⁇ g / mL of Factor X (Enzyme Research Laboratories) 20 ⁇ L, 400 ⁇ g / mL of phospholipid (Example) TBSB containing 5 L, 5 mM CaCl and ImM MgCl
  • the enzyme reaction was started by adding 15 / zL. After reacting for 30 minutes, the reaction was stopped by adding 10 ⁇ L of 0.5 M EDTA.
  • the absorbance at 405 nm (reference wavelength 655 nm) at 0 and 30 minutes was measured using a Model 3550 Microplate Reader (Bio Rad Loboratories).
  • the F.VIIIa-like activity was represented by the value obtained by subtracting the change in absorbance for 30 minutes without the antibody from the change in absorbance for 30 minutes with the addition of the antibody (see FIGS. 4 and 5).
  • the solvent for Phospholipid was TBSB, and the solvent for Factor XIa, Factor IX, and Factor X was TBSB-S.
  • the chromogenic substrate solution is a 1: 1 mixture of test team chromogenic substrate S-2222 (Chromogenix) and polybrene solution (0.6 mg / L hexadimethrine bromide (Sigma;)) dissolved according to the attached instructions.
  • the suspension was suspended in 10 mM HC1, pH 2.0 containing 0.01% Tween (R) 20, and allowed to stand for 3 minutes, after which the antibody was eluted. Immediately, 5 ⁇ L of 1 M Tris-HCl, pH 8.0 was used to neutralize the mixture. Using a Microplate Manager III (Bio-Rad Laboretories) software, the concentration of human HgG in the culture supernatant of the standard calibration curve was calculated. The antibody concentration was determined according to Example 5.
  • a recombinant Escherichia coli expressing a fusion protein (GST-AP) of F.X activating peptide (AP) and glutathione S-transferase (GST) was constructed.
  • a cDNA covering the full-length translation region of human FX is amplified by PCR from human liver Marathon-Ready cDNA (Clontech), and this is further transformed into a type II to encode the AP region (Leytus et al., Biochemistry 1986; 25: 5098).
  • the region to be amplified was amplified by PCR and subcloned into a pGEM-T vector (Promega) to obtain pGEX-F10AP encoding GST-AP.
  • the culture was centrifuged (3,000 xg, 30 minutes, 4 ° C), and the cells were collected and stored at -20 ° C until use.
  • SDS-PAGE sample buffer (IWAKI) was prepared at 2.4 mL and boiled at 95 ° C for 5 minutes. 10 ⁇ L of the reaction solution was added to each gel of SDS-PAGE mini (14%) gel (Asahi Techno Glass), and electrophoresis was performed. The gel after electrophoresis was transferred to Immobilon-P TM Transfer Membrane (MILLIPORE) using a semi-dry blotter (BIO-RAD), and BT-PBS (2% BSA And 0.05% Tween (R) 20 in PBS). After blocking was completed, the anti-FX mouse antibody SB04 or SB06 purified in Example 14 was reacted with BT-PBS diluted to 2 ⁇ g / mL for 1 hour.
  • Example 10 Obtaining bispecific antibody from scFv library derived from immunized mouse spleen 10-1. Antigen and immunity
  • mice Male, 6 weeks old at the start of immunization, Nippon Charles Riva
  • MRL / lpr mice male, 6 weeks old at the start of immunization, 3 Nippon Charles Riva
  • C57BL / 6N mice Male, 6 weeks old at the start of immunization, Nippon Charles' Liver
  • FCA complete Freund's adjuvant H37 Ra (Difco laboratories)
  • FIA Complete Freund's adjuvant (Incomplete Freund's adjuvant (Difco laboratories)
  • primers for amplifying mouse antibody heavy chain variable region (VH) and light chain variable region (VL) cDNAs a mixture of HB primer and HF primer used in Examples 3-2 and 3-3 were used.
  • the LB ply mixture and the LF ply mixture were prepared.
  • the reaction solution 50 i u L cDNA solution 2.5 ⁇ 1 KOD plus buffer (TOYOBO), 0.2 mM dNTPs, 1.5 mM MgCl, 3.75 units DNA polymerase KOD plus (Toyobo) was prepared.
  • TOYOBO cDNA solution 2.5 ⁇ 1 KOD plus buffer
  • TOYOBO 0.2 mM dNTPs
  • 1.5 mM MgCl 3.75 units DNA polymerase KOD plus
  • reaction mixture 50 L having the same composition as described above was prepared.
  • PCR was performed using a SalCycler GeneAmp PCR system 9700 (Parkin Elmer), followed by calorific heat at 98 ° C for 3 minutes, followed by 98 ° C for 20 seconds, 58 ° C for 20 seconds, and 72 ° C for 30 seconds. 32 cycles were performed. After PCR, the reaction solution was subjected to 2% agarose gel electrophoresis.
  • the amplified fragment of the target size (about 400 bp) was purified using the QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN) according to the method described in the attached instruction manual, and eluted with sterile water 501.
  • QIAGEN QIAquick Gel Extraction Kit
  • 100 ⁇ L of the reaction solution VH fragment solution 3 ⁇ 1 VL fragment solution 3 ⁇ 1 KOD plus buffer (Toyobo), 0.2 mM dNTPs, ImM MgCl, 5 units DNA polymerase KOD plus ( Toyobo)
  • the reaction solution was purified using QIAquick PCR purification kit (QIAGEN), and the purified product was digested with restriction enzyme Sfi 1 (Takara Bio) at 50 ° C overnight.
  • Sfi 1 restriction enzyme Sfi 1
  • the amplified fragment of the desired size (approximately 800 bp) is purified using the QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN) by the method described in the attached instruction manual, and is diluted with an appropriate amount of sterile water. Eluted.
  • pELBGlad was used as a phagemid vector.
  • the digested fragment of the desired size (about 5 kb) was attached using the QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN). Purified by the method described in this manual and eluted with an appropriate amount of sterilized water. The purified PCR product and the purified vector fragment were subjected to a ligation reaction at 16 ° C overnight using Ligation High (Toyobo) according to the method described in the attached instruction manual.
  • Otsuki easy bacteria XLlblue electrocompetent cell (Stratagene) or Elect-mouth Mac DH12s (Invitrogen) was transformed by electroporation according to the method described in the attached instruction manual. All the obtained ampicillin-resistant transformants were collected and stored at -20 ° C until used as a recombinant E. coli library.
  • the E. coli library (2 x 10 9 cfo) was inoculated into 50 mL 2xYTAG (100 ⁇ g / mL ampicillin, 2% containing 2% glucose) at 37 ° C until OD 600 0.4-0.5.
  • the culture supernatant was collected by centrifugation, mixed with 100 mL PEG-NaCl solution (10% polyethylene glycol 8000, 2.5 mol / L NaCl), and allowed to stand at 4 ° C for 60 minutes.
  • the phage was precipitated by centrifugation at 10,800 ⁇ g for 30 minutes, the precipitate was suspended in 40 mL of water, mixed with 8 mL of PEG-NaCl solution, and allowed to stand at 4 ° C. for 1 hour.
  • the phage was precipitated by centrifugation at 10,800 X g for 30 minutes and suspended in 5 mL PBS to obtain a phage library. The phage was stored at 4 ° C until use.
  • a phage library (801 / well ⁇ 5) incubated with 2.5% w / v skim milk for 15 minutes was added and allowed to contact with the antigen for 60 minutes.
  • the antigen-binding phage was washed several times with 1 mL of PBST (PBS containing 0.1% Tween-20), and then washed with PBS.
  • the phage was eluted by incubating with 0.8 mL of 0.1 mol / L glycine / HCl (pH 2.2) for 5 minutes.
  • the cells were resuspended in 2 ⁇ YTAK 100 mL and cultured at 30 ° C. for 10 hours.
  • the culture supernatant was collected by centrifugation, mixed with 20 mL of 10% PEG-5mol / L NaCl solution, and allowed to stand at 4 ° C for 20 minutes.
  • the phage was precipitated by centrifugation at 10,800 xg for 30 minutes, and suspended in 2 mL of PBS for the next panjung.
  • the single colony described above was inoculated into 100 L 2 ⁇ YTAG and cultured at 30 ° C. Inoculate 5 ⁇ L of this into 500 ⁇ L 2xYTAG, culture at 37 ° C for 5 hours, add helper phage 2 x 10 8 pfo, allow to stand at 37 ° C for 30 minutes, and further at 37 ° C for 30 minutes After the stirring culture, 120 L of 2 ⁇ YTAK containing 0.5 mM IPTG was added. The cells were cultured at 30 ° C, and the centrifuged supernatant was subjected to ELISA.
  • StreptaWell 96 microtiter plates (Roche) coated with 1.0 g / mL biotin-labeled antigen were used for ELISA of clones obtained in Panjung with biotin-labeled antigen.
  • an imnoplate (MaxiSorp, Nunc) immobilized with 1.0 ⁇ g / mL native antigen was used for ELISA of clones obtained by native antigen Panjung.
  • an imnoplate MaxiSorp, Nunc
  • blocking was performed with 200 L of 2% M-PBS or 2% BSA-PBS (PBS containing 2% w / v BSA) as a blocking buffer for 1 hour at room temperature.
  • the buffer was removed, and the culture supernatant was added thereto and allowed to stand for 60 minutes to bind the phage. After washing, bound phages were detected with HRP-conjugated anti-M13 antibody (Amersham Pharmacia Biotech) diluted with blocking buffer and TMB substrate (Zymed), and the reaction was performed by adding lmol / LHSO.
  • Recombinant Escherichia coli 2xYTAG culture solution of clones that were positive in ELISA also showed primers PBG3-F1 (5'-CAGCTATGAAATACCTATTGCC-3'Z SEQ ID NO: 1) and PBG3-R1 (5'-CTTTTCATAATCAAAATCACCGG -3 '/ SEQ ID NO: : ScFv by PCR using 2) The region was amplified and its nucleotide sequence was determined.
  • PCR reaction solution containing 1 L of culture solution, 1.5 ⁇ L of 10X KOD Dash buffer, 0.2 ⁇ L of 10 ⁇ mol / L primer, and 0.3 ⁇ L of KOD Dash polymerase (Toyobo, 2.5 U / ⁇ L) 15 ⁇ L L was amplified in a thermal cycler GeneAmp PCR system 9700 (Perkin Elmer) at 96 ° C, 10 seconds, 55 ° C, 10 seconds, 72 ° C, 30 seconds, 30 cycles. After PCR, add 3 ⁇ L of ExoSAP-IT (Amersham) to 5 ⁇ L of the reaction mixture, and continue at 80 at 37 ° C for 15 minutes. C, incubated for 15 minutes.
  • PBG3-F2 (5, -ATTGCCTACGGCAGCCGCT-3'Z SEQ ID NO: 3) is available! /, BigDye Terminator using PBG3-R2 (5'-AAATCACCGGGAACCAGAGCC-3'Z SEQ ID NO: 4) as a primer and ycle Sequencing kit (Applied Biosystems; [I]), electrophoresed on an Applied Biosystems PRISM 3700 DNA Sequencer. 52 clones of anti-Factor IXa and 52 clones of anti-Factor X Thirty-three clones were selected.
  • the antibody variable regions (VH, VL) were cloned into an inducible expression vector by the same method shown in Examples 3-3, 3-4, and 3-5.
  • Anti-F.IXa antibody variable regions (VH and VL) were incorporated into tetracycline-inducible vectors (pcDNA4-g4H and pcDNA4-g4L, respectively).
  • Anti-F.X antibody variable regions (VH and VL) were derived from etadysone analog-inducible vectors (pIND-g4H and
  • Plasmid DNA was isolated from each target clone using QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN) and dissolved in 100 L of sterilized water.
  • the DNA solution was expressed in animal cells in the same manner as described in Examples 42 and 43, and the culture supernatant was recovered.
  • the samples were stored at 4 ° C until use.
  • the concentration of human HgG in the culture supernatant was calculated from the calibration curve of human IgG4 (humanized anti-TF antibody, see WO 99/51743).
  • the antibody concentration was determined according to Example 5.
  • the F.VIIIa-like activity of the bispecific antibody was evaluated using the following enzyme assay. In addition, all of the following anti-J spirits are performed at the highest temperature. 10 ⁇ L of Factor IX (Enzyme Research Laboratories) at 15 ⁇ g / mL, 5 ⁇ L of TBSB containing 100 mM CaCl and 20 mM MgCl, and the method described in Example 10-7
  • the mixture of 50 ⁇ L of the culture supernatant obtained in step 1 was incubated in a 96-well plate for 1 hour. Further, 10 ng / mL of Factor XIa (Enzyme Research Laboratories) 10 ⁇ L, 50 ⁇ g / mL of Factor X (Enzyme Research Laboratories) 20 ⁇ L and 400 ⁇ g / mL of phospholipid 5 L were added to the mixture. Cultivation was performed to start the enzyme reaction. After reacting for 30 minutes, the reaction was stopped by adding 10 L of 0.5 M EDTA.
  • TBSB was used as a solvent for Phospholipid, Factor XIa, Factor IX, and Factor X.
  • Chromogenic substrate solution was prepared according to the instructions provided. ⁇ Dissolved test team chromogenic substrate S-2222 (
  • Chromogenix and 1: 1 mixture of polybrene II '(0.6 mg / L hexadimethrine bromide (Sigma)).
  • Example 11 To determine whether the bispecific antibody prepared according to the method of Example 11 restores the clotting ability of blood of hemophilia A, the activity of F.VIII-deficient plasma was compared with that of activated ligated partial thromboplastin time (APTT). The effect of this antibody was evaluated in the same manner as described in Example 7 ( Figure 1). 3). Furthermore, concentration dependence was measured for A44 / B26 and A69 / B26, which had a high effect of shortening the coagulation time (see FIGS. 14 and 15).
  • the effect of the bispecific IgG antibody on the inhibitor plasma was evaluated under the following plasma clotting conditions.
  • a mixture of 10 ⁇ L of 100 ⁇ g / mL anti-human F.VIII neutralizing antibody (Catalog Number: MAB3440, CHEMICON) was incubated in 50 ⁇ L of F.VIII-deficient plasma (Biomerieux) at room temperature for 30 minutes. This plasma was used as inhibitor plasma.
  • 40 ⁇ L of a 25 ⁇ g / mL antibody solution and 50 ⁇ L of an APTT reagent (Dade Behring) were added, and the mixture was heated at 37 ° C. for 3 minutes.
  • Example 17 Among the bispecific antibodies obtained in Example 7, the most effective in shortening the blood coagulation time was XB12 (mouse anti-FactorXa antibody) / SB04 (mouse anti-FactorX antibody). Humanization was performed as follows.
  • SB04-L chain variable region EMBL Accession No. AB064111 (IMGT Database)
  • Humanized antibodies were prepared by transplanting the complementarity determining regions (hereinafter, CDRs) of each mouse antibody into the FRs of the human antibodies (l)-(4).
  • nlm.nih.gov/BLAST/ a secretory signal sequence of a human antibody having high homology to the human antibodies (1) to (4) was searched. The following secretion signal sequences obtained by the search were used.
  • the reaction solution was subjected to 1% agarose gel electrophoresis.
  • the DNA fragment of the desired size (about 400 bp) was purified using the QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN) according to the method described in the attached instruction, and eluted with sterile water 301.
  • tetracycline inducible expression plasmid prepared in Example 3- 4 (pcDNA4- g4H, pcDNA4- g4L ) and Egudaison analogues inducible expression plasmid (pIND- g4H, P IND-g4L ) digested with Xhol and Sfil After that, the fragment containing the antibody constant region (about 5 kb) was purified using a QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN) according to the method described in the attached instruction manual, and eluted with sterile water 301.
  • QIAquick Gel Extraction Kit QIAquick Gel Extraction Kit
  • VH humanized XB12 antibody gene fragment
  • VL L chain variable region
  • pcDNA4-g4H, pcDNA4- g4L Xhol and Sfil digested tetracycline-inducible expression plasmids
  • the antibody against APTT was evaluated using F.VIII-deficient plasma according to the method of Example 7. The effects were considered. Amino acids in human antibody FR were modified to increase the activity of humanized-species-specific antibodies with reduced blood coagulation ability. In addition, the cysteine residue of CDR3 of the XB12 antibody VH, which is feared to decrease thermal stability, was also changed to an alanine residue. Specifically, a mutation was introduced into a humanized antibody expression vector using the QuikCnange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) by the method described in the attached instruction manual.
  • QuikCnange Site-Directed Mutagenesis Kit Stratagene
  • a human iris-specific antibody having the same activity as XB12 / SB04 humanized XB12 antibody (VH: hXB12f-A, VL: hXBVL) / human iris)
  • the SB04 antibody VH: hSB04e, VL: hSBVL-F31 was obtained (FIG. 18).
  • the present invention provides a bispecific antibody that recognizes both an enzyme and a substrate of the enzyme, and that substitutes for the function of a cofactor that enhances enzyme activity.
  • the bispecific antibody of the present invention has high stability in blood and low antigenicity, and is expected to be a drug.

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Abstract

　血液凝固第IX因子/活性化血液凝固第IX因子及び血液凝固第X因子の双方に結合し、酵素反応を増強させる血液凝固第VIII因子/活性化血液凝固第VIII因子の作用を代替する二種特異性抗体を作製することに成功した。

Description

明 細 書
機能蛋白質を代替する二種特異性抗体
技術分野
[0001] 本発明は、酵素反応を増強する補因子の作用を代替する二種特異性抗体、およ び該抗体を有効成分として含有する医薬組成物に関する。
背景技術
[0002] 抗体は血中での安定性が高ぐ抗原性も低いことから医薬品として注目されている 。その中には二種類の抗原を同時に認識できる二種特異性抗体がある。二種特異 性抗体は提唱されて久しい。しかしながらこれまでに、 NK細胞、マクロファージ、 T細 胞の retargetingを目的とするなど、二種類の抗原を単に繋ぐだけの抗体しか報告さ れていない (非特許文献 7参照)。例えば、臨床試験が行なわれている MDX-210は、 Fc y RIを発現して 、る monocyte等を HER- 2/neuを発現して 、る癌細胞に retargeting する二種特異性抗体であるに過ぎない。従って現在まで、二種特異性抗体を、酵素 反応を増強する補因子の代替手段として利用した例はな力つた。
[0003] 補因子としては、例えば、組織因子 (TF)、血液凝固第 V因子 (F.V)、活性化血液 凝固第 V因子 (F.va)、血液凝固第 vm因子 (F.vm)、活性ィ匕血液凝固第 vm因子（
F.VIIIa)、トロンボモデュリン（TM)、プロテイン S (PS)、プロテイン Z(PZ)、へパリン、補 体 C4b、補体制御タンパク H因子（Complement Regulatory Factor H)、 Membrane Cofactor Protein (MCP)、 Complement Receptor 1 (CR1)等が挙げられる。
[0004] これらのうち、 F.VIII/F.VIIIaは、十分な活性化血液凝固第 IX因子 (F.IXa)の活性発 現に必要な補因子である。 Scheiflinger Fらは、ある種の抗 F.IX/F.IXa抗体に、 chromogenic assayにお!/、て F.IXaによる血液凝固第 X因子 (F.X)活性化を促進する作 用があることを見出している（特許文献 1参照)。し力しながら、 F.VIII欠乏血漿の凝固 回復能測定においては、この抗体単独による凝固回復能は示されておらず、外来的 に F.IXaを添加した状態でのみ凝固回復能を示している。
[0005] F.VIIIaは、 F.IXaと相互作用するだけでなく F.Xとも相互作用することが知られている
(非特許文献 5および 6参照）。この点で、 Scheiflinger Fらの抗体は、 F.VIII/F.VIIIaの 機能を十分に代替しているといえず、その活性も不十分であると推測される。
[0006] 本発明者らは、鋭意研究の結果、酵素活性を増強する補因子の作用を代替する二 種特異性抗体の作製に成功し、本発明に至った。
[0007] 特許文献 1 :国際公開第 01/19992号
特許文献 2 :米国特許第 4， 474,893号公報
特許文献 3： EP404，097号
特許文献 4 :国際公開第 93/11161号
特許文献 5：特願 2002-112369号公報
特許文献 6：特願 2003-012648号公報
特許文献 7：特開平 5-304992号公報
特許文献 8：特開平 2-145187号公報
特許文献 9：特開平 5-213775号公報
特許文献 10：特開平 10-165184号公報
特許文献 11：特開平 11-71288号公報
特許文献 12：特表 2002-518041号公報
特許文献 13：特表平 11-506310号公報
特許文献 14 :特開平 5-199894号公報
特許文献 15 :特表平 10-511085号公報
特許文献 16：特開平 5-184383号公報
非特許文献 l : Nilsson IMら著、「J. Intern. Med.」、 1992年、 Vol.235, p.25-32 非特許文献 2 : Lofqvist Tら著、「J. Intern. Med.」、 1997年、 Vol.241、 p.395-400 Cfe 記「Lofqvist T」の「o」はウムラウトがっく文字である）
非特許文献 3 :第 24回日本血栓止血学会学術集会学術専門部会血友病標準化検 討部会ミニシンポジウム、 2001年、 http://www.jsth.org
非特許文献 4 : Medical Bulletin #193 1994
非特許文献 5 : Mertens Kら著、「Thromb. Haemost.」、 1999年、 Vol.82, p.209-217 非特許文献 6 : Lapan KAら著、「Thromb. Haemost.」、 1998年、 Vol.80, p.418-422 非特許文献 7 : Segal DMら著、「Journal of Immunological Methods] , 2001年、 Vol.248, p.1-6
非特許文献 8:Bos Rおよび Nieuwenhuitzen W著、「Hybridoma」、 1992年、 Vol.11, No.l、 p.41-51
非特許文献 9:Brennan Mら著、「Science」、 198δ年、 Vol.229, No.1708, p.81- 3 非特許文献 10:Karpovsky Bら著、「J. Exp. Med.」、 1984年、 Vol.160, No.6、 p.1686 - 701
非特許文献 ll:Suresh MRら著、「Methods Enzymol.」、 1986年、 Vol.l21、 p.210-28 非特許文献 12: Massimo YSら著、「J. Immunol. Methods] , 1997年、 Vol.201, p.57-66
非特許文献 13:Brennan Mら著、「Science」、 1985年、 Vol.229, p.81
非特許文献 14:Shalaby MRら著、「J. Exp. Med.」、 1992年、 Vol.175, p.217-25 非特許文献 15:Holliner Pら著、「Proc. Natl. Acad. Sci. USA」、 1993年、 Vol.90, p.
6444-8
非特許文献 16:Ridgway JBら著、「Protein Eng. J, 1996年、 Vol.9, p.617-21 非特許文献 17:Hammerling Uら著、「J. Exp. Med.」、 1968年、 Vol.128, p.1461-73 非特許文献 18:KurokawaTら著、「Bio/Technology」、 1989年、 Vol.7、 p.1163 非特許文献 19: Link BKら著、「Blood」、 1993年、 Vol.81、 p.3343
非特許文献 20:Nitta Tら著、「Lancet」、 1990年、 Vol.335, p.368-71
特許文献 21 :deLeij Lら著、「Foundation Nationale de Translusion Sanguine, Les
Ulis France] , 1990年、 p.249- 53
非特許文献 22: Le Doussal JMら著、「J. Nucl. Med.」、 1993年、 Vol.34, p.1662-71 非特許文献 23:Stickney DRら著、「Cancer Res. J, 1991年、 Vol.5 K p.6650- 5 非特許文献 24:Weiner LMら著、「Cancer Res.」、 1993年、 Vol.53, p.94- 100 非特許文献 25:Kroesen BJら著、「Br. J. Cancer」、 1994年、 Vol.70, p.652-61 非特許文献 26:Weiner GJら著、「J. Immunol.」、 1994年、 Vol.152, p.2385
非特許文献 27:Suresh MRら著、「Pro Natl. Acad. Sci. USA」、 1986年、 Vol.83, p.7989 - 93
非特許文献 28:Milstein Cおよび Cuello AC著、「Nature」、 1983年、 Vol.305, p.537 非特許文献 29 :Xiang Jら著、「Mol. Immunol.」、 1990年、 Vol.27, p.809 非特許文献 30 : Bebbington CRら著、「Bio/Technology」、 1992年、 Vol.10, p. 169 非特許文献 31 : Huse WDら著、「Science」、 1989年、 Vol. 246、 p.1275
非特許文献 SS McCafferty Jら著、「Nature」、 1990年、 Vol.348、 p.552
非特許文献 33 : Kang ASら著、「Proc. Natl. Acad. Sci. USA」、 1991年、 Vol.88, p.
4363
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0008] 本発明は、酵素反応を増強する補因子の機能を代替する二種特異性抗体の提供 を課題とする。
課題を解決するための手段
[0009] 本発明者らは鋭意研究を行った結果、 F.IX/F.IXa及び F.Xの双方に特異的に結合 し、 F. Villaの補因子作用、すなわち F.IXaによる F.X活性ィ匕を促進する作用を代替す る二種特異性抗体を見出すことに成功した。即ち、本発明者らは、酵素および該酵 素の基質の両者を認識し、該酵素の補因子の機能を代替し得る二種特異性抗体の 作製に成功した。
[0010] 即ち本発明は、酵素反応を増強する補因子の機能を代替する二種特異性抗体に 関し、より具体的には、
〔1〕 酵素、および該酵素の基質の両方を認識する抗体であって、酵素反応を増強 する補因子の機能を代替する二種特異性抗体、
〔2〕 酵素が蛋白質分解酵素である、〔1〕に記載の抗体、
〔3〕 蛋白質分解酵素、基質ならびに補因子が血液凝固線溶関連因子である、〔2〕 に記載の抗体、
〔4〕 血液凝固線溶関連因子の酵素が血液凝固第 IX因子および/または活性ィ匕血 液凝固第 IX因子で、基質が血液凝固第 X因子で、補因子が血液凝固第 VIII因子お よび/または活性ィ匕血液凝固第 VIII因子である、〔3〕に記載の抗体、
〔5〕 抗血液凝固第 IX/IXa因子抗体における下記（al)もしくは（a2)の CDR3のァミノ 酸配列からなる相補性決定領域またはこれと機能的に同等の相補性決定領域と、抗 血液凝固第 X因子抗体における下記 (bl)—（b9)のいずれかに記載の CDR3のアミ ノ酸配列からなる相補性決定領域またはこれと機能的に同等の相補性決定領域とを 含む、〔1〕一〔4〕のいずれかに記載の抗体、
(&1) 11鎖じ01^3が配列番号： 16に ：記載のアミノ酸配列
(a2) H鎖 CDR3が配列番号： 20に ：記載のアミノ酸配列
0)1) 11鎖じ01^3が配列番号： : 24に ：記載のアミ ：ノ酸配列
(b2) H鎖 CDR3が配列番号： : 28に ：記載のアミ ：ノ酸配列
(b3) H鎖 CDR3が配列番号： : 32に ：記載のアミ ：ノ酸配列
(b4) H鎖 CDR3が配列番号： : 36に ：記載のアミ ：ノ酸配列
(b5) H鎖 CDR3が配列番号： :40に ：記載のアミ ：ノ酸配列
(b6) H鎖 CDR3が配列番号： :44に ：記載のアミ ：ノ酸配列
(b7) H鎖 CDR3が配列番号： :48に ：記載のアミ ：ノ酸配列
(b8) H鎖 CDR3が配列番号： : 52に ：記載のアミ ：ノ酸配列
(b9) H鎖 CDR3が配列番号： : 56に ：記載のアミ ：ノ酸配列
〔6〕 抗血液凝固第 IX/IXa因子抗体における下記（al)もしくは（a2)の CDRのァミノ 酸配列からなる相補性決定領域またはこれと機能的に同等の相補性決定領域と、抗 血液凝固第 X因子抗体における下記 (bl)—（b9)のいずれかに記載の CDRのァミノ 酸配列からなる相補性決定領域またはこれと機能的に同等の相補性決定領域とを 含む、〔1〕一〔4〕のいずれかに記載の抗体、
(al) H鎖 CDR1, 2, 3が配列番号: 14、 15、 16に記載のアミノ酸配列
(a2) H鎖 CDR1, 2, 3が配列番号: 18、 19、 20に記載のアミノ酸配列
(bl) H鎖 CDR1, 2, 3が配列番号: : 22、 23、 24に記載のアミノ酸配列
(b2) H鎖 CDR1, 2, 3が配列番号: : 26、 27、 28に記載のアミノ酸配列
(b3) H鎖 CDR1, 2, 3が配列番号: : 30、 31、 32に記載のアミノ酸配列
(b4) H鎖 CDR1, 2, 3が配列番号: : 34、 35、 36に記載のアミノ酸配列
(b5) H鎖 CDR1, 2, 3が配列番号: : 38、 39、 40に記載のアミノ酸配列
(b6) H鎖 CDR1, 2, 3が配列番号: :42、 43、 44に記載のアミノ酸配列
(b7) H鎖 CDR1, 2, 3が配列番号: :46、 47、 48に記載のアミノ酸配列 (b8) H鎖 CDR1, 2, 3が配列番号： 50、 51、 52に記載のアミノ酸配列
(b9) H鎖 CDR1, 2, 3が配列番号： 54、 55、 56に記載のアミノ酸配列
〔7〕 〔1〕一〔6〕のいずれかに記載の抗体および薬学的に許容される担体を含む組 成物、
〔8〕 出血、出血を伴う疾患、もしくは出血に起因する疾患の予防および/または治療 に用いられる医薬組成物である、〔7〕に記載の組成物、
〔9〕 出血、出血を伴う疾患、もしくは出血に起因する疾患力 血液凝固第 VIII因子 および/または活性ィ匕血液凝固第 VIII因子の活性の低下ないし欠損によって発症お よび/または進展する疾患である、〔8〕に記載の組成物、
〔10〕 血液凝固第 VIII因子および/または活性ィ匕血液凝固第 VIII因子の活性の低下 ないし欠損によって発症および/または進展する疾患力 血友病 Αである、〔9〕に記 載の組成物、
〔11〕 血液凝固第 VIII因子および/または活性ィ匕血液凝固第 VIII因子の活性の低下 ないし欠損によって発症および/または進展する疾患力 血液凝固第 VIII因子および /または活性ィ匕血液凝固第 VIII因子に対するインヒビターが出現している疾患である 、〔9〕に記載の組成物、
〔12〕 血液凝固第 VIII因子および/または活性ィ匕血液凝固第 VIII因子の活性の低下 ないし欠損によって発症および/または進展する疾患力 後天性血友病である、〔9〕 に記載の組成物、
〔13〕 血液凝固第 VIII因子および/または活性ィ匕血液凝固第 VIII因子の活性の低下 によって発症および/または進展する疾患力 フォンビルブランド病である、〔9〕に記 載の組成物、
〔14〕 〔1〕一〔6〕のいずれかに記載の抗体、または〔7〕一〔13〕のいずれかに記載の 組成物を投与する工程を含む、出血、出血を伴う疾患、もしくは出血に起因する疾患 を予防および/または治療する方法、
〔15〕 〔1〕一〔6〕のいずれかに記載の抗体の、〔7〕一〔13〕のいずれかに記載した組 成物の製造のための使用、
〔16〕 少なくとも〔1〕一〔6〕のいずれかに記載の抗体、または〔7〕に記載の組成物を 含む、〔14〕に記載の予防および/または治療する方法に用いるためのキット、 〔17〕 〔4〕一〔6〕のいずれかに記載の抗体、または〔7〕一〔13〕のいずれかに記載の 組成物を投与する工程を含む、出血、出血を伴う疾患、もしくは出血に起因する疾患 を、血液凝固第 VIII因子と併用して、予防および/または治療する方法、
〔18〕 少なくとも〔4〕一〔6〕のいずれかに記載の抗体、または〔7〕に記載の組成物を 含み、かつ血液凝固第 VIII因子を含む〔17〕に記載の予防および/または治療する方 法に用いるためのキット、を提供するものである。
図面の簡単な説明
[図 1]図 1は pcDNA4- g4Hの挿入領域を表した図である。
[図 2]図 2は pcDNA4-g4Lおよび pIND- g4Lの挿入領域を表した図である。
[図 3]図 3は pIND-g4Hの挿入領域を表した図である。
[図 4]図 4は抗 F.IXa抗体 XB12と抗 F.X抗体 SB04、 SB21、 SB42、 SB38、 SB30、 SB07、 SB05、 SB06、 SB34により作製した抗 F.IXa/抗 F.X二種特異性抗体の、 F.VIIIa様活性 を測定した結果を示している。抗体溶液の濃度は 10 g/mL (最終濃度 1 μ g/mL)であ る。結果、 9種の二種特異性抗体で F.VIIIa様活性の上昇を示し、 XB12/SB04, X B12/SB21, XB12/SB42, XB12/SB38, XB12/SB30, XB12/SB07, XB12/SB05, XB12/SB06, XB12/SB34の順に活性が強かった。
[図 5]図 5は抗 F.IXa抗体 XT04と抗 F.X抗体 SB04、 SB21、 SB42、 SB38、 SB30、 SB07、 SB05、 SB06、 SB34により作製した抗 F.IXa/抗 F.X二種特異性抗体または XT04抗体 の、 F.VIIIa様活性を測定した結果を示している。抗体溶液の濃度は 10 g/mL (最終 濃度 1 μ g/mL)である。結果、 XT04/SB04、 XT04/SB21, XT04/SB42, XT04/SB38, XT04/SB30, XT04/SB07, XT04/SB05, XT04/SB06, XT04/SB34は F.VIIIa様活性 の上昇を示した。
[図 6]図 6は、図 4の中で最も活性の高かった XB12/SB04について、様々な濃度での F.VIIIa様活性を測定した結果を示している。結果、 XB12/SB04は濃度依存的に F.VIIIa様活性の上昇を示した。
[図 7]図 7は XB12/SB04、 XB12/SB21, XB12/SB42, XB12/SB38、 XB12/SB30、 XB12/SB07, XB12/SB05、 XB12/SB06、 XB12/SB34存在下での、血漿凝固時間 (APTT)を測定した結果を示して ヽる。抗体溶液と F.VIII欠乏血漿を混合後の濃度は XB12/SB06に関しては 1.7 μ g/mL、それ以外は 10 μ g/mLである。結果、 XB12/SB04 、 XB12/SB21, XB12/SB42, XB12/SB38, XB12/SB30, XB12/SB07, XB12/SB05, XB12/SB06, XB12/SB34は、抗体非存在下と比較して、凝固時間の短縮効果を示し た。
[図 8]図 8は XT04/SB04、 XT04/SB21, XT04/SB42, XT04/SB38, XT04/SB30, XT04/SB07, XT04/SB05, XT04/SB06, XT04/SB34存在下での、血漿凝固時間 (APTT)を測定した結果を示して 、る。抗体溶液と F.VIII欠乏血漿を混合後の濃度は XT04/SB06に関しては 5 μ g/mL,それ以外は 10 μ g/mLである。結果、 XT04/SB04、 XT04/SB21, XT04/SB42, XT04/SB38, XT04/SB30, XT04/SB07, XT04/SB05, XT04/SB06は、抗体非存在下と比較して、凝固時間の短縮効果を示した。
XT04/SB34は凝固時間の短縮は認められなかった。
[図 9]図 9は図 7、図 8の中で最も凝固時間 (APTT)の短縮効果の高かった XB12/SB04 について、様々な濃度での凝固時間を測定した結果を示している。結果、
XB12/SB04は濃度依存的に凝固時間の短縮効果を示した。図中の抗体濃度は抗体 溶液と F. VIII欠乏血漿を混合後の数値を表す。
[図 10]図 10は SB04または SB06の GST-APウェスタンブロッテイングの結果を示してい る。転写された GST-APに対し、 1は SB04、 2は SB06、 3は抗体を含まないサンプルと 反応させたものである。結果、 SB04のみ GST-APとの結合反応が検出された。
[図 11]図 11は pELBGlacIベクターを表した図である。 ColElori: ColEl系プラスミド複 製開始領域、 flori: flファージ複製開始領域、 lad:ラタトースリプレッサータンパク質 コード領域、 P ：ラタトースプロモーター、 pelBss:大腸菌 PelBタンパクシグナル配列
lac
、 scFv:一本鎖抗体分子コード領域、 gene III: flファージ Genelllタンパク質コード領 域、 Amp1":アンピシリン耐性遺伝子。 Sfi I：制限酵素 Sfi I切断部位。
[図 12]図 12は抗 F.IXa抗体 (A19,A25,A31,A38,A39,A40,A41,A44,A50,A69,XB12)と 抗 F.X抗体
(B2,B5,B9,B10,B11,B12,B13,B14,B15,B16,B18,B19,B20,B21,B23,B25,B26,B27,B3 1,B34-1,B34-2,B35,B36,B38,B42,SB04,SB15,SB27)とを組み合わせて発現させた二 種特異性抗体の培養上清を用いて F.VIIIa様活性を測定した結果を示す。 +は F.VIIIa様活性が 0.1以上である場合を表す。
[図 13]図 13は、抗 F.IXa抗体 (A19,A25,A31,A38,A39,A40,A41,A44,A50,A69,XB12) と抗 F.X抗体 (B2,B5,B9,B10,B11,B12,B13,B14,B15 ,B16,B18,B19,B20
,B21,B23,B25,B26 ,B27,B31,B34- 1,B34- 2,B35,B36,B38,B42,SB04,SB15,SB27)とを 組み合わせて発現させた二種特異性抗体の精製物を用いて血漿凝固アツセィを行 つた結果を示す。抗体無添カ卩時と比較し、抗体添カ卩時の凝固時間の短縮が 10秒一 20秒を +、 20秒一 40秒を + +、 40秒一 50秒を + + +、そして 50秒以上を + + + +で 表す。
[図 14]図 14は図 13の中で凝固時間 (APTT)の短縮効果の高かった A44/B26につい て、様々な濃度での凝固時間を測定した結果が示されている。抗体無添加時の凝固 時間は 113秒である。結果、 A44/B26は濃度依存的に凝固時間の短縮効果を示した
。図中の抗体濃度は抗体溶液と F.VIII欠乏血漿を混合後の数値を表す。
[図 15]図 15は図 13の中で凝固時間 (APTT)の短縮効果の高かった A69/B26につい て、様々な濃度での凝固時間を測定した結果が示されている。抗体無添加時の凝固 時間は 109.6秒である。結果、 A69/B26は濃度依存的に凝固時間の短縮効果を示し た。図中の抗体濃度は抗体溶液と F.VIII欠乏血漿を混合後の数値を表す。
[図 16]図 16は A44/B26または XB12/SB04と F.VIIIの共存下での、血漿凝固時間
(APTT)を測定した結果を示している。結果、 A44/B26または XB12/SB04と F.VIIIの混 合溶液は、 F.VIII単独と比較して、凝固時間の短縮効果を示した。
[図 17]図 17は A44/B26または XB12/SB04存在下での、インヒビター血漿における凝 固時間 (APTT)を測定した結果を示している。結果、 A44/B26または XB12/SB04は抗 体非存在下と比較して、凝固時間の短縮効果を示した。
[図 18]図 18は XB12/SB04とヒト化 XB12/ヒト化 SB04について、様々な濃度での凝固 時間を測定した結果を示している。抗体無添加時の凝固時間は 111.3秒である。測 定の結果、ヒトイ匕 XB12/ヒトイ匕 SB04は XB12/SB04と同程度の凝固時間の短縮効果を 示した。図中の抗体濃度は抗体溶液と F.VIII欠乏血漿を混合後の数値を表す。 発明を実施するための最良の形態 [0012] 本発明における二種特異性抗体 (bispedfic抗体）は、異なる抗原に対して特異性を 有する 2種類の抗体もしくは抗体断片力 なる分子である。二種特異性抗体は特に 制限されな 、が、モノクローナルであることが好まし 、。
[0013] 本発明の二種特異性抗体は、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型抗 体であることが好ましい。（例えば、 Borrebaeck CAK and Larrick JW, THER
APEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990参照）。組換え型抗体は、それをコードする DNAをハイプリドーマ、または抗体を産生する感作リンパ球等の抗体産生細胞力 ク ローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることによ り得ることがでさる。
[0014] さらに、本発明における抗体は、その抗体断片や抗体修飾物であってよ!、。抗体断 片としては、ダイァボディ (diabody;Db)、線状抗体、一本鎖抗体 (以下、 scFvとも記載 する)分子などが含まれる。ここで、 「Fv」断片は最小の抗体断片であり、完全な抗原 認識部位と結合部位を含む。「FV」断片は 1つの重 (H)鎖可変領域 (V )および軽 (L)
H
鎖可変領域 (V )が非共有結合により強く連結されたダイマー (V -Vダイマー)であ
L H L
る。各可変領域の 3つの相補鎖決定領域（complementarity determining region ;CDR )が相互作用し、 V -Vダイマーの表面に抗原結合部位を形成する。 6つの CDRが抗
H L
体に抗原結合部位を付与している。し力しながら、 1つの可変領域 (または、抗原に特 異的な 3つの CDRのみを含む Fvの半分)であっても、全結合部位よりも親和性は低い 力 抗原を認識し、結合する能力を有する。
[0015] また、 Fab断片（F(ab)とも呼ばれる）はさらに、 L鎖の定常領域および H鎖の定常領 域 (CH1)を含む。 Fab'断片は、抗体のヒンジ領域からの 1またはそれ以上のシスティ ンを含む H鎖 CH1領域のカルボキシ末端由来の数残基を付加的に有する点で Fab断 片と異なっている。 Fab'-SHとは、定常領域の 1またはそれ以上のシスティン残基が遊 離のチオール基を有する Fab'を示すものである。 F(ab')断片は、 F(ab')ペプシン消化
2
物のヒンジ部のシスティンにおけるジスルフイド結合の切断により製造される。化学的 に結合されたその他の抗体断片も当業者には知られて ヽる。
[0016] ダイアポディは、遺伝子融合により構築された二価 (bivalent)の抗体断片を指す (Holliger P et al, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90: 6444-6448 (1993)、 EP404,097号、 W093/11161号等)。ダイァボディは、 2本のポリペプチド鎖力も構成されるダイマーで あり、ポリペプチド鎖は各々、同じ鎖中で L鎖可変領域 (V )及び H鎖可変領域 (V )が、
L H
互いに結合できない位に短い、例えば、 5残基程度のリンカ一により結合されている。 同一ポリペプチド鎖上にコードされる Vと Vとは、その間のリンカ一が短いため単鎖
L H
可変領域フラグメントを形成することが出来ず二量体を形成するため、ダイアポディ は 2つの抗原結合部位を有することとなる。
[0017] 一本鎖抗体または scFv抗体断片には、抗体の Vおよび V領域が含まれ、これらの
H L
領域は単一のポリペプチド鎖中に存在する。一般に、 Fvポリペプチドはさらに Vおよ
H
び V領域の間にポリペプチドリンカ一を含んでおり、これにより scFvは、抗原結合の し
ために必要な構造を形成することができる（scFvの総説については、 Pluckthun『The Pharmacology of Monoclonal Antibodies』Vol. l丄《3 (Rosenourg ana Moore ed
(Springer Verlag, New York) pp.269- 315, 1994)を参照）。本発明におけるリンカ一は 、その両端に連結された抗体可変領域の発現を阻害するものでなければ特に限定さ れない。
[0018] IgGタイプ二種特異性抗体は IgG抗体を産生するハイプリドーマ二種を融合すること によって生じる hybrid hybridoma(quadroma)によって分泌させることが出来る（Milstein C et al. Nature 1983, 305: 537-540)。また目的の二種の IgGを構成する L鎖及び H 鎖の遺伝子、合計 4種の遺伝子を細胞に導入することによって共発現させることによ つて分泌させることが出来る。
[0019] しかし、これらの方法で産生される IgGの H鎖と L鎖の組合せは理論上 10通りにもな る。 10種類の IgGから目的の組み合わせの H鎖 L鎖力もなる IgGを精製することは困難 である。さらに目的の組み合わせのものの分泌量も理論上著しく低下するため、大き な培養規模が必要になり、製造上のコストはさらに増大する。
[0020] この際 H鎖の CH3領域に適当なアミノ酸置換を施すことによって H鎖についてへテ 口な組合せの IgGを優先的に分泌させることも出来る（Ridgway JB et al. Protein Engineering 1996, 9: 617 - 621、 Merchant AM et al. Nature Biotechnology 1998, 16: 677-681) o [0021] また、 L鎖に関しては、 H鎖可変領域に比べて L鎖可変領域の多様性が低いことか ら、両 H鎖に結合能を与え得る共通の L鎖が得られることが期待される。この共通 L鎖 と両 H鎖遺伝子を細胞に導入することによって IgGを発現させることで効率の良い二 種特異性 IgGの発現が可能となる (Nature Biotechnology. 1998, 16, 677-681)。しかし 任意に 2種の抗体を選んだ場合、同じ L鎖を含む可能性は低く上記のアイデアを実 行することは困難であり、任意の異なる H鎖に対応し高い結合能を示す共通 L鎖を選 択する方法も提案されている (WO2004/065611)。上記変異 (Nature Biotechnology. 1998, 16, 677-681) CH3を有する H鎖は、相手側の H鎖が存在しない場合ほとんど分 泌されない。この特徴を利用してまず右腕の L鎖と H鎖を誘導発現させ、これを止め た後、左腕の L鎖と H鎖を誘導発現させることによって目的の組み合わせの IgGの発 現比率を高めることが出来る（PCT/JP2004/008585)。
Fa をィ匕学的に架橋することによつても二種特異性抗体を作製し得る。例えば一 方の抗体から調製した Fab 'を 0- PDM(ortho- phenylenedi- maleimide)にてマレイミド化 し、これともう一方の抗体力 調製した Fa を反応させることにより、異なる抗体由来 Fab'同士を架橋させ二種特異性 F(a ）を作製することが出来る（Keler T et al.
2
Cancer Research 1997, 57: 4008-4014)。また Fa -チォ-トロ安息香酸 (TNB)誘導 体と Fab ' -チオール (SH)等の抗体断片をィ匕学的に結合する方法も知られて!/ヽる ( Brennan M et al. Science 1985, 229: 8ト 83)。
[0022] 化学架橋の代りに Fos, Junなどに由来するロイシンジッパーを用いることも出来る。
Fos, Junはホモダイマーも形成する力 ヘテロダイマーを優先的に形成することを利 用する。 Fosロイシンジッパーを付カ卩した Fa と Junのそれを付カ卩したもう一方の Fa を発現調製する。温和な条件で還元した単量体 Fab ' -Fos, Fab ' -Junを混合し反応さ せることによって二種特異性 F(a ）が形成できる（Kostelny SA et al. J of
2
Immunology, 1992, 148: 1547-53)。この方法は Fa には限定されず、 scFv, Fvなど にお 、ても応用可能である。
[0023] ダイアポディにおいても二種特異性抗体を作製し得る。二種特異性ダイァボディは 二つの cross- over scFv断片のへテロダイマーである。つまり二種の抗体 Α,Β由来の V と Vを 5残基前後の比較的短いリンカ一で結ぶことによって作製された V (A)-V (B), V (B)-V (A)を用いてヘテロダイマーを構成することによって出来る（Holliger P et al.
H L
Proc of the National Academy of Sciences of the USA 1993, 90: 6444—6448)。
[0024] この際、二種の scFvを 15残基程度の柔軟な比較的長いリンカ一で結ぶ (一本鎖ダイ ァボディ： Kipriyanov SM et al. J of Molecular Biology. 1999, 293: 41—56)、適当なァ ミノ酸置換 (knobs- into- holes: Zhu Z et al. Protein Science. 1997, 6: 781- 788)を行う こと〖こよって目的の構成を促進させることも出来る。
[0025] 二種の scFvを 15残基程度の柔軟な比較的長いリンカ一で結ぶことによって作製で きる sc(Fv)も二種特異性抗体となり得る（Mallender WD et al. J of Biological
2
Chemistry, 1994, 269: 199-206)。
[0026] 抗体修飾物としては、例えば、ポリエチレングリコール (PEG)等の各種分子と結合し た抗体を挙げることができる。本発明の抗体修飾物においては、結合される物質は 限定されない。このような抗体修飾物を得るには、得られた抗体に化学的な修飾を施 すことによって得ることができる。これらの方法はこの分野にぉ 、て既に確立されて！ヽ る。
[0027] 本発明の抗体は、ヒト抗体、マウス抗体、ラット抗体など、その由来は限定されない。
またキメラ抗体やヒト化抗体などの遺伝子改変抗体でもよい。
[0028] ヒト抗体の取得方法は既に知られており、例えば、ヒト抗体遺伝子の全てのレパート リーを有するトランスジエニック動物を目的の抗原で免疫することで目的のヒト抗体を 取得することができる（国際特許出願公開番号 WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096, WO 96/33735参照）。
[0029] 遺伝子改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。具体的には、たと えばキメラ抗体は、免疫動物の抗体の H鎖、および L鎖の可変領域と、ヒト抗体の H鎖 および L鎖の定常領域力 なる抗体である。免疫動物由来の抗体の可変領域をコー ドする DNAを、ヒト抗体の定常領域をコードする DNAと連結し、これを発現ベクターに 組み込んで宿主に導入し産生させることによって、キメラ抗体を得ることができる。
[0030] ヒト化抗体は、再構成 (reshaped)ヒト抗体とも称される改変抗体である。ヒト化抗体は 、免疫動物由来の抗体の CDRを、ヒト抗体の相補性決定領域へ移植することによつ て構築される。その一般的な遺伝子組換え手法も知られて 、る。 [0031] 具体的には、マウス抗体の CDRとヒト抗体のフレームワーク領域（framework region;
FR)を連結するように設計した DNA配列を、末端部にオーバーラップする部分を有す るように作製した数個のオリゴヌクレオチド力も PCR法により合成する。得られた DNA を、ヒト抗体定常領域をコードする DNAと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで 、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号 EP 239400、国際特許出願公開番号 WO 96/02576参照)。 CDRを介して連結されるヒト 抗体の FRは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される 。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成する ように抗体の可変領域におけるフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよ ヽ（Sato K et al, Cancer Research 1993, 53: 851-856)。また、様々なヒト抗体由来のフレーム ワーク領域に置換してもよい（国際特許出願公開番号 WO 99/51743参照)。
[0032] 本発明は、酵素および該酵素の基質の両方を認識するような補因子の機能を代替 する二種特異性抗体を提供する。
[0033] 本発明における補因子は、酵素に作用し酵素反応を増強し得るものであれば特に 制限されない。本発明における補因子としては、例えば、蛋白質分解酵素の補因子 を挙げることができる。蛋白質分解酵素の補因子の具体例としては、血液凝固線溶 関連因子における補因子（F.VIII/F.VIIIa、 F.V/F.Va、 PZ、 TM、 TM/PSシステム）や 補体反応の補因子 (C4b、 MCP、 CR1、 H因子)等を挙げることができる。
[0034] 本発明における酵素、および該酵素の基質、および該酵素の補因子の具体例とし ては、例えば、以下の組合せを挙げることができる。
(a)血液凝固線溶関連因子における補因子の例 1
酵素： F.IXa
基質： F.X
ネ ΐ因子： F.VIII/F.Vnia
補因子 F.VIIIaは、 F.IXaと F.Xの両方に結合することによって、 F.IXaによる F.Xの活 性化を増強する。上記の酵素 RIXa、基質 F.Xの両方を認識する二種特異性抗体の 中には、 F.Xの活性ィ匕を増強する作用を有するものがある。このような抗体の中には、 補因子 F.VIII/F.VIIIaの作用機能を代替する作用を有するものが存在すると考えられ [0035] (b)血液凝固線溶関連因子における補因子の例 2
酵素: ZPI
基質： F.X/F.Xa
補因子: PZ
補因子 PZは、 serpinファミリーの ZPIと活性ィ匕血液凝固第 X因子 (F.Xa)に結合するこ とで、 ZPIによる F.Xa阻害活性を増強する。すなわち、 ZPIと F.X/F.Xaの両方を認識 する二種特異性抗体の中には、 PZの機能を代替する作用を有するものが存在すると 考えられる。
[0036] (C)血液凝固線溶関連因子における補因子の例 3
酵素：トロンビン
基質： TAFI
補因子: TM
補因子 TMは、トロンビンによる TAFIの活性ィ匕を増強する。すなわち、トロンビンと TAFIの両方を認識する二種特異性抗体の中には、 TMの機能を代替する作用を有 するものが存在すると考えられる。
[0037] (d)血液凝固線溶関連因子における補因子の例 4
酵素：トロンビン
基質: PC
補因子： TM/PS
TM/PSシステムは、トロンビンによる PCの活性化を増強する。すなわち、トロンビンと PCの両方を認識する二種特異性抗体の中には、 TM/PSシステムの機能を代替する ものが存在すると考えられる。
[0038] (e)血液凝固線溶関連因子における補因子の例 5
酵素: F.Xa
基質：プロトロンビン
補因子： F.V/F.Va
補因子 F.Vaは、 F.Xaとプロトロンビンの両方に結合することによって、 F.Xaによるプ ロトロンビンの活性ィ匕を増強する。上記の酵素 F.Xa、基質プロトロンビンの両方を認 識する二種特異性抗体の中には、プロトロンビンの活性化を増強する作用を有する ものがある。このような抗体の中には、補因子 F.V/F.Vaの作用機能を代替する作用 を有するものが存在すると考えられる。
[0039] (D補体反応の補因子の例 1
酵素: Cls
基質: C2
補因子: C4b
C4bは Clsによる C2の分解促進作用を有する。すなわち Clsと C2の両方を認識する 二種特異性抗体の中には、 C4bの機能を代替するものが存在すると考えられる。
[0040] (g)補体反応の補因子の例 2
酵素：補体制御タンパク I因子（Complement Regulatory Factor I)
基質: C3b
補因子：補体制御タンパク H因子（Complement Regulatory Factor H) Membrane Cofactor Protein (Mし P)
Complement Receptor 1 (CRl)
Complement Regulatory Factor H、 MCP、 CRlは、 Complement Regulatory Factor I による C3b分解促進作用を有する。すなわち、 Complement Regulatory Factor Iと C3b の両方を認識する二種特異性抗体の中には、 Complement Regulatory Factor H、 MCP、 CRlの機能を代替するものが存在すると考えられる。
[0041] 上記補因子の中で、特に好ましいのは F.VIII/F.VIIIaである。 F.VIII/F.VIIIaは、トロ ンビン等の蛋白分解酵素により限定分解を受けるが、 F.VIII/F.VIIIaの補因子活性を 有している限り、その形態は問わない。また、変異 F.VIII/F.VIIIaや、遺伝子組換技術 により人為的に改変した F.VIII/F.VIIIaに関しても、 F.VIII/F.VIIIaの補因子活性を有 している限り、 F.VIII/F.VIIIaに含まれる。
[0042] 本発明の補因子機能代替二種特異性抗体を得る方法は特に制限されず、どのよう な方法で取得されてもよい。例えば、酵素 A及び基質 Bに対する補因子機能代替二 種特異性抗体を得る場合、酵素 A、基質 Bそれぞれを免疫動物に免疫し、抗酵素 A 抗体及び抗基質 B抗体を取得する。その後、抗酵素 A抗体の H鎖と L鎖及び抗基質 B 抗体の H鎖と L鎖を含む二種特異性抗体を作製する。ここで、抗酵素 A抗体と抗基質 B抗体はそれぞれ複数種得られていることが望ましぐこれらを用いてなるべく多くの 組合せの二種特異性抗体を作製することが好ましい。二種特異性抗体を作製後、補 因子機能代替活性を有する抗体を選択する。
[0043] 酵素あるいは基質に対する抗体は、当業者に公知の方法により得ることができる。
例えば、免疫動物に対して抗原を免疫することにより調製することができる。動物を免 疫する抗原としては、免疫原性を有する完全抗原と、免疫原性を有さない不完全抗 原 (ハプテンを含む）が挙げられる。本発明においては、本発明の補因子機能代替 抗体が補因子として作用すると考えられる酵素あるいは基質を、上記抗原 (免疫原） として使用する。免疫する動物として、例えば、マウス、ラット、ノ、ムスター、モルモット 、ゥサギ、 -ヮトリまたはァカゲザル等を用いることができる。これら動物に対して、抗 原を免疫することは、当業者においては、周知の方法によって行うことができる。本発 明にお 、て好ましくは、免疫された動物または該動物の細胞力 抗体の L鎖および H 鎖の可変領域の回収を行う。この操作は、当業者においては一般的に公知の技術を 用いて行うことができる。抗原によって免疫された動物は、とりわけ脾臓細胞において 該抗原に対する抗体を発現する。従って、例えば、免疫された動物の脾臓細胞から mRNAを調製し、該動物の可変領域に対応するプライマーを用いて、 RT-PCRにより L 鎖および H鎖の可変領域の回収を行うことができる。
[0044] 詳細には、動物に酵素、基質それぞれを免疫する。免疫原とする酵素、基質は、蛋 白質全体、もしくは該蛋白質の部分ペプチドであってもよい。また、動物を免疫する のに用いる免疫原としては、場合により抗原となるものを他の分子に結合させ可溶性 抗原とすることも可能であり、また、場合によりそれらの断片を用いてもよい。
[0045] 免疫されたマウスの脾臓力 脾細胞を単離し、マウスミエローマ細胞と融合し、ハイ プリドーマを作製する。抗原に結合するハイブリドーマをそれぞれ選択し、可変領域 に対応するプライマーなどを用いて RT- PCRにて L鎖、 H鎖の可変領域を回収するこ とが出来る。 CDRに対応するプライマー、 CDRよりも多様性の低いフレームワークに 対応するプライマー、あるいはシグナル配列と CH1もしくは L鎖定常領域 (C )に対応 するプライマーを用いることもできる。
[0046] あるいは、免疫された動物の脾細胞力 mRNAを抽出し、可変領域付近に対応する プライマーを用いて RT-PCRにて L鎖、 H鎖可変領域の cDNAを回収する。また、 in vitroにおいてリンパ球を免疫することもできる。これを用いて scFvもしくは Fabを提示 するライブラリーを構築する。パンユングによって抗原結合抗体クローンを濃縮'クロ ーン化し、可変領域を得ることが出来る。この際、ヒトゃ免疫していない動物の末梢血 単核球、脾臓、扁桃腺などに由来する mRNAを材料とする同様のライブラリーを用い てスクリーニングを行うことも可能である。
[0047] その可変領域を用いて抗体発現ベクターを作製する。抗酵素抗体発現ベクターと 抗基質抗体発現ベクターを同一の細胞に導入し、抗体を発現させることにより二種特 異性抗体を得ることができる。
[0048] 補因子機能代替活性を有する抗体の選択は、例えば、以下のような方法により行う ことができる。
( 1)該酵素 '該基質を含む反応系を用い、該抗体を加えることによる該酵素活性 (基 質分解能)の上昇を指標とし、選択する。
(2)該酵素 '該基質'該補因子が関わる生体機能を測定するあるいは模倣する系 (例 えば、血漿凝固測定系）を用い、該補因子非存在条件下にて該抗体を加えることに よる機能回復活性を指標とし、選択する。
[0049] 得られた抗体は、均一にまで精製することができる。抗体の分離、精製は通常の蛋 白質で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。例えばァフィ二ティーク口 マトグラフィ一等のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析、 SDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組合せれば、抗体 を分離、精製することができる (Ant¾odies： A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)力 これらに限定されるものでは ない。ァフィユティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテイン Aカラム、プ 口ティン Gカラムなどが挙げられる。
[0050] 本発明の二種特異性抗体は、例えば代替する補因子が F.VIII/F.VIIIaである場合 、すなわち酵素および基質の組合せ力 血液凝固線溶関連因子の F.IXa、及び F.X である場合には、好ましくは、抗 F.IXa抗体における可変領域と、抗 F.X抗体における 可変領域とを含む構造を有する。
[0051] 本発明の F.VIII/F.VIIIa機能代替二種特異性抗体は以下の方法で作製した。市販 の F.IXa及び F.Xをそれぞれマウスの皮下に免疫した。抗体価の上昇した免疫マウス の脾臓力 脾細胞を単離し、マウスミエローマ細胞と融合し、ハイプリドーマを作製し た。抗原 (F.IXa、 F.X)に結合するハイプリドーマをそれぞれ選択し、可変領域に対応 するプライマーを用いて RT-PCRにて L鎖、 H鎖の可変領域を回収した。 L鎖可変領 域は Cを含む L鎖発現ベクターに、 H鎖可変領域は H鎖定常領域を含む H鎖発現べ し
クタ一にそれぞれ組み込んだ。また、この免疫マウスの脾臓力も mRNAを抽出し、可 変領域に対応するプライマーを用いて RT-PCRにて L鎖、 H鎖可変領域の cDNAを回 収した。これら可変領域を用いて scFvを提示するファージライブラリーを構築した。パ ンユングによって抗原結合抗体クローンを濃縮'クローンィ匕し、その可変領域を用い て抗体発現ベクターを作製した。 抗 F.IXa抗体 (H鎖、 L鎖）の発現ベクターと F.X抗 体 (H鎖、 L鎖）の発現ベクターを同一の細胞に導入し、抗体を発現させることにより二 種特異性抗体を得た。
[0052] 得られた二種特異性抗体に関しては、 F.XIa (F.IX活性ィ匕酵素）、 F.IX、 F.X、 F.Xa の合成基質 (S-2222)、リン脂質力も成る測定系で、 F.VIII/F.VIIIa (F.IXaによる F.X活 性ィ匕の補因子）を代替する活性を評価した。その結果を以つて、 F.VIII/F.VIIIa代替 活性を有する二種特異性抗体として、原則本測定系で 0.1以上の F.VIIIa様活性を示 したものを選択した。なお、ここでいう F.VIIIa様活性とは、抗体溶液または抗体発現 培養上清の 30分間または 60分間の吸光度変化値から、溶媒または抗体非発現培養 上清の 30分間または 60分間の吸光度変化値を引いた値である。
[0053] 上記で選択された二種特異性抗体あるいはその類縁の二種特異性抗体に関して は、 F.VIII欠乏ヒト血漿を用いた凝固時間測定系を用い、凝固回復能を測定した。そ の結果、抗体無添加時に比べて、凝固時間を短縮する二種特異性抗体を得た。ここ で 、う凝固時間は実施例 7に示したように、 F.VIII欠乏ヒト血漿を用いた活性ィ匕部分ト ロンボプラスチン時間を測定したものである。それら二種特異性抗体の中で、好まし い二種特異性抗体は 10秒以上の、より好ましい二種特異性抗体は 20秒以上の、さら に好まし 、二種特異性抗体は 40秒以上の、最も好まし!/、二種特異性抗体は 50秒以 上の凝固時間短縮能を有して 、た。
[0054] 本発明の抗体の H鎖 CDR3は、特に制限されないが、具体的には、後述の実施例 に記載の ΧΒ12、 ΧΤ04、 Α19、 Α25、 Α31、 Α38、 Α39、 Α40、 Α41、 Α44、 Α50、もしくは Α69の Η鎖 CDR3配列（配列番号： 16、 20、 60、 64、 68、 72、 76、 80、 84、 88、 92も しくは 96)の 、ずれかのアミノ酸配列力もなる相補性決定領域またはこれと機能的に 同等の相補性決定領域を有し、且つ、 SB04、 SB05、 SB06、 SB07、 SB21、 SB30、 SB34 、 SB38、 SB42、 B2、 B5、 B9、 B10、 Bll、 B12、 B13、 B14、 B15、 B16、 B18、 B19、 B20、 B21、 B23、 B25、 B26、 B27、 B31、 B34 - 1、 B34 - 2、 B35、 B36、 B38、 B42、 SB15もしくは SB27の H鎖 CDR3配列（それぞれの配列番号： 24、 28、 32、 36、 40、 44、 48、 52、 5 6、 100、 104、 108、 112、 116、 120、 124、 128、 132、 136、 140、 144、 148、 1 52、 156、 160、 164、 168、 172、 176、 180、 184、 188、 192、 196、 200もしくは 204)の 、ずれかに記載のアミノ酸配列力もなる相補性決定領域またはこれと機能的 に同等の相補性決定領域を有する。
[0055] さらに、本発明の上記抗体は具体例としては、 ΧΒ12、 ΧΤ04、 Α19、 Α25、 Α31、 Α38、 Α39、 Α40、 Α41、 Α44、 Α50、もしくは Α69 (配列番号： 14一 16、 18— 20、 58— 60、 6 2— 64、 66— 68、 70— 72、 74— 76、 78— 80、 82— 84、 86— 88、 90— 92もしく は 94一 96)の Η鎖 CDR配列のいずれかのアミノ酸配列からなる相補性決定領域、ま たはこれと機能的に同等の相補性決定領域を有するものと、 SB04、 SB05、 SB06、 SB07、 SB21、 SB30、 SB34、 SB38、 SB42、 B2、 B5、 B9、 B10、 Bll、 B12、 B13、 B14、 B15、 B16、 B18、 B19、 B20、 B21、 B23、 B25、 B26、 B27、 B31、 B34— 1、 B34— 2、 B35、 B36、 B38、 B42、 SB15もしくは SB27の H鎖 CDR配列（配列番号： 22— 24、 26— 28、 3 0— 32、 34— 36、 38— 40、 42— 44、 46— 48、 50— 52、 54— 56、 98— 100、 10 2— 104、 106— 108、 110— 112、 114一 116、 118— 120、 122— 124、 126— 1 28、 130— 132、 134— 136、 138— 140、 142— 144、 146— 148、 150— 152、 1 54— 156、 158— 160、 162— 164、 166— 168、 170— 172、 174— 176、 178— 180、 182— 184、 186— 188、 190— 192、 194一 196、 198— 200もしくは 202— 204)のいずれかのアミノ酸配列力もなる相補性決定領域、またはこれと機能的に同 等の相補性決定領域を有するものとの組合せによる抗体を好適に示すことができる。
[0056] 本発明記載の ΧΒ12、 ΧΤ04、 Α19、 Α25、 Α31、 Α38、 Α39、 Α40、 Α41、 Α44、 Α50、
Α69、 SB04、 SB05、 SB06、 SB07、 SB21、 SB30、 SB34、 SB38、 SB42、 B2、 B5、 B9、 BIO 、 Bll、 B12、 B13、 B14、 B15、 B16、 B18、 B19、 B20、 B21、 B23、 B25、 B26、 B27、 B31、 B34-l、 B34-2、 B35、 B36、 B38、 B42、 SB15もしくは SB27の H鎖可変領域のアミノ酸配 列は、配列番号： 13、 17、 57, 61、 65, 69, 73, 77, 81、 85, 89, 93, 21、 25, 2
9、 33、 37、 41、 45、 49、 53、 97、 101、 105、 109、 113、 117、 121、 125、 129、 133、 137、 141、 145、 149、 153、 157、 161、 165、 169、 173、 177、 181、 185 、 189、 193、 197ならびに 201で示される。
[0057] 本発明記載の A44、 B26、 XB12、 SB04の L鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号
: 205、 209、 213、 217で示される。また、 A44、 B26、 XB12、 SB04の L鎖 CDR酉己列は 、配列番号： 206— 208、 210—212, 214—216, 218— 220で示される。また、 XB12、 SB04、 A44、 B26の H鎖 CDRの塩基配列（括弧内は該塩基配列によってコード されるアミノ酸配列）は、配列番号： 221 (222)、 223 (224)、 225 (226)、 233 (234 )、 235 (236)、 237 (238)、 245 (246)、 247 (248)、 249 (250)、 257 (258)、 25 9 (260)、 261 (262)で示され、 L鎖 CDRの塩基配列は、配列番号： 227 (228)、 22 9 (230)、 231 (232)、 239 (240)、 241 (242)、 243 (244)、 251 (252)、 253 (25 4)、 255 (256)、 263 (264)、 265 (266)、 267 (268)で示される。
[0058] なお、配列番号： 58、 62、 66、 70、 74、 78、 82、 86、 90、 94、 98、 102、 106、 1
10、 114、 118、 122、 126、 130、 134、 138、 142、 146、 150、 154、 158、 162、 166、 170、 174、 178、 182、 186、 190、 194、 198、 202、 206、 210、 214、 218 、 222、 228、 234、 240、 246、 252、 258、 264は、 CDR1を表す。
[0059] 配列番号： 59、 63、 67、 71、 75、 79、 83、 87、 91、 95、 99、 103、 107、 111、 11 5、 119、 123、 127、 131、 135、 139、 143、 147、 151、 155、 159、 163、 167、 1 71、 175、 179、 183、 187、 191、 195、 199、 203、 207、 211、 215、 219、 224、 230、 236、 242、 248、 254、 260、 266は、 CDR2を表す。
[0060] 配列番号： 60、 64、 68、 72、 76、 80、 84、 88、 92、 96、 100、 104、 108、 112、 1 16、 120、 124、 128、 132、 136、 140、 144、 148、 152、 156、 160、 164、 168、 172、 176、 180、 184、 188、 192、 196、 200、 204、 208、 212、 216、 220、 226 、 232、 238、 244、 250、 256、 262、 268は、 CDR3を表す。
[0061] 本発明の抗体は、特に制限されないが、好ましくは上記抗体と同じもしくは近傍の ェピトープを有する抗体で、抗 Factor IXa抗体と抗 Factor X抗体による組合せの二種 特異性抗体が挙げられる。ここで 、う同じもしくは近傍のェピトープを有する抗体とは 、例えば、競合 ELISAなどで結合が拮抗する抗体等を指す。この競合 ELISAの手法 は特に制限はされないが、 Factor IX/IXaもしくは Factor Xを 96-wellマイクロウエルプ レートに固相化させ、適当な標識をした該抗体と評価すべき抗体を同時に添加し、 標識を利用して結合している抗体を検出する。この標識は特に制限はされないが、ァ ルカリホスファターゼ標識、ペルォキシダーゼ標識、ピオチン標識 ストレプトアビジン 結合酵素（アルカリホスファターゼ、ペルォキシダーゼ等）、あるいは FITCなどが挙げ られる。該抗体に対して、評価すべき抗体の 100,000倍過剰までの濃度において少 なくとも 50%の競合が見られる場合、ェピトープ重なりが存在する。
[0062] 本発明で開示されて!ヽる可変領域を用いて全長抗体を作製する場合、定常領域 は特に限定されず、当業者に公知の定常領域を用いることが可能であり、例えば、 sequences of proteins of immunological interest, (1991), U.b. Department of Health and Human Services. Public Health Service National Institutes of Healthや、 An efficient route to human bispecific IgG, (1998). Nature Biotechnology vol. 16, 677-681、等に記載されて 、る定常領域を用いることができる。
[0063] 本発明における抗体の 1つの態様としては、補因子の機能を代替する作用を有す ることから、本発明の抗体は、該補因子の活性 (機能)低下に起因する疾病に対して 、有効な薬剤となることが期待される。本発明の抗体の代替する補因子が血液凝固 線溶関連因子である場合には、上記疾病として、例えば、出血、出血を伴う疾患、も しくは出血に起因する疾患等を挙げることができる。特に、 F.VIII/F.VIIIa、
F.IX/F.IXa, F.XI/F.XIaの機能低下や欠損は、血友病と呼ばれる出血異常症を引き 起こすことで知られる。
[0064] 血友病のうち、先天性の F.VIII/F.VIIIa機能低下または欠損による出血異常症は、 血友病 Aと呼ばれる。血友病 A患者が出血した場合、 F.VIII製剤の補充療法が行わ れる。また、激しい運動や遠足の当日、頻回に関節内出血を来たす場合、あるいは 重症血友病に分類される場合には、 F. VIII製剤の予防投与が行われることがある（非 特許文献 1および 2参照)。この F.VIII製剤の予防投与は、血友病 A患者の出血ェピ ソードを激減させるため、近年、大きく普及しつつある。出血エピソードを減らすことは 、致死性及び非致死性の出血の危険及びそれに伴う苦痛を低下させるだけでなぐ 頻回の関節内出血に起因する血友病性関節障害を未然に防ぐ。その結果、血友病 A患者の QOL向上に大きく寄与する。
[0065] F.VIII製剤の血中半減期は短ぐ約 12— 16時間程度である。それ故、継続的な予 防のためには、 F.VIII製剤を週に 3回程度投与する必要がある。これは、 F.VIII活性と して、概ね 1%以上を維持することに相当する（非特許文献 3および 4参照)。また、出 血時の補充療法においても、出血が軽度な場合を除き、再出血を防ぎ、完全な止血 を行うため、一定期間、 F.VIII製剤を定期的に追加投与する必要がある。
[0066] また、 F.VIII製剤は、静脈内に投与される。静脈内投与実施には、技術的な困難さ が存在する。特に年少の患者に対する投与においては、投与に用いられる静脈が細 い故、困難さが一層増す。
[0067] 前述の、 F.VIII製剤の予防投与や、出血の際の緊急投与においては、多くの場合、 家庭療法'自己注射が用いられる。頻回投与の必要性と、投与の際の技術的困難さ は、投与に際し患者に苦痛を与えるだけでなぐ家庭療法'自己注射の普及を妨げる 要因となっている。
従って、現存の血液凝固第 VIII因子製剤に比し、投与間隔が広い薬剤、あるいは 投与が簡単な薬剤が、強く求められていた。
[0068] さらに、血友病 A患者、特に重症血友病 A患者には、インヒビターと呼ばれる F.VIII に対する抗体が発生する場合がある。インヒビターが発生すると、 F.VIII製剤の効果 力 Sインヒビターにより妨げられる。その結果、患者に対する止血管理が非常に困難に なる。
[0069] このような血友病 Aインヒビター患者が出血を来たした場合は、通常、大量の F.VIII 製剤を用いる中和療法力、複合体製剤（complex concentrate)あるいは F. Vila製剤を 用いるバイパス療法が、実施される。しかしながら、中和療法では、大量の F.VIII製剤 の投与が、逆に、インヒビター (抗 F.VIII抗体)力価を上げてしまう場合がある。また、 バイパス療法では、複合体製剤や F.VIIa製剤の短血中半減期 (約 2— 8時間）が問 題となっている。その上、それらの作用機序力 F.VIII/F.VIIIaの機能、すなわち F.IXaによる F.X活性ィ匕を触媒する機能に非依存であるため、場合によっては、止血 機構をうまく機能させられず、不応答になってしまうケースがある。そのため、血友病 Aインヒビター患者では、非インヒビター血友病 A患者に比し、十分な止血効果を得ら れな 、場合が多 、のである。
[0070] 従って、インヒビターの存在に左右されず、且つ F.VIII/F.VIIIaの機能を代替する薬 剤が、強く求められていた。
[0071] ところで、 F.VIII/F.VIIIaに関係する出血異常症として、血友病、抗 F. VIII自己抗体 を有する後天性血友病のほかに、 vWFの機能異常または欠損に起因するフォンビル ブランド病が知られている。 vWFは、血小板力 血管壁の損傷部位の内皮下組織に 正常に粘着するのに必要であるだけでなぐ F.VIIIと複合体を形成し、血漿中 F.VIII レベルを正常に保つのにも必要である。フォンビルブランド病患者では、これらの機 能が低下し、止血機能異常を来たしている。
[0072] さて、（0投与間隔が広ぐ GO投与が簡単であり、（m)インヒビターの存在に左右され ず、（iv) F.VIII/F.VIIIa非依存的にその機能を代替する医薬品の創製には、抗体を 利用する方法が考えられる。抗体の血中半減期は、一般に、比較的長ぐ数日から 数週間である。また、抗体は、一般に、皮下投与後に血中に移行することが知られて いる。すなわち、一般に抗体医薬品は、上記の (0、 GOを満たしている。
[0073] 本発明では、本発明の抗体を有効成分として含有する医薬組成物を提供する。例 えば、本発明の抗体が F.IXもしくは F.IXa、および F.Xの両方を認識する抗体のうち、 F.VIIIaの機能を代替する抗体である場合には、該抗体は、出血、出血を伴う疾患、も しくは出血に起因する疾患の予防あるいは治療のための医薬品（医薬組成物)もしく は薬剤となることが期待される。また、 F.Xもしくは F.Xa、およびプロトロンビンの両方 を認識する抗体のうち、 F.Vaの機能を代替する抗体である場合には、該抗体は、出 血、出血を伴う疾患、もしくは出血に起因する疾患の予防あるいは治療のための医 薬品（医薬組成物)もしくは薬剤となることが期待される。 [0074] 一方で、 ZPIと F.Xに結合して PZの機能を代替する抗体は抗血栓作用を有する医薬 品（医薬組成物)もしくは薬剤、トロンビンと TAFIに結合して TMの機能を代替する抗 体は止血促進作用を有する医薬品（医薬組成物)もしくは薬剤、トロンビンと PCに結 合して PS/TMシステムの機能を代替する抗体は凝固調節作用を有する医薬品（医薬 組成物)もしくは薬剤となることが期待される。
[0075] また、補体 C4の欠損は全身性エリテマトーデス (SLE)を引き起こすことから、 C4bの 作用を代替する抗体は SLE発症抑制作用を有する医薬品（医薬組成物)もしくは薬 剤となることが期待される。 H因子の欠損は易ィ匕膿性感染症、 自己免疫性の糸球体 腎炎を引き起こすことから、 H因子の作用を代替する抗体はこれら疾患の発症抑制 作用を有する医薬品（医薬組成物)もしくは薬剤となることが期待される。
[0076] 治療または予防目的で使用される本発明の抗体を有効成分として含む医薬組成 物は、必要に応じて、それらに対して不活性な適当な薬学的に許容される担体、媒 体等と混和して製剤化することができる。例えば、滅菌水や生理食塩水、安定剤、賦 形剤、酸化防止剤 (ァスコルビン酸等)、緩衝剤 (リン酸、クェン酸、他の有機酸等)、防 腐剤、界面活性剤 (PEG、 Tween等)、キレート剤 (EDTA等)、結合剤等を挙げることが できる。また、その他の低分子量のポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチンや免疫グ ロブリン等の蛋白質、グリシン、グルタミン、ァスパラギン、アルギニン及びリシン等の アミノ酸、多糖及び単糖等の糖類や炭水化物、マン-トールやソルビトール等の糖ァ ルコールを含んでいてもよい。注射用の水溶液とする場合には、例えば生理食塩水 、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えば、 D-ソルビトール、 D-マンノース 、 D-マン-トール、塩ィ匕ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコー ル (エタノール等)、ポリアルコール (プロピレングリコール、 PEG等)、非イオン性界面活 性剤 (ポリソルベート 80、 HCO— 50)等と併用してもよい。
[0077] また、必要に応じ本発明の抗体をマイクロカプセル (ヒドロキシメチルセルロース、ゼ ラチン、ポリ^チルメタクリル酸]等のマイクロカプセル)に封入したり、コロイドドラッグ デリバリーシステム (リボソーム、アルブミンミクロスフエア、マイクロエマルジヨン、ナノ 粒子及びナノカプセル等)とすることもできる ("Remington's Pharmaceutical Science 16th edition", Oslo Ed. (1980)等参照)。さらに、薬剤を徐放性の薬剤とする方法も公 知であり、本発明の抗体に適用し得る (Langer et al., J.Biomed.Mater.Res. 15:
267-277 (1981); Langer, Chemtech. 12: 98-105 (1982);米国特許第 3, 773,919号;欧 州特許出願公開 (EP)第 58,481号； Sidman et al., Biopolymers 22: 547-556 (1983);EP 第 133, 988号)。
[0078] 本発明の抗体または医薬組成物は、血液凝固第 vm因子と併用することができる。
本発明の抗体または医薬組成物は、血液凝固第 vm因子と同時に投与してもよぐま たは、時期をずらして投与してもよい。また、本発明の抗体または医薬組成物と血液 凝固第 VIII因子を組み合わせたキットとして実施してもよい。さらに、本発明の抗体ま たは医薬組成物と血液凝固第 vm因子を併用する場合は、 ヽずれかを単独で用いる 場合に比べて、所望により各々の投与量を少なくすることも可能である。
[0079] 本発明の医薬組成物の投与量は、剤型の種類、投与方法、患者の年齢や体重、 患者の症状、疾患の種類や進行の程度等を考慮して、最終的には医師の判断により 適宜決定されるものである力 一般に大人では、 1日当たり、 0.1— 2000mgを 1一数回 に分けて投与することができる。より好ましくは 1一 lOOOmg/日、更により好ましくは 50 一 500mgZ日、最も好ましくは 100— 300mgZ日である。これらの投与量は患者の体 重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選 択することが可能である。投与期間も、患者の治癒経過等に応じて適宜決定すること が好ましい。
[0080] また、本発明の抗体をコードする遺伝子を遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝 子治療を行うことも考えられる。投与方法としては、 nakedプラスミドによる直接投与の 他、リボソーム等にパッケージングする力 レトロウイルスベクター、アデノウイルスべク ター、ワクシニアウィルスベクター、ボックスウィルスベクター、アデノウイルス関連べク ター、 HVJベクター等の各種ウィルスベクターとして形成するか（Adolph『ウィルスゲノ ム法』， CRC Press, Florid (1996)参照）、または、コロイド金粒子等のビーズ担体に被 覆 (WO93/17706等）して投与することができる。し力しながら、生体内において抗体 が発現され、その作用を発揮できる限りいかなる方法により投与してもよい。好ましく は、適当な非経 P経路 (静脈内、腹腔内、皮下、皮内、脂肪組織内、乳腺組織内、吸 入または筋肉内の経路を介して注射、注入、またはガス誘導性粒子衝撃法 (電子銃 等による）、点鼻薬等粘膜経路を介する方法等)により十分な量が投与される。 ex vivoにおいてリボソームトランスフエクシヨン、粒子衝撃法（米国特許第 4,945,050号）、 またはウィルス感染を利用して血液細胞及び骨髄由来細胞等に投与して、該細胞を 動物に再導入することにより本発明の抗体をコードする遺伝子を投与してもよい。遺 伝子治療では、本発明の抗体をコードする任意の遺伝子を使用することが可能であ り、例えば、前述の XB12、 SB04、 A44、 B26の CDRの塩基配列を含む遺伝子が挙げら れる。
[0081] また本発明は、本発明の抗体もしくは組成物を投与する工程を含む、出血、出血を 伴う疾患、または出血に起因する疾患の予防および Zまたは治療するための方法を 提供する。抗体もしくは組成物の投与は、例えば、前記の方法により実施することが できる。
[0082] また本発明は、本発明の抗体の、本発明の（医薬)組成物の製造のための使用に 関する。
[0083] さらに本発明は、少なくとも本発明の抗体もしくは組成物を含む、上記方法に用い るためのキットを提供する。該キットには、その他、注射筒、注射針、薬学的に許容さ れる媒体、アルコール綿布、絆創膏、または使用方法を記載した指示書等をパッケ ージしておくこともできる。
[0084] なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に 組み入れられる。
実施例
[0085] 以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限 されるものではない。
〔実施例 1〕 Factor IXa (F.IXa)に対する非中和抗体の作製
1-1.免疫およびハイプリドーマ作製
BALB/cマウス (雄、免疫開始時 6週齢、日本チヤ一ルス'リバ一） 8匹および MRL/lprマウス（雄、免疫開始時 6週齢、日本チヤ一ルス'リバ一） 5匹に、 human Factor IXa jS (Enzyme Research Laboratories, Inc.)を以下の通り免疫した。初回免 疫として FCA (フロイント完全アジュバント H37 Ra (Difco laboratories) )でェマルジヨン 化した Factor IXa j8を 40 g/head皮下投与した。 2週間後に FIA (フロイント不完全ァ ジュノ ント（Difco laboratories) )でェマルジヨン化した Factor IXa βを 40 μ g/head皮下 投与した。以後 1週間間隔で追加免疫を 3— 7回行った。 Factor IXa に対する血清 抗体価の上昇を 1-2に示した ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay)で確認後 、最終免疫として PBS(-)(カルシウムイオン、マグネシウムイオンを含まない phosphate buffered saline)に希釈した Factor IXa βを 40 μ g/head静脈内投与した。最終免疫の 3 日後、マウスの脾臓を摘出し、その一部は実施例 10— 2で使用し、残りの脾臓細胞と マウスミエローマ細胞 P3X63Ag8U.l (P3Ulと称す、 ATCC CRL- 1597)を、 PEG1500 ( ロシュ ·ダイァグノスティックス）を用いた常法に従 、細胞融合した。
10%FBS(Invitrogen)を含む RPMI1640培地（Invitrogen) (以下、 10%FBS/RPMI1640と称 す)に懸濁した融合細胞を 96 well culture plateに播種し、融合 1, 2, 3, 5日後に HAT 選択培地（10%FBS/RPMI1640 / 2%HAT 50x concentrate (大日本製薬）/ 5%
BM-Condimed HI (ロシュ'ダイァグノスティックス））への置換を行うことにより、ハイブ リドーマの選択培養を行った。融合後 8日目または 9日目に採取した培養上清を用い て、 1-2に示した ELISAにより Factor IXaに対する結合活性を測定することにより、 Factor IXa結合活性を有するハイプリドーマを選択した。続いて 1-3に示した方法で Factor IXaの酵素活性に対する中和活性を測定し、 Factor IXaに対する中和活性を 有さないハイプリドーマを選択した。ハイプリドーマは、 96 well culture plateに 1 wellあ たり 1個の細胞を播種することによる限界希釈を 2回行ってクローンィ匕した。顕微鏡観 察により単一コロニーであることが確認された細胞について、 1-2、 1-3に示した ELISAおよび中和活性測定を行い、クローンを選択した。 1-4に示した方法により、ク ローン化した抗体の腹水を作製し、腹水から抗体を精製した。精製抗体が、 APTT ( 活性ィ匕部分トロンボプラスチン時間）を延長させないことを、 1-5に示した方法で確認 した。
1-2. Factor IXa ELISA
し oating buffer (lOOmM sodium bicarbonate, pH 9·。, 0.02% soaium aziae)で 1 μ g/mLに希釈した Factor IXa βを、 Nunc— Immuno plate (Nunc— Immuno 96 MicroWell ™ plates MaxiSorp™(Nalge Nunc International) )に 100 μ L/wellで分注後、 4°Cで一 晚インキュベーションした。 Tween(R) 20を含む PBS (-)で 3回洗浄後、 diluent buffer (50mM Tris-HCl, pH8.1, 1% bovine serum albumin, ImM MgCl , 0.15M NaCl, 0.05%
2
Tween(R) 20, 0.02% sodium azide)で plateを室温で 2時間 blockingした。 Bufferを除去 後、 plateに diluent bufferで希釈したマウスの抗血清またはハイブリドーマの培養上清 を 100 L/well添カ卩し、室温で 1時間インキュベーションした。 Plateを 3回洗浄後、 diluent bufferで 1/2000希釈したアルカリホスファターゼ標識ャギ抗マウス IgG (H+L) ( Zymed Laboratories)を 100 L/well添カ卩し、室温で 1時間インキュベーションした。 Plateを 6回洗浄後、発色基質 Blue- Phos™ Phosphate Substrate (Kirkegaad & Perry Laboratories)を 100 L/well添カ卩し、室温で 20分インキュベーションした。 Blue- Phos Stop Solution (Kirkegaad & Perry Laboratoriesノ 100 μ L/well添カロした後、 595nm における吸光度を Microplate Reader Model 3550 (Bio- Rad Laboratories)で測定した
[0087] 1-3. Factor IXa中和活性測定
Phospholipid (Sigma-Aldrich)を注射用蒸留水で溶解し、超音波処理を施すこと〖こ より、 400 g/mLの phospholipid溶液を調製した。 0.1%ゥシ血清アルブミンを含むトリス 緩衝生理食塩液（以下、 TBSB O /z Lと 30ng/mL Factor IXa jS (Enzyme Research Laboratories) 10 μ Lと 400 μ g/mL phospholipid溶液 5 Lと 100 mM CaCl 、 20 mM
2
MgClを含む TBSB 5 μ Lとハイブリドーマ培養上清 10 μ Lを 96穴プレート中で混和し、
2
室温で 1時間インキュベーションした。この混合溶液に、 50 μ g/mL Factor X (Enzyme Research Laooratones) 20 μ Lおよび 3U/mL Factor Villa (Amrican diagnostica) 10 μ Lを加え、室温で 30分間反応させた。これに 10 /z Lの 0.5M EDTAを添カ卩することに より反応を停止させた。この反応溶液に、 50 しの3-2222溶液（0^^10§6 ）を添カロ し、室温で 30分間インキュベーションした後、測定波長 405nm、対照波長 655nmにお ける吸光度を Microplate Reader Model 3550 (Bio- Rad Laboratories, Inc.)により測定 した。
[0088] 1-4.腹水の作製および抗体の精製
榭立したノヽイブリドーマの腹水作製は常法に従って行った。すなわち、 in vitroで培 養したノ、イブリドーマ 2 X 106個を、あら力じめプリスタン（ 2,6,10,14-tetramethylpentadecane;和光純薬工業）を 2回腹腔内に投与しておいた BALB/cマウス（雄、実験開始時 5— 7週齢、 日本チヤ一ルス'リバ一）または BALB/cヌ 一ドマウス (雌、実験開始時 5— 6週齢、 日本チヤ一ルス'リバ一および日本クレア）の 腹腔内に移植した。移植後 1一 4週目で腹部が肥大したマウス力も腹水を回収した。
[0089] 腹水からの抗体精製は Protein G Sepharose™ 4 Fast Flow (Amersham Biosciences )カラムを用いて行った。 Binding Buffer (20 mM sodium acetate, pH5.0)にて 2倍希釈 した腹水をカラムにアプライし、 10カラム容量の Binding Bufferで洗浄した。 5カラム容 量の Elution Buffer (0.1 M glycine- HC1, pH2.5)にて抗体を溶出し、 Neutralizing Buffer (1 M Tris- HC1, pH9.0)で中和した。これを Centriprep™ lO (Millipore)にて濃 縮し、 TBS (50mM Tris-buffered Saline)に溶媒を置換した。抗体濃度は、 280nmの吸 光度から、 A(l%,lcm) = 13.5として算出した。吸光度の測定は、 DU-650 (Beckman Coulter)にて測定した。
[0090] 1-5. APTT (活性ィ匕部分トロンボプラスチン時間）の測定
APTTは CR- A (Amelung)を接続した KClOA (Amelung)により測定した。 TBSBで希 釈した抗体溶液 50 μ 標準ヒト血漿（Dade Behring) 50 L及び APTT試薬（Dade Behring) 50 μ Lの混合液を 37°Cで 3分間加温した。 20 mMの CaCl (Dade Behring) 50
2
μ Lを同混合液に加えることにより凝固反応を開始させ、凝固時間を測定した。
[0091] 〔実施例 2〕 Factor X (F.X)に対する非中和抗体の作製
2-1.免疫およびハイプリドーマ作製
BALB/cマウス (雄、免疫開始時 6週齢、 日本チヤ一ルス'リバ一） 8匹および MRL/lprマウス（雄、免疫開始時 6週齢、 日本チヤ一ルス'リバ一） 5匹に、 human Factor X (Enzyme Research Laboratories)を以下の通り免疫した。初回免疫として FC Aでェマルジヨン化した Factor Xを 40 μ g/head皮下投与した。 2週間後に FIAでェ マルジヨンィ匕した Factor Xを 20または 40 g/head皮下投与した。以後 1週間間隔で追 加免疫を合計 3— 6回行った。 Factor Xに対する血清抗体価の上昇を 2_2に示した ELISAで確認後、最終免疫として PBS (-)に希釈した Factor Xを 20または 40 μ g/head 静脈内投与した。最終免疫の 3日後、マウスの脾臓を摘出し、その一部を実施例 10— 2で使用し、残りの脾臓細胞とマウスミエローマ細胞 P3U1を、 PEG1500を用いた常法 に従い細胞融合した。 10%FBS/RPMI1640培地に懸濁した融合細胞を 96 well culture plateに播種し、融合 1, 2, 3, 5日後に HAT選択培地への置換を行うことにより、ハイ プリドーマの選択培養を行った。融合後 8日目に採取した培養上清を用いて 2-2に示 した ELISAにより Factor Xに対する結合活性を測定した。 Factor X結合活性を有する ハイプリドーマを選択し、 2-3に示した方法で Factor Xaの酵素活性に対する中和活 性を測定した。 Factor Xaに対する中和活性を有さないハイプリドーマを、限界希釈を 2回行うことによりクローン化した。 1-4に示した方法により、クローンィ匕した抗体の腹 水を作製し、腹水から抗体を精製した。精製抗体が、 APTTを延長させないことを、 2- 5に示した方法で確認した。
[0092] 2-2. Factor X ELISA
Coating bufferで 1 μ g/mLに希釈し 7こ Factor Xを、 Nunc— Immuno plateに 100 μ L/wellで分注後、 4°Cでー晚インキュベーションした。 Tween(R) 20を含む PBS (-)で 3回 洗浄後、 diluent bufferで plateを室温で 2時間 blockingした。 Bufferを除去後、 plateに diluent bufferで希釈したマウスの抗血清またはハイブリドーマの培養上清を添カロし、 室温で 1時間インキュベーションした。 Plateを 3回洗浄後、 diluent bufferで 1/2000希 釈したアルカリホスファターゼ標識ャギ抗マウス IgG (H+L)を添加し、室温で 1時間ィ ンキュベーシヨンした。 Plateを 6回洗浄後、発色基質 Blue- Phos™ Phosphate
Substrate (Kirkegaad & Perry Laboratories)を 100 μ L/well添カ卩し、室温で 20分インキ ュべ. ~~シヨンした。 Blue- Phos Stop Solution (Kirkegaad & Perry Laboratories)を 100 μ L/well添カ卩した後、 595nmにおける吸光度を Microplate Reader Model 3550 ( Bio-Rad Laboratories)で測定した。
[0093] 2- 3. Factor Xa中和活性測定
TBSBで 1/5希釈したハイプリドーマ培養上清 10 μ Lと 40 μ Lの 250 pg/mL Factor Xa (Enzyme Research Laboratories)を含む TBCP (2.78 mM CaCl、 22.2 μ Mリン脂質（
2
フォスファチジルコリン：フォスファチジルセリン = 75： 25、 Sigma-Aldrich)を含む TBSB )を混和し、室温で 1時間インキュベーションした。この混合溶液に、 20 g/mLプロトロ ンビン（Enzyme Research Laboratories)および 100 ng/mL活性化凝固第 V因子（ Factor Va (Haematologic Technologies) )を含む TBCPを 50 μ L添カ卩して室温で 10分 間反応させた。 0.5 M EDTAを 10 L添加することにより反応を停止させた。この反応 溶液に、 1 mM S- 2238溶液（Chromogenix)を 50 /z L添カ卩し、室温で 30分間インキュべ ーシヨンした後、 405 nmにおける吸光度を Microplate Reader Model 3550 (Bio- Rad Laboratories)で測定した。
[0094] 〔実施例 3〕 キメラ二種特異性抗体発現ベクターの構築
3-1ノ、イブリドーマからの抗体可変領域をコードする DNA断片の調製
抗 F.IXa抗体あるいは抗 F.X抗体を産生するハイブリドーマから、 QIAGEN(R) RNeasy (R) Mini Kit (QIAGEN)を用いて説明書記載の方法に従い全 RNAを抽出した。全 RNAを 40 μ Lの滅菌水に溶解した。精製された RNA1— 2 μ gを铸型に、 Superscript cDNA合成システム（Invitrogen)を用いて説明書記載の方法に従!、RT-PCR法により 一本鎖 cDNAを合成した。
[0095] 3-2.抗体 H鎖可変領域の PCRによる増幅と配列解析
マウス抗体 H鎖可変領域 (VH) cDNAの増幅用プライマーとして、 Krebberらの報告（ J. Immunol. Methods 1997;201:35-55)に記載の HBプライマー混合物、および HFプ ライマー混合物を用意した。各 0.5 Lの 100 M HBプライマー混合物および 100 M HFプライマー混合物を用いて、反応液 25 μ L (3-1で調製した cDNA溶液 2.5 μ 1、 KOD plus buffer (東洋紡績）、 0.2mM dNTPs, 1.5mM MgCl , 0.75 units DNA
2
polymerase KOD plus (東洋紡績））を調製した。 PCRは、サーマルサイクラ一
GeneAmp PCR system 9700 (Parkin Elmer)を用いて、 cDNA断片の増幅の効率性に 応じて、条件 A(98°Cで 3分間加熱後、 98°C 20秒、 58°C 20秒、 72°C 30秒からなる反 応を 1サイクルとして 32サイクル)ないし条件 B (94°Cで 3分間加熱後、 94°C 20秒、 46 °C 20秒、 68°C 30秒からなる反応を 1サイクルとして 5サイクル、さらに 94°C 20秒、 58 °C 20秒、 72°C 30秒からなる反応を 1サイクルとして 30サイクル）のいずれかの条件で 行った。 PCR後、反応液を 1%ァガローズゲル電気泳動に供した。 目的のサイズ (約 400bp)の増幅断片を QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN)を用い、添付説明書記 載の方法で精製し、滅菌水 30 1で溶出した。各 DNA断片の塩基配列は、 BigDye Terminatorし ycle Sequencing Kit (Applied Biosystems)を用 ヽ、 DNAン ~~クェンサ ~~ ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems)にて、添付説明書記載の方 法に従 ヽ決定した。本方法により決定した配列群を解析ソフト GENETYX- SV/RC Version 6.1 (Genetyx)にて比較解析し、異なる配列を有するものを選択した。
[0096] 3-3.クローユング用抗体可変領域 DNA断片の調製
クローニング用制限酵素 Sfi I切断サイトを抗体可変領域増幅断片の両末端へ付加 するために、以下の操作を行った。
[0097] Sfi I切断部位付加 VH断片 (Sfi I-VH)増幅のために、プライマー HBの（Gly4Ser)2- リンカ一配列を Sfi I切断部位を有するに示す配列（配列番号： 5)へ変更したもの（プ ライマー VH- 5， end)を用意した。各 0.5 μ 1の 10 μ Μ配列特異的プライマー VH- 5， endおよび 10 Mプライマー scfor (J. Immunol. Methods 1997; 201: 35- 55)を用い て、反応液 20 L ( 3- 2で調製した精製 VH cDNA増幅断片溶液 1 μ 1, KOD plus buffer (東洋紡績）、 0.2mM dNTPs, 1.5mM MgCl , 0.5 units DNA polymerase KOD
2
plus (東洋紡績））を調製した。 PCRは、サーマルサイクラ一 GeneAmp PCR system 9700 (Parkin Elmer)を用いて、断片の増幅の効率性に従い、条件 A(98°Cで 3分間加 熱後、 98°C 20秒、 58°C 20秒、 72°C 30秒力 なる反応を 1サイクルとして 32サイクル） ないし条件 B (94°Cで 3分間加熱後、 94°C 20秒、 46°C 20秒、 68°C 30秒からなる反応 を 1サイクルとして 5サイクル、さらに 94°C 20秒、 58°C 20秒、 72°C 30秒からなる反応を 1サイクルとして 30サイクル）のいずれかの条件で行った。 PCR後、反応液を 1%ァガロ ーズゲル電気泳動に供した。 目的のサイズ (約 400bp)の増幅断片を QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN)にて添付説明書記載の方法で精製し、滅菌水 30 μ Lで溶 出した。
[0098] マウス抗体 L鎖可変領域 (VL) cDNA断片増幅のために、まず Krebberらの報告（J.
Immunol. Methods 1997; 201: 35- 55)記載の各 0.5 Lの 100 M LBプライマー混合 物および 100 M LFプライマー混合物を用いて、反応液 25 L (3-lで調製した c- DNA溶液 2.5 μ L, KOD plus buffer (東洋紡績）、 0.2mM dNTPs, 1.5mM MgCl ,
2
0.75 units DNA polymerase KOD plus (東洋紡績））を調製した。 PCRは、サーマルサ イクラ一 GeneAmp PCR system 9700 (Parkin Elmer)を用いて、断片の増幅の効率性 に従い、 94°Cで 3分間加熱後、 94°C 20秒、 46°C 20秒、 68°C 30秒からなる反応を 1サ イタルとして 5サイクル、さらに 94°C 20秒、 58°C 20秒、 72°C 30秒からなる反応を 1サイ クルとして 30サイクルの条件で行った。 PCR後、反応液を 1%ァガローズゲル電気泳 動に供した。 目的のサイズ (約 400bp)の増幅断片を QIAqucick Gel Extractio Kit ( QIAGEN)にて添付説明書記載の方法で精製し、滅菌水 30 Lで溶出した。該断片 はその C末端にプライマー LF由来の（Gly4Ser)3-リンカ一配列が付加された状態に ある。該断片 C末端へ Sfi I切断部位を付加する目的で、プライマー LFの（Gly4Ser)3- リンカ一配列を Sfi I切断部位を有するに示す配列（配列番号： 6)へ変更したもの（プ ライマー VL-3' end)を用意した。 Sfi I切断部位付加 VL断片（Sfi I_VL)増幅のために 、各 0.5 Lの 10 M VL- 3， endプライマー混合物および 10 M scbackプライマーを 用いて、反応液 20 L (精製 VL cDNA増幅断片溶液 1 μ L, KOD plus buffer (東洋紡 績）、 0.2mM dNTPs, 1.5mM MgCl , 0.5 units DNA polymerase KOD plus (東洋紡績
2
) )を調製した。 PCRは、サーマルサイクラ一 GeneAmp PCR system 9700 (Parkin Elmer)を用いて、 94°Cで 3分間加熱後、 94°C 20秒、 46°C 20秒、 68°C 30秒からなる 反応を 1サイクルとして 5サイクル、さらに 94°C 20秒、 58°C 20秒、 72°C 30秒力 なる反 応を 1サイクルとして 30サイクルの条件で行った。 PCR後、反応液を 1%ァガローズゲ ル電気泳動に供した。 目的のサイズ (約 400bp)の増幅断片を QIAquick Gel
Extraction Kit (QIAGEN)を用い、添付説明書記載の方法で精製し、滅菌水 30 しで 溶出した。
[0099] 精製 Sfi I-VHおよび Sfi I-VL断片は Sfi I (タカラノィォ）にて添付説明書記載の方法 に従い反応液を調製し、 50°Cで一晩消化を行った。その後、反応液を QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN)を用いて添付説明書記載の方法で精製し、該キット添付 の Buffer EB 30 μしで溶出した。
[0100] 3-4.二種特異性 IgG抗体発現用プラスミド
目的の二種特異性 IgG抗体を産生する際に、各 H鎖のへテロ分子を形成させるた めに IgGlの knobs- into- holes技術（Ridgway et al., Protein Eng. 1996; 9: 617- 621)を 参考に IgG4の CH3部分へのアミノ酸置換体を作製した。タイプ a (IgG4 y a)は Y349C 、 T366W置換体であり、タイプ b (IgG4 y b)は E356C、 T366S、 L368A、 Y407Vの置換 体である。さらに、両置換体のヒンジ領域にも置換 (-ppcpScp- - > -ppcpPcp-)を導 入した。本技術により、殆どへテロ体となり得る力 L鎖についてはその限りでなぐ不 必要な抗体分子の生成がその後の活性測定へ影響を及ぼしかねな 、。そのため、 本方策では各特異性を有する抗体分子片腕 (HL分子と称する）を別々に発現させ細 胞内で目的型二種特異性 IgG抗体を効率的に作らせる為に各 HL分子に対応する発 現ベクターとして異なる薬剤で誘導力 Sかかるものを用いた。
[0101] 抗体分子片腕 (便宜上右腕 HL分子と称する）の発現用として、テトラサイクリン誘導 型ベクター pCDNA4 (Invitrogen)へ H鎖な!/ヽし L鎖それぞれの該領域（図 1な!、し図 2 )、すなわち動物細胞用シグナル配列（IL3ss) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984; 81 : 1075)の下流に適当なマウス抗体可変領域 (VHないし VL)とヒ HgG4 y a定常領 域 (配列番号： 7)な 、し κ定常領域 (配列番号： 8)を組み込んだもの (pcDNA4-g4H ないし pcDNA4- g4L)を作製した。まず、 pcDNA4をそのマルチクローユングサイトに存 在する制限酵素切断サイト Eco RVおよび Not 1 (タカラバイオ)で消化した。適当な抗 体可変領域を有するキメラ二種特異性抗体右腕 H鎖な ヽし L鎖発現ユニット (それぞ れ約 1.6kbないし約 l .Okb)を Xho 1 (タカラバイオ）で消化した後に、 QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN)にて添付説明書記載の方法で精製し、 DNA polymerase KOD (東洋紡績)を用いて添付説明書記載の反応液組成にて 72°C10分間反応させ 、末端を平滑化した。該平滑化末端断片を QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN )にて添付説明書記載の方法で精製し、 Not 1 (タカラバイオ)で消化した。該 Not I-blunt断片（それぞれ約 1.6kbないし l .Okb)と該 Eco RV-Not Iで消化した pcDNA4を 、 Ligation High (東洋紡績)を用いて添付説明書記載の方法に従い連結反応を行つ た。該反応液により大腸菌 DH5 α株 (Competent high DH5 a (東洋紡績)）を形質転 換した。得られたアンピシリン而性クローンより QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN) を用いて各々プラスミド DNAを単離した。
[0102] もう一方の片腕 (便宜上左腕 HL分子と称する）はエタダイソン類似体誘導型べクタ 一 pIND (Invitrogen)へ H鎖ないし L鎖それぞれの（図 2ないし図 3)、すなわち動物細 胞用シグナル配列（IL3ss) (EMBO. J. 1987; 6: 2939)の下流に適当なマウス抗体可 変領域 (VHな 、し VL)とヒト IgG4 y b定常領域 (配列番号： 9)な 、し κ定常領域 (配列 番号： 8)を組み込んだもの（pIND- g4Hな!、し pIND- g4L)を前述の方法に則り作製し 、各々のプラスミド DNAを単離した。 [0103] 3-5.二種特異性抗体発現ベクター構築
3- 4で調製されたテトラサイクリン誘導型発現プラスミド (PCDNA4- g4Hな 、し pcDNA4-g4L)を Sfi Iで消化し、反応液を 1%ァガローズゲル電気泳動に供した。もとも と有して 、た抗体可変領域部分 (VHな 、し VL (図 1な 、し図 2参照））が除かれた断 片（約 5kb)を QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN)を用い、添付説明書記載の方 法で精製し、滅菌水 30 Lで溶出した。該断片と、それぞれに対応する 3-3で調製さ れた Sfi I消化抗 F.IXa抗体由来 Sfi I-VHないし Sfi I-VL断片を Quick Ligation Kit ( New England Biolabs)を用いて添付説明書記載の方法に従い連結反応を行った。該 反応液により大腸菌 DH5 a株 (Competent high DH5 a (東洋紡績) )を形質転換した 。また、 3-4で調製された Sfi I消化エタダイソン類似体誘導型発現プラスミド（ pIND- g4Hな!、し pIND- g4L)から、上述と同様の手法で抗体可変領域部分 (VHな!ヽ し VL (図 2ないし図 3参照)）を除いた断片と、それぞれに対応する 3-3で調製された Sfi I消化抗 F.X抗体由来 Sfi I-VHないし Sfi I-VL断片を、同様の手法にて組込んだ。
[0104] 得られた各々のアンピシリン耐性形質転換体は、挿入断片を挟み込むようなプライ マーを用いて、コロニー PCR法にて目的断片の挿入を確認した。まず、抗 F.IXa抗体 キメラ H鎖ないし L鎖発現ベクターのために、挿入部位上流に存在する CMV Forward priming siteヘア-一ルする 21- merのプライマー CMVF (配列番号： 10)と挿入部位 下流に存在する BGH Reverse priming siteヘア二. ~~ノレす ol8— merのプフィマ1 ~~ BGHR (配列番号：11)を合成した（Sigma Genosys)。抗 F.X抗体キメラ H鎖な!/、し L鎖 発現ベクターのために、挿入部位上流ヘアニールする 24-merのプライマー EcdF (配 列番号： 12)と挿入部位下流に存在する BGH Reverse priming siteヘアニールする 18- merのプライマー BGHR (配列番号： 11)を合成した（Sigma Genosys) 0コロニー PCRのために、反応液 20 L (各 10 μ Μプライマー 0.2 μ L、 KOD dash buffer (東洋紡 績）、 0.2mM dNTPs、 0.75 units DNA polymerase KOD dash (東洋紡績））を調製した 。該反応液へ、形質転 ·細胞を適量投入し PCRを行った。 PCRは、サーマルサイク ラー GeneAmp PCR system 9700 (Parkin Elmer)を用いて、 96°Cで 1分間加熱後、 96 °C 10秒、 55°C 10秒、 72°C 30秒からなる反応を 1サイクルとして 30サイクル反応させる 条件より行った。 PCR後、反応液を 1%ァガローズゲル電気泳動に供し、目的サイズの 増幅断片が得られたクローンを選択した。該 PCR産物は、 ExoSAP-IT (Amersham Biosciences)を用いて添付説明書に従い、過剰のプライマーと dNTPsの不活性化を 行った。各 DNA断片の塩基配列は、 BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit ( Applied Biosystems)を用い、 DNAシークェンサ一 ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems)にて添付説明書記載の方法に従い決定した。本方法により決 定した配列群を解析ソフト GENETYX- SV/RC Version 6.1 (Genetyx)にて解析し、 VH について挿入欠失変異等の入っていない目的クローンを、また、 VLについてハイブ リドーマで使用された P3U1由来偽 VL遺伝子とは異なり挿入欠失変異等のはいって Vヽな 、目的クローンを選択した。
[0105] 該目的クローンから、 QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN)を用いて各々プラスミド DNAを単離し、 100 Lの滅菌水へ溶解した。抗 F.IXa抗体キメラ H鎖発現ベクター、 抗 F.IXa抗体キメラ L鎖発現ベクター、抗 F.X抗体キメラ H鎖発現ベクター、そして抗 F.X抗体キメラ L鎖発現ベクターを、それぞれ pcDNA4- g4IXaHn、 pcDNA4- g4IXaLn、 pIND-g4XHnそして pIND-g4XLnと名付けた。各プラスミド溶液は、使用するまで 4°C で保存した。
[0106] 〔実施例 4〕 キメラ二種特異性抗体の動物細胞での発現
4-1.DNA溶液の調製
抗体右腕 HL分子発現用ベクター（pcDNA4- g4IXaHnそして pcDNA4- g4IXaLn)は テトラサイクリンにより発現誘導がかかる。テトラサイクリンが存在しな 、状況下で発現 を完全に抑制する為に Tetリプレッサーをコードするプラスミド pcDNA6/TR(Invitrogen )が要求される。また、抗体左腕 HL分子発現用ベクター (pIND_g4XHnそして PIND-g4XLn)は昆虫ホルモンであるエタダイソン類似体（ポナステロン A)により発現 誘導がかかる。このとき、ボナステロン Aと反応し誘導を行うエタダイソンレセプターと レチノイド Xレセプターをコードするプラスミド pVgRXR(Invitrogen)が要求される。従つ て、動物細胞のトランスフエクシヨンの為に計 6種類のプラスミド DNA混液を調製した。 細胞培養液 1 mLの為に、 pcDNA4- g4IXaHn、 pcDNA4- g4IXaLn、 pIND- g4XHnそし て pIND- g4XLnを各 218.8 ng、 pcDNA6/TRそして pVgRXRを各 1312.5 ng用いた。
[0107] 4- 2.動物細胞のトランスフ クシヨン ヒト胎児腎癌細胞由来 HEK293H株（Invitrogen)を 10%FCS (MOREGATE)を含む DMEM培地 (Invitrogen)へ懸濁し、 5 X 105個/ mLの細胞密度で接着細胞用 12-wellプ レート（CORNING)の各 wellへ lmLずつ蒔きこみ COインキュベーター（37°C % CO
2 、 5
2
)内で培養した。 4-1で調製したプラスミド DNA混液をトランスフエクシヨン試薬、 Lipofectamine 2000 (Invitrogen) 7 μ Lと Opti- MEM I培地（Invitrogen) 250 μ Lの混液 へカロえて室温 20分間静置したものを各 wellの細胞へ投入し、 4一 5時間、 COインキュ
2 ベータ一（37°Cにて 5% CO )内でインキュベートした。
2
[0108] 4-3.二種特異性 IgG抗体の発現誘導
前項のようにトランスフエクシヨンした細胞培養液力も培地を吸引除去し、 1 μ g/mL のテトラサイクリン（和光純薬工業）を含む 1 mL CHO-S-SFM- II (Invitrogen)培地を 投入し、 COインキュベーター（37°C で 1日培養して、抗体右腕 HL分子
2 、 5% CO )内
2
の第一次発現誘導を行った。その後、培地を吸引除去し、一旦 1 mL
CHO- S- SFM- II培地にて洗浄した後、 5 μ Μのポナステロン A (Invitrogen)を含む 1 mL CHO- S- SFM- II培地を投入し、 COインキュベーター (37°C
2 、 5% CO )内で 2日な
2
いし 3日培養して、抗体左腕 HL分子の第二次発現誘導を行い培地中へ二種特異性 IgG抗体を分泌させた。培養上清は回収された後、遠心分離 (約 2000g、 5分間、室温 )して細胞を除去し、必要に応じて Microcon(R) YM- 50 (Millipore)で濃縮を行った。該 サンプルは使用するまで 4°Cで保存した。
[0109] 〔実施例 5〕 ヒ HgG濃度の定量
Goat affinity purined antibody to human IgG Fc (し appel) coating bufferにて 1 μ g/mLに調製し、 Nunc- Immuno plateに固相化した。 Diluent buffer (D.B.)にてブロッキ ング処理した後、 D.B.を用いて適当に希釈した培養上清サンプルを添加した。また、 抗体濃度算出のためのスタンダードとして、 1000 ng/mLから 2倍系列で D.B.にて 11段 階希釈したヒ HgG4 (ヒト型化抗 TF抗体、 WO 99/51743参照）を同様に添加した。 3回 洗净したのち、 uoat anti-human IgG, alkaline phosphatase (Biosource International) を反応させた。 5回洗浄したのち、 Sigma 104(R) phosphatase substrate (Si gma— Aldrich )を基質として発色させ、吸光度リーダー Model 3550 (Bio-Rad Laboratories)により、 参照波長 655nmとして 405nmの吸光度を測定した。 Microplate Manager III (Bio-Rad Laboretories)ソフトウェアを用いて、スタンダードの検量線から培養上清中のヒト IgG 濃度を算出した。
[0110] 〔実施例 6〕 F.VIIIa (活性ィ匕凝固第 Vin因子)様活性アツセィ
二種特異性抗体の F.VIIIa様活性は、以下の酵素アツセィで評価した。また、以下 の反応は全て室温で行った。 3.75 μ g/mLの Factor IX (Enzyme Research Laborat ories) 40 μ Lと抗体溶液 10 μ Lの混合液を 96穴プレート中で 1時間インキュベーション した。さらにその混合揿'に、 10 ng/mLの Factor XIa (Enzyme Research Laboratories) 10 μ L, 50 μ g/mLの Factor X (Enzyme Research Laboratories) 20 μ L, 400 μ g/mLの phospholipid (実施例 1-3参照） 5 L, 5mM CaClと ImM MgClを含む TBSB (以下、
2 2
TBSB-Sと称す） 15 /z Lを添加し、酵素反応を開始させた。 30分間反応させたのち、 0.5M EDTA 10 μ Lをカ卩えることにより停止させた。
[0111] 発色基質溶液 50 Lをそれぞれのゥエルに加えた後、 0分、 30分の 405nm (参照波 長 655nm)における吸光度を Model 3550 Microplate Reader (Bio Rad Loboratories) により測定した。 F.VIIIa様活性は、抗体添加の 30分間の吸光度変化値から抗体無添 加の 30分間の吸光度変化値を引いた値で表した（図 4および 5参照)。
[0112] Phospholipidの溶媒には TBSB、 Factor XIa、 Factor IX及び Factor Xの溶媒には TBSB-Sを用いた。発色基質溶液は、添付説明書に従い溶解したテストチーム発色 基質 S- 2222 (Chromogenix)とポリブレン液（0.6 mg/L hexadimethrine bromide (Sigma ；) )の 1 : 1混合液である。
[0113] さらに、最も活性の高力つた XB12/SB04について、 F.VIIIa様活性の濃度依存性を 測定した (図 6)。
[0114] 〔実施例 7〕 血漿凝固アツセィ
血友病 A血液の凝固能を二種特異性抗体が是正するか明らかにするために、 F.VIII欠乏血漿を用いた活性ィ匕部分トロンボプラスチン時間 (APTT)に対する同抗体 の影響を検討した。様々な濃度の抗体溶液 50 μ F.VIII欠乏血漿 (Biomerieux) 50 μ L及び APTT試薬（Dade Behring) 50 Lの混合液を 37°Cで 3分間加温した。凝固反 応は 20 mMの CaCl (Dade Behring) 50 Lを同混合液に加えることにより開始させた。
2
CR-A (Amelung)が接続された KClOA (Amelung)により凝固するまでの時間を測定し た（図 7および 8)。
[0115] さらに、最も凝固時間の短縮効果の高力つた XB12/SB04について濃度依存性を測 定した（図 9)。
[0116] 〔実施例 8〕 抗体精製
実施例 4に記載の方法で得られた 10mLの培養上清を Centricon(R) YM- 50 ( Millipore)により、 1 mLまで濃縮した。これに 10 μ Lの 10% BSA、 10 Lの 1 % Tween(R) 20及び 100 μ Lの rProtein A Sepharose Fast Flow (.Amersham Biosciences)を添カロ し、 4°Cでー晚転倒混和した。その溶液を 0.22 μ mのフィルターカップ Ultrafree(R)- MC (Millipore)に移し、 0.01% Tween(R) 20を含む TBS 500 μ Lにて 3回洗浄後、 rProtein A Sepharose™榭脂を 100 μしの 0.01% Tween(R) 20を含む 10 mM HC1, pH2.0に懸濁して 3分間静置したのち、抗体を溶出させた。直ちに、 5 μ Lの 1M Tris-HCl , pH8.0をカロ えて中和した。 Microplate Manager III (Bio-Rad Laboretories)ソフトウェアを用いて、 スタンダードの検量線カゝら培養上清中のヒ HgG濃度を算出した。抗体濃度は実施例 5に従い定量した。
[0117] 〔実施例 9〕抗 F.X抗体の GST-AP ウェスタンブロッテイング
F.Xの活性化ペプチド (AP)とグルタチオン Sトランスフェラーゼ (GST)との融合タンパ ク (GST-AP)を発現する組換え大腸菌を構築した。ヒト F.Xの全長翻訳領域をカバー する cDNAをヒト肝臓 Marathon- Ready cDNA(Clontech)から PCR法により増幅後、これ を铸型にさらに AP領域 (Leytus et al.， Biochemistry 1986; 25: 5098)をコードする領域 を PCR法により増幅し pGEM- Tベクター (Promega)へサブクローユングし GST- APをコ ードする pGEX- F10APを得た。該プラスミドを形質転換した大腸菌を培養し、 OD=0.8 にて ImM IPTGを添カ卩し GST-APの発現誘導を行った。培養液を遠心 (3,000 x g, 30 分間、 4°C)後、菌体を回収し使用に供するまで- 20°Cにて保存した。
[0118] その菌体ペレットを培養量の 1/20量の PBSで再懸濁し、懸濁液 O.lmLに対し、
2.4mLの割合で SDS- PAGEサンプルバッファー（IWAKI)をカ卩え、 95°C、 5分間ボイル した。 SDS-PAGE mini (14%)ゲル（旭テクノグラス）の各ゥヱルにその反応溶液 10 μ L を加え、電気泳動を行った。電気泳動後のゲルをセミドライブロッター (BIO- RAD)を 用いて Immobilon- P™ Transfer Membrane (MILLIPORE)へ転写し、 BT- PBS (2% BSA と 0.05% Tween(R) 20を含む PBS)でブロッキングした。ブロッキング終了後、実施例 1 4 で精製された抗 F.Xマウス抗体 SB04または SB06を BT-PBSで 2 μ g/mLに希釈したも のと 1時間反応させた。 0.05% Tween(R) 20を含む PBSで洗浄後、 BT-PBSで 2000倍希 釈したアルカリホスファターゼ標識ャギ抗マウス IgG (H+L) (Zymed Laboratories)と 1 時間反応させた。 0.05% Tween(R) 20を含む PBSで洗浄後、発色基質 BCIP/NBT Phosphatase substrate (Kirkegaad & Perry Laboratories)で発色 せた (|¾ 10を参照)
[0119] 〔実施例 10〕 免疫マウス脾臓由来 scFvライブラリーからの二種特異性抗体の取得 10-1.抗原および免疫
BALB/cマウス（雄、免疫開始時 6週齢、 日本チヤ一ルス'リバ一） 3匹、 MRL/lprマウ ス (雄、免疫開始時 6週齢、 日本チヤ一ルス'リバ一） 3匹、および C57BL/6Nマウス (雄 、免疫開始時 6週齢、 日本チヤ一ルス'リバ一） 3匹に、抗原である Factor IXa j8 ( Enzyme Research Laboratories, Inc.)もしくは Factor X (Enzyme Research
Laboratories, In ）を以下の通り免疫した。初回免疫として FCA (フロイント完全アジュ バント H37 Ra (Difco laboratories) )でェマルジヨン化した抗原を 40 g/head皮下投与 した。 2週間後に FIA (フロイント不完全アジュバント（Difco laboratories) )でェマルジョ ン化した抗原を g/head皮下投与した。以後 1週間間隔で追加免疫を 3回行い、 最終免疫の 8日後にマウスより脾臓を摘出した。
[0120] 10-2.ファージライブラリーの構築
実施例 1 1および 2— 1で作出した免疫マウス摘出脾臓の一部、ならびに実施例 10 1にて作出した免疫マウスからの摘出脾臓を Trizol Reagent (Invitrogen)へ投入 (50mg spleen/ml of the reagent)し、ガラスホモジナイザーを用いて均質化した。その 後、試薬添付マニュアル記載の方法に従い、 Total RNAを抽出した。抽出溶液から PolyATract System 1000キット (Promega)を用いて添付マニュアル記載の方法に従い polyA(+)RNAを抽出した。 RT— PCR(SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR, Invitrogen)にて c_DNAを合成し、使用に際するまで- 20°Cで保存した。
[0121] マウス抗体重鎖可変領域 (VH)および軽鎖可変領域 (VL)cDNAの増幅用プライマ 一として、実施例 3—2および 3—3で用いた HBプライマー混合物、 HFプライマー混合 物、 LBプライ 混合物、そして LFプライ 混合物を用意した。 VH増幅用として 各 1 μ Lの 100 Μ ΗΒプライ 混合物および 100 μ M HFプライ 混合物を用い て、反応液 50 iu L (cDNA溶液2.5 μ 1 KOD plus buffer (東洋紡績）、 0.2mM dNTPs, 1.5mM MgCl , 3.75 units DNA polymerase KOD plus (東洋紡績））を調製した。また
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VL増幅用として各 1 μ Lの 100 M LBプライ 混合物および 100 μ M LFプライ 混合物を用いて、上記と同様の組成反応液 (50 L)を調製した。 PCRは、サ ルサイクラ一 GeneAmp PCR system 9700 (Parkin Elmer)を用いて、 98°Cで 3分間カロ 熱後、 98°C 20秒、 58°C 20秒、 72°C 30秒力 なる反応を 1サイクルとして 32サイクルを 行った。 PCR後、反応液を 2%ァガローズゲル電気泳動に供した。 目的のサイズ (約 400bp)の増幅断片を QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN)を用い、添付説明書記 載の方法で精製し、滅菌水 50 1で溶出した。次に scFv断片を増幅するために、反応 液 100 μ L (VH断片溶液 3 μ 1 VL断片溶液 3 μ 1 KOD plus buffer (東洋紡績）、 0.2mM dNTPs, ImM MgCl , 5 units DNA polymerase KOD plus (東洋紡績））を 10本
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調製し、 lstPCR(94°Cで 3分間加熱後、 94°C 1分、 63°C 4分、力もなる反応を 1サイク ルとして 7サイクル）を行った後、 63°Cに保温した状態で各チューブへ 10 /z M scforプ ライマー、および 10 μ M scbackプライマーを各 2.5 μ 1ずつ添カ卩し、さらに 2nd PCR(94 °Cで 35秒加熱後、 94°C 2分、 63°C 2分、カゝらなる反応を 1サイクルとして 30サイクル）を 行った。 PCR後、反応液を QIAquick PCR purification kit (QIAGEN)にて精製し、精 製産物を制限酵素 Sfi 1(タカラバイオ)にて 50°Cで一晩消化を行った。消化物は 2%ァ ガローズゲル電気泳動に供した後、 目的のサイズ (約 800bp)の増幅断片を QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN)を用い、添付説明書記載の方法で精製し適量の滅菌 水にて溶出した。ファージ gene IIIタンパク上に scFvを提示させるため、ファージミド ベクターとして、 pELBGlad (図 11参照)を用いた。該ベクター 10 gを制限酵素 Sfi 1(タ カラノィォ)にて 50°Cで一晩消化を行った後、 目的のサイズ (約 5kb)の切断断片を QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN)を用い、添付説明書記載の方法で精製し適 量の滅菌水にて溶出した。精製 PCR産物と精製ベクター断片を、 Ligation High (東洋 紡績)を用いて添付説明書記載の方法に従い、 16°C—晩連結反応を行った。該反応 液により大月昜菌 XLlblue electrocompetent cell (Stratagene)あるいはエレクト口マック ス DH12s(Invitrogen)を添付説明書記載の方法に従いエレクトポレーシヨン法による形 質転換を行った。得られたアンピシリン耐性形質転換体を全て回収し、組換え大腸 菌ライブラリ一として使用に供するまで- 20°Cにて保存した。
[0122] 該大腸菌ライブラリー (2 X 109cfo)を 50 mL 2xYTAG (100 μ g/mLアンピシリン、 2%グ ルコースを含む 2χΤΥ)に植菌し、 OD 600 0.4— 0.5まで 37°Cにて培養した。 4 x 1011の ヘルパーファージ VCSM13(Stratagene)をカ卩ぇ 37°C、 15分間静置して感染させた。こ こに 450 mL 2xYTAK (100 μ g/mLアンピシリン、 25 μ g/mLカナマイシンを含む 2χΤΥ )、 25 L lmol/L IPTGを添カ卩し、 30°C 10時間培養した。遠心分離にて培養上清を 回収し、 lOOmL PEG- NaCl溶液（10%ポリエチレングリコール 8000, 2.5 mol/L NaCl)を 混合後、 4°C、 60分間静置した。 10,800 X g、 30分間遠心にてファージを沈殿させ、沈 殿物を 40 mLの水に懸濁し、 8 mL PEG-NaCl溶液を混合後、 4°C、 1時間静置した。 10,800 X g、 30分間遠心にてファージを沈殿させ 5 mL PBSに懸濁しファージライブラ リーを得た。該ファージは使用に際するまで、 4°Cにて保存した。
[0123] 10-3.パンユング法による結合ファージ濃縮
Factor IXa；8もしくは Factor Xを No— Weigh Premeasured NHS— PEO— Biotin
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Microtubes (Pierce)を用いてピオチン標識した。 10— 2で作成されたファージライブラ リー溶液 600 μ 1に 100 pmolのビォチン標識 Factor IXa βもしくは Factor Xを加え、 60 分間抗原と接触させた。 5% M- PBS (5%w/vスキムミルクを含む PBS)で洗浄した Dynabeads M-280 Streptavidin (DYNAL) 600 μ Lを加え、 15分間結合させた。ビーズ 結合ファージを 1 mLの PBST (0.1% Tween-20を含む PBS)にて何回か洗浄した後、 PBSにて洗浄した。 0.8 mLの 0.1 mol/Lグリシン/ HCl (pH2.2)中にビーズを 5分間懸 濁し、ファージを溶出した。
[0124] あるいは、ィムノプレート (MaxiSorp, Nunc)へ固相化した Factor IXa j8もしくは Factor
X (10 μ g/well χ 5)に、 2.5%w/vスキムミルクで 15分間インキュベートしたファージライ ブラリー (80 1/well X 5)を加え、 60分間抗原と接触させた。抗原結合ファージを 1 mL の PBST (0.1% Tween-20を含む PBS)にて何回か洗浄した後、 PBSにて洗浄した。 0.8 mLの 0.1 mol/Lグリシン/ HCl (pH2.2)にて 5分間インキュベートし、ファージを溶出し [0125] 回収したファージ溶液に 45 μし 2 mol/L Trisを添カ卩して中和し、対数増殖期 (OD 600 = 0.4— 0.5) XL1- Blue 10 mLに添加、 37°C、 30分間静置することで感染させた。 これを 2xYTAGプレートに広げ、 30°Cで培養した。コロニーを回収し、 2xYTAGに植菌 、 OD 600 = 0.4— 0.5まで 37°Cにて培養した。培養液 10 mLに 5 μ L lmol/L IPTG, 10 11 pfoヘルパーファージ (VCSM13)を添加し 37°C 30分間静置した。遠心集菌後、 2xYTAK lOOmLに再懸濁し、 30°C、 10時間培養した。遠心分離にて培養上清を回収 し、 20 mL 10%PEG-5mol/L NaCl溶液を混合後、 4°C、 20分間静置した。 10,800 x g、 30分間遠心にてファージを沈殿させ、 2 mL PBSに懸濁したものを次のパンユングに 供した。
[0126] 10-4.ファージ ELISA
上記のシングルコロニーを 100 L 2xYTAGに植菌し、 30°Cでー晚培養した。この 5 μ Lを 500 μ L 2xYTAGに植菌、 37°C、 5時間培養後、ヘルパーファージ 2 x 108pfoを 投入し 37°Cにて 30分間静置、さらに 37°Cにて 30分間攪拌培養後、 0.5 mM IPTGを含 む 2xYTAKを 120 L添カ卩した。 30°Cにてー晚培養し、遠心上清を ELISAに供した。ビ ォチン標識抗原のパンユングにて得られたクローンの ELISAのために、 1.0 g/mLの ピオチン標識抗原でコートした StreptaWell 96マイクロタイタープレート（Roche)を用 いた。また、ネイティブ抗原のパンユングにて得られたクローンの ELISAのために、 1.0 μ g/mLのネイティブ抗原を固相化したィムノプレート (MaxiSorp, Nunc)を用いた。 PBSTにて洗浄し抗原を除いた後、ブロッキングバッファ一として 2% M-PBS 200 Lあ るいは 2% BSA-PBS(2%w/v BSAを含む PBS)で室温 1時間ブロッキングした。バッファ 一を除き、ここに培養上清を加え 60分間静置しファージを結合させた。洗浄後、結合 ファージはブロッキングバッファ一にて希釈した HRP結合抗 M13抗体 (Amersham Pharmacia Biotech)と TMB基質（Zymed)で検出し、 lmol/L H SO添加により反応を
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停止した後、プレートリーダーにて A450の値を測定した。
[0127] 10-5.配列決定とクローン選択
ELISAにて陽性であったクローンの組換え大腸菌 2xYTAG培養液力もプライマー PBG3-F1 (5'- CAGCTATGAAATACCTATTGCC - 3'Z配列番号： 1)と PBG3- R1 ( 5'- CTTTTCATAATCAAAATCACCGG -3'/配列番号： 2)を用いて PCRにて scFv 領域を増幅し、その塩基配列決定した。培養液 1 L、 10 X KOD Dash緩衝液 1.5 μ L 、 10 μ mol/Lプライマーを 0.2 μ Lづっ、 KOD Dashポリメラーゼ（東洋紡績、 2.5 U/ μ L) 0.3 μ Lを含む PCR反応液 15 μ Lを、サーマルサイクラ一 GeneAmp PCR system 9700(Perkin Elmer)で 96°C、 10秒、 55°C、 10秒、 72°C、 30秒、 30サイクルの増幅を行 つた。 PCR後、 5 μ Lの反応液に ExoSAP- IT (アマシャム）を 3 μ L添加し、 37°C、 15分 間、引き続き 80。C、 15分間保温した。このサンプルについて PBG3-F2 (5，- ATTGCCTACGGCAGCCGCT - 3'Z配列番号： 3)ある!/、は PBG3- R2 (5'- AAATCACCGGAACCAGAGCC -3'Z配列番号： 4)をプライマーとして BigDye Terminatorし ycle Sequencing kit (Applied Biosystems;【こて反 i 行 ヽ、 Applied Biosystems PRISM 3700 DNA Sequencerで泳動した。塩基配列から推定されるァミノ 酸配列の CDR3の異なるクローンを抗 Factor IXaについて 52クローン、及び抗 Factor Xについて 33クローンを選択した。
[0128] 10-6.二種特異性 IgG抗体発現ベクターの構築
scFv抗体を IgG型として発現させるために、実施例 3-3、 3-4、そして 3—5に示す同 様の方策にて抗体可変領域 (VH,VL)を誘導型発現ベクターにクローユングを行った 。抗 F.IXa抗体可変領域 (VHおよび VL)はテトラサイクリン誘導型ベクター（それぞれ pcDNA4-g4Hおよび pcDNA4-g4L)へ組み込まれた。抗 F.X抗体可変領域 (VHおよ び VL)はエタダイソン類似体誘導型ベクター（それぞれ pIND-g4Hおよび
pcDNA4-g4L)へ組み込まれた。 目的クローンから QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN)を用いて各々プラスミド DNAを単離し、 100 Lの滅菌水へ溶解した。
[0129] 10-7.キメラ二種特異性抗体の動物細胞での発現
実施例 4 1に示す同様の方策で調製された DNA溶液を用いて、実施例 4 2およ び 4 3に示す同様の方策にて動物細胞で発現させ、培養上清を回収した。該サン プルは使用するまで 4°Cで保存した。
[0130] 〔実施例 11〕 抗体精製
実施例 10— 7に記載の方法で得られた 10mLの培養上清に 100 μ Lの rProtein A Sepharose™ Fast Flow (Amersham Biosciences)を添カ卩し、 4°Cでー晚転倒混和した。 その溶液を 0.22 μ mのフィルターカップ Ultrafree(R)- MC (Millipore)に移し、 0.01% Tween(R) 20を含む TBS 500 μ Lにて 3回洗浄後、 rProtein A Sepharose™榭脂を 100 μ しの 0.01% Tween(R) 20を含む 10 mM HC1, pH2.0に懸濁して 3分間静置したのち、抗 体を溶出させた。直ちに、 5 μ Lの 1M Tris-HCl , pH8.0をカ卩えて中和した。
Microplate Manager III (Bio-Rad Laboretories)ソフトウェアを用いて、ヒト IgG4 (ヒト型 化抗 TF抗体、 WO 99/51743参照）の検量線から培養上清中のヒ HgG濃度を算出し た。抗体濃度は実施例 5に従い定量した。
[0131] 〔実施例 12〕 F.VIIIa (活性化凝固第 VIII因子)様活性アツセィ
二種特異性抗体の F.VIIIa様活性は、以下の酵素アツセィで評価した。また、以下 の反 J心 fま全て至温で行つ 7こ。 15 μ g/mLの Factor IX (Enzyme Research Laboratories ) 10 μ Lと lOOmM CaClと 20mM MgClを含む TBSB 5 μ Lと実施例 10— 7記載の方法
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で得られた培養上清 50 μ Lの混合液を 96穴プレート中で 1時間インキュベーションし た。さらにその混合揿に、 10 ng/mLの Factor XIa (Enzyme Research Laboratories) 10 μ L, 50 ^ g/mLの Factor X (Enzyme Research Laboratories) 20 μ L, 400 μ g/mLの phospholipid 5 Lを添カ卩し、酵素反応を開始させた。 30分間反応させたのち、 0.5M EDTA 10 Lをカ卩えることにより停止させた。
[0132] 発色基質溶液 50 μ Lをそれぞれのゥヱルに加えた後、 0分、 60分の 405nm (参照波 長 655nm)における吸光度を Model 3550 Microplate Reader (Bio Rad Loboratories) により測定した。 F.VIIIa様活性は、抗体発現培養上清の 60分間の吸光度変化値から 抗体非発現培養上清の 60分間の吸光度変化値を引いた値で表した (図 12を参照）
[0133] Phospholipid, Factor XIa、 Factor IX及び Factor Xの溶媒には TBSBを用いた。発色 基質溶液は、添付説明書に従 ヽ溶解したテストチーム発色基質 S-2222 (
Chromogenix)とポリブレン揿' (0.6 mg/L hexadimethrine bromide (Sigma) )の 1:1混合 液である。
[0134] 〔実施例 13〕 血漿凝固アツセィ
実施例 11の方法に従い調製した二種特異性抗体が血友病 A血液の凝固能を回復 するか明らかにするために、 F.VIII欠乏血漿を用いた活性ィ匕部分トロンボプラスチン 時間 (APTT)に対する同抗体の影響を、実施例 7で示す同様の方法で評価した（図 1 3を参照）。さらに、凝固時間の短縮効果の高かった A44/B26、 A69/B26について濃 度依存性を測定した (図 14、図 15を参照)。
[0135] 〔実施例 14〕 二種特異性 IgG抗体と F. VIIIとの併用検討
二種特異性抗体と F.VIIIとの併用検討は、以下の血漿凝固アツセィ条件で評価し た。 25 μ g/mL抗体溶液 40 μ L、 F.VIII欠乏血漿（Biomerieux) 50 μ Lの混合液を室 温で、 30分間インキュベーションした。さらにその混合液に、 0.1U/mLの遺伝子組換 え型血液凝固第 Vin因子製剤コージネイト (R)FS (BAYER) 10 L及び APTT試薬（ Dade Behring) 50 Lを加え、 37°Cで 3分間加温した。凝固反応は 20 mMの CaCl (
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Dade Behring^O /z Lを同混合液に加えることにより開始させた。 CR-A (Amelung)が 接続された KClOA(Amelung)により凝固するまでの時間を測定した（図 16を参照）。
[0136] 〔実施例 15〕 インヒビター血漿における二種特異性 IgG抗体の効果
インヒビター血漿における二種特異性 IgG抗体の効果は、以下の血漿凝固アツセィ 条件で評価した。 F.VIII欠乏血漿（Biomerieux) 50 μ Lに 100 μ g/mL抗ヒト F.VIII中和 抗体（Catalog Number:MAB3440、 CHEMICON) 10 μ Lの混合液を室温で、 30分間ィ ンキュベーシヨンした。この血漿をインヒビター血漿として用いた。このインヒビター血 漿に、 25 μ g/mL抗体溶液 40 μ L及び APTT試薬（Dade Behring) 50 μ Lを加え、 37°C で 3分間加温した。凝固反応は 20 mMの CaCl (Dade Behring) 50 Lを同混合液に
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加えることにより開始させた。 CR-A (Amelung)が接続された KC1 OA (Amelung)により 凝固するまでの時間を測定した（図 17を参照)。
[0137] 〔実施例 16〕 二種特異性抗体のヒトイ匕
実施例 1一 7で取得した二種特異性抗体の中で、血液凝固時間の短縮効果が最も 高かった XB12(マウス抗 FactorlXa抗体)/ SB04(マウス抗 FactorX抗体)につ!/、て、以下 のようにヒト化を実施した。
[0138] 16-1.ヒト抗体の相同性検索
一般公開されて ヽる Kabat Database (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/kabat/) および IMGT Database (http：〃 imgt.cines.fr/)よりヒト抗体アミノ酸配列データを入手 し、構築した Databaseを用いてマウス XB12-H鎖可変領域、マウス XB12- L鎖可変領 域、マウス SB04-H鎖可変領域、マウス SB04-L鎖可変領域に分けてホモロジ一検索 を行った。その結果、以下に示すヒト抗体配列と高い相同性を持つことが確認された ことからヒト化抗体のフレームワーク領域 (以下、 FR)に使用することにした。
[0139] (1)XB12- H鎖可変領域： KABATID- 020619 (Kabat Database)
(Marietteら、 Arthritis Rheum. 1993 ; 36 : 1315-1324)
(2) XB12- L鎖可変領域： EMBL Accession No. X61642(IMGT Database)
(Markら、 J Mol Biol. 1991； 222： 581-597.)
(3) SB04-H鎖可変領域： KABATID- 025255 (Kabat Database)
(Demaisonら、 Immunogetetics 1995 ;42 : 342-352)
(4) SB04- L鎖可変領域： EMBL Accession No. AB064111(IMGT Database)
(Unpublished data)
(l)-(4)のヒト抗体の FRに各マウス抗体の相補性抗原決定領域 (以下、 CDR)を移植し たヒト化抗体を作製した。
[0140] また、 NCBIより一般公開されている相同性検索 Web site (http://www.ncbi.
nlm.nih.gov/BLAST/)を使用して、（1)-(4)のヒト抗体に相同性の高いヒト抗体の分泌 シグナル配列を検索した。検索により得られた以下に示す分泌シグナル配列を使用 した。
(1) XB12- H鎖可変領域： GenBank Accession No. AF062120
(2) XB12- L鎖可変領域： GenBank Accession No. M74019
(3) SB04- H鎖可変領域： GenBank Accession No. BC019337
(4) SB04- L鎖可変領域： GenBank Accession No. AY204756
[0141] 16-2.ヒト化抗体遺伝子発現ベクターの構築
分泌シグナル配列から抗体可変領域にいたるアミノ酸配列をコードする塩基配列 にお!/、て、 50base程度の合成オリゴ DNAを 3，末端側が約 20base程度ハイブリダィズ するように交互に 12本作製した。さらに、抗体可変領域遺伝子の 5 '末端側にハイプリ ダイズし、 Xhol切断配列を有するプライマーと抗体可変領域遺伝子の 3 '末端側にハ イブリダィズし、 Sfil切断配列を有するプライマーを作製した。
[0142] 2.5 μ Μに調製した合成オリゴ DNAを各 1 μ Lで混合し、 lx TaKaRa Ex Taq Buffer, 0.4mM dNTPs, 0.5units TaKaRa Ex Taq (全て宝酒造)を加え、反応液 48 μ Lになるよ うに調製した。 94°C 5分保温した後に、 94°C 2分、 55°C 2分、 72°C 2分からなる反応 を 2サイクル行い、各合成オリゴ DNAのアッセンブルおよび伸長反応を実施した。次 に、抗体遺伝子の 5，末端側および 3，末端側にハイブリダィズするプライマー (各 10 μ Μ)を 1 μ L添加し、 94°C 30秒、 55°C 30秒、 72°C 1分からなる反応を 35サイクル行い、 72°C 5分反応させ、抗体可変領域遺伝子を増幅した。 PCR後、反応液全量を 1%ァガ ローズゲル電気泳動に供した。 目的のサイズ (約 400bp)の増幅断片を QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN)を用いて、添付説明書記載の方法で精製し、滅菌水 30 μ 1 で溶出した。該断片を pGEM- T Easy Vector Systems (Promega)を用いて、添付説明 書記載の方法でクローユングを行った。各 DNA断片の塩基配列は、 BigDye
Terminatorし ycle Sequencing Kit (Applied Biosystems)を用 ヽ、 DNAン ~~クェンサ ~~ ABI PRISM 3700 DNA Sequencer (Applied Biosystems)にて、添付説明書記載の方 法に従い決定した。
正しいヒトイ匕抗体可変領域遺伝子配列であることが確認されたプラスミドを Xholおよ び Sfilで消化した後に、反応液を 1%ァガローズゲル電気泳動に供した。 目的のサイズ (約 400bp)の DNA断片を QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN)を用いて、添付説 明書記載の方法で精製し、滅菌水 30 1で溶出した。また、実施例 3— 4で作製したテ トラサイクリン誘導型発現プラスミド（pcDNA4- g4H、 pcDNA4- g4L)およびェグダイソン 類似体誘導型発現プラスミド (pIND- g4H、 PIND-g4L)を Xholおよび Sfilで消化した後 に、抗体定常領域を含む断片（約 5kb)を QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN)を 用いて、添付説明書記載の方法で精製し、滅菌水 30 1で溶出した。 Xholおよび Sfil で消化したヒト化 XB12抗体遺伝子断片 (H鎖可変領域 (以下 VH)または L鎖可変領域（ 以下 VL))と Xholおよび Sfilで消化したテトラサイクリン誘導型発現プラスミド（ pcDNA4— g4H、 pcDNA4— g4L)を Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics)を用い て添付説明書記載の方法で連結反応を行った。また、 Xholおよび Sfilで消化したヒト ィ匕 SB04抗体遺伝子断片 (H鎖可変領域または L鎖可変領域)と Xholおよび Sfilで消化 したェグダイソン類似体誘導型発現プラスミド（pIND- g4H、 pIND- g4L)を Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics)を用いて添付説明書記載の方法で連結反応を行つ た。各反応液の一部を用いて大腸菌 DH5 a株（東洋紡績)を形質転換した。 [0144] 16-3.ヒト化二種特異性抗体の調製
4種類のヒト化抗体発現ベクターと pcDNA6/TR、 pVgRXRを用いて、実施例 4 2、 4 3に示す方法で HEK293Hへ遺伝子導入および発現誘導を行った。さらに、実施例 8、 5に示す方法で抗体精製および抗体濃度の定量を実施した。
[0145] 16-4.ヒト化二種特異性抗体の活性評価および抗体配列の改変
調製したヒト化-種特異性抗体およびキメラ-種特異性抗体 (XB12/SB04)の血漿 凝固能を評価するために、実施例 7の方法に従って、 F.VIII欠乏血漿を用いて APTT に対する抗体の影響を検討した。血液凝固能が低下したヒト化-種特異性抗体につ いて、活性上昇を目指して、ヒト抗体 FRのアミノ酸の改変した。また、熱安定性低下な どが危惧される XB12抗体 VHの CDR3のシスティン残基についてもァラニン残基に改 変した。具体的には、 QuikCnange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) 用 いて、添付説明書記載の方法でヒト化抗体発現ベクターに変異を導入した。 FR配列 のアミノ酸改変および血液凝固能の評価を繰り返すことで XB12/SB04と同等の活性 を有するヒトイ匕-種特異性抗体 (ヒト化 XB12抗体 (VH:hXB12f- A, VL:hXBVL) /ヒトイ匕 SB04抗体 (VH:hSB04e, VL:hSBVL- F31)を取得した（図 18)。
産業上の利用可能性
[0146] 本発明により酵素および該酵素の基質の両方を認識する抗体であって、酵素活性 を増強する補因子の機能を代替する二種特異性抗体が提供された。
本発明の二種特異性抗体は、血中での安定性が高ぐ抗原性も低いと考えられる こと力 、医薬品となるものと大いに期待される。

Claims

請求の範囲
[1] 酵素、および該酵素の基質の両方を認識する抗体であって、酵素反応を増強する補 因子の機能を代替する二種特異性抗体。
[2] 酵素が蛋白質分解酵素である、請求項 1に記載の抗体。
[3] 蛋白質分解酵素、基質ならびに補因子が血液凝固線溶関連因子である、請求項 2 に記載の抗体。
[4] 血液凝固線溶関連因子の酵素が血液凝固第 IX因子および/または活性ィ匕血液凝固 第 IX因子で、基質が血液凝固第 X因子で、補因子が血液凝固第 VIII因子および/ま たは活性ィ匕血液凝固第 VIII因子である、請求項 3に記載の抗体。
[5] 抗血液凝固第 IX/IXa因子抗体における下記 (al)もしくは (a2)の CDR3のアミノ酸配 列からなる相補性決定領域またはこれと機能的に同等の相補性決定領域と、抗血液 凝固第 X因子抗体における下記 (bl)—（b9)のいずれかに記載の CDR3のアミノ酸 配列からなる相補性決定領域またはこれと機能的に同等の相補性決定領域とを含 む、請求項 1一 4のいずれかに記載の抗体。
(al) H鎖 CDR3が配列番号： 16に記載のアミノ酸配列
(a2) H鎖 CDR3が配列番号： 20に記載のアミノ酸配列
(bl) H鎖 CDR3が配列番号： 24に記載のアミノ酸配列
(b2) H鎖 CDR3が配列番号： 28に記載のアミノ酸配列
(b3) H鎖 CDR3が配列番号： 32に記載のアミノ酸配列
(b4) H鎖 CDR3が配列番号： 36に記載のアミノ酸配列
(b5) H鎖 CDR3が配列番号： 40に記載のアミノ酸配列
(b6) H鎖 CDR3が配列番号： 44に記載のアミノ酸配列
(b7) H鎖 CDR3が配列番号： 48に記載のアミノ酸配列
(b8) H鎖 CDR3が配列番号： 52に記載のアミノ酸配列
(b9) H鎖 CDR3が配列番号： 56に記載のアミノ酸配列
[6] 抗血液凝固第 IX/IXa因子抗体における下記 (al)もしくは (a2)の CDRのアミノ酸配 列からなる相補性決定領域またはこれと機能的に同等の相補性決定領域と、抗血液 凝固第 X因子抗体における下記 (bl)—（b9)のいずれかに記載の CDRのアミノ酸配 列からなる相補性決定領域またはこれと機能的に同等の相補性決定領域とを含む、 請求項 1一 4のいずれかに記載の抗体。
(al) H鎖 CDR1, 2, 3が配列番号: 14、 15、 16に .記載のアミノ酸配列
(a2) H鎖 CDR1, 2, 3が配列番号: 18、 19、 20に .記載のアミノ酸配列
(bl) H鎖 CDR1, 2, 3が配列番号: : 22、 23、 24に ：記載のアミノ酸配列
(b2) H鎖 CDR1, 2, 3が配列番号: : 26、 27、 28に ：記載のアミノ酸配列
(b3) H鎖 CDR1, 2, 3が配列番号: : 30、 31、 32に ：記載のアミノ酸配列
(b4) H鎖 CDR1, 2, 3が配列番号: 34、 35、 36に ：記載のアミノ酸配列
(b5) H鎖 CDR1, 2, 3が配列番号: : 38、 39、 40に ：記載のアミノ酸配列
(b6) H鎖 CDR1, 2, 3が配列番号: 42、 43、 44に ：記載のアミノ酸配列
(b7) H鎖 CDR1, 2, 3が配列番号: :46、 47、 48に ：記載のアミノ酸配列
(b8) H鎖 CDR1, 2, 3が配列番号: : 50、 51、 52に ：記載のアミノ酸配列
(b9) H鎖 CDR1, 2, 3が配列番号: 54、 55、 56に ：記載のアミノ酸配列
[7] 請求項 1一 6の ヽずれかに記載の抗体および薬学的に許容される担体を含む組成 物。
[8] 出血、出血を伴う疾患、もしくは出血に起因する疾患の予防および/または治療に用
V、られる医薬組成物である、請求項 7に記載の組成物。
[9] 出血、出血を伴う疾患、もしくは出血に起因する疾患が、血液凝固第 vm因子および
/または活性ィ匕血液凝固第 VIII因子の活性の低下ないし欠損によって発症および/ま たは進展する疾患である、請求項 8に記載の組成物。
[10] 血液凝固第 vm因子および/または活性ィ匕血液凝固第 vm因子の活性の低下ないし 欠損によって発症および/または進展する疾患が、血友病 Aである、請求項 9に記載 の組成物。
[11] 血液凝固第 vm因子および/または活性ィ匕血液凝固第 vm因子の活性の低下ないし 欠損によって発症および/または進展する疾患が、血液凝固第 vm因子および/また は活性ィ匕血液凝固第 vm因子に対するインヒビターが出現している疾患である、請求 項 9に記載の組成物。
[12] 血液凝固第 vm因子および/または活性ィ匕血液凝固第 vm因子の活性の低下ないし 欠損によって発症および/または進展する疾患が、後天性血友病である、請求項 9に 記載の組成物。
[13] 血液凝固第 VIII因子および/または活性ィ匕血液凝固第 VIII因子の活性の低下によつ て発症および/または進展する疾患が、フォンビルブランド病である、請求項 9に記載 の組成物。
[14] 請求項 1一 6のいずれかに記載の抗体、または請求項 7— 13のいずれかに記載の組 成物を投与する工程を含む、出血、出血を伴う疾患、もしくは出血に起因する疾患を 予防および/または治療する方法。
[15] 請求項 1一 6のいずれかに記載の抗体の、請求項 7— 13のいずれかに記載した組成 物の製造のための使用。
[16] 少なくとも請求項 1一 6のいずれかに記載の抗体、または請求項 7に記載の組成物を 含む、請求項 14に記載の予防および/または治療する方法に用いるためのキット。
[17] 請求項 4一 6のいずれかに記載の抗体、または請求項 7— 13のいずれかに記載の組 成物を投与する工程を含む、出血、出血を伴う疾患、もしくは出血に起因する疾患を
、血液凝固第 VIII因子と併用して、予防および/または治療する方法、
[18] 少なくとも請求項 4一 6のいずれかに記載の抗体、または請求項 7に記載の組成物を 含み、かつ血液凝固第 VIII因子を含む請求項 17に記載の予防および/または治療 する方法に用いるためのキット。
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