WO2017110980A1 - 増強された活性を有する抗体及びその改変方法 - Google Patents
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Classifications
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- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
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- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
Definitions
- the present invention relates to an antibody having enhanced activity, a pharmaceutical composition containing such an antibody as an active ingredient, a method for producing them, a method for increasing the activity of the antibody, and the like. More specifically, it relates to a bispecific antibody having higher blood coagulation factor VIII (FVIII) -like activity than ACE910.
- FVIII blood coagulation factor VIII
- Non-Patent Documents 1, 2, and 3 are attracting attention as pharmaceuticals because of their high stability in plasma and few side effects. Among them, many IgG-type antibody drugs are on the market, and many antibody drugs have been developed (Non-Patent Documents 1, 2, and 3).
- Hemophilia A is an abnormal bleeding due to congenital FVIII functional decline or deficiency.
- FVIII preparations are usually administered (on-demand administration).
- FVIII preparations are administered prophylactically to prevent bleeding events (Non-patent Documents 1 and 2) (preventive administration).
- the blood half-life of the FVIII preparation is about 12 to 16 hours. Therefore, for continuous prevention, FVIII preparations are administered to patients 3 times a week (Non-patent Documents 3 and 4).
- on-demand administration in order to prevent rebleeding, FVIII preparations are additionally administered at regular intervals as necessary.
- administration of the FVIII preparation is performed intravenously. Therefore, there has been a strong demand for a drug that has a lower administration burden than the FVIII preparation.
- Inhibitors against FVIII occur in hemophilia patients. Inhibitors counteract the effects of the FVIII formulation.
- a bypass formulation is administered for bleeding in patients with inhibitors (inhibitor patients). Their mechanism of action is independent of the function of FVIII, ie the ability to catalyze the activation of blood coagulation factor X (FX) by activated blood coagulation factor IX (FIXa). Therefore, there are cases where the bypass preparation cannot sufficiently stop bleeding. Therefore, there has been a strong demand for drugs that are independent of the presence of inhibitors and that substitute for the function of FVIII.
- Patent Documents 1, 2, 3, and 4 Bispecific antibodies that substitute for the function of FVIII and their use have been reported.
- Bispecific antibodies against FIXa and FX can exhibit FVIII-like activity and substitute for the function of FVIII by positioning both factors in the vicinity (Non-patent Document 5). It has been reported that the FVIII-like activity of the antibody can be improved by optimizing the affinity for FIXa and FX (Non-patent Document 6).
- the FVIII-like activity of the antibody is affected by the isotype of IgG, the disulfide bond pattern, the amino acid sequence of the hinge region, and the presence or absence of sugar chains in the Fc region (Non-patent Document 7).
- ACE910 which is one of the antibodies and has a high FVIII-like activity, has been reported to exert a hemostatic effect in a monkey hemophilia model (Non-patent Documents 8 and 9). However, no bispecific antibody having an FVIII-like activity higher than that of ACE910 has been reported so far.
- the present invention has been made in view of the above circumstances, and has an antibody having enhanced activity, a pharmaceutical composition containing such an antibody as an active ingredient, a method for producing them, and a method for enhancing the activity of the antibody
- the purpose is to provide. More specifically, a constant region mutation for producing a bispecific antibody having higher FVIII-like activity than ACE910, and an anti-FIXa / FX bispecific antibody having the same mutation, which is effective It is an object of the present invention to provide a pharmaceutical composition containing as a component, or a method for treating hemophilia A using the pharmaceutical composition.
- the present inventors have created ACE910 mutants in which various sites of the constant region are modified, and succeeded in finding a bispecific antibody having FVIII-like activity higher than that of ACE910.
- the present invention is based on such knowledge and relates to [1] to [15] below.
- the H chain consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 and the L chain consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 are associated with each other before the modification.
- the composition according to [6] which is a disease that develops and / or progresses due to a decrease or deficiency in the activity of a factor.
- Diseases that develop and / or develop due to decreased or deficient activity of blood coagulation factor VIII and / or activated blood coagulation factor VIII are hemophilia A, acquired hemophilia, von Willebrand disease or
- the composition according to [7] which is a disease in which an inhibitor against blood coagulation factor VIII and / or activated blood coagulation factor VIII appears.
- the H chain composed of the amino acid sequence described in 1 and the L chain composed of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3 are associated, and the H chain composed of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 and the amino acid described in SEQ ID NO: 3
- the method, wherein at least one amino acid residue of a constant region of a bispecific antibody to which an L chain consisting of a sequence is associated is modified.
- a method for producing a blood coagulation factor IX and / or activated blood coagulation factor IX, and a bispecific antibody against blood coagulation factor X comprising: (a) at least one amino acid residue in the constant region Is modified, the H chain consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 and the L chain consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3 are associated, and consists of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2.
- An antibody comprising the amino acid residue so that the blood coagulation factor VIII-like activity is enhanced as compared with a bispecific antibody in which the H chain and the L chain consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 are associated; Modifying the encoding nucleic acid, (b) culturing the host cell to express the nucleic acid, and (c) recovering the antibody from the host cell culture.
- a method for preventing and / or treating bleeding, a disease accompanied by bleeding, or a disease caused by bleeding which comprises the step of administering the antibody according to any one of [1] to [5].
- the disease is a disease that develops and / or progresses due to decreased or deficient activity of blood coagulation factor VIII and / or activated blood coagulation factor VIII, preferably hemophilia A, acquired blood
- an antibody according to [18] an antibody according to [18].
- a bispecific antibody having higher FVIII-like activity than ACE910 was provided. Also provided are mutations that increase FVIII-like activity and methods for increasing FVIII-like activity using the mutations.
- FIG. 4 shows the effect of various bispecific antibody formats on the FVIII-like activity of ACE910. It is the figure which showed FVIII like activity of ACE910 and T08 It is the figure which showed FVIII like activity of ACE910 and T46P
- One embodiment of the present invention relates to an antibody comprising a modified constant region, wherein the constant region contains a mutation of at least one amino acid residue and has a higher activity than the antibody before the modification.
- the “antibody containing a constant region” in the present invention is not particularly limited as long as it is an antibody containing a constant region, and may be an IgG type or a bispecific antibody.
- the constant region as one embodiment of the present invention is preferably an antibody constant region, more preferably an IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 type antibody constant region, and even more preferably human IgG1, IgG2, IgG3. IgG4 type antibody constant region.
- the constant region as another embodiment of the present invention is preferably a heavy chain constant region, more preferably an IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 type heavy chain constant region, and still more preferably a human. IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4 heavy chain constant regions.
- the amino acid sequences of human IgG1 constant region, human IgG2 constant region, human IgG3 constant region and human IgG4 constant region are known.
- constant regions of human IgG1, human IgG2, human IgG3, and human IgG4 antibodies multiple allotype sequences due to gene polymorphisms are described in SequencesSof proteins of immunological interest, NIH Publication No.91-3242. Any of them may be used.
- the constant region in which the amino acid of the present invention is modified may contain other amino acid mutations and modifications as long as it contains the amino acid mutation of the present invention.
- the Fc region includes an amino acid sequence derived from the constant region of the antibody heavy chain.
- the Fc region is a part of the heavy chain constant region of the antibody including the hinge, CH2 and CH3 domains from the N-terminus of the hinge region at the papain cleavage site at the approximately amino acid position 216 represented by EU numbering.
- hinge region refers to linking the CH1 and CH2 domains in a wild-type antibody heavy chain, eg, from around 216 to around 230 according to Kabat's EU numbering system, or according to Kabat's EU numbering system. For example, it means the antibody heavy chain polypeptide portion from about position 226 to about position 230.
- the hinge region of other IgG subclasses can be determined by aligning with the hinge region cysteine residues of the IgG1 subclass sequence.
- the polypeptide in the present invention usually refers to peptides and proteins having a length of about 10 amino acids or more.
- it is usually a biological polypeptide, but is not particularly limited, and may be, for example, a polypeptide comprising an artificially designed sequence.
- any of natural polypeptide, synthetic polypeptide, recombinant polypeptide, etc. may be sufficient.
- fragments of the above polypeptides are also included in the polypeptides of the present invention.
- the amino acid positions assigned to CDRs and FRs of antibodies are defined according to Kabat (Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute of Health, Bethesda, Md. , 1987 and 1991.
- Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest
- the amino acids in the variable region are in accordance with Kabat numbering
- the amino acids in the constant region are EU numbering according to the amino acid position of Kabat. It is expressed according to
- “Amino acid residue modification” as one embodiment of the present invention is not particularly limited as long as it is a modification that enhances the activity as compared with the antibody before the modification, and is preferably a modification in the CH3 region or the hinge region. Particularly preferred is a modification at position 434 of EU numbering, and more preferred is a modification of changing EU numbering position 434 from Asn (N) to Tyr (Y). Particularly preferred is a modification in the hinge region, and more preferred is a modification in which EU numbering at positions 216 to 230 is AAAC. It should be noted that the present invention also includes a modification in which EU numbering 216 to 230 is made AAAA by modifying a part of EU numbering 216 to 230. Moreover, as long as the said mutation is included, the other variation
- “modification” or “modifying” means replacing an original amino acid residue with another amino acid residue, deleting the original amino acid residue, a new amino acid It refers to adding a residue, a combination thereof, and the like. “Mutation” refers to substitution of an original amino acid residue with another amino acid residue, deletion of the original amino acid residue, addition of a new amino acid residue, a combination thereof, and the like. In the present specification, “modification” and “mutation” are used synonymously.
- “Activity” as one embodiment of the present invention refers to, but is not limited to, for example, a binding force of an antibody to an antigen, a biological action caused by binding of an antibody to an antigen, and the like.
- the antibody is a bispecific antibody against blood coagulation factor IX (FIX) and / or activated blood coagulation factor IX (FIXa) and blood coagulation factor X (FX), for example, activity is blood coagulation factor FVIII factor (FVIII) -like activity.
- FVIII blood coagulation factor
- the FVIII-like activity of the bispecific antibody after modification is FVIII of the bispecific antibody before modification. It means that it is higher than the activity.
- FVIII FVIII is one of a series of molecules involved in blood coagulation. When activated by thrombin or FXa, it exhibits cofactor activity and promotes FX activation by FIXa.
- FVIII-like activity of the present invention can also be referred to as FVIII function-substituting activity, activity substituting FVIII function, FXa production promoting activity, and activity promoting FXa production.
- substitution of FVIII function and “substitution of FVIII function” mean promoting the activation of FX by FIXa (promoting the production of FXa by FIXa). More specifically, in the present invention, “substitute FVIII function” recognizes FIX and / or FIXa and FX and promotes the activation of FX by FIXa (facilitates the production of FXa by FIXa) ) Means.
- FXa production promoting activity can be evaluated by a measurement system comprising, for example, FIXa, FX, synthetic substrate S-2222 (FXa synthetic substrate), and phospholipid.
- a measurement system correlates with disease severity and clinical symptoms in hemophilia A cases (Rosen S, Andersson M, Blomba ⁇ ck M et al. Clinical applications of a chromogenic substrate method for determination of FVIII activity. Thromb Haemost 1985; 54: 811-23).
- the antibody is not particularly limited, but preferably exemplifies bispecific antibodies against FIX and / or FIXa having an activity that substitutes for the function of FVIII, and FX. it can.
- Such an antibody can be obtained, for example, according to the method described in WO2005 / 035756, WO2006 / 109592, WO2012 / 067176, and the like.
- the antibodies described in these references are included in the antibodies of the present invention.
- ACE910 (emicizumab) (Q499-z121 / J327-z119 / L404-k) (described in SEQ ID NO: 1), which is a bispecific antibody described in the patent document (WO 2012/067176)
- the H chain (Q chain) consisting of the amino acid sequence and the L chain consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 are associated, and the H chain (J chain) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: Bispecific antibody in which the L chain consisting of the amino acid sequence described in 3 is associated).
- the L chain of the antibody is a so-called common L chain.
- ACE910 is also referred to as ACE910-A.
- One embodiment of the present invention is a bispecific antibody against modified FIX and / or FIXa, and FX, comprising a modification of at least one amino acid residue in the constant region of the antibody, prior to the modification
- the H chain consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 and the L chain consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3 are associated, and the H chain consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 and the sequence
- the antibody has a higher FVIII-like activity than the bispecific antibody in which the L chain consisting of the amino acid sequence of No. 3 is associated.
- One specific embodiment of the present invention is that the H chain consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 and the L chain consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 are associated, and the amino acid set forth in SEQ ID NO: 2 A bispecific antibody against FIX and / or FIXa and FX, wherein the H chain consisting of the sequence and the L chain consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 are associated, wherein EU numbering position 434 is Tyr ( Y) is an antibody.
- an H chain consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 and an L chain consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 are associated, and SEQ ID NO: 2 A bispecific antibody against FIX and / or FIXa and FX, wherein the H chain consisting of the amino acid sequence described in the above and the L chain consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3 are associated with each other, comprising EU numbering 216 It is an antibody whose position to position 230 is AAAC.
- antibody is used in the broadest sense, and as long as it exhibits the desired activity, monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, dimers, multimers, multispecific antibodies (eg, bispecific antibodies), antibody derivatives And modified antibody (Miller ⁇ K et al. J Immunol. 2003, 170 (9), 4854-61).
- the antibody may be a mouse antibody, a human antibody, a humanized antibody, a chimeric antibody, or may be derived from another species or artificially synthesized.
- the antibodies disclosed herein can be any type of immunoglobulin molecule (eg, IgG, IgE, IgM, IgD and IgA), class (eg, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 and IgA2) or subclass. It can be.
- the immunoglobulin can be from any species (eg, human, mouse or rabbit).
- the terms “antibody”, “immunoglobulin” and “immunoglobulin” are used interchangeably in a broad sense.
- Antibody derivatives comprise a portion of an antibody, preferably the variable region of an antibody, or at least the antigen binding region of an antibody.
- the antibody derivative for example Fab, Fab ', F (ab ') 2, Fv fragments, linear antibodies, single-chain antibodies (scFv), sc (Fv) 2, Fab 3, domain antibodies (dAb) (WO 2004/058821, International Publication No. 2003/002609), including but not limited to multispecific antibodies formed from diabodies, triabodies, tetrabodies, minibodies and antibody derivatives.
- Fab is composed of one light chain and the CH1 region and variable region of one heavy chain.
- “Fv” is the smallest antibody derivative and includes a complete antigen recognition region and an antigen binding region.
- the antibody derivative may be, for example, a fusion of IgG antibody with Fc.
- US Pat. No. 5,461,870, Example 2 Zapata G et al. Protein Eng. 1995, 8 (10), 1057-1062; Olafsen T et al. Protein Eng. Design & Sel. 2004, 17 (4 ): 315-323; Holliger P et al. Nat. Biotechnol. 2005, 23 (9); 1126-36; Fischer N et al. Pathobiology. 2007, 74 (1): 3-14; Shen J et al. J Immunol Methods. 2007, 318, 65-74; Wu et al. Nat Biotechnol. 2007, 25 (11), 1290-7.
- modified antibody examples include antibodies bound to various molecules such as polyethylene glycol (PEG).
- PEG polyethylene glycol
- the antibody of the present invention includes these modified antibodies.
- the substance to be bound is not limited. In order to obtain such a modified antibody, it can be obtained by chemically modifying the obtained antibody. These methods are already established in this field.
- Bispecific antibody refers to an antibody having variable regions that recognize different epitopes within the same antibody molecule.
- the bispecific antibody may be an antibody that recognizes two or more different antigens, or an antibody that recognizes two or more different epitopes on the same antigen.
- Bispecific antibodies may include whole antibodies as well as antibody derivatives.
- the antibodies of the present invention also include bispecific antibodies.
- the anti-FIXa / FX bispecific antibody is used synonymously with a bispecific antibody that binds to FIXa and FX.
- a recombinant antibody produced using a gene recombination technique can be used.
- Recombinant antibodies are produced by cloning DNA encoding them from hybridomas or antibody-producing cells such as sensitized lymphocytes that produce antibodies, incorporating them into vectors, and introducing them into hosts (host cells). Can be obtained.
- the origin of the antibody is not limited, such as a human antibody, a mouse antibody, or a rat antibody. Further, it may be a genetically modified antibody such as a chimeric antibody or a humanized antibody. Methods for obtaining human antibodies are already known.
- a target human antibody can be obtained by immunizing a transgenic animal having all repertoires of human antibody genes with a target antigen (International Patent Application Publication) No. WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096, WO 96/33735).
- Genetically modified antibodies can be produced using known methods.
- a chimeric antibody is an antibody comprising the H chain and L chain variable regions of an immunized animal antibody, and the H chain and L chain constant regions of a human antibody.
- a chimeric antibody can be obtained by ligating a DNA encoding the variable region of an antibody derived from an immunized animal with a DNA encoding the constant region of a human antibody, incorporating it into an expression vector, introducing it into a host, and producing it.
- a humanized antibody is a modified antibody also referred to as a reshaped human antibody.
- Humanized antibodies are constructed by grafting the CDRs of antibodies from immunized animals to the complementarity determining regions of human antibodies. Its general genetic recombination techniques are also known (European Patent Application Publication No. EP 239400, International Patent Application Publication No.
- Bispecific antibodies are antibodies that have specificity for two different antigens. Bispecific antibodies are not limited to those of IgG type, but for example, IgG type bispecific antibodies can be secreted by hybrid hybridoma (quadroma) generated by fusing two hybridomas producing IgG antibodies (Milstein C et al. Nature 1983, 305: 537-540). Moreover, it can be secreted by co-expressing the L chain and H chain genes constituting the two kinds of target IgG, a total of four kinds of genes by introducing them into cells.
- the L chain since the diversity of the L chain variable region is lower than that of the H chain variable region, it is expected that a common L chain capable of giving binding ability to both H chains can be obtained.
- the antibody may be an antibody having a common L chain.
- the antibody of the present invention can be produced by methods known to those skilled in the art. Specifically, DNA encoding the target antibody is incorporated into an expression vector. In that case, it integrates into an expression vector so that it may express under the control of an expression control region, for example, an enhancer and a promoter. Next, host cells are transformed with this expression vector to express the antibody. In that case, a combination of an appropriate host and an expression vector can be used.
- An expression vector is particularly useful when a vector is used for the purpose of producing an antibody.
- an expression vector for example, when the host is E. coli such as JM109, DH5 ⁇ , HB101, XL1-Blue, it is essential to have a promoter that can be expressed efficiently in E. coli, such as the lacZ promoter. is there.
- the vector may contain a signal sequence for polypeptide secretion.
- Introduction of a vector into a host cell can be performed using, for example, a calcium chloride method or an electroporation method.
- vectors for producing the antibody of the present invention include, for example, mammalian-derived expression vectors (for example, pcDNA3 (manufactured by Invitrogen), pEGF-BOS® (Nucleic® Acids.® Res. 1990, 18). (17), p5322), pEF, pCDM8), insect cell-derived expression vectors (for example, “Bac-to-BAC baculovirus expression system” (GIBCO BRL), pBacPAK8).
- mammalian-derived expression vectors for example, pcDNA3 (manufactured by Invitrogen), pEGF-BOS® (Nucleic® Acids.® Res. 1990, 18). (17), p5322), pEF, pCDM8), insect cell-derived expression vectors (for example, “Bac-to-BAC baculovirus expression system” (GIBCO BRL), pBacPAK8).
- mammalian-derived expression vectors for
- promoters necessary for expression in cells such as the SV40 promoter (Mulligan et al., Nature (1979) 277, 108), etc. It is indispensable to have a gene, and it is more preferable if it has a gene for selecting transformed cells.
- genes for selecting transformed cells include drug resistance genes that can be distinguished by drugs (neomycin, G418, etc.).
- a vector having a DHFR gene complementary to the CHO cell lacking the nucleic acid synthesis pathway for example, , PCHOI, etc.
- amplifying with methotrexate (MTX) for example, COS having a gene expressing SV40 T antigen on the chromosome
- COS having a gene expressing SV40 T antigen on the chromosome An example is a method of transforming with a vector (such as pcD) having an SV40 replication origin using cells.
- the antibody of the present invention thus obtained can be isolated from the inside of the host cell or outside the cell (medium etc.) and purified as a substantially pure and homogeneous antibody. Separation and purification of antibodies may be carried out using separation and purification methods used in normal antibody purification, and are not limited in any way. For example, chromatography column, filter, ultrafiltration, salting out, solvent precipitation, solvent extraction, distillation, immunoprecipitation, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing, dialysis, recrystallization, etc. are appropriately selected, When combined, antibodies can be separated and purified.
- chromatography examples include affinity chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration, reverse phase chromatography, adsorption chromatography, etc. (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). These chromatography can be performed using liquid phase chromatography, for example, liquid phase chromatography such as HPLC and FPLC. Examples of columns used for affinity chromatography include Protein A column and Protein G column. For example, as a column using Protein A, Hyper D, POROS, Sepharose FF (GE Amersham ⁇ Biosciences) and the like can be mentioned. The present invention also encompasses antibodies highly purified using these purification methods.
- the obtained antibody can be purified to homogeneity. Separation and purification of antibodies may be carried out using separation and purification methods used for ordinary proteins. For example, antibodies can be separated and purified by appropriately selecting and combining chromatography columns such as affinity chromatography, filters, ultrafiltration, salting out, dialysis, SDS polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing etc. (Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988), but is not limited to these. Examples of the column used for affinity chromatography include a Protein A column, a Protein G column, and the like.
- the present invention provides a pharmaceutical composition
- a pharmaceutical composition comprising the antibody according to the present invention and a pharmaceutically acceptable carrier.
- the antibody of the present invention is a bispecific antibody against FIX and / or FIXa having FVIII-like activity and FX, for example, prevention of bleeding, bleeding-related diseases, or diseases caused by bleeding and / or Expected to be a therapeutic drug (pharmaceutical composition) or drug.
- bleeding a disease accompanied by bleeding, or a disease caused by bleeding is preferably a disease that develops and / or progresses due to a decrease or deficiency in the activity of FVIII and / or FVIIIa.
- diseases include hemophilia A, diseases in which inhibitors against FVIII / FVIIIa have appeared, acquired hemophilia, von Willebrand disease, etc. Not.
- kits for use in a method for preventing and / or treating the above-mentioned disease comprising at least the antibody or composition of the present invention.
- the kit can be packaged with a syringe barrel, a needle, a pharmaceutically acceptable medium, an alcohol cotton cloth, an adhesive bandage, or instructions describing how to use the kit.
- Another embodiment of the present invention relates to the use of the antibody or composition of the present invention in the production of a preventive and / or therapeutic agent for bleeding, a disease accompanied by bleeding or a disease caused by bleeding.
- Another embodiment of the present invention relates to a method for preventing and / or treating bleeding, a disease accompanied by bleeding or a disease caused by bleeding, which comprises the step of administering the antibody or composition of the present invention.
- Another embodiment of the present invention relates to the antibody or composition of the present invention for use in the prevention and / or treatment of bleeding, bleeding-related diseases, or diseases caused by bleeding.
- a pharmaceutical composition containing the antibody of the present invention used as an active ingredient for therapeutic or prophylactic purposes is mixed with an appropriate pharmaceutically acceptable carrier, vehicle, etc. inert to them as necessary. It can be formulated. For example, sterilized water, physiological saline, stabilizers, excipients, antioxidants (ascorbic acid, etc.), buffers (phosphoric acid, citric acid, histidine, other organic acids, etc.), preservatives, surfactants ( PEG, Tween, etc.), chelating agents (EDTA, etc.), binders and the like.
- polypeptides such as serum albumin, gelatin and immunoglobulin, glycine, glutamine, asparagine, glutamic acid, aspartic acid, methionine, arginine and lysine and other amino acids, polysaccharides and monosaccharides such as saccharides and carbohydrates
- sugar alcohols such as mannitol and sorbitol may be contained.
- aqueous solution for injection for example, isotonic solutions containing physiological saline, glucose and other adjuvants such as D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol, sodium chloride
- adjuvants such as alcohol (ethanol etc.), polyalcohol (propylene glycol, PEG, etc.), nonionic surfactants (polysorbate 80, polysorbate 20, poloxamer 188, HCO-50) etc.
- the antibody of the present invention may be encapsulated in microcapsules (microcapsules such as hydroxymethylcellulose, gelatin, poly [methylmethacrylic acid]) or colloid drug delivery systems (liposomes, albumin microspheres, microemulsions, nanoparticles). And nanocapsules) (see “Remington's Pharmaceutical Science 16th edition”, Oslo Ed. (1980), etc.).
- a method of making a drug a sustained-release drug is also known and can be applied to the antibody of the present invention (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15: 267-277 (1981); Langer, Chemtech. 12: 98-105 (1982); US Pat. No. 3,773,919; European Patent Application Publication (EP) 58,481; Sidman et al., Biopolymers 22: 547-556 (1983); EP 133,988).
- microcapsules such as hydroxymethylcellulose, gelatin, poly [methylmethacrylic acid]
- the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is determined according to the judgment of the doctor in consideration of the type of dosage form, the administration method, the age and weight of the patient, the symptoms of the patient, the type of disease and the degree of progression, etc.
- the bispecific antibody it is about 0.001 to about 1000 mg / kg per administration.
- it is about 0.01 mg / kg to about 100 mg / kg.
- the administration interval is at least one day.
- they are 1 week, 2 weeks, 4 weeks, 1 month, 3 months, and 6 months. These doses vary depending on the weight and age of the patient, the administration method, etc., but those skilled in the art can appropriately select an appropriate dose.
- the administration period is also preferably determined appropriately according to the patient's healing progress and the like.
- the pharmaceutical composition of the present invention can be administered to a patient by either oral or parenteral administration. Preferably, it is parenteral administration. Specific examples of such administration methods include injection administration, nasal administration, transpulmonary administration, and transdermal administration. Examples of injection administration include intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, and subcutaneous injection.
- the pharmaceutical composition of the present invention can be made into oral preparations such as granules, powders, tablets, capsules, solvents, emulsions or suspensions, injections, and the like.
- the present invention also provides a gene or nucleic acid encoding the antibody of the present invention. It is also conceivable to perform gene therapy by incorporating a gene or nucleic acid encoding the antibody of the present invention into a gene therapy vector.
- Another embodiment of the present invention relates to a method for enhancing the activity of an antibody comprising a constant region, wherein the method modifies at least one amino acid residue in the constant region.
- a method of modifying at least one amino acid residue in the CH3 region or hinge region is preferable.
- Particularly preferred is a method of modifying EU numbering 434, and more preferred is a method of modifying Asn (N) at EU numbering 434 to Tyr (Y).
- Particularly preferred is a method of modifying the hinge region, and more preferred is a method of modifying EU numbering 216 to 230 with AAAC (SEQ ID NO: 28).
- the present invention also includes a method of modifying EU numbering 216 to 230 so that the EU numbering 216 to 230 becomes AAAC. Further, other modifications may be included as long as the modifications are included.
- Another embodiment of the present invention is a method for enhancing FVIII-like activity of a bispecific antibody against FIX and / or FIXa and FX, comprising the heavy chain consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 And an L chain consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 are associated, and an H chain consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is associated with an L chain consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.
- Another specific embodiment of the present invention is a method for enhancing FVIII-like activity of a bispecific antibody against FIX and / or FIXa and FX, comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1
- the H chain and the L chain consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 are associated, and the H chain consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and the L chain consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 are associated.
- This is a method of modifying the amino acid residue at position 434 of EU numbering of the bispecific antibody to Tyr (Y).
- Another specific embodiment of the present invention is a method for enhancing FVIII-like activity of a bispecific antibody against FIX and / or FIXa and FX, comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1
- the H chain and the L chain consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 are associated, and the H chain consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and the L chain consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 are associated.
- EU numbering of the bispecific antibody in which the amino acid residues at positions 216 to 230 of EU numbering are altered to AAAC.
- Another embodiment of the present invention is a method for producing an antibody comprising a constant region, wherein (a) at least one amino acid residue in the constant region is modified to enhance the activity compared to the antibody before modification. Modifying the nucleic acid encoding the antibody comprising the amino acid residue, (b) culturing the host cell to express the nucleic acid, and (c) recovering the antibody from the host cell culture. Is the method.
- an aspect represented by the expression “comprising” is an aspect represented by an expression “essentially consisting of”. As well as an embodiment represented by the expression “consistingconsistof”.
- ACE910 an anti-FIXa / FX bispecific antibody, is an antibody having a human IgG4 isotype (J Thromb Haemost. 2014 Feb; 12 (2): 206-213.).
- ACE910 (hereinafter also referred to as ACE910-A) is composed of three types of four chains. The heavy chain for FIXa is the Q chain, the heavy chain for FX is the J chain, and the common light chain is the L chain.
- ACE910-A Q, J, L: SEQ ID NO: 1, 2, 3) (WO 2012/067176) was used as a control antibody.
- Human IgG1, 2, and 4 type ACE910 were prepared using Knobs into holes (Nat Biotechnol.
- ACE910-B-IgG1 (Q, J, L: SEQ ID NO: 4, 5, 3)
- ACE910-B-IgG2 Q, J, L: SEQ ID NO: 6, 7, 3
- ACE910-B- IgG4 Q, J, L: SEQ ID NOs: 8, 9, 3
- ACE910 is an anti-FIXa / FX bispecific antibody that uses a common light chain (made with reference to WO2006 / 109592) and CH3 / CH3 interface control (made with reference to WO2006 / 106905).
- ACE910-B-IgG4 (Q, J, L: SEQ ID NO: 8, 9, 3), ACE910-D1 (heavy chain Q, J: SEQ ID NO: 12, 13) (light chain L1, L2) : SEQ ID NO: 14, 15) (prepared with reference to WO2011 / 117329), ACE910-D2 (heavy chain Q, J: SEQ ID NO: 16, 17) (light chain L1, L2: SEQ ID NO: 18, 19) (WO2011 / 117329), ACE910-E (heavy chain Q, J: SEQ ID NO: 20, 21) (light chain L1, L2: SEQ ID NO: 22, 23) (prepared with reference to WO2013 / 065708) FVIII-like activity was evaluated.
- ACE910 variants were prepared by methods known to those skilled in the art such as total synthesis of these genes.
- Antibody expression was performed using HEK293FS (Invitrogen), purification was performed using recombinant protein A (GE healthcare), and bispecific antibodies were prepared by methods known to those skilled in the art.
- FVIII-like activity (FXa production promoting activity) of the purified bispecific antibody was measured by the following method. All reactions were performed at room temperature. 5 ⁇ L of antibody solution diluted with Tris-buffered saline (hereinafter referred to as TBSB) containing 0.1% bovine serum albumin is mixed with 5 ⁇ L of 150 ng / mL Human Factor IXa beta (Enzyme Research Laboratories).
- TBSB Tris-buffered saline
- ACE910-B-IgG4 (Q, J, L: SEQ ID NO: 8) which is a human IgG4 bispecific antibody having the same variable region sequence as ACE910-A (Q, J, L: SEQ ID NO: 1, 2, 3) , 9, 3) or ACE910-C (Q, J, L: SEQ ID NOs: 10, 11, 3) (prepared with reference to WO2015 / 046467), methods known to those skilled in the art, such as PCR or total gene synthesis
- PCR total gene synthesis
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Abstract
定常領域の様々な部位を改変したACE910変異体を作製した結果、ACE910よりも高いFVIII様活性を有する二重特異性抗体を見出した。また、FVIII様活性を高める変異位置の同定、その変異を用いたFVIII様活性を高める方法を見出した。
Description
本発明は、増強された活性を有する抗体、そのような抗体を有効成分として含有する医薬組成物、それらの製造方法及び抗体の活性を高める方法等に関する。より具体的にはACE910よりも高い血液凝固第VIII因子（FVIII）様活性を有する二重特異性抗体に関する。
抗体は血漿中での安定性が高く、副作用も少ないことから医薬品として注目されている。中でもIgG型の抗体医薬は多数上市されており、現在も数多くの抗体医薬が開発されている（非特許文献１、２、３）。
血友病Aは、先天性のFVIIIの機能低下または欠損による出血異常症である。血友病A患者の出血に対しては、FVIII製剤が通常投与される（on-demand投与）。また、近年は、出血イベントを防ぐために、予防的に、FVIII製剤が投与される（非特許文献１、２）（予防投与）。FVIII製剤の血中半減期は、約12～16時間程度である。それ故、継続的な予防のためには、週に3回、FVIII製剤が、患者に投与される（非特許文献３、４）。また、on-demand投与においては、再出血を防ぐため、FVIII製剤を、必要に応じ、一定間隔で追加投与する。また、FVIII製剤の投与は静脈内に実施される。従って、FVIII製剤と比べて投与の負担が少ない薬剤が、強く求められていた。
時折、FVIIIに対する抗体（インヒビター）が、血友病患者に発生する。インヒビターは、FVIII製剤の効果を打ち消す。インヒビターが発生した患者（インヒビター患者）の出血に対しては、バイパス製剤が投与される。それらの作用機序は、FVIIIの機能、すなわち活性化血液凝固第IX因子（FIXa）による血液凝固第X因子（FX）の活性化を触媒する機能に非依存である。そのため、バイパス製剤が、出血を十分止められないケースがある。従って、インヒビターの存在に左右されず、且つFVIIIの機能を代替する薬剤が、強く求められていた。
これらの課題を解決する手段として、FVIIIの機能を代替する二重特異性抗体及びその使用が報告されている（特許文献１、２、３および４）。FIXaとFXに対する二重特異性抗体は、両因子を近傍に位置付けることによって、FVIII様の活性を発揮し、FVIIIの機能を代替することが可能である（非特許文献５）。該抗体のFVIII様活性はFIXaとFXに対する親和性を最適化することにより向上できることが報告されている（非特許文献６）。また、該抗体のFVIII様活性はIgGのアイソタイプ、ジスルフィド結合パターン、ヒンジ領域のアミノ酸配列、Fc領域の糖鎖の有無によって影響を受けることが知られている（非特許文献７）。該抗体の一つであり、高いFVIII様活性を有するACE910はサル血友病モデルで止血効果を発揮することが報告されている（非特許文献８、９）。しかしながら、これまでにACE910よりも高いFVIII様活性を有する二重特異性抗体は報告されていない。
Blood 58, 1-13 (1981)
Nature 312, 330-337(1984)
Nature 312, 337-342(1984)
Biochim.Biophys.Acta 871, 268-278(1986)
Nat Med. 2012 Oct;18(10):1570-4.
PLoS One. 2013;8(2):e57479.
MAbs. 2015;7(1):120-8.
J Thromb Haemost. 2014 Feb;12(2):206-213.
Blood. 2014 Nov 13;124(20):3165-71.
本発明は上記のような状況に鑑みてなされたものであり、増強された活性を有する抗体、そのような抗体を有効成分として含有する医薬組成物、それらの製造方法及び抗体の活性を高める方法等を提供することを目的とする。より具体的にはACE910よりも高いFVIII様活性を有する二重特異性抗体を作製するための定常領域部位の変異、および、同変異を有する抗FIXa/FX二重特異性抗体、当該抗体を有効成分として含む医薬組成物、または当該医薬組成物による血友病Aの治療方法を提供することを目的とする。
本発明者らは上記課題を解決すべく、定常領域の様々な部位を改変したACE910変異体を作製したところ、ACE910よりも高いFVIII様活性を有する二重特異性抗体を見出すことに成功した。また、FVIII様活性を高める変異の同定、その変異を用いたFVIII様活性を高める方法を見出すことにも成功した。本発明はこのような知見に基づくものであり、以下〔１〕から〔１５〕に関する。
〔１〕改変された血液凝固第IX因子および／または活性化血液凝固第IX因子、ならびに血液凝固第X因子に対する二重特異性抗体であって、当該抗体の定常領域に少なくとも1つのアミノ酸残基の改変を含み、当該改変前の抗体である配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるH鎖と配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるL鎖が会合し、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるH鎖と配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるL鎖が会合している二重特異性抗体に比べ高い血液凝固第VIII因子様活性を有する、前記抗体。
〔２〕前記改変はCH3領域及び/又はヒンジ領域における改変である、〔１〕に記載の抗体。
〔３〕CH3領域における改変がEUナンバリング434位における改変である、〔２〕に記載の抗体。
〔４〕EUナンバリング434位における改変はTyr（Y）への改変である、〔３〕に記載の抗体。
〔５〕ヒンジ領域における改変はEUナンバリング216位～230位をAAACとする改変である、〔２〕に記載の抗体。
〔６〕〔１〕～〔５〕のいずれかに記載の抗体、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
〔７〕出血、出血を伴う疾患、もしくは出血に起因する疾患の予防および/または治療に用いられる医薬組成物であって、該疾患が、血液凝固第VIII因子および/または活性化血液凝固第VIII因子の活性の低下ないし欠損によって発症および/または進展する疾患である、〔６〕に記載の組成物。
〔８〕血液凝固第VIII因子および/または活性化血液凝固第VIII因子の活性の低下ないし欠損によって発症および/または進展する疾患が、血友病A、後天性血友病、フォンビルブランド病又は血液凝固第VIII因子および/もしくは活性化血液凝固第VIII因子に対するインヒビターが出現している疾患である、〔７〕に記載の組成物。
〔９〕少なくとも〔１〕～〔５〕のいずれかに記載の二重特異性抗体を含む、出血、出血を伴う疾患もしくは出血に起因する疾患を予防および/または治療する方法に用いるためのキット。
〔１０〕血液凝固第IX因子および／または活性化血液凝固第IX因子、ならびに血液凝固第X因子に対する二重特異性抗体の血液凝固第VIII因子様活性を増強する方法であって、配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるH鎖と配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるL鎖が会合し、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるH鎖と配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるL鎖が会合している二重特異性抗体の定常領域の少なくとも1つのアミノ酸残基を改変する、前記方法。
〔１１〕前記改変はCH3領域及び/又はヒンジ領域における少なくとも1つのアミノ酸残基の改変である、〔１０〕に記載の方法。
〔１２〕CH3領域における改変がEUナンバリングによる434位における改変である、〔１１〕に記載の方法。
〔１３〕434位における改変はTyr（Y）への改変である、〔１２〕に記載の方法。
〔１４〕ヒンジ領域における改変はEUナンバリング216位～230位をAAACとする改変である、〔１１〕に記載の方法。
〔１５〕血液凝固第IX因子および／または活性化血液凝固第IX因子、ならびに血液凝固第X因子に対する二重特異性抗体の製造方法であって、(a) 定常領域の少なくとも1つのアミノ酸残基を改変することで改変前の配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるH鎖と配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるL鎖が会合し、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるH鎖と配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるL鎖が会合している二重特異性抗体に比べ血液凝固第VIII因子様活性が増強されるように、該アミノ酸残基を含む抗体をコードする核酸を改変し、（ｂ）宿主細胞を該核酸が発現するように培養し、（ｃ）宿主細胞培養物から抗体を回収することを含む方法。
〔１６〕〔１〕～〔５〕のいずれかに記載の抗体を投与する工程を含む、出血、出血を伴う疾患、または出血に起因する疾患を予防および/または治療する方法。
〔１７〕出血、出血を伴う疾患、または出血に起因する疾患の予防および/または治療において使用するための、〔１〕～〔５〕のいずれかに記載の抗体。
〔１８〕出血、出血を伴う疾患、または出血に起因する疾患の予防剤および/または治療剤の製造における、〔１〕～〔５〕のいずれかに記載の抗体の使用。
〔１９〕前記疾患が、血液凝固第VIII因子および/または活性化血液凝固第VIII因子の活性の低下ないし欠損によって発症および/または進展する疾患であり、好ましくは、血友病A、後天性血友病、フォンビルブランド病又は血液凝固第VIII因子および/もしくは活性化血液凝固第VIII因子に対するインヒビターが出現している疾患である、〔１６〕に記載の方法または〔１７〕に記載の使用のための抗体または〔１８〕に記載の使用。
〔１〕改変された血液凝固第IX因子および／または活性化血液凝固第IX因子、ならびに血液凝固第X因子に対する二重特異性抗体であって、当該抗体の定常領域に少なくとも1つのアミノ酸残基の改変を含み、当該改変前の抗体である配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるH鎖と配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるL鎖が会合し、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるH鎖と配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるL鎖が会合している二重特異性抗体に比べ高い血液凝固第VIII因子様活性を有する、前記抗体。
〔２〕前記改変はCH3領域及び/又はヒンジ領域における改変である、〔１〕に記載の抗体。
〔３〕CH3領域における改変がEUナンバリング434位における改変である、〔２〕に記載の抗体。
〔４〕EUナンバリング434位における改変はTyr（Y）への改変である、〔３〕に記載の抗体。
〔５〕ヒンジ領域における改変はEUナンバリング216位～230位をAAACとする改変である、〔２〕に記載の抗体。
〔６〕〔１〕～〔５〕のいずれかに記載の抗体、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
〔７〕出血、出血を伴う疾患、もしくは出血に起因する疾患の予防および/または治療に用いられる医薬組成物であって、該疾患が、血液凝固第VIII因子および/または活性化血液凝固第VIII因子の活性の低下ないし欠損によって発症および/または進展する疾患である、〔６〕に記載の組成物。
〔８〕血液凝固第VIII因子および/または活性化血液凝固第VIII因子の活性の低下ないし欠損によって発症および/または進展する疾患が、血友病A、後天性血友病、フォンビルブランド病又は血液凝固第VIII因子および/もしくは活性化血液凝固第VIII因子に対するインヒビターが出現している疾患である、〔７〕に記載の組成物。
〔９〕少なくとも〔１〕～〔５〕のいずれかに記載の二重特異性抗体を含む、出血、出血を伴う疾患もしくは出血に起因する疾患を予防および/または治療する方法に用いるためのキット。
〔１０〕血液凝固第IX因子および／または活性化血液凝固第IX因子、ならびに血液凝固第X因子に対する二重特異性抗体の血液凝固第VIII因子様活性を増強する方法であって、配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるH鎖と配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるL鎖が会合し、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるH鎖と配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるL鎖が会合している二重特異性抗体の定常領域の少なくとも1つのアミノ酸残基を改変する、前記方法。
〔１１〕前記改変はCH3領域及び/又はヒンジ領域における少なくとも1つのアミノ酸残基の改変である、〔１０〕に記載の方法。
〔１２〕CH3領域における改変がEUナンバリングによる434位における改変である、〔１１〕に記載の方法。
〔１３〕434位における改変はTyr（Y）への改変である、〔１２〕に記載の方法。
〔１４〕ヒンジ領域における改変はEUナンバリング216位～230位をAAACとする改変である、〔１１〕に記載の方法。
〔１５〕血液凝固第IX因子および／または活性化血液凝固第IX因子、ならびに血液凝固第X因子に対する二重特異性抗体の製造方法であって、(a) 定常領域の少なくとも1つのアミノ酸残基を改変することで改変前の配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるH鎖と配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるL鎖が会合し、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるH鎖と配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるL鎖が会合している二重特異性抗体に比べ血液凝固第VIII因子様活性が増強されるように、該アミノ酸残基を含む抗体をコードする核酸を改変し、（ｂ）宿主細胞を該核酸が発現するように培養し、（ｃ）宿主細胞培養物から抗体を回収することを含む方法。
〔１６〕〔１〕～〔５〕のいずれかに記載の抗体を投与する工程を含む、出血、出血を伴う疾患、または出血に起因する疾患を予防および/または治療する方法。
〔１７〕出血、出血を伴う疾患、または出血に起因する疾患の予防および/または治療において使用するための、〔１〕～〔５〕のいずれかに記載の抗体。
〔１８〕出血、出血を伴う疾患、または出血に起因する疾患の予防剤および/または治療剤の製造における、〔１〕～〔５〕のいずれかに記載の抗体の使用。
〔１９〕前記疾患が、血液凝固第VIII因子および/または活性化血液凝固第VIII因子の活性の低下ないし欠損によって発症および/または進展する疾患であり、好ましくは、血友病A、後天性血友病、フォンビルブランド病又は血液凝固第VIII因子および/もしくは活性化血液凝固第VIII因子に対するインヒビターが出現している疾患である、〔１６〕に記載の方法または〔１７〕に記載の使用のための抗体または〔１８〕に記載の使用。
本発明により、ACE910よりも高いFVIII様活性を有する二重特異性抗体が提供された。また、FVIII様活性を高める変異、その変異を用いたFVIII様活性を高める方法が提供された。
本発明の一つの実施態様は、改変された定常領域を含む抗体であって、当該定常領域に少なくとも1つのアミノ酸残基の変異を含み、当該改変前の抗体に比べ高い活性を有する抗体に関する。
本発明における「定常領域を含む抗体」とは定常領域を含む抗体であれば特に限定されるものではなく、IgG型であってもよく、二重特異性抗体であってもよい。
本発明の一つの実施態様としての定常領域とは、好ましくは抗体定常領域であり、より好ましくはIgG1、IgG2、IgG3、IgG4型の抗体定常領域であり、さらにより好ましくはヒトIgG1、IgG2、IgG3、IgG4型の抗体定常領域である。また本発明の別の一つの実施態様としての定常領域とは、好ましくは重鎖定常領域であり、より好ましくはIgG1、IgG2、IgG3、IgG4型の重鎖定常領域であり、さらにより好ましくはヒトIgG1、IgG2、IgG3、IgG4型の重鎖定常領域である。ヒトIgG1定常領域、ヒトIgG2定常領域、ヒトIgG3定常領域およびヒトIgG4定常領域のアミノ酸配列は公知である。ヒトIgG1、ヒトIgG2、ヒトIgG3、ヒトIgG4抗体の定常領域としては、遺伝子多型による複数のアロタイプ配列がSequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No.91-3242に記載されているが、本発明においてはそのいずれであっても良い。なお本発明のアミノ酸が改変された定常領域は、本発明のアミノ酸変異を含むものである限り、他のアミノ酸変異や修飾を含んでもよい。
Fc領域は、抗体重鎖の定常領域に由来するアミノ酸配列を含む。Fc領域は、EUナンバリングで表されるおよそ216位のアミノ酸における、パパイン切断部位のヒンジ領域のN末端から、当該ヒンジ、CH2およびCH3ドメインを含める抗体の重鎖定常領域の部分である。
「ヒンジ領域」という用語は、野生型抗体重鎖においてCH1ドメインおよびCH2ドメインを連結する、例えばKabatのEU番号方式によれば216位あたりから230位あたりまでの、またはKabatのEU番号方式によれば226位あたりから230位あたりまでの、抗体重鎖ポリペプチド部分を意味する。他のIgGサブクラスのヒンジ領域は、IgG1サブクラス配列のヒンジ領域システイン残基と整列させることによって決定することができる。
本発明におけるポリペプチドとは、通常、１０アミノ酸程度以上の長さを有するペプチド、およびタンパク質を指す。また、通常、生物由来のポリペプチドであるが、特に限定されず、例えば、人工的に設計された配列からなるポリペプチドであってもよい。また、天然ポリペプチド、あるいは合成ポリペプチド、組換えポリペプチド等のいずれであってもよい。さらに、上記のポリペプチドの断片もまた、本発明のポリペプチドに含まれる。
EUナンバリングおよびKabatナンバリング
本発明で使用されている方法によると、抗体のCDRとFRに割り当てられるアミノ酸位置はKabatにしたがって規定される（Sequences of Proteins of Immunological Interest（National Institute of Health, Bethesda, Md., 1987年および1991年）。本明細書において、抗原結合分子が抗体または抗原結合断片である場合、可変領域のアミノ酸はKabatナンバリングにしたがい、定常領域のアミノ酸はKabatのアミノ酸位置に準じたEUナンバリングにしたがって表される。
本発明で使用されている方法によると、抗体のCDRとFRに割り当てられるアミノ酸位置はKabatにしたがって規定される（Sequences of Proteins of Immunological Interest（National Institute of Health, Bethesda, Md., 1987年および1991年）。本明細書において、抗原結合分子が抗体または抗原結合断片である場合、可変領域のアミノ酸はKabatナンバリングにしたがい、定常領域のアミノ酸はKabatのアミノ酸位置に準じたEUナンバリングにしたがって表される。
本発明の一つの実施態様としての「アミノ酸残基の改変」は当該改変前の抗体に比べ活性を高める改変であれば特に限定されず、好ましくはCH3領域又はヒンジ領域における改変である。特に好ましくはEUナンバリング434位における改変であり、より好ましくはEUナンバリング434位をAsn(N)からTyr（Y）にする改変である。また特に好ましくはヒンジ領域における改変であり、より好ましくはEUナンバリング216位～230位をAAACとする改変である。尚、EUナンバリング216位～230位の一部を改変することにより、EUナンバリング216位～230位をAAACとする改変も本発明に含まれる。また、上記変異を含む限り、その他の変異が含まれていてもよい。
本発明の一つの実施態様としての「改変」又は「改変する」とは、元のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基へ置換すること、元のアミノ酸残基を欠失させること、新たなアミノ酸残基を付加すること、これらの組み合わせ等を指す。また、「変異」とは元のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換、元のアミノ酸残基の欠失、新たなアミノ酸残基の付加、これらの組み合わせ等を指す。尚、本明細書において、「改変」と「変異」は同義で用いられる。
本発明の一つの実施態様としての「活性」とは、例えば抗体の抗原への結合力、抗体が抗原に結合することにより生じる生物学的作用などをいうがこれに限定されない。抗体が血液凝固第IX因子（FIX）および／または活性化血液凝固第IX因子(FIXa)、ならびに血液凝固第X因子（FX）に対する二重特異性抗体である場合、例えば活性とは血液凝固第FVIII因子（FVIII）様活性である。
改変前の抗体に比べ高い活性を有するとは、例えば前記二重特異性抗体のFVIII様活性の場合、改変後の二重特異性抗体のFVIII様活性が改変前の二重特異性抗体のFVIII様活性に比べて高いことをいう。
改変前の抗体に比べ高い活性を有するとは、例えば前記二重特異性抗体のFVIII様活性の場合、改変後の二重特異性抗体のFVIII様活性が改変前の二重特異性抗体のFVIII様活性に比べて高いことをいう。
FVIII
FVIIIは血液凝固に関与する一連の分子の１つであり、トロンビンやFXaにより活性化を受けると補因子活性を呈し、FIXaによるFX活性化反応を促進する。
FVIIIは血液凝固に関与する一連の分子の１つであり、トロンビンやFXaにより活性化を受けると補因子活性を呈し、FIXaによるFX活性化反応を促進する。
FVIII様活性
本発明のFVIII様活性は、FVIII機能代替活性、FVIIIの機能を代替する活性、FXa産生促進活性、FXa産生を促進する活性と言い換えることもできる。本発明において「FVIII機能代替」、「FVIIIの機能を代替する」とは、FIXaによるFXの活性化を促進する（FIXaによるFXa産生を促進する）ことを意味する。また、より具体的には、本発明において「FVIIIの機能を代替する」とは、FIXおよび/またはFIXaならびにFXを認識し、FIXaによるFXの活性化を促進する（FIXaによるFXa産生を促進する）ことを意味する。FXa産生促進活性は、例えば、FIXa、FX、合成基質S-2222（FXaの合成基質）、リン脂質から成る測定系で評価することができる。このような測定系は、血友病A症例における疾患の重症度および臨床症状と相関性を示す(Rosen S, Andersson M, Blomba¨ck M et al. Clinical applications of a chromogenic substrate method for determination of FVIII activity. Thromb Haemost 1985; 54: 811-23)。
本発明のFVIII様活性は、FVIII機能代替活性、FVIIIの機能を代替する活性、FXa産生促進活性、FXa産生を促進する活性と言い換えることもできる。本発明において「FVIII機能代替」、「FVIIIの機能を代替する」とは、FIXaによるFXの活性化を促進する（FIXaによるFXa産生を促進する）ことを意味する。また、より具体的には、本発明において「FVIIIの機能を代替する」とは、FIXおよび/またはFIXaならびにFXを認識し、FIXaによるFXの活性化を促進する（FIXaによるFXa産生を促進する）ことを意味する。FXa産生促進活性は、例えば、FIXa、FX、合成基質S-2222（FXaの合成基質）、リン脂質から成る測定系で評価することができる。このような測定系は、血友病A症例における疾患の重症度および臨床症状と相関性を示す(Rosen S, Andersson M, Blomba¨ck M et al. Clinical applications of a chromogenic substrate method for determination of FVIII activity. Thromb Haemost 1985; 54: 811-23)。
本発明の一つの実施態様において、抗体は特に限定されるものではないが、好ましくはFVIIIの機能を代替する活性を有するFIXおよび/またはFIXa、ならびにFXに対する二重特異性抗体を例示することができる。このような抗体は、例えばWO2005/035756、WO2006/109592、WO2012/067176などに記載の方法に従って取得することができる。本発明の抗体にはこれらの文献に記載の抗体が含まれる。
好ましい二重特異性抗体として、特許文献（WO 2012/067176）に記載の二重特異性抗体であるACE910 (emicizumab)（Q499-z121/J327-z119/L404-k）（配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるH鎖（Q鎖）と配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるL鎖が会合し、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるH鎖（J鎖）と配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるL鎖が会合している二重特異性抗体）を挙げることができる。当該抗体のL鎖は、いわゆる共通L鎖である。尚、本明細書において、ACE910はACE910-Aとも記載される。
好ましい二重特異性抗体として、特許文献（WO 2012/067176）に記載の二重特異性抗体であるACE910 (emicizumab)（Q499-z121/J327-z119/L404-k）（配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるH鎖（Q鎖）と配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるL鎖が会合し、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるH鎖（J鎖）と配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるL鎖が会合している二重特異性抗体）を挙げることができる。当該抗体のL鎖は、いわゆる共通L鎖である。尚、本明細書において、ACE910はACE910-Aとも記載される。
本発明の一つの実施態様は、改変されたFIXおよび／またはFIXa、ならびにFXに対する二重特異性抗体であって、当該抗体の定常領域に少なくとも1つのアミノ酸残基の改変を含み、当該改変前の抗体である配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるH鎖と配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるL鎖が会合し、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるH鎖と配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるL鎖が会合している二重特異性抗体に比べ高いFVIII様活性を有する抗体である。
本発明の特定の一つの実施態様は、配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるH鎖と配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるL鎖が会合し、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるH鎖と配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるL鎖が会合している、FIXおよび／またはFIXa、ならびにFXに対する二重特異性抗体であって、EUナンバリング434位がTyr(Y)である抗体である。
また、別の本発明の特定の一つの実施態様は、配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるH鎖と配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるL鎖が会合し、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるH鎖と配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるL鎖が会合している、FIXおよび／またはFIXa、ならびにFXに対する二重特異性抗体であって、EUナンバリング216位～230位がAAACである抗体である。
「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、所望の活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二量体、多量体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、抗体誘導体及び抗体修飾物であってもよい（Miller K et al. J Immunol. 2003, 170(9), 4854-61）。抗体は、マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体であってもよく、または他の種由来であっても、人工的に合成したものであってもよい。本明細書中に開示される抗体は、免疫グロブリン分子の任意のタイプ（例えば、IgG、IgE、IgM、IgDおよびIgA）、クラス（例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2）またはサブクラスであり得る。免疫グロブリンは、任意の種（例えば、ヒト、マウスまたはウサギ）由来であり得る。尚、「抗体」、「免疫グロブリン」及び「イムノグロブリン」なる用語は互換性をもって広義な意味で使われる。
「抗体誘導体」とは抗体の一部、好ましくは抗体の可変領域、または少なくとも抗体の抗原結合領域を含む。抗体誘導体には、例えばFab、Fab'、F(ab')2、Fv断片、線状抗体、一本鎖抗体（scFv）、sc(Fv)2、Fab3、ドメイン抗体 （dAb）（国際公開第2004/058821号、国際公開第2003/002609号）、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ及び抗体誘導体から形成される多重特異性抗体が含まれるが、それらに限定されるわけではない。ここで、「Fab」は一本の軽鎖、ならびに一本の重鎖のCH1領域および可変領域から構成される。また、「Fv」は最小の抗体誘導体であり、完全な抗原認識領域と抗原結合領域を含む。また抗体誘導体は例えばIgG抗体のFcとの融合体であってもよい。例えば、米国特許第5641870号明細書、実施例2；Zapata G et al. Protein Eng.1995, 8(10), 1057-1062 ; Olafsen T et al. Protein Eng. Design & Sel. 2004, 17(4):315-323 ; Holliger P et al. Nat. Biotechnol. 2005, 23(9);1126-36；Fischer N et al. Pathobiology. 2007, 74(1):3-14 ; Shen J et al. J Immunol Methods. 2007, 318, 65-74 ; Wu et al. Nat Biotechnol. 2007, 25(11), 1290-7を参照できる。
抗体修飾物としては、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)等の各種分子と結合した抗体を挙げることができる。本発明の抗体には、これらの抗体修飾物も包含される。本発明の抗体修飾物においては、結合される物質は限定されない。このような抗体修飾物を得るには、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。これらの方法はこの分野において既に確立されている。
「二重特異性」抗体は、異なるエピトープを認識する可変領域を同一の抗体分子内に有する抗体をいう。二重特異性抗体は2つ以上の異なる抗原を認識する抗体であってもよいし、同一抗原上の異なる2つ以上のエピトープを認識する抗体であってもよい。二重特異性抗体には、wholeの抗体だけでなく抗体誘導体が含まれていてもよい。本発明の抗体には、二重特異性抗体も含まれる。なお、本明細書において、抗FIXa/FX二重特異性抗体は、FIXa及びFXに結合する二重特異性抗体と同義で用いられる。
遺伝子組換え抗体の作成方法
抗体としては、遺伝子組換え技術を用いて産生した組換え型抗体を用いることができる。組換え型抗体は、それをコードするDNAをハイブリドーマ、または抗体を産生する感作リンパ球等の抗体産生細胞からクローニングし、ベクターに組み込んで、これを宿主（宿主細胞）に導入し産生させることにより得ることができる。
抗体は、ヒト抗体、マウス抗体、ラット抗体など、その由来は限定されない。またキメラ抗体やヒト化抗体などの遺伝子改変抗体でもよい。
ヒト抗体の取得方法は既に知られており、例えば、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を目的の抗原で免疫することで目的のヒト抗体を取得することができる（国際特許出願公開番号WO 93/12227, WO 92/03918，WO 94/02602, WO 94/25585，WO 96/34096, WO 96/33735参照）。
遺伝子改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。具体的には、たとえばキメラ抗体は、免疫動物の抗体のH鎖、およびL鎖の可変領域と、ヒト抗体のH鎖およびL鎖の定常領域からなる抗体である。免疫動物由来の抗体の可変領域をコードするDNAを、ヒト抗体の定常領域をコードするDNAと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることによって、キメラ抗体を得ることができる。
ヒト化抗体は、再構成(reshaped)ヒト抗体とも称される改変抗体である。ヒト化抗体は、免疫動物由来の抗体のCDRを、ヒト抗体の相補性決定領域へ移植することによって構築される。その一般的な遺伝子組換え手法も知られている（欧州特許出願公開番号EP 239400、国際特許出願公開番号WO 96/02576、Sato K et al, Cancer Research 1993, 53: 851-856、国際特許出願公開番号WO 99/51743参照）。
二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ抗体）は、二種の異なる抗原に対して特異性を有する抗体である。
二重特異性抗体はIgGタイプのものに限られないが、例えばIgGタイプ二重特異性抗体はIgG抗体を産生するハイブリドーマ二種を融合することによって生じるhybrid hybridoma(quadroma)によって分泌させることが出来る（Milstein C et al. Nature 1983, 305: 537-540）。また目的の二種のIgGを構成するL鎖及びH鎖の遺伝子、合計4種の遺伝子を細胞に導入することによって共発現させることによって分泌させることが出来る。
この際H鎖のCH3領域に適当なアミノ酸置換を施すことによってH鎖についてヘテロな組合せのIgGを優先的に分泌させることも出来る（Ridgway JB et al. Protein Engineering 1996, 9: 617-621、Merchant AM et al. Nature Biotechnology 1998, 16: 677-681、WO2006/106905、Davis JH et al. Protein Eng Des Sel. 2010, 4: 195-202.）。
また、L鎖に関しては、H鎖可変領域に比べてL鎖可変領域の多様性が低いことから、両H鎖に結合能を与え得る共通のL鎖が得られることが期待され、本発明の抗体は、共通のL鎖を有する抗体であってもよい。この共通L鎖と両H鎖遺伝子を細胞に導入することによってIgGを発現させることで効率の良い二重特異性IgGの発現が可能となる。
抗体としては、遺伝子組換え技術を用いて産生した組換え型抗体を用いることができる。組換え型抗体は、それをコードするDNAをハイブリドーマ、または抗体を産生する感作リンパ球等の抗体産生細胞からクローニングし、ベクターに組み込んで、これを宿主（宿主細胞）に導入し産生させることにより得ることができる。
抗体は、ヒト抗体、マウス抗体、ラット抗体など、その由来は限定されない。またキメラ抗体やヒト化抗体などの遺伝子改変抗体でもよい。
ヒト抗体の取得方法は既に知られており、例えば、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を目的の抗原で免疫することで目的のヒト抗体を取得することができる（国際特許出願公開番号WO 93/12227, WO 92/03918，WO 94/02602, WO 94/25585，WO 96/34096, WO 96/33735参照）。
遺伝子改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。具体的には、たとえばキメラ抗体は、免疫動物の抗体のH鎖、およびL鎖の可変領域と、ヒト抗体のH鎖およびL鎖の定常領域からなる抗体である。免疫動物由来の抗体の可変領域をコードするDNAを、ヒト抗体の定常領域をコードするDNAと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることによって、キメラ抗体を得ることができる。
ヒト化抗体は、再構成(reshaped)ヒト抗体とも称される改変抗体である。ヒト化抗体は、免疫動物由来の抗体のCDRを、ヒト抗体の相補性決定領域へ移植することによって構築される。その一般的な遺伝子組換え手法も知られている（欧州特許出願公開番号EP 239400、国際特許出願公開番号WO 96/02576、Sato K et al, Cancer Research 1993, 53: 851-856、国際特許出願公開番号WO 99/51743参照）。
二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ抗体）は、二種の異なる抗原に対して特異性を有する抗体である。
二重特異性抗体はIgGタイプのものに限られないが、例えばIgGタイプ二重特異性抗体はIgG抗体を産生するハイブリドーマ二種を融合することによって生じるhybrid hybridoma(quadroma)によって分泌させることが出来る（Milstein C et al. Nature 1983, 305: 537-540）。また目的の二種のIgGを構成するL鎖及びH鎖の遺伝子、合計4種の遺伝子を細胞に導入することによって共発現させることによって分泌させることが出来る。
この際H鎖のCH3領域に適当なアミノ酸置換を施すことによってH鎖についてヘテロな組合せのIgGを優先的に分泌させることも出来る（Ridgway JB et al. Protein Engineering 1996, 9: 617-621、Merchant AM et al. Nature Biotechnology 1998, 16: 677-681、WO2006/106905、Davis JH et al. Protein Eng Des Sel. 2010, 4: 195-202.）。
また、L鎖に関しては、H鎖可変領域に比べてL鎖可変領域の多様性が低いことから、両H鎖に結合能を与え得る共通のL鎖が得られることが期待され、本発明の抗体は、共通のL鎖を有する抗体であってもよい。この共通L鎖と両H鎖遺伝子を細胞に導入することによってIgGを発現させることで効率の良い二重特異性IgGの発現が可能となる。
抗体の製造方法
本発明の抗体は当業者に公知の方法により製造することができる。具体的には、目的とする抗体をコードするDNAを発現ベクターへ組み込む。その際、発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させる。その際には、適当な宿主と発現ベクターの組み合わせを使用することができる。
本発明の抗体は当業者に公知の方法により製造することができる。具体的には、目的とする抗体をコードするDNAを発現ベクターへ組み込む。その際、発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させる。その際には、適当な宿主と発現ベクターの組み合わせを使用することができる。
抗体を生産する目的においてベクターを使用する場合には、特に、発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、例えば、宿主をJM109、DH5α、HB101、XL1-Blueなどの大腸菌とした場合においては、大腸菌で効率よく発現できるようなプロモーター、例えば、lacZプロモーターなどを持っていることが不可欠である。
また、ベクターには、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよい。
宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法を用いて行うことができる。
また、ベクターには、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよい。
宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法を用いて行うことができる。
大腸菌発現ベクターの他、本発明の抗体を製造するためのベクターとしては、例えば、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、pcDNA3（Invitrogen社製）や、pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res.1990, 18(17),p5322)、pEF、pCDM8）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Bac-to-BAC baculovirus expression system」（GIBCO BRL社製）、pBacPAK8）が挙げられる。
CHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばSV40プロモーター（Mulliganら, Nature (1979) 277, 108）などを持っていることが不可欠であり、形質転換細胞を選抜するための遺伝子を有すればさらに好ましい。形質転換細胞を選抜するための遺伝子としては、例えば、薬剤（ネオマイシン、G418など）により判別できるような薬剤耐性遺伝子がある。
さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を目的とする場合には、核酸合成経路を欠損したCHO細胞にそれを相補するDHFR遺伝子を有するベクター（例えば、pCHOIなど）を導入し、メトトレキセート（MTX）により増幅させる方法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、SV40 T抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つCOS細胞を用いてSV40の複製起点を持つベクター（pcDなど）で形質転換する方法が挙げられる。
さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を目的とする場合には、核酸合成経路を欠損したCHO細胞にそれを相補するDHFR遺伝子を有するベクター（例えば、pCHOIなど）を導入し、メトトレキセート（MTX）により増幅させる方法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、SV40 T抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つCOS細胞を用いてSV40の複製起点を持つベクター（pcDなど）で形質転換する方法が挙げられる。
これにより得られた本発明の抗体は、宿主細胞内または細胞外（培地など）から単離し、実質的に純粋で均一な抗体として精製することができる。抗体の分離、精製は、通常の抗体の精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせれば抗体を分離、精製することができる。
クロマトグラフィーとしては、例えばアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996）。これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィー、例えばHPLC、FPLC等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、Protein Aカラム、Protein Gカラムが挙げられる。例えば、Protein Aを用いたカラムとして、Hyper D, POROS, Sepharose FF（GE Amersham Biosciences）等が挙げられる。本発明は、これらの精製方法を用い、高度に精製された抗体も包含する。
得られた抗体は、均一にまで精製することができる。抗体の分離、精製は通常の蛋白質で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。例えばアフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組合せれば、抗体を分離、精製することができる(Antibodies : A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)が、これらに限定されるものではない。アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、Protein Aカラム、Protein Gカラムなどが挙げられる。
本発明では、本発明に記載の抗体および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。例えば、本発明の抗体がFVIII様活性を有するFIXおよび／またはFIXa、ならびにFXに対する二重特異性抗体である場合、例えば、出血、出血を伴う疾患、もしくは出血に起因する疾患の予防および／または治療のための医薬品（医薬組成物）もしくは薬剤となることが期待される。
本発明において、出血、出血を伴う疾患、もしくは出血に起因する疾患とは、好ましくはFVIIIおよび／またはFVIIIaの活性の低下ないし欠損によって発症および／または進展する疾患である。このような疾患としては、例えば上記の血友病A、FVIII/FVIIIaに対するインヒビターが出現している疾患、後天性血友病、フォンビルブランド病等を挙げることができるが、これら疾患に特に制限されない。
本発明の別の一つの実施態様は、少なくとも本発明の抗体もしくは組成物を含む、上記疾患の予防および/又は治療する方法に用いるためのキットである。該キットには、その他、注射筒、注射針、薬学的に許容される媒体、アルコール綿布、絆創膏、または使用方法を記載した指示書等をパッケージしておくこともできる。
また本発明の別の一つの実施態様は、本発明の抗体または組成物の、出血、出血を伴う疾患もしくは出血に起因する疾患の予防および/または治療剤の製造における使用に関する。
また本発明の別の一つの実施態様は、本発明の抗体または組成物を投与する工程を含む、出血、出血を伴う疾患もしくは出血に起因する疾患を予防および/または治療する方法に関する。
また本発明の別の一つの実施態様は、出血、出血を伴う疾患もしくは出血に起因する疾患の予防および/または治療において用いるための、本発明の抗体または組成物に関する。
治療または予防目的で使用される本発明の抗体を有効成分として含む医薬組成物は、必要に応じて、それらに対して不活性な適当な薬学的に許容される担体、媒体等と混和して製剤化することができる。例えば、滅菌水や生理食塩水、安定剤、賦形剤、酸化防止剤(アスコルビン酸等)、緩衝剤（リン酸、クエン酸、ヒスチジン、他の有機酸等）、防腐剤、界面活性剤（PEG、Tween等）、キレート剤（EDTA等）、結合剤等を挙げることができる。また、その他の低分子量のポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチンや免疫グロブリン等の蛋白質、グリシン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸、メチオニン、アルギニン及びリシン等のアミノ酸、多糖及び単糖等の糖類や炭水化物、マンニトールやソルビトール等の糖アルコールを含んでいてもよい。注射用の水溶液とする場合には、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えば、D-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール（エタノール等）、ポリアルコール（プロピレングリコール、PEG等）、非イオン性界面活性剤（ポリソルベート80、ポリソルベート20、ポロキサマー188、HCO-50）等と併用してもよい。また、製剤中にヒアルロニダーゼ（hyaluronidase）を混合することによって、より大きな液量を皮下投与することも可能である（Expert Opin Drug Deliv. 2007 Jul;4(4):427-40.）。
また、必要に応じ本発明の抗体をマイクロカプセル（ヒドロキシメチルセルロース、ゼラチン、ポリ[メチルメタクリル酸]等のマイクロカプセル）に封入したり、コロイドドラッグデリバリーシステム（リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル等）とすることもできる（"Remington's Pharmaceutical Science 16th edition", Oslo Ed. (1980)等参照）。さらに、薬剤を徐放性の薬剤とする方法も公知であり、本発明の抗体に適用し得る（Langer et al., J.Biomed.Mater.Res. 15: 267-277 (1981); Langer, Chemtech. 12: 98-105 (1982);米国特許第3,773,919号;欧州特許出願公開(EP)第58,481号; Sidman et al., Biopolymers 22: 547-556 (1983);EP第133,988号）。
また、必要に応じ本発明の抗体をマイクロカプセル（ヒドロキシメチルセルロース、ゼラチン、ポリ[メチルメタクリル酸]等のマイクロカプセル）に封入したり、コロイドドラッグデリバリーシステム（リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル等）とすることもできる（"Remington's Pharmaceutical Science 16th edition", Oslo Ed. (1980)等参照）。さらに、薬剤を徐放性の薬剤とする方法も公知であり、本発明の抗体に適用し得る（Langer et al., J.Biomed.Mater.Res. 15: 267-277 (1981); Langer, Chemtech. 12: 98-105 (1982);米国特許第3,773,919号;欧州特許出願公開(EP)第58,481号; Sidman et al., Biopolymers 22: 547-556 (1983);EP第133,988号）。
本発明の医薬組成物の投与量は、剤型の種類、投与方法、患者の年齢や体重、患者の症状、疾患の種類や進行の程度等を考慮して、最終的には医師の判断により適宜決定されるものであるが、例えば前記二重特異性抗体の場合、1投与当たり約0.001～約1000mg/kgである。好ましくは、約0.01 mg/kg～約100 mg/kgである。投与間隔は、例えば前記二重特異性抗体の場合、少なくとも1日以上である。好ましくは、1週間、2週間、4週間、1カ月、3カ月、6カ月である。これらの投与量は患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。投与期間も、患者の治癒経過等に応じて適宜決定することが好ましい。
本発明の医薬組成物は、経口、非経口投与のいずれかによって患者に投与することができる。好ましくは非経口投与である。係る投与方法としては具体的には、注射投与、経鼻投与、経肺投与、経皮投与などが挙げられる。注射投与としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などが挙げられる。
本発明の医薬組成物は顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、溶剤、乳剤、あるいは懸濁剤等の経口剤、注射剤等とすることが出来る。
また本発明は、本発明の抗体をコードする遺伝子あるいは核酸を提供する。また、本発明の抗体をコードする遺伝子あるいは核酸を遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。
本発明の別の一つの実施態様は、定常領域を含む抗体の活性を増強する方法であって、定常領域の少なくとも1つのアミノ酸残基を改変する方法に関する。好ましくはCH3領域又はヒンジ領域の少なくとも1つのアミノ酸残基を改変する方法が好ましい。特に好ましくはEUナンバリング434位を改変する方法であり、より好ましくはEUナンバリング434位のAsn(N)をTyr（Y）に改変する方法である。また特に好ましくはヒンジ領域を改変する方法であり、より好ましくはEUナンバリング216位～230位をAAAC（配列番号：２８）と改変する方法である。尚、EUナンバリング216位～230位の一部を改変することで、EUナンバリング216位～230位がAAACとなるように改変する方法も本発明に含まれる。また、上記改変を含む限り、その他の改変が含まれていてもよい。
本発明の別の一つの実施態様は、FIXおよび／またはFIXa、ならびにFXに対する二重特異性抗体のFVIII様活性を増強する方法であって、配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるH鎖と配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるL鎖が会合し、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるH鎖と配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるL鎖が会合している二重特異性抗体の定常領域の少なくとも1つのアミノ酸残基を改変する方法である。
本発明の別の特定の一つの実施態様は、FIXおよび／またはFIXa、ならびにFXに対する二重特異性抗体のFVIII様活性を増強する方法であって、配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるH鎖と配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるL鎖が会合し、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるH鎖と配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるL鎖が会合している二重特異性抗体のEUナンバリング434位のアミノ酸残基をTyr（Y）に改変する方法である。
本発明の別の特定の一つの実施態様は、FIXおよび／またはFIXa、ならびにFXに対する二重特異性抗体のFVIII様活性を増強する方法であって、配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるH鎖と配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるL鎖が会合し、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるH鎖と配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるL鎖が会合している二重特異性抗体のEUナンバリングEUナンバリング216位～230位のアミノ酸残基をAAACに改変する方法である。
本発明の別の一つの実施態様は、定常領域を含む抗体の製造方法であって、(a) 定常領域の少なくとも1つのアミノ酸残基を改変することで改変前の抗体に比べ活性が増強されるように、該アミノ酸残基を含む抗体をコードする核酸を改変し、（ｂ）宿主細胞を該核酸が発現するように培養し、（ｃ）宿主細胞培養物から抗体を回収することを含む方法である。
本明細書において用いる場合、「・・・を含む（comprising）」との表現により表される態様は、「本質的に・・・からなる（essentially consisting of）」との表現により表される態様、ならびに「・・・からなる（consisting of）」との表現により表される態様を包含する。
本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て本明細書に参照として取り込まれる。
本発明は、以下の実施例によってさらに例示されるが、下記の実施例に限定されるものではない。
本発明は、以下の実施例によってさらに例示されるが、下記の実施例に限定されるものではない。
[実施例１]
抗FIXa/FX二重特異性抗体であるACE910はヒトＩｇＧ４アイソタイプを有する抗体である（J Thromb Haemost. 2014 Feb;12(2):206-213.）。ACE910（以下ACE910-Aとも記載する）は3種類の４本の鎖からなり、それぞれFIXaに対する重鎖をＱ鎖、FXに対する重鎖をＪ鎖、共通軽鎖をＬ鎖とする。ACE910-A（Q、J、L：配列番号１、２、３）（WO 2012/067176）をコントロール抗体として使用した。
Knobs into holes（Nat Biotechnol. 1998 Jul;16(7):677-81.）を用い、ヒトIgG1、2、4型のACE910を作製した。すなわち、ACE910-B-IgG1（Q、J、L：配列番号４、５、３）、ACE910-B-IgG2（Q、J、L：配列番号６、７、３）、および、ACE910-B-IgG4（Q、J、L：配列番号８、９、３）を作製し、ヒトＩｇＧのアイソタイプの及ぼすFVIII様活性への影響を評価した。
ACE910は共通Ｌ鎖（WO2006/109592を参照して作製）とＣＨ３／ＣＨ３界面制御（WO2006/106905を参照して作製）を用いた抗FIXa/FX二重特異性抗体であるが、二重特異性抗体を製造する方法は他にも報告されている（Drug Discov. Today. 2015 Jul;20(7):838-47.、WO2015/046467、WO2011/117329、WO2013/065708）。これらの方法を用いて、ACE910-Aの可変領域配列を有する二重特異性抗体を作製し、二重特異性抗体を製造する方法の及ぼすFVIII様活性への影響を評価した。具体的には、以下、ACE910-B-IgG4（Q、J、L：配列番号８、９、３）、ACE910-D１（重鎖Q、J：配列番号１２、１３）（軽鎖L1、L2：配列番号１４、１５）（WO2011/117329を参照して作製）、ACE910-D2（重鎖Q、J：配列番号１６、１７）（軽鎖L1、L2：配列番号１８、１９）（WO2011/117329を参照して作製）、ＡCE910-E（重鎖Q、J：配列番号２０、２１）（軽鎖L1、L2：配列番号２２、２３）（WO2013/065708を参照して作製）を作製し、FVIII様活性を評価した。
抗FIXa/FX二重特異性抗体であるACE910はヒトＩｇＧ４アイソタイプを有する抗体である（J Thromb Haemost. 2014 Feb;12(2):206-213.）。ACE910（以下ACE910-Aとも記載する）は3種類の４本の鎖からなり、それぞれFIXaに対する重鎖をＱ鎖、FXに対する重鎖をＪ鎖、共通軽鎖をＬ鎖とする。ACE910-A（Q、J、L：配列番号１、２、３）（WO 2012/067176）をコントロール抗体として使用した。
Knobs into holes（Nat Biotechnol. 1998 Jul;16(7):677-81.）を用い、ヒトIgG1、2、4型のACE910を作製した。すなわち、ACE910-B-IgG1（Q、J、L：配列番号４、５、３）、ACE910-B-IgG2（Q、J、L：配列番号６、７、３）、および、ACE910-B-IgG4（Q、J、L：配列番号８、９、３）を作製し、ヒトＩｇＧのアイソタイプの及ぼすFVIII様活性への影響を評価した。
ACE910は共通Ｌ鎖（WO2006/109592を参照して作製）とＣＨ３／ＣＨ３界面制御（WO2006/106905を参照して作製）を用いた抗FIXa/FX二重特異性抗体であるが、二重特異性抗体を製造する方法は他にも報告されている（Drug Discov. Today. 2015 Jul;20(7):838-47.、WO2015/046467、WO2011/117329、WO2013/065708）。これらの方法を用いて、ACE910-Aの可変領域配列を有する二重特異性抗体を作製し、二重特異性抗体を製造する方法の及ぼすFVIII様活性への影響を評価した。具体的には、以下、ACE910-B-IgG4（Q、J、L：配列番号８、９、３）、ACE910-D１（重鎖Q、J：配列番号１２、１３）（軽鎖L1、L2：配列番号１４、１５）（WO2011/117329を参照して作製）、ACE910-D2（重鎖Q、J：配列番号１６、１７）（軽鎖L1、L2：配列番号１８、１９）（WO2011/117329を参照して作製）、ＡCE910-E（重鎖Q、J：配列番号２０、２１）（軽鎖L1、L2：配列番号２２、２３）（WO2013/065708を参照して作製）を作製し、FVIII様活性を評価した。
これらの遺伝子全合成等の当業者公知の方法により行い、各種ACE910 variantを作製した。抗体の発現はHEK293FS (Invitrogen)を用い、精製はrecombinant protein A (GE healthcare)を用いて行い、当業者公知の方法により二重特異性抗体を調製した。
精製された二重特異性抗体のFVIII様活性（FXa産生促進活性）は、以下の方法で測定した。反応はすべて室温で行われた。0.1%牛血清アルブミンを含むトリス緩衝生理食塩水（以下、TBSBと称す）で希釈した抗体溶液5μLを、150 ng/mLのHuman Factor IXa beta (Enzyme Research Laboratories) 5μLと混合した後、384穴plate中にて室温で30分インキュベーションした。この混合液中の酵素反応は、24.7μg/mLのHuman Factor X (Enzyme Research Laboratories) 5μLを添加して開始させ、4分後、0.5 M EDTA 5μLを添加して停止させた。発色反応は、発色基質溶液5μLを添加することによって、開始させた。30分間の発色反応後、405 nmの吸光度変化はSpectraMax 340PC384 (Molecular Devices) を用いて測定した。
精製された二重特異性抗体のFVIII様活性（FXa産生促進活性）は、以下の方法で測定した。反応はすべて室温で行われた。0.1%牛血清アルブミンを含むトリス緩衝生理食塩水（以下、TBSBと称す）で希釈した抗体溶液5μLを、150 ng/mLのHuman Factor IXa beta (Enzyme Research Laboratories) 5μLと混合した後、384穴plate中にて室温で30分インキュベーションした。この混合液中の酵素反応は、24.7μg/mLのHuman Factor X (Enzyme Research Laboratories) 5μLを添加して開始させ、4分後、0.5 M EDTA 5μLを添加して停止させた。発色反応は、発色基質溶液5μLを添加することによって、開始させた。30分間の発色反応後、405 nmの吸光度変化はSpectraMax 340PC384 (Molecular Devices) を用いて測定した。
ACE910-B-IgG1およびACE910-B-IgG4の活性を比較した結果を図１に示した。ヒトIgG1アイソタイプであっても高いFVIII様活性を有することが確認された。これまでの報告では、FVIII様活性を有する抗FIXa/FX二重特異性抗体はヒトIgG4アイソタイプでなければ高い活性を示さなかった（特許文献１，２，３，４および非特許文献７）。本試験の結果から、ヒトIgG1であっても高いFVIII様活性を有する抗FIXa/FX二重特異性抗体が見いだされた。
ACE910-B-IgG4およびACE910-D1、ACE910-D2、ACE910-Eの活性を比較した結果を図２に示した。これらのACE910 variantの活性はACE910-Aとほぼ同等であることが確認され、ACE910の可変領域のFVIII様活性は二重特異性抗体を製造する方法の影響を受けないことが見いだされた。
[実施例２]
ACE910-A（Q、J、L：配列番号１、２、３）と同一の可変領域配列を有するヒトIgG4二重特異性抗体であるACE910-B-IgG4（Q、J、L：配列番号８、９、３）あるいはACE910-C（Q、J、L：配列番号１０、１１、３）（WO2015/046467を参照して作製）に対して、PCRあるいは遺伝子全合成等の当業者公知の方法により、変異を導入し、各種ACE910 variantを作製した。抗体の発現および精製は実施例１の方法に従って実施した。導入した変異は以下の表1（ヒンジ領域以外への変異導入）および表２（ヒンジ領域への変異導入）にまとめた。
ACE910-A（Q、J、L：配列番号１、２、３）と同一の可変領域配列を有するヒトIgG4二重特異性抗体であるACE910-B-IgG4（Q、J、L：配列番号８、９、３）あるいはACE910-C（Q、J、L：配列番号１０、１１、３）（WO2015/046467を参照して作製）に対して、PCRあるいは遺伝子全合成等の当業者公知の方法により、変異を導入し、各種ACE910 variantを作製した。抗体の発現および精製は実施例１の方法に従って実施した。導入した変異は以下の表1（ヒンジ領域以外への変異導入）および表２（ヒンジ領域への変異導入）にまとめた。
表1および表２に示した各種ACE910 variantのうち、親抗体であるACE910-Aと比較してFVIII様活性が上昇したのは、T08（Q、J、L：配列番号２４、２５、３）およびT46P（Q、J、L：配列番号２６、２７、３）であった。その他のACE910 variantはACE910と同等あるいは以下のFVIII様活性であった。ACE910、T08およびT46PのFVIII様活性を図３、図４に示す。
Claims (15)
- 改変された血液凝固第IX因子および／または活性化血液凝固第IX因子、ならびに血液凝固第X因子に対する二重特異性抗体であって、当該抗体の定常領域に少なくとも1つのアミノ酸残基の改変を含み、当該改変前の抗体である配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるH鎖と配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるL鎖が会合し、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるH鎖と配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるL鎖が会合している二重特異性抗体に比べ高い血液凝固第VIII因子様活性を有する、前記抗体。
- 前記改変はCH3領域及び/又はヒンジ領域における改変である、請求項１に記載の抗体。
- CH3領域における改変がEUナンバリング434位における改変である、請求項２に記載の抗体。
- EUナンバリング434位における改変はTyr（Y）への改変である、請求項３に記載の抗体。
- ヒンジ領域における改変はEUナンバリング216位～230位をAAACとする改変である、請求項２に記載の抗体。
- 請求項１～５のいずれかに記載の抗体、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
- 出血、出血を伴う疾患、もしくは出血に起因する疾患の予防および/または治療に用いられる医薬組成物であって、該疾患が、血液凝固第VIII因子および/または活性化血液凝固第VIII因子の活性の低下ないし欠損によって発症および/または進展する疾患である、請求項６に記載の組成物。
- 血液凝固第VIII因子および/または活性化血液凝固第VIII因子の活性の低下ないし欠損によって発症および/または進展する疾患が、血友病A、後天性血友病、フォンビルブランド病又は血液凝固第VIII因子および/もしくは活性化血液凝固第VIII因子に対するインヒビターが出現している疾患である、請求項7に記載の組成物。
- 少なくとも請求項１～５のいずれかに記載の二重特異性抗体を含む、出血、出血を伴う疾患もしくは出血に起因する疾患を予防および/または治療する方法に用いるためのキット。
- 血液凝固第IX因子および／または活性化血液凝固第IX因子、ならびに血液凝固第X因子に対する二重特異性抗体の血液凝固第VIII因子様活性を増強する方法であって、配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるH鎖と配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるL鎖が会合し、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるH鎖と配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるL鎖が会合している二重特異性抗体の定常領域の少なくとも1つのアミノ酸残基を改変する、前記方法。
- 前記改変はCH3領域及び/又はヒンジ領域における少なくとも1つのアミノ酸残基の改変である、請求項１０に記載の方法。
- CH3領域における改変がEUナンバリングによる434位における改変である、請求項１１に記載の方法。
- 434位における改変はTyr（Y）への改変である、請求項１２に記載の方法。
- ヒンジ領域における改変はEUナンバリング216位～230位をAAACとする改変である、請求項１１に記載の方法。
- 血液凝固第IX因子および／または活性化血液凝固第IX因子、ならびに血液凝固第X因子に対する二重特異性抗体の製造方法であって、(a) 定常領域の少なくとも1つのアミノ酸残基を改変することで改変前の配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるH鎖と配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるL鎖が会合し、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるH鎖と配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるL鎖が会合している二重特異性抗体に比べ血液凝固第VIII因子様活性が増強されるように、該アミノ酸残基を含む抗体をコードする核酸を改変し、（ｂ）宿主細胞を該核酸が発現するように培養し、（ｃ）宿主細胞培養物から抗体を回収することを含む方法。
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Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP6496095B1 (ja) * | 2017-09-29 | 2019-04-03 | 中外製薬株式会社 | 血液凝固第ｖｉｉｉ因子（ｆｖｉｉｉ）補因子機能代替活性を有する多重特異性抗原結合分子および当該分子を有効成分として含有する薬学的製剤 |
| US10450381B2 (en) | 2010-11-17 | 2019-10-22 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Methods of treatment that include the administration of bispecific antibodies |
| CN111479829A (zh) * | 2017-11-01 | 2020-07-31 | 中外制药株式会社 | 具有降低的生物活性的抗体变体和同种型 |
| US10815308B2 (en) | 2018-12-21 | 2020-10-27 | Kymab Limited | FIXaxFX bispecific antibody with common light chain |
| US11919969B2 (en) | 2017-06-22 | 2024-03-05 | Kymab Limited | Bispecific antibodies for factor IX and factor X |
| US12168697B2 (en) | 2015-12-25 | 2024-12-17 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Bispecific antibodies which bind blood coagulation factor VIII and have enhanced activity, and methods of use thereof for treating bleeding and associated conditions |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AR080428A1 (es) | 2010-01-20 | 2012-04-11 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Formulaciones liquidas estabilizadas contentivas de anticuerpos |
| FR3082427B1 (fr) * | 2018-06-14 | 2020-09-25 | Lab Francais Du Fractionnement | Combinaison de facteur vii et d'un anticorps bispecifique anti-facteurs ix et x |
Citations (25)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3773919A (en) | 1969-10-23 | 1973-11-20 | Du Pont | Polylactide-drug mixtures |
| EP0058481A1 (en) | 1981-02-16 | 1982-08-25 | Zeneca Limited | Continuous release pharmaceutical compositions |
| EP0133988A2 (de) | 1983-08-02 | 1985-03-13 | Hoechst Aktiengesellschaft | Regulatorische Peptide enthaltende pharmazeutische Präparate mit protrahierter Freisetzung und Verfahren zu deren Herstellung |
| EP0239400A2 (en) | 1986-03-27 | 1987-09-30 | Medical Research Council | Recombinant antibodies and methods for their production |
| WO1992003918A1 (en) | 1990-08-29 | 1992-03-19 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
| WO1993012227A1 (en) | 1991-12-17 | 1993-06-24 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
| WO1994002602A1 (en) | 1992-07-24 | 1994-02-03 | Cell Genesys, Inc. | Generation of xenogeneic antibodies |
| WO1994025585A1 (en) | 1993-04-26 | 1994-11-10 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
| WO1996002576A1 (fr) | 1994-07-13 | 1996-02-01 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Anticorps humain reconstitue contre l'interleukine-8 humaine |
| WO1996033735A1 (en) | 1995-04-27 | 1996-10-31 | Abgenix, Inc. | Human antibodies derived from immunized xenomice |
| WO1996034096A1 (en) | 1995-04-28 | 1996-10-31 | Abgenix, Inc. | Human antibodies derived from immunized xenomice |
| US5641870A (en) | 1995-04-20 | 1997-06-24 | Genentech, Inc. | Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification |
| WO1999051743A1 (fr) | 1998-04-03 | 1999-10-14 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Anticorps humanise contre le facteur tissulaire humain (tf) et procede de production d'anticorps humanises |
| WO2003002609A2 (en) | 2001-06-28 | 2003-01-09 | Domantis Limited | Dual-specific ligand and its use |
| WO2004058821A2 (en) | 2002-12-27 | 2004-07-15 | Domantis Limited | Dual specific single domain antibodies specific for a ligand and for the receptor of the ligand |
| WO2005035756A1 (ja) | 2003-10-10 | 2005-04-21 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | 機能蛋白質を代替する二種特異性抗体 |
| WO2005035754A1 (ja) | 2003-10-14 | 2005-04-21 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | 機能蛋白質を代替する二重特異性抗体 |
| WO2006106905A1 (ja) | 2005-03-31 | 2006-10-12 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | 会合制御によるポリペプチド製造方法 |
| WO2006109592A1 (ja) | 2005-04-08 | 2006-10-19 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | 血液凝固第viii因子の機能代替抗体 |
| JP2008510466A (ja) * | 2004-08-19 | 2008-04-10 | ジェネンテック・インコーポレーテッド | エフェクター機能が変更しているポリペプチド変異体 |
| WO2011117329A1 (en) | 2010-03-26 | 2011-09-29 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Bispecific, bivalent anti-vegf/anti-ang-2 antibodies |
| WO2012067176A1 (ja) | 2010-11-17 | 2012-05-24 | 中外製薬株式会社 | 血液凝固第viii因子の機能を代替する機能を有する多重特異性抗原結合分子 |
| WO2013065708A1 (ja) | 2011-10-31 | 2013-05-10 | 中外製薬株式会社 | 重鎖と軽鎖の会合が制御された抗原結合分子 |
| WO2015046467A1 (ja) | 2013-09-27 | 2015-04-02 | 中外製薬株式会社 | ポリペプチド異種多量体の製造方法 |
| JP2015514684A (ja) * | 2012-02-22 | 2015-05-21 | ユセベ ファルマ ソシエテ アノニム | 配列非対称形に修飾されたＩｇＧ４二重特異性抗体 |
Family Cites Families (90)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4208479A (en) | 1977-07-14 | 1980-06-17 | Syva Company | Label modified immunoassays |
| US4474893A (en) | 1981-07-01 | 1984-10-02 | The University of Texas System Cancer Center | Recombinant monoclonal antibodies |
| US4444878A (en) | 1981-12-21 | 1984-04-24 | Boston Biomedical Research Institute, Inc. | Bispecific antibody determinants |
| US6010902A (en) | 1988-04-04 | 2000-01-04 | Bristol-Meyers Squibb Company | Antibody heteroconjugates and bispecific antibodies for use in regulation of lymphocyte activity |
| IL89491A0 (en) | 1988-11-17 | 1989-09-10 | Hybritech Inc | Bifunctional chimeric antibodies |
| US5530101A (en) | 1988-12-28 | 1996-06-25 | Protein Design Labs, Inc. | Humanized immunoglobulins |
| DE3920358A1 (de) | 1989-06-22 | 1991-01-17 | Behringwerke Ag | Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung |
| KR100236375B1 (ko) | 1989-12-11 | 1999-12-15 | 오트리브 데이비스 더블유 | 진단제 또는 치료제를 목표부위에 타게팅하기 위한 제제 및 키트 |
| TW212184B (ja) | 1990-04-02 | 1993-09-01 | Takeda Pharm Industry Co Ltd | |
| JPH05184383A (ja) | 1990-06-19 | 1993-07-27 | Dainabotsuto Kk | 二重特異性抗体 |
| JPH05199894A (ja) | 1990-08-20 | 1993-08-10 | Takeda Chem Ind Ltd | 二重特異性抗体および抗体含有薬剤 |
| JPH05304992A (ja) | 1991-06-20 | 1993-11-19 | Takeda Chem Ind Ltd | ハイブリッド・モノクローナル抗体および抗体含有薬剤 |
| JPH06104071A (ja) | 1991-08-30 | 1994-04-15 | Jasco Corp | 発熱体セラミックス溶接加工方法 |
| ATE297465T1 (de) | 1991-11-25 | 2005-06-15 | Enzon Inc | Verfahren zur herstellung von multivalenten antigenbindenden proteinen |
| US5667988A (en) | 1992-01-27 | 1997-09-16 | The Scripps Research Institute | Methods for producing antibody libraries using universal or randomized immunoglobulin light chains |
| JPH05203652A (ja) | 1992-01-28 | 1993-08-10 | Fuji Photo Film Co Ltd | 抗体酵素免疫分析法 |
| JPH05213775A (ja) | 1992-02-05 | 1993-08-24 | Otsuka Pharmaceut Co Ltd | Ｂｆａ抗体 |
| US6749853B1 (en) | 1992-03-05 | 2004-06-15 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Combined methods and compositions for coagulation and tumor treatment |
| US6129914A (en) | 1992-03-27 | 2000-10-10 | Protein Design Labs, Inc. | Bispecific antibody effective to treat B-cell lymphoma and cell line |
| US5744446A (en) | 1992-04-07 | 1998-04-28 | Emory University | Hybrid human/animal factor VIII |
| WO1994013804A1 (en) | 1992-12-04 | 1994-06-23 | Medical Research Council | Multivalent and multispecific binding proteins, their manufacture and use |
| AU7214294A (en) | 1993-07-01 | 1995-01-24 | Dade International Inc. | Process for the preparation of factor x depleted plasma |
| NZ288883A (en) | 1994-07-11 | 1998-12-23 | Univ Texas | Conjugates comprising coagulation factors |
| JPH10511085A (ja) | 1994-12-02 | 1998-10-27 | カイロン コーポレイション | 二重特異性抗体を用いる免疫応答を促進する方法 |
| US5731168A (en) | 1995-03-01 | 1998-03-24 | Genentech, Inc. | Method for making heteromultimeric polypeptides |
| MA24512A1 (fr) | 1996-01-17 | 1998-12-31 | Univ Vermont And State Agrienl | Procede pour la preparation d'agents anticoagulants utiles dans le traitement de la thrombose |
| JP3032287U (ja) | 1996-06-10 | 1996-12-17 | 幸喜 高橋 | 人 形 |
| JPH10165184A (ja) | 1996-12-16 | 1998-06-23 | Tosoh Corp | 抗体、遺伝子及びキメラ抗体の製法 |
| CA2288600C (en) | 1997-05-02 | 2010-06-01 | Genentech, Inc. | A method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components |
| US20020062010A1 (en) | 1997-05-02 | 2002-05-23 | Genentech, Inc. | Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components |
| US20030207346A1 (en) | 1997-05-02 | 2003-11-06 | William R. Arathoon | Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components |
| DE19725586C2 (de) | 1997-06-17 | 1999-06-24 | Gsf Forschungszentrum Umwelt | Verfahren zur Herstellung von Zellpräparaten zur Immunisierung mittels heterologer intakter bispezifischer und/oder trispezifischer Antikörper |
| US6207805B1 (en) | 1997-07-18 | 2001-03-27 | University Of Iowa Research Foundation | Prostate cell surface antigen-specific antibodies |
| US6342220B1 (en) | 1997-08-25 | 2002-01-29 | Genentech, Inc. | Agonist antibodies |
| AT411997B (de) | 1999-09-14 | 2004-08-26 | Baxter Ag | Faktor ix/faktor ixa aktivierende antikörper und antikörper-derivate |
| AU2001264946A1 (en) | 2000-05-24 | 2001-12-03 | Imclone Systems Incorporated | Bispecific immunoglobulin-like antigen binding proteins and method of production |
| US7732133B2 (en) | 2000-07-17 | 2010-06-08 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Screening methods for biologically active ligands |
| ES2332402T5 (es) | 2000-10-12 | 2018-05-14 | Genentech, Inc. | Formulaciones de proteína concentradas de viscosidad reducida |
| AU2002210918B2 (en) | 2000-10-20 | 2006-03-16 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Degraded agonist antibody |
| ES2326964T3 (es) | 2001-10-25 | 2009-10-22 | Genentech, Inc. | Composiciones de glicoproteina. |
| DE10156482A1 (de) | 2001-11-12 | 2003-05-28 | Gundram Jung | Bispezifisches Antikörper-Molekül |
| EP1500665B1 (en) | 2002-04-15 | 2011-06-15 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | METHODS FOR CONSTRUCTING scDb LIBRARIES |
| US7732149B2 (en) | 2002-04-26 | 2010-06-08 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Methods of screening agonistic antibodies |
| JP4836451B2 (ja) | 2002-07-18 | 2011-12-14 | メルス ベー ヴェー | 抗体混合物の組換え生産 |
| AU2003303543A1 (en) | 2002-12-26 | 2004-07-29 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Agonist antibody against heteroreceptor |
| ATE431423T1 (de) | 2003-01-21 | 2009-05-15 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Verfahren zum screening der leichten kette eines antikörpers |
| CN100353997C (zh) | 2003-02-28 | 2007-12-12 | 中外制药株式会社 | 稳定的含蛋白质的制剂 |
| GB2400851B (en) | 2003-04-25 | 2004-12-15 | Bioinvent Int Ab | Identifying binding of a polypeptide to a polypeptide target |
| US8597911B2 (en) | 2003-06-11 | 2013-12-03 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Process for producing antibodies |
| US7297336B2 (en) | 2003-09-12 | 2007-11-20 | Baxter International Inc. | Factor IXa specific antibodies displaying factor VIIIa like activity |
| JP5490734B2 (ja) * | 2003-10-10 | 2014-05-14 | 中外製薬株式会社 | 機能蛋白質を代替する二種特異性抗体 |
| US20050266425A1 (en) | 2003-12-31 | 2005-12-01 | Vaccinex, Inc. | Methods for producing and identifying multispecific antibodies |
| US8802820B2 (en) | 2004-11-12 | 2014-08-12 | Xencor, Inc. | Fc variants with altered binding to FcRn |
| CN105177091A (zh) | 2006-03-31 | 2015-12-23 | 中外制药株式会社 | 用于纯化双特异性抗体的抗体修饰方法 |
| US7683158B2 (en) | 2006-03-31 | 2010-03-23 | Baxter International Inc. | Pegylated factor VIII |
| CA2647846C (en) * | 2006-03-31 | 2016-06-21 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Methods for controlling blood pharmacokinetics of antibodies |
| EP2035456A1 (en) | 2006-06-22 | 2009-03-18 | Novo Nordisk A/S | Production of bispecific antibodies |
| CN101874042B9 (zh) | 2007-09-26 | 2019-01-01 | 中外制药株式会社 | 利用cdr的氨基酸取代来改变抗体等电点的方法 |
| PE20091174A1 (es) | 2007-12-27 | 2009-08-03 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Formulacion liquida con contenido de alta concentracion de anticuerpo |
| SI2235064T1 (sl) | 2008-01-07 | 2016-04-29 | Amgen Inc. | Metoda za izdelavo heterodimernih molekul - protitelesa fc z uporabo elektrostatičnih usmerjevalnih učinkov |
| EP2424567B1 (en) | 2009-04-27 | 2018-11-21 | OncoMed Pharmaceuticals, Inc. | Method for making heteromultimeric molecules |
| WO2011078332A1 (ja) | 2009-12-25 | 2011-06-30 | 中外製薬株式会社 | ポリペプチド多量体を精製するためのポリペプチドの改変方法 |
| AR080428A1 (es) | 2010-01-20 | 2012-04-11 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Formulaciones liquidas estabilizadas contentivas de anticuerpos |
| CN108285488B (zh) | 2011-03-25 | 2023-01-24 | 伊克诺斯科学公司 | 异二聚体免疫球蛋白 |
| GB201112429D0 (en) * | 2011-07-19 | 2011-08-31 | Glaxo Group Ltd | Antigen-binding proteins with increased FcRn binding |
| AR088941A1 (es) | 2011-11-23 | 2014-07-16 | Bayer Ip Gmbh | Anticuerpos anti-fgfr2 y sus usos |
| DK2794905T3 (da) | 2011-12-20 | 2020-07-06 | Medimmune Llc | Modificerede polypeptider til bispecifikke antistofgrundstrukturer |
| AU2013229613B2 (en) | 2012-03-08 | 2015-07-30 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Abeta antibody formulation |
| UY35148A (es) | 2012-11-21 | 2014-05-30 | Amgen Inc | Immunoglobulinas heterodiméricas |
| EP2925785A4 (en) | 2012-11-28 | 2016-11-16 | Zymeworks Inc | MANIPULATED IMMUNOGLOBULIN HEAVY CHAIN LIGHT CHAIN COUPLES AND USES THEREOF |
| NZ631007A (en) * | 2014-03-07 | 2015-10-30 | Alexion Pharma Inc | Anti-c5 antibodies having improved pharmacokinetics |
| UA117289C2 (uk) | 2014-04-02 | 2018-07-10 | Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг | Мультиспецифічне антитіло |
| CN106413750B (zh) * | 2014-05-16 | 2022-04-29 | 免疫医疗有限责任公司 | 具有增强的治疗和诊断特性的带有改变的新生儿Fc受体结合的分子 |
| US11306156B2 (en) | 2014-05-28 | 2022-04-19 | Zymeworks Inc. | Modified antigen binding polypeptide constructs and uses thereof |
| TW201625299A (zh) | 2014-06-20 | 2016-07-16 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | 用於因第ｖｉｉｉ凝血因子及／或活化的第ｖｉｉｉ凝血因子的活性降低或欠缺而發病及／或進展的疾病之預防及／或治療之醫藥組成物 |
| AU2015283704A1 (en) | 2014-07-01 | 2016-12-15 | Pfizer Inc. | Bispecific heterodimeric diabodies and uses thereof |
| AU2016245887B2 (en) | 2015-04-10 | 2021-09-23 | Adimab, Llc. | Methods for purifying heterodimeric multispecific antibodies from parental homodimeric antibody species |
| BR112017016952A2 (pt) | 2015-04-17 | 2018-04-03 | F. Hoffmann-La Roche Ag | terapia de combinação com fatores de coagulação e anticorpos multiespecíficos |
| JP2018123055A (ja) | 2015-04-24 | 2018-08-09 | 公立大学法人奈良県立医科大学 | 血液凝固第ｖｉｉｉ因子（ｆｖｉｉｉ）の機能を代替する多重特異性抗原結合分子を含有する、血液凝固第ｘｉ因子（ｆｘｉ）異常症の予防および／または治療に用いられる医薬組成物 |
| WO2017110980A1 (ja) | 2015-12-25 | 2017-06-29 | 中外製薬株式会社 | 増強された活性を有する抗体及びその改変方法 |
| TWI797073B (zh) | 2016-01-25 | 2023-04-01 | 德商安美基研究（慕尼黑）公司 | 包含雙特異性抗體建構物之醫藥組合物 |
| PE20181889A1 (es) | 2016-04-28 | 2018-12-11 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Preparaciones que contienen anticuerpos |
| JP7301540B2 (ja) | 2016-05-26 | 2023-07-03 | チールー ピュージェット サウンド バイオセラピューティクス コーポレイション | 抗体の混合物 |
| NZ772558A (en) | 2016-07-19 | 2024-11-29 | Ibentrus Inc | Bispecific proteins and methods for preparing same |
| CN117986372A (zh) | 2016-07-29 | 2024-05-07 | 中外制药株式会社 | 显示增加的备选fviii辅因子功能活性的双特异性抗体 |
| KR102560808B1 (ko) | 2016-09-06 | 2023-07-27 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | 응고 제 ix 인자 및/또는 활성화 응고 제 ix 인자 및 응고 제 x 인자 및/또는 활성화 응고 제 x 인자를 인식하는 이중특이성 항체의 사용법 |
| CN110461358A (zh) | 2017-03-31 | 2019-11-15 | 公立大学法人奈良县立医科大学 | 可用于预防和/或治疗凝血因子ⅸ异常、包含代替凝血因子ⅷ的功能的多特异性抗原结合分子的药物组合物 |
| JP6496095B1 (ja) | 2017-09-29 | 2019-04-03 | 中外製薬株式会社 | 血液凝固第ｖｉｉｉ因子（ｆｖｉｉｉ）補因子機能代替活性を有する多重特異性抗原結合分子および当該分子を有効成分として含有する薬学的製剤 |
| TW201930352A (zh) | 2017-11-01 | 2019-08-01 | 日商中外製藥股份有限公司 | 生物活性降低之抗體變異體與同功型 |
| EP4130732A4 (en) | 2020-04-02 | 2024-06-19 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | METHOD FOR ANALYZING IMPURITIES MOLECULES IN A COMPOSITION CONTAINING MULTI-SPECIFIC ANTIGEN BINDING MOLECULES |
-
2016
- 2016-12-22 WO PCT/JP2016/088299 patent/WO2017110980A1/ja active Application Filing
- 2016-12-22 US US16/061,429 patent/US20200270363A1/en not_active Abandoned
- 2016-12-22 JP JP2017558248A patent/JP6954842B2/ja active Active
- 2016-12-22 EP EP16878867.7A patent/EP3395835B1/en active Active
-
2021
- 2021-07-09 JP JP2021114362A patent/JP2021176865A/ja active Pending
- 2021-12-28 US US17/563,149 patent/US12168697B2/en active Active
Patent Citations (25)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3773919A (en) | 1969-10-23 | 1973-11-20 | Du Pont | Polylactide-drug mixtures |
| EP0058481A1 (en) | 1981-02-16 | 1982-08-25 | Zeneca Limited | Continuous release pharmaceutical compositions |
| EP0133988A2 (de) | 1983-08-02 | 1985-03-13 | Hoechst Aktiengesellschaft | Regulatorische Peptide enthaltende pharmazeutische Präparate mit protrahierter Freisetzung und Verfahren zu deren Herstellung |
| EP0239400A2 (en) | 1986-03-27 | 1987-09-30 | Medical Research Council | Recombinant antibodies and methods for their production |
| WO1992003918A1 (en) | 1990-08-29 | 1992-03-19 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
| WO1993012227A1 (en) | 1991-12-17 | 1993-06-24 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
| WO1994002602A1 (en) | 1992-07-24 | 1994-02-03 | Cell Genesys, Inc. | Generation of xenogeneic antibodies |
| WO1994025585A1 (en) | 1993-04-26 | 1994-11-10 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
| WO1996002576A1 (fr) | 1994-07-13 | 1996-02-01 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Anticorps humain reconstitue contre l'interleukine-8 humaine |
| US5641870A (en) | 1995-04-20 | 1997-06-24 | Genentech, Inc. | Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification |
| WO1996033735A1 (en) | 1995-04-27 | 1996-10-31 | Abgenix, Inc. | Human antibodies derived from immunized xenomice |
| WO1996034096A1 (en) | 1995-04-28 | 1996-10-31 | Abgenix, Inc. | Human antibodies derived from immunized xenomice |
| WO1999051743A1 (fr) | 1998-04-03 | 1999-10-14 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Anticorps humanise contre le facteur tissulaire humain (tf) et procede de production d'anticorps humanises |
| WO2003002609A2 (en) | 2001-06-28 | 2003-01-09 | Domantis Limited | Dual-specific ligand and its use |
| WO2004058821A2 (en) | 2002-12-27 | 2004-07-15 | Domantis Limited | Dual specific single domain antibodies specific for a ligand and for the receptor of the ligand |
| WO2005035756A1 (ja) | 2003-10-10 | 2005-04-21 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | 機能蛋白質を代替する二種特異性抗体 |
| WO2005035754A1 (ja) | 2003-10-14 | 2005-04-21 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | 機能蛋白質を代替する二重特異性抗体 |
| JP2008510466A (ja) * | 2004-08-19 | 2008-04-10 | ジェネンテック・インコーポレーテッド | エフェクター機能が変更しているポリペプチド変異体 |
| WO2006106905A1 (ja) | 2005-03-31 | 2006-10-12 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | 会合制御によるポリペプチド製造方法 |
| WO2006109592A1 (ja) | 2005-04-08 | 2006-10-19 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | 血液凝固第viii因子の機能代替抗体 |
| WO2011117329A1 (en) | 2010-03-26 | 2011-09-29 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Bispecific, bivalent anti-vegf/anti-ang-2 antibodies |
| WO2012067176A1 (ja) | 2010-11-17 | 2012-05-24 | 中外製薬株式会社 | 血液凝固第viii因子の機能を代替する機能を有する多重特異性抗原結合分子 |
| WO2013065708A1 (ja) | 2011-10-31 | 2013-05-10 | 中外製薬株式会社 | 重鎖と軽鎖の会合が制御された抗原結合分子 |
| JP2015514684A (ja) * | 2012-02-22 | 2015-05-21 | ユセベ ファルマ ソシエテ アノニム | 配列非対称形に修飾されたＩｇＧ４二重特異性抗体 |
| WO2015046467A1 (ja) | 2013-09-27 | 2015-04-02 | 中外製薬株式会社 | ポリペプチド異種多量体の製造方法 |
Non-Patent Citations (34)
| Title |
|---|
| "Antibodies: A Laboratory Manual", 1988, COLD SPRING HARBOR LABORATORY |
| "Remington's Pharmaceutical Science", 1980 |
| "Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual", 1996, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS |
| BIOCHIM. BIOPHYS. ACTA, vol. 871, 1986, pages 268 - 278 |
| BLOOD, vol. 124, no. 20, 13 November 2014 (2014-11-13), pages 3165 - 71 |
| BLOOD, vol. 58, 1981, pages 1 - 13 |
| DAVIS JH ET AL., PROTEIN ENG DES SEL., vol. 4, 2010, pages 195 - 202 |
| DRUG DISCOV. TODAY, vol. 7, 20 July 2015 (2015-07-20), pages 838 - 47 |
| EXPERT OPIN DRUG DELIV., vol. 4, no. 4, July 2007 (2007-07-01), pages 427 - 40 |
| FISCHER N ET AL., PATHOBIOLOGY, vol. 74, no. 1, 2007, pages 3 - 14 |
| HOLLIGER P ET AL., NAT. BIOTECHNOL., vol. 23, no. 9, 2005, pages 1126 - 36 |
| J THROMB HAEMOST., vol. 12, no. 2, February 2014 (2014-02-01), pages 206 - 213 |
| LANGER ET AL., J. BIOMED. MATER. RES., vol. 15, 1981, pages 267 - 277 |
| LANGER, CHEMTECH., vol. 12, 1982, pages 98 - 105 |
| MABS, vol. 7, no. 1, 2015, pages 120 - 8 |
| MERCHANT AM ET AL., NATURE BIOTECHNOLOGY, vol. 16, 1998, pages 677 - 681 |
| MILLER K ET AL., J IMMUNOL., vol. 170, no. 9, 2003, pages 4854 - 61 |
| MILSTEIN C. ET AL., NATURE, vol. 305, 1983, pages 537 - 540 |
| MULLIGAN, NATURE, vol. 277, 1979, pages 108 |
| NAT BIOTECHNOL., vol. 16, no. 7, July 1998 (1998-07-01), pages 677 - 81 |
| NAT MED., vol. 18, no. 10, October 2012 (2012-10-01), pages 1570 - 4 |
| NATURE, vol. 312, 1984, pages 330 - 337 |
| NATURE, vol. 312, 1984, pages 337 - 342 |
| NUCLEIC ACIDS. RES., vol. 18, no. 17, 1990, pages 5322 |
| OLAFSEN T ET AL., PROTEIN ENG. DESIGN & SEL., vol. 17, no. 4, 2004, pages 315 - 323 |
| PLOS ONE, vol. 8, no. 2, 2013, pages e57479 |
| RIDGWAY JB ET AL., PROTEIN ENGINEERING, vol. 9, 1996, pages 617 - 621 |
| ROSEN S; ANDERSSON M; BLOMBACK M ET AL.: "Clinical applications of a chromogenic substrate method for determination of FVIII activity", THROMB HAEMOST, vol. 54, 1985, pages 811 - 23 |
| SAMPEI, ZENJIRO ET AL.: "Non-antigen-contacting region of an asymmetric bispecific antibody to factors IXa/X significantly affects factor VIII-mimetic activity", MABS, vol. 7, 18 December 2014 (2014-12-18), pages 120 - 128, XP009186086 * |
| SATO K ET AL., CANCER RESEARCH, vol. 53, 1993, pages 851 - 856 |
| SHEN ET AL., J IMMUNOL METHODS, vol. 318, 2007, pages 65 - 74 |
| SIDMAN ET AL., BIOPOLYMERS, vol. 22, 1983, pages 547 - 556 |
| WU ET AL., NAT BIOTECHNOL., vol. 25, no. 11, 2007, pages 1290 - 7 |
| ZAPATA G ET AL., PROTEIN ENG., vol. 8, no. 10, 1995, pages 1057 - 1062 |
Cited By (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10450381B2 (en) | 2010-11-17 | 2019-10-22 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Methods of treatment that include the administration of bispecific antibodies |
| US12168697B2 (en) | 2015-12-25 | 2024-12-17 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Bispecific antibodies which bind blood coagulation factor VIII and have enhanced activity, and methods of use thereof for treating bleeding and associated conditions |
| US11919969B2 (en) | 2017-06-22 | 2024-03-05 | Kymab Limited | Bispecific antibodies for factor IX and factor X |
| JP6496095B1 (ja) * | 2017-09-29 | 2019-04-03 | 中外製薬株式会社 | 血液凝固第ｖｉｉｉ因子（ｆｖｉｉｉ）補因子機能代替活性を有する多重特異性抗原結合分子および当該分子を有効成分として含有する薬学的製剤 |
| WO2019065795A1 (ja) | 2017-09-29 | 2019-04-04 | 中外製薬株式会社 | 血液凝固第ｖｉｉｉ因子（ｆｖｉｉｉ）補因子機能代替活性を有する多重特異性抗原結合分子および当該分子を有効成分として含有する薬学的製剤 |
| KR20190039020A (ko) | 2017-09-29 | 2019-04-10 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | 혈액 응고 제 viii 인자(fviii) 보인자 기능 대체 활성을 갖는 다중특이성 항원 결합 분자 및 당해 분자를 유효 성분으로서 함유하는 약학적 제제 |
| CN111108202A (zh) * | 2017-09-29 | 2020-05-05 | 中外制药株式会社 | 具有凝血因子viii(fviii)辅因子功能替代活性的多特异性抗原结合分子及含有所述分子作为活性成分的药物制剂 |
| KR20200049764A (ko) | 2017-09-29 | 2020-05-08 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | 혈액 응고 제 viii 인자(fviii) 보인자 기능 대체 활성을 갖는 다중특이성 항원 결합 분자 및 당해 분자를 유효 성분으로서 함유하는 약학적 제제 |
| US10759870B2 (en) | 2017-09-29 | 2020-09-01 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Multispecific antigen-binding molecules having blood coagulation factor VIII (FVIII) cofactor function-substituting activity and pharmaceutical formulations containing such a molecule as an active ingredient |
| CN111479829A (zh) * | 2017-11-01 | 2020-07-31 | 中外制药株式会社 | 具有降低的生物活性的抗体变体和同种型 |
| US10815308B2 (en) | 2018-12-21 | 2020-10-27 | Kymab Limited | FIXaxFX bispecific antibody with common light chain |
| US11976135B2 (en) | 2018-12-21 | 2024-05-07 | Kymab Limited | FIXaxFX bispecific antibody with common light chain |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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