TWI741980B

TWI741980B - 一種生物磚及其用途

Info

Publication number: TWI741980B
Application number: TW105110819A
Authority: TW
Inventors: 裕建康; 左瀟
Original assignee: 大陸商四川藍光英諾生物科技股份有限公司
Priority date: 2015-04-07
Filing date: 2016-04-06
Publication date: 2021-10-11
Also published as: CN106039407B; CN106039412B; CN106039408B; CN108159504A; CN108273140A; CN108126242A; CN106039411A; CN108273140B; US20170216498A1; CN106039406A; TW201636420A; CN106039415B; CN106039419B; CN106039414B; CN108159504B; CN106039415A; CN108096638A; CN106039407A; CN106039411B; CN106039410A

Abstract

本發明涉及生物學，再生醫學，生物列印(例如3D生物列印)，組織工程學等技術領域。特別地，本發明涉及一種可用於生物列印(例如3D生物列印)和組織工程的生物磚，包含所述生物磚的組合物(例如生物墨汁)，所述生物磚的製備方法以及其用途，以及包含所述生物磚或者使用所述生物磚/生物墨汁構建的構建體(例如三維構建體)。

Description

一種生物磚及其用途

在人體組織中，細胞按照一定的規則和順序進行排列與分佈。不同功能的組織，其細胞排布不同。例如，構成上皮組織的上皮細胞呈單層緊密排列以保證其保護功能；肌細胞成條索狀排列以保證其收縮功能；神經細胞間平行排列或交織成網以增強其資訊傳遞功能等。細胞排布的異常，表現為細胞形態、細胞間連接、細胞群整體功能的異常。各種組織器官的病理變化過程中均存在細胞排布異常，引起細胞功能異常並導致組織器官整體結構和功能的破壞。例如，肝臟腫瘤組織中肝細胞條索排布紊亂，無正常肝小葉結構；小腸上皮細胞排布紊亂引起細胞屏障作用受到破壞，腸道內毒素吸收增加並形成內毒素血症；血管平滑肌細胞排布紊亂，引起血管順應性降低、彈性減弱、抗壓力能力減弱等。因此，實現對細胞的精確排布是人工構建組織器官的關鍵。

3D生物列印技術是近幾年來興起的一項技術，其已被嘗試用於構建複雜的組織和器官。目前已報導了數種3D生物列印技術，其中最受關注的是，CYFUSE BIOMEDICAL KK公司提出的3D生物列印技術(下文簡稱為Cyfuse技術，參見例如美國專利申請US 14/126,681，以及Organovo公司提出的3D生物列印技術(下文簡稱為Organovo技術，參見例如中國專利申請CN103946374A)。

Cyfuse技術主要涉及以下步驟：構建細胞球，形成微型組織塊；通過「劍山」將不同的微型組織塊以特定的空間排布形式堆疊在一起，並進一步通過細胞自發融合的特性，將堆疊的微型組織塊連接在一起形成所需結構的組織。

Organovo技術的基本原理如下：首先製備生物列印所需的生物墨汁(即，細胞)和生物紙(通常是凝膠)；然後，根據準備列印的組織或器官的3D模型，通過下述步驟使用生物墨汁和生物紙進行3D列印：(1)列印一層生物墨，即，將一層細胞置於另一層細胞或凝膠之上；(2)列印一張生物紙，即，將一層凝膠置於細胞上；(3)不斷重複步驟(1)和(2)，直至列印完成新組織或器官。

然而，這些已知的生物列印技術也存在著顯著的缺陷。特別地，目前已經知曉的生物列印方法均無法實現對細胞的精確分佈，從而也不能製造出具有精細結構的微組織團塊。與此同時，在目前已經知曉的生物列印方法中，所使用的細胞均缺乏力學保護。因此，當將細胞用於3D生物列印時，細胞易於因外界壓力或剪切力的傷害而受損或死亡。這大大限制了生物列印技術的應用。此外，一些已知的生物列印技術在構建微型組織塊時，需要使用大量細胞，這進一步嚴重限制了生物列印技術的應用。

因此，目前已知的3D生物列印技術均無法實現以細胞數量可控、細胞精確排布的方式構建具有三維結構的複雜組織或器官，並且所製備三維構建體的細胞存活率較低，且尺寸受到了嚴重的限制。

為了解決上述技術問題，本申請發明人開發了一種可用於列印組織或器官的基礎單元，生物磚。本發明的生物磚所包裹的細胞類型和細胞數目是可控的，並且生物磚本身的結構和尺寸也是可控的，從而其可用於製備標準化、可控化的生物墨汁，並且由此所製備的生物墨汁可在生物列印過程中實現細胞的精確排布，實現組織或器官的精確生物列印。此外，本發明的生物磚(例如其殼層的硬度和彈性模量)還給細胞提供了有效的力學保護，從而確保了細胞在列印過程中存活率(達到90%以上)，避免了因細胞受損或死亡而導致的應用限制。本發明的生物磚可用作生物列印的基礎單元，並且還可用作研究工具。

因此，在一個方面，本發明提供了一種生物磚，其包括：細胞，包裹細胞的核層，和，封裝核層的殼層，其中所述核層和殼層各自獨立地由生物可降解材料製成。在本發明的某些優選實施方案中，所述核層和殼層中的生物可降解材料能夠減少或避免生物磚內的細胞在操作(例如生物列印)過程中遭受機械損傷，並且能夠提供物質(例如營養物質，細胞外基質，細胞因子，藥物活性成分等)的可控釋放，以促進細胞活性和功能(增殖、分化、遷移、分泌或新陳代謝)。

在另一個方面，本發明提供了一種組合物(例如生物墨汁)，其包含本發明的生物磚，並且任選地，還包含載體(所述載體優選包含生物黏合劑)。

在另一個方面，本發明提供了用於製備本發明的生物磚的方法，其包括下述步驟：

(1)提供一種或多種核層材料，所述核層材料各自獨立地由生物可降解材料製成，並且各自獨立地包裹相同或不同的細胞或細胞組合；

(2)提供一種或多種殼層材料，所述殼層材料各自獨立地由生物可降解材料製成；

(3)從步驟(1)所述的一種或多種核層材料中選擇一種核層材料，並將其顆粒化，從而獲得第一核層；

(4)任選地，使用來自步驟(1)的一種核層材料或使用來自步驟(2)的一種殼層材料對前一步驟獲得的產物進行包覆；

(5)任選地，重複步驟(4)一次或數次；

(6)使用來自步驟(2)的一種殼層材料對前一步驟的產物進行包覆，從而產生所述生物磚。

(1)將細胞與用於形成核層的生物可降解材料混合，以提供包裹細胞的核層材料；和

(2)將核層材料顆粒化，並使用用於形成殼層的生物可降解材料進行包覆，從而製備所述生物磚。

在另一個方面，本發明提供了用於製備本發明的組合物(其例如為生物墨汁)的方法，其包括下述步驟：將本發明的生物磚與載體(所述載體優選包含生物黏合劑)混合。

在另一個方面，本發明提供了一種構建體(例如三維構建體，組織前體，組織或器官)，其包含本發明的生物磚，或者使用本發明的生物磚或組合物(例如生物墨汁)製備。

在另一個方面，本發明提供了一種製備構建體，例如三維構建體，組織前體，組織或器官的方法，其包括，使用本發明的生物磚或組合物(例如生物墨汁)的步驟。

在另一個方面，還提供了本發明的生物磚的用途。例如，本發明的生物磚可用於培養細胞(例如用於細胞的三維培養)；或用於使細胞生長、增殖、分化、分泌或遷移；或用於生物列印(例如3D生物列印)；或用於形成構建體(例如三維構建體)，例如組織前體、組織或器官。本發明的生物磚或構建體還可用於各種應用，例如用於研究領域或醫藥領域的應用。例如，本發明的生物磚或構建體可用於研究幹細胞分化，用於藥物發現，用於藥物篩選，用於體內或體外測定，用於植入宿主體內，用於組織工程或用於組織再生。

在另一個方面，本發明提供了一種試劑盒，其包含本發明的生物磚，組合物(例如生物墨汁)，和/或構建體(例如三維構建體，組織前體，組織或器官)。

在另一個方面，本發明提供了一種藥物組合物，其包含一種或多種本發明的生物磚。在某些優選的實施方案中，所述藥物組合物用於組織再生。

下面將結合附圖和發明詳述來對本發明的實施方案進行詳細闡釋。但是，本領域技術人員將理解，下列圖式簡單說明和實施方式僅用於說明本發明，而不是對本發明的範圍的限定。根據圖式簡單說明和實施方式的詳細公開內容，本發明的各種目的和有利方面對於本領域技術人員來說將變得顯然。

術語定義

在本發明中，除非另有說明，否則本文中使用的科學和技術名詞具有本領域技術人員所通常理解的含義。然而，為了更好地理解本發明，下面提供本說明書中的相關術語的定義和解釋。當本說明書中給出的定義與本領域技術人員所通常理解的含義相衝突時，以本說明書中的定義為准。

如本說明書和所附申請專利範圍中使用的，單數形式「一個」、「一種」和「該/所述」包括複數的指示物，除非上下文另有明確規定。此外，本文中任何提及的「或」意在包括「和/或」，除非另有說明。

如本文中所使用的，術語「生物磚」用於指本發明人構建的一種基本單元，其可用於多個領域，例如生物列印(如3D生物列印)、組織工程、再生醫學等領域。特別地，本發明的生物磚具有特定的結構和組成，即，其包括：細胞，包裹所述細胞的核層，和，封裝所述細胞和核層的殼層，其中所述核層和殼層各自由生物可降解材料製成。本發明的生物磚的示意性結構可參見圖1A-1E。在本發明中，生物磚不局限於特定的形狀或大小，例如，其可以是球形的，或者任何期望的形狀。

如本文中使用的，術語「生物列印」是指：利用生物材料(包括但不限於，生物分子例如蛋白質，脂質，核酸和代謝產物；細胞例如細胞溶液、含細胞的凝膠、細胞懸浮液、細胞濃縮物、多細胞聚集體和多細胞體；亞細胞結構例如細胞器和細胞膜；與生物分子相關的分子例如合成的生物分子或生物分子的類似物)的列印。如本文中使用的，術語「列印」是指，按照預定的模式沉積材料的過程。在本發明中，生物列印優選地通過與自動的或半自動的、電腦輔助的三維原型裝置(例如生物印表機)相匹配的方法來實現。然而，在本發明中，「列印」(例如生物列印)可通過各種方法來進行，包括但不限於，使用印表機(例如3D印表機或生物印表機)進行列印；使用自動化或非自動化機械過程(而非印表機)進行列印；通過手工放置或手工沉積(例如使用移液器)進行列印。

如本文中使用的，術語「組織」是指由形態相同或類似、機能相同的細胞群構成的細胞集合體，並且通常還包含非細胞形態的物質(稱為細胞間質，例如基質、纖維等)。組織可包括一種或多種細胞。如本文中使用的，術語「器官」是指由不同的細胞和組織構成的、用於實現某一或某些特定功能的結構。器官可包括一種或多種組織。「人工組織」是指，不是通過天然組織生成或發育過程在生物體內形成的組織。人工組織可以是人為製造的組織，例如通過生物列印方法獲得的組織。在本發明中，術語「人工組織」和「組織構建體」可互換使用。如本文中使用的，術語「組織前體」是指細胞集合體，其在培養、誘導或操作步驟後，能夠形成組織。在本發明中，組織前體可以是人為製造的組織前體(即，人工組織前體)。

特別地，在本發明中，組織的實例包括但不限於：結締組織(例如，疏鬆結締組織、緻密結締組織、彈性組織、網狀結締組織和脂肪組織)、肌肉組織(例如，骨骼肌、平滑肌和心肌)、泌尿生殖組織、胃腸組織、肺組織、骨組織、神經組織和上皮組織(例如，單層上皮和複層上皮)、內胚層來源的組織、中胚層來源的組織和外胚層來源的組織。

如本文中使用的，術語「構建體」是指，使用本發明的生物磚構建的物體，其可以具有二維或三維的結構，並且可以是組織前體，組織或器官。

如本文中使用的，術語「組織工程」具有本領域技術人員通常理解的含義。特別地，組織工程是跨學科的領域，其應用並結合了工程學和生命科學的原理，並且通常是指，使用生物替代品(例如本發明的生物磚)來恢復、保持或改善組織功能。經典組織工程學的基本原理是：從機體獲取少量的活體組織，用特殊的酶或其他方法將細胞(又稱種子細胞)從組織中分離出來在體外進行培養擴增，然後將擴增的細胞與具有良好生物相容性、可降解性和可吸收的生物材料(支架)按一定的比例混合，使細胞黏附在生物材料(支架)上形成細胞-材料複合物；將該複合物植入機體的組織或器官病損部位，隨著生物材料在體內逐漸被降解和吸收，植入的細胞在體內不斷增殖並分泌細胞外基質，最終形成相應的組織或器官，從而達到修復創傷和重建功能的目的。本發明的生物磚具有下述顯著的優點：生物磚所包裹的細胞類型和細胞數目是可控的；並且生物磚本身的尺寸也是可控的；並且，生物磚的核層和殼層各自由生物可降解材料製成；從而特別適合用於組織工程。

如本文中使用的，「生物相容性材料」是指這樣的材料，其(以及其降解產物)對於細胞是無毒性的，並且在植入宿主(例如人體)後與宿主相容，不會造成顯著的或者嚴重的副作用，例如，不會對宿主(例如人體組織)造成毒害作用，不會引起宿主的免疫排斥反應、過敏反應或炎症反應等等。

如本文中使用的，「生物可降解材料」是指這樣的材料，其能夠被細胞或生物體降解和吸收，並且其降解產物是生物相容性的。此類材料可以是天然來源的(例如來源於動植物)，也可以是人工合成的。

如本文中使用的，「海藻酸」是指一類由褐藻提取的多糖,其為β-1,4-D-甘露糖醛酸(M單元)和α-1,4-L-古洛糖醛酸(G單元)的無規嵌段共聚物。通常，海藻酸中的M和G單元以M-M，G-G或M-G的組合方式通過1,4糖苷鍵相連成為嵌段共聚物。海藻酸的實驗式為(C₆ H₈ O₆ )_n ，其分子量通常為4 kDa-1500 kDa。如本文中使用的，「海藻酸鹽」是指由海藻酸形成的鹽，包括但不限於，海藻酸鈉，海藻酸鈣，海藻酸鍶，海藻酸鋇等。

如本文中使用的，「氧化的海藻酸鹽」是指，對海藻酸鹽(例如海藻酸鈉)進行氧化反應後形成的產物。通常情況下，氧化反應將使得海藻酸鹽(例如海藻酸鈉)中的部分糖醛酸單元的羥基被氧化為醛基。

如本文中使用的，「G/M值」是指海藻酸、海藻酸鹽或氧化的海藻酸鹽中，α-1,4-L-古洛糖醛酸(G單元)和β-1,4-D-甘露糖醛酸(M單元)的摩爾比。

如本文中使用的，「氧化度」是指被氧化的糖醛酸單元占海藻酸或海藻酸鹽的總糖醛酸單元的摩爾分數。

如本文中使用的，「黏度」是指流體黏滯性的一種量度，是流體流動力對其內部摩擦現象的一種表示。將兩塊面積為1 m² 的板浸於液體中,兩板距離為1米,若在某一塊板上加1N的切應力,使兩板之間的相對速率為1 m/s,則此液體的黏度為1 Pa·s。

如本文中使用的，「經過改性的可降解聚合物」是指，通過化學和/或物理方法，改變原始聚合物具有的化學性質和/或物理性質而得到的可降解聚合物。例如，可通過化學反應改變原始聚合物的主鏈或側鏈上的原子或原子團的種類和/或結合方式，從而獲得經過改性的可降解聚合物。例如，對海藻酸鈉進行氧化反應，以得到改性的海藻酸鈉(即，氧化海藻酸鈉)。

如本文中所使用的，術語「力學保護」是指，生物磚或其殼層具有一定的硬度和彈性模量，從而能夠減少或避免其內封裝的細胞遭受外界的機械損傷/力學損傷(例如，3D生物列印過程中可能產生的剪切力，擠壓力等引起的損傷)。

如本文中使用的，「生物墨汁」是指，包含一種或多種本發明的生物磚的液體，半固體(例如凝膠)或固體組合物。例如，本發明的生物墨汁可以是包含生物磚的溶液，懸浮液，凝膠，或濃縮物。在優選的實施方案中，本發明的生物墨汁包含生物磚以及生物黏合劑。在本發明中，生物墨汁能夠被用於生物列印，以產生特定的平面和/或層狀幾何形狀；並且優選地，所產生的平面和/或層狀幾何形狀能夠進一步堆疊，從而形成具有特定形狀和結構的三維構建體。此外，在生物列印之前，期間和/或之後，生物墨汁中的生物磚內的細胞能夠進行各種期望的生命活動。在優選的實施方案中，生物磚內的細胞在生物列印之前處於休眠狀態，而在生物列印之後進行生長和增殖，從而形成穩固的三維構建體。在優選的實施方案中，生物墨汁是可擠出的組合物。如本文中所使用的，「可擠出的」是指，組合物能夠通過被迫(例如在壓力下)穿過噴嘴或孔口而成形。

如本文中使用的，「生物黏合劑」是指，起黏合作用的、與細胞和生物體相容的、生物可降解的材料。其具體實例可包括，但不限於膠原、纖維蛋白、殼聚糖、海藻酸鹽、澱粉、透明質酸、層黏連蛋白、彈性蛋白、明膠、聚氨基酸(例如聚賴氨酸)、瓊脂糖、葡聚糖、甲基纖維素、聚乙烯醇、聚丙烯酸及其衍生物(例如聚甲基丙烯酸，丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物)，或其任何組合。

如本文中使用的，「凝聚」指將細胞、細胞聚集體、多細胞聚集體、多細胞體和/或它們的層結合起來的細胞-細胞黏附。該術語可以與「融合」互換使用。

如本文中使用的，「層狀」是指多層的、生物列印的組織，其中兩個或多個平面層組合起來以增加該組織在z平面(即，垂直平面)的總厚度。在一些實施方案中，每個平面層在結構和/或組成上可以是基本類似的。在其它實施方案中，每個平面層在結構和/或組成上可以是基本上獨特的，即彼此不同。此外，在每個平面層的x-y平面(即：水準平面)內，多個生物磚(或者其中的細胞)和/或空隙空間相對於彼此空間佈置成設定的圖案。

如本文中使用的，「一層或多層」是指，由至少一個平面層/組織層組成，其中每個平面層/組織層是一個或多個細胞層的厚度。由於本發明的生物磚可以包含一個細胞，也可以包含多個細胞(例如100個或1000個)。因此，在一些實施方案中，平面層/組織層為一個細胞層的厚度。在其它實施方案中，平面層/組織層為多個細胞層的厚度。此外，在3D生物列印過程中，可以一次沉積一個層，也可以同時沉積多個層。任選地，每個平面層/組織層包含多種細胞類型。此外，在每個平面層/組織層中的多種細胞類型任選地在x-y平面(即：水準平面)上以空間限定的結構相對於彼此排列。此外，在某些情況下，在z-平面(即：垂直平面)上的組織層增加導致細胞在組織層內相對於彼此的受控空間定位，使得空間限定的結構在z-平面上繼續。

如本文中使用的，「試劑」是指化學試劑，生化試劑或藥物，包括但不限於，小分子化合物，激素，肽(例如寡肽或蛋白質)，核酸(寡核苷酸，DNA，RNA或化學修飾的核酸)等，其對細胞活性，功能和/或行為具有作用或影響。試劑可以是天然來源的，重組產生的，或化學合成的。「刺激」是指，化學因素(例如試劑，酸，堿，氧濃度等)或物理因素(例如溫度，輻照，機械力等)，其對細胞活性，功能和/或行為具有作用或影響。

如本文中使用的，「受試者」是指動物，例如脊椎動物。優選地，受試者為哺乳動物，例如人，牛科動物，馬科動物，貓科動物，犬科動物，齧齒類動物或靈長類動物。特別優選地，受試者為人。在本文中，該術語可以與「患者」、「受體」和「供體」互換使用。

如本文中使用的，「不同的細胞」是指不同來源和/或類型的細胞。例如，細菌細胞和動物細胞屬於不同的細胞；來源於鼠的細胞與來源於人的細胞屬於不同的細胞；鼠軟骨細胞與人軟骨細胞屬於不同的細胞；人軟骨細胞與人上皮細胞屬於不同的細胞。

因此，在一個方面，本發明提供了一種生物磚，其包括：細胞，包裹細胞的核層，和，封裝核層的殼層，其中所述核層和殼層各自獨立地由生物可降解材料製成。在本發明的某些優選實施方案中，所述核層和殼層中的生物可降解材料能夠減少或避免生物磚內的細胞在操作(例如生物列印)過程中遭受機械損傷，並且能夠提供物質(例如營養物質，細胞外基質，細胞因子或藥物活性成分等)的可控釋放，以促進細胞活性和功能(增殖、分化、遷移、分泌或新陳代謝)。在某些優選實施方案中，所述生物磚是生物列印的基本單元。在某些優選實施方案中，所述生物磚用於生物列印。

生物磚的核層提供了適合細胞黏附和伸展的空間結構和微環境，從而細胞在該結構內能夠正常進行增殖、分化、遷移、分泌或新陳代謝。所述微環境指細胞所生長的環境，其包含的要素包括物理因素，比如空間結構、力學強度、溫度、濕度、滲透壓等；化學因素，比如酸鹼度、離子濃度等；生物因素，包括細胞、細胞因子等。這些要素共同構成細胞生命活動的環境，並對在這個環境中生長的細胞的增殖、分化、遷移、分泌和新陳代謝進行動態調控。在某些實施方案中，所述核層能夠為細胞的生命活動提供微環境，例如空間結構、營養物質等。優選地，所述核層各自獨立地由生物可降解材料製成，並且所述生物可降解材料是生物相容性的。

在本發明中，使用生物可降解材料來製備生物磚的核層是特別優選的。特別地，對於生物磚的某些用途(例如，生物列印，製備構建體，組織工程等)而言，無法降解的材料的使用是不利的。這是因為，一方面，這些無法降解的材料將被保留在所獲得的構建體或人工組織中，從而限制構建體或人工組織的應用；另一方面，這些無法降解的材料將阻礙不同生物磚的細胞之間建立細胞連接，不利於構建有機的整體(例如，人工組織)。因此，生物可降解材料在核層中的使用對於利用生物磚來製備構建體、人工組織、器官是特別有利的和優選的。

在本發明的實施方案中，用於製備核層的生物可降解材料可以是天然存在的(例如來源於動植物的天然存在的生物可降解材料，例如膠原蛋白，纖維蛋白，殼聚糖，海藻酸鹽，澱粉，透明質酸，層黏連蛋白，瓊脂糖，明膠，葡聚糖，以及其任意組合)，人工合成的，重組產生的，經過改性的，或者其任何組合。

在某些優選的實施方案中，用於製備核層的所述生物可降解材料是天然存在的可降解聚合物。優選地，所述可降解聚合物選自膠原蛋白，纖維蛋白，殼聚糖，海藻酸鹽(例如海藻酸鈉)，澱粉，透明質酸，層黏連蛋白，瓊脂糖，明膠，葡聚糖，以及其任意組合。

在某些優選的實施方案中，用於製備核層的所述生物可降解材料是經過改性的可降解聚合物，例如經過改性的海藻酸鹽，例如氧化海藻酸鹽(例如氧化海藻酸鈉)。

在某些優選的實施方案中，用於製備核層的所述生物可降解材料是合成的可降解聚合物。此類可降解聚合物包括但不限於，聚磷腈，聚丙烯酸及其衍生物(例如聚甲基丙烯酸，丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物)，聚乳酸(PLA)，聚羥基乙酸(PGA)，聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)，聚原酸酯(POE)，聚己內酯(PCL)，聚羥基丁酸酯(PHB)，聚氨基酸(例如聚賴氨酸)，可降解性聚氨酯，以及其任何組合。

在某些優選的實施方案中，用於製備核層的所述生物可降解材料包含天然存在的可降解聚合物和合成的可降解聚合物。

在某些優選的實施方案中，用於製備核層的所述生物可降解材料能夠被酶(例如細胞分泌的酶)所降解。不同的生物可降解材料的降解速率差異很大，其範圍可以為一個月到數年。然而在本發明中，特別優選地，用於製備核層的生物可降解材料在不超過2個月的時間內降解，例如在不超過1個月的時間內降解，例如在不超過30天、不超過25天、不超過20天、不超過15天、不超過10天、不超過5天、不超過4天、不超過3天、不超過2天、或不超過1天的時間內降解。例如，用於製備核層的生物可降解材料可以在1-2天，2-3天，3-4天，4-5天，5-10天，10-15天，15-20天，20-25天，25-30天，或30-60天的時間內降解。降解速率與生物可降解材料的分子組成、分子量大小和分子排列(例如，直鏈或支鏈)密切相關。一般情況下，分子量越高、分子排列越緊密，降解時間越長。因此，核層的降解速率可通過對核層的組分和/或含量的配置來控制。例如，為了獲得更快的降解速率，可使用低含量(例如低於0.5%、1%、2%、3%、4%、或5%)的生物可降解材料、低分子量(例如低於500 Da、1 kDa、2 kDa、3 kDa、5 kDa、或10 kDa)的生物可降解材料，和/或具有疏鬆分子排布的生物可降解材料。為了獲得更慢的降解速率，可使用高含量(例如高於0.5%、1%、2%、3%、4%、或5%)的生物可降解材料、高分子量(例如高於500 Da、1 kDa、2 kDa、3 kDa、5 kDa、或10 kDa)的生物可降解材料，和/或具有緊密分子排布的生物可降解材料。另外，還可通過改變生物磚的結構(如：多層包裹、表面多孔、孔隙率大小、比表面積等)來調節生物可降解材料的降解速率。此外，生物可降解材料的降解速率還可以通過改變合成該材料的聚合方式和共聚物比例來進行調節；或者，可通過對該材料的交聯來進行調節。

各種生物可降解材料是本領域技術人員已知的，並且其降解性能已被進行了廣泛研究。參見例如，Alexander D. Augst, Hyun Joon Kong, David J. Mooney, Alginate Hydrogels as Biomaterials, Macromol. Biosci. 2006, 6, 623-633，其通過引用併入本文。

在某些優選的實施方案中，所述核層的降解能夠提供維持或促進所述細胞的生命活動的微環境，例如營養物質。在某些優選的實施方案中，核層的降解產物為小分子化合物，例如有機酸、單糖(例如葡萄糖)、寡糖、氨基酸、脂質等。此類降解產物可參與到細胞的新陳代謝活動中，用於合成細胞外基質或轉化為活動所需的能量。

在某些優選的實施方案中，用於製備核層的生物可降解材料及其降解產物對於細胞是無毒的，和/或對於宿主是非免疫原性的。

在某些優選的實施方案中，用於製備核層的生物可降解材料選自膠原蛋白(例如I型，II型，III型膠原蛋白)、纖維蛋白、殼聚糖、海藻酸鹽(例如海藻酸鈉)、氧化海藻酸鹽(例如氧化海藻酸鈉)、澱粉、透明質酸，層黏連蛋白，彈性蛋白，明膠、葡聚糖、聚氨基酸(例如聚賴氨酸)、瓊脂糖、可降解性聚氨酯，或其任何組合。

在某些優選的實施方案中，用於製備核層的生物可降解材料含有細胞外基質或其類似物(例如膠原蛋白)。細胞外基質或其類似物(例如膠原蛋白)的使用能夠為生物磚內的細胞的生命活動(特別是細胞的生長、黏附、伸展，以及細胞間連接的建立)提供類似於體內的有利的微環境，從而是優選的。例如，I型膠原的空間結構與細胞外基質的空間結構類似，能夠為細胞生存和增殖提供類似於細胞外基質骨架結構的微環境，為細胞生物學功能的實現提供支援。因此，在某些優選的實施方案中，用於製備核層的生物可降解材料為I型膠原或者含有I型膠原。

在某些優選的實施方案中，所述核層包含I型膠原蛋白和/或海藻酸鹽，例如包含I型膠原蛋白和海藻酸鈉。在某些優選的實施方案中，I型膠原蛋白和海藻酸鈉在核層中的重量比為約1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、3:25、1:9、1:10、1:20、1:30、或1:50。在某些優選的實施方案中，I型膠原蛋白和海藻酸鈉在核層中的重量比為1:1-1:2、1:2-1:4、1:4-1:6、1:6-1:8、1:8-1:9、1:9-1:10、1:10-1:20、1:20-1:30、1:30-1:50、1:1-1:5、1:5-1:10、1:7-1:10、或1:8-1:9。在某些優選的實施方案中，I型膠原蛋白在核層中的重量百分比為約0.01%、0.05%、0.1%、0.125%、0.15%、0.175%、0.2%、0.25%、0.3%、0.4%、0.5%、1%、2%、3%、4%、或5%。在某些優選的實施方案中，I型膠原蛋白在核層中的重量百分比為0.01%-0.05%、0.05%-0.1%、0.1%-0.125%、0.125%-0.15%、0.15%-0.175%、0.175%-0.2%、0.2%-0.25%、0.25%-0.3%、0.3%-0.4%、0.4%-0.5%、0.5%-1%、1%-2%、2%-3%、3%-4%、4%-5%、0.01%-0.1%、0.1%-0.2%、0.125%-0.175%、0.2%-0.5%、0.1%-0.5%、0.1%-1%、或0.05%-5%。在某些優選的實施方案中，海藻酸鈉在核層中的重量百分比為約0.1%、0.5%、1%、1.25%、1.5%、2%、3%、4%、5%、7.5%、或10%。在某些優選的實施方案中，海藻酸鈉在核層中的重量百分比為0.1%-0.5%、0.5%-1%、1%-1.25%、1.25%-1.5%、1.5%-2%、2%-3%、3%-4%、4%-5%、5%-7.5%、7.5%-10%、0.1%-1%、1%-1.5%、1%-2%、0.5-2.5%、1%-3%、5-10%、或0.5-5%。

在某些優選的實施方案中，所述核層包含海藻酸鈉。在某些優選的實施方案中，所述核層包含I型膠原蛋白。在某些優選的實施方案中，所述核層包含澱粉。在某些優選的實施方案中，所述核層包含可降解性聚氨酯。在某些優選的實施方案中，所述核層包含層黏連蛋白。

在某些優選的實施方案中，所述核層包含海藻酸鹽(例如海藻酸鈉或海藻酸鈣)和氧化海藻酸鹽(例如氧化海藻酸鈉)。在某些優選的實施方案中，海藻酸鹽(例如海藻酸鈉或海藻酸鈣)和氧化海藻酸鹽(例如氧化海藻酸鈉)在核層中的重量比為約10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、或1:10。在某些優選的實施方案中，海藻酸鹽(例如海藻酸鈉或海藻酸鈣)和氧化海藻酸鹽(例如氧化海藻酸鈉)在核層中的重量比為10:1-9:1、9:1-8:1、8:1-7:1、7:1-6:1、6:1-5:1、5:1-4:1、4:1-3:1、3:1-2:1、2:1-1:1、1:1-1:2、1:2-1:3、1:3-1:4、1:4-1:5、1:5-1:6、1:6-1:7、1:7-1:8、1:8-1:9、1:9-1:10、10:1-5:1、5:1-1:1、1:1-1:5、1:5-1:10、2:1-1:2、4:1-1:4、或10:1-1:10。

在某些優選的實施方案中，所述核層為凝膠狀。

生物磚的殼層為包裹的細胞提供了力學保護。在某些優選的實施方案中，所述生物磚或生物磚的殼層具有一定的力學強度，從而能夠實現立體堆積。在本發明中，特別優選地，生物磚及其殼層具有適當的力學保護性能(例如，具有合適的硬度和/或彈性模量)。一方面，生物磚內的細胞在操作過程中(例如，在3D列印過程中)易於因外界壓力或剪切力的傷害而受損或死亡。因此，如果生物磚及其殼層的硬度和/或彈性模量太低，那麼將導致生物磚內的細胞存活率在人工作業後顯著下降，進而導致生物磚的應用受到限制，或者需要使用大量的細胞。另一方面，如果生物磚及其殼層的硬度和/或彈性模量太高，那麼將導致生物磚內的細胞的伸展、遷移受到限制，並且阻礙不同生物磚的細胞之間建立細胞連接，不利於構建有機的整體(例如，人工組織)。因此，適當的力學保護性能不僅使得能夠對本發明的生物磚進行各種操作(例如進行3D生物列印，進行生物磚的精確排布等)，而且有利於生物磚內的細胞伸展、遷移、建立細胞連接，並形成有機的構建體(例如人工組織)，因此，是特別優選的。

在某些優選的實施方案中，所述生物磚或生物磚的殼層各自獨立地具有約0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.15、0.2、0.3、或0.4 GPa的硬度。在某些優選的實施方案中，所述生物磚或生物磚的殼層各自獨立地具有0.01-0.02、0.02-0.03、0.03-0.04、0.04-0.05、0.05-0.06、0.06-0.07、0.07-0.08、0.08-0.09、0.09-0.1、0.1-0.15、0.15-0.2、0.2-0.3、0.3-0.4、0.01-0.4、0.01-0.05、0.05-0.1、0.1-0.2、0.2-0.4、0.05-0.15、或0.06-0.1 GPa的硬度。在某些優選的實施方案中，所述生物磚或生物磚的殼層具有約0.083 GPa的硬度。在某些優選的實施方案中，所述生物磚或生物磚的殼層各自獨立地具有約0.01、0.05、0.1、0.5、0.8、1、1.2、1.4、1.6、1.8、2、2.4、2.8、3.2、4、10、20、30、40、50、80、或100 MPa的彈性模量。在某些優選的實施方案中，所述生物磚或生物磚的殼層各自獨立地具有0.01-0.05、0.05-0.1、0.1-0.5、0.5-0.8、0.8-1、1-1.2、1.2-1.4、1.4-1.6、1.6-1.8、1.8-2、2-2.4、2.4-2.8、2.8-3.2、3.2-4、4-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-80、80-100、0.5-4、0.5-1、1-1.5、1.5-2、2-3、0.8-1.6、1.4-2.4、0.8-3.2、0.01-100、1-100、10-100、或0.5-50MPa的彈性模量。在某些優選的實施方案中，所述生物磚或生物磚的殼層具有約1.683 MPa的彈性模量。殼層的力學保護作用(例如，硬度和彈性模量)可通過對殼層的組分和/或含量的配置來控制。

在某些優選的實施方案中，所述殼層也能夠為細胞的生命活動提供微環境，例如營養物質。優選地，所述殼層各自獨立地由生物可降解材料製成，並且所述生物可降解材料是生物相容性的。

在本發明中，使用生物可降解材料來製備生物磚的殼層是特別優選的。特別地，對於生物磚的某些用途(例如，生物列印，製備構建體，組織工程等)而言，無法降解的材料的使用是不利的。這是因為，一方面，這些無法降解的材料將被保留在所獲得的構建體或人工組織中，從而限制構建體或人工組織的應用；另一方面，這些無法降解的材料將阻礙不同生物磚的細胞之間建立細胞連接，不利於構建有機的整體(例如，人工組織)。因此，生物可降解材料在殼層中的使用對於利用生物磚來製備構建體、人工組織、器官是特別有利的和優選的。

在本發明的實施方案中，用於製備殼層的生物可降解材料可以是天然存在的(例如來源於動植物的天然存在的生物可降解材料，例如膠原蛋白，纖維蛋白，殼聚糖，海藻酸鹽，澱粉，透明質酸，層黏連蛋白，瓊脂糖，明膠，葡聚糖，以及其任意組合)，人工合成的，重組產生的，經過改性的，或者其任何組合。

在某些優選的實施方案中，用於製備殼層的所述生物可降解材料是天然存在的可降解聚合物。優選地，所述可降解聚合物選自膠原蛋白，纖維蛋白，殼聚糖，海藻酸鹽(例如海藻酸鈉或海藻酸鈣)，澱粉，透明質酸，層黏連蛋白，瓊脂糖，明膠，葡聚糖，以及其任意組合。

在某些優選的實施方案中，用於製備殼層的所述生物可降解材料是經過改性的可降解聚合物，例如經過改性的海藻酸鹽，例如氧化海藻酸鹽(例如氧化海藻酸鈉)。

在某些優選的實施方案中，用於製備殼層的所述生物可降解材料是合成的可降解聚合物。此類可降解聚合物包括但不限於，聚磷腈，聚丙烯酸及其衍生物(例如聚甲基丙烯酸，丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物)，聚乳酸(PLA)，聚羥基乙酸(PGA)，聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)，聚原酸酯(POE)，聚己內酯(PCL)，聚羥基丁酸酯(PHB)，聚氨基酸(例如聚賴氨酸)，可降解性聚氨酯，以及其任何組合。

在某些優選的實施方案中，用於製備殼層的所述生物可降解材料包含天然存在的可降解聚合物和合成的可降解聚合物。

在某些優選的實施方案中，用於製備殼層的所述生物可降解材料能夠被酶(例如細胞分泌的酶)所降解。不同的生物可降解材料的降解速率差異很大，其範圍可以為一個月到數年。然而在本發明中，特別優選地，用於製備殼層的生物可降解材料在不超過1個月的時間內降解，例如在不超過30天、不超過25天、不超過20天、不超過15天、不超過10天、不超過5天、不超過4天、不超過3天、不超過2天、或不超過1天的時間內降解。例如，用於製備殼層的生物可降解材料可以在1-2天，2-3天，3-4天，4-5天，5-10天，10-15天，15-20天，20-25天，或25-30天的時間內降解。特別優選地，用於製備殼層的生物可降解材料在不超過10天的時間內降解。降解速率與生物可降解材料的分子組成、分子量大小和分子排列(例如，直鏈或支鏈)密切相關。一般情況下，分子量越高、分子排列越緊密，降解時間越長。因此，殼層的降解速率可通過對殼層的組分和/或含量的配置來控制。例如，為了獲得更快的降解速率，可使用低含量(例如低於0.5%、1%、2%、3%、4%、或5%)的生物可降解材料、低分子量(例如低於500 Da、1 kDa、2 kDa、3 kDa、5 kDa、或10 kDa)的生物可降解材料，和/或具有疏鬆分子排布的生物可降解材料。為了獲得更慢的降解速率，可使用高含量(例如高於0.5%、1%、2%、3%、4%、或5%)的生物可降解材料、高分子量(例如高於500 Da、1 kDa、2 kDa、3 kDa、5 kDa、或10 kDa)的生物可降解材料，和/或具有緊密分子排布的生物可降解材料。另外，還可通過改變生物磚的結構(如：多層包裹、表面多孔、孔隙率大小、比表面積等)來調節生物可降解材料的降解速率。此外，生物可降解材料的降解速率還可以通過改變合成該材料的聚合方式和共聚物比例來進行調節；或者，可通過對該材料的交聯來進行調節。此外，用於製備殼層的生物可降解材料的降解速率還可受細胞生命活動的影響。

在本發明中，特別優選的是，生物磚內的細胞能夠生長、伸展、增殖、遷移，並與其他生物磚內的細胞建立細胞連接，形成有機的構建體(例如人工組織)。因此，在某些優選的實施方案中，所述生物磚的殼層在相對短的時間(例如不超過30天的時間內，例如不超過10天的時間內)降解，以促進不同生物磚之間的細胞連接的建立，避免因殼層的存在而阻礙或影響不同生物磚之間的細胞建立相互的細胞連接。在某些優選的實施方案中，所述生物磚的殼層在不超過30天、不超過25天、不超過20天、不超過15天、不超過10天、不超過5天、不超過4天、不超過3天、不超過2天、或不超過1天的時間內降解。例如，所述生物磚的殼層可以在1-2天，2-3天，3-4天，4-5天，5-10天，10-15天，15-20天，20-25天，或25-30天的時間內降解。

在某些優選的實施方案中，所述殼層的降解能夠提供維持或促進所述細胞的生命活動的微環境，例如營養物質。在某些優選的實施方案中，殼層的降解產物為小分子化合物，例如有機酸、單糖(例如葡萄糖)、寡糖、氨基酸、脂質等。此類降解產物可參與到細胞的新陳代謝活動中，用於合成細胞外基質或轉化為活動所需的能量。

在某些優選的實施方案中，用於製備殼層的生物可降解材料及其降解產物對於細胞是無毒的，和/或對於宿主是非免疫原性的。

在某些優選的實施方案中，用於製備殼層的生物可降解材料含有細胞外基質或其類似物(例如彈性蛋白)。細胞外基質或其類似物(例如彈性蛋白)的使用能夠為生物磚內的細胞的生命活動(特別是細胞的生長、黏附、伸展，以及細胞間連接的建立)提供類似於體內的有利的微環境，從而是優選的。

在某些優選的實施方案中，用於製備殼層的生物可降解材料選自膠原蛋白(例如I型，II型，III型膠原蛋白)、纖維蛋白、殼聚糖、海藻酸鹽(例如海藻酸鈉或海藻酸鈣)、氧化海藻酸鹽(例如氧化海藻酸鈉)、澱粉、透明質酸，層黏連蛋白，彈性蛋白，明膠、葡聚糖、聚氨基酸(例如聚賴氨酸)、瓊脂糖，或其任何組合。

在某些優選的實施方案中，所述殼層包含海藻酸鹽(例如海藻酸鈉或海藻酸鈣)，例如包含海藻酸鈣和明膠，任選地還包含彈性蛋白。

在某些優選的實施方案中，所述殼層包含海藻酸鹽(例如海藻酸鈉或海藻酸鈣)和明膠。在某些優選的實施方案中，海藻酸鹽(例如海藻酸鈉或海藻酸鈣)和明膠在殼層中的重量比為約10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、或1:10。在某些優選的實施方案中，海藻酸鹽(例如海藻酸鈉或海藻酸鈣)和明膠在殼層中的重量比為10:1-9:1、9:1-8:1、8:1-7:1、7:1-6:1、6:1-5:1、5:1-4:1、4:1-3:1、3:1-2:1、2:1-1:1、1:1-1:2、1:2-1:3、1:3-1:4、1:4-1:5、1:5-1:6、1:6-1:7、1:7-1:8、1:8-1:9、1:9-1:10、10:1-5:1、5:1-1:1、1:1-1:5、1:5-1:10、2:1-1:2、4:1-1:4、或10:1-1:10。在某些優選的實施方案中，所述殼層還包含彈性蛋白。在某些優選的實施方案中，海藻酸鹽(例如海藻酸鈉或海藻酸鈣)和彈性蛋白在殼層中的重量比為約1000:1、500:1、400:1、300:1、250:1、200:1、100:1、50:1或10:1。在某些優選的實施方案中，海藻酸鹽(例如海藻酸鈉或海藻酸鈣)和彈性蛋白在殼層中的重量比為10:1-50:1、50:1-100:1、100:1-200:1、200:1-250:1、250:1-300:1、300:1-400:1、400:1-500:1、500:1-1000:1、10:1-100:1、100:1-200:1、200:1-300:1、300:1-400:1、400:1-1000:1、或100:1-500:1。在某些優選的實施方案中，明膠和彈性蛋白在殼層中的重量比為約1000:1、500:1、400:1、300:1、250:1、200:1、100:1、50:1或10:1。在某些優選的實施方案中，明膠和彈性蛋白在殼層中的重量比為10:1-50:1、50:1-100:1、100:1-200:1、200:1-250:1、250:1-300:1、300:1-400:1、400:1-500:1、500:1-1000:1、10:1-100:1、100:1-200:1、200:1-300:1、300:1-400:1、400:1-1000:1、或100:1-500:1。在某些優選的實施方案中，海藻酸鹽(例如海藻酸鈉或海藻酸鈣)、明膠和彈性蛋白在殼層中的重量比為約250:250:1。在某些優選的實施方案中，海藻酸鹽(例如海藻酸鈉或海藻酸鈣)在殼層中的重量百分比為約0.1%、0.5%、1%、1.25%、1.5%、2%、3%、4%、5%、7.5%、或10%。在某些優選的實施方案中，海藻酸鹽(例如海藻酸鈉或海藻酸鈣)在殼層中的重量百分比為0.1%-0.5%、0.5%-1%、1%-1.25%、1.25%-1.5%、1.5%-2%、2%-3%、3%-4%、4%-5%、5%-7.5%、7.5%-10%、0.1%-1%、1%-1.5%、1%-2%、0.5-2.5%、1%-3%、5-10%、或0.5%-5%。在某些優選的實施方案中，明膠在殼層中的重量百分比為約0.1%、0.5%、1%、1.25%、1.5%、2%、3%、4%、5%、7.5%、或10%。在某些優選的實施方案中，明膠在殼層中的重量百分比為0.1%-0.5%、0.5%-1%、1%-1.25%、1.25%-1.5%、1.5%-2%、2%-3%、3%-4%、4%-5%、5%-7.5%、7.5%-10%、0.1%-1%、1%-1.5%、1%-2%、0.5-2.5%、1%-3%、5-10%、或0.5%-5%。在某些優選的實施方案中，彈性蛋白在殼層中的重量百分比為約0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%、0.07%、0.08%、0.1%、0.15%、0.2%、或0.5%。在某些優選的實施方案中，彈性蛋白在殼層中的重量百分比為0.01%-0.02%、0.02%-0.03%、0.03%-0.04%、0.04%-0.05%、0.05%-0.06%、0.06%-0.07%、0.07%-0.08%、0.08%-0.1%、0.1%-0.15%、0.15%-0.2%、0.2%、0.2%-0.5%、0.01%-0.03%、0.03%-0.05%、0.05%-0.08%、0.08%-0.15%、0.01%-0.05%、0.05%-0.1%、0.03%-0.07%、0.04%-0.06%、0.01%-0.1%、0.1%-0.5%、或0.01%-0.5%。

在某些優選的實施方案中，所述殼層包含海藻酸鹽(例如海藻酸鈉或海藻酸鈣)，例如包含海藻酸鈣和明膠，任選地還包含彈性蛋白。在某些優選的實施方案中，所述殼層包含氧化海藻酸鹽(例如氧化海藻酸鈉)。在某些優選的實施方案中，所述殼層包含海藻酸鹽(例如海藻酸鈉或海藻酸鈣)和瓊脂糖。

在某些優選的實施方案中，可使用氧化的海藻酸鹽(例如氧化的海藻酸鈉和氧化的海藻酸鈣)來製備生物磚的殼層/外殼，並且可通過控制海藻酸鹽的氧化度來調節其降解速度，從而使殼層/外殼的降解速度與包裹在其中的細胞生長速度相匹配。

因此，在某些優選的實施方案中，本發明生物磚的至少一個殼層包含氧化的海藻酸鹽(例如氧化的海藻酸鈉和/或氧化的海藻酸鈣)，從而使得能夠對生物磚(或其殼層)的降解速度進行控制(例如，通過控制海藻酸鹽的氧化度)。在某些優選的實施方案中，本發明生物磚的至少一個殼層(例如所有殼層)包含氧化的海藻酸鹽(例如氧化的海藻酸鈉和/或氧化的海藻酸鈣)。在某些優選的實施方案中，本發明生物磚的位於最外側的殼層包含氧化的海藻酸鹽(例如氧化的海藻酸鈉和/或氧化的海藻酸鈣)。在某些優選的實施方案中，在本發明的生物磚中，僅位於最外側的殼層包含氧化的海藻酸鹽(例如氧化的海藻酸鈉和/或氧化的海藻酸鈣)。

在某些優選的實施方案中，所述氧化的海藻酸鹽包含氧化的海藻酸鈉和/或氧化的海藻酸鈣。在某些優選的實施方案中，所述氧化的海藻酸鹽包含氧化的海藻酸鈉。在某些優選的實施方案中，所述氧化的海藻酸鹽包含氧化的海藻酸鈣。在某些優選的實施方案中，所述氧化的海藻酸鹽包含氧化的海藻酸鈉和氧化的海藻酸鈣。

在某些優選的實施方案中，所述氧化的海藻酸鹽的分子量為4 kDa-1500 kDa。在某些優選的實施方案中，所述氧化的海藻酸鹽的分子量為4-10 kDa、10-20 kDa、20-30 kDa、30-40 kDa、40-50 kDa、50-60 kDa、60-70 kDa、70-80 kDa、80-90 kDa、90-100 kDa、100-200kDa、200-300 kDa、300-400 kDa、400-500 kDa、500-600 kDa、700-800 kDa、800-900 kDa、900-1000 kDa、1100-1200 kDa、1200-1300 kDa、1300-1400 kDa、或1400-1500 kDa。在某些優選的實施方案中，所述氧化的海藻酸鹽的分子量為32k-250k Da。在某些優選的實施方案中，所述氧化的海藻酸鹽是可溶於水的。

在某些優選的實施方案中，所述氧化的海藻酸鹽的G/M值為0.2-5。在某些優選的實施方案中，所述氧化的海藻酸鹽的G/M值為0.2-0.3、0.3-0.4、0.4-0.5、0.5-0.6、0.6-0.7、0.7-0.8、0.8-0.9、0.9-1.0、1.0-1.5、1.5-2.0、2.0-2.5、2.5-3.0、3.0-3.5、3.5-4.0、4.0-4.5、或4.5-5.0。在某些優選的實施方案中，所述氧化的海藻酸鹽的G/M值為0.2-2.5。

在某些優選的實施方案中，所述氧化的海藻酸鹽的氧化度為1-40%。在某些優選的實施方案中，所述氧化的海藻酸鹽的氧化度為1-2%、2-3%、3-4%、4-5%、5-6%、6-7%、7-8%、8-9%、9-10%、11-12%、12-13%、13-14%、14-15%、15-16%、16-17%、17-18%、18-19%、19-20%、20-25%、25-30%、30-35%、或35-40%。在某些優選的實施方案中，所述氧化的海藻酸鹽的氧化度為2.5-4.4%、4.4-8.8%、8.8-17.6%或17.6-22%。

在某些優選的實施方案中，用於製備殼層的氧化的海藻酸鹽的黏度為100-3000 mPa∙s。在某些優選的實施方案中，用於製備殼層的氧化的海藻酸鹽的黏度為100-200、200-300、300-400、400-500、500-600、600-700、700-800、800-900、900-1000、1000-1100、1100-1200、1200-1300、1300-1400、1400-1500、1500-1600、1600-1700、1700-1800、1800-1900、1900-2000、2000-2100、2100-2200、2200-2300、2300-2400、2400-2500、2500-2600、2600-2700、2700-2800、2800-2900、或2900-3000 mPa∙s。在某些優選的實施方案中，用於製備殼層的氧化的海藻酸鹽的黏度為200-2000 mPa∙s。

在某些優選的實施方案中，所述氧化的海藻酸鹽是通過將從藻類(例如褐藻，例如海帶和馬尾藻)中提取到的海藻酸鹽氧化而獲得的。

在某些優選的實施方案中，本發明生物磚的至少一個殼層包含1-25% (wt)的氧化的海藻酸鹽。在某些優選的實施方案中，本發明生物磚的至少一個殼層包含1-2%、2-3%、3-4%、4-5%、5-6%、6-7%、7-8%、8-9%、9-10%、10-15%、15-20%、20-25% (wt)的氧化的海藻酸鹽。在某些優選的實施方案中，本發明生物磚的至少一個殼層包含至少5% (wt)的氧化的海藻酸鹽。

在某些優選的實施方案中，本發明生物磚的至少一個殼層包含氧化的海藻酸鹽(例如，上文所定義的氧化的海藻酸鹽)，以及海藻酸鹽(例如海藻酸鈉和/或海藻酸鈣)。

在某些優選的實施方案中，包含於所述至少一個殼層中的海藻酸鹽的分子量為4 kDa-1500 kDa。在某些優選的實施方案中，包含於所述至少一個殼層中的海藻酸鹽的分子量為4-10 kDa、10-20 kDa、20-30 kDa、30-40 kDa、40-50 kDa、50-60 kDa、60-70 kDa、70-80 kDa、80-90 kDa、90-100 kDa、100-200 kDa、200-300 kDa、300-400 kDa、400-500 kDa、500-600 kDa、700-800 kDa、800-900 kDa、900-1000 kDa、1100-1200 kDa、1200-1300 kDa、1300-1400 kDa、或1400-1500 kDa。在某些優選的實施方案中，包含於所述至少一個殼層中的海藻酸鹽的分子量為32k-250k Da。

在某些優選的實施方案中，包含於所述至少一個殼層中的海藻酸鹽的G/M值為0.2-5。在某些優選的實施方案中，包含於所述至少一個殼層中的海藻酸鹽的G/M值為0.2-0.3、0.3-0.4、0.4-0.5、0.5-0.6、0.6-0.7、0.7-0.8、0.8-0.9、0.9-1.0、1.0-1.5、1.5-2.0、2.0-2.5、2.5-3.0、3.0-3.5、3.5-4.0、4.0-4.5、或4.5-5.0。在某些優選的實施方案中，包含於所述至少一個殼層中的海藻酸鹽的G/M值為0.2-2.5。

在某些優選的實施方案中，用於製備所述至少一個殼層的海藻酸鹽的黏度為100-3000 mPa∙s。在某些優選的實施方案中，用於製備所述至少一個殼層的海藻酸鹽的黏度為100-200、200-300、300-400、400-500、500-600、600-700、700-800、800-900、900-1000、1000-1100、1100-1200、1200-1300、1300-1400、1400-1500、1500-1600、1600-1700、1700-1800、1800-1900、1900-2000、2000-2100、2100-2200、2200-2300、2300-2400、2400-2500、2500-2600、2600-2700、2700-2800、2800-2900、或2900-3000 mPa∙s。在某些優選的實施方案中，用於製備所述至少一個殼層的海藻酸鹽的黏度為200-2000 mPa∙s。

在某些優選的實施方案中，在所述至少一個殼層中，海藻酸鹽與氧化的海藻酸鹽的品質比為1:9至9:1。在某些優選的實施方案中，在所述至少一個殼層中，海藻酸鹽與氧化的海藻酸鹽的品質比為1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2、9:1。

在某些優選的實施方案中，所述殼層包含海藻酸鹽(例如海藻酸鈉或海藻酸鈣)和氧化海藻酸鹽(例如氧化海藻酸鈉)。在某些優選的實施方案中，海藻酸鹽(例如海藻酸鈉或海藻酸鈣)和氧化海藻酸鹽(例如氧化海藻酸鈉)在殼層中的重量比為約10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、或1:10。在某些優選的實施方案中，海藻酸鹽(例如海藻酸鈉或海藻酸鈣)和氧化海藻酸鹽(例如氧化海藻酸鈉)在殼層中的重量比為10:1-9:1、9:1-8:1、8:1-7:1、7:1-6:1、6:1-5:1、5:1-4:1、4:1-3:1、3:1-2:1、2:1-1:1、1:1-1:2、1:2-1:3、1:3-1:4、1:4-1:5、1:5-1:6、1:6-1:7、1:7-1:8、1:8-1:9、1:9-1:10、10:1-5:1、5:1-1:1、1:1-1:5、1:5-1:10、2:1-1:2、4:1-1:4、或10:1-1:10。

在某些優選的實施方案中，所述至少一個殼層在不超過28天的時間內完全降解。在某些優選的實施方案中，所述至少一個殼層在不超過21天、不超過14天、不超過12天、不超過10天、不超過9天、不超過8天、不超過7天、不超過6天、不超過5天、不超過4天、不超過3天、或不超過2天的時間內完全降解。在某些優選的實施方案中，所述至少一個殼層在2-5天，2-6天，2-8天，2-10天，2-12天，或2-14天內完全降解。

在某些優選的實施方案中，所述至少一個殼層的黏度為100-3000 mPa∙s。在某些優選的實施方案中，所述至少一個殼層的黏度為100-200、200-300、300-400、400-500、500-600、600-700、700-800、800-900、900-1000、1000-1100、1100-1200、1200-1300、1300-1400、1400-1500、1500-1600、1600-1700、1700-1800、1800-1900、1900-2000、2000-2100、2100-2200、2200-2300、2300-2400、2400-2500、2500-2600、2600-2700、2700-2800、2800-2900、或2900-3000 mPa∙s。在某些優選的實施方案中，所述至少一個殼層的黏度為200-2000 mPa∙s。

在某些優選的實施方案中，用於製備核層和殼層的生物可降解材料可以是相同的或不同的。然而，特別優選地，根據其預期的目的，核層和殼層具有不同的組成。不拘於理論限制，通常認為，殼層提供了主要的力學保護作用，而核層則提供了細胞生命活動所需的主要的營養成分和微環境。因此，在某些優選的實施方案中，與殼層相比，核層具有更多的營養物質。在某些優選的實施方案中，與核層相比，殼層具有較低的降解速率，但具有更高的硬度和/或彈性模量。在某些優選的實施方案中，殼層中不包含細胞。

因此，在某些優選的實施方案中，核層和殼層由不同的生物可降解材料製成。例如，在某些優選的實施方案中，用於製備核層的生物可降解材料為，海藻酸鈉和任選的I型膠原；並且，用於製備殼層的生物可降解材料為，海藻酸鈉和任選的彈性蛋白。在某些優選的實施方案中，用於製備核層的生物可降解材料為澱粉；並且，用於製備殼層的生物可降解材料為海藻酸鈉。在某些優選的實施方案中，用於製備核層的生物可降解材料為I型膠原；並且，用於製備殼層的生物可降解材料為聚賴氨酸。在某些優選的實施方案中，用於製備核層的生物可降解材料為I型膠原；並且，用於製備殼層的生物可降解材料為海藻酸鈉。在某些優選的實施方案中，用於製備核層的生物可降解材料為聚氨酯；並且，用於製備殼層的生物可降解材料為海藻酸鈉。在某些優選的實施方案中，用於製備核層的生物可降解材料為海藻酸鈉；並且，用於製備殼層的生物可降解材料為聚賴氨酸。

在某些優選的實施方案中，核層和殼層分別以不同的重量比包含相同的生物可降解材料。換言之，核層和殼層可以由相同的生物可降解材料製成，但以不同的重量比包含生物可降解材料。例如，在某些優選的實施方案中，核層和殼層均由海藻酸鈉製成；但核層包含不超過2% (例如1.5%)的海藻酸鈉，而殼層包含超過4% (例如5%)的海藻酸鈉。不超過2% (例如1.5%)的海藻酸鈉能夠為細胞在核層中的生長、增殖、分化或遷移提供優良的條件(通常，細胞難以在超過2%的海藻酸鈉的條件下生長和存活)；而超過4% (例如5%)的海藻酸鈉則能夠為殼層提供足夠的硬度和彈性。

在某些優選的實施方案中，所述核層和殼層包含選自下述的組合：

在某些優選的實施方案中，所述殼層各自獨立地是通透性的。例如，所述殼層對於水，氧氣，和營養物質(糖類例如葡萄糖，脂肪，蛋白質，氨基酸，短肽，礦物質，維生素、細胞因子、核苷酸等)是通透性的。

一般認為，半通透的(即，選擇通透的)殼層的使用可能是有利的，因為其能夠使得水，氧氣，葡萄糖，礦物質，和氨基酸等營養物質透過殼層，進入核層，並提供給細胞，並且能夠阻止對細胞有害的物質(例如來自宿主免疫系統的抗體蛋白)進入核層。然而，在本發明的生物磚中，通透性殼層的使用是優選的和有利的。特別地，通透性的殼層使得各種營養物質(包括大分子和小分子營養物質，例如葡萄糖，脂肪，蛋白質，氨基酸，短肽，礦物質，維生素、細胞因子、核苷酸等)能夠更加容易、順暢地進行交換，避免局部區域的細胞無法獲得充足的營養物質。例如，當使用本發明的生物磚構建大尺寸的人工組織時，通透性的殼層將能夠促進各種營養物質的交換，促進人工組織內部/核心區域的生物磚內的細胞獲得充足的營養物質。此外，通透性的殼層有利於不同生物磚之間的細胞進行信號傳遞和建立細胞連接。特別地，細胞在生長過程中會分泌多種物質(包括細胞外基質的某些組分和多種信號分子)，與鄰近的、甚至遠端的細胞進行信號傳遞和/或物質交流，並由此對細胞自身的生命活動以及鄰近的、甚至遠端的細胞的生命活動產生影響或進行調控。因此，如果使用選擇通透性的殼層的話，那麼細胞之間的信號傳遞和/或物質交流將有可能受到影響/阻礙，例如細胞分泌的某些大分子信號物質(例如細胞因子蛋白)可能無法透過殼層，從而可能阻礙不同生物磚之間的細胞信號的傳遞和細胞連接的建立，不利於構建有機的整體(例如，人工組織)。因此，通透性殼層的使用對於本發明的生物磚而言是優選的。在本發明中，表述「通透性殼層」意指，各種小分子和大分子物質(例如蛋白質)能夠自由通過殼層。例如，在某些優選的實施方案中，所述殼層對於分子量在5000 kDa以下的分子是通透的。例如，在某些實施方案中，所述殼層對於分子量在200 kDa以下或分子量在200 kDa-300 kDa、300 kDa-400 kDa、400 kDa-500 kDa、500 kDa-800 kDa、800 kDa-1000 kDa、1000 kDa-1500 kDa、1500 kDa-2000 kDa、2000 kDa-3000 kDa、3000 kDa-4000 kDa或4000 kDa-5000 kDa範圍內的分子是通透的。在某些實施方案中，所述殼層對於免疫球蛋白(例如IgG、IgM、IgA、IgD、IgE)是通透的。

在某些優選的實施方案中，所述殼層各自獨立地具有用於生物磚內外物質交換的通道或孔。在某些優選的實施方案中，營養物質(糖類例如葡萄糖，脂肪，蛋白質，氨基酸，短肽，礦物質，維生素、細胞因子、核苷酸等)通過所述通道或孔擴散進入所述生物磚內。在某些優選的實施方案中，所述通道的直徑為至少10、20、50、100、150、200、250、300、350、400、或500 nm。在某些優選的實施方案中，所述通道的直徑為例如1 nm-5 μm；10 nm-2 μm；100 nm-1 μm；200-800 nm等。在某些優選的實施方案中，所述孔的直徑為至少100、200、400、600、800、1000、1500、2000、4000、或5000 nm。

本發明的生物磚的殼層的厚度可以根據實際需要進行選擇，而不受特別限制。例如，本發明生物磚的殼層的厚度各自獨立地可以為1-20 μm，例如5-15 μm，例如8-12 μm。在某些優選的實施方案中，本發明的生物磚的殼層的厚度各自獨立地可以為約0.1、0.5、1、2、5、10、15、20、25、30、或50 μm。在某些優選的實施方案中，本發明的生物磚的殼層的厚度各自獨立地可以為0.1-0.5、0.5-1、1-2、2-5、5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-50、50-100、100-200、200-300、300-400、400-500、0.1-1、1-5、1-10、5-10、10-20、10-30、5-20、或1-20 μm。

在某些優選的實施方案中，本發明的生物磚的殼層不包含細胞。

在某些優選的實施方案中，所述核層和/或殼層各自獨立地還包含額外的試劑，例如，營養物質、細胞外基質、細胞因子和/或藥物活性成分。優選地，所述額外的試劑能夠調控(例如促進)細胞的增殖、分化、遷移、分泌和/或新陳代謝。在某些優選的實施方案中，所述核層包含至少一種(例如1、2、3、4、5或更多種)能夠調控(例如促進)細胞的增殖、分化、遷移、分泌和/或新陳代謝的額外的試劑。在某些優選的實施方案中，所述核層能夠以受控的方式釋放所述額外的試劑。

在某些優選的實施方案中，所述營養物質包括但不限於，核苷酸，氨基酸，多肽，碳水化合物(例如單糖，寡糖，多糖)，脂質，維生素等。

在某些優選的實施方案中，細胞外基質選自多糖，例如糖胺聚糖、蛋白聚糖；結構蛋白，例如膠原和彈性蛋白；黏著蛋白，例如纖黏連蛋白和層黏連蛋白。

在某些優選的實施方案中，所述細胞因子可以是用於調控細胞的增殖、分化、遷移、分泌和/或新陳代謝的細胞因子，包括但不限於： - 與細胞生長相關的細胞因子，例如胰島素、類胰島素生長因子(如IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ)、轉化生長因子(如TGFα和TGFβ)、血管內皮生長因子、表皮生長因子、成纖細胞生長因子、血小板來源生長因子、骨肉瘤來源生長因子、生長激素釋放抑制因子、神經生長因子、白細胞介素(如IL-1、IL-11、IL-3)、紅細胞生長素、集落刺激因子、皮質醇、甲狀腺素，或其任何組合； - 與細胞分化相關的細胞因子，例如Oct3/4，Sox2，Klf4，c-Myc，GATA4，TSP1，β-甘油磷酸鈉，地塞米松，維生素C，胰島素，IBMX，吲哚美鋅，血小板衍生生長因子BB(PDGF-BB)，5-氮雜胞苷，或其任何組合； - 與細胞遷移相關的細胞因子，例如環磷酸腺苷，三磷酸磷脂醯肌醇，基質細胞衍生因子-1、N-鈣黏蛋白，核因子κB，骨連接素，血栓素A2，Ras，或其任何組合；和/或 - 與細胞新陳代謝相關的細胞因子，例如胰島素生長因子1、TRIP-Br2、DKK-1、sRANKL、OPG、TRACP-5b、ALP、SIRT1(2-7)、PGC-1α，PGC-1β、OPG、IL-3、IL-4、IL-6、TGF-β、PGE2、G-CSF、TNF-α，或其任何組合。

在某些優選的實施方案中，所述藥物活性成分為能夠調控(例如促進)細胞的增殖、分化、遷移、分泌和/或新陳代謝的試劑。在某些優選的實施方案中，所述藥物活性成分選自rhIL-2、rhIL-11、rhEPO、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、G-CSF、GM-CSF、rHuEPO、sTNF-R1、和rhTNF-α。

本發明生物磚的核層所包含的細胞的數量可以根據實際需要進行選擇，而不受特別限制。例如，本發明生物磚的核層各自獨立地可以包含1-10⁶ 個細胞，例如10-900、20-800、30-700、40-600、50-500、60-400、70-300、80-200、10-100個、10-10³ 個、10-10⁴ 個、10-10⁵ 個、10-10⁶ 個細胞。在某些優選的實施方案中，本發明生物磚的核層各自獨立地包含至少1、2、4、6、8、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10⁴ 、2×10⁴ 、3×10⁴ 、4×10⁴ 、5×10⁴ 、6×10⁴ 、7×10⁴ 、8×10⁴ 、9×10⁴ 、10⁵ 、2×10⁵ 、3×10⁵ 、4×10⁵ 、5×10⁵ 、6×10⁵ 、7×10⁵ 、8×10⁵ 、9×10⁵ 、或10⁶ 個細胞。在某些優選的實施方案中，本發明生物磚的核層各自獨立地可以包含1-2、2-4、4-6、6-8、8-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100、100-150、150-200、200-300、300-400、400-500、500-1000、1000-2000、2000-3000、3000-4000、4000-5000、5000-10⁴ 、10⁴ -2×10⁴ 、2×10⁴ -3×10⁴ 、3×10⁴ -4×10⁴ 、4×10⁴ -5×10⁴ 、5×10⁴ -10⁵ 、10⁵ -2×10⁵ 、2×10⁵ -3×10⁵ 、3×10⁵ -4×10⁵ 、4×10⁵ -5×10⁵ 、5×10⁵ -10⁶ 、1-10、2-10、2-5、5-10、10-20、20-30、30-50、2-25、25-50、2-50、50-100、100-200、50-250、250-500、500-2000、2-100、2-500、或2-2000個細胞。

不受理論限制，本發明的生物磚可以包含任何種類和類型的細胞。在某些優選的實施方案中，本發明的生物磚可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、或更多種類型的細胞。例如，所述細胞可以為細菌、酵母、植物細胞或動物細胞，例如哺乳動物細胞，優選人細胞。優選地，所述細胞為黏附細胞，例如分化的黏附細胞或未分化的黏附細胞。優選地，所述細胞為多能幹細胞。在某些優選的實施方案中，所述黏附細胞來源於選自下述的組織：結締組織(例如，疏鬆結締組織、緻密結締組織、彈性組織、網狀結締組織和脂肪組織)、肌肉組織(例如，骨骼肌、平滑肌和心肌)、泌尿生殖組織、胃腸組織、肺組織、骨組織、神經組織和上皮組織(例如，單層上皮和複層上皮)、內胚層來源的組織、中胚層來源的組織和外胚層來源的組織。

在某些優選的實施方案中，所述黏附細胞選自肌肉細胞(例如，骨骼肌細胞、心肌細胞、平滑肌細胞和成肌細胞)、結締組織細胞(例如，骨細胞、軟骨細胞、成纖維細胞以及分化為成骨細胞、軟骨細胞或淋巴組織的細胞)、骨髓細胞、內皮細胞、皮膚細胞、上皮細胞、乳腺細胞、血管細胞、血細胞、淋巴細胞、神經細胞、許旺細胞、胃腸細胞、肝細胞、胰細胞、肺細胞、氣管細胞、角膜細胞、泌尿生殖細胞、腎細胞、脂肪細胞、實質細胞、周細胞、間皮細胞、基質細胞、未分化的細胞(如幹細胞和祖細胞)、內胚層來源的細胞、中胚層來源的細胞、外胚層來源的細胞、癌來源的細胞，細胞系、誘導的多能幹細胞(iPS)、或其任何組合。

可根據實際需要來選擇合適的細胞。例如，在某些優選的實施方案中，所述生物磚包含心肌細胞，並且其用於產生心臟組織。在某些優選的實施方案中，所述生物磚包含內皮細胞，平滑肌細胞和成纖維細胞，並且其用於產生血管。在某些優選的實施方案中，所述生物磚包含內皮細胞，並且其用於產生皮膚組織。

在某些優選的實施方案中，所述生物磚的核層包裹的細胞包括內皮細胞。在某些優選的實施方案中，所述核層包裹的內皮細胞獲自動物，例如哺乳動物，例如人、猿、大猩猩、牛、豬、犬、綿羊和山羊。在某些實施方案中，所述內皮細胞為動物內皮細胞，優選人內皮細胞或大鼠內皮細胞。在某些優選的實施方案中，所述內皮細胞包括靜脈內皮細胞和/或動脈內皮細胞，優選臍靜脈內皮細胞。在某些優選的實施方案中，所述內皮細胞包括人臍靜脈內皮細胞。在某些優選的實施方案中，所述內皮細胞包括大鼠血管內皮細胞。

在某些優選的實施方案中，除了如上描述的內皮細胞之外，所述核層包裹的細胞還包括未分化的細胞，例如幹細胞、祖細胞或其組合。在某些優選的實施方案中，所述幹細胞為多能幹細胞，例如誘導的多能幹細胞。在某些優選的實施方案中，所述幹細胞包括間充質幹細胞。在某些優選的實施方案中，所述間充質幹細胞是骨髓、脂肪、臍帶、臍帶血、和/或胎盤來源的間充質幹細胞。在某些優選的實施方案中，所述間充質幹細胞是骨髓來源的間充質幹細胞。在某些優選的實施方案中，所述間充質幹細胞獲自動物，例如哺乳動物，例如人、猿、大猩猩、牛、豬、犬、綿羊和山羊。

在某些優選的實施方案中，除了如上描述的內皮細胞之外，所述核層包裹的細胞還包括額外細胞。在某些優選的實施方案中，所述額外細胞來源於選自下述的組織：結締組織(例如，疏鬆結締組織、緻密結締組織、彈性組織、網狀結締組織和脂肪組織)、肌肉組織(例如，骨骼肌、平滑肌和心肌)、泌尿生殖組織、胃腸組織、肺組織、骨組織、神經組織和上皮組織(例如，單層上皮和複層上皮)、內胚層來源的組織、中胚層來源的組織和外胚層來源的組織。在某些優選的實施方案中，所述額外細胞選自肌肉細胞(例如，骨骼肌細胞、心肌細胞、平滑肌細胞和成肌細胞)、結締組織細胞(例如，骨細胞、軟骨細胞、成纖維細胞以及分化為成骨細胞、軟骨細胞或淋巴組織的細胞)、骨髓細胞、皮膚細胞、上皮細胞、乳腺細胞、血管細胞、血細胞、淋巴細胞、神經細胞、許旺細胞、胃腸細胞、肝細胞、胰細胞、肺細胞、氣管細胞、角膜細胞、泌尿生殖細胞、腎細胞、脂肪細胞、實質細胞、周細胞、間皮細胞、基質細胞、內胚層來源的細胞、中胚層來源的細胞、外胚層來源的細胞、癌來源的細胞、細胞系、或其任何組合。在某些優選的實施方案中，所述額外細胞為肝細胞。

在某些優選的實施方案中，所述生物磚包含內皮細胞和未分化的細胞。在某些優選的實施方案中，所述內皮細胞和所述未分化的細胞包裹於同一核層或不同核層。例如，所述內皮細胞位於第一核層且所述未分化的細胞位於第二核層，或者相反。

在某些優選的實施方案中，所述生物磚包含內皮細胞、未分化的細胞和額外細胞。在某些優選的實施方案中，所述內皮細胞、所述未分化的細胞和所述額外細胞包裹於同一核層或不同核層，例如其中兩種細胞位於同一核層(例如第一核層)而第三種位於另一核層(例如第二核層)。

在某些優選的實施方案中，所述核層包裹的內皮細胞、未分化的細胞和/或額外細胞的來源是相同的，例如，均來源於人，或均來源於大鼠。

在某些優選的實施方案中，所述生物磚包含內皮細胞和/或未分化的細胞。在某些優選的實施方案中，所述內皮細胞占細胞總數量的1%-100%，例如，2%-90%、3%-80%、4%-70%、5%-60%、5.5%-50%、6%-40%、6.5%-30%、7%-20%、7.5%-19%、8%-18%、8.5%-17%、9%-16%、9.1%-15%、9.2%-14%、9.3%-13%、9.4%-12%、9.5%-11.5%、9.6%-11%、9.7%-10.9%、9.8%-10.8%、9.9%-10.7%、9.9%-10.6%、9.9%-10.5%、9.9%-10.4%、9.9%-10.3%、9.9%-10.2%、9.9%-10.1%、或10.0%。在某些優選的實施方案中，所述未分化的細胞占細胞總數量的0%-99%，例如，1%-90%、5%-80%、10%-70%、15%-65%、20%-60%、25%-55%、30%-50%、35%-45%、36%-44%、37%-43%、38%-42%、39%-41%、39.1%、39.2%、39.3%、39.4%、39.5%、39.6%、39.7%、39.8%、39.9%、40.0%、40.1%、40.2%、40.3%、40.4%、40.5%、40.6%、40.7%、40.8%或40.9%。在某些優選的實施方案中，所述內皮細胞與未分化的細胞的比例為約1:20-約1:1,例如約1:19、約1:18、約1:17、約1:16、約1:15、約1:14、約1:13、約1:12、約1:11、約1:10、約1:9、約1:8、約1:7、約1:6、約1:5、約1:4、約1:3、約1:2、或約1:1.5。在某些優選的實施方案中，所述內皮細胞與未分化的細胞的比例為約1:15、約1:14、約1:13、約1:12、約1:11.5、約1:11、約1:10.5、約1:10、約1:9.5、約1:9、約1:8.5、約1:8、約1:7、約1:6。在某些優選的實施方案中，所述內皮細胞與未分化的細胞的比例為約1:10。

在某些優選的實施方案中，所述核層包裹的細胞包括內皮細胞和未分化的細胞，且所述內皮細胞為人臍靜脈內皮細胞，所述未分化的細胞為骨髓來源的間充質幹細胞，所述人臍靜脈內皮細胞與所述骨髓來源的間充質幹細胞的比例為約1:10。任選地，所述生物磚還包括額外細胞，其中所述額外細胞的數量與內皮細胞的數量比例優選為約1:1。在某些優選的實施方案中，所述額外細胞為肝細胞。在某些優選的實施方案中，所述核層包裹的細胞包括，比例為約1:1:10的人臍靜脈內皮細胞、肝細胞和骨髓來源的間充質幹細胞。

在某些優選的實施方案中，所述生物磚包括：MSC細胞，包裹所述MSC細胞的核層，和，封裝所述核層的殼層；優選地，所述核層和殼層各自獨立地由生物可降解材料製成，並且所述核層提供誘導MSC向成骨細胞或骨分化的微環境(例如，所述核層包含誘導MSC向成骨細胞或骨分化的誘導因子)。在某些優選實施方案中，此類生物磚的殼層也提供誘導MSC向成骨細胞或骨分化的微環境(例如，所述殼層包含誘導MSC向成骨細胞或骨分化的誘導因子)。在某些優選實施方案中，所述誘導MSC向成骨細胞或骨分化的誘導因子包含地塞米松、抗壞血酸和甘油磷酸。

在某些優選的實施方案中，所述生物磚包括：MSC細胞，包裹所述MSC細胞的核層，和，封裝所述核層的殼層；優選地，所述核層和殼層各自獨立地由生物可降解材料製成，並且所述核層提供誘導MSC向成軟骨細胞或軟骨分化的微環境(例如，所述核層包含誘導MSC向成軟骨細胞或軟骨分化的誘導因子)。在某些優選實施方案中，此類生物磚的殼層也提供誘導MSC向成軟骨細胞或軟骨分化的微環境(例如，所述殼層包含誘導MSC向成軟骨細胞或軟骨分化的誘導因子)。在某些優選實施方案中，所述誘導MSC向成軟骨細胞或軟骨分化的誘導因子包含TGF-β3、地塞米松、2-磷酸抗壞血酸、丙酮酸鈉、脯氨酸和胰島素-轉鐵蛋白-硒溶液。

本發明的生物磚的尺寸可以根據實際需要進行選擇，而不受特別限制。球形生物磚的尺寸通常可以通過其直徑來進行明確定義。在嚴格定義的情況下，術語「直徑」不能用於描述非球形的結構。然而，在本發明中，也使用術語「直徑」來描述非球形的生物磚的尺寸。在此情況下，術語「直徑」表示，與非球形的生物磚具有相同體積的球形生物磚的直徑。換言之，在本發明中，使用球形生物磚的直徑來描述具有相同體積的非球形的生物磚的尺寸。因此，在某些優選的實施方案中，本發明生物磚的尺寸(即，本文所定義的直徑)可以為20-2000 μm，例如30-1900 μm，40-1800 μm，50-1700 μm，60-1600 μm，70-1500 μm，80-1400 μm，90-1300 μm，100-1200 μm，200-1000 μm，300-800 μm，400-600 μm，100-500 μm。在某些優選的實施方案中，本發明生物磚的尺寸(即，本文所定義的直徑)可以為20-30、30-50、50-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-600、600-700、700-800、800-900、900-1000、1000-1500、1500-2000、20-50、20-100、100-200、200-400、500-600、600-800、800-1000、或1000-2000 μm。在某些優選的實施方案中，本發明生物磚的尺寸(即，本文所定義的直徑)為至少20、30、50、100、120、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、1500、或2000 μm。

本發明的生物磚的形狀可以根據實際需要進行選擇，而不受特別限制。例如，本發明生物磚可以是球形，或者任何期望的形狀(例如立方體，矩形棱柱，六棱柱，圓柱，或不規則的形狀)。例如，一些形狀(例如球形，立方體，矩形棱柱，六棱柱)可用於實現生物磚在構建體中的緊密堆積。

在某些優選的實施方案中，本發明的生物磚為固體或半固體。在某些優選的實施方案中，本發明的生物磚為凝膠態。例如，本發明的生物磚的核層和/或殼層可以為凝膠態。在某些優選的實施方案中，本發明的生物磚包含水凝膠。在某些優選的實施方案中，所述水凝膠包含海藻酸鹽，瓊脂糖，明膠，殼聚糖，或其它水溶性或親水性聚合物。

在某些優選的實施方案中，本發明的生物磚以混合物的形式存在。在此類實施方案中，生物磚可以與混合物中的另一生物磚接觸或融合。在某些優選的實施方案中，本發明的生物磚是分離的生物磚。例如，在某些實施方案中，生物磚不與其他的生物磚直接接觸。在某些優選的實施方案中，本發明的分離的生物磚提供於容器中。

本發明的生物磚可使用各種方法來製備。例如，在某些優選的實施方案中，可使用用於製造微球體的方法來製備本發明的生物磚，例如使用造粒儀來進行製備。在某些優選的實施方案中，本發明的生物磚是在無菌條件下製備的。某些優選的實施方案中，本發明的生物磚是在GMP工作間中製備的。在某些優選的實施方案中，本發明的生物磚在即將使用前被製備。在某些優選的實施方案中，本發明的生物磚在製備後儲存於4ºC，例如儲存3小時、6小時、12小時、1天、2天、或3天。

在某些優選的實施方案中，本發明的生物磚能夠減少細胞在生物列印過程中受到的機械損傷。例如，在某些優選的實施方案中，在使用相同生物印表機和相同列印條件的情況下，與將細胞直接用於生物列印相比，本發明的生物磚能夠減少細胞受到的機械損傷至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、70%、80%、或90%。在某些優選的實施方案中，本發明的生物磚能夠在生物列印過程中保留生物磚內的細胞的生物活性(例如，增殖、分化、遷移、分泌和/或新陳代謝)。在某些優選的實施方案中，生物磚內至少80%、85%、87.5%、90%、92.5%、95%、或98%的細胞在生物列印後存活至少24小時。在某些優選的實施方案中，生物磚內至少90%的細胞在生物列印後存活至少3小時、6小時、12小時、1天、2天、4天、或7天。在某些優選的實施方案中，生物磚內至少80%、85%、87.5%、90%、92.5%、95%、或98%的細胞在生物列印24小時後能夠增殖和/或分化。在某些優選的實施方案中，生物磚內至少80%、85%、87.5%、90%、92.5%、95%、或98%的細胞在生物列印24小時後具有正常的新陳代謝。在某些優選的實施方案中，生物磚內至少80%、85%、87.5%、90%、92.5%、95%、或98%的細胞在生物列印24小時後能夠遷移。在某些優選的實施方案中，生物磚內至少80%、85%、87.5%、90%、92.5%、95%、或98%的細胞在生物列印24小時後能夠分泌。

本發明的生物磚的示意性結構示於圖1A-1E中。如圖1A-1E所示，本發明的生物磚包括：細胞，其能夠進行生長、增殖、分化或遷移；包裹細胞的核層，其由生物可降解材料製成，並且為細胞的生命活動提供微環境，例如營養物質；和，封裝核層的殼層，由生物可降解材料製成，並且為內部的核層和細胞提供力學保護。在某些優選的實施方案中，所述殼層是通透性的，具有用於生物磚內外物質交換的通道。在某些優選的實施方案中，細胞可均勻分散於核層中，或者可以聚集在一起，位於核層內部。

在某些優選的實施方案中，本發明的生物磚包括至少一個核層。在某些優選的實施方案中，本發明的生物磚包括至少二個核層。例如，本發明的生物磚可包括1個、2個、3個、4個、5個或更多個核層。

在某些優選的實施方案中，本發明生物磚的各個核層各自獨立地由上文所定義的生物可降解材料或生物可降解材料的組合製成。換言之，在本發明的生物磚包含至少二個核層的情況下，各個核層可以獨立地由相同或不同的生物可降解材料或生物可降解材料的組合製成。例如，如果本發明的生物磚包含2個核層，那麼這2個核層可以由相同的生物可降解材料或生物可降解材料的組合製成，也可以由不同的生物可降解材料或生物可降解材料的組合製成。如果本發明的生物磚包含3個核層，那麼這3個核層可以由相同的生物可降解材料或生物可降解材料的組合製成；或者可以由3種不同的生物可降解材料或生物可降解材料的組合製成；或者其中的2個核層由相同的生物可降解材料或生物可降解材料的組合製成，且第3個核層由另一種生物可降解材料或生物可降解材料的組合製成。在某些優選的實施方案中，本發明生物磚的各個核層具有不同的組成成分。

在某些優選的實施方案中，本發明生物磚的各個核層各自獨立地包裹細胞。換言之，在本發明的生物磚包含至少二個核層的情況下，各個核層可以獨立地包裹相同或不同的細胞或細胞組合。例如，如果本發明的生物磚包含2個核層，那麼這2個核層可以包裹相同的細胞或細胞組合，也可以包裹不同的細胞或細胞組合。如果本發明的生物磚包含3個核層，那麼這3個核層可以包裹相同的細胞或細胞組合；或者可以包裹3種不同的細胞或細胞組合；或者其中的2個核層包裹相同的細胞或細胞組合，且第3個核層包裹另一種細胞或細胞組合。

此外，本發明生物磚的各個核層各自獨立地包含一個或多個細胞，例如，本發明生物磚的各個核層各自獨立地可以包含1-10⁶ 個細胞，例如10-900、20-800、30-700、40-600、50-500、60-400、70-300、80-200、10-100個、10-10³ 個、10-10⁴ 個、10-10⁵ 個、10-10⁶ 個細胞。在某些優選的實施方案中，本發明生物磚的各個核層各自獨立地包含至少1、2、4、6、8、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10⁴ 、2×10⁴ 、3×10⁴ 、4×10⁴ 、5×10⁴ 、6×10⁴ 、7×10⁴ 、8×10⁴ 、9×10⁴ 、10⁵ 、2×10⁵ 、3×10⁵ 、4×10⁵ 、5×10⁵ 、6×10⁵ 、7×10⁵ 、8×10⁵ 、9×10⁵ 、或10⁶ 個細胞。

通常，用於製備核層的生物可降解材料的選擇與核層包裹的細胞的選擇是獨立的。因此，本發明生物磚的不同核層可以：(1)由相同的生物可降解材料或生物可降解材料的組合製成，且包裹相同的細胞或細胞組合；或者(2)由相同的生物可降解材料或生物可降解材料的組合製成，且包裹不同的細胞或細胞組合；或者(3)由不同的生物可降解材料或生物可降解材料的組合製成，且包裹相同的細胞或細胞組合；或者(4)由不同的生物可降解材料或生物可降解材料的組合製成，且包裹不同的細胞或細胞組合。然而，特別優選地，根據所使用的細胞或細胞組合以及預期的目的，選擇合適的生物可降解材料或生物可降解材料的組合來製備核層，以給細胞的生長、增殖、分化或遷移提供最佳的條件。

在某些優選的實施方案中，本發明的生物磚包括至少一個殼層。在某些優選的實施方案中，本發明的生物磚包括至少二個殼層。例如，本發明的生物磚可包括1個、2個、3個、4個、5個或更多個殼層。

在某些優選的實施方案中，本發明生物磚的各個殼層各自獨立地由上文所定義的生物可降解材料或生物可降解材料的組合製成。換言之，在本發明的生物磚包含至少二個殼層的情況下，各個殼層可以獨立地由相同或不同的生物可降解材料或生物可降解材料的組合製成。例如，如果本發明的生物磚包含2個殼層，那麼這2個殼層可以由相同的生物可降解材料或生物可降解材料的組合製成，也可以由不同的生物可降解材料或生物可降解材料的組合製成。如果本發明的生物磚包含3個殼層，那麼這3個殼層可以由相同的生物可降解材料或生物可降解材料的組合製成；或者可以由3種不同的生物可降解材料或生物可降解材料的組合製成；或者其中的2個殼層由相同的生物可降解材料或生物可降解材料的組合製成，且第3個殼層由另一種生物可降解材料或生物可降解材料的組合製成。在某些優選的實施方案中，本發明生物磚的各個殼層具有不同的組成成分。

在某些優選的實施方案中，本發明生物磚的各個殼層各自任選地經過處理(例如使用殼層固定液進行處理，例如，以改善殼層的力學性能)。在某些優選的實施方案中，本發明生物磚的各個殼層均經過處理。在某些優選的實施方案中，位於本發明生物磚最外側的殼層經過處理。

本發明生物磚中的核層和殼層的數量和排布方式不受特別的限制。然而，特別優選地，生物磚的最外側包含至少一個殼層。在某些優選的實施方案中，本發明的生物磚包括一個核層和一個殼層。在某些優選的實施方案中，本發明的生物磚包括一個核層和2個或更多個殼層。在某些優選的實施方案中，本發明的生物磚包括2個或更多個核層和一個殼層。在某些優選的實施方案中，本發明的生物磚包括至少2個核層和至少2個殼層。在某些優選的實施方案中，本發明的生物磚由內到外依次包括，核層、第一殼層、和第二殼層。在某些優選的實施方案中，本發明的生物磚由內到外依次包括，第一核層、第二核層、和殼層。在某些優選的實施方案中，本發明的生物磚由內到外依次包括，第一核層、第二核層、第一殼層、和第二殼層。在某些優選的實施方案中，本發明的生物磚由內到外依次包括，第一核層、第一殼層、第二核層、和第二殼層。本說明書的圖1A-1E示意性描述了本發明生物磚的多種結構。

在另一個方面，本發明提供了多種分離的生物磚。在某些優選的實施方案中，本發明提供了多種分離的生物磚，其中所述生物磚是彼此分離的。在某些優選的實施方案中，本發明提供了多種分離的生物磚，並且其中至少兩種分離的生物磚是不同的。在某些優選的實施方案中，每種分離的生物磚各自包含不同的試劑或試劑組合，所述試劑或試劑組合促進細胞增殖、分化、遷移、新陳代謝、分泌或其任何組合。在某些優選的實施方案中，每種分離的生物磚各自包含至少一種幹細胞。在某些優選的實施方案中，每種分離的生物磚各自包含不同類型的幹細胞。在某些優選的實施方案中，多種分離的生物磚各自包含相同的幹細胞。在某些優選的實施方案中，所述多種分離的生物磚各自包含在不同的容器中。在某些優選的實施方案中，所述多種分離的生物磚提供於單個容器中。合適的容器包括但不限於，皿(例如組織培養皿或細胞培養皿)，瓶，管(例如試管，離心管，微量離心管等)，多孔板的孔等。在某些優選的實施方案中，所述多種分離的生物磚用於平行測定或高通量測定中。

在另一個方面，本發明提供了包含多種分離的生物磚的容器。在某些優選的實施方案中，所述容器還包含液體或半液體組合物。在某些優選的實施方案中，所述液體或半液體組合物包含無機鹽，培養基，緩衝劑，或用於培養所述生物磚或使用所述生物磚來進行實驗的其他組分。在某些優選的實施方案中，所述液體或半液體組合物包含能夠促進細胞增殖、分化、遷移、新陳代謝、分泌或信號傳導的試劑或試劑組合。在某些優選的實施方案中，所述液體或半液體組合物包含促進生物磚分離的化合物(例如表面活性劑)。在某些優選的實施方案中，所述液體或半液體組合物包含穩定劑或防腐劑。在某些優選的實施方案中，所述生物磚分散於所述液體或半液體組合物中。

在某些優選的實施方案中，所述容器包含至少兩種不同的分離的生物磚。不同的生物磚可在下述的一個或多個方面存在差異：生物磚的尺寸；生物磚的形狀；所包含的細胞數目；所包含的細胞的類型；核層的組成(包括組分的類型和含量)；殼層的組成(包括組分的類型和含量)；核層和/或殼層中包含的額外試劑(包括類型和含量)；和/或，上文論述的任何其他參數。在某些優選的實施方案中，每種分離的生物磚各自包含不同的試劑或試劑組合，所述試劑或試劑組合促進細胞增殖、分化、遷移、新陳代謝、分泌或其任何組合。在某些優選的實施方案中，每種分離的生物磚各自包含至少一種幹細胞。在某些優選的實施方案中，每種分離的生物磚各自包含不同類型的幹細胞。在某些優選的實施方案中，所述多種分離的生物磚各自包含相同的幹細胞。在某些優選的實施方案中，所述多種分離的生物磚各自包含在不同的容器中。在某些優選的實施方案中，所述多種分離的生物磚提供於單個容器中。在某些優選的實施方案中，所述容器選自但不限於，皿(例如組織培養皿或細胞培養皿)，瓶，管(例如試管，離心管，微量離心管等)，多孔板的孔等。

在某些優選的實施方案中，所述多種分離的生物磚用於組織工程。在某些優選的實施方案中，所述多種分離的生物磚用於體外或體內測定。在某些優選的實施方案中，所述多種分離的生物磚用於研究細胞信號傳導。在某些優選的實施方案中，所述多種分離的生物磚用於研究幹細胞分化。

在另一個方面，本發明提供了一種組合物，其包含本發明的生物磚。在某些優選的實施方案中，本發明的組合物包含生物磚和載體(所述載體優選包含生物黏合劑)。特別優選地，此類組合物可用作生物墨汁，用於生物列印。因此，在某些優選的實施方案中，本發明提供了一種生物墨汁，其包含本發明的生物磚，以及任選的載體(所述載體優選包含生物黏合劑)。在某些優選的實施方案中，所述載體包含生物黏合劑，或者由生物黏合劑組成。在某些優選實施方案中，本發明的生物墨汁用於生物列印。

在某些優選的實施方案中，所述載體(例如生物黏合劑)及其降解產物對於細胞是無毒的，和/或對於宿主是非免疫原性的。在某些優選的實施方案中，所述載體(例如生物黏合劑)包含生物可降解材料。在某些優選的實施方案中，所述載體(例如生物黏合劑)中的生物可降解材料是生物相容性的。

在某些優選的實施方案中，所述載體(例如生物黏合劑)中的生物可降解材料的降解能夠提供維持或促進生物磚內的細胞的生命活動的微環境，例如營養物質。在某些優選的實施方案中，降解產物為小分子化合物，例如有機酸、單糖(例如葡萄糖)、寡糖、氨基酸、脂質等。此類降解產物可參與到細胞的新陳代謝活動中(例如用於合成細胞外基質)，用於合成細胞外基質或轉化為活動所需的能量。

在某些優選的實施方案中，所述載體(例如生物黏合劑)中的生物可降解材料是天然存在的(例如來源於動植物的天然存在的生物可降解材料，例如膠原蛋白，纖維蛋白，殼聚糖，海藻酸鹽，澱粉，透明質酸，層黏連蛋白，瓊脂糖，明膠，葡聚糖，以及其任意組合)，人工合成的，重組產生的，經過改性的，或者其任何組合。

在某些優選的實施方案中，所述載體(例如生物黏合劑)中的生物可降解材料是天然存在的可降解聚合物。優選地，所述可降解聚合物選自膠原蛋白，纖維蛋白，殼聚糖，海藻酸鹽，澱粉，透明質酸，層黏連蛋白，明膠，葡聚糖，彈性蛋白，以及其任意組合。

在某些優選的實施方案中，所述載體(例如生物黏合劑)中的生物可降解材料是經過改性的可降解聚合物，例如經過改性的海藻酸鹽，例如氧化海藻酸鹽(例如氧化海藻酸鈉)。

在某些優選的實施方案中，所述載體(例如生物黏合劑)中的生物可降解材料是合成的可降解聚合物。此類可降解聚合物包括但不限於，聚磷腈，聚丙烯酸及其衍生物(例如聚甲基丙烯酸，丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物)，聚乳酸(PLA)，聚羥基乙酸(PGA)，聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)，聚原酸酯(POE)，聚己內酯(PCL)，聚羥基丁酸酯(PHB)，聚氨基酸(例如聚賴氨酸)，可降解性聚氨酯，以及其任何組合。

在某些優選的實施方案中，所述載體(例如生物黏合劑)中的生物可降解材料選自膠原、纖維蛋白、殼聚糖、海藻酸鹽(例如海藻酸鈉或海藻酸鈣)、氧化海藻酸鹽(例如氧化海藻酸鈉)、澱粉、透明質酸、層黏連蛋白、彈性蛋白、明膠、聚氨基酸(例如聚賴氨酸)、瓊脂糖、葡聚糖、甲基纖維素、氧化海藻酸鹽、聚乙烯醇、聚丙烯酸及其衍生物(例如聚丙烯酸或其酯、聚甲基丙烯酸或其酯)、聚丙烯醯胺、聚N-取代丙烯醯胺或其任何組合。在某些優選的實施方案中，所述載體(例如生物黏合劑)包含海藻酸鈉。在某些優選的實施方案中，所述載體(例如生物黏合劑)包含海藻酸鹽(例如海藻酸鈉或海藻酸鈣)和氧化海藻酸鹽(例如氧化海藻酸鈉)。在某些優選的實施方案中，海藻酸鹽(例如海藻酸鈉或海藻酸鈣)和氧化海藻酸鹽(例如氧化海藻酸鈉)在載體中的重量比為約10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、或1:10。在某些優選的實施方案中，海藻酸鹽(例如海藻酸鈉或海藻酸鈣)和氧化海藻酸鹽(例如氧化海藻酸鈉)在載體中的重量比為10:1-9:1、9:1-8:1、8:1-7:1、7:1-6:1、6:1-5:1、5:1-4:1、4:1-3:1、3:1-2:1、2:1-1:1、1:1-1:2、1:2-1:3、1:3-1:4、1:4-1:5、1:5-1:6、1:6-1:7、1:7-1:8、1:8-1:9、1:9-1:10、10:1-5:1、5:1-1:1、1:1-1:5、1:5-1:10、2:1-1:2、4:1-1:4、或10:1-1:10。

在某些優選的實施方案中，與生物磚的核層或殼層相比，所述載體(例如生物黏合劑)以不同的濃度包含相同的生物可降解材料，或者以不同的重量比包含相同的生物可降解材料的組合。在某些優選的實施方案中，與生物磚的核層或殼層相比，所述載體(例如生物黏合劑)包含不同的生物可降解材料。

在某些優選的實施方案中，所述載體還包含水，無機鹽，pH緩衝劑，穩定劑，防腐劑，或其任何組合。

在某些優選的實施方案中，所述載體(例如生物黏合劑)促進生物磚在構建體(例如三維構建體，組織前體，或組織)上的安置，和/或將生物磚固定在構建體(例如三維構建體，組織前體，或組織)上。

在某些優選的實施方案中，載體(例如生物黏合劑)為液體或半液體(例如凝膠)。在某些優選的實施方案中，所述載體(例如生物黏合劑)的黏度為1-1000 Pa∙s，例如30-160 Pa∙s。在某些優選的實施方案中，所述載體(例如生物黏合劑)的黏度為約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25、30、50、80、100、200、300、400、500、800、或1000 Pa∙s。在某些優選的實施方案中，所述載體(例如生物黏合劑)的黏度為1-2、2-3、3-4、4-5、5-6、6-7、7-8、8-9、9-10、10-12、12-14、14-16、16-18、18-20、20-25、25-30、30-50、50-80、80-100、100-200、200-300、300-400、400-500、500-800、或800-1000、1-3、3-8、8-16、3-10、10-20、20-50、50-160 Pa∙s、或30-160Pa∙s。

在某些優選的實施方案中，所述組合物(例如生物墨汁)由或者基本上由本發明的生物磚組成。在某些優選的實施方案中，所述組合物(例如生物墨汁)包含至少約50%的生物磚(按重量計，w/w)。在某些優選的實施方案中，所述組合物(例如生物墨汁)包含至少約10%、20%、30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、或99%的生物磚(w/w)。在某些優選的實施方案中，所述組合物(例如生物墨汁)包含10%-20%、20%-30%、30%-40%、40%-50%、50%-55%、55%-60%、60%-65%、65%-70%、70%-75%、75%-80%、80%-85%、85%-90%、90%-95%、95%-100%、50%-60%、60%-70%、70%-80%、80%-90%、90%-100%、50%-75%、75%-100%、或50%-100%的生物磚(w/w)。在某些優選的實施方案中，除了生物磚中包含的液體之外，所述組合物(例如生物墨汁)基本上不含液體，例如具有少於約1%、2.5%、5%、7.5%、或10%的液體。

在某些優選的實施方案中，所述組合物(例如生物墨汁)包含一種或多種生物磚。在某些優選的實施方案中，所述組合物(例如生物墨汁)包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10種生物磚。不同類型的生物磚可在下述的一個或多個方面存在差異：生物磚的尺寸；生物磚的形狀；所包含的細胞數目；所包含的細胞的類型；核層的組成(包括組分的類型和含量)；殼層的組成(包括組分的類型和含量)；核層和/或殼層中包含的額外試劑(包括類型和含量)；和/或，上文論述的任何其他參數。

在某些優選的實施方案中，所述組合物(例如生物墨汁)中的生物磚的平均尺寸(即，本文所定義的直徑)為約20、30、50、100、120、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、1500、或2000 μm。在某些優選的實施方案中，所述組合物(例如生物墨汁)中的生物磚的平均尺寸為20-30、30-50、50-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-600、600-700、700-800、800-900、900-1000、1000-1500、1500-2000、20-50、20-100、100-200、200-400、500-600、600-800、800-1000、1000-2000、20-100、100-500、500-1000、300-800、30-50、30-200、30-500、30-1000、30-2000、或20-2000 μm。在某些優選的實施方案中，所述組合物(例如生物墨汁)中的生物磚的尺寸的變異程度小於生物磚的平均尺寸的1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、或35%。在某些優選的實施方案中，所述組合物(例如生物墨汁)中的生物磚所包含的細胞的平均數目為至少1、2、4、6、8、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、400、500、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10⁴ 、2×10⁴ 、3×10⁴ 、4×10⁴ 、5×10⁴ 、6×10⁴ 、7×10⁴ 、8×10⁴ 、9×10⁴ 、10⁵ 、2×10⁵ 、3×10⁵ 、4×10⁵ 、5×10⁵ 、6×10⁵ 、7×10⁵ 、8×10⁵ 、9×10⁵ 、或10⁶ 個細胞。在某些優選的實施方案中，所述組合物(例如生物墨汁)中的生物磚所包含的細胞的平均數目為1-2、2-4、4-6、6-8、8-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100、100-150、150-200、200-300、300-400、400-500、500-1000、1000-2000、2000-3000、3000-4000、4000-5000、5000-10⁴ 、10⁴ -2×10⁴ 、2×10⁴ -3×10⁴ 、3×10⁴ -4×10⁴ 、4×10⁴ -5×10⁴ 、5×10⁴ -10⁵ 、10⁵ -2×10⁵ 、2×10⁵ -3×10⁵ 、3×10⁵ -4×10⁵ 、4×10⁵ -5×10⁵ 、5×10⁵ -10⁶ 、1-10、2-10、2-5、5-10、10-20、20-30、30-50、2-25、25-50、2-50、50-100、100-200、50-250、250-500、500-2000、2-100、2-500、2-2000個細胞。在某些優選的實施方案中，在本發明的組合物(例如生物墨汁)中，相同類型的生物磚之間細胞數目的變異程度小於相同類型的生物磚的平均細胞數目的1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、或35%。

在某些優選的實施方案中，通過將多種生物磚混合而製備本發明的組合物(例如生物墨汁)。在某些優選的實施方案中，通過將一種或多種生物磚與上文論述的載體(例如生物黏合劑)混合而製備本發明的組合物(例如生物墨汁)。在某些優選的實施方案中，本發明的組合物(例如生物墨汁)是在無菌條件下製備的。在某些優選的實施方案中，本發明的組合物(例如生物墨汁)是在GMP工作間中製備的。在某些優選的實施方案中，本發明的組合物(例如生物墨汁)在即將使用前被製備。在某些優選的實施方案中，本發明的組合物(例如生物墨汁)在製備後儲存於4ºC，例如儲存3小時、6小時、12小時、1天、2天、或3天。在某些優選的實施方案中，本發明的組合物(例如生物墨汁)用於生物列印構建體(例如三維構建體，組織前體，組織)。在某些優選的實施方案中，本發明的組合物(例如生物墨汁)與其他生物相容性材料，墨汁或組合物一起用於生物列印。

如上文所描述的，本發明生物磚的殼層是通透性的。因此，在某些優選的實施方案中，載體(例如生物黏合劑)可包含額外的試劑，例如，營養物質、細胞外基質、細胞因子和/或藥物活性成分。優選地，所述額外的試劑能夠調控(例如促進)細胞的增殖、分化、遷移、分泌和/或新陳代謝。在某些優選的實施方案中，所述載體(例如生物黏合劑)包含至少一種(例如1、2、3、4、5或更多種)能夠調控(例如促進)細胞的增殖、分化、遷移、分泌和/或新陳代謝的額外的試劑。在某些優選的實施方案中，所述載體(例如生物黏合劑)能夠以受控的方式釋放所述額外的試劑。

在某些優選的實施方案中，所述載體(例如生物黏合劑)可包括，維持或促進細胞的生命活動的營養物質(包括但不限於，核苷酸，氨基酸，多肽，碳水化合物(例如單糖，寡糖，多糖)，脂質，維生素，細胞培養基等等)。在某些優選的實施方案中，所述載體(例如生物黏合劑)可包括，改善或調控細胞的生命活動的物質，例如細胞因子，細胞外基質，抗凋亡劑，抗氧化劑，藥物活性成分，或其任何組合。

在某些優選的實施方案中，本發明的組合物(例如生物墨汁)包含，上文所描述的含有內皮細胞的生物磚。

在某些優選的實施方案中，本發明的組合物(例如生物墨汁)包含，上文所描述的含有MSC細胞和誘導MSC向成骨細胞或骨分化的誘導因子的生物磚。優選地，在此類組合物中，所述載體(例如生物黏合劑)也包含誘導MSC向成骨細胞或骨分化的誘導因子。

在某些優選的實施方案中，本發明的組合物(例如生物墨汁)包含，上文所描述的含有MSC細胞和誘導MSC向成軟骨細胞或軟骨分化的誘導因子的生物磚。優選地，在此類組合物中，所述載體(例如生物黏合劑)也包含誘導MSC向成軟骨細胞或軟骨分化的誘導因子。

本發明的組合物(例如生物墨汁)可以包含一種類型的生物磚(其也被稱為均質或單型墨汁)，或者可以包含超過一種類型的生物磚(其也被稱為異質或多型墨汁)。在某些優選的實施方案中，本發明的生物墨汁包含至少約10% (w/w)、至少約20% (w/w)、至少約30% (w/w)、至少約40% (w/w)、至少約50% (w/w)、至少約60% (w/w)、至少約70% (w/w)、至少約80% (w/w)、至少約90% (w/w)的生物磚。在某些優選的實施方案中，本發明的生物墨汁包含10%-90% (w/w)，20%-80% (w/w)，30%-70% (w/w)，40%-60% (w/w)，例如約50%的生物磚。

在某些優選的實施方案中，本發明的組合物(例如生物墨汁)為液體，半固體(例如凝膠)或固體組合物，例如溶液，懸浮液，凝膠，或濃縮物。在某些優選的實施方案中，本發明的載體(例如生物黏合劑)和/或組合物(例如生物墨汁)的黏度為1-1000 Pa∙s，例如30-160 Pa∙s，例如40-120 Pa∙s，50-150 Pa∙s，80-100 Pa∙s。在某些優選的實施方案中，本發明的組合物(例如生物墨汁)是可擠出的組合物。由此，本發明的組合物(例如生物墨汁)能夠被用於生物列印，以產生特定的平面和/或層狀幾何形狀；並且優選地，所產生的平面和/或層狀幾何形狀能夠進一步堆疊，從而形成具有特定形狀和結構的構建體(例如三維構建體)。因此，本發明的組合物(例如生物墨汁)可用於形成構建體(例如三維構建體，組織前體，組織或器官)。

本發明的生物磚可使用各種方法來製備。例如，在某些優選的實施方案中，可使用用於製造微球體的方法來製備本發明的生物磚，例如使用製備微球體的儀器，例如造粒儀來進行製備。

因此，在另一個方面，本發明提供了用於製備本發明的生物磚的方法，其包括下述步驟： (1)提供一種或多種核層材料，所述核層材料各自獨立地由生物可降解材料製成，並且各自獨立地包裹相同或不同的細胞或細胞組合； (2)提供一種或多種殼層材料，所述殼層材料各自獨立地由生物可降解材料製成； (3)從步驟(1)所述的一種或多種核層材料中選擇一種核層材料，並將其顆粒化，從而獲得第一核層； (4)任選地，使用來自步驟(1)的一種核層材料或使用來自步驟(2)的一種殼層材料對前一步驟獲得的產物進行包覆； (5)任選地，重複步驟(4)一次或數次； (6)使用來自步驟(2)的一種殼層材料對前一步驟的產物進行包覆，從而產生所述生物磚。

在某些優選的實施方案中，在步驟(1)中，將細胞、用於形成核層的生物可降解材料和任選的期望的額外試劑(例如，營養物質、細胞外基質、細胞因子和/或藥物活性成分)均勻混合，從而獲得核層材料。

在某些優選的實施方案中，在步驟(2)中，至少一種殼層材料包含氧化的海藻酸鹽，並且，步驟(4)-(6)使用的殼層材料中的至少一種包含氧化的海藻酸鹽。

在某些優選的實施方案中，步驟(2)所述的殼層材料不包含細胞。

在某些優選的實施方案中，在步驟(3)-(6)中，使用製備微球體的儀器，例如造粒儀來進行顆粒化和包覆。

在某些優選的實施方案中，在每一次進行步驟(4)之後，如果所獲得的產物的最外層包覆為殼層材料，則任選地進行下述步驟：對最外層包覆進行處理(例如使用殼層固定液進行處理，例如，以改善殼層的力學性能)。

在某些優選的實施方案中，在步驟(6)之後，對所獲得的生物磚的最外側殼層進行處理(例如使用殼層固定液進行處理，例如，以改善殼層的力學性能)。

在某些優選的實施方案中，在步驟(6)中，使用來自步驟(2)的包含氧化的海藻酸鹽的殼層材料對前一步驟的產物進行包覆。在某些優選的實施方案中，在步驟(4)-(6)中，僅步驟(6)使用的殼層材料包含氧化的海藻酸鹽。

在某些優選的實施方案中，所述方法在無菌條件下進行。在某些優選的實施方案中，所述方法在GMP工作間裡進行。在某些優選的實施方案中，在即將使用前，利用本發明方法製備生物磚。在某些優選的實施方案中，所述方法在步驟(6)之後，將獲得的生物磚儲存於4ºC，例如儲存3小時、6小時、12小時、1天、2天、或3天。

在某些優選的實施方案中，所述核層材料能夠為細胞的生命活動提供微環境(例如，營養物質)。在某些優選的實施方案中，所述核層材料各自獨立地由生物可降解材料製成，並且所述生物可降解材料是生物相容性的。在某些優選的實施方案中，用於製備核層材料的生物可降解材料是天然存在的(例如來源於動植物的天然存在的生物可降解材料)，人工合成的，重組產生的，經過改性的，或者其任何組合。

在某些優選的實施方案中，用於製備核層材料的所述生物可降解材料包含：天然存在的可降解聚合物，例如膠原蛋白，纖維蛋白，殼聚糖，海藻酸鹽(例如海藻酸鈉)，澱粉，透明質酸，層黏連蛋白，瓊脂糖，明膠，葡聚糖，以及其任意組合；和/或，經過改性的可降解聚合物，例如經過改性的海藻酸鹽，例如氧化海藻酸鹽(例如氧化海藻酸鈉)；和/或，合成的可降解聚合物，例如聚磷腈，聚丙烯酸及其衍生物(例如聚甲基丙烯酸，丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物)，聚乳酸(PLA)，聚羥基乙酸(PGA)，聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)，聚原酸酯(POE)，聚己內酯(PCL)，聚羥基丁酸酯(PHB)，聚氨基酸(例如聚賴氨酸)，可降解性聚氨酯，以及其任何組合。

在某些優選的實施方案中，用於製備核層材料的所述生物可降解材料能夠被酶(例如細胞分泌的酶)所降解。在某些優選的實施方案中，用於製備核層材料的所述生物可降解材料在不超過2個月的時間內降解，例如在不超過1個月的時間內降解，例如在不超過30天、不超過25天、不超過20天、不超過15天、不超過10天、不超過5天、不超過4天、不超過3天、不超過2天、或不超過1天的時間內降解。例如，用於製備核層材料的所述生物可降解材料可以在1-2天，2-3天，3-4天，4-5天，5-10天，10-15天，15-20天，20-25天，25-30天，或30-60天的時間內降解。在某些優選的實施方案中，所述核層材料的降解能夠提供維持或促進所述細胞的生命活動的營養物質。

在某些優選的實施方案中，用於製備核層材料的所述生物可降解材料含有細胞外基質或其類似物(例如膠原蛋白)。細胞外基質或其類似物(例如膠原蛋白)的使用能夠為生物磚內的細胞的生命活動(特別是細胞的生長、黏附、伸展，以及細胞間連接的建立)提供類似於體內的有利的微環境，從而是優選的。例如，在某些優選的實施方案中，用於製備核層材料的生物可降解材料為I型膠原或者含有I型膠原。

在某些優選的實施方案中，用於製備核層材料的所述生物可降解材料選自膠原蛋白(例如I型，II型，III型膠原蛋白)、纖維蛋白、殼聚糖、海藻酸鹽(例如海藻酸鈉)、氧化海藻酸鹽(例如氧化海藻酸鈉)、澱粉、透明質酸，層黏連蛋白，彈性蛋白，明膠、聚氨基酸(例如聚賴氨酸)、葡聚糖、瓊脂糖、可降解性聚氨酯，或其任何組合。優選地，所述核層材料包含I型膠原蛋白和/或海藻酸鹽，例如包含I型膠原蛋白和/或海藻酸鈉；或者，包含層黏連蛋白；或者，包含澱粉；或者，包含可降解性聚氨酯；或者，包含海藻酸鹽(例如海藻酸鈉)和氧化海藻酸鹽(例如氧化海藻酸鈉)。在某些優選的實施方案中，所述核層材料為凝膠狀。

在某些優選的實施方案中，所述殼層材料能夠為核層材料包裹的細胞提供力學保護。在某些優選的實施方案中，所述殼層材料各自獨立地具有0.01-0.4GPa的硬度，例如0.01-0.02、0.02-0.03、0.03-0.04、0.04-0.05、0.05-0.06、0.06-0.07、0.07-0.08、0.08-0.09、0.09-0.1、0.1-0.15、0.15-0.2、0.2-0.3、0.3-0.4、0.01-0.4、0.01-0.05、0.05-0.1、0.1-0.2、0.2-0.4、0.05-0.15、或0.06-0.1 GPa的硬度；和/或，具有0.01-100 MPa的彈性模量，例如0.01-0.05、0.05-0.1、0.1-0.5、0.5-0.8、0.8-1、1-1.2、1.2-1.4、1.4-1.6、1.6-1.8、1.8-2、2-2.4、2.4-2.8、2.8-3.2、3.2-4、4-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-80、80-100、0.5-4、0.5-1、1-1.5、1.5-2、2-3、0.8-1.6、1.4-2.4、0.8-3.2、0.01-100、1-100、10-100、或0.5-50 MPa的彈性模量。

在某些優選的實施方案中，所述殼層材料能夠為細胞的生命活動提供微環境，例如營養物質。在某些優選的實施方案中，所述殼層材料各自獨立地由生物可降解材料製成，並且所述生物可降解材料是生物相容性的。在某些優選的實施方案中，不同的殼層材料的組成成分不同。在某些優選的實施方案中，用於製備殼層材料的生物可降解材料是天然存在的(例如來源於動植物的天然存在的生物可降解材料)，人工合成的，重組產生的，經過改性的，或者其任何組合。

在某些優選的實施方案中，用於製備殼層材料的所述生物可降解材料包含：天然存在的可降解聚合物，例如膠原蛋白，纖維蛋白，殼聚糖，海藻酸鹽(例如海藻酸鈉或海藻酸鈣)，澱粉，透明質酸，層黏連蛋白，瓊脂糖，明膠，葡聚糖，以及其任意組合；和/或，經過改性的可降解聚合物，例如經過改性的海藻酸鹽，例如氧化海藻酸鹽(例如氧化海藻酸鈉)；和/或，合成的可降解聚合物，例如聚磷腈，聚丙烯酸及其衍生物(例如聚甲基丙烯酸，丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物)，聚乳酸(PLA)，聚羥基乙酸(PGA)，聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)，聚原酸酯(POE)，聚己內酯(PCL)，聚羥基丁酸酯(PHB)，聚氨基酸(例如聚賴氨酸)，可降解性聚氨酯，以及其任何組合。

在某些優選的實施方案中，用於製備殼層材料的所述生物可降解材料能夠被酶(例如細胞分泌的酶)所降解。在某些優選的實施方案中，用於製備殼層材料的所述生物可降解材料在不超過1個月的時間內降解，例如在不超過30天、不超過25天、不超過20天、不超過15天、不超過10天、不超過5天、不超過4天、不超過3天、不超過2天、或不超過1天的時間內降解。例如，用於製備殼層材料的所述生物可降解材料可以在1-2天，2-3天，3-4天，4-5天，5-10天，10-15天，15-20天，20-25天，或25-30天的時間內降解。特別優選地，用於製備殼層材料的所述生物可降解材料在不超過10天的時間內降解。在某些優選的實施方案中，所述殼層材料的降解能夠提供維持或促進所述細胞的生命活動的營養物質。在某些優選的實施方案中，用於製備殼層材料的所述生物可降解材料含有細胞外基質或其類似物(例如彈性蛋白)。

在某些優選的實施方案中，用於製備殼層材料的所述生物可降解材料選自膠原蛋白(例如I型，II型，III型膠原蛋白)、纖維蛋白、殼聚糖、海藻酸鹽(例如海藻酸鈉或海藻酸鈣)、氧化海藻酸鹽(例如氧化海藻酸鈉)、澱粉、透明質酸，層黏連蛋白，彈性蛋白，明膠、聚氨基酸(例如聚賴氨酸)、葡聚糖、瓊脂糖，或其任何組合。

在某些優選的實施方案中，所述殼層材料包含海藻酸鹽(例如海藻酸鈉或海藻酸鈣)，例如包含海藻酸鈣和明膠，任選地還包含彈性蛋白；或者，包含氧化海藻酸鹽(例如氧化海藻酸鈉)；或者，包含海藻酸鹽(例如海藻酸鈉或海藻酸鈣)和氧化海藻酸鹽(例如氧化海藻酸鈉)；或者，包含海藻酸鹽(例如海藻酸鈉或海藻酸鈣)和瓊脂糖。

在某些優選的實施方案中，所述殼層材料各自獨立地為通透性的；例如，所述殼層材料對於水，氧氣，和營養物質(糖類例如葡萄糖，脂肪，蛋白質，氨基酸，短肽，礦物質，維生素、細胞因子、核苷酸)是通透性的。在某些優選的實施方案中，所述殼層材料對於分子量在5000 kDa以下的分子是通透的。例如，在某些實施方案中，所述殼層材料對於分子量在200 kDa以下或分子量在200 kDa-300 kDa、300 kDa-400 kDa、400 kDa-500 kDa、500 kDa-800 kDa、800 kDa-1000 kDa、1000 kDa-1500 kDa、1500 kDa-2000 kDa、2000 kDa-3000 kDa、3000 kDa-4000 kDa或4000 kDa-5000 kDa範圍內的分子是通透的。在某些實施方案中，所述殼層材料對於免疫球蛋白(例如IgG、IgM、IgA、IgD、IgE)是通透的。

在某些優選的實施方案中，所獲得的生物磚包括：細胞，包裹細胞的核層，和，封裝核層的殼層。在某些優選的實施方案中，所獲得的生物磚包括至少一個核層，例如1個、2個、3個、4個、5個或更多個核層。優選地，所獲得的生物磚包括至少2個核層。在某些優選的實施方案中，所獲得的生物磚包括至少一個殼層，例如1個、2個、3個、4個、5個或更多個殼層。優選地，所獲得的生物磚包括至少2個殼層。

在某些優選的實施方案中，所獲得的生物磚包括：一個核層和一個殼層；或者，一個核層和2個或更多個殼層；或者，2個或更多個核層和一個殼層；或者，至少2個核層和至少2個殼層。例如，在某些優選的實施方案中，所獲得的生物磚由內到外依次包括：核層和殼層；或者，核層、第一殼層、和第二殼層；或者，第一核層、第二核層、和殼層；或者，第一核層、第二核層、第一殼層、和第二殼層；或者，第一核層、第一殼層、第二核層、和第二殼層。

在某些優選的實施方案中，所獲得的生物磚具有一定的力學強度，從而能夠實現立體堆積。在某些優選的實施方案中，所獲得的生物磚具有0.01-0.4GPa的硬度，例如0.01-0.02、0.02-0.03、0.03-0.04、0.04-0.05、0.05-0.06、0.06-0.07、0.07-0.08、0.08-0.09、0.09-0.1、0.1-0.15、0.15-0.2、0.2-0.3、0.3-0.4、0.01-0.4、0.01-0.05、0.05-0.1、0.1-0.2、0.2-0.4、0.05-0.15、或0.06-0.1 GPa的硬度；和/或，具有0.01-100 MPa的彈性模量，例如0.01-0.05、0.05-0.1、0.1-0.5、0.5-0.8、0.8-1、1-1.2、1.2-1.4、1.4-1.6、1.6-1.8、1.8-2、2-2.4、2.4-2.8、2.8-3.2、3.2-4、4-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-80、80-100、0.5-4、0.5-1、1-1.5、1.5-2、2-3、0.8-1.6、1.4-2.4、0.8-3.2、0.01-100、1-100、10-100、或0.5-50 MPa的彈性模量。

在某些優選的實施方案中，所獲得的生物磚的殼層各自獨立地具有用於生物磚內外物質交換的通道或孔。優選地，所述通道的直徑為至少10、20、50、100、150、200、250、300、350、400、或500 nm。優選地，所述孔的直徑為至少100、200、400、600、800、1000、1500、2000、4000、或5000 nm。

在某些優選的實施方案中，所獲得的生物磚的殼層的厚度各自獨立地為0.1-50 μm，例如0.1-0.5、0.5-1、1-2、2-5、5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-50、50-100、100-200、200-300、300-400、400-500、0.1-1、1-5、1-10、5-10、10-20、10-30、5-20、或1-20 μm。

在某些優選的實施方案中，所述核層材料和/或殼層材料各自獨立地還包含額外的試劑，例如，營養物質、細胞外基質、細胞因子和/或藥物活性成分。在某些優選的實施方案中，所述額外的試劑能夠調控(例如促進)細胞的增殖、分化、遷移、分泌和/或新陳代謝。

在某些優選的實施方案中，所述營養物質包括但不限於，核苷酸，氨基酸，多肽，碳水化合物(例如單糖，寡糖，多糖)，脂質，維生素。

在某些優選的實施方案中，所述細胞外基質選自多糖，例如糖胺聚糖、蛋白聚糖；結構蛋白，例如膠原和彈性蛋白；黏著蛋白，例如纖黏連蛋白和層黏連蛋白。

在某些優選的實施方案中，所述細胞因子可以是用於調控細胞的增殖、分化、遷移、分泌和/或新陳代謝的細胞因子，包括但不限於： - 與細胞生長相關的細胞因子，例如胰島素、類胰島素生長因子(如IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ)、轉化生長因子(如TGFα和TGFβ)、血管內皮生長因子、表皮生長因子、成纖細胞生長因子、血小板來源生長因子、骨肉瘤來源生長因子、生長激素釋放抑制因子、神經生長因子、白細胞介素(如IL-1、IL-1、IL-3)、紅細胞生長素、集落刺激因子、皮質醇、甲狀腺素，或其任何組合； - 與細胞分化相關的細胞因子，例如Oct3/4，Sox2，Klf4，c-Myc，GATA4，TSP1，β-甘油磷酸鈉，地塞米松，維生素C，胰島素，IBMX，吲哚美鋅，血小板衍生生長因子BB(PDGF-BB)，5-氮雜胞苷，或其任何組合； - 與細胞遷移相關的細胞因子，例如環磷酸腺苷，三磷酸磷脂醯肌醇，基質細胞衍生因子-1、N-鈣黏蛋白，核因子κB，骨連接素，血栓素A2，Ras，或其任何組合；和/或 - 與細胞新陳代謝相關的細胞因子，例如胰島素生長因子1、TRIP-Br2、DKK-1、sRANKL、OPG、TRACP-5b、ALP、SIRT1(2-7)、PGC-1α，PGC-1β、OPG、IL-3、IL-4、IL-6、TGF-β、PGE2、G-CSF、TNF-α，或其任何組合。

在某些優選的實施方案中，所述藥物活性成分為能夠調控(例如促進)細胞的增殖、分化、遷移、分泌和/或新陳代謝的試劑。優選地，所述藥物活性成分選自rhIL-2、rhIL-11、rhEPO、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、G-CSF、GM-CSF、rHuEPO、sTNF-R1、和rhTNF-α。

在某些優選的實施方案中，所獲得的生物磚的核層各自獨立地包含一個或多個細胞，例如，1-10⁶ 個細胞，例如10-900、20-800、30-700、40-600、50-500、60-400、70-300、80-200、10-100個、10-10³ 個、10-10⁴ 個、10-10⁵ 個、10-10⁶ 個細胞。在某些優選的實施方案中，所述細胞為細菌、酵母、植物細胞或動物細胞，例如哺乳動物細胞，優選人細胞；優選地，所述細胞為黏附細胞，例如分化的黏附細胞或未分化的黏附細胞；優選地，所述細胞為多能幹細胞。在某些優選的實施方案中，所述細胞來源於選自下述的組織：結締組織(例如，疏鬆結締組織、緻密結締組織、彈性組織、網狀結締組織和脂肪組織)、肌肉組織(例如，骨骼肌、平滑肌和心肌)、泌尿生殖組織、胃腸組織、肺組織、骨組織、神經組織和上皮組織(例如，單層上皮和複層上皮)、內胚層來源的組織、中胚層來源的組織和外胚層來源的組織。在某些優選的實施方案中，所述細胞選自肌肉細胞(例如，骨骼肌細胞、心肌細胞、平滑肌細胞和成肌細胞)、結締組織細胞(例如，骨細胞、軟骨細胞、成纖維細胞以及分化為成骨細胞、軟骨細胞或淋巴組織的細胞)、骨髓細胞、內皮細胞、皮膚細胞、上皮細胞、乳腺細胞、血管細胞、血細胞、淋巴細胞、神經細胞、許旺細胞、胃腸細胞、肝細胞、胰細胞、肺細胞、氣管細胞、角膜細胞、泌尿生殖細胞、腎細胞、脂肪細胞、實質細胞、周細胞、間皮細胞、基質細胞、未分化的細胞(如幹細胞和祖細胞)、內胚層來源的細胞、中胚層來源的細胞、外胚層來源的細胞、癌來源的細胞，細胞系、誘導的多能幹細胞(iPS)、或其任何組合。

在某些優選的實施方案中，在步驟(1)中，至少一種核層材料包括內皮細胞(例如臍靜脈內皮細胞)；任選地，還包括未分化的細胞(例如幹細胞、祖細胞或其組合；例如MSC細胞)，和/或，額外細胞(例如肝細胞)。

在某些優選的實施方案中，在步驟(1)中，至少一種核層材料包括MSC細胞，並且，所述核層材料包含誘導MSC向成骨細胞或骨分化的誘導因子(例如，包含地塞米松、抗壞血酸和甘油磷酸)，或誘導MSC向成軟骨細胞或軟骨分化的誘導因子(例如，包含TGF-β3、地塞米松、2-磷酸抗壞血酸、丙酮酸鈉、脯氨酸和胰島素-轉鐵蛋白-硒溶液)。進一步優選地，在步驟(2)中，至少一種殼層材料還包含誘導MSC向成骨細胞或骨分化的誘導因子(例如，包含地塞米松、抗壞血酸和甘油磷酸)，或誘導MSC向成軟骨細胞或軟骨分化的誘導因子(例如，包含TGF-β3、地塞米松、2-磷酸抗壞血酸、丙酮酸鈉、脯氨酸和胰島素-轉鐵蛋白-硒溶液)。

在某些優選的實施方案中，所獲得的生物磚的尺寸為20-2000 μm，例如30-1900 μm，40-1800 μm，50-1700 μm，60-1600 μm，70-1500 μm，80-1400 μm，90-1300 μm，100-1200 μm，200-1000 μm，300-800 μm，400-600 μm，100-500 μm。

在某些優選的實施方案中，所獲得的生物磚為球形，或者任何期望的形狀(例如立方體，矩形棱柱，六棱柱，圓柱，或不規則的形狀)。在某些優選的實施方案中，所獲得的生物磚為固體或半固體，例如凝膠態。在某些優選的實施方案中，所獲得的生物磚以混合物的形式存在。在某些優選的實施方案中，所獲得的所述生物磚是分離的生物磚。在某些優選的實施方案中，所獲得的生物磚提供於容器中。

在某些優選的實施方案中，所獲得的生物磚具有如上文所描述的本發明生物磚的任一個或多個技術特徵。

在另一個方面，本發明提供了製備本發明生物磚的方法，其包括下述步驟： (1)將細胞與用於形成核層的生物可降解材料混合，以提供包裹細胞的核層材料；和 (2)將核層材料顆粒化，並使用用於形成殼層的生物可降解材料進行包覆，從而製備所述生物磚。

在某些優選的實施方案中，在步驟(1)中，將細胞、用於形成核層的生物可降解材料和任選的期望的額外試劑(例如，營養物質、細胞外基質、細胞因子和/或藥物活性成分)均勻混合。

在某些優選的實施方案中，在步驟(2)中，所述用於形成殼層的生物可降解材料包含氧化的海藻酸鹽。

在某些優選的實施方案中，在步驟(2)中，使用製備微球體或的儀器，例如造粒儀來進行顆粒化和包覆。

在某些優選的實施方案中，所述方法在步驟(2)之後還包括下述步驟：處理生物磚的殼層(例如使用殼層固定液，例如，以改善殼層的力學保護性能)。

在某些優選的實施方案中，本發明的方法在無菌條件下進行。在某些優選的實施方案中，本發明的方法在GMP工作間裡進行。在某些優選的實施方案中，在即將使用前，利用本發明方法製備生物磚。在某些優選的實施方案中，在步驟(2)之後，將獲得的生物磚儲存於4ºC，例如儲存3小時、6小時、12小時、1天、2天、或3天。

在另一個方面，本發明提供了通過上述方法獲得的生物磚。

在另一個方面，本發明提供了製備本發明的組合物(例如生物墨汁)的方法，其包括下述步驟：將本發明的生物磚與載體(例如生物黏合劑)混合。在某些優選的實施方案中，所述組合物(例如生物墨汁)和/或載體(例如生物黏合劑)具有如上所定義的任何一項或多項技術特徵。

在另一個方面，本發明提供了一種構建體，其包含本發明的生物磚或者使用本發明的生物磚或生物墨汁而製備。在某些優選的實施方案中，所述構建體是三維構建體，組織前體，組織或器官。在某些優選的實施方案中，所述構建體是活的構建體。

在某些優選的實施方案中，所述構建體是骨組織、軟骨組織、關節組織、或包含骨和軟骨的複合結構。對於此類構建體而言，其可包含，上文所描述的含有MSC細胞和誘導MSC向成骨細胞或骨分化的誘導因子的生物磚，和/或，上文所描述的含有MSC細胞和誘導MSC向成軟骨細胞或軟骨分化的誘導因子的生物磚。此類構建體可通過使用上文所描述的含有MSC細胞和誘導MSC向成骨細胞或骨分化的誘導因子的生物磚，和/或，上文所描述的含有MSC細胞和誘導MSC向成軟骨細胞或軟骨分化的誘導因子的生物磚而製備。

在某些優選的實施方案中，所述構建體是肝臟組織、或包含微血管的構建體。對於此類構建體而言，其可包含，上文所描述的含有內皮細胞的生物磚。類似地，此類構建體可通過使用上文所描述的含有內皮細胞的生物磚而製備。例如，可使用含有臍靜脈內皮細胞、肝臟細胞和幹細胞的生物磚來製備肝臟組織。或者，可使用含有臍靜脈內皮細胞和間充質幹細胞的生物磚來製備包含微血管的構建體。

在某些優選的實施方案中，所述構建體包含多個生物磚。在某些優選的實施方案中，所述生物磚以預定的模式排布。在某些優選的實施方案中，所述預定的模式基於天然組織或器官的結構和細胞分佈模式。在某些優選的實施方案中，所述構建體包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10種生物磚。在某些優選的實施方案中，所述生物磚包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10種不同的細胞類型。在某些優選的實施方案中，所述構建體(例如三維構建體，組織前體，組織或器官)的尺寸為至少30 μm、50 μm、100 μm、200 μm、500 μm、1 mm、2 mm、5 mm、1 cm、2 cm、5 cm、10 cm、20 cm、或50 cm。在某些優選的實施方案中，所述構建體被進一步培養以產生器官(例如心，肝，腎)或其功能單位。

在某些優選的實施方案中，所述構建體是通過生物列印而製備的。在某些優選的實施方案中，所述構建體的至少一個部分是生物列印的。生物列印的構建體一般通過使用快速原型技術的方法得到。快速原型技術是基於通過三維遞送裝置(例如生物印表機)將細胞/生物磚/生物墨汁和任選的限制材料向生物相容性表面(例如由水凝膠和/或多孔膜組成的生物相容性表面)上進行三維、自動化、電腦輔助的沉積。如本文中使用的，在用於指代組織和/或器官時，術語「工程化的」是指：根據電腦腳本，通過電腦輔助的裝置(例如生物印表機)，將細胞、細胞溶液、細胞懸浮液、包含細胞的凝膠或漿料、細胞濃縮物、多細胞聚集體、生物磚和它們的層放置以形成三維結構。在進一步的實施方案中，電腦腳本例如是一個或多個電腦程式、電腦應用或電腦模組。在更進一步的實施方案，通過細胞、多細胞體或生物磚的列印後融合來形成三維組織結構。

儘管有許多方法可以用來將細胞、多細胞聚集體、生物磚和/或它們的層佈置在生物相容性表面上以產生三維結構(例如手動放置)，但通過自動化的、電腦輔助的機器(例如生物印表機)來放置是有利的。採用生物印表機來遞送細胞、多細胞體、生物磚是有利的，其優點包括：快速、精確和可再現地放置細胞、多細胞體、生物磚以產生構建體，該構建體表現出具有各種組成的細胞、多細胞聚集體、生物磚和/或它們的層的計畫的或預先確定的取向或圖案。

在一些實施方案中，生物列印方法是連續的和/或基本連續的。連續生物列印方法的非限制性實例是：經由連接到生物墨汁儲存器的分配末端(例如，注射器、毛細管等)從生物印表機分配生物墨汁(例如與生物黏合劑或擠出化合物組合的生物磚)。在進一步的非限制性實施方案中，連續生物列印方法是按功能單元的重複圖案分配生物墨汁。在各個實施方案中，重複功能單元具有任何適宜的幾何形狀，包括例如：圓形、正方形、矩形、三角形、多邊形和不規則的幾何形狀，從而產生具有通過獨特生物墨汁和/或間隙空間的空間圖案化而獲得的平面幾何形狀的一個或多個組織層。在進一步的實施方案中，生物列印的功能單元的一個重複圖案包括一個層，相鄰地生物列印(例如堆疊)多個層以形成具有層狀幾何形狀的工程化組織或器官。在各個實施方案中，相鄰地生物列印(例如堆疊)了2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15個或更多個層，以形成工程化組織或器官。在進一步的實施方案中，具有層狀幾何形狀的組織的一個或多個層也具有平面幾何形狀。

除了噴墨生物列印技術之外，還可使用低溫沉降成型技術或紫外光固化成型技術，利用本發明的生物磚來構建三維構建體。關於噴墨生物列印技術、低溫沉降成型技術和紫外光固化成型技術的詳細描述，可參見例如，25thAnniversaryArticle: Engineering Hydrogels for Biofabrication，其通過引用以其全文併入本文。

因此，在某些優選的實施方案中，所述構建體具有預先確定的結構。特別地，可以以預先確定的模式，將本發明的生物磚用於列印或者堆疊，從而形成具有預先確定的結構的構建體。

在某些優選的實施方案中，所述構建體具有一層或多層結構。進一步優選的，每一個層結構各自由一層或多層生物磚構建。不同的結構層所使用的生物磚可以是相同或者不同的。例如，所述構建體可具有類似於血管的三層結構，即，內皮細胞層，平滑肌細胞層和成纖維細胞層。例如，所述構建體可具有兩層結構，即，包含含有MSC細胞和誘導MSC向成骨細胞或骨分化的誘導因子的生物磚的成骨層，和包含含有MSC細胞和誘導MSC向成軟骨細胞或軟骨分化的誘導因子的生物磚的成軟骨層。

在某些優選的實施方案中，所述構建體由生物磚內的細胞凝聚而形成。特別地，在本發明的實施方案中，生物磚的核層和殼層，以及載體(例如生物黏合劑)各自由生物可降解材料製成。因此，在生物列印後，在生物磚內部/外部各種活性物質的刺激下，生物磚內的細胞開始進行生長、增殖、分化、分泌和/或遷移；生物磚的核層和殼層以及載體(例如生物黏合劑)開始不斷降解；細胞之間逐步凝聚/融合，建立連接(包括生物磚內部的細胞連接，生物磚之間的細胞連接)；並且，細胞分泌的細胞外基質也相互融合形成一體；由此，列印後精確排布的所有細胞融合形成有機排列的、一體化的三維構建體(例如，具有生物學功能的組織或器官)。

在某些優選的實施方案中，所述構建體為微型組織塊。例如，此類微型組織塊的尺寸可以為微米至釐米級別，例如1 μm-1 cm，例如，10 μm-5 mm，50 μm-1 mm，100 μm-800 μm，300 μm-600 μm。在某些優選的實施方案中，微型組織塊的尺寸可以為至少30 μm、50 μm、100 μm、200 μm、500 μm、1 mm、2 mm、5 mm、1 cm、2 cm、5 cm、10 cm、20 cm、或50 cm。

在某些優選的實施方案中，所述構建體可進行進一步的培養。在某些優選的實施方案中，構建體的生物磚中的細胞生長，增殖，分化、分泌和/或遷移；並且生物磚的核層和/或殼層的生物可降解材料被至少部分降解。在某些優選的實施方案中，生物磚內的細胞在培養後增殖至少2、5、10、20、50、100、200、500、1000、2000、5000、10000、20000、50000、或100000倍。在某些優選的實施方案中，構建體的生物磚中包含幹細胞。優選地，所述幹細胞能夠分化產生至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10種不同的細胞。在某些優選的實施方案中，生物磚的核層和/或殼層的生物可降解材料被降解至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、或90%。在某些優選的實施方案中，在培養後，構建體中的不同生物磚之間的細胞彼此連接，並且生物磚的核層和/或殼層的生物可降解材料被至少部分降解。在某些優選的實施方案中，不同生物磚之間，至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、或90%的細胞彼此連接。在某些優選的實施方案中，載體(例如生物黏合劑)中的生物可降解材料被降解至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、或90%。在某些優選的實施方案中，核層和/或殼層和/或載體中的生物可降解材料的降解產物為細胞提供了營養物質或細胞外基質材料。在某些優選的實施方案中，所述構建體被培養至少0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、25、或30天，例如1-3、3-5、5-7、7-10、10-14、14-21、21-28、1-7、7-14、1-14、或14-28天，以獲得微型組織塊，組織前體、組織或器官。在某些優選的實施方案中，所述構建體在3D培養箱中進行培養。在某些優選的實施方案中，所述構建體在生物反應器中進行培養。在某些優選的實施方案中，在培養過程中對構建體施加物理刺激(例如壓力，剪切力，光照，加熱等)。在某些優選的實施方案中，在培養過程中對構建體施加化學刺激(例如激素，細胞因子，化學試劑等)。

使用本發明生物磚構建的三維構建體的一個實例的示意性結構示於圖2中。如圖2所示，該三維構建體包括三層結構，即，內皮細胞層，平滑肌細胞層和成纖維細胞層。其中，內皮細胞層由包含內皮細胞的生物磚構建；平滑肌細胞層由包含平滑肌細胞的生物磚構建；成纖維細胞層由包含成纖維細胞的生物磚構建。內皮細胞層，平滑肌細胞層和成纖維細胞層各自可以由一層或多層細胞構成，根據所使用的生物磚中含有的細胞的具體數量而定。生物磚之間的間隙填充有載體(其包含生物黏合劑)。在優選的實施方案中，載體可進一步包含維持、促進、改善、調控生物磚內的細胞的生命活動的試劑。例如，當生物磚中的細胞為內皮細胞時，載體中可進一步包含促進內皮細胞生長和分化的細胞因子。當生物磚中的細胞為平滑肌細胞時，載體中可進一步包含促進平滑肌細胞生長和分化的細胞因子。當生物磚中的細胞為成纖維細胞時，載體中可進一步包含促進成纖維細胞生長和分化的細胞因子。在某些優選的實施方案中，本發明的三維構建體是使用本發明的生物磚，通過3D生物列印方法而構建的。然而，不受於理論限制，本發明的三維構建體也可以使用本發明的生物磚，通過任何其他已知的方法(例如手工放置的方法)來構建。

在另一個方面，本發明提供了製備構建體，例如三維構建體，組織前體，組織或器官的方法，其包括，使用本發明的生物磚或本發明的包含生物磚的組合物(例如生物墨汁)的步驟。在某些優選的實施方案中，本發明的方法包括，使用本發明的生物磚或本發明的包含生物磚的組合物(例如生物墨汁)進行生物列印的步驟。在某些優選的實施方案中，本發明的方法產生了具有預定模式的構建體，例如三維構建體，人工組織或其前體。在某些優選的實施方案中，本發明的方法使用了一種組合物(例如生物墨汁)。在某些優選的實施方案中，本發明的方法使用了至少2種(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、或10種)組合物(例如生物墨汁)。不同類型的組合物(例如生物墨汁)可在下述的一個或多個方面存在差異：所包含的生物磚的類型；所包含的載體的類型；生物磚與載體的含量比；和/或不同類型的生物磚之間的含量比。在某些優選的實施方案中，本發明方法中的生物列印步驟是連續的和/或基本連續的。在某些優選的實施方案中，本發明方法包括，連續地生物列印多個層，以獲得具有預定模式的、包含多個層的三維構建體，其中每個層根據預定的模式用本發明的組合物(例如生物墨汁)進行生物列印。在某些優選的實施方案中，本發明方法包括，連續地生物列印多個區段，以獲得具有預定模式的、包含多個區段的三維構建體，其中每個區段根據預定的模式用本發明的組合物(例如生物墨汁)進行生物列印。在某些優選的實施方案中，組合物(例如生物墨汁)中的載體包含生物黏合劑，其將層、區段和/或構建體中的生物磚黏結在一起。在某些優選的實施方案中，組合物(例如生物墨汁)中的載體包含生物黏合劑，其將生物磚固定在層、區段和/或構建體中。在某些優選的實施方案中，所述預定的模式通過支架來限定。在某些優選的實施方案中，本發明的組合物(例如生物墨汁)被列印至支架上。優選地，所述支架具有預定的模式。在某些優選的實施方案中，所述支架為包含生物可降解材料的人工結構，其能夠支援組合物(例如生物墨汁)中的生物磚形成人工組織或組織前體。在某些優選的實施方案中，本發明的製備構建體的方法不使用支架。

在某些優選的實施方案中，使用上文所描述的含有MSC細胞和誘導MSC向成骨細胞或骨分化的誘導因子的生物磚，和/或，上文所描述的含有MSC細胞和誘導MSC向成軟骨細胞或軟骨分化的誘導因子的生物磚來製備構建體，例如骨組織、軟骨組織、關節組織、或包含骨和軟骨的複合結構。

在某些優選的實施方案中，使用上文所描述的含有內皮細胞的生物磚來製備構建體，例如肝臟組織、或包含微血管的構建體。例如，可使用含有臍靜脈內皮細胞、肝臟細胞和幹細胞的生物磚來製備肝臟組織。或者，可使用含有臍靜脈內皮細胞和間充質幹細胞的生物磚來製備包含微血管的構建體。

在某些優選的實施方案中，本發明的製備構建體的方法還包括，使用本發明的生物磚以及任選的載體(例如生物黏合劑)製備本發明的組合物(例如生物墨汁)的步驟。在某些優選的實施方案中，本發明的製備構建體的方法還包括，使用其他的生物相容性材料、墨汁或組合物進行生物列印。在某些優選的實施方案中，本發明的製備構建體的方法還包括，根據天然組織或器官的形狀和/或細胞排布模式，建立構建體(例如三維構建體)的結構模型。

本發明的製備構建體的方法與本領域已知的其他生物列印方法是相容的。例如，本發明的方法可用於Cyfuse、Organovo和EnvisionTEC開發的生物印表機。目前已開發了三種主要的生物印表機，即，噴墨型生物印表機，擠出型生物印表機和鐳射輔助型生物印表機(參見Murph SV and Atala A. (2014) Nature Biotechnology, 32 (8): 773-785)。備選地，本發明的製備構建體的方法可用於使用自動化或非自動化機械過程(而非印表機)的生物列印方法中，或者使用手工放置或手工沉積法(例如使用移液器)的生物列印方法中。在某些優選的實施方案中，通過噴墨方式來進行生物列印。在某些優選的實施方案中，通過擠出的方式來進行生物列印。在某些優選的實施方案中，通過手工放置或手工沉積來進行生物列印。

在某些優選的實施方案中，使用本發明的生物磚或組合物(例如生物墨汁)在體內進行生物列印。在某些優選的實施方案中，在受試者(例如人受試者)上直接進行生物列印。在某些優選的實施方案中，在受試者的組織(例如皮膚組織)的損傷位元點直接進行生物列印。在某些優選的實施方案中，所述組織因創傷，感染，疾病，或老齡化而遭致損傷。在某些優選的實施方案中，根據組織或組織損傷位元點的細胞分佈資訊，在受試者的組織(例如皮膚組織)的損傷位元點直接進行生物列印。在某些優選的實施方案中，所述細胞分佈資訊選自，組織或組織損傷位元點的各個細胞層的位置或類型，各個層的細胞的類型，各個層中不同細胞的比率，各個層中的細胞分佈模式，或其任何組合。在某些優選的實施方案中，在進行生物列印之前，獲得組織或組織損傷位元點的細胞分佈資訊。在某些優選的實施方案中，所述方法還包括，獲得組織或組織損傷位元點的細胞分佈資訊，然後根據所述細胞分佈資訊進行生物列印。在某些優選的實施方案中，用於在受試者上進行生物列印的組合物(例如生物墨汁)中的細胞來源於所述受試者。在某些優選的實施方案中，用於在受試者上進行生物列印的組合物(例如生物墨汁)中的細胞來源於與所述受試者具有相似或相同特徵(例如，物種，年齡，性別，遺傳信息等)的其他受試者。在某些優選的實施方案中，用於在受試者上進行生物列印的組合物(例如生物墨汁)中的細胞來源於同種異體。在某些優選的實施方案中，用於在受試者上進行生物列印的組合物(例如生物墨汁)中的細胞來源於細胞系。在某些優選的實施方案中，使用本發明的生物磚或組合物(例如生物墨汁)在體外進行生物列印。

本發明的製備構建體的方法不會對組合物(例如生物墨汁)中或生物磚內的細胞造成機械損傷。在某些優選的實施方案中，組合物(例如生物墨汁)中或生物磚內至少80%、85%、87.5%、90%、92.5%、95%、或98%的細胞在生物列印後存活。在某些優選的實施方案中，組合物(例如生物墨汁)中或生物磚內至少90%的細胞在生物列印後存活至少3小時、6小時、12小時、1天、2天、4天、或7天。在某些優選的實施方案中，組合物(例如生物墨汁)中或生物磚內至少80%、85%、87.5%、90%、92.5%、95%、或98%的細胞在生物列印後能夠增殖和/或分化。在某些優選的實施方案中，組合物(例如生物墨汁)中或生物磚內至少80%、85%、87.5%、90%、92.5%、95%、或98%的細胞在生物列印後具有正常的新陳代謝。在某些優選的實施方案中，組合物(例如生物墨汁)中或生物磚內至少80%、85%、87.5%、90%、92.5%、95%、或98%的細胞在生物列印後能夠遷移。在某些優選的實施方案中，組合物(例如生物墨汁)中或生物磚內至少80%、85%、87.5%、90%、92.5%、95%、或98%的細胞在生物列印後能夠分泌。

在某些優選的實施方案中，本發明的製備構建體的方法還包括，在允許生物磚內的細胞增殖、分化、遷移、分泌和/或新陳代謝的條件下，培養所獲得的構建體。培養條件取決於所使用的細胞類型，所使用的生物磚的類型，構建體的結構和形狀等等。本領域技術人員能夠選擇合適的培養條件，例如培養基，pH，溫度，CO₂ 水準和持續時間。一般的組織和細胞培養條件可參見例如，Doyle, Alan, and J. Bryan Griffiths, eds. Cell and tissue culture: laboratory procedures in biotechnology. New York: Wiley, 1998。在某些優選的實施方案中，培養所獲得的構建體至少0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、25、或30天，例如以獲得人工組織或其前體。在某些優選的實施方案中，培養所獲得的構建體1-3、3-5、5-7、7-10、10-14、14-21、21-28、1-7、7-14、1-14、或14-28天，例如以獲得人工組織或其前體。在某些優選的實施方案中，在3D培養箱中培養所獲得的構建體。在某些優選的實施方案中，在生物反應器中培養所獲得的構建體。在某些優選的實施方案中，在37ºC，5% CO₂ 的條件下培養所獲得的構建體。在某些優選的實施方案中，在培養過程中對構建體施加物理刺激(例如壓力，剪切力，光照，加熱等)。在某些優選的實施方案中，在培養過程中對構建體施加化學刺激(例如激素，細胞因子，化學試劑等)。在某些優選的實施方案中，生物磚的核層和/或殼層和/或載體中的生物可降解材料在培養過程中至少一部分被降解。優選地，此類生物可降解材料的降解產物為生物磚中的細胞提供了營養物質和/或細胞外基質。在某些優選的實施方案中，細胞在培養過程中的分泌物整合入構建體的細胞外基質中。在某些優選的實施方案中，生物磚內的細胞在培養過程中彼此連接。在某些優選的實施方案中，生物磚之間的細胞在培養過程中彼此連接。在某些優選的實施方案中，所述構建體在培養後具有高細胞密度(例如至少100、200、500、1000、2000、5000、10000、20000、50000、或100000細胞/mm³ )。在某些優選的實施方案中，生物磚內的細胞在培養後增殖至少2、5、10、20、50、100、200、500、1000、2000、5000、10000、20000、50000、或100000倍。

本發明方法所製備的構建體可具有任何預定的模式，例如任何預定的形狀。例如，所述構建體可以是片狀結構(例如長方形，正方形，圓形，橢圓形，六角形或不規則形狀的片狀結構)，或中空管狀結構，或中空三維結構(例如中空立方體，中空球體，中空的矩形棱柱體，中空圓柱體，或中空的不規則形狀的三維結構)，或實心三維結構(例如實心立方體，實心球體，實心矩形棱柱體，實心圓柱體，或實心不規則形狀的三維結構)，或其任何組合。在某些優選的實施方案中，所述構建體的形狀類比天然組織或器官的形狀。在某些優選的實施方案中，所述構建體的尺寸為至少30 μm、50 μm、100 μm、200 μm、500 μm、1 mm、2 mm、5 mm、1 cm、2 cm、5 cm、10 cm、20 cm、或50 cm。

與現有技術方法不同，在剛剛完成生物列印步驟之時，構建體中的不同生物磚之間的細胞彼此不互相連接。對構建體進行進一步培養將導致細胞首先在生物磚殼層內生長、增殖、分化、分泌和/或遷移；隨後在培養過程中，隨著生物磚內生物可降解材料(例如核層和殼層中的生物可降解材料)的降解，細胞可突破生物磚的殼層。由此，可在基於生物磚的構建體中實現精確的細胞排布，這進而使得能夠產生更加複雜的組織或器官。

在另一個方面，本發明提供了通過上述方法製備的構建體。在某些優選的實施方案中，所述構建體是三維構建體，組織前體，組織或器官；例如骨組織、軟骨組織、關節組織、包含骨和軟骨的複合結構、肝臟組織、或包含微血管的構建體。在某些優選的實施方案中，所述構建體是活的構建體。

在另一個方面，本發明提供了本發明的生物磚的用途，其例如用於培養細胞(例如用於細胞的三維培養，例如用於培養內皮細胞或幹細胞，例如臍靜脈內皮細胞或MSC細胞)；或用於使細胞生長、增殖、分化、分泌或遷移；或用於生物列印(例如3D生物列印)；或用於形成構建體(例如三維構建體)，例如組織前體、組織或器官；例如骨組織、軟骨組織、關節組織、包含骨和軟骨的複合結構、肝臟組織、或包含微血管的構建體。在某些優選的實施方案中，本發明的生物磚用於通過生物列印而製備構建體(例如三維構建體)，例如組織前體、組織或器官；例如骨組織、軟骨組織、關節組織、包含骨和軟骨的複合結構、肝臟組織、或包含微血管的構建體。

在另一個方面，本發明提供了本發明的組合物(例如生物墨汁)的用途，其用於生物列印(例如3D生物列印)；或用於形成構建體(例如三維構建體)，例如組織前體、組織或器官；例如骨組織、軟骨組織、關節組織、包含骨和軟骨的複合結構、肝臟組織、或包含微血管的構建體。在某些優選的實施方案中，本發明的組合物(例如生物墨汁)用於通過生物列印而製備構建體(例如三維構建體)，例如組織前體、組織或器官；例如骨組織、軟骨組織、關節組織、包含骨和軟骨的複合結構、肝臟組織、或包含微血管的構建體。

在另一個方面，本發明提供了本發明的生物磚或構建體(例如三維構建體，例如組織前體、組織或器官)的用途。本發明的生物磚或構建體可用於各種應用，例如用於研究領域或醫藥領域的應用。例如，本發明的生物磚或構建體可用於研究幹細胞(例如MSC細胞)分化，用於藥物發現，用於藥物篩選，用於體內或體外測定，用於植入宿主體內，用於組織工程或用於組織再生。本發明的生物磚或構建體還可用於製備試劑盒，所述試劑盒用於各種應用，例如用於研究領域或醫藥領域的應用。例如，本發明的生物磚或構建體可用於研究幹細胞(例如MSC細胞)分化，用於藥物發現，用於藥物篩選，用於體內或體外測定，用於植入宿主體內，用於組織工程或用於組織再生。

在某些優選的實施方案中，本發明的生物磚或構建體可用於組織工程。在某些優選的實施方案中，生物磚為生物磚內的細胞提供了獨特的微環境，從而允許研究培養條件(例如三維培養條件)的作用/影響，例如研究培養條件(例如三維培養條件)對細胞增殖、分化、新陳代謝、遷移、分泌、組織發育或器官生成的影響。在某些優選的實施方案中，本發明的構建體可用於研究幹細胞分化。

在某些優選的實施方案中，本發明的生物磚或構建體可用於體外測定。在某些優選的實施方案中，所述體外測定是用於檢測或測量物質(例如化學試劑，生化試劑，藥物等)在生物學樣品(例如細胞聚集體，組織，器官，生物體等)中的存在或活性的方法。在某些優選的實施方案中，所述體外測定是定性的。在某些優選的實施方案中，所述體外測定是定量的。示例性的體外測定包括但不限於，基於圖像的測定，分泌的蛋白質的測定，標誌物的表達和蛋白質的產生。在某些優選的實施方案中，體外測定用於檢測或測量下述中的一個或多個：分子結合(包括放射性配體結合)，分子攝取，活性(例如，酶活性和受體活性等)，基因表達，蛋白質表達，受體激動作用，受體拮抗作用，細胞信號傳導，細胞凋亡，化學敏感性，轉染，細胞遷移，趨化性，細胞活力，細胞增殖，安全性，有效性，新陳代謝，毒性和濫用傾向。在某些優選的實施方案中，體外測定是免疫測定，例如競爭性免疫測定和非競爭性免疫測定。在某些優選的實施方案中，體外測定是酶聯免疫吸附測定。在某些優選的實施方案中，本發明的生物磚或構建體提供了體外測定中測量或檢測的分子，細胞，細胞群或組織。在某些優選的實施方案中，體外測定用於基礎研究，以發現、開發或研究任何分子，細胞，或其結構或作用機制。體外測定的示例性應用包括但不限於，開發三維培養系統，研究信號傳導通路，幹細胞誘導和分化，細胞間相互作用等等。

在某些優選的實施方案中，本發明的生物磚或構建體可用於藥物篩選或藥物發現。在某些優選的實施方案中，本發明的生物磚或構建體用於製備細胞的陣列，微陣列或晶片，多細胞聚集體或組織，從而用於藥物篩選或藥物發現。在某些優選的實施方案中，本發明的生物磚或構建體存在於多孔容器的孔中。優選地，所述容器與自動化藥物篩選方法和/或裝置相容。在某些優選的實施方案中，本發明的生物磚或構建體用於藥物篩選或藥物發現，以研究或開發可用於治療疾病的藥物。優選地，所述疾病包括但不限於，感染性疾病，血液疾病，腫瘤疾病，兒科疾病，心血管疾病，中樞神經系統疾病，神經內科疾病，消化內科疾病，肝病科疾病，泌尿科疾病，不孕不育，眼科疾病，腎內科疾病，骨科疾病，疼痛，呼吸病，皮膚疾病，免疫疾病，精神疾病。

在某些優選的實施方案中，本發明的生物磚或構建體用於體內測定。在某些優選的實施方案中，本發明的生物磚或構建體用作受試者(例如動物模型)中的異種移植物。在某些優選的實施方案中，本發明的生物磚或構建體用作移植物，用於植入受試者體內。

在某些優選的實施方案中，本發明的生物磚或構建體用於分析細胞在體內響應刺激或試劑而產生的變化(例如形態變化或功能變化)。在此類實施方案中，將生物磚中的細胞暴露於所述刺激或試劑，和，評估生物磚中的細胞的變化(例如形態變化或功能變化)。在某些優選的實施方案中，所述生物磚位於受試者體內。

在某些優選的實施方案中，本發明的生物磚或構建體用於研究幹細胞分化。在某些優選的實施方案中，本發明的生物磚或構建體用於評估因子(例如，化學試劑，例如化合物；物理刺激，例如輻射或加熱)對組織或組織中的細胞的作用。在某些優選的實施方案中，本發明的生物磚或構建體用於三維組織培養。在某些優選的實施方案中，本發明的生物磚或構建體用於修復受試者中損傷組織。

在某些優選的實施方案中，本發明的生物磚用於直接在受試者中進行生物列印。在某些優選的實施方案中，根據組織的細胞分佈資訊來進行生物列印。在某些優選的實施方案中，所述生物磚被列印至受試者中的支架上。在某些優選的實施方案中，所述受試者是動物模型。

在某些優選的實施方案中，本發明的生物磚用於研究體內微環境的影響，因為生物磚中的細胞能夠在受試者體內增殖，分化，遷移，新陳代謝，分泌或發育。在某些優選的實施方案中，本發明的生物磚用於研究化合物(例如藥物)在體內對生物磚或構建體中的細胞的作用。

在某些優選的實施方案中，本發明的生物磚或構建體用於組織再生。在某些優選的實施方案中，本發明的生物磚或構建體用於體內組織或器官移植。在某些優選的實施方案中，本發明的生物磚或構建體用於保護、修復或替換受試者(例如人)體內的受損的，患病的或衰竭的組織或器官。在某些優選的實施方案中，本發明的生物磚或構建體用於生產細胞(例如幹細胞，祖細胞，前體細胞，免疫細胞等等)，以用於細胞療法。在某些優選的實施方案中，本發明的生物磚或構建體用於生產生物活性分子(例如激素，生長因子，細胞因子，配體等等)。優選地，所述生物活性分子可用於誘導接受本發明的生物磚或構建體或其產物(例如細胞或生物活性分子)的受試者(例如人)的組織再生。

在另一個方面，本發明提供了一種分析細胞(例如內皮細胞或幹細胞，例如臍靜脈內皮細胞或MSC細胞)響應刺激或試劑而產生的變化(例如形態變化或功能變化)的方法，其包括，將本發明的生物磚中細胞暴露於所述刺激或試劑，和，評估生物磚中的細胞的變化(例如形態變化或功能變化)。在某些優選的實施方案中，所述細胞功能包括但不限於，細胞活性，細胞行為，亞細胞的細胞器動態和活性，細胞內的分子的功能和活性。細胞功能的實例包括但不限於，增殖，存活，基因表達，毒性，分化，新陳代謝，遷移，分泌，信號傳導，細胞凋亡，壞死，死亡，趨化作用，分子定位，分子結合等。在某些優選的實施方案中，在所述生物磚的核層中提供所述刺激或試劑。在某些優選的實施方案中，所述生物磚是分離的生物磚。在某些優選的實施方案中，所述分離的生物磚提供於容器中。在某些優選的實施方案中，所述刺激或試劑提供於容器中。在某些優選的實施方案中，在所述方法中，平行地(例如同時)和/或以高通量的方式分析多個分離的生物磚。在某些優選的實施方案中，所述生物磚被置於受試者體內。在某些優選的實施方案中，所述刺激或試劑是藥物。在某些優選的實施方案中，所述方法用於測定所述藥物的功效。在某些優選的實施方案中，所述方法用於篩選藥物。在某些優選的實施方案中，所述生物磚中的細胞來源於需要所述藥物的受試者。

在另一個方面，本發明提供了用於研究幹細胞分化的方法，其包括，使用本發明的生物磚，所述生物磚包含幹細胞(例如MSC細胞)。在某些優選的實施方案中，使用多種分離的生物磚來研究幹細胞分化。優選地，每一種分離的生物磚包含至少一種幹細胞。在某些優選的實施方案中，所述多種分離的生物磚中，至少兩種分離的生物磚是不同的，從而允許同時研究至少兩種不同的幹細胞分化條件。在某些優選的實施方案中，所述至少兩種分離的生物磚各自包含不同類型的幹細胞。在某些優選的實施方案中，多種分離的生物磚各自包含相同類型的幹細胞。在某些優選的實施方案中，所述至少兩種分離的生物磚各自包含不同的試劑或試劑組合，所述試劑或試劑組合促進細胞增殖、分化、遷移、新陳代謝、分泌、信號傳導或其任何組合。在某些優選的實施方案中，以平行(例如，同時)和/或高通量的方式分析所述多種分離的生物磚。

在另一個方面，本發明提供了評估因子(例如，化學試劑，例如化合物；物理刺激，例如輻射或加熱)對組織或組織中的細胞的作用的方法，其包括，將本發明的構建體(例如三維構建體，組織前體，組織或器官；例如骨組織、軟骨組織、關節組織、包含骨和軟骨的複合結構、肝臟組織、或包含微血管的構建體)暴露於所述因子，和，評估所述構建體中的細胞回應所述因子的變化(例如形態變化或功能變化)，從而確定所述因子對組織或組織中的細胞的作用。在某些優選的實施方案中，所述化合物是藥物。在某些優選的實施方案中，所述方法用於測定所述藥物的功效。在某些優選的實施方案中，所述方法用於篩選藥物。在某些優選的實施方案中，所述生物磚中的細胞來源於需要所述藥物的受試者。

在另一個方面，本發明提供了用於三維組織培養的方法，其包括，提供包含待培養的細胞(例如內皮細胞或幹細胞，例如臍靜脈內皮細胞或MSC細胞)的生物磚，和用於組織培養或細胞培養的試劑或其他組分，以及，在合適的條件下培養所述生物磚。在某些優選的實施方案中，所述生物磚中的細胞產生在組織中天然發現的細胞。在某些優選的實施方案中，所述細胞是幹細胞。在某些優選的實施方案中，在所述方法中，使用多種生物磚來研究三維組織培養條件。在某些優選的實施方案中，在所述方法中，平行(例如同時)或以高通量的方式分析多種分離的生物磚。在某些優選的實施方案中，所示方法使用至少兩種生物磚。在某些優選的實施方案中，所述至少兩種生物磚是不同的，允許同時研究至少兩種組織培養條件。在某些優選的實施方案中，所述生物磚提供於容器中。在某些優選的實施方案中，包含生物磚的容器用於三維組織培養方法中。

在另一個方面，本發明提供了修復受試者中損傷組織的方法，其包括，使用本發明的生物磚或組合物(例如生物墨汁)在受試者中組織的損傷位元點直接進行生物列印。在某些優選的實施方案中，在置於組織損傷位元點的支架上進行生物列印。在某些優選的實施方案中，所述方法包括，獲得組織或組織損傷位元點的細胞分佈資訊，然後根據所述細胞分佈資訊進行生物列印。在某些優選的實施方案中，用於在受試者上進行生物列印的生物磚或組合物(例如生物墨汁)中的細胞來源於所述受試者。在某些優選的實施方案中，用於在受試者上進行生物列印的生物磚或組合物(例如生物墨汁)中的細胞來源於與所述受試者具有相似或相同特徵(例如，物種，年齡，性別，遺傳信息等)的其他受試者。在某些優選的實施方案中，用於在受試者上進行生物列印的生物磚或組合物(例如生物墨汁)中的細胞來源於同種異體。在某些優選的實施方案中，用於在受試者上進行生物列印的生物磚或組合物(例如生物墨汁)中的細胞來源於細胞系。在某些優選的實施方案中，所述生物磚或組合物中的生物磚包含幹細胞。

在另一個方面，本發明提供了一種藥物組合物，其包含一種或多種本發明的生物磚。在某些優選的實施方案中，所述藥物組合物用於組織再生。在某些優選的實施方案中，所述藥物組合物還包含藥學可接受的載體，賦形劑，穩定劑或能夠為所述藥物組合物的施用(例如施用給人受試者)提供有利性質的其他試劑。合適的藥物載體包括例如，無菌水，鹽水，葡萄糖，蓖麻油和環氧乙烷的縮合產物，液體酸，低級醇，油(例如玉米油，花生油，芝麻油；其任選還包含乳化劑如脂肪酸的單-或二-甘油酯，或磷脂例如卵磷脂)，乙二醇，聚亞烷基二醇，藻酸鈉，聚(乙烯基吡咯烷酮)等等。所述載體任選地還可包含佐劑，防腐劑，穩定劑，潤濕劑，乳化劑，滲透增強劑等。在某些優選的實施方案中，所述藥物組合物是無菌的。此外，所述藥物組合的黏度可通過選擇合適的溶劑或賦形劑來控制和維持。

在某些優選的實施方案中，賦形劑和稀釋劑可包括但不限於，乳糖，葡萄糖，蔗糖，山梨醇，甘露糖醇，澱粉，阿拉伯樹膠，磷酸鈣，海藻酸鹽，黃蓍膠，明膠，矽酸鈣，微晶纖維素，纖維素，水，鹽水溶液，糖漿，甲基纖維素，羥基苯甲酸甲酯和丙酯，滑石，硬脂酸鎂和礦物油。在某些優選的實施方案中，所述藥物組合物經配製具有4.5-9.0，5.0-8.0，6.5-7.5，或6.5-7.0的pH。在某些優選的實施方案中，所述藥物組合物是與血液等滲的。

在某些優選的實施方案中，所述藥物組合物用於治療需要保護、修復或置換組織(例如皮膚)的受試者，例如人受試者。在某些優選的實施方案中，本發明提供了保護組織的方法，其包括，給有此需要的受試者施用有效量的本發明的藥物組合物。在某些優選的實施方案中，本發明提供了修護受損組織的方法，其包括，給有此需要的受試者施用有效量的本發明的藥物組合物。在某些優選的實施方案中，本發明提供了置換組織(例如受損組織，缺陷組織)的方法，其包括，給有此需要的受試者施用有效量的本發明的藥物組合物。在某些優選的實施方案中，所述組織是皮膚。在某些優選的實施方案中，所述受試者是人。在某些優選的實施方案中，所述藥物組合物用於組織再生。在某些優選的實施方案中，所述藥物組合物用於細胞療法。在某些優選的實施方案中，本發明提供了細胞療法，其包括，給有此需要的受試者施用有效量的本發明的藥物組合物。在某些優選的實施方案中，有效量的藥物組合物足以改善組織條件(例如完整性，健康，外觀等)至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、或90%。藥物組合物的有效量可根據實際情況來確定。在某些優選的實施方案中，有效量的藥物組合物包含至少1，5，10，20，50，100，200，500，1000個生物磚。

本發明的藥物組合物可以通過任何合適的方式來施用。示例性的施用方式包括但不限於，靜脈內，動脈內，腹膜內，肺內，囊內，肌內，氣管內，皮下，眼內，鞘內，透皮或局部施用。在某些優選的實施方案中，通過手術植入來使用所述藥物組合物。在某些優選的實施方案中，所述藥物組合物被施用一次。在某些優選的實施方案中，所述藥物組合物被施用多次。在某些優選的實施方案中，所述藥物組合物以選自下述的頻率施用：每天三次，每天兩次，每天一次，每兩天一次，每3天一次，每週一次，每兩週一次，每三週一次，每月一次，每兩個月一次，每3個月一次，每六個月一次或每年一次。

在另一個方面，本發明提供了本發明的生物磚用於製備上述藥物組合物的用途。在某些優選的實施方案中，所述藥物組合物用於組織再生，或體內組織或器官移植。

在另一個方面，本發明提供了一種試劑盒，其包含本發明的生物磚，組合物(例如生物墨汁)，和/或構建體(例如三維構建體，組織前體，組織或器官；例如骨組織、軟骨組織、關節組織、包含骨和軟骨的複合結構、肝臟組織、或包含微血管的構建體)。

在某些優選的實施方案中，所述試劑盒包含本發明的生物磚，其例如用於生物列印構建體(例如三維構建體，組織前體，組織或器官)。在某些優選的實施方案中，所述試劑盒包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10種生物磚。不同類型的生物磚可在下述的一個或多個方面存在差異：生物磚的尺寸；生物磚的形狀；所包含的細胞數目；所包含的細胞的類型；核層的組成(包括組分的類型和含量)；殼層的組成(包括組分的類型和含量)；核層和/或殼層中包含的額外試劑(包括類型和含量)；和/或，上文論述的任何其他參數。在某些優選的實施方案中，所述試劑盒還包含載體(例如生物黏合劑)，其可與生物磚混合用於生物列印。在某些優選的實施方案中，所述試劑盒還包含定義生物列印模式的模型。在某些優選的實施方案中，所述模型基於待列印的構建體的天然結構和細胞排布模式。

在某些優選的實施方案中，所述試劑盒包含本發明的組合物(例如生物墨汁)，其例如用於生物列印構建體(例如三維構建體，組織前體，組織或器官)。在某些優選的實施方案中，所述組合物(例如生物墨汁)包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10種生物磚。在某些優選的實施方案中，所述試劑盒包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10種組合物(例如生物墨汁)。在某些優選的實施方案中，所述試劑盒還包含載體(例如生物黏合劑)。在某些優選的實施方案中，所述試劑盒還包含定義生物列印模式的模型。在某些優選的實施方案中，所述模型基於待列印的構建體的天然結構和細胞排布模式。

在某些優選的實施方案中，所述試劑盒還包含另外的組分，例如容器，培養基，緩衝劑，和/或生物列印所需的其他試劑。在某些優選的實施方案中，所述試劑盒還包含使用說明書，其描述了產生構建體(例如三維構建體，組織前體，組織或器官)的方法，包括例如生物列印的步驟和培養條件。

在某些優選的實施方案中，所述試劑盒包含本發明的構建體。在某些優選的實施方案中，本發明的構建體是使用本發明的生物磚或組合物(例如生物墨汁)製備的(例如通過生物列印)。在某些優選的實施方案中，所述試劑盒還包含，培養基，緩衝劑，和/或用於培養構建體所需的其他試劑。在某些優選的實施方案中，所述試劑盒還包含使用說明書，其描述了培養所述構建體的方法。在某些優選的實施方案中，所述試劑盒用於再生醫學，例如體內移植或細胞療法。在某些優選的實施方案中，所述試劑盒用於體外測定或藥物篩選。在某些優選的實施方案中，所述試劑盒還包含，體外測定、藥物篩選或再生醫學(例如體內移植或細胞療法)所需的其他試劑，和/或使用說明書。在某些優選的實施方案中，所述試劑盒還包含支架，或者用於製備支架的材料。

在某些優選的實施方案中，所述試劑盒可用於分析細胞響應刺激或試劑而產生的變化(例如形態變化或功能變化)，用於藥物篩選或藥物發現，用於治療有此需要的受試者，用於研究幹細胞分化，用於評估因子(例如，化學試劑，例如化合物；物理刺激，例如輻射或加熱)對組織或組織中的細胞的作用，用於三維組織培養，用於修復受試者中損傷組織。

本發明的試劑盒可置於任何合適的包裝中。此類包裝包括但不限於，瓶，罐，和軟包裝(如聚酯薄膜或塑膠袋)。

在另一個方面，本發明提供了本發明的生物磚，組合物(例如生物墨汁)，和/或構建體(例如三維構建體，組織前體，組織或器官)用於製備試劑盒的用途，所述試劑盒可用於上文所論述的各種應用。例如，所述試劑盒可用於分析細胞響應刺激或試劑而產生的變化(例如形態變化或功能變化)，用於藥物篩選或藥物發現，用於治療有此需要的受試者，用於研究幹細胞分化，用於評估因子(例如，化學試劑，例如化合物；物理刺激，例如輻射或加熱)對組織或組織中的細胞的作用，用於三維組織培養，用於修復受試者中損傷組織。

發明的有益效果與現有技術相比，本發明的技術方案具有以下有益效果： (1) 本發明的生物磚所包裹的細胞類型和細胞數目是可控的，並且生物磚本身的結構和尺寸也是可控的，從而其可用於製備標準化、可控化的生物墨汁。特別地，本發明的生物磚可以包含1至10⁶ 個細胞，例如1至數千個細胞，並且任選地，可以以預先確定的比例包含不同的細胞類型。 (2) 在本發明的生物磚中，可以通過調整生物磚內的物質，如細胞因子和生物可降解材料，為不同種類的細胞提供特定的微環境，從而調控細胞的生長和功能；這進一步使得能夠在複雜的構建體(例如組織和器官)內對不同區域的細胞，或同一區域的不同細胞進行調控。 (3) 在本發明的生物磚中，生物磚為特定細胞的生命活動提供了適當的微環境(例如特定細胞生長、分化所需的生長因子或營養物質，適合細胞增殖、分化的空間結構，促進細胞正常發揮生物學功能的物理因素例如力學刺激等，協助或者調控幹細胞分化的滋養層細胞等)，使得能夠在相同的培養體系中培養不同的細胞類型，或者在相同的培養體系中將相同的幹細胞分化培養為不同的細胞類型。 (4) 本發明的生物磚具有殼核結構，給細胞提供了有效的力學保護，有效地減少或避免細胞遭受外界的機械損傷/力學損傷(例如，在生物列印過程中)，從而確保了細胞在列印過程中存活率(達到90%以上)。此外，本發明的生物磚的殼層還可用作細胞的生物可降解支架，這使得在生物列印過程中，可以不用再為細胞提供生物可降解表面(例如，Organovo技術中使用的水凝膠表面)。 (5) 本發明的生物磚和生物墨汁可在生物列印過程中實現細胞的精確排布，實現組織或器官的精確生物列印。特別地，可根據需要，定制不同類型的生物磚，其可以具有不同的結構，使用不同類型的細胞，使用不同類型的細胞因子和/或使用不同類型的生物可降解材料。隨後，可根據預定的模式，將各種類型的生物磚用於生物列印，從而獲得由按照預定模式排布的生物磚(細胞)構成的構建體，並最終實現生物磚(細胞)的精確排布。此外，由於細胞首先在生物磚內增殖，因此本發明的生物磚還使得能夠顯著增加所獲得的構建體內的細胞密度，而不破壞生物磚(細胞)的預期排布/精確排布。 (6) 通過添加不同的細胞因子/藥物活性成分，本發明能夠對各種生物磚內的細胞的增殖、分化、遷移、新陳代謝進行調控。

具體實施方式

現參照下列意在舉例說明本發明(而非限定本發明)的實施例來描述本發明。

實施例中未指明其來源的試劑、試劑盒或儀器均為市場上商購可得的常規產品。本領域技術人員知曉，實施例以舉例方式描述本發明，且不意欲限制本發明所要求保護的範圍。

實施例1. 生物磚的製備

本實施例提供了製備生物磚的示例性方法。生物磚的製備方法應當在無菌條件下進行。此外，如果意欲將生物磚應用於人體的話，那麼其製備方法的生物安全等級應當達到GMP車間級別。

本方法所使用的儀器為造粒儀(BUCHI，Encapsulator，B-395 Pro)，其配備的同心噴嘴的直徑如下：內層噴嘴，200 μm；外層噴嘴，300 μm。

本方法所使用的材料如下： (1)用於製備核層的材料 I型膠原：4 mg/ml，使用無菌1 M NaOH進行中和；海藻酸鈉：使用去離子水溶解稀釋；血管內皮生長因子VEGF；將I型膠原與2% (w/v) (即，2 g/100 ml，下同)海藻酸鈉溶液以1:1的比例(按重量計)混合，用於製備核層。 (2)用於製備殼層的材料 4%海藻酸鈉；彈性蛋白；殼層固定液，即，0.1 mol/L CaCl₂ 溶液。 (3)所使用的細胞：人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)(購買自ATCC)。

製備生物磚的操作步驟如下(以下實驗步驟均在冰上操作)：

將120 μl NaOH溶液與750 μl I型膠原混合，然後向其中加入130 μl血管內皮細胞懸液(細胞濃度為1×10⁵ 個/ml，懸浮於PBS中)，從而獲得1 ml細胞包裹液。然後，將細胞包裹液與1 ml 2%海藻酸鈉(包含終濃度為20 ng/ml的VEGF)混合，使細胞均勻分散，從而獲得包裹細胞的核層材料。

向2 ml 4%海藻酸鈉溶液中加入100 ng彈性蛋白(elastin，其終濃度為50 ng/ml)，充分混勻，該混合物用作殼層材料，用於製備生物磚的殼層。此外，取300 ml 0.1 mol/L CaCl₂ 溶液置於燒杯中，用於殼層材料的固定。

將如上製備的核層材料和殼層材料分別置於2支5 ml注射器中。按照製造商的說明書，設置造粒儀的壓力、離散力、泵的速度等參數，然後使用所述核層材料和殼層材料進行造粒和包覆。造粒儀的內噴嘴的直徑設置為200 μm，外噴嘴的直徑設置為300 μm。將獲得的生物磚微粒收集於裝有300 ml 0.1 mol/L CaCl₂ 溶液的燒杯中，固定5分鐘，製備獲得生物磚。所製備的生物磚可以在4ºC下保存，或可直接用於3D生物列印。

實施例2. 生物磚的表徵

本實施例具體分析了通過實施例1方法製備的生物磚的性能，包括生物磚的尺寸，殼層的厚度和力學保護作用，所包含的細胞的數量等。

使用顯微鏡來觀察通過實施例1方法製備的生物磚，結果示於圖3A-3C中。圖3A-3C顯示了使用造粒儀在不同儀器參數(同心噴嘴的內噴嘴和外噴嘴的直徑)下製備的生物磚的顯微照片，其中，圖3A中的生物磚的直徑為約120 μm(尺規為100 μm)；圖3B中的生物磚的直徑為約200 μm(尺規為100 μm)；圖3C中的生物磚的直徑為約450 μm(尺規為200 μm)。這些結果表明，可通過控制造粒儀的儀器參數(例如，同心噴嘴的內噴嘴和外噴嘴的直徑)來控制生物磚的尺寸。本發明的生物磚的尺寸是可控的，可根據需要進行選擇。

還使用顯微鏡進一步觀察了通過實施例1方法製備的生物磚的殼層厚度，結果示於圖4中。圖4顯示了通過實施例1方法製備的生物磚的顯微照片，其中，高亮部分代表生物磚的殼層，且該殼層的厚度為約2 μm(尺規為50 μm)。結果表明，可通過控制造粒儀的同心噴嘴的內噴嘴和外噴嘴的直徑，殼層材料的泵出速度等參數來控制殼層的厚度。本發明的生物磚的殼層厚度是可控的，可根據需要進行選擇。

還使用顯微鏡進一步觀察了通過實施例1方法製備的生物磚所包含的細胞的數量。結果示於圖5A-5C中。圖5A-5C顯示了通過實施例1方法製備的生物磚的顯微照片，其中，圖5A中的生物磚包裹的細胞數為約50個(尺規為100 μm)；圖5B中的生物磚包裹的細胞數為約8個(尺規為100 μm)；圖5C中的生物磚包裹的細胞數為約2個(尺規為100 μm)。這些結果表明，可通過控制細胞懸液的細胞濃度來控制生物磚包裹的細胞數。本發明生物磚包含的細胞的數量是可控的，可根據需要進行選擇。

另外，還根據製造商的說明書，使用美國Hysitron(海思創)TI-950型納米壓痕儀，檢測了通過實施例1方法製備的生物磚(尺寸為約400 μm)的力學性能。檢測結果顯示，該批次的生物磚的硬度平均大約為0.083GPa，彈性模量平均大約為1.683MPa。

這些結果表明，本發明生物磚具有優良的力學保護性能，可有效避免生物磚內的細胞遭受外界的力學損傷/機械損傷。此外，還已發現，可通過控制生物磚的殼層厚度和殼層材料等參數來控制生物磚的力學保護性(資料未顯示)。本發明生物磚的力學保護性能是可控的，可根據需要進行選擇。

實施例3. 其他類型的生物磚的製備

還使用與實施例1類似的方法，利用造粒儀，以下述原料製備了其他類型的生物磚(即，生物磚B1-B4)。

圖6A-6D顯示了使用造粒儀製備的生物磚B1-B4的顯微照片，其中，圖6A中的生物磚為生物磚B1，其直徑為約600 μm (尺規為500 μm)；圖6B中的生物磚為生物磚B2，其直徑為約500 μm (尺規為500 μm)；圖6C中的生物磚為生物磚B3，其直徑為約500 μm (尺規為500 μm)；圖6D中的生物磚為生物磚B4，其直徑為約500 μm (尺規為500 μm)。這些結果表明，可使用各種合適的生物可降解材料來製備本發明的生物磚。

另外，為了更清楚地觀察所製備的生物磚的結構，還使用tracker CM-Dil (紅色螢光)對用於製備生物磚B2的核層材料所包裹的細胞進行標記；並且，使用帶有FITC (綠色螢光)的聚賴氨酸作為製備生物磚B2的殼層材料。隨後，使用共聚焦顯微鏡來觀察用含有tracker CM-Dil標記的細胞的核層材料和帶有FITC的殼層材料所製備的生物磚B2。結果示於圖6E中。圖6E顯示了用經標記的核層材料和殼層材料製備的生物磚B2的共聚焦顯微圖像，其中，綠色螢光代表殼層，紅色螢光代表核層所包裹的細胞。

實施例4. 殼層含有氧化海藻酸鹽的生物磚的製備

本實施例提供了殼層含有氧化海藻酸鹽的生物磚的示例性製備方法。生物磚的製備方法應當在無菌條件下進行。此外，如果意欲將生物磚應用於人體的話，那麼其製備方法的生物安全等級應當達到GMP車間級別。

本方法所使用的材料如下： (1)用於製備核層的材料 I型膠原：4 mg/ml，使用無菌1 M NaOH進行中和； (2)用於製備殼層的材料指定濃度的氧化海藻酸鈉溶液，或含有指定濃度的氧化海藻酸鈉和其他殼層材料的混合溶液；殼層固定液，即，0.1 mol/L CaCl₂ 溶液。 (3)所使用的細胞：人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)(購買自ATCC)、肝癌細胞(HepG2，購買自ATCC)、人成纖維細胞(購買自ATCC)、大鼠間充質幹細胞(MSC，原代)。

製備生物磚的操作步驟如下(以下實驗步驟均在冰上操作)： (1)將120 μl NaOH溶液與750 μl I型膠原混合，然後向其中加入130 μl細胞懸液(細胞濃度為1×10⁵ 個/ml，懸浮於PBS中)，從而獲得1 ml細胞包裹液，用作核層材料。 (2)配製50 ml 5wt%氧化海藻酸鈉溶液用作殼層材料。 (3)配製300 ml 0.1M CaCl₂ 溶液置於燒杯中，用於殼層材料的固定。 (4)將如上製備的核層材料置於2 ml注射器中，並且將50 ml殼層材料置於造粒儀的包裹液瓶中，隨後，用所述核層材料和殼層材料進行造粒和包覆。 (5)將步驟(4)的產物收集於裝有300 ml 0.1 mol/L CaCl₂ 溶液的燒杯中，固定5分鐘，製備獲得生物磚。所製備的生物磚可以在4ºC下保存，或可直接用於3D生物列印。

實施例5. 殼層含有氧化海藻酸鹽的生物磚的表徵

本實施例具體分析了通過實施例4方法製備的生物磚的性能，包括生物磚的尺寸，殼層的厚度和力學保護作用，所包含的細胞的數量等。

使用顯微鏡來觀察通過實施例4方法製備的生物磚。在製備過程中，使用了不同的造粒儀的儀器參數(例如，同心噴嘴的內噴嘴和外噴嘴的直徑)，製備了不同尺寸的生物磚。結果顯示，可通過控制造粒儀的儀器參數(例如，同心噴嘴的內噴嘴和外噴嘴的直徑)來控制生物磚的尺寸。本發明的生物磚的尺寸是可控的，可根據需要進行選擇。

還使用顯微鏡進一步觀察了通過實施例4方法製備的生物磚的殼層厚度。結果表明，可通過控制造粒儀的同心噴嘴的內噴嘴和外噴嘴的直徑，殼層材料的泵出速度等參數來控制殼層的厚度。本發明的生物磚的殼層厚度是可控的，可根據需要進行選擇。

還使用顯微鏡進一步觀察了通過實施例4方法製備的生物磚所包含的細胞的數量。結果表明，可通過控制細胞懸液的細胞濃度來控制生物磚包裹的細胞數。本發明生物磚包含的細胞的數量是可控的，可根據需要進行選擇。

另外，還根據製造商的說明書，使用美國Hysitron(海思創)TI-950型納米壓痕儀，檢測了通過實施例4方法製備的生物磚的力學性能。結果顯示，本發明生物磚具有優良的力學保護性能，可有效避免生物磚內的細胞遭受外界的力學損傷/機械損傷。此外，還已發現，可通過控制生物磚的殼層厚度和殼層材料等參數來控制生物磚的力學保護性(資料未顯示)。本發明生物磚的力學保護性能是可控的，可根據需要進行選擇。

實施例6. 生物磚殼層的降解速度的調控

在本實施例中，對生物磚的殼層降解速度進行了研究。本實施例所使用的生物磚基本上按照實施例4描述的方法來製備，其中根據實驗設置，對所使用的造粒儀的儀器參數(例如，同心噴嘴的內噴嘴和外噴嘴的直徑)、細胞(類型和數量)，核層材料，和殼層材料進行了調整。並且，在本實施例中，通過下述方法來檢測所製備的生物磚的殼層降解速度：將生物磚在37ºC培養箱中進行培養，並在指定的時間點檢測生物磚的品質，測定生物磚的失重率。另外，還可繪製失重率-時間曲線，作為生物磚殼層的降解曲線。

首先，我們檢測了所使用的細胞的類型和數量，以及氧化海藻酸鈉的氧化度對生物磚殼層的降解速度的影響。

按照實施例4描述的方法來製備生物磚，其中，所使用的細胞為HUVEC、HepG2和MSC；所使用的細胞密度為4×10⁶ /mL，6×10⁶ /mL，或12×10⁶ /mL；所使用的核層材料為包裹細胞的I型膠原；所使用的殼層材料為5 wt%氧化海藻酸鈉，並且氧化海藻酸鈉的氧化度為2.5%、4.4%、8.8%、17.6%或22%。隨後，按照上文描述的方法，測定所製備的生物磚的殼層降解速度。測定結果示於表1中。表1.

上述結果表明，用於製備生物磚的細胞的類型和數量以及氧化海藻酸鈉的氧化度均能夠影響生物磚殼層的降解速度。具體而言，(1)細胞的生長和增殖速度越快，則生物磚殼層的降解速度也越快。例如，HUVEC/HepG2細胞的生長和增殖速度快於MSC，因此，在同等條件下，包含HUVEC/HepG2的生物磚的殼層降解速度快於包含MSC的生物磚，如生物磚4和9所顯示的。(2)細胞的數量越多，則生物磚殼層的降解速度越快，例如，如生物磚5和7所顯示的。(3)氧化海藻酸鈉的氧化度越高，則生物磚殼層的降解速度越快，例如，如生物磚4-6，或生物磚9和11所顯示的。

其次，我們檢測了生物磚殼層中氧化海藻酸鈉的濃度對生物磚殼層的降解速度的影響。

按照實施例4描述的方法來製備生物磚，其中，所使用的核層材料為包裹細胞的I型膠原；所使用的殼層材料為指定濃度(5%、6%、7%、8%、9%、或10%)的氧化海藻酸鈉，並且氧化海藻酸鈉的氧化度為8.8%。隨後，按照上文描述的方法，測定所製備的生物磚的殼層降解速度。實驗結果見表2。表2

實驗結果表明，生物磚殼層中氧化海藻酸鈉的濃度能夠影響生物磚殼層的降解速度。特別地，氧化海藻酸鈉的濃度越高，則生物磚殼層的降解速度越慢。

另外，我們還研究了生物磚殼層中其他生物可降解材料(例如，海藻酸鈉)的存在對生物磚殼層的降解速度的影響。特別地，我們使用不同比例的海藻酸鈉和氧化海藻酸鈉來製備生物磚的殼層，並研究了海藻酸鈉和氧化海藻酸鈉的比例對生物磚殼層的降解速度的影響。

按照實施例4描述的方法來製備生物磚，其中，所使用的核層材料為包裹細胞的I型膠原；所使用的殼層材料為指定比例的氧化海藻酸鈉(OSA)和海藻酸鈉(SA)，並且氧化海藻酸鈉(OSA)和海藻酸鈉(SA)的總濃度為5%。隨後，按照上文描述的方法，測定所製備的生物磚的殼層降解速度。實驗結果見表3。表3.

結果表明，生物磚殼層中氧化海藻酸鈉含量的降低將導致生物磚殼層的降解速度下降。特別地，氧化海藻酸鈉在殼層中所占的比例越高，則生物磚殼層的降解速度越快；反之，氧化海藻酸鈉在殼層中所占的比例越低，則生物磚殼層的降解速度越慢。

此外，我們還檢測了所使用的細胞的類型對生物磚殼層的降解速度的影響。

按照實施例4描述的方法來製備生物磚，其中，所使用的細胞為MSC、HUVEC、HepG2或成纖維細胞；並且，在製備生物磚過程中，使用相同的細胞密度(例如6×10⁶ /mL)，相同的核層材料(例如I型膠原)，相同的殼層材料(例如，5wt%氧化海藻酸鈉，並且氧化海藻酸鈉的氧化度為8.8%)，並且使用相同的造粒儀的儀器參數。隨後，按照上文描述的方法，測定所製備的包含不同類型的細胞的生物磚的殼層降解速度。

結果顯示，用於製備生物磚的細胞的類型能夠影響生物磚殼層的降解速度。具體而言，細胞的生長和增殖速度越快，則生物磚殼層的降解速度也越快。例如，HUVEC/HepG2細胞的生長和增殖速度快於MSC，因此，在同等條件下，包含HUVEC/HepG2的生物磚的殼層降解速度快於包含MSC的生物磚。

另外，我們還檢測了所使用的細胞的數量對生物磚殼層的降解速度的影響。

按照實施例4描述的方法來製備生物磚，其中，所使用的細胞密度為4×10⁶ /mL，6×10⁶ /mL，8×10⁶ /mL，12×10⁶ /mL，16×10⁶ /mL，或24×10⁶ /mL；並且，在製備生物磚過程中，使用相同的細胞(例如HepG2細胞)，相同的核層材料(例如I型膠原)，相同的殼層材料(例如，5wt%氧化海藻酸鈉，並且氧化海藻酸鈉的氧化度為8.8%)，並且使用相同的造粒儀的儀器參數。隨後，按照上文描述的方法，測定所製備的包含不同數量的細胞的生物磚的殼層降解速度。

結果顯示，用於製備生物磚的細胞的數量能夠影響生物磚殼層的降解速度。具體而言，細胞的數量越多，則生物磚殼層的降解速度越快。反之，細胞的數量越少，則生物磚殼層的降解速度越慢。

此外，我們還檢測了所製備的生物磚的殼層厚度對生物磚殼層的降解速度的影響。

按照實施例4描述的方法來製備生物磚，其中，在製備生物磚過程中，使用相同的細胞(例如HepG2細胞)，相同的細胞密度(例如6×10⁶ /mL)，相同的核層材料(例如I型膠原)，相同的殼層材料(例如，5wt%氧化海藻酸鈉，並且氧化海藻酸鈉的氧化度為8.8%)，但是通過調整造粒儀的儀器參數(例如，同心噴嘴的內噴嘴和外噴嘴的直徑)，製備具有不同殼層厚度的生物磚。隨後，按照上文描述的方法，測定所製備的具有不同殼層厚度的生物磚的殼層降解速度。

結果顯示，生物磚的殼層厚度能夠影響生物磚殼層完全降解所需的時間。具體而言，生物磚的殼層越厚，則殼層完全降解所需的時間越長。

實施例7. 生物墨汁的製備和表徵

本實施例將根據實施例1中描述的方法製備的生物磚與生物黏合劑均勻混合，製備成用於生物列印的生物墨汁。所使用的生物黏合劑為海藻酸鈉與明膠。

在製備所述生物墨汁後，立即使用相差顯微鏡來進行觀察。為了便於觀察，在製備生物磚時，在核層中添加了甲基紫染料。觀察結果示於圖7A中。

圖7A顯示了使用本發明的生物磚製備的生物墨汁的顯微照片。其中，生物磚包含人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)，並且其殼層的主要成分是海藻酸鈣，核層的主要成分是海藻酸鈉與I型膠原，且包含甲基紫染料；生物黏合劑的主要成分是海藻酸鈉與明膠。另外，由於生物磚和生物黏合劑的部分成分是一致的，因此，為了便於觀察，在生物磚中添加了甲基紫染料。從而，在圖7A中，生物磚顯示為紫色。如圖7A所示，紫色染色僅存在於生物磚內部，而不存在於生物墨汁的載體(生物黏合劑)中。這表明生物磚的殼層能夠在生物墨汁中保持生物磚的完整性。

進一步，將如上製備的生物墨汁列印為單細胞層(寬度約為250 μm)，並使用顯微鏡來進行觀察。觀察結果示於圖7B中。

圖7B顯示了用本發明的生物墨汁列印得到的單細胞層的顯微照片。其中，生物磚包含人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)，並且其殼層的主要成分是海藻酸鈣，核層的主要成分是海藻酸鈉與I型膠原，且包含甲基紫染料；生物黏合劑的主要成分是海藻酸鈉與明膠。在圖7B中，生物磚因甲基紫染料的存在，而顯示為紫色。如圖7B所示，紫色染色僅存在於生物磚內部，而不存在於生物墨汁的載體(生物黏合劑)中。這表明生物磚的殼層能夠在生物列印過程中保持生物磚的完整性。

為了進一步表徵生物墨汁，使用黏度測定儀，測量生物黏合劑的黏度隨溫度(25ºC-40ºC)的變化情況。結果示於圖8中。

圖8顯示了所使用的生物黏合劑(海藻酸鈉與明膠)的黏度分析。結果顯示，在25ºC-40ºC下，所使用的生物黏合劑的黏度為30-160 Pa∙s；並且，隨著溫度升高，生物黏合劑的黏度有所下降。另外，還已發現，生物黏合劑與生物磚混合後(即，生物墨汁)的黏度未發生顯著改變(資料未顯示)。生物墨汁的黏度主要取決於載體(例如生物黏合劑)的黏度。

可通過控制生物黏合劑的組分的類型和含量來調整生物墨汁/生物黏合劑的黏度。通常，黏度在1-1000 Pa∙s範圍內的生物墨汁可與生物印表機例如(EnvisionTEC 3D-BIOPLOTTER^® )相容。因此，本發明的生物墨汁在4ºC-40ºC的溫度下可用於本領域已知的生物列印系統。

實施例8. 生物磚/生物墨汁的細胞相關的性能分析

細胞的活力

在本實驗中，通過染色法檢測了生物磚內的細胞活性。所使用的試劑如下：

鈣黃綠素CaAM (公司：Invitrogen，貨號：C3100MP)，其用於活細胞染色，能夠對細胞漿進行標記，顯示綠色螢光。使用方法：用10 ml DMSO溶解50 mg鈣黃綠素，然後添加10 ml PBS並混勻。所獲得的溶液中鈣黃綠素的終濃度為5 mmol/l。

碘化丙啶核酸染料(公司：Invitrogen，貨號：P1304MP)，其用於死細胞染色，能夠對細胞核進行標記，顯示紅色螢光。使用方法：用雙蒸水將碘化丙啶核酸染料稀釋至1 mg/ml，用作儲存液；然後用PBS將儲存液以1:3000的比例稀釋至終濃度500 nM，用作工作液。

染色方法如下：

將通過實施例1方法製備的生物磚(包含HUVEC，100個細胞/生物磚)置於1 ml CaAM中，於37ºC孵育1小時；然後加入1 ml碘化丙啶核酸染料，染色15分鐘。之後，使用鐳射共聚焦顯微鏡觀察生物磚的染色結果。結果示於圖9A-9D中。

圖9A-9D顯示了使用共聚焦顯微鏡觀察通過實施例1方法製備的生物磚中細胞活力的分析結果，其中，所述生物磚用鈣黃綠素(綠色螢光)和碘化丙啶(紅色螢光)進行了雙重染色；所使用的細胞為人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)，殼層的主要成分是海藻酸鈣，核層的主要成分是海藻酸鈉與I型膠原。

圖9A顯示了在生物磚製備之後立即進行的生物磚中細胞活力的分析結果。在圖9A中，每個標記的白色圓圈代表一個生物磚，並且，高亮點為紅色螢光(代表死細胞)，低亮點為綠色螢光(代表活細胞)。使用image pro plus軟體，對紅色、綠色進行顏色聚類統計，並計算紅光斑和綠光斑的數量、面積、平均光密度、直徑、累計光密度，由此確定紅、綠圖元點的個數，並計算細胞生存率。細胞生存率=活細胞數量/(活細胞數+死細胞數)。圖9A的結果顯示，在用實施例1的方法製備生物磚後，生物磚中98%以上的細胞存活。

圖9B顯示了將製備的生物磚在4ºC下儲存3小時後，生物磚中細胞活力的分析結果。在圖9B中，每個標記的白色圓圈代表一個生物磚，並且，高亮點為紅色螢光(代表死細胞)，低亮點為綠色螢光(代表活細胞)。如圖9A，使用image pro plus軟體計算細胞生存率。圖9B的結果顯示，所製備的生物磚在4ºC下保存3小時後，生物磚中的細胞仍然保持高活力(存活率為90%)。

圖9C顯示了在將生物磚製備成生物墨汁並進行生物列印後，立即進行的生物磚中細胞活力的分析結果。在圖9C中，高亮點為紅色螢光(代表死細胞)，低亮點為綠色螢光(代表活細胞)。如圖9A，使用image pro plus軟體計算細胞生存率。圖9C的結果顯示，將生物磚製備成生物墨汁並立即進行生物列印後，生物磚中的細胞仍然保持高活力(存活率為97%)。

圖9D顯示了所製備的生物磚在37ºC下，在H-DMEM培養基中培養5天後，生物磚中細胞活力的分析結果。在圖9D中，高亮點為紅色螢光(代表死細胞)，低亮點為綠色螢光(代表活細胞)。如圖9A，使用image pro plus軟體計算細胞生存率。圖9D的結果顯示，所製備的生物磚在37ºC下培養5天後，生物磚中的細胞仍然保持高活力(存活率為95%)。

細胞的黏附和伸展

將包含HepG2細胞的生物磚在37ºC，5% CO₂ ，含10% FBS(胎牛血清)的H-DMEM培養基中培養5天，以允許細胞伸展，增殖，並建立生物磚內的細胞之間的連接(即，黏附)。如上文所述的，使用鈣黃綠素(綠色螢光)和碘化丙啶(紅色螢光)對生物磚進行雙重染色，並使用鐳射共聚焦顯微鏡進行觀察。觀察結果示於圖10A-10B中。

圖10A-10B顯示了使用共聚焦顯微鏡觀察通過實施例1方法製備的生物磚中細胞的黏附和伸展的分析結果，其中，所述生物磚用鈣黃綠素(綠色螢光)和碘化丙啶(紅色螢光)進行了雙重染色；所使用的細胞為HepG2細胞，殼層的主要成分是海藻酸鈣，核層的主要成分是海藻酸鈉與I型膠原。

圖10A顯示了在培養生物磚第1天，使用共聚焦顯微鏡觀察到的照片(放大倍數：40倍)，其中細胞呈圓形，未黏附伸展。圖10B顯示了培養所述生物磚5天後，使用共聚焦顯微鏡觀察到的照片(放大倍數：200倍)，其中細胞黏附伸展。圖10A-10B的結果表明，在培養5天後，生物磚內的細胞伸展並建立細胞間連接。

細胞的增殖

將包含HepG2細胞的生物磚(100個細胞/生物磚)在37ºC，5% CO₂ ，含10% FBS(胎牛血清)的H-DMEM培養基中培養5天，以允許細胞增殖。隨後，使用DAPI (藍色螢光)和EdU (紅色螢光)對細胞進行雙重染色，並使用鐳射共聚焦顯微鏡進行觀察。觀察結果示於圖11中。

圖11顯示了使用共聚焦顯微鏡觀察生物磚中的細胞增殖的分析結果(放大倍數：200倍)，其中，所述生物磚用DAPI (藍色螢光)和EdU (紅色螢光)進行了雙重染色；所使用的細胞為HepG2細胞，殼層的主要成分是海藻酸鈣，核層的主要成分是海藻酸鈉與I型膠原。圖11的結果表明，在培養5天後，生物磚內的細胞處於增殖狀態。

生物磚與細胞微球的比較

在本實驗中，將本發明生物磚中的細胞增殖/連接情況與通過傳統方法製備的細胞微球中的細胞增殖/連接情況進行了比較。

通過下述傳統方法來製備細胞微球：使用造粒儀，用海藻酸鈉直接包裹細胞，以形成細胞液滴；隨後，將細胞液滴置於CaCl₂ 溶液中，以使海藻酸鈉在鈣離子的作用下形成海藻酸鈣，從而將細胞液滴交聯固化成細胞微球。

另外，通過實施例1的方法來製備生物磚，其中，所使用的細胞為HepG2細胞，殼層的主要成分是海藻酸鈣，核層的主要成分是海藻酸鈉與I型膠原。

將如上製備的細胞微球和生物磚於37ºC、5% CO₂ 環境下培養7天。並且，在培養之前和培養7天後，用鈣黃綠素(綠色螢光)對細胞微球和生物磚進行染色。染色結果示於圖12A-12E中。

圖12A-12B顯示了通過傳統方法製備的細胞微球在培養過程中的細胞增殖情況(尺規為500 μm)。結果顯示，與培養之前(圖12A)相比，培養7天後(圖12B)的細胞微球中的細胞增殖不明顯，細胞呈圓形，散在分佈，細胞之間未建立連接。

圖12C-12D顯示了使用實施例1方法製備的生物磚在培養過程中的細胞增殖情況(尺規為500 μm)。結果顯示，與培養之前(圖12C)相比，培養7天後(圖12D)的生物磚中的細胞增殖明顯，細胞在生物磚中伸展、黏附，並相互連接在一起。

圖12E顯示了使用實施例1方法製備的生物磚在培養7天後的顯微照片(尺規為100 μm)。結果顯示，生物磚中的HepG2細胞之間相互連接，形成有機的整體。

圖12A-12E的結果表明，與傳統方法製備的細胞微球相比，本發明的生物磚能夠更好地促進細胞的增殖，促進細胞之間建立連接。這對於後續的組織形成具有重要意義。

細胞間連接的建立-1

在本實驗中，使用共聚焦顯微鏡觀察生物磚內部的細胞間連接的建立。

通過實施例1的方法來製備生物磚，其中，所使用的細胞為HepG2，其用cell tracker Green CMFDA (綠色螢光)進行標記，以及人HUVEC細胞，其用tracker CM-Dil (紅色螢光)進行標記；殼層的主要成分是海藻酸鈣，核層的主要成分是海藻酸鈉與I型膠原。將所製備的生物磚於37ºC、5% CO₂ 環境下培養7天，隨後用共聚焦顯微鏡進行觀察。觀察結果示於圖13中。

圖13顯示了使用共聚焦顯微鏡觀察培養7天後的生物磚的結果(圖中尺規為100 μm)，其中，所使用的生物磚同時包含用綠色螢光標記的HepG2細胞和用紅色螢光標記的HUVEC細胞，並且圖中的黃色區域是由紅色螢光和綠色螢光疊加所致，這表明HepG2細胞和HUVEC細胞之間建立了連接。結果顯示，生物磚內部的HepG2細胞之間、HUVEC細胞之間以及HepG2細胞與HUVEC細胞之間均建立了細胞間連接。

細胞間連接的建立-2

本實驗中，使用共聚焦顯微鏡觀察生物磚之間的細胞連接的建立情況。

通過實施例1方法來製備生物磚，其中，殼層的主要成分是海藻酸鈣，核層的主要成分是海藻酸鈉與I型膠原。生物磚於37ºC、5% CO₂ 環境下培養7天後，用共聚焦顯微鏡進行觀察。結果如圖14A-14C所示。

圖14A顯示了使用共聚焦顯微鏡觀察培養7天後的生物磚的結果(圖中尺規為100 μm)，其中，所使用的生物磚包含分別用cell tracker Green CMFDA (綠色螢光)標記的HepG2細胞和HUVEC細胞。結果顯示，兩個生物磚的細胞之間建立了細胞連接，如方框中的橋狀結構所顯示的。

圖14B顯示了使用共聚焦顯微鏡觀察培養7天後的生物磚的結果(圖中尺規為500 μm)，其中，使用了兩種生物磚：一種生物磚包含用cell tracker Green CMFDA (綠色螢光)標記的HepG2細胞，且另一種生物磚包含用tracker CM-Dil (紅色螢光)標記的HUVEC細胞；並且，圖中的黃色區域是由紅色螢光和綠色螢光疊加所致。結果顯示，表達紅色螢光的生物磚與表達綠色螢光的生物磚之間建立了細胞連接，如圖中的黃色區域所顯示的。

圖14C顯示了使用共聚焦顯微鏡觀察培養7天後的生物磚的結果(圖中尺規為500 μm)，其中，所使用的生物磚包含用cell tracker Green CMFDA (綠色螢光)標記的HepG2細胞和HUVEC細胞；並且，圖中的各個白色圓環分別表示一個生物磚。結果顯示，不同生物磚的細胞之間建立了細胞連接，並形成有機的整體。

本實施例的結果顯示，細胞在本發明的生物磚內具有高活力(存活率為98%以上)，並且能夠在生物磚內正常生長，增殖，伸展和分化。此外，本實施例的結果還顯示，生物磚內部的細胞之間以及不同生物磚的細胞之間能夠建立細胞間連接。這表明，本發明的生物磚以及其製備方法能夠有效保持細胞的活力，並且能夠促進細胞在生物磚內增殖，促進細胞之間建立連接，從而可有利地用於下游的各種應用，例如生物列印。

實施例9. 包含MSC細胞的生物磚的製備及應用

使用與實施例1類似的方法，利用造粒儀，製備了包裹MSC細胞的生物磚，其中，所使用的細胞為來自原代培養的大鼠的MSC細胞(其用cell tracker dil標記紅色螢光)，核層材料為I型膠原，殼層材料為聚賴氨酸。

將包含MSC細胞的生物磚在37ºC，5% CO₂ 的環境下進行培養，以允許細胞伸展，增殖，並建立細胞之間的連接。使用顯微鏡來觀察培養之前、培養7天後以及培養9天後的包含MSC細胞的生物磚，結果示於圖15中。

圖15顯示了包含MSC細胞的生物磚的顯微照片，其中，圖15A顯示了培養第2天的包含MSC細胞的單個生物磚(尺規為100 μm)；圖15B顯示了培養7天後的包含MSC細胞的生物磚(尺規為500 μm)；圖15C顯示了培養9天後的包含MSC細胞的生物磚(尺規為500 μm)。結果顯示，培養7天後，多個包含MSC細胞的生物磚相互融合(如圖15B中的白色箭頭所指示的)；並且，培養9天後，包含MSC細胞的生物磚完全融合，形成有機整體(如圖15C所顯示的)。

實施例10. 包含MSC細胞和誘導因子的生物磚的製備

本實施例提供了製備包含MSC細胞和誘導因子的生物磚的示例性方法。生物磚的製備方法應當在無菌條件下進行。此外，如果意欲將生物磚應用於人體的話，那麼其製備方法的生物安全等級應當達到GMP車間級別。

本方法所使用的材料如下： (1)用於製備核層的材料海藻酸鈉：使用去離子水溶解稀釋； I型膠原：4 mg/ml，使用無菌1 M NaOH進行中和；在I型膠原中添加下述因子： (a)誘導MSC向成骨細胞或骨分化的誘導因子：0.1 μm地塞米松、0.05 mM抗壞血酸、以及10 mM甘油磷酸；用於製備第一生物磚。或者 (b)誘導MSC向成軟骨細胞或軟骨分化的誘導因子：10 ng/ml TGF-β3、100 nM地塞米松、50 μg/ml的2-磷酸抗壞血酸、100 μg/ml 丙酮酸鈉、40 μg/ml脯氨酸以及胰島素-轉鐵蛋白-硒溶液(ITS+, Collaborative Biomedical, Bedford, MA, USA)；用於製備第二生物磚。將I型膠原與2% (w/v) (即，2 g/100 ml)海藻酸鈉以1:1的比例(按重量計)混合，用於製備核層。 (2)用於製備殼層的材料 4%海藻酸鈉；彈性蛋白；殼層固定液，即，0.1 mol/L CaCl₂ 溶液。 (3)所使用的細胞：MSC細胞(購買自ATCC)。

製備生物磚的操作步驟如下(以下實驗步驟均在冰上操作)：

將120 μl NaOH溶液與750 μl I型膠原混合，然後向其中加入130 μl MSC細胞懸液(細胞濃度為1×10⁵ 個/ml，懸浮於PBS中)，從而獲得1 ml細胞包裹液。然後，將細胞包裹液與1 ml 2%海藻酸鈉混合，使細胞均勻分散，從而獲得包裹細胞的核層材料。

將如上製備的核層材料和殼層材料分別置於2支5 ml注射器中。按照製造商的說明書，設置造粒儀的壓力、離散力、泵的速度等參數，然後使用所述核層材料和殼層材料進行造粒和包覆。造粒儀的內噴嘴的直徑設置為200 μm，外噴嘴的直徑設置為300 μm。將獲得的生物磚微粒收集於裝有300 ml 0.1 mol/L CaCl₂ 溶液的燒杯中，固定5分鐘，製備獲得第一生物磚和第二生物磚。所製備的生物磚可以在4ºC下保存，或可直接用於3D生物列印。

實施例11. 包含MSC細胞和誘導因子的生物磚的表徵

使用顯微鏡來觀察通過實施例10的方法製備的第一生物磚，結果示於圖16A-16B中。圖16A顯示了通過實施例10的方法製備的第一生物磚在37ºC，5% CO₂ 下培養1天後的顯微照片。結果顯示，細胞正常生長，但未出現分化。圖16B顯示了通過實施例10的方法製備的第一生物磚在37ºC，5% CO₂ 下培養10天後經茜素紅染色的顯微照片，其中，粗箭頭所指處為一個完整的生物磚，細箭頭所指處為鈣結節。結果顯示，生物磚內出現大量鈣結節，如細箭頭所指示的。這表明，第一生物磚中的MSC細胞向成骨細胞分化。

實施例12. 包含內皮細胞和間充質幹細胞的生物磚的製備

本實施例的製備方法中所採用的材料與細胞：核材料：4 mg/ml 的I型膠原，使用無菌1 M NaOH進行中和；殼材料：1wt%聚賴氨酸；種子細胞：HUVEC與MSC按1：10進行共混，細胞總濃度為3.7×10⁶ /ml；

本實施例的製備生物磚的方法的步驟如下： (1)製備U型底超疏水孔板：在超淨室內將U型底孔板用酒精清洗乾淨後，將U型底孔板置入過氧化氫/濃硫酸溶液[30%(v/v)，H₂ O₂ :H₂ SO₄ =1:3]中，80ºC反應1小時，以進行羥基化處理。將羥基化的U型底孔板放入濃度為1%的1H,1H,2H,2H-全氟癸基三乙氧基矽烷(Sigma)溶液中12小時，再在100ºC烘箱中加熱4小時，以進行矽化處理。最後，清洗U型底孔板並風乾。 (2)製備含種子細胞的膠原溶液：將120 μl NaOH溶液(1 mol/L)與750 μl I型膠原(4 mg/mL)混合，然後向其中加入130 μl以1:10進行混合的HUVEC與經Tracker CM-Dil標記的大鼠MSC細胞的混合懸液(細胞總濃度為3.7×10⁶ /ml，懸浮於PBS中)，獲得混合了種子細胞的膠原溶液。 (3)製備聚賴氨酸-FITC溶液：將經FITC(綠色螢光)標記的聚賴氨酸(Sigma，數均分子量Mn為150,000-300,000)溶於pH7.2的DMEM高糖培養基，得到濃度為1 wt%的聚賴氨酸溶液。 (4)膠原滴加(形成核層結構)：採用能夠吸取和排出納升級液體的電子式吸取裝置(例如Eppendorf Xplorer 0.5-10 mL或TransferpetteElectronic 0.5-10 mL，借助他們的分液功能，每分液量最低可達到0.1 μl；或者採用SGE自動進樣器1 μl或0.5 μl，可分別實現10次和5次的0.1 μl液體滴定，特殊地，可選用錐形特質針頭進行滴定，提高精確度)精密吸取0.1 μl步驟2製備的I型膠原溶液，滴入步驟1製備的U型底超疏水孔板中，形成液滴，在37ºC恆溫保持30分鐘，使其成型。 (5)滴加聚賴氨酸-FITC溶液(殼層結構)：更換吸頭後，精密吸取0.5 μl步驟3製備的聚賴氨酸-FITC溶液，在超疏水孔板中央位置將其滴入步驟4中成型的核層表面，反應10分鐘，以形成包含HUVEC和MSC的生物磚。

實施例13. 三維構建體的生物列印

本實施例示例性地使用包含根據實施例1描述的方法製備的生物磚的生物墨汁，通過生物列印方法，構建了三維構建體(例如血管)。

圖17示意性地描述了使用本發明的生物磚/生物墨汁來生物列印血管的流程圖。具體而言，該方法包含下述步驟： (1) 用DIO (綠色)、Mitochacker (紅色)和hoechst (藍色)對血管的內皮細胞、平滑肌細胞和成纖維細胞進行染色，然後採集大鼠血管的生物學資訊，並構建血管結構數位模型。根據該模型，血管分為三層結構，即，位於最內層的血管內皮細胞，位於中間層的血管平滑肌細胞，以及位於最外層的成纖維細胞。 (2)使用實施例1中描述的方法，構建包含血管內皮細胞的生物磚、包含血管平滑肌細胞的生物磚、以及包含成纖維細胞的生物磚。其中，所使用的血管內皮細胞、血管平滑肌細胞和成纖維細胞分別為來源於大鼠的原代培養的細胞；所使用的核層材料和殼層材料如實施例1所述。另外，為了促進細胞增殖和分化，在包含血管內皮細胞的生物磚核層中添加血管內皮生長因子(VEGF)；在包含血管平滑肌細胞的生物磚核層中添加血小板源生長因子(PDGF)；在包含成纖維細胞的生物磚核層中添加成纖維細胞生長因子(FGF)。所製備的包含血管內皮細胞的生物磚大小為約30 μm，內含2-3個血管內皮細胞；包含血管平滑肌細胞的生物磚大小為約200 μm，內含50個左右的血管平滑肌細胞；包含成纖維細胞的生物磚大小為約100 μm，內含10個左右的成纖維細胞。 (3)將生物黏合劑分別與前一步驟獲得的3種生物磚混合，製備獲得三種生物墨汁。所使用的生物黏合劑為海藻酸鈉與明膠；生物黏合劑與生物磚的用量比為1:4 (按重量計)。應當注意的是，步驟(1)可以在步驟(2)和(3)之前，與之同時，或之後進行。 (4)使用3D生物印表機，以旋轉列印方式進行列印。列印過程中，以血管結構數位模型為範本，使用對應的生物墨汁進行生物列印，其中，如圖2所示，血管的最內層結構使用包含含有血管內皮細胞的生物磚的生物墨汁進行列印，中間層結構使用包含含有血管平滑肌細胞的生物磚的生物墨汁進行列印，最外層結構使用包含含有成纖維細胞的生物磚的生物墨汁進行列印。生物磚通過生物黏合劑而固化，形成血管前體。 (5)將血管前體置於三維培養箱中，在37ºC，5% CO₂ 的條件下使用常規細胞培養基(H-DMEM培養基與10%胎牛血清)對血管前體進行培養。培養過程中，可對血管前體施加物理刺激，例如剪切力。連續培養7-10天，使血管前體形成血管。

實施例14. 人工肝臟組織的生物列印

使用實施例12中描述的方法來製備生物磚，其中，使用以10:1的比例混合的脂肪來源的間充質幹細胞(MSC)與原代培養的肝臟細胞(Hepatocyte)的混合物作為種子細胞；使用I型膠原作為核材料；並且，使用聚賴氨酸作為殼材料。使用3D生物印表機，將製備好的生物磚進行生物列印，並置於37ºC、5% CO₂ 、含10%胎牛血清的H-DMEM環境下培養7天，以製備人工肝臟組織。隨後，對獲得的人工肝臟組織進行HE染色和針對白蛋白的免疫組化染色，結果示於圖18。圖18的HE染色結果顯示，在使用生物磚列印獲得的人工肝臟組織中，細胞呈條索狀排列，且該人工組織產生了類似肝小葉的結構，與正常肝臟組織相似。此外，圖18的免疫組化染色結果顯示，處於人工肝臟組織內部的肝臟細胞能夠正常分泌肝臟特異性蛋白——白蛋白(Albumin)，而處於邊緣的非肝臟細胞則不表達白蛋白。這些實驗結果表明，本發明的生物磚可用於生物列印人工肝臟組織。

實施例15.包含微血管的構建體的生物列印

使用3D生物印表機，將實施例12中製備好的生物磚以環樣結構進行列印，並置於37ºC、5% CO₂ 、含10%胎牛血清的H-DMEM環境下培養9天。將培養後的人工組織體進行切片，並使用CD31抗體(RD, US)對切片進行染色。染色結果示於圖19。結果顯示，使用生物磚列印獲得的人工組織內出現了大量的微血管(圖19)。這些實驗結果表明，所製備的生物磚可用於生物列印包含微血管的構建體。

實施例16. 不同種類和比例的種子細胞對微血管形成的影響

使用實施例12中描述的方法，採用下表描述的細胞組合製備生物磚。然後，使用實施例15描述的方法，將製備的生物磚列印、培養、切片染色，並觀察所獲得的人工組織內的微血管結構。結果分別示於圖20A-20G。表4

注：BMSC：骨髓來源的間充質幹細胞；SMC: 血管平滑肌細胞；HUMSC: 人臍帶間充質幹細胞。

這些實驗結果表明，當種子細胞為HUVEC和BMSC時，採用1:1.5至1:20之間不同比例的HUVEC和BMSC的組合均可以見到微血管形成，尤其是當HUVEC和BMSC的比例為1:10時，能夠形成大量的微血管(圖20A-20D)。另外，當種子細胞中除了HUVEC和BMSC，還存在大鼠肝臟細胞時，也可以見到微血管形成(資料未顯示)。特別地，當HUVEC：肝臟細胞：BMSC = 1:1:10時，可以見到大量微血管(圖20E)。此外，當種子細胞中除了HUVEC和BMSC，還存在SMC(血管平滑肌細胞)時，也可以觀察到微血管形成(圖20F)。此外，當種子細胞為HUVEC和HUMSC時，採用1:1.5至1:20之間不同比例的HUVEC和HUMSC的組合也可以見到微血管形成(資料未顯示)。例如，當HUVEC和HUMSC的比例為1:3時，可以見到微血管形成(圖20G)。

實施例17：生物磚的各種應用

幹細胞分化的研究

製備各自包含來源於骨髓的間充質幹細胞的多種分離的生物磚。向每一種分離的生物磚添加誘導幹細胞朝向成骨細胞，脂肪細胞，軟骨細胞或肌細胞分化的試劑或試劑組合。在相同的培養系統，例如在相同的容器(例如培養皿或培養瓶)中培養所述多種分離的生物磚。觀察各個分離的生物磚中的細胞，分析細胞中的幹細胞標誌物的表達情況，並評估不同的微環境對幹細胞分化的影響。

組織再生

本實施例提供了示例性的組織再生方法，其用於修復皮膚中的大傷口，避免大傷口的天然恢復過程所可能導致的大的傷疤。

首先，使用醫學成像方法來掃描傷口，以獲得皮膚以及傷口部位的結構資訊。

其次，基於醫學成像資料，根據傷口的結構資訊和皮膚組織的細胞分佈資訊，構建數位修復模型。進一步，基於數位修復模型，製備相應類型的生物磚，包括含有成纖維細胞的生物磚，含有內皮細胞的生物磚。隨後，根據數位修復模型，將這些生物磚用於直接在傷口上進行生物列印。在某些情況下，生物磚中的細胞來源於獲自相同受試者的自體幹細胞。在生物列印後，生物磚中的細胞在傷口部位的不同層和微環境中增殖和分化，形成了相應的組織層和結構，從而修復了皮膚的傷口。

實施例18：構建體的各種應用

使用構建體來體外研究組織發育

製備多種生物磚，其各自包含不同類型的幹細胞。根據目的組織的細胞分佈模式，使用所製備的生物磚進行生物列印，獲得相應的構建體(即，組織前體)。在合適的條件下，體外培養所獲得的組織前體，以使其發育為目的組織。將生物磚中的細胞暴露於可能影響組織發育的候選試劑或試劑組合。然後，觀察整個發育過程中，生物磚中的細胞的變化以及組織發育過程的變化。

移植物免疫學的體內研究

製備包含來源於即將接受組織移植的受試者(實驗動物)的細胞的生物磚。使用所製備的生物磚進行生物列印，以獲得組織前體或人工組織。隨後，將組織前體或人工組織植入受試者中，並觀察受試者對組織前體或人工組織的免疫學應答，包括生物相容性和免疫排斥。

藥物發現

製備合適的生物磚，並將其列印為與藥物功能相關的人工組織。根據製備過程中所使用的條件，例如生物磚中的細胞的來源，生物磚的核層中包含的試劑或刺激，或培養條件，此類人工組織可以為健康組織或患病組織。將所獲得的人工組織暴露於一組化合物，並任選地，將各種化合物對患病的人工組織的作用與相同化合物對相應健康的人工組織的作用進行比較，從而確定各種化合物對與該組織相關的疾病的治療效果。還基於化合物對健康的人工組織的影響來確定各種化合物的毒性和副作用。隨後，將具有最佳治療效果和/或最低毒性和副作用的化合物，或者在治療效果與副作用之間取得最佳平衡的化合物確定為前導化合物，用於進一步的藥物研發。

儘管本發明的具體實施方式已經得到詳細的描述，但本領域技術人員將理解：根據已經公開的所有教導，可以對細節進行各種修改和變動，並且這些改變均在本發明的保護範圍之內。本發明的全部範圍由所附申請專利範圍及其任何等同物給出。

圖1A-1E示意性描述了本發明的生物磚的示例性結構，其包括：細胞，其能夠進行生長、增殖、分化或遷移；包裹細胞的核層，其由生物可降解材料製成，並且為細胞的生命活動提供微環境，例如營養物質；和，封裝核層的殼層，由生物可降解材料製成，其為內部的核層和細胞提供力學保護，並維持生物磚的空間狀態。此外，所述殼層是通透性的，具有用於生物磚內外物質交換的通道。在優選的實施方案中，細胞可均勻分散於核層中，或者可以聚集在一起，位於核層內部。其中，圖1A示意性描述了本發明生物磚的一種結構，其包括一個核層和一個殼層，其中，所述核層包裹有細胞，並且所述殼層位於核層外側，且封裝核層。圖1B示意性描述了本發明生物磚的一種結構，其由內到外依次包含：包裹細胞的核層、封裝所述核層的第一殼層、和圍繞第一殼層的第二殼層。圖1C示意性描述了本發明生物磚的一種結構，其由內到外依次包含：包裹細胞的第一核層、位於第一核層外側的包裹細胞的第二核層、和封裝所述第一核層和第二核層的第一殼層。圖1D示意性描述了本發明生物磚的一種結構，其由內到外依次包含：包裹細胞的第一核層、位於第一核層外側的包裹細胞的第二核層、封裝所述第一核層和第二核層的第一殼層、和圍繞第一殼層的第二殼層。圖1E示意性描述了本發明生物磚的一種結構，其由內到外依次包含：包裹細胞的第一核層、封裝所述第一核層的第一殼層、包裹細胞的第二核層、和封裝所述第二核層的第二殼層。圖2示意性描述了使用本發明生物磚構建的三維構建體的一個結構實例，其包括三層結構，即，內皮細胞層，平滑肌細胞層和成纖維細胞層。其中，內皮細胞層由包含內皮細胞的生物磚構建；平滑肌細胞層由包含平滑肌細胞的生物磚構建；成纖維細胞層由包含成纖維細胞的生物磚構建。內皮細胞層，平滑肌細胞層和成纖維細胞層各自可以由一層或多層細胞構成，根據所使用的生物磚中含有的細胞的具體數量而定。生物磚之間的間隙填充有生物黏合劑。在優選的實施方案中，生物黏合劑中可進一步包含維持、促進、改善、調控生物磚內的細胞的生命活動的試劑。例如，當生物磚中的細胞為內皮細胞時，生物黏合劑中可進一步包含促進內皮細胞生長和分化的細胞因子。在優選的實施方案中，本發明的三維構建體是使用本發明的生物磚，通過3D生物列印方法而構建的。然而，不受於理論限制，本發明的三維構建體也可以使用本發明的生物磚，通過任何其他已知的方法(例如手工放置的方法)來構建。圖3A-3C顯示了使用造粒儀在不同儀器參數下製備的生物磚的相差顯微照片。其中，圖3A中的生物磚的直徑為約120 mm(尺規為100 mm)；圖3B中的生物磚的直徑為約200 mm(尺規為100 mm)；圖3C中的生物磚的直徑為約450 mm(尺規為200 mm)。圖3A-3C的生物磚中所使用的細胞為人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)，殼層的主要成分是海藻酸鈣，核層的主要成分是海藻酸鈉與I型膠原。這些結果表明，可通過控制造粒儀的儀器參數(例如，同心噴嘴的內噴嘴和外噴嘴的直徑)來控制生物磚的尺寸。本發明的生物磚的尺寸是可控的，可根據需要進行選擇。圖4顯示了通過實施例1方法製備的生物磚A的顯微照片，其中，高亮部分代表生物磚的殼層，且該殼層的厚度為約2 mm(尺規為50 mm)。圖4的生物磚中所使用的細胞為人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)，殼層的主要成分是海藻酸鈣，核層的主要成分是海藻酸鈉與I型膠原。結果表明，可通過控制造粒儀的同心噴嘴的內噴嘴和外噴嘴的直徑，殼層材料的泵出速度等參數來控制殼層的厚度。本發明的生物磚的殼層厚度是可控的，可根據需要進行選擇。圖5A-5C顯示了通過實施例1方法製備的生物磚的顯微照片，其中，圖5A中的生物磚包裹的細胞數為約50個(尺規為100 mm)；圖5B中的生物磚包裹的細胞數為約8個(尺規為100 mm)；圖5C中的生物磚包裹的細胞數為約2個(尺規為100 mm)。圖5A-5C的生物磚中所使用的細胞為人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)，殼層的主要成分是海藻酸鈣，核層的主要成分是海藻酸鈉與I型膠原。這些結果表明，可通過控制細胞懸液的細胞濃度來控制生物磚包裹的細胞數。本發明生物磚包含的細胞的數量是可控的，可根據需要進行選擇。圖6A-6D顯示了使用造粒儀製備的生物磚B1-B4的顯微照片，其中，圖6A中的生物磚為生物磚B1，其直徑為約600 mm (尺規為500 mm)；圖6B中的生物磚為生物磚B2，其直徑為約500 mm (尺規為500 mm)；圖6C中的生物磚為生物磚B3，其直徑為約500 mm (尺規為500 mm)；圖6D中的生物磚為生物磚B4，其直徑為約500 mm (尺規為500 mm)。這些結果表明，可使用各種合適的生物可降解材料來製備本發明的生物磚。圖6E顯示了用包裹有Tracker CM-Dil (紅色螢光)標記的細胞的核層材料和帶有FITC(綠色螢光)的殼層材料製備的生物磚B2的共聚焦顯微圖像，其中，綠色螢光代表殼層，紅色螢光代表核層所包裹的細胞。圖7A顯示了使用本發明的生物磚製備的生物墨汁的顯微照片。其中，生物磚包含人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)，並且其殼層的主要成分是海藻酸鈣，核層的主要成分是海藻酸鈉與I型膠原，且包含甲基紫染料；生物黏合劑的主要成分是海藻酸鈉與明膠。如圖7A所示，紫色染色僅存在於生物磚內部，而不存在於生物墨汁的載體(生物黏合劑)中。這表明生物磚的殼層能夠在生物墨汁中保持生物磚的完整性。圖7B顯示了用本發明的生物墨汁列印得到的單細胞層的顯微照片。其中，生物磚包含人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)，並且其殼層的主要成分是海藻酸鈣，核層的主要成分是海藻酸鈉與I型膠原，且包含甲基紫染料；生物黏合劑的主要成分是海藻酸鈉與明膠。如圖7B所示，紫色染色僅存在於生物磚內部，而不存在於生物墨汁的載體(生物黏合劑)中。這表明生物磚的殼層能夠在生物列印過程中保持生物磚的完整性。圖8顯示了所使用的生物黏合劑(海藻酸鈉與明膠)的黏度分析。結果顯示，在25ºC至40ºC下，所使用的生物黏合劑的黏度為30-160 Pa∙s；並且，隨著溫度升高，生物黏合劑的黏度有所下降。圖9A-9D顯示了使用共聚焦顯微鏡觀察通過實施例1方法製備的生物磚中細胞活力的分析結果，其中，所述生物磚用鈣黃綠素(綠色螢光)和碘化丙啶(紅色螢光)進行了雙重染色；所使用的細胞為人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)，殼層的主要成分是海藻酸鈣，核層的主要成分是海藻酸鈉與I型膠原。圖9A顯示了在生物磚製備之後立即進行的生物磚中細胞活力的分析結果。在圖9A中，每個標記的白色圓圈代表一個生物磚，並且，高亮點為紅色螢光(代表死細胞)，低亮點為綠色螢光(代表活細胞)。圖9A的結果顯示，在用實施例1的方法製備生物磚後，生物磚中98%以上的細胞存活。圖9B顯示了將製備的生物磚在4ºC下儲存3小時後，生物磚中細胞活力的分析結果。在圖9B中，每個標記的白色圓圈代表一個生物磚，並且，高亮點為紅色螢光(代表死細胞)，低亮點為綠色螢光(代表活細胞)。圖9B的結果顯示，所製備的生物磚在4ºC下保存3小時後，生物磚中的細胞仍然保持高活力(存活率為90%)。圖9C顯示了在將生物磚製備成生物墨汁並進行生物列印後，立即進行的生物磚中細胞活力的分析結果。在圖9C中，高亮點為紅色螢光(代表死細胞)，低亮點為綠色螢光(代表活細胞)。圖9C的結果顯示，將生物磚製備成生物墨汁並立即進行生物列印後，生物磚中的細胞仍然保持高活力(存活率為97%)。圖9D顯示了所製備的生物磚在37ºC下，在H-DMEM培養基中培養5天後，生物磚中細胞活力的分析結果。在圖9D中，高亮點為紅色螢光(代表死細胞)，低亮點為綠色螢光(代表活細胞)。圖9D的結果顯示，所製備的生物磚在37ºC下培養5天後，生物磚中的細胞仍然保持高活力(存活率為95%)。圖10A-10B顯示了使用共聚焦顯微鏡觀察通過實施例1方法製備的生物磚中細胞的黏附和伸展的分析結果，其中，所述生物磚用鈣黃綠素(綠色螢光)和碘化丙啶(紅色螢光)進行了雙重染色；所使用的細胞為HepG2，殼層的主要成分是海藻酸鈣，核層的主要成分是海藻酸鈉與I型膠原。圖10A顯示了在培養生物磚第1天，使用共聚焦顯微鏡觀察到的照片(放大倍數：40倍)，其中細胞呈圓形，未黏附伸展。圖10B顯示了培養所述生物磚5天後，使用共聚焦顯微鏡觀察到的照片(放大倍數：200倍)，其中細胞黏附伸展。圖10A-10B的結果表明，在培養5天後，生物磚內的細胞伸展並建立細胞間連接。圖11顯示了使用共聚焦顯微鏡觀察生物磚中的細胞增殖的分析結果(放大倍數：200倍)，其中，所述生物磚用DAPI(藍色螢光)和EdU(紅色螢光)進行了雙重染色；所使用的細胞為HepG2細胞，殼層的主要成分是海藻酸鈣，核層的主要成分是海藻酸鈉與I型膠原。圖11的結果表明，在培養5天後，生物磚內的細胞處於增殖狀態。圖12A-12B顯示了通過傳統方法製備的細胞微球在培養過程中的細胞增殖情況(尺規為500 mm)。結果顯示，與培養之前(圖12A)相比，培養7天後(圖12B)的細胞微球中的細胞增殖不明顯，細胞呈圓形，並呈瀰漫性分佈。圖12C-12D顯示了使用實施例1方法製備的生物磚在培養過程中的細胞增殖情況(尺規為500 mm)。結果顯示，與培養之前(圖12C)相比，培養7天後(圖12D)的生物磚中的細胞增殖明顯，細胞在生物磚中伸展、黏附，並相互連接在一起。圖12E顯示了使用實施例1方法製備的生物磚在培養7天後的顯微照片(尺規為100 mm)。結果顯示，生物磚中的HepG2細胞之間相互連接，形成有機的整體。圖12A-12E的結果表明，與傳統方法製備的細胞微球相比，本發明的生物磚能夠更好地促進細胞的增殖，促進細胞之間建立連接。圖13顯示了使用共聚焦顯微鏡觀察培養7天後的生物磚的結果(圖中尺規為100 mm)，其中，所使用的生物磚包含用綠色螢光標記的HepG2細胞和用紅色螢光標記的HUVEC細胞，並且圖中的黃色區域是由紅色螢光和綠色螢光疊加所致，這表明HepG2細胞和HUVEC細胞之間建立了連接。結果顯示，生物磚內部的HepG2細胞之間、HUVEC細胞之間以及HepG2細胞與HUVEC細胞之間均建立了細胞間連接。圖14A顯示了使用共聚焦顯微鏡觀察培養7天後的生物磚的結果(圖中尺規為100 mm)，其中，所使用的生物磚包含分別用CellTracker™ CMFDA(綠色螢光)標記的HepG2細胞和HUVEC細胞。結果顯示，兩個生物磚的細胞之間建立了細胞連接，如方框中的橋狀結構所顯示的。圖14B顯示了使用共聚焦顯微鏡觀察培養7天後的生物磚的結果(圖中尺規為500 mm)，其中，使用了兩種生物磚：一種生物磚包含用CellTracker™ Green CMFDA (綠色螢光)標記的HepG2細胞，且另一種生物磚包含用CellTracker™ CM-Dil (紅色螢光)標記的HUVEC細胞；並且，圖中的黃色區域是由紅色螢光和綠色螢光疊加所致。結果顯示，表達紅色螢光的生物磚與表達綠色螢光的生物磚之間建立了細胞連接，如圖中的黃色區域所顯示的。圖14C顯示了使用共聚焦顯微鏡觀察培養7天後的生物磚的結果(圖中尺規為500 mm)，其中，所使用的生物磚包含用CellTracker™ Green CMFDA (綠色螢光)標記的HepG2細胞和HUVEC細胞；並且，圖中的各個白色圓環分別表示一個生物磚。結果顯示，不同生物磚的細胞之間建立了細胞連接，並形成有機的整體。圖15顯示了包含MSC細胞的生物磚的顯微照片，其中，圖15A顯示了包含間質幹細胞(Mesenchymal Stem Cell, MSC)的單個生物磚(尺規為100 μm)；圖15B顯示了培養7天後的包含MSC細胞的生物磚(尺規為500 mm)；圖15C顯示了培養9天後的包含MSC細胞的生物磚(尺規為500 mm)。結果顯示，培養7天後，多個包含MSC細胞的生物磚相互融合(如圖15B中的白色箭頭所指示的)；並且，培養9天後，包含MSC細胞的生物磚完全融合，形成有機整體(如圖15C所顯示的)。圖16A顯示了通過實施例10的方法製備的第一生物磚在37ºC，5% CO₂ 下培養1天後的顯微照片。結果顯示，MSC細胞正常生長，但未出現分化。圖16B顯示了通過實施例10的方法製備的第一生物磚在37ºC，5% CO₂ 下培養10天後經茜素紅染色的顯微照片，其中，粗箭頭所指處為一個完整的生物磚，細箭頭所指處為鈣結節。結果顯示，生物磚內出現大量鈣結節，如細箭頭所指示。這表明，第一生物磚中的MSC細胞向成骨細胞分化。圖17示意性地描述了使用本發明的生物磚/生物墨汁來生物列印血管的流程圖。圖18顯示了使用生物磚列印獲得的人工肝臟組織的HE染色結果和針對白蛋白的免疫組化染色結果。圖18的HE染色結果顯示，在使用生物磚列印獲得的人工肝臟組織中，細胞呈條索狀排列，且該人工組織產生了類似肝小葉的結構，與正常肝臟組織相似。此外，圖18的免疫組化染色結果顯示，處於人工肝臟組織內部的肝臟細胞能夠正常分泌肝臟特異性蛋白-白蛋白(albumin)，而處於邊緣的非肝臟細胞則不表達白蛋白。這些實驗結果表明，本發明的生物磚可用於生物列印人工肝臟組織。圖19顯示了使用CD31抗體對實施例15獲得的人工組織體的切片進行染色的染色結果。結果顯示，使用生物磚列印獲得的人工組織體內出現了大量的微血管。這些實驗結果表明，所製備的生物磚可用於生物列印包含微血管的構建體。圖20A-20G顯示了以不同種類和比例的種子細胞進行列印而獲得的微血管。

Claims

一種生物磚，其是生物列印的基本單元，所述生物磚包含：細胞，包裹所述細胞的核層；和封裝所述核層的殼層；其中，所述核層包裹25至5000個所述細胞，所述核層和所述殼層各自獨立地由生物可降解材料製成；且所述生物磚具有0.01至0.4GPa的硬度和0.01至100MPa的彈性模量；其中，所述生物可降解材料是天然存在的、人工合成的、經過改性的，或其等之任意組合；所述天然存在的生物可降解材料選自膠原蛋白、纖維蛋白、殼聚糖、海藻酸鹽、澱粉、透明質酸、層黏連蛋白、瓊脂糖、明膠、葡聚糖，以及其等之任意組合；所述經過改性的生物可降解材料為氧化的海藻酸鹽；以及所述人工合成的生物可降解材料選自聚磷腈、聚丙烯酸及其衍生物、聚乳酸、聚羥基乙酸、聚乳酸-乙醇酸共聚物、聚原酸酯、聚己內酯、聚羥基丁酸酯、聚氨基酸、可降解性聚氨酯，以及其等之任意組合。
如請求項1所述之生物磚，其中，所述核層能夠為所述細胞的生命活動提供微環境。
如請求項1所述之生物磚，其中，所述殼層為受包裹的所述細胞提供了力學保護。
如請求項1所述之生物磚，其中，所述生物磚的至少一個所述殼層包含氧化的海藻酸鹽。
如請求項1所述之生物磚，其中，所述殼層各自獨立地為通透性的。
如請求項1所述之生物磚，其中，所述核層和/或所述殼層各自獨立地還包含額外的試劑。
如請求項1所述之生物磚，其中，所述核層各自獨立地包裹多個所述細胞。
如請求項1所述之生物磚，其中，所述細胞包括內皮細胞。
如請求項1所述之生物磚，其中，所述細胞包括間質幹細胞(Mesenchymal Stem Cell，MSC)。
如請求項9所述之生物磚，其中，所述核層提供誘導所述MSC向成骨細胞或骨分化的微環境。
如請求項9所述之生物磚，其中，所述核層提供誘導所述MSC向成軟骨細胞或軟骨分化的微環境。
一種製備如請求項1至11中任一項所述之生物磚的方法，其包括下述步驟：(1)提供一種或多種核層材料，所述核層材料各自獨立地由所述生物可降解材料製成，並且各自獨立地包裹相同或不同的所述細胞或所述細胞之組合；(2)提供一種或多種殼層材料，所述殼層材料各自獨立地由所述生物可降解材料製成；(3)從所述步驟(1)的一種或多種所述核層材料中選擇一種核層材料，並將其顆粒化，從而獲得第一核層；(6)使用來自所述步驟(2)的一種所述殼層材料對前一步驟的產物進行包被，從而產生所述生物磚。
如請求項12所述之方法，其中，所述步驟(3)與所述步驟(6)之間，還存在步驟(4)：使用來自所述步驟(1)的一種所述核層材料或使用來自所述步驟(2)的一種所述殼層材料對前一步驟獲得的產物進行包被。
如請求項13所述之方法，其中，所述步驟(4)與所述步驟(6)之間，還存在步驟(5)：重複所述步驟(4)一次或數次。
如請求項12所述之方法，其具有選自下列的一個或多個技術特徵：(a)在所述步驟(2)中，至少一種所述殼層材料包含氧化的海藻酸鹽；(b)在所述步驟(1)中，至少一種所述核層材料包裹的細胞是內皮細胞；和(c)在所述步驟(1)中，至少一種所述核層材料包裹的細胞是MSC，並且，所述核層材料還包含誘導所述MSC向成骨細胞或骨分化的誘導因子或誘導所述MSC向成軟骨細胞或軟骨分化的誘導因子。
一種組合物，其包含請求項1至11中任一項所述的生物磚。
一種製備如請求項16所述的組合物的方法，其包括下述步驟：將請求項1至11中任一項所述的生物磚與載體混合。
一種構建體，其包含如請求項1至11中任一項所述的生物磚。
一種製備構建體的方法，其包括使用如請求項1至11中任一項所述的生物磚或如請求項16所述的組合物的步驟。
一種如請求項1至11中任一項所述的生物磚的用途，其中，所述生物磚用於體外培養細胞；用於體外使細胞生長、增殖、分化、分泌或遷移；用於體外生物列印；或用於體外形成構建體。
一種如請求項16所述的組合物的用途，其用於體外生物列印；或用於體外形成構建體。
一種如請求項1至11中任一項所述的生物磚或如請求項18所述的構建體的用途，其用於研究幹細胞分化，用於藥物發現，用於藥物篩選，用於體外測定，用於體外評估因子對組織或組織中的細胞的作用，或用於體外三維組織培養。
一種如請求項1至11中任一項所述的生物磚或如請求項18所述的構建體的用途，其用於製備試劑盒，所述試劑盒用於體內測定，用於植入宿主體內，用於組織工程，用於組織再生，用於分析細胞在體內響應刺激或試劑而產生的變化，用於研究體內微環境的影響，用於治療有此需要的受試者，用於體內評估因子對組織或組織中的細胞的作用，用於體內三維組織培養，或用於修復受試者中損傷組織。
一種試劑盒，其包含如請求項1至11中任一項所述的生物磚、如請求項16所述的組合物或如請求項18所述的構建體。
一種藥物組合物，其包含一種或多種如請求項1至11中任一項所述的生物磚；並且，所述藥物組合物還包含藥學可接受的載體，賦形劑，穩定劑或能夠為所述藥物組合物的施用提供有利性質的其他試劑。
一種如請求項1至11中任一項所述的生物磚用於製備藥物組合物的用途。
一種容器，其包含如請求項1至11中任一項所述的生物磚。
一種體外分析細胞響應刺激或試劑而產生的變化的方法，其包括：將請求項1至11中任一項所述的生物磚中的所述細胞暴露於所述刺激或試劑，和評估所述生物磚中的所述細胞的變化。
一種體外研究幹細胞分化的方法，其包括：使用如請求項1至11中任一項所述的生物磚，其中，所述生物磚中的所述細胞包括幹細胞。
一種體外評估因子對組織或組織中的細胞的作用的方法，其包括：將請求項18所述的構建體暴露於所述因子，和評估所述構建體中的所述細胞回應所述因子的變化，從而確定所述因子對所述組織或組織中的細胞的作用。
一種三維組織培養的方法，其包括：提供請求項1至11中任一項所述的生物磚，所述生物磚中的所述細胞為待培養的細胞，以及提供用於組織培養或細胞培養的試劑或其他組分；和培養所述生物磚。