CN103272288B - 基于生物打印技术的细胞-生物支架复合物的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于生物打印技术的细胞-生物支架复合物的制备方法及其应用，所述细胞-生物复合物由患者自体血液中提取的纤维蛋白经喷墨打印技术制备而成，其表面和内部包覆有一种或几种营养因子和来源于自体的骨髓间充质干细胞。本发明利用生物打印技术，可根据需要和实际情况设计外观形状和细胞、营养因子包覆状态模型，精确打印得到细胞-生物支架复合物，所述的纤维蛋白和骨髓间充质干细胞均来源于自体，避免了免疫排斥等问题，且营养因子种植在支架内部，随支架材料的降解缓慢释放，长期作用于脊髓损伤部位，以促进损伤部位的神经再生和功能修复。

Description

基于生物打印技术的细胞-生物支架复合物的制备方法

技术领域

本发明涉及一种用于治疗脊髓损伤的细胞-生物支架复合物的构建，尤其是一种基于生物打印技术的细胞-生物支架复合物的制备方法及其应用。 

背景技术

脊髓损伤是一种严重的中枢神经系统创伤性疾病，具有高耗费、高致残率等特点，给社会带来巨大的损伤和沉重的负担。由于脊髓连续性的中断、神经元缺失、神经营养因子缺乏、胶质瘢痕和空洞形成等导致脊髓损伤后神经再生的困难。药物、手术等传统治疗方法无法解决再生的问题，而异体脱细胞支架来源有限、且存在较大的免疫排斥。近年来基础研究特别是神经组织工程技术的发展，在脊髓损伤后神经功能恢复的研究方面取得了较大进步，使神经再生和修复成为可能。 

神经组织工程技术是在损伤部位植入种植有细胞的三维生物工程材料，以达到修复损伤神经组织的目的。组织工程材料主要有天然高分子材料和可降解高分子合成材料。天然高分子材料具有良好的生物相容性，在体外能促进细胞的粘附、增殖与分化，且方便承载神经营养因子，与脊髓组织的整合性好，能够降低炎症反应以及减少星形胶质细胞增生所形成的瘢痕，在一定程度上能够促进受损脊髓结构和功能的恢复。天然高分子材料包括胶原、壳聚糖和海藻酸盐等。其中纤维蛋白可以从患者血液中获得，用患者自身的纤维蛋白做水凝胶支架，减轻了仿生支架植入体内产生的免疫排斥，且纤维蛋白水凝胶中含有转化生长因子β和血小板衍生生长因子，可以促进细胞的迁移、增殖和细胞外基质合成，因而具有广阔的应用前景。 

用于脊髓损伤修复的种子细胞目前主要有干细胞、嗅鞘细胞、雪旺细胞等。骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,MSCs）是骨髓内造血干细胞以外的非造血干细胞，其在体内、体外均有跨胚层分化为神经细胞和胶质细胞的潜能。研究表明，骨髓间充质干细胞移植到脊髓损伤模型中可以迁移到损伤部位，并在局部微环境的作用下分化为神经元和神经胶质细胞，替代损伤细胞，重建神经环路，并分泌神经营养因子促进脊髓损伤的修复。MSCs取材方便、扩增迅速、可实现自体移植，避免免疫排斥和伦理学约束，是目前广泛应用的一种种子细胞。 

神经营养因子(neurotrophic factors，NTFs)是一类对神经元存活、生长有维持作用的多肽类生长因子，损伤处微环境中NTFs的缺乏可能是神经再生困难的关键因素之一。其在脊髓损伤时可调节神经元的可塑性和促进神经再生，因此应用外源性的NTFs治疗脊髓损伤是目前的研究热点之一，应用较多的有神经生长因子（NGF）、脑源性神经营养因子（BDNF）和神经营养素-3（NT-3）等。研究表明，BMSCs移植治疗脊髓损伤与神经营养因子如BDNF、NGF等具有协同作用。 

研究表明，联合治疗策略有望使脊髓损伤修复达到更好的效果，如神经营养因子与细胞-生物支架复合物联合应用。但是传统组织工程方法是建立在预先制作好的固体支架和分离的患者正常组织细胞基础上的，将患者正常组织细胞进行培养扩增后接种到预先制造的可降解生物支架中，细胞-生物支架复合物在体外进行培养后被移植到患者体内，可降解生物支架不断降解直至消失，同时细胞在支架中增殖分化，最终在体内形成形态和功能与正常组织和器官一致的替代物。虽然这种方法在构建结构简单的空腔组织和器官取得了一些巨大成功，但是这方法存在许多不足，特别是在构建内部结构复杂的组织和器官时，这种方法中，细胞无法精确种植到支架内部，只是随机吸附表面，细胞活性因子只能影响支架表面细胞的生长分化，但对支架内部细胞活性的控制则很难做到，鉴于传统组织工程方法的局限性，寻找更加科学的组织工程技术迫在眉睫。 

喷墨打印技术是将墨滴喷射到接受体形成图像或文字的非接触性打印技术，它不仅应用于办公喷墨打印机，而且被成功的运用于医学与生物医学工程中。生物打印的纸片理论上设计为一种在体内可降解的生物纸片；生物打印的墨水理论上设计为特质的细胞溶液或有生物活性的营养因子溶液。将这种特制溶液喷射到可降解的生物纸片上，打印后再将纸片按一定顺序堆叠。使用生物打印技术，可以将细胞/营养因子精确的结合到预定部位。随着该技术的研究不断深入，研究表明喷墨打印技术适用于打印细胞、生物支架材料和细胞活性因子，其在器官打印中的应用也日益受到关注，这为组织工程在构建仿生组织和器官中的成功运用带来了新的希望。 

中国专利公开号CN101829361A公开了一种用于组织修复的纳米仿生材料及其制备方法，所述纳米仿生材料包括纳米仿生支架和附着于其上的水溶胶，水溶胶内包覆有一种或几种营养因子/细胞。其所述制备方法包括制备电纺溶液和含有营养因子/细胞的水溶液；用静电纺丝制得纳米仿生支架；用喷墨打印机将含有营养因子/细胞的水溶液打印到纳米仿生支架上等步骤。 

中国专利公开号CN102908207A提供了一种基于生物打印技术的组织工程神经移植物及其制备方法，所述组织工程神经移植物包括外管和管内纤维支架，内外表面可包覆营养因子/细胞。利用生物打印技术，按照神经实际形态需求进行高真度仿真打印，通过调整喷墨打印机喷嘴的大小、数量、喷嘴到底层的距离、增压器脉冲频率和编制特定打印的控制程序，用喷墨打印机将聚合物材料溶液打印成特定的神经移植物。 

近期，有研究者运用喷墨打印技术层层打印纤维蛋白单体和凝血酶，成功的构成了3D 纤维蛋白水凝胶支架，扫描电镜观察3D纤维蛋白支架，通过纤维蛋白水凝胶的多孔性和纤维蛋白纤维的形态学分析表明，纤维蛋白水凝胶支架具有呈现一个疏松多孔的微结构，这种结构可以更有效的为支架内的细胞输送营养与氧气。 

综上，本发明专利通过提取患者自身血液中的纤维蛋白，利用生物打印技术打印一层纤维蛋白水凝胶层，然后在水凝胶层上打印神经营养因子和来源于患者自身的BMSCs，如上步骤层层叠加，从而形成用于脊髓损伤移植的细胞-生物支架复合物。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于生物打印技术的细胞-生物支架复合物的制备方法及其应用治疗脊髓损伤，以促进损伤部位的神经再生和功能修复。 

本发明提出的基于生物打印技术的细胞-生物支架复合物的制备方法，获取患者自身的BMSCs和纤维蛋白，制备含有营养因子/细胞的水溶液；利用生物打印技术打印一层纤维蛋白单体和凝血酶，获得纤维蛋白水凝胶层；在水凝胶层上打印神经营养因子和BMSCs；层层叠加，从而形成用于脊髓损伤移植的细胞-生物支架复合物；具体步骤如下： 

(1).自体血液中提取纤维蛋白原，抽取受试者血液，制备纤维蛋白原；

(2).制备自体骨髓间充质干细胞（BMSCs）溶液；

(3).制备神经营养因子水溶液，所述神经营养因子为碱性成纤维生长因子（bFGF）、脑源神经营养因子（BDNF）、神经营养因子3（NT-3）或胶质细胞源神经营养因子（GDNF）中的一至几种，神经营养因子在细胞-生物支架复合物上的量为1μg/g-10mg/g。

(4).细胞-生物支架复合物的打印 

(4.1)将步骤(1)得到的纤维蛋白原溶于PBS，配置成浓度为10mg/mL的溶液，装于打印机墨盒中；凝血酶溶于GaCl₂溶液，配置成浓度为20IU/mL的溶液，装于另一墨盒中；

(4.2)调整与装有纤维蛋白原墨盒的打印机喷嘴针头直径为200μm,针头数量为8个，喷嘴到底层的距离为50mm，增压器脉冲频率15v；

调整与装有凝血酶墨盒的打印机喷嘴针头直径为100μm，针头数量为10个，喷嘴到底层的距离为25mm,增压器脉冲频率15v；

(4.3)根据实际需求，设计细胞-生物支架复合物的形状，在盖玻片上打印一薄层纤维蛋白原，更换装有凝血酶墨盒的喷头，在纤维蛋白原薄层上连续打印三次，凝胶时间3-5min。

(4.4)调整与装有自体骨髓间充质干细胞墨盒的打印机喷嘴针头直径为100μm，针头数量为6个，喷嘴到底层的距离为25mm,增压器脉冲频率15v； 

调整与装有一种或几种神经营养因子墨盒的打印机喷嘴针头直径为50-200μm，针头数量为3-6个，喷嘴到底层的距离为25mm,增压器脉冲频率15v；

(4.5)根据实际需求，设计细胞和营养因子包覆形态，编制相应的控制程序，在上述纤维蛋白水凝胶上打印自体骨髓间充质干细胞和神经营养因子。

重复步骤(4.1)-(4.5)，直至得到目标的细胞-生物支架复合物，其形状符合实际移植的需要，支架主体为纤维蛋白水凝胶，支架表面和内部包覆有自体骨髓间充质干细胞和一种或几种神经营养因子。 

本发明中，所述喷墨打印机优选改装的惠普打印机55C喷墨打印机，采用墨盒型号为HP51626A。 

利用本发明方法制备得到的基于生物打印技术的细胞-生物支架复合物在治疗脊髓损伤中的应用。 

与现有技术相比，本发明具有显著优点： 

（1）本发明利用生物打印技术，可根据需要和实际情况设计模型，精确打印得到细胞-生物支架复合物用于脊髓损伤的移植。

（2）本发明使用的生物打印技术简单易行，成本较低，生产过程安全可控。 

（3）本发明所用纤维蛋白来源于患者自身，无免疫排斥、疾病传染等诸多风险，且移植后自动降解，降解产物被人体完全吸收，避免了免疫组织反应。 

（4）本发明所用的种子细胞为骨髓间充质干细胞，其来源丰富，取材方便，容易分离纯化，且来源于自体，无免疫排斥。 

（5）本发明的种子细胞和神经营养因子种植在支架内部，随支架材料的降解缓慢释放，长期作用。 

具体实施方式

下面通过实施例进一步说明本发明。

实施例1：

1.自体血液中提取纤维蛋白原

抽取受试者血液约200mL，纤维蛋白原制备方法参见专利公开号CN102286095A。

2.自体骨髓间充质干细胞（BMSCs）溶液的制备 

抽取受试者骨髓约40mL，肝素抗凝，注意尽量避免凝块形成，将骨髓在超净台内转移到2支50mL无菌离心管内，分别用PBS等比稀释并混匀，吸取FICOLL10-20mL/管×4管，倾斜离心管，将骨髓悬液分别沿壁缓慢加到FICOLL表面，使之形成清晰的分界面，22℃,1350转/分，离心30分钟，平稳取出离心管，于超净台中将中间白膜层取出，置于无菌离心管中，加入PBS至40mL混匀，1500转/分，离心5分钟，弃上清，加入MESENCμLT培养液10mL，吹打均匀，取细胞悬液20μl于EP管中，再加入白细胞稀释液180μl稀释，于振荡器混匀，取20μl加到细胞计数板上，计数：四象限细胞总数的均数×10-E⁶为细胞总数。按2-5×10-E⁶/皿将细胞接种到培养皿中，并加入新鲜培养液，使终体积达7-8mL，放入孵育箱。以后每3天换液1次，直到细胞生长达到培养皿底部的70-80%传代。传代后的细胞3-4天半量换液1次，细胞生长面积达培养皿底部80-90%需再传代。在细胞传代过程中直接收集BMSCs或收集解冻后经过洗涤的MSCs，加入含20%白蛋白的生理盐水制成细胞悬液备用，使细胞密度是1×10⁶-1×10⁸/mL。

BMSCs用于辅助治疗前进行流式细胞仪鉴定细胞类型；染色体检测排除二倍体变异；输注前行病原学检测；细胞悬液皮试。 

3.神经营养因子水溶液的制备 

所述神经营养因子为碱性成纤维生长因子（bFGF）、脑源神经营养因子（BDNF）、神经营养因子3（NT-3）、胶质细胞源神经营养因子（GDNF）中的一种或几种，神经营养因子在细胞-生物支架复合物上的量为1μg/g-10mg/g。

4.细胞-生物支架复合物的打印 

4.1纤维蛋白原溶于PBS，配置终浓度为10mg/mL的溶液，装于型号为HP51626A的墨盒中；凝血酶溶于GaCl₂溶液，配置终浓度为20Iμ/mL的溶液，装于另一墨盒中。

4.2调整与装有纤维蛋白原墨盒的打印机喷嘴针头直径为200μm,针头数量为8个，喷嘴到底层的距离为50mm，增压器脉冲频率15v； 

调整与装有凝血酶墨盒的打印机喷嘴针头直径为100μm，针头数量为10个，喷嘴到底层的距离为25mm,增压器脉冲频率15v；

4.3设计细胞-生物支架复合物的宏观构型为平行排列的多管状结构，在计算机上设置相应参数在盖玻片上打印一薄层纤维蛋白原，更换装有凝血酶墨盒的喷头，在纤维蛋白原薄层上连续打印三次，凝胶时间3-5min。

4.4调整与装有自体骨髓间充质干细胞墨盒的打印机喷嘴针头直径为100μm，针头数量为6个，喷嘴到底层的距离为25mm,增压器脉冲频率15v； 

调整与装有一种或几种神经营养因子墨盒的打印机喷嘴针头直径为50-200μm，针头数量为3-6个，喷嘴到底层的距离为25mm,增压器脉冲频率15v；

4.5根据实际需求，设计细胞和营养因子包覆形态，编制相应的控制程序，在上述纤维蛋白水凝胶上打印自体骨髓间充质干细胞和神经营养因子。

重复步骤4.1-4.5，直至得到目标的细胞-生物支架复合物，其宏观构型为平行排列的多管状结构，支架主体为纤维蛋白水凝胶，支架表面和内部包覆有自体骨髓间充质干细胞（细胞密度1×10⁶/mL）和一种或几种神经营养因子（量为1μg/g-10mg/g）。 

Claims (2)

1.一种基于生物打印技术的细胞-生物支架复合物的制备方法，其特征在于采用患者自身的BMSCs和纤维蛋白原；制备含有营养因子/细胞的水溶液；利用生物打印技术打印一层纤维蛋白原，并在其上打印凝血酶，获得纤维蛋白水凝胶层；在水凝胶层上打印神经营养因子和BMSCs；层层叠加，从而形成用于脊髓损伤移植的细胞-生物支架复合物；具体步骤如下：

(1).自体血液中提取纤维蛋白原；

(2).制备自体骨髓间充质干细胞溶液；

(3).制备神经营养因子水溶液，所述神经营养因子为碱性成纤维生长因子、脑源神经营养因子、神经营养因子3或胶质细胞源神经营养因子中的一至几种，神经营养因子在细胞-生物支架复合物上的量为1μg/g-10mg/g；

(4).细胞-生物支架复合物的打印

(4.1)将步骤(1)得到的纤维蛋白原溶于PBS，配置成浓度为10mg/mL的溶液，装于打印机墨盒中；凝血酶溶于CaCl₂溶液，配置成浓度为20IU/mL的溶液，装于另一墨盒中；

(4.2)调整与装有纤维蛋白原墨盒的打印机喷嘴针头直径为200μm,针头数量为8个，喷嘴到底层的距离为50mm，增压器脉冲频率15v；

调整与装有凝血酶墨盒的打印机喷嘴针头直径为100μm，针头数量为10个，喷嘴到底层的距离为25mm,增压器脉冲频率15v；

(4.3)根据实际需求，设计细胞-生物支架复合物的形状，在盖玻片上打印一薄层纤维蛋白原，更换装有凝血酶墨盒的喷头，在纤维蛋白原薄层上连续打印三次，凝胶时间3-5min；

(4.4)调整与装有自体骨髓间充质干细胞墨盒的打印机喷嘴针头直径为100μm，针头数量为6个，喷嘴到底层的距离为25mm,增压器脉冲频率15v；

调整与装有一种或几种神经营养因子墨盒的打印机喷嘴针头直径为50-200μm，针头数量为3-6个，喷嘴到底层的距离为25mm,增压器脉冲频率15v；

(4.5)根据实际需求，设计细胞和营养因子包覆形态，编制相应的控制程序，在上述纤维蛋白水凝胶上打印自体骨髓间充质干细胞和神经营养因子；

重复步骤(4.1)-(4.5)，直至得到目标的细胞-生物支架复合物，其形状符合实际移植的需要，支架主体为纤维蛋白水凝胶，支架表面和内部包覆有自体骨髓间充质干细胞和一种或几种神经营养因子。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述喷墨打印机优选改装的惠普打印机55C喷墨打印机，采用墨盒型号为HP51626A。