CN102091056B

CN102091056B - 一种治疗帕金森病的细胞微囊及复合细胞支架

Info

Publication number: CN102091056B
Application number: CN200910242411A
Authority: CN
Inventors: 张定军; 郭戈; 唐果林; 颜旭涛; 戴丽娜
Original assignee: YINHUA LASER RAPID SHAPE AND MOULD TECHNOLOGY Co Ltd BEIJING
Current assignee: Jiangsu Yongnian Laser Forming Technology Co., Ltd.
Priority date: 2009-12-10
Filing date: 2009-12-10
Publication date: 2012-10-24
Anticipated expiration: 2029-12-10
Also published as: CN102091056A

Abstract

本发明一种治疗帕金森病的细胞微囊及复合细胞支架，涉及帕金森病移植治疗领域。细胞微囊内含细胞为视网膜色素上皮细胞，囊壳中混合有神经营养因子。为异源的视网膜色素上皮细胞用于治疗人帕金森病提供了可行方法，神经营养因子加入到了囊壳中一起移植治疗患者病变脑组织，既克服了临床应用中存在的问题，直接发挥其修复神经元的功能；又与视网膜色素上皮细胞之间由协同作用，延长移植细胞的存活期，为缓解帕金森病症状和修复病变细胞提供了一种理想的途径。

Description

一种治疗帕金森病的细胞微囊及复合细胞支架

技术领域

本发明涉及帕金森病移植治疗领域，特别是一种治疗帕金森病的细胞微囊及复合细胞支架。

背景技术

帕金森病(parkinson’s disease，简称PD)是一种突发的、缓慢进展的中枢神经系统变性疾病，其病理特征主要是中脑黑质多巴胺能神经元选择性变性死亡，临床特征主要是动作缓慢与缺失、肌肉僵直、静止性震颤和姿势不稳，又名震颤麻痹，是最常见的神经退行性疾病。

目前还没有能预防或者彻底治愈帕金森病的方法，治疗原则是药物和手术治疗相结合。但帕金森病的药物治疗和外科手术方法都只能改善部分症状，且长期疗效并不乐观。由于帕金森病主要是由黑质多巴胺神经元变性导致纹状体内多巴胺水平下降所致，因此在黑质纹状体系统内移植能够分泌多巴胺的细胞，恢复多巴胺的神经环路，即成为一种针对病因的理想治疗方向。

自1985年肾上腺髓质组织移植首次在临床应用于帕金森治疗并取得一定疗效后，经历了二十多年的发展，作为一种功能重建性手术，已成为世界性关注热点，加拿大的D.Doudet报道了9只用1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)制造的帕金森病的猴子，在其苍白球中植入人视网膜色素上皮细胞(RPE)，来自捐献者的眼球，经过体外培养并在其表面包裹了一层抗排斥反应的凝胶，结果显示一年内所有的猴子均有明显的改善，PET扫描显示[18F]-L-dopa(多巴胺)的摄取增加，多巴胺D2受体的示踪剂([11C]-raclopride)结合位点减少，表明纹状体多巴胺水平增加。中国专利申请号为“200510123306.7”的发明专利申请“一种治疗老年痴呆症、帕金森病的神经干细胞注射液”公开一种以人源的视网膜色素上皮细胞为主要成分的注射液，直接注入患者脑组织中病变部位，并有实验例数据证明该注射液对帕金森病症状的改善有效率达80％，进一步佐证视网膜色素上皮细胞能在治疗帕金森病中发挥作用。另一方面，该专利申请的说明书中提到：脑和脊髓由于血脑屏障的存在使之在干细胞移植到中枢神经系统后不会产生免疫排斥反应(见说明书第4页第2行)，同时传统观念也认为脑组织具有免疫豁免特性，主要原因有：(1)脑组织缺乏淋巴组织以及淋巴管道，外来抗原不能引起免疫应答；(2)脑组织缺乏抗原呈递细胞，不会在移植免疫中诱发同种移植免疫排斥反应；(3)脑组织存在血脑屏障，血液中的抗体以及免疫活性细胞不能与外来抗原接触，便不能产生免疫反应；(4)脑组织缺乏主要组织相容性复合体(MHC)抗原，其在诱发同种移植免疫排斥反应中起重要作用。但是随着人们对脑组织免疫特性的深入研究，脑组织的免疫豁免性受到怀疑，这是因为(1)脑内血管周围间隙起到淋巴管道的作用；(2)脑内的星形胶质细胞、小胶质细胞和血管内皮细胞在特定情况下可表达MHC抗原；(3)血脑屏障在某些区域存在局部组织的损伤导致血脑屏障的开放、淋巴细胞活化，诱发免疫排斥反应。另外，在移植治疗中虽然可以采用自体细胞，自体细胞较少有免疫排斥反应的危险，但来源稀少及功能差等缺陷限制了其临床应用，人源视网膜色素上皮细胞主要来源于早期胚胎中的眼球组织，获取来源同样非常稀少，因此需要寻找更广阔的干细胞来源。幸运的是，复旦大学附属医院在对牛视网膜色素上皮细胞的研究中发现，其生长曲线显示第1～4天为其指数生长期，多巴胺分泌在第2h开始检测到，48h达高峰以后缓慢下降并趋稳定；此外，他们在对猪视网膜色素上皮细胞的研究中发现，基础状态下猪RPE细胞在接种后2h开始分泌DA，4h达高峰，之后缓慢下降并趋于平稳。这证明，动物视网膜色素上皮细胞有望在治疗帕金森病中发挥作用，这为细胞移植治疗帕金森提供了广阔的细胞来源；但这些细胞用于移植治疗帕金森病，一方面需克服免疫排斥，另一方面，移植细胞存活时间需要长达数年之久以足以修复病变位置的细胞。

另外有研究表明，神经营养因子有营养神经元、刺激轴突再生、再髓鞘化、调节小胶质细胞的功能，中枢神经直接给药时，神经营养因子对及时改善帕金森病症状有明显效果，且有效率达80％左右。目前已知对神经元有滋养作用四种主要的神经营养因子已从哺乳动物中分离出来，它们是：神经生长因子(NGF)、脑源神经营养因子(BDNF)，神经营养因子3(NT-3)和神经营养因子4/5(NT-4/5)(Guyton AC，Hall JE.Textbook of medicalphysiology，11th Edition.Philadelphia：Elsevier Saunders.2006，医学生理学，英文影印版，北京大学医学出版社，2007)；随着无血清培养神经元等技术的应用，在许多组织液和细胞外基质中陆续发现一些新的特异蛋白质分子，也能促进神经元的增殖、分化和存活。例如，施万细胞和星形胶质细胞产生的睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor，CNTF)能促进受损伤的和胚胎的脊髓神经元存活，并在治疗人类运动神经元变性疾病中有重要价值。又如，胶质细胞源神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)在离体实验中能支持中脑多巴胺能神经元的生存，在各种帕金森病动物模型上可提高多巴胺能神经元的存活率和神经术梢的密度而改善其症状(韩济生主编.神经科学原理.第2版.北京：北京医科大学出版社，1999)。这些神经营养因子应用在临床上的效果并不满意。主要原因是(1)：神经营养因子分子量大，难于通过血脑屏障；(2)：通过血脑屏障后不一定能迅速到达黑质纹状体作用于靶点。因此，临床上采用来治疗帕金森必须解决以上两个问题。

“人工细胞”伴随着包裹技术和微囊化技术的出现开始在生物医学领域获得了广泛应用。人工细胞的概念由Chang，T.M.S提出于1965年，至今已有四十多年的研究历史，其概念是将包括细胞、酶和吸附剂在内的生命材料用高分子超薄膜包裹起来，从而形成微胶囊，即细胞微囊化。通过微胶囊的选择性渗透膜对组织或细胞进行免疫保护，可以在无需免疫抑制剂的条件下进行同种异体或者异种移植，补充疾病体内缺乏的生理活性物质，同时，异种移植的实现能够克服人类移植器官供体来源的局限性。微囊化常用的材料主要有天然、半合成和合成高分子三大类数十种，常用的方法有海藻酸钠、多聚赖氨酸(APA)微胶囊制备法；海藻酸钠、壳聚糖(ACA)微胶囊制备法、琼脂囊心制备法和合成聚电解质微胶囊制备法等；细胞微囊制备过程有一步法和两步法。一步法是将壳聚糖和氯化钙的混合溶液直接滴入海藻酸钠溶液中反应得到微囊，囊壁含有壳聚糖沉积层、海藻酸钠-壳聚糖络合层和海藻酸钙凝聚层共3层，传统的微囊制备方法是两步法。第一步是将细胞与海藻酸钠溶液的混合液通过注射器泵的微孔滴入氯化钙溶液中制备出海藻酸钙微球，第二步将得到的海藻酸钙微球置于壳聚糖溶液中成膜，再以海藻酸钠溶液中和成膜后的海藻酸钙微球即得到海藻酸钠-壳聚糖微囊。另外一种更好的微囊体系是以海藻酸钠、多聚赖氨酸为微囊材料，其步骤是：第一步将细胞与海藻酸钠溶液的混合液通过注射器泵的微孔滴入氯化钙溶液中制备出海藻酸钙微球，第二步海藻酸钙微球以聚赖氨酸水溶液浸渍在表面形成海藻酸纳-聚赖氨酸聚电解质配合物层，然后将此微球浸于柠檬酸钠水溶液中，海藻酸钠从微囊中溶出使微球转变成海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠(APA)的半透膜膜层结构，细胞在此微囊中比在海藻酸钙凝胶中易自由活动，且膜强度高，细胞不会泄漏，适于长期使用。

目前，没有见到细胞色素上皮细胞做成人工细胞以克服免疫排斥反应的报道，同时也没有见到与神经营养因子相结合用于延长移植细胞存活期的报道。

发明内容

本发明根据上述领域存在的缺陷及空白，提供一种治疗帕金森病的细胞微囊及复合细胞支架，细胞微囊为异源的视网膜色素上皮细胞用于治疗人帕金森病提供了可行途径；本发明中移植细胞存活率高、存活期长，为缓解帕金森病症状和修复病变细胞提供了一种理想的途径。

一种治疗帕金森病的细胞微囊，其特征在于：内含细胞为视网膜色素上皮细胞，微囊的囊壳材料中混合有神经营养因子。

所述囊壳从里到外依次为海藻酸钠层、壳聚糖层、海藻酸钠层；或海藻酸钠层、多聚赖氨酸层、海藻酸钠层。

所述神经营养因子为明胶包裹而成的神经营养因子微球。

所述神经营养因子微球为20％明胶溶液与神经营养因子以体积质量比5～10ml∶50～200μg，通过凝聚法制得。

所述囊壳为3％的海藻酸钠溶液、1.5％的壳聚糖溶液和神经营养因子微球制得；所述3％的海藻酸钠溶液、1.5％的壳聚糖溶液及神经营养因子微球的体积比为0.5～1.5∶0.5～1.5∶0.5～1.5，所述壳聚糖溶液与所述神经营养因子微球先混合后再参与反应。

所述囊壳为1.5％的海藻酸钠溶液、0.05％的多聚赖氨酸溶液和神经营养因子微球制得；所述1.5％的海藻酸钠溶液、0.05％的多聚赖氨酸溶液及神经营养因子微球的体积比为0.5～1.5∶0.5～1.5∶0.5～1.5，所述壳聚糖溶液与所述神经营养因子微球先混合后再参与反应。

所述细胞微囊中，视网膜色素上皮细胞为1×10⁸～1×10⁹cells/L。

所述神经营养因子为神经生长因子、脑源神经营养因子、神经营养因子-3和/或神经营养因子-4/5。

所述视网膜色素上皮细胞为第3～5代传代细胞。

所述视网膜色素上皮细胞的来源为人、牛、猪、兔。

一种治疗帕金森病的复合细胞支架，通过以下步骤制得：

(1)将视网膜色素上皮细胞与海藻酸钠溶液混合，再加入壳聚糖或多聚赖氨酸溶液混匀，最后加入神经营养因子混匀，置于0～7℃冰箱冷冻；

(2)按预设的三维结构，通过三维受控组装方法得到组装产物；

(3)在组装产物上滴加氯化钙使其发生交联反应，

所述神经营养因子为明胶包裹着的神经营养因子微球。

本发明提供的治疗帕金森的细胞微囊，将视网膜色素上皮细胞包裹于微囊材料中，微囊的囊壳起着半透膜的作用，允许小分子量的分泌物质、营养物质进出，而对大分子量的免疫活性物质有屏蔽作用。该微囊移植到大脑病变位置后，使囊内细胞免受人体免疫系统的攻击，提高了细胞移植的成功率和细胞存活率，同时，也使用于移植的细胞来源不再局限于自体细胞或人源细胞，也可以是牛、猪、兔等动物的视网膜色素上皮细胞；而囊内细胞分泌的多巴胺类物质扩散到囊外，细胞所需的营养物质可以扩散到囊内，因此囊内合成的多巴胺可以分泌到病变部位，而植入环境中的营养分子可以扩散到囊内滋养细胞使之持续保持分泌多巴胺的活力；本发明细胞微囊的囊壳中，加入了神经营养因子，神经营营养因子通过移植直接与病变部位接触，使其发挥修复神经元的功能，使病变细胞主动修复；另一方面，神经营养因子能够刺激诱导囊内细胞生长，从而延长囊内细胞的存活期，达到持续分泌多巴胺、延长移植治疗的有效期；同时将神经营养因子加入到用于微囊的囊壳材料中，解决了其在临床上使用治疗帕金森的存在的难题。

本发明制作微囊的材料采用目前常用的海藻酸钠与壳聚糖微囊体系，或者海藻酸钠与多聚赖氨酸体系，这两种体系生物相容性较好，膜层的半透性稳定，膜层强度足以为其中的细胞的生理代谢活动提供保护。本发明中，为了使囊壳材料中混合的神经营养因子能够长期起作用，本发明优选将神经营养因子包裹于明胶中形成明胶微球，明胶微球与囊壳材料混合一起制作细胞微囊，明胶起着缓释的作用，使神经营养因子缓慢释放出来，延长对神经元的修复时间，逐渐达到使部分病变神经元侧底修复的目的；。本发明中，优选明胶微球为20％的明胶溶液与神经营养因子以5～10ml∶50～200μg的比例制成，制作方法采用常用的凝聚法，制成的明胶微球的缓释作用可持续2～3年，足以配合视网膜色素上皮细胞一起彻底治疗帕金森患者的病变脑组织，但本发明不限于该比例和方法。

在本发明的一个优选方案中，囊壳材料为1～3％的海藻酸钠溶液和1.5％的壳聚糖溶液，本发明优选的3％的海藻酸钠溶液、1.5％的壳聚糖溶液、神经营养因子微球按体积比0.5～1.5∶0.5～1.5∶0.5～1.5混合，这一比例范围制作而得的微囊具有合适的膜强度及适宜多巴胺分泌及小分子营养物质进出交换的半透膜孔隙。

在细胞微囊中，细胞与囊壳材料应该有一个合适的比例，应该为细胞与植入环境之间提供尽可能大的接触面积，同时保证细胞之间信号和物质传输途径畅通形成良好互相保护的机制，若微囊中容纳太多细胞，则细胞与植入环境之间的接触面积不够分泌的多巴胺物质不能高效地扩散到靶点，细胞太少则容易死亡，影响移植细胞存活期。因此，本发明通过大量的对比摸索实验，确定本发明中视网膜色素上皮细胞在微囊中的体积比为1×10⁸～1×10⁹cells/L，能达到上述目的。

本发明针对治疗帕金森这一目的提供的细胞微囊，其中的神经营养因子可以为神经生长因子、脑源神经营养因子、神经营养因子-3、神经营养因子-4/5中的一种或几种，上述四种是目前已经在哺乳动物体内分离到的证明有神经元修复作用的神经营养因子。本发明的一个实施例中，优选脑源神经营养因子。

有研究数据证明，视网膜色素上皮细胞传代后可保持分泌DA特性，在4代细胞中明显可见多巴胺的分泌，本发明采用的视网膜色素上皮细胞优选为干细胞传代3～5代的细胞，这样使得制作出来的细胞微囊在移植到病变部位后，可立即分泌多巴胺，立即改善患者症状。

本发明中的视网膜色素上皮细胞优选自目前研究证明有多巴胺分泌功能的牛、猪、兔，也可以采用生物公司中培养的人源的视网膜色素上皮细胞。

本发明还提供一种治疗帕金森的复合细胞支架，视网膜色素上皮细胞先与囊壳材料混合成细胞支架混合物，然后采用与李曼，赵铱民等(“细胞直接三维受控组装技术体外构建组织工程化软骨”，实用口腔医学杂志，2008年Sep，24(5))报道的三维受控组装方法及其设备，按预设的复合细胞支架的三维结构的二维线路进行逐层堆积成型制得雏形的复合细胞支架，最后再进行交联化或者固定步骤，从而制得具有一定宏观结构复合细胞支架。复合支架的作用在于可以为微囊细胞提供一种利于培养的宏观支撑结构，可直接将支架移植到病变位置，为细胞提供了良好的生存环境，支架的材料就是的具有半渗透多孔隙微的囊壳材料，支架的三维结构有利于提高植入物与体内环境的接触表面积，便于植入环境和微囊内部的营养物质交换和治疗物质释放，提高治疗效果和延长有效治疗周期。

附图说明

图1细胞微囊治疗帕金森小鼠的效果曲线

横坐标表示移植时间，纵坐标表示旋转次数减少的比例

图2.复合细胞支架的结构

左上：复合细胞支架组装过程中

右上：组装完成的复合细胞支架

左下：显微镜下观察孔隙的情况

右下：电子显微镜下观察复合细胞支架上细胞附着的情况

具体实施方式

实施例1.视网膜色素上皮细胞的传代培养。

视网膜色素上皮细胞原代细胞购自美国ScienCell公司

所用培养液为美国ScienCell公司的EpiCM培养基(EpiCM，Catalog Number为4101)，该培养基组分为每500ml培养基含有10ml胎牛血清FBS(Catalog No.0010)，5ml上皮细胞营养物(Catalog No.4152)和5ml青霉素链霉素抗体(P/S，Catalog No.0503)。

细胞传代培养使用0.25％的胰蛋白酶Trypsine作为消化液。所购原代细胞为75cm2培养瓶装，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养，每3d更换一次培养液，直至细胞融合传代。

细胞分裂增殖至融合时应及时传代，将培养液吸去，PBS缓冲液冲洗3次，0.25％胰酶消化3～5分钟，倒置显微镜下观察细胞边缘开始收缩时，吸去消化液，加入培养液中止消化，吹打混匀，分装至新培养瓶中传代培养。

实施例2：单凝聚法制备包含神经营养因子的明胶微球

制备质量分数为20％的明胶溶液5ml，烘箱80℃高温灭菌2～3次，每次4～5小时。无菌条件下加入100ug神经营养因子(ScienCell，NGS，Catalog No.1562)，在pH3.8条件下滴加丙酮使明胶溶液发生凝聚，再加入戊二醛交联得到直径200-400nm、表面光滑的明胶微球。

实施例3.制作海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠细胞微囊

步骤1.取实施例1中制得的75cm²培养瓶的生长接近融合的第3～5代视网膜色素上皮细胞，细胞浓度为8×10⁶～10×10⁶/L

步骤2.提取细胞，吸去培养液，加入0.25％胰酶消化3～5分钟，加入培养液(EpiCM，CatalogNumber为4101)中止，充分吹打混匀，离心后弃上清液，即可获得RPE。

步骤3，将RPE与1.5％的海藻酸钠混合制成密度为1×10⁶/ml的细胞悬液。用4号针头将细胞悬液滴入轻微搅动的1.1％CaCl₂中，使其形成凝胶珠。

步骤4，实施例2制得的神经营养因子微球与0.05％多聚赖氨酸以等体积混合，

步骤5.凝胶珠依次与步骤4的混合液、海藻酸钠化合反应，最后用浓度约5.5％的柠檬酸钠液化微球的核心，即得到细胞微囊。

实施例4.制作海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠细胞微囊

步骤3.将RPE与3％的海藻酸钠混合制成密度为1×10⁶/ml的细胞悬液。用4号针头将细胞悬液滴入轻微搅动的1.1％CaCl₂中，使其形成凝胶珠。

步骤4.实施例2制得的神经营养因子微球与1.5％壳聚糖溶液以等体积混合，

步骤5.凝胶珠依次与步骤4的混合液、海藻酸钠化合反应。

实施例

制备视网膜色素上皮细胞微囊化的复合支架

步骤2.提取细胞，吸去培养液，加入0.25％胰酶消化3～5分钟，加入培养液(EpiCM，CatalogNumber为4101)中止，充分吹打混匀，离心后弃上清液，即可获得RPE

步骤3.将提取的RPE细胞与1mL 3％海藻酸钠溶液无菌条件下混合制成密度为1×10⁶/ml的细胞悬液，再加入1mL 1.5％的壳聚糖溶液混匀，再加入实施里2制得的1mL明胶包裹的神经营养因子微球，混合均匀后置于0～7℃冰箱冷冻20分钟。

步骤4.将冷冻好的凝胶态混合物装入与三维受控组装机I代相配合的5mL注射器中，装好针头，安装在细胞三维受控组装机上(即李曼，赵铱民等，“细胞直接三维受控组装技术体外构建组织工程化软骨”，实用口腔医学杂志，2008年Sep，24(5)中的采用的设备)，启动控制程序，按照预设的蜂窝状结构，进行组装。

步骤5.组装好的蜂窝状的复合细胞支架，见图2，位于载波片上，将载波片取出，无菌条件下加入100mmol/L的氯化钙(CaCl₂)溶液500ul进行交联反应，固化5～30分钟后即得到复合细胞支架。

步骤6.用细胞培养液(同实施例1)冲洗干净，将载波片上的复合支架刮入多孔培养板，加入3～5ml培养液(同实施例1)进行培养观察，培养3～5细胞分裂周期(D)后，取少量进行检测。采用台盼蓝染色法检验支架上的细胞活性，仅少量细胞着色说明细胞活性良好，可用于移植治疗。

实验例1.小鼠试验

采用实施例3制作的细胞微囊，采用帕金森大鼠模型，6-OHDA大鼠模型术后3周腹腔注射阿朴吗啡(0.5mg/kgBW)，以旋转圈数大于210次/30min为成模标准。

设定生理盐水(NS)对照组，裸细胞组(RPE)和本发明制得的细胞微囊组(RPE-APA)。

其中NS组12只，RPE组和RPE-APA组各15只。移植时将RPE细胞悬液调整至1×10⁶cells/ml，RPE-APA组浓度调整至2×10⁶个囊/L用于移植，采用右侧纹状体两点移植。NS组按相同方法注射20ul生理盐水，留针15分钟；RPE组和RPE-APA组采用注射法。

分别在细胞移植后第1，2，4，8，14周观察各组大鼠阿朴吗啡诱导的旋转行为变化，测定30min的旋转圈数。旋转行为评定采用自身前后对比，即用移植后阿朴吗啡诱发的旋转次数较移植前减少的百分比(％)来表示旋转行为变化程度(见图1)。观察结果表明RPE-APA组中大鼠阿朴吗啡诱发的旋转次数在移植后第2周开始减少，第4周减少幅度更加明显，为54.79％，旋转次数的减少一直持续到第14周，减少幅度为60.25％。RPE组的大鼠旋转次数从第2周开始有所减少，但随后减少幅度来回波动，与生理盐水组对照无显著差异。实验结构表明采用细胞微囊移植具有明显疗效，而且与直接移植RPE细胞相比，前者持续疗效时间更长，效果更显著。直接移植的细胞仅在移植初期能产生治疗效果。

实验例2.临床试验

采用本发明的细胞微囊移植治疗2例晚期帕金森病病人，手术采用立体定位，通过CT或MRI扫描定位，确定手术靶点，再通过计算机辅助定位系统软件，确定靶点的三维坐标。将细胞微囊，调整至2×10⁶个囊/L注入帕金森病患者脑内纹状体区靶点(壳核，丘脑腹后外侧核)。所有患者均未使用免疫抑制药物，治疗前后应用统一帕金森病等级评分(Unified Parkinson’sDisease Rating Scale，UPDRS)对病人进行评估。结果显示，采用细胞微囊的移植疗效更持久，可显著改善病人的运动机能，其功能改善可持续3年。患者对细胞移植过程耐受良好，没有明显副作用。

综上所述，本发明为异源的视网膜色素上皮细胞用于治疗人帕金森病提供了可行方法，神经营养因子加入到了囊壳中一起移植治疗患者病变脑组织，既克服了临床应用中存在的问题，直接发挥其修复神经元的功能；又与视网膜色素上皮细胞之间由协同作用，延长移植细胞的存活期，为缓解帕金森病症状和修复病变细胞提供了一种理想的途径。

Claims

1.一种治疗帕金森病的细胞微囊，其特征在于：内含细胞为视网膜色素上皮细胞，微囊的囊壳材料中混合有神经营养因子，所述囊壳从里到外依次为海藻酸钠层、壳聚糖层、海藻酸钠层；或海藻酸钠层、多聚赖氨酸层、海藻酸钠层，所述神经营养因子为明胶包裹而成的神经营养因子微球，所述微球引入微囊的囊壳材料的方法为：在制备细胞微囊的过程中，将明胶包裹而成的神经营养因子微球与多聚赖氨酸溶液或壳聚糖溶液先混合再参与反应。

2.根据权利要求1所述的细胞微囊，所述神经营养因子微球为20％明胶溶液与神经营养因子以体积质量比5～10ml∶50～200μg，通过凝聚法制得。

3.根据权利要求2所述的细胞微囊，所述囊壳为3％的海藻酸钠溶液、1.5％的壳聚糖溶液和神经营养因子微球制得；所述3％的海藻酸钠溶液、1.5％的壳聚糖溶液及神经营养因子微球的体积比为0.5～1.5∶0.5～1.5∶0.5～1.5，所述壳聚糖溶液与所述神经营养因子微球先混合后再参与反应；或者所述囊壳为1.5％的海藻酸钠溶液、0.05％的多聚赖氨酸溶液和神经营养因子微球制得；所述1.5％的海藻酸钠溶液、0.05％的多聚赖氨酸溶液及神经营养因子微球的体积比为0.5～1.5∶0.5～1.5∶0.5～1.5，所述壳聚糖溶液与所述神经营养因子微球先混合后再参与反应。

4.根据权利要求1所述的细胞微囊，视网膜色素上皮细胞个数与所述细胞微囊的体积比为1×10⁸～1×10⁹cells/L。

5.根据权利要求1～4任一所述的细胞微囊，所述神经营养因子为神经生长因子、脑源神经营养因子、神经营养因子-3和/或神经营养因子-4/5。

6.根据权利要求1～4任一所述的细胞微囊，所述视网膜色素上皮细胞为第3～5代传代细胞。

7.根据权利要求1～4任一所述的细胞微囊，所述视网膜色素上皮细胞的来源为人、牛、猪、兔。

8.一种治疗帕金森病的复合细胞支架，通过以下步骤制得：

(3)在组装产物上滴加氯化钙使其发生交联反应，

所述神经营养因子为明胶包裹着的神经营养因子微球。