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CN116899016A - 软骨细胞外基质微胶囊、组织工程支架及它们的制备方法 - Google Patents

软骨细胞外基质微胶囊、组织工程支架及它们的制备方法 Download PDF

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CN116899016A
CN116899016A CN202310314283.6A CN202310314283A CN116899016A CN 116899016 A CN116899016 A CN 116899016A CN 202310314283 A CN202310314283 A CN 202310314283A CN 116899016 A CN116899016 A CN 116899016A
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cartilage
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cartilage extracellular
stirring
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应慧春
王世坤
韩菲
曾胜
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Hainan Susheng Biotechnology Co ltd
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Hainan Susheng Biotechnology Co ltd
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Abstract

本发明公开了一种软骨细胞外基质微胶囊、组织工程支架及它们的制备方法，属于组织工程领域。本发明的软骨细胞外基质微胶囊包括芯材与包裹于芯材外的壁材；所述壁材与芯材的质量比优选为1:(1～3)，所述壁材为壳聚糖；所述芯材包括生长因子、吸附剂、乳化剂、分散剂与基础油；所述生长因子、吸附剂、乳化剂、分散剂与基础油的质量比为(0.01‑0.03):(1～10):(1～6):(1～4):(2～6)。用软骨细胞外基质微胶囊制得的组织工程支架具有优异的力学性能，高吸水、高孔径，没有生物毒性，不仅为细胞提供生存的微环境，还可以持续促进BMSC分化增殖为软骨细胞，促进软骨的再生修复。

Description

软骨细胞外基质微胶囊、组织工程支架及它们的制备方法
技术领域
本发明属于组织工程领域，具体涉及一种软骨细胞外基质微胶囊、组织工程支架及它们的制备方法。
背景技术
关节软骨是一种富含Ⅱ型胶原和糖胺多糖的透明软骨，在关节活动中起到承载机械负荷与润滑关节的作用。与其他组织不同，软骨组织中没有血管、神经，其退变和损伤后的自生修复能力极其有限，损伤达到3mm后就很难修复，而损伤达到6mm后，就会对下骨造成伤害。目前，治疗关节软骨损伤的手术方法主要有微骨折、自体软骨细胞植入(ACI)、镶嵌成形术和同种异体软骨移植等方法。但这几种方法都存在一定的局限性，不能完全恢复自体原始软骨，而且预后具有不确定性，基于此，植入合适的组织工程支架便为解决这一问题提供了更好的解决办法。
软骨组织工程是在一些利于细胞分化和增殖的因子参与下，体外培养和扩增软骨种子细胞，把一定量的种子细胞培养在生物材料支架上，然后移植到软骨缺损部位，形成新的软骨组织，经过重塑形，并与机体组织整合在一起，达到损伤软骨的再生修复。软骨组织工程的内容主要是三个方面：种子细胞、生物材料支架、生长因子，其中，生物材料支架作为细胞外基质的临时替代物，为工程化软骨组织提供三维几何形状，并为种子细胞提供生存的微环境，为细胞的粘附、增殖、分化并最终形成新的软骨组织基本框架和代谢场所，是软骨组织工程成功的关键。
目前应用于生物支架的材料主要包括天然和合成两种，人工合成多聚体有聚羟基乙酸、聚乳酸、聚羟基乙酸复合物、聚乙烯醇等，天然聚合物有软骨细胞外基质、琼脂糖、明胶、透明质酸等。其中，软骨细胞外基质因其良好的生物安全性和生物相容性以及细胞识别及粘附的位点而广泛的用于组织工程支架材料。
现有的组织工程支架只是被动的为细胞提供生存的微环境，而且性能相对比较差，不能很好的促进软骨的再生分化。
发明内容
有鉴于此，本发明的第一个目的，是提出一种软骨细胞外基质微胶囊，其具有缓释功能，为软骨种子细胞长时间提供营养，维持软骨种子细胞在软骨缺损部位生长，达到损伤软骨的再生修复。
本发明的第二个目的，是提出上述软骨细胞外基质微胶囊的制备方法。
本发明的第三个目的，是提出一种软骨细胞外基质组织工程支架，该支架具有优异的力学性能，高吸水、高孔径，没有生物毒性，不仅为细胞提供生存的微环境，还可以持续促进BMSC分化增殖为软骨细胞，促进软骨的再生修复。
本发明的第四个目的，是提出上述软骨细胞外基质组织工程支架的制备方法。
本发明的一种软骨细胞外基质微胶囊，包括芯材与包裹于芯材外的壁材；所述壁材与芯材的质量比优选为1:(1～3)，更优选为1:(1～2.5)，再优选为1:(1.2～2)，最优选为1：(1.4～1.6)。
本发明提供的软骨细胞外基质微胶囊的壁材为壳聚糖；所述壳聚糖脱乙酰度≥90％，分子量20-40w；
所述芯材包括生长因子、吸附剂、乳化剂、分散剂与基础油；所述生长因子、吸附剂、乳化剂、分散剂与基础油的质量比为(0.01-0.03):(1～10):(1～6)：(1～4):(2～6)；最优选为0.02:6:3:2:3。
本发明的芯材中生长因子包括TPF-β1和/或BMP-4，优选地，生长因子包括TPF-β1和BMP-4，两者按质量比为1:1进行复配；本发明中采用TPF-β1与BMP-4两种生长因子复配的方式，用以提高支架对于软骨损伤的修复，其中TPF-β1可以促进骨髓间充质干细胞的Sox-9基因表达以及软骨细胞外基质的合成，并可以促进软骨细胞的新陈代谢；BMP-4可以增大细胞外基质的产出量，抑制细胞肥大，促进干细胞向软骨分化；但是生产因子很容易失活，因此需要载体将生长因子储存缓慢释放，提高生长因子的作用时间；细胞外基质的超微机构是TPF-β1、BMP-4等生长因子天然的优良载体，使用细胞外基质作为生长因子的吸附剂，可以有效延长生长因子的存活时。
所述吸附剂为软骨细胞外基质，优选地，所述软骨细胞外基质的粒径为800-1200目。
优选地，本发明的软骨细胞外基质来源于牛，该软骨细胞外基质制备方法包括以下步骤：
S1.取牛膝盖骨在无菌条件下打开腔体，使用手术刀将软骨剔出，不要剔到软骨下骨；
S2.使用PBS浸泡清洗，除去软骨表面的血水及杂物；
S3.采用0.5mol/L的氢氧化钠溶液浸泡灭活，料液比为1:5-1:10，m/V，于4℃条件下浸泡24-48h；
S4.将软骨放入液氮中冷冻，然后进行研磨，冷冻时间2-4min，研磨工艺为1500转/min，研磨时间1-2min；
S5.去脂、去细胞膜，加入脱脂液，料液比为1:3-1:5，m/V在37℃恒温振荡48H，每12h换一次液，所述脱脂液配比如下：
3-8份碳酸钠、0.1-0.5份EDTA-4Na、1-3份碳酸氢钠、0.5-1份SDS、0.5-1份tritonx-100、3-5份异丙醇、0.1-0.3份AEBSF、82.2-92.8份纯化水。
所述脱脂液采用弱碱性的碳酸钠加碳酸氢钠组合脱脂，可以有效剥离软骨组织中的脂类，而且相对温和，加入的SDS与triton x-100可以改变细胞膜通透性，从而使细胞破裂，而且还可以增大脂类的溶解性，与此同时，本发明中采用EDTA-4Na作为重金属清除剂，可以有效降低所得到的细胞外基质中的重金属含量，保证细胞外基质的生物安全性。
S6.DNA酶、RNA酶消化，采用消化酶混合液处理去细胞的软骨组织，料液比为1:1-1:2，m/V，所述消化酶混合液包含50-100U/ml DNase，0.5-2U/ml RNase，置于恒温摇床内37℃消化12-24小时，震荡频率100-180rpm；
S7.将去细胞后的软骨组织反复水洗，冷冻干燥，得到软骨细胞外基质固体；
S8.将软骨细胞外基质固体液氮冷冻后研磨，冷冻时间2-4min，研磨工艺为1500转/min，研磨时间1-2min，待软骨细胞外基质恢复到室温后，在50℃恒温干燥箱中，放置0.5-1h，先过800目筛，取筛下粉末，再过1200目筛，取筛上粉末，重复上述操作3-5次，最终得到本发明所述的软骨细胞外基质粉末，作为吸附剂；
采用本发明的方法制备的软骨细胞外基质，可以有效去除软骨组织中的脂类、细胞，而且能更大程度的保存胶原蛋白和糖胺聚糖，保持细胞外基质完整形态和组织学及超微结构。
所述乳化剂为司盘80和/或司盘20。
所述分散剂优选为聚乙烯醇；所述聚乙烯醇的醇解度优选为98％～100％；所述聚乙烯醇的粘度优选为5-6mPa.s；所述聚乙烯醇优选挥发分：≤5.0，纯度：≥93.5，灰分：≤0.7；所述聚乙烯醇的pH值优选为5～7；在本发明中，最优选地所述聚乙烯醇为阿拉丁牌，货号为P139533。
所述基础油为甜杏仁油。
本发明的软骨细胞外基质微胶囊的制备方法，包括：
S1)芯材溶液制备：依次将生长因子、吸附剂在PBS中混合，得到芯材PBS溶液；S2)油相制备：将乳化剂、分散剂与甜杏仁油混合加热，得到油相；S3)壁材溶液制备：将壳聚糖加入到0.1mol/L的乙酸水溶液中，充分溶解过滤，得到壁材溶液；S4)将芯材水溶液与壁材溶液混合搅拌，加入油相继续搅拌，得到软骨细胞外基质微胶囊溶液；S5)将所述软骨细胞外基质微胶囊溶液经喷雾干燥后，得到所需的软骨细胞外基质微胶囊。
具体地，上述制备方法中，步骤S1的具体操作过程如下：首先将生长因子加入到PBS中搅拌，此过程中搅拌的转速优选为500～800转/min，搅拌的时间优选为10～30min，更优选为15～25min，再优选为20min；然后缓慢加入吸附剂搅拌，此过程中搅拌的转速优选为100～300转/min；时间优选为20～50min，更优选为25～40min，再优选为30min，从而得到芯材PBS溶液。
将乳化剂、分散剂与甜杏仁油混合加热，得到油相；所述混合加热的温度优选为50℃～90℃，更优选为60℃～80℃，再优选为70℃；所述混合加热的时间优选为20～50min，更优选为20～40min，再优选为30min；所述混合搅拌的转速优选为500～800转/min。
步骤S3中，将壳聚糖与0.1mol/L的乙酸水溶液混合搅拌，得到壁材溶液；所述壳聚糖与乙酸水溶液的质量比优选为1：(2～5)，更优选为1：(3～4)；混合搅拌过程中转速优选为500～800转/min；时间优选为20～50min，更优选为20～40min，再优选为30min。
步骤S4中，将芯材水溶液与壁材溶液混合搅拌时，混合搅拌的转速优选为500～800转/min，时间优选为20～50min，更优选为20～40min，再优选为30min。然后加入油相继续搅拌得到软骨细胞外基质微胶囊，该过程中继续搅拌的转速优选为2000～2500转/min，时间优选为1～4h，更优选为2～3h。
本发明的一种软骨细胞外基质组织工程支架，包括如下重量组分原料：软骨细胞外基质微胶囊0.5-1份，可溶性软骨细胞外基质0.5-1.5份，羧甲基壳聚糖0.5-1.5份，明胶0.5-1.5份，盐酸1-2份，无机盐0.05-0.15份，纯水92.35-96.95份。
其中，软骨细胞外基质微胶囊在前面已经做出了详细介绍。
所述可溶性软骨细胞外基质为软骨细胞外基质粉末进一步酶解所得，具体制备工艺包括以下步骤：
S1、配制胃蛋白酶溶液，胃蛋白酶浓度为0.1-0.3％，使用盐酸调节PH到1-3，优选，1.5-2.5，最优选1.8；
S2、将软骨细胞外基质粉末与胃蛋白酶溶液充分混合，料液比为1:5-1:8，m/V，恒温振荡12-24h；
S3、离心过滤，取上清液，加入30％过氧化氢溶液终止反应；
S4、将终止反应后的溶液进行冷冻干燥，即可得到所需的可溶细胞外基质。
所述盐酸的浓度为1mol/L，所述无机盐为氯化钠、氯化钾、硫酸钠、硫酸钾的一种或两种混合。
所述软骨细胞外基质组织工程支架的制备方法包括以下步骤：
S1、组织工程支架溶液制备：
a.取纯水，加入盐酸，无机盐，开启搅拌，搅拌时间10-20min，搅拌机转速300-600r/min；
b.加入羧甲基壳聚糖，继续搅拌10-20min，搅拌机转速600-800r/min；
c.加入明胶，升温至45-60℃，继续搅拌10-20min，搅拌机转速600-800r/min；
d.自然冷却至室温后，加入0.5-1.5份可溶性软骨细胞外基质，继续搅拌，搅拌时间5-10min，搅拌机转速300-600r/min；
e.加入软骨细胞外基质微胶囊0.5-1份，继续搅拌，搅拌时间5-10min，搅拌机转速100-200r/min；
S2、成型：
a.称取规定量S1的组织工程支架溶液加入到模具中；
b.将模具放入4-6℃冰箱中预冷10-20min，然后放入-20℃冰箱中1-2h，最后放入-80℃冰箱中深冷1-2h；
c.将冷冻后的模具放入冷冻干燥机进行冷冻干燥，冻干机温度-80℃，冻干时间12-24h；
S3、交联：使用碳化二亚胺与琥珀酰亚胺或戊二醛作为交联剂，4℃交联24-48h；
S4、冻干成型：将交联后的支架反复用纯化水冲洗，冲洗完成后，进行冷冻干燥，最终得到本发明所述的软骨细胞外基质组织工程支架。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果为：
本发明制备的支架具有优异的力学性能，正常人体软骨的抗压强度为1MPa，本发明所制备的支架抗压强度要优于软骨本身，因此，植入人体后，可以提供较好的力学支撑，而且本发明的支架的吸水率很高，可以达到1800％以上，孔隙率≥85％，这些性能可以为细胞生长提供非常适宜的环境，与此同时，还可以持续释放生长因子，促进骨髓间充质干细胞的增殖分化。通过测试，可以看到，本发明的支架没有生物毒性可以应用于生物体的治疗，治疗后软骨生长良好，基本完全覆盖缺损部位，治疗效果十分优异。
附图说明
图1为实施例1制备的组织工程支架产品照片；
图2为实施例1的组织工程支架的SEM图；
图3为实施例1组织工程支架MTT测试结果；
图4为各实施例的生长因子TFP-β1缓释曲线；
图5为动物实验6周空白对照组的兔膝盖软骨恢复图；
图6为动物实验6周微骨折处理组的兔膝盖软骨恢复图；
图7为动物实验6周采用实施例1的工程支架组的兔膝盖软骨恢复图。
具体实施方式
为让本领域的技术人员更加清晰直观的了解本发明，下面将结合附图，对本发明作进一步的说明。
本发明的一种软骨细胞外基质组织工程支架，包括如下重量组分原料：软骨细胞外基质微胶囊0.5-1份，可溶性软骨细胞外基质0.5-1.5份，羧甲基壳聚糖0.5-1.5份，明胶0.5-1.5份，1mol/L的盐酸1-2份，无机盐0.05-0.15份，纯水92.35-96.95份。
其中，软骨细胞外基质微胶囊包括芯材与包裹于芯材外的壁材；所述壁材与芯材的质量比优选为1:(1～3)，更优选为1:(1～2.5)，再优选为1:(1.2～2)，最优选为1：(1.4～1.6)。
本发明提供的软骨细胞外基质微胶囊的壁材为壳聚糖；所述壳聚糖脱乙酰度≥90％，分子量20-40w；所述芯材包括生长因子、吸附剂、乳化剂、分散剂与基础油(优选为甜杏仁油)；所述生长因子、吸附剂、乳化剂、分散剂与基础油的质量比为(0.01-0.03):(1～10):(1～6)：(1～4):(2～6)；最优选为0.02:6:3:2:3。
本发明的芯材中生长因子包括TPF-β1和/或BMP-4，优选地，生长因子包括TPF-β1和BMP-4，两者按质量比为1:1进行复配；本发明中采用TPF-β1与BMP-4两种生长因子复配的方式，用以提高支架对于软骨损伤的修复，其中TPF-β1可以促进骨髓间充质干细胞的Sox-9基因表达以及软骨细胞外基质的合成，并可以促进软骨细胞的新陈代谢；BMP-4可以增大细胞外基质的产出量，抑制细胞肥大，促进干细胞向软骨分化；但是生产因子很容易失活，因此需要载体将生长因子储存缓慢释放，提高生长因子的作用时间；细胞外基质的超微机构是TPF-β1、BMP-4等生长因子天然的优良载体，使用细胞外基质作为生长因子的吸附剂，可以有效延长生长因子的存活时。
所述吸附剂为软骨细胞外基质，优选地，所述软骨细胞外基质的粒径为800-1200目。
优选地，本发明的软骨细胞外基质来源于牛，该软骨细胞外基质制备方法包括以下步骤：
S1.取牛膝盖骨在无菌条件下打开腔体，使用手术刀将软骨剔出，不要剔到软骨下骨；
S2.使用PBS浸泡清洗，除去软骨表面的血水及杂物；
S3.采用0.5mol/L的氢氧化钠溶液浸泡灭活，料液比为1:5-1:10，m/V，于4℃条件下浸泡24-48h；
S4.将软骨放入液氮中冷冻，然后进行研磨，冷冻时间2-4min，研磨工艺为1500转/min，研磨时间1-2min；
S5.去脂、去细胞膜，加入脱脂液，料液比为1:3-1:5，m/V在37℃恒温振荡48H，每12h换一次液，所述脱脂液配比如下：
3-8份碳酸钠、0.1-0.5份EDTA-4Na、1-3份碳酸氢钠、0.5-1份SDS、0.5-1份tritonx-100、3-5份异丙醇、0.1-0.3份AEBSF、82.2-92.8份纯化水。
所述脱脂液采用弱碱性的碳酸钠加碳酸氢钠组合脱脂，可以有效剥离软骨组织中的脂类，而且相对温和，加入的SDS与triton x-100可以改变细胞膜通透性，从而使细胞破裂，而且还可以增大脂类的溶解性，与此同时，本发明中采用EDTA-4Na作为重金属清除剂，可以有效降低所得到的细胞外基质中的重金属含量，保证细胞外基质的生物安全性。
S6.DNA酶、RNA酶消化，采用消化酶混合液处理去细胞的软骨组织，料液比为1:1-1:2，m/V，所述消化酶混合液包含50-100U/ml DNase，0.5-2U/ml RNase，置于恒温摇床内37℃消化12-24小时，震荡频率100-180rpm；
S7.将去细胞后的软骨组织反复水洗，冷冻干燥，得到软骨细胞外基质固体；
S8.将软骨细胞外基质固体液氮冷冻后研磨，冷冻时间2-4min，研磨工艺为1500转/min，研磨时间1-2min，待软骨细胞外基质恢复到室温后，在50℃恒温干燥箱中，放置0.5-1h，先过800目筛，取筛下粉末，再过1200目筛，取筛上粉末，重复上述操作3-5次，最终得到本发明所述的软骨细胞外基质粉末，作为吸附剂；
采用本发明的方法制备的软骨细胞外基质，可以有效去除软骨组织中的脂类、细胞，而且能更大程度的保存胶原蛋白和糖胺聚糖，保持细胞外基质完整形态和组织学及超微结构。
所述乳化剂为司盘80和/或司盘20。
所述分散剂优选为聚乙烯醇；所述聚乙烯醇的醇解度优选为98％～100％；所述聚乙烯醇的粘度优选为5-6mPa.s；所述聚乙烯醇优选挥发分：≤5.0，纯度：≥93.5，灰分：≤0.7；所述聚乙烯醇的pH值优选为5～7；在本发明中，最优选地所述聚乙烯醇为阿拉丁牌，货号为P139533。
本发明的软骨细胞外基质微胶囊的制备方法，包括：
S1)芯材溶液制备：依次将生长因子、吸附剂在PBS中混合，得到芯材PBS溶液；S2)油相制备：将乳化剂、分散剂与甜杏仁油混合加热，得到油相；S3)壁材溶液制备：将壳聚糖加入到0.1mol/L的乙酸水溶液中，充分溶解过滤，得到壁材溶液；S4)将芯材水溶液与壁材溶液混合搅拌，加入油相继续搅拌，得到软骨细胞外基质微胶囊溶液；S5)将所述软骨细胞外基质微胶囊溶液经喷雾干燥后，得到所需的软骨细胞外基质微胶囊。
具体地，上述制备方法中，步骤S1的具体操作过程如下：首先将生长因子加入到PBS中搅拌，此过程中搅拌的转速优选为500～800转/min，搅拌的时间优选为10～30min，更优选为15～25min，再优选为20min；然后缓慢加入吸附剂搅拌，此过程中搅拌的转速优选为100～300转/min；时间优选为20～50min，更优选为25～40min，再优选为30min，从而得到芯材PBS溶液。
将乳化剂、分散剂与甜杏仁油混合加热，得到油相；所述混合加热的温度优选为50℃～90℃，更优选为60℃～80℃，再优选为70℃；所述混合加热的时间优选为20～50min，更优选为20～40min，再优选为30min；所述混合搅拌的转速优选为500～800转/min。
步骤S3中，将壳聚糖与0.1mol/L的乙酸水溶液混合搅拌，得到壁材溶液；所述壳聚糖与乙酸水溶液的质量比优选为1：(2～5)，更优选为1：(3～4)；混合搅拌过程中转速优选为500～800转/min；时间优选为20～50min，更优选为20～40min，再优选为30min。
步骤S4中，将芯材水溶液与壁材溶液混合搅拌时，混合搅拌的转速优选为500～800转/min，时间优选为20～50min，更优选为20～40min，再优选为30min。然后加入油相继续搅拌得到软骨细胞外基质微胶囊，该过程中继续搅拌的转速优选为2000～2500转/min，时间优选为1～4h，更优选为2～3h。
所述可溶性软骨细胞外基质为软骨细胞外基质进一步酶解所得，具体制备工艺包括以下步骤：
S1、配制胃蛋白酶溶液，胃蛋白酶浓度为0.1-0.3％，使用盐酸调节PH到1-3，优选，1.5-2.5，最优选1.8；
S2、将软骨细胞外基质粉末与胃蛋白酶溶液充分混合，料液比为1:5-1:8，m/V，恒温振荡12-24h；
S3、离心过滤，取上清液，加入30％过氧化氢溶液终止反应；
S4、将终止反应后的溶液进行冷冻干燥，即可得到所需的可溶细胞外基质。
所述盐酸的浓度为1mol/L，所述无机盐为氯化钠、氯化钾、硫酸钠、硫酸钾的一种或两种混合。
本发明的软骨细胞外基质组织工程支架的制备方法包括以下步骤：
S1、组织工程支架溶液制备：
a.取纯水，加入盐酸，无机盐，开启搅拌，搅拌时间10-20min，搅拌机转速300-600r/min；
b.加入羧甲基壳聚糖，继续搅拌10-20min，搅拌机转速600-800r/min；
c.加入明胶，升温至45-60℃，继续搅拌10-20min，搅拌机转速600-800r/min；
d.自然冷却至室温后，加入0.5-1.5份可溶性软骨细胞外基质，继续搅拌，搅拌时间5-10min，搅拌机转速300-600r/min；
e.加入软骨细胞外基质微胶囊0.5-1份，继续搅拌，搅拌时间5-10min，搅拌机转速100-200r/min；
S2、成型：
a.称取规定量S1的组织工程支架溶液加入到模具中；
b.将模具放入4-6℃冰箱中预冷10-20min，然后放入-20℃冰箱中1-2h，最后放入-80℃冰箱中深冷1-2h；
c.将冷冻后的模具放入冷冻干燥机进行冷冻干燥，冻干机温度-80℃，冻干时间12-24h；
S3、交联：使用碳化二亚胺与琥珀酰亚胺或戊二醛作为交联剂，4℃交联24-48h；
S4、冻干成型：将交联后的支架反复用纯化水冲洗，冲洗完成后，进行冷冻干燥，最终得到本发明所述的软骨细胞外基质组织工程支架。
下面以实施例1-5对本申请做进一步说明。
实施例1
本实施例的软骨细胞外基质组织工程支架包括如下重量份的组分：
软骨细胞外基质微胶囊0.5重量份，可溶性软骨细胞外基质1重量份，羧甲基壳聚糖1重量份，明胶1重量份，1mol/L的盐酸1重量份，无机盐(氯化钠)0.05重量份，纯水95.45重量份；
所述软骨细胞外基质组织工程支架的制备方法包括以下步骤：
S1、组织工程支架溶液制备：a取纯水，加入盐酸和无机盐，开启搅拌，搅拌时间10min，搅拌机转速400r/min；b加入羧甲基壳聚糖，继续搅拌10min，搅拌机转速600r/min；c加入明胶，升温至50℃，继续搅拌20min，搅拌机转速700r/min；d自然冷却至室温后，加入可溶性软骨细胞外基质，继续搅拌，搅拌时间5min，搅拌机转速400r/min；e加入软骨细胞外基质微胶囊，继续搅拌，搅拌时间5min，搅拌机转速100r/min；
S2、成型：a取上述组织工程支架溶液加入到模具中；b将模具放入4-6℃冰箱中预冷20min，然后放入-20℃冰箱中2h，最后放入-80℃冰箱中深冷1h；c将冷冻后的模具放入冷冻干燥机进行冷冻干燥，冻干机温度-80℃，冻干时间24h；
S3、交联：使用50mM碳化二亚胺与10mM琥珀酰亚胺作为交联剂，4℃交联24h；
S4、冻干成型：将交联后的支架反复用纯化水冲洗，冲洗完成后，进行冷冻干燥，最终得到本发明所述软骨细胞外基质组织工程支架。
其中的软骨细胞外基质微胶囊，包括芯材与包裹于芯材外的壁材，所述壁材与芯材的质量比优选为1：1.5；所述壁材为壳聚糖，壳聚糖脱乙酰度≥90％，分子量20-40w；所述芯材包括：生长因子、吸附剂、乳化剂、分散剂与基础油(甜杏仁油)；所述生长因子、吸附剂、乳化剂、分散剂与基础油的质量比为0.02：6：3：2：3；
所述生长因子为TPF-β1、BMP-4按1:1的复配；所述吸附剂为软骨细胞外基质；所述软骨细胞外基质来源于牛，且软骨细胞外基质的粒径为800-1200目。
作为吸附剂的软骨细胞外基质的制备方法包括以下步骤：
S1、取牛膝盖骨在无菌条件下打开腔体，使用手术刀将软骨剔出，不要剔到软骨下骨；
S2、使用PBS浸泡清洗，除去软骨表面的血水及杂物；
S3、采用0.5mol/L的氢氧化钠溶液浸泡灭活，料液比为1:5m/V，于4℃条件下浸泡48h；
S4、将软骨放入液氮中冷冻，然后进行研磨，冷冻时间3min，研磨工艺为1500转/min，研磨时间2min；
S5、去脂、去细胞膜，加入脱脂液，料液比为1:3，m/V在37℃恒温振荡48H，每12h换一次液；所述脱脂液配比如下：5份碳酸钠、0.2份EDTA4Na、2份碳酸氢钠、1份SDS、1份tritonx-100、5份异丙醇、0.1份AEBSF、85.7份纯化水。
S6、DNA酶、RNA酶消化，采用消化酶混合液处理去细胞的软骨组织，料液比为1:1，m/V，所述消化酶混合液包含50U/ml DNase，1U/ml RNase，置于恒温摇床内37℃消化24小时，震荡频率150rpm；
S7、将去细胞后的软骨组织反复水洗，冷冻干燥，得到软骨细胞外基质固体；
S8、将S7步骤的软骨细胞外基质用液氮冷冻研磨，冷冻时间3min，研磨工艺为1500转/min，研磨时间2min，待软骨细胞外基质恢复到室温后，在50℃恒温干燥箱中，放置1h，先过800目筛，取筛下粉末，再过1200目筛，取筛上粉末，重复上述操作3-5次，最终得到本发明所述的软骨细胞外基质粉末；
所述乳化剂为司盘80和/或司盘20。
所述分散剂优选为聚乙烯醇；所述聚乙烯醇的醇解度优选为98％～100％；所述聚乙烯醇的粘度优选为5-6mPa·s；所述聚乙烯醇优选挥发分：≤5.0，纯度：≥93.5，灰分：≤0.7；所述聚乙烯醇的pH值优选为5～7；在本发明中，最优选地所述聚乙烯醇为阿拉丁的P139533。
本发明还提供了一种软骨细胞外基质微胶囊的制备方法，包括：S1、芯材溶液制备：将生长因子、吸附剂、在PBS中混合，得到芯材PBS溶液；S2、油相制备：将乳化剂、分散剂与甜杏仁油混合加热，得到油相；S3、壁材溶液制备：将壳聚糖加入到0.1mol/L的乙酸水溶液中，充分溶解过滤，得到壁材溶液；S4、将芯材水溶液与壁材溶液混合搅拌，加入油相继续搅拌，得到软骨细胞外基质微胶囊溶液；S5、将所述软骨细胞外基质微胶囊溶液经喷雾干燥后，得到所需的微胶囊。
本实施例中，上述制备方法中，芯材溶液制备的具体操作过程如下：首先将生长因子在PBS中搅拌稀释到所需含量，搅拌的转速优选为600r/min，时间为20min；然后缓慢加入吸附剂搅拌，搅拌的转速优选为100r/min，时间优选为30min，得到芯材PBS溶液。
油相制备过程中，将乳化剂、分散剂与甜杏仁油混合加热的温度优选为70℃，混合加热的时间优选为30min；混合过程中搅拌的转速优选为800转/min。
壁材溶液制备过程中，壳聚糖与乙酸水溶液的质量比优选为1：(3～4)；混合过程中的转速优选为500转/min，时间优选为30min。
芯材水溶液与壁材溶液混合搅拌的转速优选为500转/min，时间优选为30min，然后加入油相继续搅拌的转速优选为2500转/min，时间优选2h。
所述可溶性软骨细胞外基质为软骨细胞外基质进一步酶解所得，制备工艺包括以下步骤：
S1、配制胃蛋白酶溶液，胃蛋白酶浓度为0.2％，使用盐酸调节PH到1.8；
S2、将软骨细胞外基质粉末与胃蛋白酶溶液充分混合，料液比为1:5，m/V，恒温振荡24h；
S3、离心过滤，取上清液，加入30％过氧化氢溶液终止反应；
S4、将终止后的溶液进行冷冻干燥，即可得到所需的可溶细胞外基质。
实施例2
本实施例的软骨细胞外基质组织工程支架包括以下重量份的组分：
软骨细胞外基质微胶囊0.5份，可溶性软骨细胞外基质0.5份，羧甲基壳聚糖0.5份，明胶0.5份，1mol/L的盐酸1份，无机盐(氯化钠)0.05份，纯水96.95份。
本实施例中的软骨细胞外基质组织工程支架的制备方法与实施例1中的软骨细胞外基质组织工程支架的制备方法相同。
此外，其他方面，如软骨细胞外基质微胶囊、可溶性软骨细胞外基质的组成和制备方法、各组分的用料选择等都与实施例1保持一致。
实施例3
本实施例的软骨细胞外基质组织工程支架包括以下重量份的组分：
软骨细胞外基质微胶囊0.5份，可溶性软骨细胞外基质0.7份，羧甲基壳聚糖0.8份，明胶0.7份，1mol/L的盐酸1份，无机盐(氯化钠)0.05份，纯水96.25份。
本实施例中的软骨细胞外基质组织工程支架的制备方法与实施例1中的软骨细胞外基质组织工程支架的制备方法相同。
此外，其他方面，如软骨细胞外基质微胶囊、可溶性软骨细胞外基质的组成和制备方法、各组分的用料选择等都与实施例1保持一致。
实施例4
本实施例的软骨细胞外基质组织工程支架包括以下重量份的组分：
软骨细胞外基质微胶囊0.5份，可溶性软骨细胞外基质1.2份，羧甲基壳聚糖1.2份，明胶1.2份，0.1mol/L的盐酸1.5份，无机盐(氯化钠)0.05份，纯水94.35份。
本实施例中的软骨细胞外基质组织工程支架的制备方法与实施例1中的软骨细胞外基质组织工程支架的制备方法相同。
此外，其他方面，如软骨细胞外基质微胶囊、可溶性软骨细胞外基质的组成和制备方法、各组分的用料选择等都与实施例1保持一致。
实施例5
本实施例的软骨细胞外基质组织工程支架包括以下重量份的组分：
软骨细胞外基质微胶囊0.8份，可溶性软骨细胞外基质1份，羧甲基壳聚糖1份，明胶1份，1mol/L的盐酸1份，无机盐(氯化钠)0.05份，纯水95.15份。
本实施例中的软骨细胞外基质组织工程支架的制备方法与实施例1中的软骨细胞外基质组织工程支架的制备方法相同。
此外，其他方面，如软骨细胞外基质微胶囊、可溶性软骨细胞外基质的组成和制备方法、各组分的用料选择等都与实施例1保持一致。
以实施例1为代表，本发明制备得到的软骨细胞外基质组织工程支架如图1所示，经过扫描电子显微镜观察，可见支架呈空间网状结构，孔径在100um以上，而且间隙较大，有利于细胞在支架内部的迁移黏附，如图2所示。
性能测试
吸水率参照标准GB/T 1034-2008
将样品浸入23℃蒸馏水中，在规定温度下放置一定时间，测试试样开始实验时与吸水后的质量差异，用质量差异对于初始质量的百分比表示。
计算公式
c＝(m2-m1)/m1*100
式中
C—试样的吸水质量分数，数值以％表示；
m1—浸泡前，干燥后试样重量，单位mg；
m2—浸泡后试样的重量，单位mg；
表1
实施例1 实施例2 实施例3 实施例4 实施例5
吸水率(％) 2200 1804 1980 2315 2235
压缩强度参照标准GB/T1041-2008
计算公式为：
σ＝F/A
式中：
σ—应力参数，单位为兆帕(MPa)；
F—测试的力，单位为牛顿(N)；
A—试样的原始面积，单位为平方毫米(mm2)；
表2
实施例1 实施例2 实施例3 实施例4 实施例5
压缩强度(MPa) 1.84 1.46 1.65 2.21 1.98
孔隙率参照标准YY/T 1616-2018
选取有刻度的试管，并在试管中装入一定量的无水乙醇，测定无水乙醇体积V1；取8个支架样品浸入无水乙醇中充分浸泡，接负压，吸引样本中残存的空气排空，使无水乙醇充分充盈于多孔支架，最终无气泡逸出为止，得到支架和无水乙醇的总体积V2；取出浸满无水乙醇的支架后读数，得剩余无水乙醇体积V3；每个样本测试3次，取平均值。
计算公式
E＝(V1-V3)/(V2-V3)，式中：
V1—初始无水乙醇体积；
V2—无水乙醇充分充盈于多孔支架后，试管中无水乙醇体积；
V3—将充满无水乙醇的支架取出后，剩余无水乙醇体积；
表3
实施例1 实施例2 实施例3 实施例4 实施例5
孔隙率(％) 87.4 92.5 90.1 95.3 86.8
MTT毒性实验参照GB/T 16886.5-2017《医疗器械生物学评价第五部分体外细胞毒性试验》采用MTT法测定样品的潜在细胞毒性。确认材料的浸提液与培养细胞接触之后，是否能引起毒性反应。
评价标准
(1)50％的样品浸提液至少和100％的细胞活力相同或者比100％的细胞活力更高，否则应该重复实验。
(2)细胞活力％越低，潜在的细胞毒性越大。
(3)细胞活力＜空白组70％，说明样品具有潜在的细胞毒性。
(4)100％试验样品浸提液的细胞活力％为最终结果。
测试结果如图3所示。
生长因子缓释
将质量为0.01g的软骨细胞外基质组织工程支架材料加入1mL磷酸缓冲盐溶液PBS(pH为7.4)中，之后于转速为80rpm的室温(20℃～25℃)摇床。缓释一定时间后，10000rcf离心5分钟，取上清保存，并加入等量新鲜的PBS缓冲液(pH为7.4)继续进行缓释；在缓释周期内按此方式依次取多个上清样品。使用ELISA试剂盒测定上清样品中生长因子TGF-β1的浓度，每组测试3个样品，结果取平均值。结果见图4，可知，本发明的工程支架缓释时间可以达到超长的42天。
小动物实验
试验方法：
S1、诱导麻醉：采用新西兰兔作为实验动物，使用盐酸赛拉嗪注射液对实验兔肌内注射进行诱导麻醉；
S2、造模：使用直径为4mm的牙科钻钻头在膝关节股骨软骨上钻一个直径为4mm，深度控制在2mm的软骨缺损模型，生理盐水冲洗创口；
S3、给药治疗：在新西兰兔在膝关节软骨缺损模型放入实施例1的工程支架，缝合；观察恢复情况。同时设置不处理的空白对照组和微骨折治疗组，对比三个组的关节恢复情况。
本发明制备的支架具有优异的力学性能，正常人体软骨的抗压强度为1MPa，本发明所制备的支架抗压强度要优于软骨本身，因此，植入人体后，可以提供较好的力学支撑，而且本发明支架的吸水率很高，可以达到1800％以上，孔隙率≥85％，这些性能可以为细胞生长提供非常适宜的环境，于此同时，还可以持续释放生长因子，促进骨髓间充质干细胞的增殖分化。通过进行细胞长入测试，可以看到，本发明的支架没有生物毒性可以应用于生物体的治疗；从图5-7可以看到，不治疗，或者采用微骨折治疗，只会在缺损区域形成纤维软骨，而采用本发明的支架治疗后，软骨生长良好，基本完全覆盖缺损部位，治疗效果十分优异。
上述对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和应用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于这里的实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，对于本发明做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种软骨细胞外基质微胶囊，其特征在于，包括芯材与包裹于芯材外的壁材；
所述壁材与芯材的质量比优选为1:(1～3)，更优选为1:(1～2.5)，再优选为1:(1.2～2)，最优选为1：(1.4～1.6)；
所述壁材为壳聚糖；
所述芯材包括生长因子、吸附剂、乳化剂、分散剂与基础油；所述生长因子、吸附剂、乳化剂、分散剂与基础油的质量比为(0.01-0.03):(1～10):(1～6):(1～4):(2～6)；最优选为0.02:6:3:2:3。
2.如权利要求1所述的软骨细胞外基质微胶囊，其特征在于，所述芯材中生长因子包括TPF-β1和/或BMP-4，优选地，生长因子包括TPF-β1和BMP-4，两者按质量比为1:1进行复配。
3.如权利要求1所述的软骨细胞外基质微胶囊，其特征在于，所述吸附剂为牛的软骨细胞外基质，该软骨细胞外基质的制备方法包括以下步骤：
S1.取牛膝盖骨在无菌条件下打开腔体，使用手术刀将软骨剔出；
S2.使用PBS浸泡清洗，除去软骨表面的血水及杂物；
S3.采用0.5mol/L的氢氧化钠溶液浸泡灭活，料液比为1:5-1:10，m/V，于4℃条件下浸泡24-48h；
S4.将软骨放入液氮中冷冻，然后进行研磨，冷冻时间2-4min，研磨工艺为1500转/min，研磨时间1-2min；
S5.去脂、去细胞膜，加入脱脂液，料液比为1:3-1:5，m/V在37℃恒温振荡48H，每12h换一次液，所述脱脂液配比如下：3-8份碳酸钠、0.1-0.5份EDTA-4Na、1-3份碳酸氢钠、0.5-1份SDS、0.5-1份triton x-100、3-5份异丙醇、0.1-0.3份AEBSF、82.2-92.8份纯化水；
S6.DNA酶、RNA酶消化，采用消化酶混合液处理去细胞的软骨组织，料液比为1:1-1:2，m/V，所述消化酶混合液包含50-100U/ml DNase，0.5-2U/ml RNase，置于恒温摇床内37℃消化12-24小时，震荡频率100-180rpm；
S7.将去细胞后的软骨组织反复水洗，冷冻干燥，得到软骨细胞外基质固体；
S8.将软骨细胞外基质固体液氮冷冻后研磨，冷冻时间2-4min，研磨工艺为1500转/min，研磨时间1-2min，待软骨细胞外基质恢复到室温后，在50℃恒温干燥箱中，放置0.5-1h，先过800目筛，取筛下粉末，再过1200目筛，取筛上粉末，重复上述操作3-5次，最终得到软骨细胞外基质粉末。
4.如权利要求1所述的软骨细胞外基质微胶囊，其特征在于，所述乳化剂为司盘80和/或司盘20；
所述基础油为甜杏仁油；
所述分散剂优选为聚乙烯醇；所述聚乙烯醇的醇解度优选为98％～100％；所述聚乙烯醇的粘度优选为5-6mPa.s；所述聚乙烯醇优选挥发分≤5.0，纯度≥93.5，灰分≤0.7；所述聚乙烯醇的pH值优选为5～7。
5.如权利要求1所述的软骨细胞外基质微胶囊的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、芯材溶液制备：依次将生长因子、吸附剂在PBS中混合，得到芯材PBS溶液；
S2、油相制备：将乳化剂、分散剂与甜杏仁油混合加热，得到油相；
S3、壁材溶液制备：将壳聚糖加入到0.1mol/L的乙酸水溶液中，充分溶解过滤，得到壁材溶液；
S4、将芯材水溶液与壁材溶液混合搅拌，加入油相继续搅拌，得到软骨细胞外基质微胶囊溶液；
S5、将所述软骨细胞外基质微胶囊溶液经喷雾干燥后，得到所需的软骨细胞外基质微胶囊。
6.如权利要求5所述的软骨细胞外基质微胶囊的制备方法，其特征在于，步骤S1的具体操作过程如下：首先将生长因子加入到PBS中搅拌，此过程中搅拌的转速优选为500～800转/min，搅拌的时间优选为10～30min，更优选为15～25min，再优选为20min；然后缓慢加入吸附剂搅拌，此过程中搅拌的转速优选为100～300转/min；时间优选为20～50min，更优选为25～40min，再优选为30min，从而得到芯材PBS溶液；
步骤S2中，将乳化剂、分散剂与基础油混合加热，得到油相；混合加热的温度优选为50℃～90℃，更优选为60℃～80℃，再优选为70℃；混合加热的时间优选为20～50min，更优选为20～40min，再优选为30min；混合搅拌的转速优选为500～800转/min；
步骤S3中，将壳聚糖与0.1mol/L的乙酸水溶液混合搅拌，得到壁材溶液；所述壳聚糖与乙酸水溶液的质量比优选为1：(2～5)，更优选为1：(3～4)；混合搅拌过程中转速优选为500～800转/min；时间优选为20～50min，更优选为20～40min，再优选为30min；
步骤S4中，将芯材水溶液与壁材溶液混合搅拌时，混合搅拌的转速优选为500～800转/min，时间优选为20～50min，更优选为20～40min，再优选为30min；然后加入油相继续搅拌得到软骨细胞外基质微胶囊，该过程中继续搅拌的转速优选为2000～2500转/min，时间优选为1～4h，更优选为2～3h。
7.一种软骨细胞外基质组织工程支架，其特征在于，包括如下重量组分原料：权利要求1～4任一项所述的软骨细胞外基质微胶囊0.5-1份，可溶性软骨细胞外基质0.5-1.5份，羧甲基壳聚糖0.5-1.5份，明胶0.5-1.5份，盐酸1-2份，无机盐0.05-0.15份，纯水92.35-96.95份；所述可溶性软骨细胞外基质为牛的软骨细胞外基质进一步经胃蛋白酶溶液酶解所得。
8.如权利要求7所述的一种软骨细胞外基质组织工程支架，其特征在于，可溶性软骨细胞外基质的制备工艺包括以下步骤：
S1、配制胃蛋白酶溶液，胃蛋白酶浓度为0.1-0.3％，使用盐酸调节PH到1-3，优选为1.5-2.5，最优选1.8；
S2、将牛的软骨细胞外基质粉末与胃蛋白酶溶液充分混合，料液比为1:5-1:8，m/V，恒温振荡12-24h；
S3、离心过滤，取上清液，加入30％过氧化氢溶液终止反应；
S4、将终止反应后的溶液进行冷冻干燥，即可得到所需的可溶细胞外基质。
9.如权利要求7所述的一种软骨细胞外基质组织工程支架，其特征在于，
所述盐酸的浓度为1mol/L；
所述无机盐为氯化钠、氯化钾、硫酸钠、硫酸钾的一种或两种混合。
10.如权利要求7所述的一种软骨细胞外基质组织工程支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、组织工程支架溶液制备：
a.取纯水，加入盐酸，无机盐，开启搅拌，搅拌时间10-20min，搅拌机转速300-600r/min；
b.加入羧甲基壳聚糖，继续搅拌10-20min，搅拌机转速600-800r/min；
c.加入明胶，升温至45-60℃，继续搅拌10-20min，搅拌机转速600-800r/min；
d.自然冷却至室温后，加入0.5-1.5份可溶性软骨细胞外基质，继续搅拌，搅拌时间5-10min，搅拌机转速300-600r/min；
e.加入软骨细胞外基质微胶囊0.5-1份，继续搅拌，搅拌时间5-10min，搅拌机转速100-200r/min；
S2、成型：
a.称取规定量S1的组织工程支架溶液加入到模具中；
b.将模具放入4-6℃冰箱中预冷10-20min，然后放入-20℃冰箱中1-2h，最后放入-80℃冰箱中深冷1-2h；
c.将冷冻后的模具放入冷冻干燥机进行冷冻干燥，冻干机温度-80℃，冻干时间12-24h；
S3、交联：使用碳化二亚胺与琥珀酰亚胺或戊二醛作为交联剂，4℃交联24-48h；
S4、冻干成型：将交联后的支架反复用纯化水冲洗，冲洗完成后，进行冷冻干燥，最终得到本发明所述的软骨细胞外基质组织工程支架。
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