CN102238970B - 利用动物组织粉末制造多孔立体支架的方法及其多孔立体支架 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种利用动物组织粉末来制造多孔立体支架的方法，包括将动物衍生组织制成粉末，在将该动物衍生组织制成粉末之前或之后，或在制成粉末的同时，将其去细胞化，并通过颗粒过滤法将该去细胞化的动物衍生组织粉末制成多孔立体支架。
Description
技术领域
本发明涉及一种制造多孔立体支架的方法及通过该方法制成的多孔立体支架，尤指一种利用来自动物衍生组织的粉末来制造多孔立体支架的方法及通过该方法制成的多孔立体支架，其中利用颗粒过滤法将来自动物衍生组织的粉末制成因应其目的与治疗用途的具有多种尺寸、孔隙率、形状及结构的多孔立体支架。
背景技术
关节软骨细胞为只存在于软骨的中层衍生细胞。软骨为一种无血管组织，其由生成自软骨细胞的细胞外基质所组成。其不会造成发炎反应，也不会在受损时自行再生。一旦软骨受损，其自行再生的能力相当有限，并最后将导致骨关节炎，而骨关节炎将让病人的生活质量受到很大的影响。
目前，典型处置受损软骨的方法包含：例如磨削关节成形术及微骨折术的骨髓刺激法；通过移植软骨组织到受损区域的软骨镶嵌成形术；通过培养并移植自体软骨细胞到受损区域的自体软骨细胞移植(ACI)等。
由于骨髓刺激法以关节内窥镜进行侵入式治疗只需很短的时间，使其成为现今广泛使用的方式。此方法的优点在于其操作流程简单且所需操作时间短，但其有个关键性的缺点，其无法妥善保存软骨修复所必需的血块(包含干细胞)。此外，该技术所形成的血块物理上并不稳定且很难有效产生正常的软骨。更明确的说，损失的血块大多让重建的软骨变成纤维状软骨而非正常的透明软骨。因此很难预期通过该骨髓刺激法能够成功治愈软骨缺陷。
此外，该软骨镶嵌成形术主要是将损坏的软骨区域以分离自较少体重负担及低摩擦力区域的正常骨软骨组织填满。此技术对于治愈损坏的软骨效果相当不错，但问题在于很难在分离骨软骨组织时避免造成二次伤害。
近年来，自体软骨细胞移植(ACI)主要通过培养并移植自体软骨细胞到受损区域以治疗受损的软骨。ACI是临床认可的用以治疗受损软骨的移植术(Brittberg M.等人，新英格兰医学期刊，331：889，1994)。然而，其也具有一个缺点，即软骨的受损区域必须以骨膜覆盖并在植入软骨细胞后紧密的缝合。此外，该骨膜可允许软骨细胞增生，导致受损区域在手术后疼痛。ACI另有一缺点，其手术过程必须进行两个步骤；以关节内窥镜手术将软骨细胞分离并在体外培养一长段时间，再将细胞悬浮液植入受损区域。
本案发明人发现立体支架在植入受损软骨内时，可有效再生透明软骨组织。其立体支架若在分离动物组织，尤其，动物软骨之后，通过“软骨制成粉末过程”及“颗粒过滤法”，可在不受限于透明软骨组织的物理特性、孔隙率、形状、结构及尺寸下，增进其再生的效果。
近来，直接从动物取得的同种或异种组织或器官在去细胞化后，可应用于各种支架或薄膜的制造中。
至今，小肠黏膜下组织(SIS)、膀胱黏膜下组织(UBM)、皮肤、人类羊膜(HAM)等已充分商品化或发展。举例来说，“Alloderm”通过将捐赠者的皮肤组织去细胞化来取得，“OASIS”通过将小肠黏膜下组织(SIS)去细胞化来取得，其用作伤口的修饰剂，及膀胱黏膜下组织(UBM)通过将猪膀胱组织去细胞化来取得。此外，“Chondro-gide”是由第I型及第III型胶原蛋白所组成的双层膜，其在严密的研发下发展出来作为软骨缺陷的再生。
详细的说，软骨组织依其生化组成包括组织液、大分子及其它物质。组织液大部分是由水(65-80％)所组成，并进一步包含蛋白质、无机盐、气体及各种代谢物。组织液一般在高浓度下带有正电以平衡带有负电的蛋白多糖。
约60％的大分子是由胶原蛋白所组成。胶原蛋白在细胞外基质中与蛋白多糖键结在一起以形成网状结构的大分子，其保有软骨结构的完整性并赋予软骨组织张力与弹性。大多数的软骨胶原蛋白，即90-95％，是由第II型胶原蛋白所组成，该第II型胶原蛋白是由三条α型链组合成螺旋结构以形成纤维状。蛋白多糖是个复杂的分子，其核心蛋白与糖胺多糖(GAG)键结，糖胺多糖(GAG)包含4-硫酸软骨素、6-硫酸软骨素、硫酸角质素及之类。大多数的蛋白多糖，即80～90％聚集在软骨以形成一个大分子，简称为聚蛋白多糖。
其他基质包含非胶原蛋白、糖蛋白等类，其占有软骨净重的10～15％。这些基质主要扮演稳定大分子结构及协助形成器官组织的角色。
不幸地，部分细胞抗原会在异体同种组织植入至主体时，因遭主体辨识而造成发炎反应或免疫排斥。然而，细胞外基质的组成物一般对于那些同种异体接受者的排斥反应有抵抗作用。因此，包含于心血管系统、血管、皮肤、神经、骨骼肌、肌腱、膀胱、肝脏等的组织中的各种细胞外基质已被积极研究，并应用于组织工程及医疗重建中。将细胞外基质去细胞化的主要目的在于减少对细胞外基质的细胞组成物的排斥反应并通过有效去除细胞、细胞核等方式来增加细胞外基质的机械强度。
有效及常用的去细胞化方法包含物理及化学方法。物理方法包括搅拌、超音波、机械施压、及冷冻/解冻程序。物理方法可破坏细胞膜并让细胞组成物外露。接下来，利用冲洗程序来将细胞从细胞外基质移除。然而，一般物理方法被视为无法完全去细胞化。因此，物理方法应搭配化学方法的使用。使用胰蛋白酵素的酵素消化法或使用离子溶液的化学处置法皆可破坏细胞膜并打断细胞内部及外部之间的连结。在去细胞化的过程中，细胞外基质会被破坏但却仍保有其基础骨干。去细胞化过程可以去除微孔材料及来自组织的残骸并将所有的细胞充份暴露于促溶液中。去细胞化的目的主要在于保有组织完整的物理特性或生物特性的同时并降低对其的破坏。
关于上述目的，传统技术已揭露通过使用来自天然组织的细胞外基质来制造多孔支架的方法。更明确的说，美国专利公开第2007/0248638A1号便揭露：例如软骨细胞的天然组织细胞可通过同时以氧化剂与去污剂处置并冷冻干燥来去细胞化以形成多孔支架。美国专利公开第2008/0124374A1号揭露一种将来自脊椎动物骨髓细胞中的细胞外基质去细胞化的方法及其治疗装置。
上述已知技术皆通过将自然软骨细胞或骨髓细胞所组成的组织去细胞化来取得异种细胞外基质以形成多孔立体支架。由于已知技术是通过将天然组织去细胞化以制造多孔立体支架，故可减少可能的免疫排斥反应，然而，这有个缺点：由于其使用本身的天然组织，故其支架的尺寸、孔隙率、形状及结构易受限。因此，已知技术很难应用于商业目的及医疗使用。
因此，最好能够随着受损部位、受损范围及病人特性来改变治疗所使用多孔立体支架的尺寸、形状或结构。然而，由于已知技术采用单纯将天然软骨组织去细胞化的方式，阻碍了治疗的多元性，故无法满足上述需求。
此外，美国专利第7,201,917号揭露一种通过将细胞外基质置于液体中以形成泥浆再将泥浆冷冻干燥来制成多孔支架的方法，但这只能取得来自天然组织细胞外基质的液态泥浆。此外，美国专利第4,656,137号揭露一种制造动物软骨粉末的方法，包括搜集来自动物的软骨；通过酵素剂将附着于软骨上的各种蛋白质及脂质组织移除；将其粉碎成约4～8mm大小；透过低压冻干法将水份移除；及将其制成40～70μm大小的粉末。
然而，上述方法有一个问题：由于所使用的细胞外基质是通过将天然组织本身去细胞化来取得，故其支架的尺寸、孔隙率、形状及结构易受限。因此，很难将上述方法应用于商业目的及医疗使用。美国专利第4,656,137号仅揭露一种以软骨粉末处置伤口的方法，却完全没有揭示如何以软骨粉末制成具有各种尺寸、形状及结构的立体支架。
因此，目前亟需延发一种可以再生透明软骨组织且又不受限于其物理特性、孔隙率、形状、结构及尺寸的立体支架的技术。
为了解决上述传统方法的问题，我们研发出一种在分离动物组织，举例来说，动物软骨之后，通过“软骨制成粉末过程”及“颗粒过滤法”来制备可不受限于物理特性、孔隙率、形状、结构及尺寸的多孔立体支架。
颗粒过滤法一般在组织工程领域中是用来将例如PLA、PGA、PLGA等的合成聚合物制成立体支架。在颗粒过滤法中，具有所欲孔洞尺寸的立体支架可由下列步骤制造：添加具有所欲孔洞尺寸的造孔剂(盐、有机糖、石蜡、冰颗粒及之类)到一特定容量的聚合物溶液中；将其混合；将其塑造成所欲形状；将其浇铸或冻干以完全移除有机溶剂；及将造孔剂以水、适当溶剂等溶解，或通过干燥的方式移除造孔剂。
本案发明人结合上述颗粒过滤法的基本理论，并在不将动物衍生组织粉末溶解于有机溶剂或任何其他溶剂下，将该动物衍生组织粉末与造孔剂混合在一起，并使用交联剂(例如：EDC)将粉末聚集在一起。
此外，以例如软骨粉末的动物组织粉末所组成的多孔立体支架，经证实，假若制造该多孔立体支架时，在将动物组织制成粉末之前或之后，或在制成粉末的同时，将其去细胞化，则该多孔立体支架将具有良好的生物兼容性及临床实用性，且其在植入时，也不会造成任何发炎现象。
发明内容
本发明的目的在于提供一种多孔立体支架及其制造方法，其中用以制成该多孔立体支架的粉末是来自动物组织，举例来说，利用颗粒过滤法将动物软骨制成根据其目的与治疗用途的具有多种尺寸、孔隙率、形状及结构的多孔立体支架。
更明确的说，本发明的目的在于提供一种制造多孔立体支架的方法及通过该方法制成的多孔立体支架，其在分离动物组织，举例来说，动物软骨之后，通过“软骨制成粉末过程”及“颗粒过滤法”，可在不受限于透明软骨组织的物理特性、孔隙率、形状、结构及尺寸下，增进其再生的效果。
再者，本发明的目的在于提供一种制造多孔立体支架的方法及通过该方法制成的多孔立体支架，其中假若在分离例如动物软骨的动物组织后，通过物理及/或化学的方式，在将动物组织制成粉末之前或之后，或在制成粉末的同时，将其去细胞化，以制造该多孔立体支架，则该多孔立体支架将具有良好的生物兼容性及临床实用性，且其在植入时，也不会造成任何发炎现象。
此外，本发明的目的在于提供一种细胞治疗剂，其包括由软骨细胞、骨骼细胞、干细胞等类的细胞所灌输的立体支架。
为了达成上述目的，本发明提供一种利用动物组织粉末制造多孔立体支架的方法，其包括下列步骤：将动物衍生组织制成粉末；在将该动物衍生组织制成粉末之前或之后，或在制成粉末的同时，将其去细胞化；及通过颗粒过滤法将该去细胞化的动物衍生组织粉末制成多孔立体支架。
依据本发明一实施例，该颗粒过滤法包含在不溶解于有机溶剂或任何其他溶剂下将该去细胞化的动物衍生组织粉末与造孔剂混合在一起，并使用交联剂将该去细胞化的动物衍生组织粉末聚集在一起。
依据本发明一实施例，该颗粒过滤法使用的造孔剂选自例如氯化钠的盐颗粒、有机糖颗粒、葡萄聚糖颗粒、蔗糖颗粒、冰颗粒或石蜡颗粒其中至少一种或几种的混合物。
依据本发明一实施例，通过将该去细胞化的动物衍生组织粉末与该颗粒过滤法所使用的造孔剂颗粒混合在一起，再将其倒入铸模中，根据其用途及治疗部位的不同，以压力将该去细胞动物衍生组织粉末铸造成具有多种形状与尺寸的多孔立体支架。
依据本发明一实施例，该方法进一步包括通过选自由UV、EDC、NHS、脱水加热法、及戊二醛至少一种方式来交联该多孔立体支架。
依据本发明一较佳实施例，该方法进一步包括将至少一个生长因子加入到该动物衍生组织粉末中并将其冷冻干燥。
依据本发明一更较佳实施例，该方法进一步包括将软骨细胞灌输到通过该颗粒过滤法所形成的多孔立体支架之上或之中，再将多孔立体支架之上或之中的软骨细胞再培养，取得组织工程软骨组织。
依据本发明一较佳实施例，该动物衍生组织可衍生自例如猪、牛、羊、马、狗或猫的脊椎动物的软骨。更明确的说，该动物衍生组织粉末可为猪软骨粉末。
依据本发明一较佳实施例，将该动物衍生组织制成粉末的步骤包括将软骨从动物衍生软骨组织分离出来，通过粉碎机将该软骨粉碎，并通过冷冻磨粉机将该粉碎的软骨磨成粉末。
依据本发明一较佳实施例，该动物衍生组织可衍生自例如猪、牛、羊、马、狗或猫的脊椎动物的羊膜、皮肤、小肠黏膜下组织(SIS)、筋膜或脊髓膜。
依据本发明一较佳实施例，该去细胞化是通过物理去细胞化、化学去细胞化、或该物理去细胞化及该化学去细胞化的组合来达成。
该物理去细胞化可利用冷冻-解冻、超音波或物理震动的方式来进行，而该化学去细胞化是通过将该动物衍生组织粉末以低渗溶液、负离子去污剂、非离子去污剂、阳离子去污剂、脱氧核糖核酸酶、核糖核酸酶或胰蛋白酵素处置来达成。此外，该去细胞化在大约0到50C的温度下进行。
在该化学去细胞化过程中，使用的低渗溶液为Tris HCl(pH 8.0)溶液，使用的负离子去污剂为十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)、脱氧胆酸钠(sodiumdeoxycholate)或Triton X-200，使用的非离子去污剂为Triton X-100，而使用的阳离子去污剂为CHAPS、磺基甜菜碱-10(Sulfobetaine-10，SB-10)、磺基甜菜碱-16(Sulfobetaine-16，SB-16)或磷酸三正丁酯(tri-n-butyl磷酸盐)。
一种依据本发明的方法所制造的多孔立体支架可用来再生软骨。此外，本发明的多孔立体支架亦可用来构成间盘组织、骨骼组织及关节软骨组织。
本发明较佳多孔立体支架可进一步包括至少一个生长因子。
本发明更较佳多孔立体支架可通过将软骨细胞灌输到多孔立体支架之上或之中，再将该多孔立体支架之上或之中的软骨细胞再培养，并形成组织工程软骨组织来取得。
本发明通过例如动物软骨粉末的动物组织所制造的多孔立体支架，因其具有多种尺寸、孔隙率、形状及结构以因应其目的与治疗用途，其可有效应用于临床治疗。本发明的多孔立体支架在不受限于其物理特性、孔隙率、形状、结构及尺寸下，可有效增进透明软骨组织的再生。
此外，既然本发明在分离例如动物软骨的动物组织后，通过物理及/或化学的方式，在将动物组织制成粉末之前或之后，或在制成粉末的同时，将之去细胞化，使得其所制造出来的多孔立体支架具有良好的生物兼容性及临床实用性，且其在植入时，也不会造成任何发炎现象。再者，相较于由胶原蛋白或其他合成聚合物所组成的支架，本发明的多孔立体支架对于软骨再生的功效更为显著。
除此之外，通过例如动物软骨粉末的动物组织所制造的多孔立体支架，由于其立体结构，其可提供一个适合细胞移动、细胞生长及细胞分化的环境。另外，该多孔立体支架可包括生长因子及适用于软骨再生的适当要素。由于本发明的多孔立体支架的高生物兼容性、生物可降解性及立体结构，使得其可有效应用于制备治疗软骨损耗的组织工程支架中。
附图说明
图1(a)为由猪软骨分离出来的猪软骨切片的照片，图1(b)为经冷冻粉碎后再去细胞化的猪软骨粉末的照片，及图1(c)为去细胞化猪软骨粉末的SEM照片；
图2为天然猪软骨(去细胞化之前的PC)、去细胞化猪软骨切片(去细胞化PC)、及去细胞化猪软骨粉末(去细胞化PCP)的DNA残余含量表；
图3为依据本发明利用软骨粉末制造多孔立体支架的流程示意图；
图4为依据本发明一实施例，通过软骨粉末所制造的多孔立体支架的照片；
图5为依据本发明一实施例，通过软骨粉末所制造的多孔立体支架的SEM照片；图5(a)为其表面的20倍放大照片，图5(b)为其表面的50倍放大照片，图5(c)为其侧面的20倍放大照片，及图5(d)为其侧面的50倍放大照片；
图6为依据本发明一实施例，通过软骨粉末所制造的多孔立体支架的孔隙率分布曲线图；
图7为依据本发明一实施例，通过软骨粉末所制造的多孔立体支架的亲水性实验资料的照片；
图8为胶原蛋白海棉及本发明猪软骨粉末支架的代表照片，其为评估两者细胞在体外培养条件下的功效之前所拍摄；图8(a)为胶原蛋白海棉的正视图的照片，图8(b)为胶原蛋白海棉的侧视图的照片，图8(c)为本发明猪软骨粉末支架的正视图的照片，及图8(d)为本发明猪软骨粉末支架的侧视图的照片；
图9为对照组的胶原蛋白海棉及本发明猪软骨粉末支架在灌输细胞到其之上或之中后的细胞种植率的分析结果；
图10为对照组的胶原蛋白海棉及本发明猪软骨粉末支架，在体外培养1星期之后的生长的照片；图10(a)为胶原蛋白海棉的正视图，图10(b)为胶原蛋白海棉的侧视图，图10(c)为本发明猪软骨粉末支架的正视图，及图10(d)为本发明猪软骨粉末支架的侧视图；
图11为对照组的胶原蛋白海棉及本发明猪软骨粉末支架，在体外培养1星期之后，以藏红-O(Safranin-O)染色的照片；图11(a)为胶原蛋白海棉的20倍放大照片，图11(b)为胶原蛋白海棉的100倍放大照片，图11(c)为本发明猪软骨粉末支架的20倍放大照片，及图11(d)为本发明猪软骨粉末支架的100倍放大照片；
图12为对照组的胶原蛋白海棉及本发明猪软骨粉末支架，在体外培养2星期之后的生长的照片；图12(a)为胶原蛋白海棉的正视图，图12(b)为胶原蛋白海棉的侧视图，图12(c)为本发明猪软骨粉末支架的正视图，及图12(d)为本发明猪软骨粉末支架的侧视图；
图13为对照组的胶原蛋白海棉及本发明猪软骨粉末支架，在体外培养2星期之后，以藏红-O(Safranin-O)染色的照片；图13(a)为胶原蛋白海棉的20倍放大照片，图13(b)为胶原蛋白海棉的100倍放大照片，图13(c)为本发明猪软骨粉末支架的20倍放大照片，及图13(d)为本发明猪软骨粉末支架的100倍放大照片。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明进行具体的说明。值得注意的是，本发明下列实施例中的描述仅用于描述与图式之用，并不限制发明的保护范围。
实施例
参考实施例1：猪软骨的分离
为了分离猪软骨，猪软骨是从一家符合EN 12442标准“应用于制造医疗装置的动物组织及其衍生物，第1部份；分析及风险管理，第2部份；来源、收集及处理的控制”的公司所购入并使用。
从猪软骨将软骨组织分离出来并切成小片(约20x30mm)，然后，以盐水冲洗三次，10分钟。将软骨切片浸泡在含有抗生素抗霉菌剂的PBS溶液中，再将其储存于-80C的超低温冰箱中(参见图1(a))。
实施例1：粉碎猪软骨
通过本领域技术人员所熟知并已充分使用于商业上的粉碎机(Hood MixerHMF-505，Hanil股份有限公司，韩国)，将洗好的软骨切片粉碎，以将其尺寸缩小到约2x2mm。将粉碎的软骨切片冷冻干燥，再将冷冻干燥的软骨切片通过冷冻磨粉机(JAI，JFC-300，日本)磨成尺寸约10μm的粉末。
1-1.猪软骨粉末的形态分析
以电子扫描显微镜将猪软骨粉末进行形态分析。将实施例1所制备的猪软骨粉末以2.5％的戊二醛处置约1小时，再以磷酸盐缓冲溶液冲洗。将样本脱水并干燥，再以显微镜(JEOL，JSM-6380，日本；20KV)观察，以测量粉末的尺寸及形状。经观察，该粉末的尺寸约为10μm(图1(c))。
实施例2：猪软骨粉末的去细胞化及特性
2-1.猪软骨粉末的去细胞化
为了移除软骨细胞及遗传成份，以取得纯的细胞外基质，将以如下方式进行去细胞化。
将实施例1所制备的猪软骨粉末加入到1公升0.1％的十二烷基硫酸钠(sodiumdodecyl sulfate，SDS，Bio-Rad，美国)(每10g的猪软骨粉末)，并以100rpm搅拌24小时。在进行SDS处理之后，将产物用三级蒸馏水以100rpm的转速下冲洗5次，30分钟。
为了让软骨粉末沉淀以便替换冲洗溶液，将软骨粉末以超速离心机(US-21SMT，Vision，韩国)10,000rpm的转速旋转1小时。
将200ml的200U/ml脱氧核糖核酸酶(Sigma，美国)加入到软骨粉末并在37C下以100rpm的转速搅拌24小时。将产物用三级蒸馏水以100rpm的转速下冲洗5次，30分钟。以如上相同的SDS冲洗方式将该冲洗溶液作替换。该去细胞化软骨粉末显示于图1(b)。
虽然在本发明此一实施例中，该去细胞化步骤是在制备软骨粉末之后进行，但本领域技术人员应了解本发明不限于此流程，该去细胞化步骤亦可在软骨制成粉末之前进行。
2-2.去细胞化猪软骨粉末的DNA含量分析
将去细胞化之前未受处置的软骨组织(在此之后，简称为“PC”)、去细胞化软骨切片(PC)及去细胞之后化的软骨粉末(在此之后，简称为“PCP”)制成样本，并以Qubic DNA定量装置(Qubic，Bio-Rad，美国)定量测量其DNA含量。DNA含量的定量分析结果如下显示于表1及图2。更明确的说，该去细胞化流程依据实施例2-1所述的流程进行。
表1
DNA残余数量的测量
实施例3：利用去细胞化猪软骨粉末制造立体支架并说明其特征
3-1.制造多孔立体支架
以实施例2-1相同流程所制备的去细胞化软骨粉末，以1∶9的比例与氯化钠(具有250到350μm的晶体尺寸)均匀混合。再以10％的比例将100mM EDC(N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide hydrochloride)(Sigma，美国)及三级蒸馏水所配成的溶液加入到该混合溶液中。
该EDC溶液与该软骨粉末及氯化钠的混合溶液均匀混合。再将前述混合溶液倒入到硬质合金的自制铸模中，并以1000psi的压力铸造成型，以制成一盘形产物。该铸模包含固定组件及移动组件，并在固定组件及/或移动组件之内形成一立体支架。虽然在此实施例中，以制造盘形立体支架为例，但其亦可制造其他具有多种形状与尺寸的立体支架，以因应其目的与治疗用途。
虽然在此实施例中，以氯化钠作为制造多孔立体支架的造孔剂，但本领域技术人员应了解本发明不限于此，亦可使用其他例如糖颗粒或冰颗粒做替代物。
接下来，将该盘形产物于室温下干燥，然后以100mM EDC溶液(溶解于99.9％的乙醇)交联1小时。再将100mM NHS(N-hydroxysuccinimide，Fluka，日本)加入到该反应物并让其作用4小时。其交联作用是用来增进软骨粉末所制成的多孔立体支架的物理特性并延长其降解期。
在交联作用完成后，以三级蒸馏水浸泡该盘形产物，并将该三级蒸馏水至少替换5次，以将该盘形产物中的盐完全洗涤掉。为了移除交联后未作用的部份，以NH2PO4冲洗该盘形产物3次。最后，再以三级蒸馏水重新冲洗3次并冷冻干燥。
图3显示利用软骨粉末制造多孔立体支架的流程，而图4显示通过该流程所制成的最终产物。
3-2.猪软骨粉末支架的孔洞结构分析
以电子扫描显微镜分析猪软骨粉末支架的孔洞结构。由实施例3-1所制备的猪软骨粉末支架是以2.5％的戊二醛处置约1小时，再以磷酸盐缓冲溶液冲洗。将样本以乙醇脱水干燥，再以显微镜(JEOL，JSM-6380，日本；20KV)分析，以观察猪软骨粉末支架的孔洞尺寸及形状。
经观察，支架的孔洞尺寸约为200μm且这些孔洞彼此相互连接在一起。此外，这些孔洞皆均匀分布且支架的表面孔洞为向外开启(参见图5)。
3-3.猪软骨粉末支架的孔隙率分析
以水银测孔仪分析猪软骨粉末支架的孔隙率。该分析样本的重量为0.0193克。其分析条件如下：
压力：50μmHg；
时间：5分钟；及
水银-填充压力0.44psia。
因此，猪软骨粉末支架所测得的孔隙率为82.39％(参见图6)。
实施例4：猪软骨粉末支架的亲水性评估
为了检测猪软骨粉末支架的亲水性，利用染剂以裸眼观察其吸水能力。将猪软骨粉末支架浸入到2.5％的锥蓝细胞染色溶液。在浸入10秒后，拍摄一张照片，从照片可观察到该猪软骨粉末支架会立即吸收染剂。因此，可确认本发明的猪软骨粉末支架具有显著的亲水性(参见图7)。
实施例5：猪软骨粉末支架的功效评估
5-1.在猪软骨粉末支架之上或之中培养软骨细胞
软骨细胞是从2周大的纽西兰白兔的软骨所分离出来。其软骨组织是从膝关节的关节软骨中单独分离出来，再切成约1～2mm大小的切片，并在37C的细胞培养器中以0.1％的胶原酶(type II，Washington，美国)处置12小时以分离软骨细胞。在以0.1％胶原酶处置12小时后，以细胞过滤机筛选出软骨细胞并以离心机(1,700rpm，10分钟)纯粹分离出软骨细胞。
从兔子分离出来的软骨细胞以5x106细胞的浓度播种到由实施例1～3的流程所制备的多孔立体软骨粉末支架(半径5mm，高2mm)之上或之中。
然后，每周3次更新细胞培养基[DMEM+1％的抗生素抗霉菌+ITS包括“1.0mg/ml的胰岛素、0.55mg/ml的人类运铁蛋白及0.5mg/ml的亚硒酸钠”+50μg/ml的抗坏血酸+1.25mg/ml的牛血清白蛋白+100nM的合成葡萄糖性类固醇+40μg/ml的脯氨酸]。
5-2.猪软骨粉末支架的细胞种植率评估
通过静置播种的方式将5x106个兔子软骨细胞灌输到猪软骨粉末支架之上或之中。灌输的细胞在细胞培养器中以37C培养4小时以允许该细胞附着于支架之上或之中，然后将培养基倒入到支架中。此时，计算没有附着于支架之上或之中并从中掉落的自由细胞数量。24小时后，将该支架移到新的盘子上，并再次计算掉落到盘子上的自由细胞数量。
结果，经观察，胶原蛋白海棉及猪软骨粉末支架在4小时之后所测得的细胞种植率分别为90.5％及80％。此外，胶原蛋白海棉及猪软骨粉末支架在24小时之后所测得的细胞种植率分别为90％及79％。
即使胶原蛋白海棉的细胞种植率显示比猪软骨粉末支架来得高，但可确认软骨粉末支架亦显示约80％的高细胞种植率(参见图9)。
5-3.随着时间软骨组织形成的比较
将第I型去端肽胶原蛋白(MATRIXENTM，Bioland，韩国)溶解成1％的浓度，再以冷冻干燥的方式制成海棉。所制成的海绵被使用来作为对照组，以与本发明的支架作比较。
如上所述，将用以作为对照组的胶原蛋白海棉及本发明的软骨粉末支架在兔子软骨细胞播种之后，培养1星期及2星期。然后，在一段时间之后，重新取得该些样本并以10％的福尔马林处置24小时。再将该些样本埋入石蜡中，切成片段并以藏红-O及H&E染色法染色，以比较胶原蛋白海棉及软骨粉末支架形成软骨组织的能力。
结果，经观察，在将兔子软骨细胞培养到胶原蛋白海棉及软骨粉末支架之后的1星期，形成白色半透明组织(参见图10)。当以藏红-O染色，该软骨细胞分布于胶原蛋白海棉及软骨粉末支架两者之上。然而，本发明的软骨粉末支架相较于胶原蛋白海棉显示具有较高的细胞分布。此外，由于糖胺聚糖的合成及沿着支架壁骨质溶解进展，本发明的软骨粉末支架优于胶原蛋白海棉(参见图10)。
如图11所示，两个群组皆在培养兔子软骨细胞之后的2星期呈现半透明。通过藏红-O染色法观察得知两个群组的软骨再生能力在2星期后相较于1星期后来得好。尤其，本发明的多孔立体软骨粉末支架确实几乎可以完全再生软骨(参见图12)。
因此，由于本发明的多孔立体支架的立体结构，其可以在不受限于其物理特性、孔隙率、形状、结构及尺寸下重生软骨，并提供一个适合细胞移动、细胞生长及细胞分化的环境。此外，由于本发明的多孔立体支架的高生物兼容性、生物可降解性及立体结构，使得其可有效应用于制备治疗软骨损耗的组织工程支架中。
虽然本发明已以实施例揭露如上，但其并非用以限定本发明。反之，所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，可作些许的更动与润饰，因此本发明的保护范围应当以权利要求书所界定的范围为准。
Claims (18)
1.一种利用动物组织粉末制造多孔立体支架的方法，包括：
(a)将天然材料的动物衍生组织制成粉末；
(b)在将该动物衍生组织制成粉末之前或之后，或在制成粉末的同时，将其去细胞化；
(c)在不溶解于额外有机溶剂或任何其他溶剂下，将该去细胞化的动物衍生组织粉末与盐颗粒的造孔剂混合在一起，并将交联剂加入到该混合中，以将该去细胞化的动物衍生组织粉末交联并聚集在一起；
(d)在步骤(c)后，通过颗粒过滤法将该交联并去细胞化的动物衍生组织粉末制成多孔立体支架。
2.如权利要求1所述的方法，其中通过将该去细胞化的动物衍生组织粉末与该颗粒过滤法所使用的造孔剂盐颗粒混合在一起，再将其倒入铸模中，根据其用途及治疗部位的不同，以压力将该去细胞化的动物衍生组织粉末铸造成具有多种形状与尺寸的多孔立体支架。
3.如权利要求1或2所述的方法，进一步包括通过选自UV、EDC、NHS、脱水加热法或戊二醛其中至少一种方式来交联该多孔立体支架。
4.如权利要求1或2所述的方法，进一步包括将至少一个生长因子加入到该动物衍生组织粉末中并将其冷冻干燥。
5.如权利要求1或2所述的方法，进一步包括将软骨细胞灌输到通过该颗粒过滤法所形成的多孔立体支架之上或之中，再将多孔立体支架之上或之中的软骨细胞再培养，取得组织工程软骨组织。
6.如权利要求1或2所述的方法，其中该动物衍生组织为衍生自猪、牛、羊、马、狗或猫的软骨。
7.如权利要求4所述的方法，其中该动物衍生组织粉末为猪软骨粉末。
8.如权利要求1或2所述的方法，其中将该动物衍生组织制成粉末的步骤包括将软骨从动物衍生软骨组织中分离出来，通过粉碎机将该软骨粉碎，并通过冷冻磨粉机将该粉碎的软骨磨成粉末。
9.如权利要求1或2所述的方法，其中该动物衍生组织为衍生自猪、牛、羊、马、狗或猫的羊膜、皮肤、小肠黏膜下组织(SIS)、筋膜、或脊髓膜。
10.如权利要求1或2所述的方法，其中该去细胞化是通过物理去细胞化、化学去细胞化或该物理去细胞化及该化学去细胞化的组合来达成。
11.如权利要求10所述的方法，其中该物理去细胞化是利用冷冻-解冻、超音波或物理震动的方式来进行，而该化学去细胞化是通过将该动物衍生组织粉末以低渗溶液、负离子去污剂、非离子去污剂、阳离子去污剂、脱氧核糖核酸酶、核糖核酸酶或胰蛋白酵素处置来达成。
12.如权利要求1或2所述的方法，其中该去细胞化在0到50℃的温度下进行。
13.如权利要求11所述的方法，其中在该化学去细胞化过程中，使用的低渗溶液为pH值为8.0的Tris HCl溶液，使用的负离子去污剂为十二烷基硫酸钠(sodiumdodecyl sulfate,SDS)、脱氧胆酸钠(sodium deoxycholate)或Triton X-200，使用的非离子去污剂为Triton X-100，而使用的阳离子去污剂为CHAPS、磺基甜菜碱-10(Sulfobetaine-10,SB-10)、磺基甜菜碱-16(Sulfobetaine-16,SB-16)或磷酸三正丁酯(tri-n-butyl磷酸盐)。
14.一种利用来自动物组织的粉末制成的立体支架，其是使用权利要求1或2所述的方法所制造。
15.如权利要求14所述的立体支架，其中该立体支架用于再生软骨。
16.如权利要求14所述的立体支架，其中该立体支架用于构成关节软骨组织、间盘组织或骨骼组织。
17.如权利要求14所述的立体支架，进一步包括至少一个生长因子。
18.如权利要求14所述的立体支架，其中通过将软骨细胞灌输到多孔立体支架之上或之中以将组织工程软骨组织形成于立体支架之上或之中，再将该多孔立体支架之上或之中的软骨细胞再培养。
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