KR101472045B1 - 코어-쉘 섬유상 세포전달체 및 이를 포함하는 골조직 또는 연골조직 재생용 조성물 - Google Patents
코어-쉘 섬유상 세포전달체 및 이를 포함하는 골조직 또는 연골조직 재생용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 세포 및 콜라겐을 포함하는 코어; 알지네이트를 포함하는 쉘을 포함하는 코어-쉘 섬유상 세포전달체, 상기 코어-쉘 섬유상 세포전달체의 제조방법으로서, 중심을 공유하는 서로 다른 직경의 바늘을 통해 내부 바늘로부터는 세포와 콜라겐을 포함하는 코어물질을, 외부 바늘로부터는 알지네이트를 포함하는 쉘물질을 염화칼슘을 포함하는 수조에 일정한 속도로 주입하는 단계를 포함하는 제조방법 및 상기 코어-쉘 섬유상 세포전달체를 포함하는 골 또는 연골 재생용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 코어와 쉘이 명확히 구분된 코어-쉘 섬유상 세포전달체는 쉘의 알지네이트 함량을 최적화하여 코어에 위치한 세포에 산소 및 영양분을 원활히 공급할 수 있고, 이때 세포는 산소와 영양분의 공급이 원활한 쉘과의 경계부분에서 네트워크를 형성할 수 있다. 상기 세포전달체는 하이드로겔 형태로 성형이 용이하여 작거나 복잡한 형태의 조직 손상부분에도 직접 채워넣어 이식할 수 있다.
본 발명의 코어와 쉘이 명확히 구분된 코어-쉘 섬유상 세포전달체는 쉘의 알지네이트 함량을 최적화하여 코어에 위치한 세포에 산소 및 영양분을 원활히 공급할 수 있고, 이때 세포는 산소와 영양분의 공급이 원활한 쉘과의 경계부분에서 네트워크를 형성할 수 있다. 상기 세포전달체는 하이드로겔 형태로 성형이 용이하여 작거나 복잡한 형태의 조직 손상부분에도 직접 채워넣어 이식할 수 있다.
Description
본 발명은 세포 및 콜라겐을 포함하는 코어; 및 알지네이트를 포함하는 쉘을 포함하는 코어-쉘 섬유상 세포전달체, 중심을 공유하는 서로 다른 직경의 바늘을 통해 내부 바늘로부터는 세포와 콜라겐을 포함하는 코어물질을, 외부 바늘로부터는 알지네이트를 포함하는 쉘물질을 가교제를 포함하는 수조에 일정한 속도로 주입하는 단계를 포함하는, 상기 코어-쉘 섬유상 세포전달체의 제조방법 및 상기 코어-쉘 섬유상 세포전달체를 포함하는 골 또는 연골 재생용 조성물을 제공하는 것이다.
골조직은 척추손상, 골절, 감염, 종양 등 여러 질환에 의해 손상을 입을 수 있다. 단순 골절 등의 경우에는 자연치료가 가능하나, 자연치료 한계를 넘어서는 골손실을 입을 경우 이를 치료 및/또는 재생시키기 위한 치료제가 필요하다. 아울러 치주질환이나 외상으로 인하여 발치를 하는 경우 치조골의 흡수가 일어나게 되어 보철치료와 임플란트 치료에 문제를 야기하게 된다. 특히 성공적인 임플란트를 위해서는 일정한 길이와 직경의 매식체가 식립되어야 하는데 치조골이 부족한 경우에는 임플란트 식립이 제한될 수 있다. 이와 같은 부위에는 치조골의 높이와 폭을 증가시키기 위한 골이식술이 필요하며, 이를 위해 여러 재생적 치료법이 발달되었다. 이와 같은 골결손에 가장 널리 사용되는 것은 골이식이며 골 재생을 위한 이식재료로는 자가골, 동종골, 이종골 또는 합성골이 사용되고 있다. 자가골은 직접 골형성을 할 수 있는 골세포를 포함하고 있으며 거부반응이 없는 최고의 골이식재로 높은 성공률을 보장하지만, 골채취를 위한 채취부위에 대한 추가적인 수술이 필요하고 이에 따른 수술 후 불편감이 수반되며 채취량이 한정적이어서 필요한 만큼 채취하는 것이 용이하지 못하다. 따라서, 임상에 있어서, 자가골을 대체하기 위한 골이식재의 개발에 대한 요구가 증가하고 있다. 동종골은 자가골 이식과 비교하여 다량의 골채취가 가능하고 한번의 수술로 이식가능한 장점이 있고 골 형성가능성이 높은 것으로 보고되어 있어 자가골의 대체재로 널리 사용되고 있다. 그러나, 조작이 쉽지 않고 일관된 골재생 결과를 보여주지 못하고 골재생에 있어서 실패를 초래하거나, 면역거부반응 등의 부작용이 발생할 수 있으며, 질환보유자로부터 채취한 골을 사용한 경우 감염으로 인한 질병전파의 가능성이 있어 논란이 되고 있다. 이종골은 인간 이외의 동물로부터 채취한 골조직을 처리하여 이식재로 사용하는 것으로 우골이 널리 사용되고 있다. 이종골이 지니고 있는 항원성과 감염 가능성을 제거하기 위한 탈단백과정을 거치며, 이러한 탈단백과정을 거친 우골은 치과영역의 골이식술에 널리 사용되고 있다. 이 외에 합성골로 사용할 수 있는 다양한 합성재료들이 개발되고 있다. 합성골로 사용되기 위해서는 독성이 없고 생체 적합성을 가지며 다공성 이어서 재생되는 골세포의 침투가 가능하고 안정적으로 부착되어 증식할 수 있어야 하며 시간에 따라 체내에서 분해될 수 있는 재료여야 한다.
연골조직은 혈관, 신경, 림프관이 없기 때문에 손상을 받은 후 세포를 보충할 수 있는 길이 매우 제한적이다. 연골 결손부위로 공급될 수 있는 세포에는 인근 연골로부터 이동(migration)하는 연골세포, 골수와 활막 및 지방조직에 존재하는 줄기세포 등이 있다. 이중 주위 연골로부터 이동한 연골세포는 이동 속도와 거리가 매우 제한적이기 때문에 연골재생에 충분하지 않다. 한편, 골수의 줄기세포는 전층연골결손의 경우 연골의 재생에 참여할 수 있는 반면에, 부분층 결손인 경우에는 연골의 재생에 관여하기 어렵다. 한편, 활막과 지방조직에 있는 줄기세포의 존재가 보고되고 있으나, 아직 이들이 연골의 자발적 재생에 참여하는지에 대해서는 충분한 근거가 제시되지 않고 있다. 이러한 특징 때문에 물리적 손상을 받은 연골은 다시 정상적인 기능과 구조를 가진 연골조직으로 재생되는데 있어 많은 한계점을 지니고 있다.
또한 일단 손상된 연골의 경계부위는 기계적 압력에 취약하여 쉽게 부서지고 마모되어 결손부위는 더 커지게 된다. 아울러 연골의 부스러기(debris)는 염증을 일으키는 원인을 제공함으로써 더욱 연골을 손상시키고, 그 결과 골관절염이 빠르게 진행될 수 있다. 따라서, 손상된 연골을 조기에 재생시켜주는 것이 매우 중요한데, 현재 연골 결손의 재생을 위한 방법이 다양하게 제시되고 있으나, 아직 정상적 초자 연골(hyaline cartilage)의 재생에는 미치지 못하고 있다.
1994년 M. Brittberg에 의해 자가 연골세포 이식술이 소개된 이래, 세포를 이용한 연골의 재생치료법이 급속히 발전하고 있다. 세포이식에 의한 연골의 재생치료 방법은 결손된 부위에 세포를 공급하거나 인공적으로 배양된 관절연골을 이식하는 방법 등이 있다.
한편 줄기세포의 분리 및 배양기술이 발달함에 따라, 상기 손상된 골조직 및 연골조직의 재생을 위하여 세포치료제로서 다양한 조직으로 분화할 수 있는 줄기세포를 환부에 이식하는 방법이 사용되기도 한다. 이때, 효율적으로 손상부위에 세포를 전달하고 원하는 조직으로 빠르게 분화시켜 재생을 촉진할 수 있는 세포전달체가 요구되는 실정이다.
이에 본 발명자들은 생체적합성 물질인 콜라겐과 알지네이트를 각각 포함하는 코어-쉘 구조의 콜라겐 코어부분에 줄기세포를 봉입시켜 섬유상으로 성형하면 산소 및 영양분 공급이 원활하여 줄기세포의 생존 및 분화에 유리한 미세환경을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 성형이 용이하여 복잡한 손상부위에도 맞추어 주입할 수 있으므로 효과적으로 세포를 전달하여 조직의 재생을 촉진할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 세포 및 콜라겐을 포함하는 코어; 및 알지네이트를 포함하는 쉘을 포함하는 코어-쉘 섬유상 세포전달체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 중심을 공유하는 서로 다른 직경의 바늘을 통해 내부 바늘로부터는 세포와 콜라겐을 포함하는 코어물질을, 외부 바늘로부터는 알지네이트를 포함하는 쉘물질을 가교제를 포함하는 수조에 일정한 속도로 주입하는 단계를 포함하는, 상기코어-쉘 섬유상 세포전달체의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 코어-쉘 섬유상 세포전달체를 포함하는 골조직 또는 연골조직 재생용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 세포 및 콜라겐을 포함하는 코어; 및 알지네이트를 포함하는 쉘을 포함하는 코어-쉘 섬유상 세포전달체를 제공한다.
기존의 세포전달체는 세포를 내부에 봉입시킨 하이드로겔 또는 고체 구의 형태로 제조하여 액체에 부유시킨 형태로 투여하였다. 따라서 이의 바람직한 투여형태는 주사제였다. 그러나, 이는 환부에 직접 주사하여도 액체 중에 부유된 상태이므로 원하는 위치에 생착시키기 어려운 단점이 있었다. 이에 용액 중에 부유하지 않으면서, 기존의 미세구(microsphere) 형태에 비하여 기계적 강도가 향상되어 형태 유지가 용이하면서도, 골 조직 손상부위에 맞추어 적용시킬 수 있는 세포전달체를 제공하고자, 본 발명에서는 콜라겐 및 세포를 포함하는 코어; 및 알지네이트를 포함하는 쉘을 포함하는 섬유상 형태의 세포전달체를 개발하였다.
본 발명에서 용어, "세포전달체(cell carrier)"는 치료제로서의 세포를 환부에 전달하기 위한 시스템으로 전달하고자 하는 세포를 봉입시킨 고체 또는 반고체의 미세구조물을 의미한다. 상기 미세구조물은 일정량의 세포를 포함할 수 있도록 수십 내지 수백 마이크로미터 수준의 규모로 제조되나, 그 형태는 제한되지 않는다. 상기 고체 또는 반고체는 세포를 지지하기 위하여 도입된 부가물로 세포에 독성이 없는 재질을 선택하는 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 세포전달체는 콜라겐 코어에 세포를 포함하도록 제조하되 상기 세포가 외부와 직접 접촉하지 않도록 알지네이트를 포함하는 쉘을 외부에 추가로 포함하도록 제조한, 코어-쉘 구조의 세포전달체이다.
상기 콜라겐은 전술한 바와 같이 세포를 지지하기 위해 도입된 부가물로서 겔형태의 반고체이며, 세포 독성을 나타내지 않고 체내에서 서서히 분해되는 생분해성 물질이다.
본 발명의 세포전달체에 봉입되는 세포는 배양 환경에 따라 다양한 조직세포로 분화가능한 미분화 줄기세포이거나, 골세포, 연골세포 등의 조직세포일 수 있다. 이때, 상기 골세포 및 연골세포 등은 성체로부터 직접 채취한 것이거나, 줄기세포를 체외에서 분화시킨 세포일 수 있다. 또는, 미분화 줄기세포를 봉입시켜 세포전달체를 제조한 후 체내에 투여하기 전에 분화배지에서 분화시켜 사용할 수도 있다.
본 발명에 따른 세포전달체의 코어는 100 μm 내지 1500 μm의 직경을 갖는 것이 바람직하다. 본 발명의 세포전달체의 코어물질에 혼합하여 봉입된 세포는 산소 및 영양분을 제공받기에 용이한 쉘과의 경계면에 위치하여 서로서로 네트워크를 형성한다. 따라서, 이를 고려할 때, 코어가 상기 범위보다 작게 형성되는 경우, 세포들이 배열할 수 있는 충분한 코어-쉘 경계면적을 제공할 수 없어 다중층으로 배열될 수 있으며, 이 경우 코어의 내부에 배향된 세포는 충분한 산소 및 영양분을 공급받지 못하여 정상적인 생장이 어려워질 수 있다. 또는 분화조건에서는 분화를 위한 한편 코어가 상기 범위보다 크게 형성되는 경우 세포 수에 비해 표면적이 과다하여 세포밀도가 낮아 정상적인 세포 네트워크 형성이 어렵거나 형성되는 조직의 밀도가 너무 낮아질 수 있다.
본 발명에 따른 세포전달체의 쉘은 100 μm 내지 250 μm의 두께를 갖는 것이 바람직하다. 쉘이 상기 범위보다 얇게 형성되는 경우, 기계적 강도가 낮고 빠르게 분해될 수 있다. 한편, 상기 범위보다 두껍게 형성되는 경우에는 코어부분에 위치한 세포로의 영양분의 확산 및 산소전달이 저해되어 정상적인 세포생장을 저해할 수 있다.
본 발명에 따른 세포전달체의 코어는 코어 총 중량에 대해여 콜라겐을 0.5 내지 5% 포함하는 것이 특징이다. 콜라겐 함량이 0.5% 미만인 경우, 기계적 강도가 너무 낮아 물성이 약해질 수 있다. 한편, 콜라겐 함량이 5%를 초과하는 경우, 세포의 성장과 이동에 제약을 줄 수 있다.
본 발명에 따른 세포전달체의 쉘은 쉘 총 중량에 대해여 알지네이트를 2 내지 5 중량% 포함하는 것이 특징이다. 쉘부분의 알지네이트 함량이 2% 미만인 경우 내구성이 낮아 분해속도가 빠르고 기계적 성질이 악화된다. 반면, 5%를 초화하는 함량으로 알지네이트를 포함하는 경우에는 두껍고 조밀한 쉘층을 형성하여 코어부분에 봉입된 세포의 생존 및 증식을 위한 산소 및 영양분 등의 침투를 저해할 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 중심을 공유하는 서로 다른 직경의 바늘을 통해 내부 바늘로부터는 세포와 콜라겐을 포함하는 코어물질을, 외부 바늘로부터는 알지네이트를 포함하는 쉘물질을 가교제를 포함하는 수조에 일정한 속도로 주입하는 단계를 포함하는, 상기 코어-쉘 섬유상 세포전달체의 제조방법을 제공한다.
상기 코어-쉘 섬유상 세포전달체, 코어, 쉘 및 세포에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명에 따른 세포전달체는 콜라겐과 세포를 포함하는 코어부분과 알지네이트를 포함하는 쉘의 명확히 구분된 영역으로 구성되는 것이 특징이다. 이와 같은 구조적 특징을 갖는 세포전달체를 제조하기 위하여 특별히 고안된 중심을 공유하는 서로 다른 직경의 바늘을 통해 내부 바늘로부터는 코어물질을 외부 바늘로부터는 쉘물질을 방출하도록 하되 이를 가교제 용액을 포함하는 수조에 직접 잠기도록 하여 쉘의 알지네이트가 상기 가교제 용액과 접촉하면서 알지네이트의 낮은 원자가의 이온이 보다 높은 원자가의 이온과 교환하여 교차결합함으로써 쉘 외부에 경화된 네트워크를 성장시킨다. 상기 알지네이트 외부의 빠른 교차결합에 의한 경화는 세포가 로딩된 콜라겐 코어를 물리적 완전성(physical integrity)의 손실 없이 유지할 수 있다.
본 발명에 따른 세포전달체 제조방법에서 코어 및 쉘물질의 주입 속도는 20 내지 80 ml/h인 것이 특징이다. 주입 속도가 20 ml/h 미만인 경우, 느린 속도로 인한 공정의 지연으로 제자리(in situ) 섬유상 세포전달체 제조과정 동안 세포사멸의 위험성이 증가할 수 있다. 한편, 주입 속도가 80 ml/h를 초과하는 경우, 부적절하게 두꺼운 쉘 형성을 유도하여 세포 생존에 요구되는 산소 및 영양분의 전달을 저해할 수 있다.
바람직하게, 상기 가교제는 이에 제한되지 않으나, 염화칼슘일 수 있다. 예컨대, 염화칼슘 용액과 접촉할 때 알지네이트의 1가의 나트륨 이온은 2가의 칼슘 이온으로 교환되어 교차결합을 형성함으로써 표면을 경화할 수 있다. 이때, 상기 염화칼슘은 5 mM 내지 50 mM의 농도로 사용할 수 있다. 상기 염과칼슘의 농도가 50 mM을 초과하는 경우 알지네이트의 과도한 교차결합을 유발하여 고도로 경화된 전달체로 제조되어 내포된 세포의 활성에 악영향을 줄 수 있으며, 5 mM 미만인 경우 교차결합이 부족하여 형태를 유지하기 어렵다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 코어-쉘 섬유상 세포전달체를 포함하는 골조직 또는 연골조직 재생용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 코어-쉘 섬유상 세포전달체를 포함하는 골 또는 연골 재생용 조성물을 이식하는 단계를 포함하는 골조직 또는 연골조직을 재생시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 용어 "골조직(osseous tissue)"은 뼈를 형성하는 조직을 일컫는 용어이다. 뼈는 표면이 치밀골질로 이루어지며, 중심부나 장골의 양 끝은 그물눈 같이 연합된 해면골질로 되어 있다. 대부분의 뼈는 처음에 결합조직 중의 연골로서 발생하여 나중에 골조직으로 바뀌는데 일부는 결합조직 중에서 직접 생성된다. 말단에는 이웃 뼈와 접하는 부분에 관절면이 있고, 그 표면은 초자연골인 관절연골로 덮여있다. 해면질 가운데의 해면소주는 일정한 배열로 되어 있는 것이 특징이다. 골세포는 골층판 사이에 배열되어 있으며, 불규칙한 별모양으로 가는 원형질 돌기로 인접한 다른 골세포와 연결되어 있다. 뼈의 표면에는 질긴 결합조직성 골막이 있으며, 신경과 혈관이 분포되어 뼈의 보호와 영양을 맡고 있다. 골막이 결손되면 뼈의 생존, 신생, 재생 등의 곤란해진다. 골질의 성분은 수분 20%, 세포를 포함한 유기질 35%, 무기질 45%인데, 뼈가 일정한 탄력성을 유지하는 것은 유기질이 있기 때문이다. 연령이 증가함에 따라 무기질(주로 인산칼슘)이 증가하여 뼈의 경도도 증가한다.
본 발명의 용어 "연골조직(cartilage tissue)"은 인간 및 동물의 체내 여러 부분에서 발견되는 유연한 결합조직으로, 뼈, 흉곽, 귀, 코, 기관지 및 추간판 사이의 접합부를 포함한다. 뼈와 달리 딱딱하고 경직되지 않으나, 근육보다는 뻣뻣하고 덜 유연하다. 연골은 콜라겐 섬유(collagen fiber), 단백당(proteoglycan)이 풍부한 기반물질(ground substance) 및 탄력소 섬유(elastin fiber)로 구성된 다량의 세포외기질(extracellular matrix)을 생산하는 연골모세포(chondroblast)라 불리는 특화된 세포로 구성된다. 연골은 상기 세 가지 주요 요소들의 상대적인 함유량에 따라 탄성연골(elastic cartilage), 유리연골(hyaline cartilage) 및 섬유연골(fibrocartilage)의 세 가지 타입으로 분류된다. 기질 내에 포획된 연골모세포를 연골세포(chondrocyte)라 하며, 이는 소강이라 불리는 공간에 위치한다. 하나의 공간은 8개의 연골세포까지 수용할 수 있다. 연골은 다른 결합조직과는 달리 혈관을 포함하지 않으며, 연골세포는 관절연골의 압박 또는 탄성연골의 굽힘에 의해 생성되는 펌핑작용에 의한 확산에 의해 제공된다. 따라서, 다른 결합조직에 비해 연골은 성장 및 회복이 매우 느리다.
본 발명의 용어 "재생"은 일반적으로 생물체에는 몸의 일부 또는 그 기능을 상실하였을 때, 그 부분의 조직이나 기관을 다시 만들어 원래 상태로 복구시키거나 그 기능을 회복하려는 작용을 일컫는다. 이러한 재생능력은 체계가 간단하고 계통적으로 진화의 정도가 낮은 것일수록 강하다.
바람직하게 상기 세포전달체는 미분화 줄기세포를 포함하거나, 골 또는 연골세포를 포함하는 것이 특징이다. 본 발명에 따른 세포전달체는 명확히 구분된, 콜라겐 및 세포를 포함하는 코어부분과 알지네이트를 포함하는 쉘부분을 포함한다. 상기 알지네이트 쉘은 기공을 포함하여 코어에 존재하는 생존에 필요한 산소 및 영양분을 공급할 수 있으며, 분화에 필요한 신호전달물질, 성장인자 및/또는 사이토카인 등을 전달하여 분화를 유도할 수 있다. 이러한 구조적 특징에 의해 코어부분의 세포는 산소 및 영양분 등의 공급이 원활한 알지네이트와의 경계부분으로 이동하여 섬유상 구조의 축을 따라 네트워크를 형성한다.
상기 세포전달체에 봉입되는 골 또는 연골세포는 전술한 세포전달체의 제조방법에 따라 골 또는 연골세포를 이용하여 제조하거나, 미분화 줄기세포를 이용하여 제조한 세포전달체를 골 또는 연골 분화배지에서 2 내지 15일 동안 분화시켜 제조하는 것이 특징이다. 상기 골 또는 연골세포는 체세포 예컨대 자가 골세포 또는 연골세포이거나, 줄기세포를 분화시켜 수득한 것일 수 있다. 상기 미분화 줄기세포는 성체줄기세포, 배아줄기세포, 유도만능줄기세포 등일 수 있으나, 다양한 조직세포로 분화가능한 세포이면 유래 또는 획득하는 방법과 무관하게 제한없이 사용될 수 있다.
상기 골 분화배지로는 통상의 세포배양 배지에 아스코르브산, β-글리세로포스페이트 및 덱사메타손을 첨가하여 사용하는 것이 바람직하며, 연골 분화배지로는 통상의 세포배양 배지에 TGF-β를 첨가하여 사용하는 것이 바람직하다. 상기 세포배양 배지는 당 분야에서 사용되는 배지를 모두 포함하며, 배지 및 배양조건은 세포의 종류에 따라 선택할 수 있다. 배양에 사용되는 배지는 바람직하게 세포 배양 최소 배지(cell culture minimum medium; CCMM)로, 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 이러한 세포 배양 최소 배지의 비제한적인 예는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12, αMEM(α Minimal essential Medium), GMEM(Glasgows Minimal essential Medium) 및 IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)등이 있다. 또한, 상기 배지는 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin) 또는 겐타마이신(gentamicin) 등의 항생제 또는 소태아혈청(fetal bovine serum; FBS), 인간혈청알부민(human serum albumin) 등의 혈청첨가물을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 골조직 또는 연골조직 재생용 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기 "약학적으로 허용가능한"이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 것을 말한다. 상기 담체는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제, 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등 당업계에 공지된 것이라면 제한없이 사용할 수 있다. 본 발명의 재생용 조성물은 질병부위로 이동을 유도할 수 있다면 어떠한 경로를 통해서든지 투여 가능하다. 바람직하게는 조직 손상부위에 알맞은 형태로 성형하여 직접 이식할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 조성물은 하이드로겔의 일종으로 성형이 용이하므로 이러한 투여형태에 적합하다. 예컨대, 조직 손상 형태에 알맞은 형태로 성형되어 이식될 수 있어 효과적으로 조직재생을 촉진할 수 있다. 또한 변질방지를 위한 안정화제로 아스코르빈산, 아황산수소나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등과, 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 벤질알콜 등의 미생물 발육을 저지하기 위한 보존제 등의 담체를 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 "이식(transplantation)"은 일반적으로 공여자의 세포, 조직 또는 장기 등을 수혜자의 손상 조직 또는 장기에 옮기는 과정을 의미한다. 공여자 형태에 따라 자기 세포나 조직을 다른 곳에 이식하는 자가이식(autograft), 수혜자와 동일한 종인 공여자로부터의 세포, 조직, 장기 등을 이식하는(예컨대 인간에서 인간으로) 동종이식(allograft), 다른 종으로부터의 장기 등을 이식하는(예컨대 동물의 장기를 인간에게) 이종이식(xenograft)로 분류될 수 있다. 이식의 대상은 보다 넓게는 공여자의 세포, 조직 또는 장기 뿐 아니라 수혜자의 손상된 조직의 재생을 도울 수 있는 물질이면 제한없이 포함한다. 이식은 당업계에 공지된 방법으로 수행될 수 있으며, 본 발명의 실시예에 제한되지 않는다. 일반적으로 세포를 이식하는 경우 고형 지지체인 스캐폴드에 로딩시켜 이식하거나 주사를 이용하여 이식할 수 있다. 그러나, 본 발명의 조성물은 반고체인 하이드로겔의 형태로서 별도의 지지체를 필요로 하지 않으면서도 성형이 용이하여 작거나 복잡한 형태의 손상 조직에도 맞추어 이식할 수 있다. 한편 세포 자체로 또는 비드형태에 봉입시켜 주사제 형태로 제제화하는 경우 주사액에 희석되고 부유되므로 원하는 위치에 정착되도록 하기 어려운 점이 있으나, 본 발명의 조성물의 경우 연속적인 반고체의 하이드로겔 섬유상으로 제조되므로 희석할 필요 없이 원하는 부위에 이식할 수 있어 도입된 세포의 빠른 생착을 도모할 수 있다. 한편 본 발명에 따른 조성물의 코어 및 쉘의 성분인 콜라겐과 알지네이트는 모두 생체적합성 물질이며 생분해성을 갖는 물질이므로 체내에 이식되어도 부작용이나 독성을 나타내지 않으며, 시간이 흐름에 따라 자연적으로 분해되면서 도입된 세포가 생착할 수 있게 돕는다.
본 발명의 코어와 쉘이 명확히 구분된 코어-쉘 섬유상 세포전달체는 쉘의 알지네이트 함량을 최적화하여 코어에 위치한 세포에 산소 및 영양분을 원활히 공급할 수 있고, 이때 세포는 산소와 영양분의 공급이 원활한 쉘과의 경계부분에서 네트워크를 형성할 수 있다. 상기 세포전달체는 하이드로겔 형태로 성형이 용이하여 작거나 복잡한 형태의 조직 손상부분에도 직접 채워넣어 이식할 수 있다.
도 1은 줄기세포가 포획된 콜라겐 코어 및 알지네이트 쉘 하이드로겔 운반체를 제조하기 위한 (a) 기기장치, (b) 제조과정 및 (c) 제조된 코어-쉘 섬유상 하이드로겔 운반체를 나타낸 개략도이다. MSC-콜라겐 (2) 및 알지네이트 (3) 용액 각각을 주입기로부터 일정한 속도로 주입하되 본 발명을 위해 고안된 코어-쉘 바늘(4, 5)를 사용하여 저농도(50 mM)의 염화칼슘 용액을 포함하는 수조 (6)에 직접 디포짓하여 칼슘 이온과 나트륨-알지네이트의 교차결합을 통해 알지네이트가 경화되도록 하였다. 콜라겐 내부 코어에 로딩된 MSC는 경화된 알지네이트 내에 포획되었다. 직접 디포짓된 세포 구조물(direct-deposited cell-construction)을 37℃에서 인큐베이션하여 콜라겐이 겔화되도록 하였다. 이후 골조직 공학을 위한 세포 배양을 위해 추가적으로 인큐베이션하였다. (b)는 연속적인 섬유상 구조를 보존하면서 디포짓된 코어-쉘 하이드로겔 운반체를 나타낸 도이다. (c)는 문자 'DKU'의 형태로 제조한 코어-쉘 섬유상 하이드로겔 운반체이다. 도 1c에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 코어-쉘 섬유상 하이드로겔 운반체는 조직-결손 형태에 적합하게 어떠한 원하는 형태로도 쉽게 성형될 수 있다.
도 2는 코어 및 쉘 두께에 대한 알지네이트 농도(a 내지 e) 및 주입 속도(f 내지 j)의 영향을 나타낸 도이다. (a) 및 (b)는 각각 알지네이트 농도 변화에 대해 측정된 쉘과 코어의 두께를 나타낸 도이다. (c 내지 e)에는 각기 다른 알지네이트 농도(c; 2%, d; 3% 및 e; 5%)로 사용하여 제조한 코어-쉘 섬유상 형태를 나타낸 광항적 이미지이다. (f) 및 (g)는 각각 주입 속도 변화에 대해 측정된 쉘과 코어의 두께를 나타낸 도이다. (h 내지 j)에는 각기 다른 주입 속도(h; 20 ml/h, i; 50 ml/h 및 j; 80 ml/h)로 사용하여 제조한 코어-쉘 섬유상 형태를 나타낸 광항적 이미지이다. 스케일 바=250 μm.
도 3은 다양한 알지네이트 농도(2%, 3% 및 5%)로 제조한 코어-쉘 구조 섬유상 하이드로겔 세포전달체의 기계적 특성을 나타낸 도이다. 변화하는 주파수(0.1 Hz로부터 10 Hz까지)에서 동적 기계적 분석에 의해 (a) 저장 탄성률 및 (b) 손실 탄성률을 기록하였다. 저장 탄성률은 알지네이트 농도가 증가함에 따라 눈에 띠게 증가한 반면, 손실 탄성률에서는 큰 변화는 관찰되지 않았다.
도 4는 21일까지 코어-쉘 하이드로겔 운반체 내에서 배양시간에 따른 (a) MSC의 증식, (b) 세포생존율 및 (c) 코어 두께 변화를 나타낸 도이다. 결과를 양성 대조군으로 사용한, 순수 콜라겐 하이드로겔 내에서 배양된 MSC에 대해 측정한 값과 서로 비교하였다. 7일째에 유사한 값을 나타내었던 세포 증식은 14일 및 21일로 배양 기간이 길어짐에 따라 차이가 나기 시작하였다(코어-쉘＜콜라겐, *p＜0.05, 통계적으로 상이함). (b)는 트리판 블루 스크리닝과 혈구계 계수에 의한 상기 두 개 군에 대해 정량된 live/dead cell 비를 나타낸 것으로 두 경우 모두 유사한 수준을 나타내었다(모든 시점에서 약 70%의 생존율). (c)는 21일까지 측정된 콜라겐 코어 수축을 나타낸 것으로 코어 크기는 약 1050 μm(초기)로부터 7일에 900 μm, 14일에 500 μm 및 21일에 350 μm로 눈에 띄게 감소하였다.
도 5는 각기 다른 배양 시기에서 (a, c, e 및 g) MSC를 포획한 코어-쉘 하이드로겔 전달체 및 (b, d, f 및 h) MSC를 포함하는 콜라겐 겔의 광학적 현미경 이미지를 나타낸 도이다. 분주 시 초기 둥근 형태를 갖는 MSC(a 및 b)는 7일에 방추형으로 변형되고(spindle shaped; c 및 d) 이후 14일에 고도로 신장되었다(highly elongated; e 및 f). 21일에는 세포가 널리 증식되어 거의 컨플루언스에 도달하였다(g 및 h). 코어-쉘 운반체에서 콜라겐 코어 부분은 배양 시간이 증가함에 따라 상당히 수축되었다. 스케일 바=350 μm.
도 6은 일정 기간 배양(7일; a 및 b, 14일; c 및 d, 및 21일; e 및 f) 후 코어-쉘 섬유상 운반체 내의 세포골격 과정 및 신장 형태를 나타낸 공초점 레이저 주사 현미경 이미지를 나타낸 도이다. 세포 핵은 파란 색(DAPI)으로, 세포골격은 빨간 색(Alexa Fluor Phalloidin 548)으로 염색하였다. 스케일 바=850 μm(a, c 및 e) 및 350 μm(b, d 및 f).
도 7은 코어-쉘 섬유상 하이드로겔 운반체 내에서 14일 및 21일에 걸쳐 배양한 MSC의 골형성 분화를 나타낸 도이다. (a) BSP, (b) OPN 및 (c) OCN 유전자의 mRNA 발현 수준을 정량적으로 확인하였다. *는 유의적인 차이를 나타낸다(p＜0.05, by ANOVA).
도 8은 MSC를 포획시킨 코어-쉘 하이드로겔 운반체의 생체 내 골형성능을 나타낸 도이다. 상기 사용한 실험군은 운반체 단독('w/o cell'), 미분화 MSC를 포함하는 운반체('non-osteogenic') 및 골형성 배지에서 7일간 분화시킨 MSC를 포함하는 운반체('osteogenic')을 포함한다. 이식 6주 후 ?CT에 의해 골재생을 분석하였다; (a)는 5 mm-직경의 결손 부분 주위에서 신생 골형성(오렌지색)을 나타내는 ?CT 구조적 이미지이다. (b) 내지 (d)는 각각 신생 골부피의 백분율, 골 표면적 및 골 표면밀도를 나타낸 정량분석 결과이다. 유의한 차이가 관찰되었다(*p＜0.05, by ANOVA).
도 9는 이식 6주 후 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 및 마송삼색(Masson's trichrome) 염색 후 이식된 시료의 조직학적 이미지를 나타낸 도이다; (a) 운반체 단독, (b) 미분화 MSC를 포함하는 운반체 및 (c) 분화된 MSC를 포함하는 운반체. (d)는 (c)에서 새롭게 형성된 뼈를 확대한 이미지이다. 화살표: 결손 가장자리, NB: 신생 골, HB: 호스트 골. 스케일 바= 1 mm(a 내지 c) 및 200 μm(d).
도 2는 코어 및 쉘 두께에 대한 알지네이트 농도(a 내지 e) 및 주입 속도(f 내지 j)의 영향을 나타낸 도이다. (a) 및 (b)는 각각 알지네이트 농도 변화에 대해 측정된 쉘과 코어의 두께를 나타낸 도이다. (c 내지 e)에는 각기 다른 알지네이트 농도(c; 2%, d; 3% 및 e; 5%)로 사용하여 제조한 코어-쉘 섬유상 형태를 나타낸 광항적 이미지이다. (f) 및 (g)는 각각 주입 속도 변화에 대해 측정된 쉘과 코어의 두께를 나타낸 도이다. (h 내지 j)에는 각기 다른 주입 속도(h; 20 ml/h, i; 50 ml/h 및 j; 80 ml/h)로 사용하여 제조한 코어-쉘 섬유상 형태를 나타낸 광항적 이미지이다. 스케일 바=250 μm.
도 3은 다양한 알지네이트 농도(2%, 3% 및 5%)로 제조한 코어-쉘 구조 섬유상 하이드로겔 세포전달체의 기계적 특성을 나타낸 도이다. 변화하는 주파수(0.1 Hz로부터 10 Hz까지)에서 동적 기계적 분석에 의해 (a) 저장 탄성률 및 (b) 손실 탄성률을 기록하였다. 저장 탄성률은 알지네이트 농도가 증가함에 따라 눈에 띠게 증가한 반면, 손실 탄성률에서는 큰 변화는 관찰되지 않았다.
도 4는 21일까지 코어-쉘 하이드로겔 운반체 내에서 배양시간에 따른 (a) MSC의 증식, (b) 세포생존율 및 (c) 코어 두께 변화를 나타낸 도이다. 결과를 양성 대조군으로 사용한, 순수 콜라겐 하이드로겔 내에서 배양된 MSC에 대해 측정한 값과 서로 비교하였다. 7일째에 유사한 값을 나타내었던 세포 증식은 14일 및 21일로 배양 기간이 길어짐에 따라 차이가 나기 시작하였다(코어-쉘＜콜라겐, *p＜0.05, 통계적으로 상이함). (b)는 트리판 블루 스크리닝과 혈구계 계수에 의한 상기 두 개 군에 대해 정량된 live/dead cell 비를 나타낸 것으로 두 경우 모두 유사한 수준을 나타내었다(모든 시점에서 약 70%의 생존율). (c)는 21일까지 측정된 콜라겐 코어 수축을 나타낸 것으로 코어 크기는 약 1050 μm(초기)로부터 7일에 900 μm, 14일에 500 μm 및 21일에 350 μm로 눈에 띄게 감소하였다.
도 5는 각기 다른 배양 시기에서 (a, c, e 및 g) MSC를 포획한 코어-쉘 하이드로겔 전달체 및 (b, d, f 및 h) MSC를 포함하는 콜라겐 겔의 광학적 현미경 이미지를 나타낸 도이다. 분주 시 초기 둥근 형태를 갖는 MSC(a 및 b)는 7일에 방추형으로 변형되고(spindle shaped; c 및 d) 이후 14일에 고도로 신장되었다(highly elongated; e 및 f). 21일에는 세포가 널리 증식되어 거의 컨플루언스에 도달하였다(g 및 h). 코어-쉘 운반체에서 콜라겐 코어 부분은 배양 시간이 증가함에 따라 상당히 수축되었다. 스케일 바=350 μm.
도 6은 일정 기간 배양(7일; a 및 b, 14일; c 및 d, 및 21일; e 및 f) 후 코어-쉘 섬유상 운반체 내의 세포골격 과정 및 신장 형태를 나타낸 공초점 레이저 주사 현미경 이미지를 나타낸 도이다. 세포 핵은 파란 색(DAPI)으로, 세포골격은 빨간 색(Alexa Fluor Phalloidin 548)으로 염색하였다. 스케일 바=850 μm(a, c 및 e) 및 350 μm(b, d 및 f).
도 7은 코어-쉘 섬유상 하이드로겔 운반체 내에서 14일 및 21일에 걸쳐 배양한 MSC의 골형성 분화를 나타낸 도이다. (a) BSP, (b) OPN 및 (c) OCN 유전자의 mRNA 발현 수준을 정량적으로 확인하였다. *는 유의적인 차이를 나타낸다(p＜0.05, by ANOVA).
도 8은 MSC를 포획시킨 코어-쉘 하이드로겔 운반체의 생체 내 골형성능을 나타낸 도이다. 상기 사용한 실험군은 운반체 단독('w/o cell'), 미분화 MSC를 포함하는 운반체('non-osteogenic') 및 골형성 배지에서 7일간 분화시킨 MSC를 포함하는 운반체('osteogenic')을 포함한다. 이식 6주 후 ?CT에 의해 골재생을 분석하였다; (a)는 5 mm-직경의 결손 부분 주위에서 신생 골형성(오렌지색)을 나타내는 ?CT 구조적 이미지이다. (b) 내지 (d)는 각각 신생 골부피의 백분율, 골 표면적 및 골 표면밀도를 나타낸 정량분석 결과이다. 유의한 차이가 관찰되었다(*p＜0.05, by ANOVA).
도 9는 이식 6주 후 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 및 마송삼색(Masson's trichrome) 염색 후 이식된 시료의 조직학적 이미지를 나타낸 도이다; (a) 운반체 단독, (b) 미분화 MSC를 포함하는 운반체 및 (c) 분화된 MSC를 포함하는 운반체. (d)는 (c)에서 새롭게 형성된 뼈를 확대한 이미지이다. 화살표: 결손 가장자리, NB: 신생 골, HB: 호스트 골. 스케일 바= 1 mm(a 내지 c) 및 200 μm(d).
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시에에 한정되는 것은 아니다.
하기 실시예에서 달리 특정되지 않은 한 실험은 3회 수행하였다. 데이터는 평균(mean)±단일 표준편차(one standard deviation)로 표현하였다. 피셔 사후검정(Fisher post-hoc test)으로 변이의 일방분석(one way analysis of variance; ANOVA)에 의해 통계적 분석을 수행하였으며, p<0.05을 유의수준(significant level)으로 판단하였다.
실시예
1: 코어-쉘
섬유상
세포전달체의 제조 및 특성분석
(1) 코어-쉘
섬유상
세포전달체의 제조
본 발명에서는 이중 동심 노즐(dual concentric nozzle; 내부 23G 및 외부 17G)을 특별히 고안하여 콜라겐-알지네이트의 코어-쉘 구조의 섬유상 네트워크의 제조에 사용하였다. 여기서, 사용된 알긴산나트륨(sodium alginate; A2158, Sigma-Aldrich)은 1.67의 M/G 비율과 약 50 kDa의 분자량을 가졌다. 상기 이중 동심 노즐에, 2 중량% 내지 5 중량%의 비율로 알긴산나트륨 용액을 외부 실린지에 주입하는 한편 콜라겐 용액을 내부 실린지에 로딩하였으며, 이의 개략도를 도 1에 나타내었다.
구체적으로 100 μl 10× DMEM(Dulbecco’s modified eagle medium)을 포함하는 1 ml 콜라겐을 적당량의 1 N NaOH와 혼합하여 콜라겐(랫트 꼬리 제1형 콜라겐; First Link(UK); 2.05 mg/ml) 용액을 제조하여, 이어지는 겔화와 로딩된 세포에 비독성 환경을 제공하기 위하여 용액 조건을 조절하여 중성 pH를 제공하도록 하였다. 각각의 실린지를 미세관을 통해 주입펌프(injection pump; KD Scientific)에 부착하였으며, 주입 속도는 20 내지 80 ml/h 사이에서 변화시켰다. 코어-쉘 구조의 콜라겐-알지네이트 섬유를 동심 노즐을 통해 50 mM 염화칼슘(CaCl2)을 포함하는 수조에 5분간 주입하였다. 전체 주입과정은 멸균조건 하에서 수행하였다. 주입 후, 외부 알지네이트는 칼슘 이온과 접촉하여 섬유상 세포 캐리어의 안정성을 유지하도록 교차결합하고 겔화하였다.
도 1a에 도시한 장치를 이용하여, 코어-쉘 구조 하이드로겔 세포 캐리어를 제조하고, 동심 노즐을 통한 코어-쉘 섬유상 주입 및 섬유상 스캐폴드의 수집을 광학적으로 가시화하여, 도 1b에 나타내었다. 알지네이트가 콜라겐-MSC를 내부에 포함하는 코어-쉘 구조를 보존하는 연속적인 섬유를 성공적으로 제조하였다. 또한, 본 발명의 섬유상 하이드로겔은 어떠한 형태로도 용이하게 성형될 수 있다; 예컨대, 조립식 주형(Prefabricated mold)을 이용하여 문자 'DKU'를 형성하였으며(도 1c), 이는 코어-쉘 섬유상 장치가 조직-결손 3D 형태(geometry)로 조절 가능하도록 할 수 있음을 나타낸다.
(2) 제조한 코어-쉘
섬유상
세포전달체의 특성분석
(2)-1 저장탄성률 및 손실탄성률의 분석
상기 (1) 단계에서 제조한 코어-쉘 섬유상 구조의 세포전달체의 침착 후, 광학현미경으로 측정한, 10개의 임의로 선택한 이미지로부터 코어 및 쉘의 두께를 측정하였다. 주입속도(20, 50 및 80 ml/h) 또는 알지네이트 농도(2%, 3% 및 5%)를 조절하여 준비한 섬유상 하이드로겔 시료를 측정에 사용하였다. Dynamic Mechanical Analysis(DMA; MetraVib, DMA25N)로 병렬 접시 배열(parallel plate configuration)을 이용하여 섬유상 하이드로겔의 기계적 특성을 측정하였다. 이를 위하여 침착된 섬유를 원통형 테플론 주형(cycylinderic Teflon mould; 12 mm 직경×6 mm 높이)에 일정한 부피(constant volume; 0.5 ml 섬유 제형)로 적층하였다. 37℃에서 0.1 내지 10 Hz 범위의 주파수 및 점탄성(viscoelasticity) 선형영역 내의 5% 변형률(strain amplitude)로 역학적 주파수 ?음(dynamic frequency sweep)을 이용하여 기계적 테스트를 수행하였다. 이때, 자동-압축(auto-compression) 및 자동-변형 수정(auto-strain adjustment)을 적용하였다. 힘을 0.001로부터 0.2 N으로 증가시켰고 변형을 허용하는 최대값을 10%로 설정하였다. 시료의 저장탄성률(storage modulus; E') 및 손실탄성률(loss modulus; E'')을 측정하였다. 위상각 차이(Phase angle delta; tan delta)는 E''/E'으로 계산하였다(n=3).
코어 및 쉘 부분의 두께를 조절하는 것은 영양분/산소 투과성 및 포획된 세포의 생존에 현저한 영향을 미칠 수 있으며, 이는 알지네이트의 농도 및 주입속도를 변화시킴으로써 달성할 수 있었다. 도 2에 쉘 및 코어 두께값에 대한 상기 변수들의 영향을 나타내었다. 쉘의 두께는 알지네이트 농도가 증가함에 따라 증가하였다(2% 알지네이트에 대해 200 μm로부터 5% 알지네이트에 대해 450 μm로; 도 2a). 코어 두께는 가장 높은 알지네이트 농도에서 감소하였다(도 2b). 또한 코어-쉘 형태(morphology)는 알지네이트 농도에 대한 코어 및 쉘 두께 변화를 잘 반영하였다(도 2c 내지 e). 주입 속도의 영향 또한 명확하였다. 쉘 두께는 주입 속도가 증가함에 따라 증가(20 ml/h에 대해 100 μm로부터 80 ml/h에 대해 400 μm; 도 2f)하는 반면 코어 두께는 변하지 않았다(도 2g). 광학적 이미지 또한 주입 속도 변화에 따른 코어-쉘 두께 변화를 나타내었다.
동적 기계적 분석(dynamic mechanical analysis)을 통해 코어-쉘 하이드로겔 세포전달체의 기계적 성질을 측정하였다. 알제네이트 농도를 변화시키면서 제조한 시료를 비교하였다. 다른 주파수에서 기록한 저장 탄성률(storage modulus; E') 및 손실 탄성률(loss modulus; E'') 값을 도 3에 나타내었다. 알지네이트 농도가 증가함에 따라 저장 탄성률이 증가(2% 알지네이트에 대해 30 kPa로부터 5% 알지네이트에 대해 50 kPa; 도 3a)하였고 이는 알지네이트 농도를 증가시킴으로써 소성변형(plastic deformation)에 대한 저항성(ability to withstand)을 향상시킬 수 있음을 나타낸다. 손실 탄성률은 각기 다른 알지네이트 농도에서 매우 유사한 값을 나타내었으며(도 3b), 이는 스캐폴드의 점성 거동(viscous behavior)이 알지네이트 농도에 의해 영향받지 않았음을 나타낸다.
즉, 저장 탄성률은 주파수 변수에 대한 의존성을 나타내지 않은 반면, 손실 탄성률은 주파수가 증가함에 따라 거의 선행적인 증가를 나타내었다. 또한 기록된 저장 탄성률 값은, 모든 경우에서 손실 탄성률 보다 더 높았다.
(2)-2 질량측정
섬유상 하이드로겔 세포 캐리어의 물흡수능(water-uptake capacity)을 확인하였다. 각 시료를 증류수에 1시간 동안 담근 후, 시료를 취하여 증류수로 포화시킨 여과지에 점적하고, 질량(Wim)을 기록하였다. 시료를 세척 및 동결건조한 후, 건조질량(Wdry)을 기록하였다. 물흡수능은 (Wim-Wdry)/Wdry로 결정하여 백분율로 표현하였다(n=3). 각각의 시료를 인산완충염용액(PBS)에 담그어 시료(0.3 ml 부피의 섬유 제형)의 분해를 시험하였다. 21일까지 다양한 시간 동안 담근 후 시료를 수득하여 세척하고 건조시켜 분해실험 후 질량(Wdeg)을 기록하였다. 분해율은 (Wdry-Wdeg)/Wdry 백분율로 계산하였다.
코어-쉘 하이드로겔 세포전달체의 분해를 PBS에서 21일에 걸쳐 측정하였다. 3% 알지네이트를 사용하여 제조한 세포전달체를 대표적인 실험군으로 사용하여 질량 손실을 측정하였다. 이는 3일째에 약 4%, 7일째에 약 22% 및 14일째에 약 43%를 나타내었다. 또한 세포전달체는 98%까지 물을 흡수하는 결과를 나타내었다. 상기 물 흡수율은 하이드로겔 및 동결건조 시료 간의 질량 차이로부터 측정하였으며, 상기의 결과는 전형적인 하이드로겔의 특성을 나타내었다.
실시예
2: 코어-쉘
섬유상
세포전달체 내에 세포의 봉입 및
봉입된
세포의 생존율 및
증식율
(1) 세포 배양
단국대학교 동물실험윤리위원회에 의해 승인된 지침에 따라 랫트 골수로부터 유래된 중간엽 줄기세포를 성체 랫트(180 내지 200 g)의 대퇴 및 경골로부터 수득하였다. 수득한 시료를 원심분리하여 상등액을 수거하여 정상 배양 배지(10% FBS(fetal bovine serum), 100 U/ml 페니실린 및 100 mg/ml 스트렙토마이신을 포함하는 α-MEM(α-최소 필수 배지; α-minimal essential medium))의 배양 플라스크에 분산시켜 37℃의 5% 이산화탄소를 포함하는 습식 배양기에서 배양하였다. 1일간 배양한 다음, 배지를 교환하고 세포가 80% 이상 컨플루언시에 달할 때까지 배양하였다. 그 다음, 트립신으로 세포를 계대배양(subculture)하고 정상 배양 조건에 유지하였다. 2 내지 3 계대(passage)의 세포를 추가적인 실험에 사용하였다.
(2) 코어-쉘
섬유상
세포전달체 내에 세포의 봉입
세포를 봉입하기 위하여 알긴산나트륨 분말을 에틸렌옥사이드로 멸균하고 멸균조건 하에 보관하였다. 분말을 증류수와 혼합하여 3% 알긴산나트륨 용액을 제조하였다. 콜라겐 용액은 멸균조건에 두고 수득한 대로(as-received) 사용하였다. 콜라겐 하이드로겔에 MSC를 포함시키기 위하여 공지된 방법에 따라 콜라겐 하이드로겔을 제조하였다. 콜라겐 용액의 색 변화(노란색에서 오렌지-핑크색으로 변화)를 관찰하여 pH가 중성값에 도달한 후 1×105 세포를 봉입하였다. 세포를 로딩한 콜라겐 용액을 내부 실린지에 넣고 알지네이트 용액을 외부 실린지에 두었으며 전술한 방법에 따라 멸균 조건에서 섬유상 구조화를 수행하였다. 코어-쉘 섬유 구조물에 존재하는 콜라겐의 양을 모든 케이스에 대해 0.3 ml로 유지하였다(n=3). 결과로서 세포를 봉입한 섬유상 하이드로겔(세포-콜라겐을 코어에, 알지네이트를 쉘에 포함)을 수득하였다. 5분간 스캐폴드를 구성한 후, 세포가 봉입된 하이드로겔을 배양배지로 3회 세척하여 과량의 염화칼슘을 제거하고 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 α-MEM에서, 21일까지 37℃의 5% 이산화탄소를 포함하는 습식 배양기에 배양하였다. 양성대조군으로서, 1×105 MSC를 포함하는 0.3 ml 콜라겐 하이드로겔을 코어-쉘 섬유상 구조물 없이 배양 웰에 넣었다.
(3) 코어-쉘
섬유상
세포전달체 내에
봉입된
세포의 생존율 측정
코어-쉘 섬유상 세포 캐리어 또는 양성 대조군으로서 사용된 콜라겐 겔 내의 생존세포의 수를 측정하였다. 각 배양 시기에 세포를 포함하는 하이드로겔 시료를 PBS로 2회 세척하고 1% 콜라게나제로 5분간 37℃에서 용해시켰다. 부유액을 원심분리하여 상등액을 제거하고 살아있는 세포 수를 혈구계를 이용하여 트리판 블루 스크리닝으로 정량하였다. 이중가닥 DNA 검출 키트(Quanti-iT Picogreen, Invitrogen)을 이용하여 세포 증식 가능성(cell proliferative potential)을 측정하였다. 이를 위하여 세포를 포함하는 하이드로겔을 세척하고 1% 콜라게나제로 용해시켰다. 세포 펠렛을 회수한 후 시료를 -20℃에 보관하였다. 혼합물을 2회 반복 사이클로 동결-융해(freeze-thawed)하였다. 420 nm 여기 및 530 nm 방출 파장에서 형광세기를 측정하여 제조업자의 설명서에 따라 세포를 정량하였다. 제조업자의 지시에 따라 표준곡선을 획득하고 형광세기를 DNA 함량으로 변환하는데 사용하였다.
상기 과정을 통하여, 코어-쉘 하이드로겔 운반체에 포획된 MSC의 증식능 및 생존능을 조사한 결과를 도 4에 나타내었다. 이때, 결과를 세포 성장 및 증식에 효과적인 3D 기질인 콜라겐 하이드로겔 기질 내에 배양한 MSC와 비교하였고, 상기 콜라겐 하이드로겔 기질을 양성 대조군으로 사용하였다.
그 결과 DNA 분석결과는, MSC가 21일에 걸쳐 계속적으로 증가하면서 2개 군 모두에서 활발하게 증식함을 나타내었다(도 4a). 그러나, 세포 증식 수준은 7일 동안 상기 2개 군에서 견줄만 하였으나, 14일 및 21일 후에는 코어-쉘 구조에서 보다 콜라겐에서의 증식이 현저히 더 높은 결과를 보였다.
또한, Live/dead cell assay는 콜라겐 및 코어-쉘 군에서 모두 전체 배양 기간에서 약 70% 정도의 세포 생존율로 견줄만한 수준임을 나타내었다(도 4b).
21일에 걸쳐 MSC가 생존하고 증식하는 콜라겐 코어의 수축을 확인하고, 그 결과를 도 4에 나타낸 바와 같이, 코어 직경은 초기 1050 μm로부터 7일째에는 900 μm로, 14일째에는 500 μm로, 21일째에는 350 μm로 현저하게 감소한 결과를 보였다.
실시예
3: 코어-쉘
섬유상
세포전달체 내에서 배양된 세포의 형태분석
배양하는 동안 올림푸스 BX-50 현미경을 사용하여 광학현미경 하에서 모니터하였다. 각 배양 시기(7, 14 및 21일)에 각 시료 상에서 성장한 세포를 4% 파라포름알데하이드로 고정하고 0.1% 트리톤 X-100으로 처리하였다. PBS로 세척한 후, PBS에 희석한 알렉사 플루오르 546-결합 팔로이딘(Invitrogen A22283)를 각 시료에 첨가하여 F-액틴을 염색하였다. 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(4',6-diamidino-2-phenylindole; DAPI, Invitrogen)를 포함하는 ProLong Gold antifade 시약을 사용하여 세포를 염색하여 핵 내의 DNA에 결합함으로써 청색형광을 형성하였고, Zeiss LSM 510 현미경을 이용하여 공초점 레이저 주사 현미경(confocal laser scanning microscopy; CLSM)로 이미지를 획득하였고, 그 결과를 도 5 및 6에 나타내었다.
도 5는 코어-쉘 섬유상 하이드로겔 운반체 내에 포획되어 21일까지 배양하면서 얻은 MSC의 대표적인 광학 현미경 이미지이다. 대조군으로는 콜라겐 내에 포획된 세포를 사용하였다. MSC는 포획 직후 초기에는 둥근 형태를 나타내었고(도 5a) 배양 7일 후에는 얼마간의 세포골격 확대(extension)가 관찰되었다(도 5c). 콜라겐 겔 대조군에서도 유사하게 관찰되었다(도 5b 및 5d). 코어-쉘 운반체 내의 세포는 14일째에 고도로 길쭉해졌다(도 5e). 흥미롭게도 세포는 섬유축(fiber axis)을 따라 방향성 있는 신장(directional elongation)을 나타내었다. 콜라겐 내의 세포 또한 고도로 길쭉해졌으나 임의의 방향으로 신장되었다(도 5f). 21일에 코어-쉘 운반체 내의 세포는 콜라겐 코어 내에서 거의 컨플루언스에 이르렀으며(도 5g), 유사한 거동이 콜라겐 겔에서도 관찰되었다(도 5f). 코어-쉘 시스템에서 콜라겐 코어부분은 장시간의 배양 동안 상당히 축소되는 것으로 나타났다.
도 6에 나타난 바와 같이, 세포를 면역염색한 후 공초점 현미경으로 관찰하여 세포의 세포골격 과정 및 신장 형태를 확인하였다. 7일째에 제한된 세포골격 확대를 포함하는 MSC(도 6a 및 6b)는 현저한 신장을 나타내었으며, 14일째에 세포를 따르는 고도로 네트워크화된 구조를 형성하였다(도 6c 및 6d). 세포 네트워크는 코어부분의 외부 표면에서 즉, 코어/쉘 경계에 가깝게, 주로 형성되었다. 표면 부분에서 세포 컨플루언스가 달성되었을 때, 세포는 콜라겐 코어 부분의 안쪽 부분으로 성장하고 증식하며 21일에 세포는 콜라겐 코어를 통해 섬유축을 따라 고도로 배향된 보다 밀집된 네트워크를 형성하였다(도 6e 및 6f).
실시예
4: 코어-쉘
섬유상
세포전달체 내에서 배양된 세포의 분화
하이드로겔 세포 캐리어 내에 봉입된 MSC는 50 μg/ml 아스코르브산, 10 mM β-글리세로포스페이트 및 10 nM 덱사메타손을 포함하는 골형성 배지에서 골형성 분화를 유도하였다. 오스테오칼신(OCN), 골 시알로프로테인(BSP) 및 오스테오폰틴(OPN)을 포함하는 골형성과 관련된 유전자 발현을 정량 PCR(qPCR)에 기초하여 확인하였다.
구체적으로, 14 및 21일 간 배양 후, 세포가 봉입된 스캐폴드를 세척하고 콜라게나제로 용해시켰다. 세포 펠렛을 회수하여 사용전까지 -80℃에서 동결시켰다. 제조업자의 지시에 따라 RNeasy 키트(Qiagen)를 이용하여 분화된 세포로부터 총 RNA를 추출하였다. RNA 시료의 농도는 Nanodrop 2000 분광광도계(Thermo Scientific)을 사용하여 정량하였다. 임의의 6합체와 RNA를 결합시킨 후 70℃에서 5분간 변성시켜 RNA 시료를 cDNA로 전사하였다. 완전한 cDNA 합성을 위하여 변성 후 시료를 RT 프리믹스와 혼합하였다. 이후 RT-PCR 프리믹스(Bioneer)를 사용하여 94℃에서 5분간 처리하고, 94℃에서 1분간 변성, 57℃에서 1분간 어닐링 및 72℃에서 1분간 신장을 35 사이클 수행하여 cDNA를 증폭시켰다. 증폭에 사용한 프라이머는 OCN: AGGACCCTCTCTCTGCTCAC (정방향; 서열번호 1), AACGGTGGTGCCATAGATGC (역방향; 서열번호 2); BSP: CTGCTTTAATCTTGCTCTG (정방향; 서열번호 3), CCATCTCCATTTTCTTCC (역방향; 서열번호 4); OPN: TCCAGCTGACTTGACTCATGG (정방향; 서열번호 5), CCGATGAATCTGATGAGTCCTT (역방향; 서열번호 6); 및 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로게나제(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; GAPDH): CCATGTTTGTGATGGGTGTG (정방향; 서열번호 7), GGATGCAGGGATGATGTTCT (역방향; 서열번호 8)이며 결과는 GAPDH에 대해 표준화하였다.
코어-쉘 섬유상 운반체에서 배양한 MSC의 골형성 분화를 BSP, OPN 및 OCN을 포함하는 뼈와 관련된 유전자 발현의 측면에서 확인하였다. 도 7에 정량적 PCR 분석(quantitative PCR analysis)에 의한 이들 유전자의 mRNA 발현수준을 나타내었다(발현수준은 14일에 콜라겐 겔에 대해 표준화하여 나타내었다). 그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 14일간 배양 후, 모든 유전자는 콜라겐 겔에서 보다 코어-쉘 운반체에서 현저하게 더 높은 수준으로 발현되었다. 배수 증가는 BSP, OPN 및 OCN에 대해 각각 1.6, 3.0 및 5.5였다. 그러나, 21일에는 차이가 감소하였다.
실시예
5: 코어-쉘
섬유상
세포전달체의 생체 내 전달 및 분화
랫트 두개관 결손 모델을 이용하여 하이드로겔 세포 캐리어에 의해 전달되는 MSC의 조직적합성 및 골형성능을 확인하였다. 하우징, 관리 및 실험 프로토콜은 단국대학교 동물실험윤리위원회에 의해 승인되었다. 9마리의 11주령, 350 내지 400 g의 건강한 수컷 Sprague-Dawley 랫트를 사용하였다. 수술을 위해 80 mg/kg의 Zoletil과 10 mg/kg의 xylazine을 우측 사두근(quadriceps muscle)에 근육내 주사하여 마취하였다. 모든 기구는 사용 전 멸균하였고 동물에 대한 모든 수술과정은 무균기법(sterile technique)을 사용하여 일반적인 마취하에 수행하였다. Bard-Parker 스캘펄(scalpel)을 구비한 10번 칼(#10 blade)을 이용하여 피부를 통한 중간선절개(midline incision) 및 골막(periosteum) 절제(excision) 후 두개골(cranial bone)을 노출시켰다. 원형천공기(trephine burr)를 이용하여 각각의 두정골(parietal bone)의 중앙부에 5 mm 직경의 최대 두께 원통형 결손을 형성하였다. 각 동물에 두 개 결손을 형성하고 결손을 3개 군으로 임의 추출하였다. 결손을 0.1 ml 테스트 시료로 채웠다. 그룹 1은 세포캐리어만으로 구성하였다. 그룹 2는 미분화된 MSC를 봉입한 세포 캐리어를 포함한다. 그룹 3은 분화된 MSC를 봉입한 세포 캐리어를 포함한다(n=4). 그룹 3에 대해, 하이드로겔 구조물 내의 MSC는 1주일간 골형성 배지에 배양하였다. 이식 후 피하조직 부위(subcutaneous area)를 4-0 흡수봉합사 물질(absorbable suture material)로 봉합하고 피부를 이어서 4-0 비흡수성 단섬유 봉합사 물질로 봉합하였다. 수술 후, 랫트를 20 내지 24℃ 및 30 내지 70% 상대습도 조건의 케이지에 개별적으로 수용하였고 표준 펠렛 사료와 물을 원하는 대로(ad libitum) 공급하면서 교차 12시간 명/암 순환을 유지하였다. 1주일 간 육안으로 관찰하여 감염, 염증 및 역효과의 징후를 모니터하였다.
수술 6주 후에, 시료 및 주변 조직을 회수하기 위하여 동물을 치사시켰다. 안락사(euthanasia)하여 각 동물로부터 검체를 회수하고 10% 중성 완충 포르말린(neutral buffered formalin) 용액으로 최소 24 내지 48시간 동안 고정하였다. 고해상도 마이크로-컴퓨터단층촬영술(high resolution micro-computed tomography; μCT) 시스템(Skyscan 1072; Skyscan, Belgium)을 이용하여 시료를 이미징하여 조직 회복 및 골재생을 확인하였다. 회수한 시료를 스캔하고 NRecon CT Reconstruction software를 이용하여 미가공 이미지(raw image)로부터 일련의 관상으로 배향된 단층영상(serial coronally oriented tomogram)을 재구성하였다. 결손자리 내의 모든 신규한 뼈를 모두 아우르도록 원통형 관심영역(cylindrical region of interest; ROI)을 각 결손의 중심에 정확히 중첩되도록 위치시켰다. 관상으로 배향된 μCT 이미지를 축 방향(axial orientation)으로 재구성(reformat)하였다. CTAn(Skyscan)과 3D 이미지를 사용하여 ROI에 중첩시킨 재구성된 이미지를 형성하였다. 총 골함량(total bone content)(섬유주 및 피질 뼈(trabecular and cortical bone)를 포함하는)에 대해 역치를 설정(assigning threshold)하여 각 ROI 내에 새롭게 형성된 뼈의 총 부피를 측정하였다. 각 군에 대해 4개 시료를 측정하여 뼈의 총 부피(mm3)를 보고하였다.
μCT 스캐닝 후, RapidCal™ 용액으로 검체를 탈석회화하고 증가하는 단계별로 증가하는 에탄올 농도(70 내지 100%)의 일련의 용액에서 탈수시킨 후, 다듬어(trimmed) 파라핀에 포매시켰다. 두개골에 수직으로 약 5 μm 두께의 조직 절편을 준비하고 생체적합성 및 골형성을 확인하기 위한 병리조직학적 시험(histopathological examination)을 위해 절편을 헤마톡실린-에오신(hematoxylin-eosin; HE) 및 마송삼색(Masson’s trichrome; MT)로 염색하였다. Meta-Morph를 이용하여 광학현미경 디지털 이미지를 획득하고 전산화된 이미지 분석 시스템(computerized image analysis system; Molecular Devices)으로 분석하였다.
코어-쉘 하이드로겔 운반체에 포획된 MSC의 조직 적합성 및 골형성능을 랫트 구개관 모델을 이용하여 추가적으로 확인하였다. 코어-쉘 운반체 단독, MSC가 포획된 운반체 및 7일간 골형성 분화 후 MSC를 포획시킨 운반체의 3가지 다른 군으로 실험하였다.
그 결과 6주 간의 실험 기간을 통해 동물들은 조직거부반응(adverse tissue reaction)과 재료 독성(material toxicity) 없이 우수한 치유 반응을 나타내었으며, 또한 회수한 조직에서는 내부 염증의 어떠한 가시적인 징후도 나타나지 않았다. 도 8에 나타난 바와 같이, 골재생을 μCT로 확인하였다. μCT-구성 이미지(μCT-constructed image)는 3개 군에 대해 결손 부위 내에 신생 골형성(오렌지색)을 나타내었다(도 8a). 결손 가장자리로부터의 골재생이 다른 수준으로 관찰되었다. μCT 이미지에 기초하여 골부피 백분율(percent bone volume), 골 표면적(bone surface area) 및 골 표면밀도(bone surface density)를 정량하였다. 골부피 백분율은 운반체를 단독으로 처리한 실험군에서 약 13%로 나타난 반면, MSC가 포획된 운반체에 대해서는 각각 25% 그리고 분화된 MSC가 포획된 운반체에 대해서는 45%까지 골부피가 증가되었다(도 8b). 골 표면적 및 골 표면밀도 또한 MSC를 포함하는 운반체의 골형성 분화에 대한 효율성을 나타내었다(도 8c 및 8d).
신생 골형성 및 결손 봉합(defect closure)을 H&E 및 MT 염색 후 조직학적 관점에서 재확인하고 그 결과를 도 9에 나타내었다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 3개 군 모두 염증성 세포의 눈에 띠는 증상 없이 우수한 생체적합성을 나타내었다. H&E 염색은 결손 부위에서 안으로 성장하는(in-growth) 세포 및/또는 조직을 나타내었다. MT 염색은 결손 부위 내에 새롭게 형성된 뼈를 보다 명확히 나타내었다. 운반체를 단독으로 처리한 실험군은 가장자리에서 제한된 양의 신생 골형성을 포함하는 결손 내에 형성된 느슨한 결합조직이 관찰되었다(도 9a). 반대로, 미분화된 MSC를 운반체 내에 포획시킨 경우 신생 골형성(NB로 표시) 수준은 결손의 중심에서 관찰되었다(도 9b). 분화된 MSC를 포함하는 운반체를 사용한 실험군에서는 결손의 중심 부분에서 현저한 수준의 새롭게 형성된 뼈가 관찰되었다(도 9c). (c)에서 새롭게 형성된 뼈의 보다 높은 배율에서 신생 뼈가 조밀한 구조로 성숙되고 많은 조골세포로 배열되었음을 증명하였다(도 9d).
<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Dankook University
<120> Core-shell fibrous cell carrier and composition for regeneration
of bone or cartilage comprising the same
<130> PA130406/KR
<160> 8
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> OCN forward primer
<400> 1
aggaccctct ctctgctcac 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> OCN reverse primer
<400> 2
aacggtggtg ccatagatgc 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BSP forward primer
<400> 3
ctgctttaat cttgctctg 19
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BSP reverse primer
<400> 4
ccatctccat tttcttcc 18
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> OPN forward primer
<400> 5
tccagctgac ttgactcatg g 21
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> OPN reverse primer
<400> 6
ccgatgaatc tgatgagtcc tt 22
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAPDH forward primer
<400> 7
ccatgtttgt gatgggtgtg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAPDH reverse primer
<400> 8
ggatgcaggg atgatgttct 20
Claims (12)
- 세포 및 콜라겐을 포함하는 코어; 및
알지네이트를 포함하는 쉘
을 포함하는 코어-쉘 섬유상 세포전달체.
- 제1항에 있어서,
상기 코어는 100 μm 내지 1500 μm의 직경을 갖는 것인 세포전달체.
- 제1항에 있어서,
상기 쉘은 100 μm 내지 250 μm의 두께를 갖는 것인 세포전달체.
- 제1항에 있어서,
상기 코어는 코어 총 중량에 대해여 콜라겐을 0.5 내지 5 중량% 포함하는 것이 특징인 세포전달체.
- 제1항에 있어서,
상기 쉘은 쉘 총 중량에 대해여 알지네이트를 2 내지 5 중량% 포함하는 것이 특징인 세포전달체.
- 중심을 공유하는 서로 다른 직경의 바늘을 통해 내부 바늘로부터는 세포와 콜라겐을 포함하는 코어물질을, 외부 바늘로부터는 알지네이트를 포함하는 쉘물질을 가교제를 포함하는 수조에 일정한 속도로 주입하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 코어-쉘 섬유상 세포전달체의 제조방법.
- 제6항에 있어서,
상기 속도는 20 내지 80 ml/h인 것이 특징인 제조방법.
- 제6항에 있어서,
상기 가교제는 염화칼슘인 것인 제조방법.
- 제8항에 있어서,
상기 염화칼슘은 5 mM 내지 50 mM의 농도인 것인 제조방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 코어-쉘 섬유상 세포전달체를 포함하는 골조직 또는 연골조직 재생용 조성물.
- 제10항에 있어서,
상기 세포전달체는 미분화 줄기세포를 포함하거나, 골 또는 연골세포를 포함하는 것이 특징인 조성물.
- 제11항에 있어서,
상기 골 또는 연골세포를 포함하는 세포전달체는 골 또는 연골세포를 이용하여 제조하거나, 미분화 줄기세포를 이용하여 제조한 세포전달체를 골 또는 연골 분화배지에서 2 내지 15일 동안 분화시켜 제조하는 것이 특징인 조성물.
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