CN115044530B - 一种工程化微载体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本申请涉及细胞培养的技术领域，具体公开了一种工程化微载体及其制备方法和应用。上述工程化微载体包括：位于中心的海藻酸钠微球、包覆于海藻酸钠微球外部的黄芪多糖层以及包覆于黄芪多糖层外部的PDGF‑BB层。同时，本申请还提供了上述工程化微载体的制备方法以及在细胞培养领域的应用。利用本申请提供的工程化微载体用于细胞培养能够有效提高细胞的扩增倍数。

Description

一种工程化微载体及其制备方法和应用

技术领域

本申请涉及细胞培养的技术领域，具体公开了一种工程化微载体及其制备方法和应用。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)来源广泛，是一种自我更新能力强且能够分化成多种类型的成体细胞，其自身具有免疫调节能力，不易引发免疫排斥反应，在干细胞功能分化研究和临床应用中具有巨大应用前景和应用潜力。然而，MSC原始含量很少，需要进行体外大规模扩增培养才能满足临床治疗对MSC的需求。

在过去的几十年里，利用传统的二维细胞培养工艺扩增培养MSC，是大规模扩增MSC较为广泛的方式。但是，二维细胞培养工艺不能准确模拟生物体内丰富的环境和复杂的扩增过程，如细胞信号转导、化学梯度或空间结构变化等，使得细胞培养过程中收集的数据准确度较低。另外，二维细胞培养工艺扩增获得的细胞扩增倍数较少，细胞之间的均一性较差。因此，传统的二维细胞培养方式不能满足MSC培养日益增长的研究和应用需求。

基于微载体的三维(3D)细胞培养技术能够较好地模拟生物体内细胞存活的自然环境，促进细胞的贴壁与增殖。相对于二维细胞培养方式，将上述3D细胞培养技术用于细胞培养时，获得的细胞的扩增倍数更高，以满足细胞的大规模扩增。然而，将3D细胞培养技术用于MSC扩增培养的关键因素是微载体的选择。但是，我国目前使用的商品化微载体均为进口产品，价格昂贵，使得我国MSC培养技术从传统的二维细胞培养向3D细胞培养转型受到了限制。

发明内容

为了进一步提高培养获得的细胞的扩增倍数，本申请提供一种工程化微载体及其制备方法和应用。

第一方面，本申请提供一种工程化微载体，采用如下的技术方案：

一种工程化微载体，所述工程化微载体包括：位于中心的海藻酸钠微球、包覆于海藻酸钠微球外部的黄芪多糖层以及包覆于黄芪多糖层外部的PDGF-BB层。

本申请提供的技术方案，以海藻酸钠微球为中心，将黄芪多糖层作为中间层包覆在海藻酸钠微球外部，然后将人血小板源生长因子(PDGF-BB)层作为外层包覆在黄芪多糖层外部，制备得到工程化微载体。其中，方案中使用的黄芪多糖能够促进各类血细胞的生成、发育及成熟过程，具有刺激骨髓造血功能和增强免疫功能的作用；PDGF-BB可以与MSC表面受体结合，激活信号通路，具有细胞增殖的作用。本申请将黄芪多糖层包覆在海藻酸钠微球外部，然后将PDGF-BB层包覆在黄芪多糖层外部，制备的工程化微载体可以用于MSC的三维培养，有利于增强细胞的贴壁与增殖能力，能够提高MSC的培养效果，从而有效提高细胞的扩增倍数。

经过试验分析可知，相比于采用二维细胞培养工艺培养MSC，或者利用商品化的微载体cytodex用于三维培养MSC，选择使用本申请提供的工程化微载体用于三维培养MSC，细胞的扩增倍数能够获得明显提高。

另外，相比于对海藻酸钠微球仅包被黄芪多糖层，或者对海藻酸钠微球仅包被PDGF-BB层，再或者先将PDGF-BB层包覆在海藻酸钠微球外部，然后将黄芪多糖层包覆在PDGF-BB层外部，本申请选择使用先将黄芪多糖层包覆在海藻酸钠微球外部，然后将PDGF-BB层包覆在黄芪多糖层外部，制备得到的工程化微载体用于MSC的三维培养时，能够有效提高细胞的扩增倍数。因此，本申请采用先将黄芪多糖层包覆在海藻酸钠微球外部，然后将PDGF-BB层包覆在黄芪多糖层外部，制备得到工程化微载体，用于大规模扩增MSC。

第二方面，本申请还提供了上述工程化微载体的制备方法，具体包括以下步骤：

(1)利用海藻酸钠溶液和氯化钙溶液进行交联反应，得到所述海藻酸钠微球；

(2)将明胶溶液与黄芪多糖溶液混合均匀制得混合溶液，将步骤(1)所述海藻酸钠微球加入到所述混合溶液中，进行包被反应，得到中间体；

(3)将步骤(2)所述中间体加入到PDGF-BB溶液中，进行包被反应，得到所述工程化微载体。

本申请中，通过海藻酸钠与氯化钙的交联反应得到海藻酸钠微球，随后使用明胶与黄芪多糖的混合溶液对海藻酸钠微球进行包被，得到中间体，然后用PDGF-BB对中间体进行包覆，即可获得工程化微载体。其中，明胶具有生物可降解性以及具有与胶原相同的组分和生物性质，且无免疫原性有利于增强细胞的黏附作用，且能够提高黄芪多糖对海藻酸钠微球的包被效果。本申请提供的制备方法可以适应于规模化生产工艺，连续生产尺寸均一的微载体，具有良好的生物相容性及细胞黏附性，能够促进细胞的黏附、生长和增殖，从而能够快速且大规模地生产细胞。

经过试验分析可知，相比于使用不含黄芪多糖的明胶对海藻酸钠微球进行中间层包被，选择使用含有黄芪多糖的明胶对海藻酸钠微球进行中间层包被，制备得到的工程化微载体用于MSC的三维培养时，能够有效提高细胞的扩增倍数。因此，本申请采用含有黄芪多糖的明胶对海藻酸钠微球进行中间层包被，制备得到工程化微载体。

在一个具体的实施方式中，所述海藻酸钠溶液的质量浓度为50mg/mL。

在一个具体的实施方式中，所述氯化钙溶液的质量浓度为100mg/mL。

在一个具体的实施方式中，所述明胶溶液的质量浓度为50mg/mL。

优选的，所述黄芪多糖溶液的质量浓度为0.03-0.10mg/mL。

优选的，所述黄芪多糖溶液的质量浓度为0.05-0.08mg/mL。

在一个具体的实施方式中，所述黄芪多糖溶液的质量浓度可以为0.03mg/mL、0.05mg/mL、0.07mg/mL、0.08mg/mL、0.10mg/mL。

在一些具体的实施方式中，所述黄芪多糖溶液的质量浓度还可以为0.03-0.05mg/mL、0.03-0.07mg/mL、0.03-0.08mg/mL、0.05-0.07mg/mL、0.05-0.10mg/mL、0.07-0.08mg/mL、0.07-0.10mg/mL、0.08-0.10mg/mL。

经过试验分析可知，当控制黄芪多糖溶液的质量浓度在上述范围内时，制备得到的工程化微载体用于MSC的三维培养时，能够进一步有效提高细胞的扩增倍数。因此，本申请将黄芪多糖溶液的质量浓度控制在上述范围内。

进一步地，所述明胶溶液与所述黄芪多糖溶液的体积比为1：(0.3-3)。

进一步地，所述明胶溶液与所述黄芪多糖溶液的体积比为1：(1.5-2.5)。

在一个具体的实施方式中，所述明胶溶液与黄芪多糖溶液的体积比可以为1：0.3、1：1、1：1.5、1：2.5、1：3。

在一些具体的实施方式中，所述明胶溶液与黄芪多糖溶液的体积比还可以为1：(0.3-1)、1：(0.3-1.5)、1：(0.3-2.5)、1：(1-1.5)、1：(1-2.5)、1：(1-3)、1：(1.5-3)、1：(2.5-3)。

经过试验分析可知，当控制明胶溶液与黄芪多糖溶液的体积比在上述范围内时，制备得到的工程化微载体用于MSC的三维培养时，能够更进一步有效提高细胞的扩增倍数。因此，本申请将明胶溶液与黄芪多糖溶液的体积比控制在上述范围内。

优选地，所述PDGF-BB溶液的质量浓度为(2-8)×10^-4mg/mL。

进一步地，所述PDGF-BB溶液的质量浓度为(3-7)×10^-4mg/mL。

在一个具体的实施方式中，所述PDGF-BB溶液的质量浓度可以为2×10^-4mg/mL、3×10^-4mg/mL、5×10^-4mg/mL、7×10^-4mg/mL、8×10^-4mg/mL。

在一些具体的实施方式中，所述PDGF-BB溶液的质量浓度还可以为(2-3)×10^-4mg/mL、(2-5)×10^-4mg/mL、(2-7)×10^-4mg/mL、(3-5)×10^-4mg/mL、(3-8)×10^-4mg/mL、(5-7)×10^-4mg/mL、(5-8)×10^-4mg/mL、(7-8)×10^-4mg/mL。

经过试验分析可知，当控制PDGF-BB溶液的质量浓度在上述范围内时，制备得到的工程化微载体用于MSC的三维培养时，能够再进一步有效提高细胞的扩增倍数。因此，本申请将PDGF-BB溶液的质量浓度控制在上述范围内。

进一步地，所述步骤(1)中交联反应的反应条件为：反应温度20-30℃；搅拌速度400-600rpm；反应时间0.3-1h。

进一步地，所述步骤(2)中包被反应的反应条件为：反应温度20-30℃；搅拌速度400-600rpm；反应时间3-5h。

进一步地，所述步骤(3)中包被反应的反应条件为：反应温度20-30℃；搅拌速度400-600rpm；反应时间1-3h。

第三方面，本申请还提供了上述工程化微载体在细胞培养领域中的应用。

综上所述，本申请的技术方案具有以下效果：

本申请以海藻酸钠微球为中心，将黄芪多糖层作为中间层包覆在海藻酸钠微球外部，然后将PDGF-BB层作为外层包覆在黄芪多糖层外部，制备得到的工程化微载体的形状为球形、尺寸较为均一、直径在微米级别。

同时，本申请提供的微载体能够很好地模拟生物体内细胞存活的自然环境，促进细胞的贴壁与增殖，用于细胞三维培养，能够有效提高细胞的扩增倍数。

利用本申请提供的工程化微载体三维培养MSC的表型正常，表明本申请提供的工程化微载体适合于细胞的三维培养。

附图说明

图1为本申请实施例4提供的工程化微载体的形貌图。

具体实施方式

本申请提供了一种工程化微载体，具体包括：位于中心的海藻酸钠微球、包覆于海藻酸钠微球外部的黄芪多糖层以及包覆于黄芪多糖层外部的PDGF-BB层。

本申请还提供了上述工程化微载体的制备方法，具体包括以下步骤：

(1)将海藻酸钠溶液以15mL/min的速度滴加到氯化钙溶液中，进行交联反应0.5h，反应结束后水洗，得到海藻酸钠微球。

其中，海藻酸钠溶液的质量浓度为50mg/mL。氯化钙溶液的质量浓度为100mg/mL。海藻酸钠溶液与氯化钙溶液的体积比为1：1。

(2)将明胶溶液与黄芪多糖溶液混合均匀制得混合溶液，将步骤(2)中的海藻酸钠微球加入到混合溶液中，进行包被反应4h，反应结束后水洗，得到中间体。

其中，明胶溶液的质量浓度为50mg/mL。

黄芪多糖溶液的质量浓度为0.03-0.10mg/mL。进一步地，黄芪多糖溶液的质量浓度为0.05-0.08mg/mL。

明胶溶液与黄芪多糖溶液的体积比为1：(0.3-3)。进一步地，明胶溶液与黄芪多糖溶液的体积比为1：(1.5-2.5)。

同时，海藻酸钠微球与明胶溶液和黄芪多糖溶液的混合溶液的体积比为1：50。

(3)将步骤(3)中的中间体加入到PDGF-BB溶液中，进行包被反应2h，反应结束后水洗，得到工程化微载体。

其中，PDGF-BB溶液的质量浓度为(2-8)×10^-4mg/mL。进一步地，PDGF-BB溶液的质量浓度为(3-7)×10^-4mg/mL。

同时，步骤(2)中的中间体与PDGF-BB溶液的体积比为2：50。

上述制备方法中，海藻酸钠溶液、氯化钙溶液、明胶溶液、黄芪多糖溶液以及PDGF-BB溶液均为水溶液，且于高压灭菌锅内进行高压灭菌，灭菌条件为：121℃，20min。

另外，步骤(1)中的反应条件为：反应温度20-30℃、搅拌速度400-600rpm、反应时间为0.3-1h；步骤(2)中的反应条件为：反应温度20-30℃、搅拌速度400-600rpm、反应时间3-5h；步骤(3)中的反应条件为：反应温度20-30℃、搅拌速度400-600rpm、反应时间1-3h。

本申请还提供了上述工程化微载体在细胞培养领域中的应用。

以下结合实施例1-19、对比例1-6、附图1以及性能检测试验对本申请作进一步详细描述，这些实施例不能理解为限制本申请所要求保护的范围。

实施例

实施例1-7

实施例1-7分别提供了一种工程化微载体。

上述各实施例的不同之处在于：工程化微载体制备方法中黄芪多糖溶液的质量浓度，具体如表1所示。

上述各实施例的制备方法具体包括以下步骤：

首先，将海藻酸钠、氯化钙、明胶、黄芪多糖以及PDGF-BB分别溶解于去离子水中，配置成相应浓度的海藻酸钠溶液、氯化钙溶液、明胶溶液、黄芪多糖溶液以及PDGF-BB溶液，然后将配置好的溶液置于高压灭菌锅内，于121℃灭菌20min，灭菌后的溶液备用；

(1)在温度为25℃、搅拌速度为500rpm的条件下，取100mL质量浓度为50mg/mL的海藻酸钠溶液与100mL质量浓度为100mg/mL的氯化钙溶液，然后将海藻酸钠溶液以15mL/min的速度滴加到氯化钙溶液中，进行交联反应0.5h，反应结束后水洗，得到海藻酸钠微球；

(2)在温度为25℃、搅拌速度为500rpm的条件下，取100mL质量浓度为50mg/mL的明胶溶液与150mL的黄芪多糖溶液，混合均匀制得混合溶液，将步骤(1)中5mL的海藻酸钠微球加入到混合溶液中，进行包被反应4h，反应结束后水洗，得到中间体；

(3)在温度为25℃、搅拌速度为500rpm的条件下，将步骤(2)中4mL的中间体加入到100mL质量浓度为5×10^-4mg/mL的PDGF-BB溶液中，进行包被反应2h，反应结束后水洗，得到工程化微载体。

表1实施例1-7中黄芪多糖层与PDGF-BB层中各原料的添加情况

实施例8-13

实施例8-13分别提供了一种工程化微载体。

上述各实施例与实施例4的不同之处在于：工程化微载体制备方法中明胶溶液与黄芪多糖溶液的体积比，具体如表2所示。

表2实施例4、8-13中黄芪多糖层与PDGF-BB层中各原料的添加情况

实施例14-19

实施例14-19分别提供了一种工程化微载体。

上述各实施例与实施例4的不同之处在于：工程化微载体制备方法中PDGF-BB溶液的质量浓度，具体如表3所示。

表3实施例4、14-19中中黄芪多糖层与PDGF-BB层中各原料的添加情况

对比例

对比例1

对比例1提供了一种工程化微载体。

本对比例与实施例4的不同之处在于：工程化微载体制备方法中对海藻酸钠微球仅包被黄芪多糖层，具体包括以下步骤：

(1)将海藻酸钠、氯化钙、明胶以及黄芪多糖分别溶解于去离子水中，配置质量浓度为50mg/mL的海藻酸钠溶液、质量浓度为100mg/mL的氯化钙溶液、质量浓度为50mg/mL的明胶溶液以及质量浓度为0.07mg/mL的黄芪多糖溶液，然后将配置好的溶液置于高压灭菌锅内，于121℃灭菌20min，灭菌后的溶液备用；

(2)在温度为25℃、搅拌速度500rpm的条件下，取100mL海藻酸钠溶液与100mL氯化钙溶液，然后将海藻酸钠溶液以15mL/min的速度滴加到氯化钙溶液中，进行交联反应0.5h，反应结束后水洗，得到海藻酸钠微球；

(3)在温度为25℃、搅拌速度500rpm的条件下，取100mL明胶溶液与150mL黄芪多糖溶液，混合均匀制得混合溶液，将步骤(1)中5mL的海藻酸钠微球加入到混合溶液中，进行包被反应4h，反应结束后水洗，得到黄芪多糖层包被的海藻酸钠微球，即为工程化微载体。

对比例2

对比例2提供了一种工程化微载体。

本对比例与实施例4的不同之处在于：工程化微载体制备方法中对海藻酸钠微球仅包被PDGF-BB层，具体包括以下步骤：

(1)将海藻酸钠、氯化钙以及PDGF-BB分别溶解于去离子水中，配置质量浓度为50mg/mL的海藻酸钠溶液、质量浓度为100mg/mL的氯化钙溶液以及质量浓度为5×10^-4mg/mL的PDGF-BB溶液，然后将配置好的溶液置于高压灭菌锅内，于121℃灭菌20min，灭菌后的溶液备用；

(2)在温度为25℃、搅拌速度500rpm的条件下，取100mL海藻酸钠溶液与100mL氯化钙溶液，然后将海藻酸钠溶液以15mL/min的速度滴加到氯化钙溶液中，进行交联反应0.5h，反应结束后水洗，得到海藻酸钠微球；

(3)在温度为25℃、搅拌速度500rpm的条件下，取步骤(2)中4mL的海藻酸钠微球加入到100mL的PDGF-BB溶液中，进行包被反应2h，反应结束后水洗，得到工程化微载体。

对比例3

对比例3提供了一种工程化微载体。

本对比例与实施例4的不同之处在于：工程化微载体制备方法中先将PDGF-BB层包覆在海藻酸钠微球外部，然后将黄芪多糖层包覆在PDGF-BB层外部，具体包括以下步骤：

(1)将海藻酸钠、氯化钙、明胶、黄芪多糖以及PDGF-BB分别溶解于去离子水中，配置质量浓度为50mg/mL的海藻酸钠溶液、质量浓度为100mg/mL的氯化钙溶液、质量浓度为50mg/mL的明胶溶液、质量浓度为0.07mg/mL的黄芪多糖溶液以及质量浓度为5×10^-4mg/mL的PDGF-BB溶液，然后将配置好的溶液置于高压灭菌锅内，于121℃灭菌20min，灭菌后的溶液备用；

(2)在温度为25℃、搅拌速度500rpm的条件下，取100mL海藻酸钠溶液与100mL氯化钙溶液，然后将海藻酸钠溶液以15mL/min的速度滴加到氯化钙溶液中，进行交联反应0.5h，反应结束后水洗，得到海藻酸钠微球；

(3)在温度为25℃、搅拌速度500rpm的条件下，取步骤(2)中4mL的海藻酸钠微球加入到100mL的PDGF-BB溶液中，进行包被反应2h，反应结束后水洗，得到中间体；

(4)在温度为25℃、搅拌速度500rpm的条件下，取100mL明胶溶液与150mL黄芪多糖溶液，混合均匀制得混合溶液，将步骤(3)中5mL的中间体加入到混合溶液中，进行包被反应4h，反应结束后水洗，得到黄芪多糖层包被的海藻酸钠微球，即为工程化微载体。

对比例4

对比例4提供了一种工程化微载体。

本对比例与实施例4的不同之处在于：工程化微载体制备方法中步骤(3)中使用不含黄芪多糖的明胶对海藻酸钠微球进行中间层包被，具体包括以下步骤：

(1)将海藻酸钠、氯化钙、明胶以及PDGF-BB分别溶解于去离子水中，配置质量浓度为50mg/mL的海藻酸钠溶液、质量浓度为100mg/mL的氯化钙溶液、质量浓度为50mg/mL的明胶溶液、以及质量浓度为5×10^-4mg/mL的PDGF-BB溶液，然后将配置好的溶液置于高压灭菌锅内，于121℃灭菌20min，灭菌后的溶液备用；

(2)在温度为25℃、搅拌速度500rpm的条件下，取100mL海藻酸钠溶液与100mL氯化钙溶液，然后将海藻酸钠溶液以15mL/min的速度滴加到氯化钙溶液中，进行交联反应0.5h，反应结束后水洗，制备得到海藻酸钠微球；

(3)在温度为25℃、搅拌速度500rpm的条件下，取步骤(2)中2mL的海藻酸钠微球加入到100mL明胶溶液中，进行包被反应4h，反应结束后水洗，制备得到中间体；

(4)在温度为25℃、搅拌速度500rpm的条件下，将步骤(3)中4mL的中间体加入到100mL的PDGF-BB溶液中，进行包被反应2h，反应结束后水洗，制备得到工程化微载体。

对比例5

对比例5提供了一种微载体。

本对比例提供的微载体为商品化Cytodex微载体，购买自上海西格生物科技有限公司。

对比例6

对比例6提供了一种人间充质干细胞无血清培养基。

本对比例提供的人间充质干细胞无血清培养基，购买自上海埃泽思生物科技有限公司。

性能检测试验

一、形貌检测

以实施例4提供的工程化微载体为检测对象，用倒置显微镜对工程化微载体的形貌进行观察。

检测结果如图1所示。

图1为实施例4提供的工程化微载体的形貌图。

由图1可知，实施例4提供的工程化微载体的形状为球形，直径为300-500μm，表明本申请提供的工程化微载体是三维结构，直径在微米级别。同时，本申请提供的微载体能够很好地模拟生物体内细胞存活的自然环境，促进细胞的贴壁与增殖。因此，本申请提供的微载体可以用于MSC三维培养，且能够实现更高的扩增倍数，从而满足细胞大规模的制造。

二、细胞培养效果检测

以实施例1-19、对比例1-6培养后的细胞为检测对象，检测细胞扩增倍数。

检测方法如下：

(1)MSC细胞复苏：从液氮中取出冻存的MSC细胞，迅速将冻存管放入37℃水浴快速融解；在生物安全柜或超净台中，将解冻后的细胞悬液缓慢加入5mL对比例6提供的人间充质干细胞培养基；1000rpm离心3min，吸掉上清，加入10mL人间充质干细胞培养基重悬细胞；将细胞均匀铺到培养皿中，置于5％CO₂的37℃恒温细胞培养箱中培养24h后观察细胞状态；更换新鲜的对比例6提供的人间充质干细胞培养基继续培养，在显微镜下观察细胞，当细胞融合度达到90％，即可进行细胞培养。

(2)MSC细胞培养：在超净台中，吸掉原有培养基，加入pH为7.2的PBS缓冲液清洗一次，加入5mL Xeno-Free细胞消化液，使之完全覆盖瓶底；37℃孵育3min，显微镜下观察大部分细胞脱离皿底即停止消化；加入10mL人间充质干细胞培养基，用移液器轻轻吹打瓶壁上未完全脱离的细胞，并轻轻吹打混匀，使细胞完全分散；将细胞悬液转移到15mL离心管中，1000rpm离心3min，弃上清，备用。

①三维培养MSC：

在无菌条件下，取实施例1-19、对比例1-5提供的微载体10mL倒入玻璃瓶中，加入对比例6提供的人间充质干细胞无血清培养基50mL，搅拌均匀，静置4h，然后按照1.5×10⁵/mL的密度接种MSC，重悬细胞，初始细胞总数计为X₁，然后置于37℃，5％CO₂培养箱中培养，每天取样观察细胞生长情况，待细胞长满后，消化计数。

②二维培养MSC：

在无菌条件下，取对比例6提供的人间充质干细胞培养基50mL，加入10mL PBS缓冲液，然后按照1.5×10⁵/mL的密度接种MSC，重悬细胞，初始细胞总数计为X₁，然后置于37℃，5％CO₂培养箱中培养，每天取样观察细胞生长情况，待细胞长满后，消化计数。

(3)台盼蓝计数法测定细胞数量：取培养后的0.5mL细胞悬液放入小试管里，再加0.4％台盼蓝染液0.5mL，用吸管轻轻吹打混匀，染色3min，然后把悬液摇匀，吸取悬液滴在血球计数板上，置于显微镜下观察，并对细胞进行计数，计为X₂。

(4)细胞扩增倍数如下所示：

其中：

X₁表示MSC培养过程中，初始接种细胞数量；

X₂表示MSC培养结束后的细胞数量。

检测结果如表4所示。

表4细胞培养的扩增倍数

结合表4，通过对比实施例1-19、对比例1-6的检测结果可知，本申请以海藻酸钠微球为中心，将黄芪多糖层作为中间层包覆在海藻酸钠微球外部，然后将PDGF-BB层作为外层包覆在黄芪多糖层外部，制备得到工程化微载体。将上述工程化微载体用于MSC的三维培养时，能够有效提高细胞的扩增倍数。表明本申请提供的工程化微载体具有良好的细胞贴壁与增殖的能力，能够提高MSC的培养效果，从而在3D细胞培养可以实现更高的扩增倍数。

通过对比实施例1-19、对比例5-6的检测结果可知，对比例6中采用人间充质干细胞无血清培养基用于MSC二维培养的细胞扩增倍数为3倍；对比例5中采用商品化的微载体cytodex用于MSC三维培养的细胞扩增倍数为6倍；而实施例提供的工程化微载体用于MSC三维培养的细胞扩增倍数均大于7倍。因此，本申请提供的工程化微载体用于MSC的三维培养，能够有效提高细胞的扩增倍数。

通过对比实施例4、对比例1-3的检测结果可知，相比于对海藻酸钠微球仅包被黄芪多糖层，或者对海藻酸钠微球仅包被PDGF-BB层，再或者先将PDGF-BB层包覆在海藻酸钠微球外部，然后将黄芪多糖层包覆在PDGF-BB层外部，本申请选择先将黄芪多糖层包覆在海藻酸钠微球外部，然后将PDGF-BB层包覆在黄芪多糖层外部，制备得到的工程化微载体用于MSC的三维培养时，能够有效提高细胞的扩增倍数。因此，本申请采用的技术方案先将黄芪多糖层包覆在海藻酸钠微球外部，然后将PDGF-BB层包覆在黄芪多糖层外部，制备得到工程化微载体。

通过对比实施例4、对比例4的检测结果可知，相比于使用不含黄芪多糖的明胶对海藻酸钠微球进行中间层包被，选择使用将含有黄芪多糖的明胶对海藻酸钠微球进行中间层包被，制备得到的工程化微载体用于MSC的三维培养时，能够有效提高细胞的扩增倍数。因此，本申请采用含有黄芪多糖的明胶对海藻酸钠微球进行中间层包被，制备得到工程化微载体。

通过对比实施例1-7的检测结果可知，在制备工程化微载体的过程中，经过试验分析可知，当控制黄芪多糖溶液的质量浓度在0.03-0.10mg/mL的范围内时，制备得到的工程化微载体用于MSC的三维培养时，能够进一步有效提高细胞的扩增倍数。因此，本申请将黄芪多糖溶液的质量浓度控制在上述范围内。进一步地，将黄芪多糖溶液的质量浓度控制在0.05-0.08mg/mL。

通过对比实施例4、8-13的检测结果可知，在制备工程化微载体的过程中，当控制明胶溶液与黄芪多糖溶液的体积比在1：(0.3-3)的范围内时，制备得到的工程化微载体应用于MSC的三维培养时，能够更进一步有效提高细胞的扩增倍数。因此，本申请将明胶溶液与黄芪多糖溶液的体积比控制在上述范围内。进一步地，将明胶溶液与黄芪多糖溶液的体积比控制在1：(1.5-2.5)。

通过对比实施例4、14-19的检测结果可知，在制备工程化微载体的过程中，当控制PDGF-BB溶液的质量浓度在(2-8)×10^-4mg/mL的范围内时，制备得到的工程化微载体用于MSC的三维培养时，能够再进一步有效提高细胞的扩增倍数。因此，本申请将PDGF-BB溶液的质量浓度控制在上述范围内。进一步地，将PDGF-BB溶液的质量浓度控制在(3-7)×10^-4mg/mL。

三、流式检测

以实施例4提供的工程化微载体为检测对象，将工程化微载体培养MSC后的细胞消化并收集用于流式检测。

检测方法如下：

将“性能检测试验二”中实施例4培养获得的MSC用PBS缓冲液悬浮，以10⁶/100uL加到1.5mL的PE管中，每个管中加入5uL的荧光标记的抗体，对照组加5uL的PBS缓冲液，4℃避光孵育30min，PBS缓冲液洗涤3次，1200rmp，离心5min，加入500uL的PBS缓冲液重悬细胞，转移到流式管中，上机检测。

检测结果如表5所示。

由表5可知，经工程化微载体培养后的MSC表型中，具体表现为CD90、CD29、CD105、CD73表达水平均在98％以上；CD45、CD19、CD14、HLA-DR、CD34表达水平均在3％以下，表明本申请提供的工程化微载体培养后的MSC表型中阳性marker表达水平均在98％以上，阴性marker表达水平均在3％以下。因此，利用本申请提供的工程化微载体培养后的MSC表型正常，表明本申请提供的工程化微载体适合于细胞的三维培养，且能够明显提高细胞的扩增倍数。

表5MSC表型中各指标表达水平

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.一种工程化微载体，其特征在于，所述工程化微载体包括位于中心的海藻酸钠微球、包覆于海藻酸钠微球外部的黄芪多糖层以及包覆于黄芪多糖层外部的PDGF-BB层；

所述的工程化微载体的制备方法，具体包括以下步骤：

（1）利用海藻酸钠溶液和氯化钙溶液进行交联反应，得到所述海藻酸钠微球；

（2）将质量浓度为50mg/mL的明胶溶液与质量浓度为0.03-0.10mg/mL的黄芪多糖溶液混合均匀制得混合溶液，将步骤（1）所述海藻酸钠微球加入到所述混合溶液中，进行包被反应，得到中间体；所述明胶溶液与所述黄芪多糖溶液的体积比为1：（0.3-3）；

（3）将步骤（2）所述中间体加入到质量浓度为（2-8）×10^-4mg/mL的PDGF-BB溶液中，进行包被反应，得到所述工程化微载体。

2.如权利要求1所述的工程化微载体的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

（1）利用海藻酸钠溶液和氯化钙溶液进行交联反应，得到所述海藻酸钠微球；

（2）将明胶溶液与黄芪多糖溶液混合均匀制得混合溶液，将步骤（1）所述海藻酸钠微球加入到所述混合溶液中，进行包被反应，得到中间体；

（3）将步骤（2）所述中间体加入到PDGF-BB溶液中，进行包被反应，得到所述工程化微载体。

3.根据权利要求2所述的工程化微载体的制备方法，其特征在于，所述黄芪多糖溶液的质量浓度为0.05-0.08mg/mL。

4.根据权利要求2所述的工程化微载体的制备方法，其特征在于，所述PDGF-BB溶液的质量浓度为（3-7）×10^-4mg/mL。

5.根据权利要求2所述的工程化微载体的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中包被反应的反应条件为：反应温度20-30℃；搅拌速度400-600rpm；反应时间3-5h。

6.根据权利要求2所述的工程化微载体的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中包被反应的反应条件为：反应温度20-30℃；搅拌速度400-600rpm；反应时间1-3h。

7.如权利要求1所述的工程化微载体在细胞培养领域中的应用。