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TWI596107B - 單株抗體之新穎純化方法 - Google Patents

單株抗體之新穎純化方法 Download PDF

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TWI596107B
TWI596107B TW103121726A TW103121726A TWI596107B TW I596107 B TWI596107 B TW I596107B TW 103121726 A TW103121726 A TW 103121726A TW 103121726 A TW103121726 A TW 103121726A TW I596107 B TWI596107 B TW I596107B
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桑吉夫 曼蒂羅塔
桑傑 班迪派德西
艾維納 辛格
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卡地拉保健有限公司
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Description

單株抗體之新穎純化方法
本發明提供一種由細胞培養物純化單株抗體的改良方法。所欲單株抗體的純化方法包含親和性、疏水性交互作用及任意地離子交換管柱層析。該方法提供所欲單株抗體的純度大於99%。
由細胞培養介質純化醫藥級單株抗體蛋白質包括收穫(harvest)/澄清(clarification)，接著藉由使用一系列與膜超過濾及透濾結合的管柱層析步驟進行純化。在純化過後，該所欲抗體製備物在合適條件下適當地配製及儲存。然而，在許多時候，這些步驟不會提供具有供其醫藥用途所需之所欲純度及品質等級的抗體。有時候，在管柱純化過程中會觀察到與過程相關及與產物相關的雜質會與該所欲抗體共同沖提(co-elute)。因此，從所欲製備物中減少或移除此種雜質是重要的。此外，蛋白質聚集物(aggregate)是單株抗體(mAb)製造期間主要的疑慮。聚集物的存在會減少單株抗體的療效，且已知會觸發人的免疫反應。因此，在下游純化過程中(主要藉由管柱層析)從所欲單株抗體的 製備物移除聚集物是必要的。為了解決這個問題，本發明提供抗體的新穎純化方法，其藉由使用特定方式之一系列之管柱層析，有助於由含有所關注抗體之無細胞培養介質中移除與過程及與產物相關之伴隨高分子量聚集物之雜質，以達到所欲等級。在本發明中，該抗體純化方法證明以簡易方式良好控制的純化方法會產生經高度純化之具有大於80%回收率的抗體製備物。在本發明中，該經高度純化之抗體製備物是指具有至少99%純度及實質上無與過程及與產物相關之雜質且基本上缺乏高分子量蛋白質聚集物的抗體製備物。此外，本發明提供可高度擴充(scalable)及可再現的單株抗體純化方法。該所述之新穎純化方法在方法經濟性及產業耐久性方面提供用於治療用途之多種抗體純化的共同平台。
以下專利揭示一些此種技術：US 6417335揭示由包含該抗體和污染物之組成物純化抗體的方法，該方法包含：(a)將該組成物填充至陽離子交換樹脂，其中填充至該陽離子交換樹脂的抗體量為每mL陽離子交換樹脂約20mg至約35mg的抗體，及(b)從該陽離子交換樹脂沖提該抗體。
US 7863426描述由包含抗體及至少一種HCP的混合物製造一種宿主細胞蛋白質-(HCP)減少之抗體製備物的方法，其包含離子交換分離步驟，其中該混合物經第一離子交換材料處理，因而取得該HCP-減少之抗體製備物。
本發明領域中的其他相關專利為US 6489447、EP 1075488、EP1308455、EP1308456B等。將其各者以整體引用方式併入。
本發明藉由以獨特方式使用傳統管柱層析技術提供抗體之新穎純化方法，以獲得經高度純化之所欲抗體的製備物，並同時移除與過程及與產物相關之雜質，尤其是蛋白質聚集物。我們在此揭示此種純化方法。
發明概要
本發明提供一種由衍生自粗質混合物之細胞培養物純化單株抗體的方法。
在一個態樣中，本發明提供一種由粗質混合物純化單株抗體的方法，其包含一系列的管柱層析及超過濾透濾步驟。
在另一個態樣中，本發明提供一種由粗質混合物純化單株抗體的方法，其包含使用蛋白質A親和性層析及疏水性交互作用層析步驟。可將蛋白質G或蛋白質L作為親和性層析步驟中的管柱基質。
在另外的態樣中，蛋白質A親和性層析步驟包括在適於進行結合的pH及/或導電度將含有所欲抗體之粗質混合物填充至管柱中，接著在沖提單峰形式之所欲抗體之前進行管柱沖洗。
在另一個態樣中，如本發明之方法包括三個管柱沖洗步驟，其中(i)以平衡緩衝液進行第一次沖洗；(ii)以與 該第一次沖洗緩衝液相同之pH和/或高於該第一次沖洗緩衝液之導電度進行第二次沖洗；(iii)以低於該第二次沖洗的pH和/或導電度進行第三次沖洗；(iv)以低於第三次沖洗的pH和/或高於第三次沖洗的導電度進行抗體的沖提。
在另一個態樣中，如本發明之疏水性交互作用層析以下降梯度(down-the-gradient)鹽濃度進行。
在另外的態樣中，本發明提供一種由粗質混合物純化單株抗體的方法，其包含蛋白質A層析、疏水性交互作用層析及離子交換管柱層析。
在又另一個態樣中，本發明提供一種由粗質混合物純化單株抗體的方法，其包含與超過濾透濾結合之蛋白質A層析、疏水性交互作用層析及離子交換管柱層析，以重調節(reconditioning)該蛋白質溶液。此處所稱之蛋白質溶液為含有蛋白質及該所欲抗體之混合物或經由此處所述之方法所獲得之所欲抗體之相對性純製備物。
在其他態樣中，如本發明之離子交換層析係選自陽離子交換層析及陰離子交換層析，較佳為陰離子交換層析。
在一較佳具例中，本發明提供一種單株抗體的純化方法，其包含以下步驟：
1.蛋白質A層析
2.疏水性交互作用層析
3.陰離子交換層析該疏水性交互作用層析及陰離子交換層析步驟可以任何順序進行。
蛋白質A管柱步驟有助於由粗質混合物捕獲該單株抗體及以高度純度之結合-沖提模式由該管柱沖提該所欲單株抗體。疏水性交互作用層析步驟係用於以結合-沖提模式進一步移除與過程及與產物相關之雜質。使用陰離子交換層析以流經模式(flow-through mode)進一步移除與過程相關之雜質。
在一個態樣中，可以本發明純化之抗體包括抗-HER2抗體、抗-TNF α抗體、抗-VEGF抗體、抗-CD20抗體、抗-CD52、抗-RANKL、抗-IgE抗體等。
在其他態樣中，本發明提供在蛋白質A親和性層析步驟之後聚集物的量不大於5%之抗體製備物。
在另一個態樣中，本發明提供聚集物的量不大於1%之抗體製備物，更佳為不大於0.5%。
本文中所使用之縮寫定義如下：蛋白質A：蛋白質A交聯瓊脂糖管柱。
HIC：疏水性交互作用管柱層析。
AEX：陰離子交換管柱層析。
HP-SEC：高效能-尺寸篩除層析。
MWCO：分子量篩截(Molecular weight cut-off)。
NaCl：氯化鈉。
WFI：供注射之水。
發明詳細說明
本發明描述藉由使用一系列的管柱層析步驟(包含與 超過濾及透濾結合之親和力管柱、疏水性交互作用管柱及離子交換管柱層析)之衍生自細胞培養物之單株抗體的純化方法。
在一個具體例中，本發明提供一種從粗質混合物中純化衍生自細胞培養物之單株抗體的方法，其藉由使用蛋白質A管柱層析先捕獲、且接著在低pH及任意的添加劑/鹽類存在下從該管柱沖提具有高度純度之蛋白質。除了該所關注蛋白質之外，粗質混合物可包括衍生自宿主細胞的污染蛋白質、與產物相關的物質及其他雜質。可將蛋白質G或蛋白質L作為該親和性層析步驟中的管柱基質。
在另一個具體例中，如本發明之方法包括三個管柱沖洗步驟，其中(i)以平衡緩衝液進行第一次沖洗；(ii)以與該第一次沖洗緩衝液相同之pH和/或高於該第一次沖洗緩衝液之導電度進行第二次沖洗；(iii)以低於該第二次沖洗的pH和/或導電度進行第三次沖洗；(iv)以低於第三次沖洗的pH和/或高於第三次沖洗的導電度進行抗體的沖提。
在一較佳具體例中，如本發明之管柱沖洗步驟包含：(i)以約pH7.4和/或導電度約20mS/cm(較佳介於1mS/cm至30mS/cm)之平衡緩衝液進行第一次沖洗；(ii)以約pH7.4和/或導電度高於20mS/cm進行第二次沖洗；(iii)以pH低於pH 7.4(較佳介於pH 5至pH 6.5)和/或導電度低於20mS/cm(較佳介於1mS/cm至5mS/cm)進行第三次沖洗；(iv)以約pH 3.5和/或導電度高於5mS/cm進行 抗體的沖提。
在一個具體例中，用於蛋白質A層析純化步驟的緩衝液成分係選自Tris、乙酸鹽及檸檬酸鹽緩衝液。
在一較佳具體例中，如本發明之抗體的沖提以介於約pH 3.5至4(較佳為3.5至3.7)的pH進行。
在一個具體例中，如本發明之方法包括選自氯化鈉、精胺酸、甘胺酸(較佳為氯化鈉)的添加劑/鹽類。
本發明亦證明在低緩衝液pH的條件且在鹽的存在下藉由蛋白質A管柱層析移除大部分的宿主細胞污染蛋白質，且同時將所關注蛋白質沖提出該管柱具有最大回收率。
在一個具體例中，本發明亦證明將所欲單株抗體從蛋白質A管柱沖提之後，在酸性pH條件下所欲單株抗體的分子完整度維持不變持續至少約1小時，如同分析性HP-SEC所評估。
在另一個具體例中，本發明提供藉由使用結合-沖提模式之疏水性交互作用管柱層析從所欲蛋白質部份移除殘留之與方法相關及與產物相關的雜質。該所欲蛋白質之沖提以主要波峰形式(form of a major peak)之下降梯度鹽濃度進行。
在另外的具體例中，用於疏水性交互作用層析的管柱基質係選自苯基瓊脂糖凝膠(sepharose)、丁基瓊脂糖凝膠、辛基瓊脂糖凝膠，較佳為苯基瓊脂糖凝膠。
在更多的具體例中，用於在疏水性交互作用層析步驟 中沖提該所欲蛋白質的鹽係選自硫酸銨、氯化鈉、氯化銨及硫酸鈉，較佳為硫酸銨。
在另一個具體例中，疏水性交互作用層析係以pH介於pH 5至pH 7和/或導電度高於100mS/cm進行。
在一個具體例中，如本發明之離子交換層析係選自陽離子交換層析及陰離子交換層析，較佳為陰離子交換層析。
在另一個具體例中，用於陰離子交換層析步驟的管柱基質係選自DEAE瓊脂糖凝膠、Mono Q及Q瓊脂糖凝膠XL，較佳為Q瓊脂糖凝膠。
在一個具體例中，本發明亦例示將所欲單株抗體以流經及沖洗模式(flow-through-and-wash mode)經由陰離子交換管柱層析或以結合沖提模式(bind-elute mode)經由陽離子交換層析進行純化。
在一較佳具體例中，衍生自細胞培養物之所欲單株抗體的純化係以下述進行：
1.蛋白質A層析
2.疏水性交互作用層析
3.陰離子交換層析
該疏水性及陰離子交換層析步驟可在該蛋白質A管柱層析步驟之後以任何順序進行。
在一較佳具體例中，衍生自細胞培養物之所欲單株抗體的純化係以下述進行：
1.蛋白質A層析
2.低pH培養
3.中和及重調節(reconditioning)
4.疏水性交互作用層析
5.超過濾透濾(Ultrafiltration-diafiltration)
6.陰離子交換層析
7.奈米過濾
8.超過濾透濾其中，該疏水性層析、超過濾透濾及陰離子交換層析步驟可在該蛋白質A層析步驟之後以任何順序進行。
在另外的具體例中，透濾介質係選自水、檸檬酸鹽緩衝液、磷酸鹽緩衝液、琥珀酸鹽緩衝液、乙酸鹽緩衝液及彼等之組合。
在一具體例中，如本發明之從管柱中回收抗體係以選自氯化鈉、精胺酸、甘胺酸(較佳為氯化鈉)的添加劑/鹽進行。
在一具體例中，如本發明之抗體整體回收率範圍不低於初始量的50%，較佳為不低於70%、更佳為介於85%至90%。
在一較佳具體例中，該抗體係選自抗-HER抗體、抗-TNF抗體、抗-VEGF抗體、抗-CD20抗體、抗-CD52抗體、抗-RANKL、抗-IgE抗體等。
在一更佳具體例中，該抗體係選自曲妥珠單抗(trastuzumab)、帕妥珠單抗(pertuzumab)、英夫利昔單抗(infliximab)、阿達木單抗(adalimumab)、貝伐單抗 (bevacizumab)、蘭尼單抗(ranibizumab)、利妥昔單抗(rituximab)、貝妥莫單抗(bectumomab)、依帕珠單抗(epratuzumab)等。
在另外具體例中，本發明提供在蛋白質A親和性層析步驟之後聚集物的含量不大於5%，較佳為不大於2%之經純化的抗體製備物。
在另一個具體例中，本發明提供聚集物的含量不大於1%，更佳為不大於0.5%之抗體製備物。
所欲單株抗體的純化方法包含以下步驟：
- 藉由離心及深度過濾進行細胞分離及培養物上清液的澄清，接著進行重調節(reconditioning)
- 蛋白質A管柱層析
- 低pH培養
- 中和及重調節
- 疏水性交互作用管柱層析
- 超過濾透濾
- 陰離子交換管柱層析
- 奈米過濾
- 超過濾透濾
- 微過濾。
如本發明純化步驟之更詳細說明如下：
I)蛋白質A管柱層析：
將含有所欲單株抗體及其他污染物之衍生自細胞培養 物的經澄清上清液填充至以pH接近中性的適當緩衝液平衡的蛋白質A管柱。該所欲單株抗體結合至親和力基質，而大部分的污染物在該流經物中通過該管柱。在沖提該所欲蛋白質之前，以複數沖洗步驟沖洗該管柱。在完成管柱填充之後以相同的平衡緩衝液進行第一次沖洗。以導電度高於該第一次沖洗緩衝液之相同pH緩衝液進行第二次沖洗。以與該第一及第二沖洗步驟之緩衝液pH和導電度不同的緩衝液進行第三次沖洗。以低於第三沖洗步驟之緩衝液的pH但高於第三沖洗步驟之緩衝液的導電度進行該所欲蛋白質的沖提。最後，以鹼性溶液進行管柱清洗。
II)疏水性交互作用管柱層析：
從含有至少一種不想要的污染物的混合物中純化所欲單株抗體蛋白質係藉由疏水性交互作用管柱層析以結合-沖提模式之進行。在完成蛋白質填充至該管柱之後，將所欲單株抗體以下降梯度(down-the-gradient)鹽濃度(亦即，以比該平衡緩衝液導電度低的導電度)自管柱沖提。該所欲單株抗體蛋白質的沖提以單一寬波峰的形式發生。以部分方式收集該經沖提蛋白質，且將含有該所欲純度的部分倒在一起。
III)陰離子交換管柱層析：
將含有該所欲單株抗體之蛋白質溶液實質重調節至符合陰離子交換管柱平衡條件的pH和導電度。將管柱以pH 約6.5之緩衝液平衡。將該所欲蛋白質在流經及沖洗部分(flow-through-and-wash fraction)中從該管柱回收。為了進行如本發明之陰離子交換層析，可使用的其他陰離子交換器係選自DEAE瓊脂糖凝膠、Mono Q、Q瓊脂糖凝膠XL等。本發明已使用陰離子交換器Q瓊脂糖凝膠。
分析性技術：分析性尺寸篩除層析(HP-SEC)係藉由使用在300mM NaCl存在下以pH 6.8之磷酸鈉緩衝液平衡的TSK-3000管柱進行。蛋白質以0.5mL/min之等度模式(isocratic-mode)沖提。
圖1例示經過蛋白質A親和力管柱層析之阿達木單抗(adalimumab)的沖提曲線(profile)。
圖2例示藉由分析性HP-尺寸篩除層析(HP-SEC)之經蛋白質A親和力純化之阿達木單抗的純度。該圖式顯示在第一管柱純化之後阿達木單抗之純度達到大於99%。
圖3例示經過疏水性交互作用管柱層析之阿達木單抗的沖提曲線。
圖4例示藉由分析性HP-尺寸篩除層析(HP-SEC)之經HIC純化之阿達木單抗的純度。該圖式顯示在第二管柱純化之後阿達木單抗之純度達到大於99%。
圖5例示該阿達木單抗的陰離子交換管柱層析曲線。
圖6例示藉由分析性HP-尺寸篩除層析(HP-SEC)之經AEX管柱純化之阿達木單抗的純度。該圖式顯示在AEX管柱純化之後阿達木單抗之純度達到大於99%。
圖7例示藉由分析性HP-尺寸篩除層析(HP-SEC)之經純化之阿達木單抗的純度。該圖式顯示在最終製備物之純化末端阿達木單抗之純度達到大於99%。
圖8例示藉由分析性HP-尺寸篩除層析(HP-SEC)之經HIC純化之利妥昔單抗(rituximab)的純度。該圖式顯示在第二管柱純化之後利妥昔單抗之純度達到大於99%。
圖9例示藉由分析性HP-尺寸篩除層析(HP-SEC)之經HIC純化之曲妥珠單抗(trastuzumab)的純度。該圖式顯示在第二管柱純化之後曲妥珠單抗之純度達到大於99%。
在此，以下列非限制性實例說明本發明，其不應被解釋為以任何方式限制發明的範圍：
實例1：阿達木單抗(抗-TNFα抗體)之純化 步驟1：細胞分離/澄清/重調節
在收穫該批次之後，將細胞由該培養液中分離，先藉由離心，接著藉由深度過濾(depth filtration)，以得到含有所關注蛋白質與其他可溶性污染物的清澈上清液。以10,000g×30分鐘進行離心。使用0.45→0.22μm膜進行深度過濾。重調節該經澄清之上清液以針對pH及導電度 調整成符合蛋白質A管柱平衡緩衝液條件。
步驟2：蛋白質A管柱層析
在重調節之後該經澄清上清液通過蛋白質A親和力管柱以藉由親和力基質捕獲阿達木單抗，接著將其於低pH由管柱沖提。在填充之前，將該管柱以導電度介於10-25mS/cm之pH 7.4的適當緩衝液平衡。隨後進行填充，將該管柱以相同緩衝液沖洗(第一次沖洗)。在該第一次沖洗步驟之後，將該管柱以pH 7.4之相同緩衝液但在較高導電度(>25mS/cm)下進行沖洗。以導電度介於1-5mS/cm之適當的pH 5.5緩衝液進行第三沖洗步驟。在該第三沖洗步驟之後，以導電度大於5mS/cm之適當的pH 3.5-3.7緩衝液進行該所欲蛋白質(阿達木單抗)的沖提，如圖1所示。當以圖2所示之分析性HP-SEC分析時，在此步驟之後所沖提之阿達木單抗呈現至少98%純度。
步驟3：低pH培養
將經蛋白質A管柱沖提之所欲蛋白質部分以相同的沖提pH條件在室溫條件下培養約45-60分鐘，以進行病毒去活化作用，在此之後將該蛋白質溶液通過0.22μm過濾器。
步驟4：中和及重調節(reconditioning)
在低pH處理之後，以控制方式添加鹼性溶液以進行中和步驟。藉由使用30kDa MWCO膜過濾器之UF/DF調整pH和導電度以重調節該蛋白質溶液至符合下一個管柱之平衡條件。為了調整導電度，將濃縮之硫酸銨溶液添加至該蛋白質溶液。在重調節之後，將蛋白質溶液通過0.22μm膜過濾器並填充至疏水性交互作用管柱。
步驟5：疏水性交互作用管柱層析
在重調節之後，使該含有阿達木單抗的蛋白質溶液通過疏水性交互作用層析基質、苯基瓊脂糖凝膠，以結合-沖提模式進行另外的純化。將該管柱以導電度大於90mS/cm之pH約6.5至pH 7.0的適當緩衝液進行平衡。在結合至該管柱基質之後，以具有下降的鹽梯度之相同緩衝液將阿達木單抗由該管柱沖提，如圖3所示。在此管柱步驟之後阿達木單抗之純度可達到大於99%，如同圖4所示之HP-SEC所評估。
步驟6：超過濾透濾(UF/DF)
重調節該經疏水性管柱沖提所集合的部分，隨後藉由使用30kDa MWCO膜過濾器的UF/DF抵抗pH 6.5之低離子強度Na-檸檬酸鹽緩衝溶液，以符合下一個管柱(Q管柱)步驟之平衡緩衝液條件(如，pH及導電度)。將經透濾之蛋白質溶液通過0.22μm之過濾器並填充至Q-管柱。
步驟7：陰離子交換管柱層析
將含有該所欲單株抗體之經透濾之蛋白質溶液以導電度低於10mS/cm之pH 6.5的適當緩衝液以流經及沖洗模式通過Q-瓊脂糖凝膠管柱，如圖5所示。在該Q-管柱步驟之後，可觀察到阿達木單抗的純度為>99%，如同圖6所示之HP-SEC所評估。
步驟8：奈米過濾
在該Q-管柱步驟之後，使含有該所欲單株抗體之蛋白質溶液進行奈米過濾步驟。在奈米過濾之後，可觀察到阿達木單抗的純度仍為大於99%。
步驟9：超過濾透濾
在奈米過濾之後，將蛋白質溶液以所欲介質透濾，以製備大批的藥品物質。
步驟10：微過濾
最後，將含有該所欲單株抗體之經純化製備物無菌地通過0.22μm膜過濾器，且可在冷的狀態下或冷凍狀態下以液態形式儲存。在最終製備物中蛋白質濃度變化可從1mg/mL至60mg/mL。該最終經純化的單株抗體阿達木單抗顯示出大於99%的純度，如同圖7所示之HP-SEC所評估。
實例2：利妥昔單抗(抗-CD20抗體)之純化
以實例1所述之方式進行抗-CD20抗體(利妥昔單抗)的純化方法。該最終經純化之單株抗體顯示出大於99%的純度，如同圖8所示之HP-SEC所評估。
實例3：曲妥珠單抗(抗-HER2抗體)之純化
以實例1所述之方式進行抗-HER2抗體(曲妥珠單抗)的純化方法。該最終經純化之單株抗體顯示出大於99%的純度，如同圖9所示之HP-SEC所評估。
接著可適當地調配該經純化之製備物，以做為供人使用之醫藥物質。

Claims (18)

  1. 一種由細胞培養物純化單株抗體之方法，其依序包含下列步驟：(a)蛋白質A親和性層析，其包含(i)以平衡緩衝液進行第一次沖洗；(ii)以與該第一次沖洗相同之pH和/或高於該第一次沖洗之導電度下進行第二次沖洗；(iii)以低於該第二次沖洗之pH和/或導電度下進行第三次沖洗；及(iv)以低於該第三次沖洗之pH和/或高於該第三次沖洗之導電度下進行沖提；(b)疏水性交互作用層析；及(c)陰離子交換層析；其中該單株抗體係選自阿達木單抗(adalimumab)、妥珠單抗(trastuzumab)或利妥昔單抗(rituximab)，且其中該經純化之單株抗體製備物含有不多於1%的聚集物。
  2. 如請求項1之方法，其中步驟(a)包含在進行結合的pH及/或導電度下將含有該單株抗體之粗質混合物填充至管柱中。
  3. 如請求項1之方法，其中該步驟(a)包含：(i)以約pH 7.4和/或導電度介於1mS/cm至30mS/cm之平衡緩衝液進行第一次沖洗；(ii)以約pH 7.4和/或導電度高於30mS/cm進行第二次沖洗；(iii)以pH介於pH 5至pH 6.5和/或導電度介於1mS/cm至5mS/cm進行第三次沖洗；及 (iv)以約pH 3.5和/或導電度高於5mS/cm進行沖提。
  4. 如請求項1之方法，其中該平衡緩衝液係選自Tris、醋酸鹽或檸檬酸鹽緩衝液。
  5. 如請求項1之方法，其中該沖提係在pH介於約pH 3.5至pH 4進行。
  6. 如請求項1之方法，其中該沖提係以該緩衝液中的添加劑進行，該添加劑係選自氯化鈉、精胺酸或甘胺酸。
  7. 如請求項1之方法，其中在步驟(a)後抗體製備物中聚集物的量係不大於5%。
  8. 如請求項1之方法，其中步驟(b)係以pH介於約pH 5至pH 7和/或導電度高於100mS/cm下進行。
  9. 如請求項1之方法，其中在步驟(b)中抗體係以下降梯度(down-the-gradient)鹽濃度模式沖提。
  10. 如請求項9之方法，其中該鹽係選自硫酸銨、氯化鈉、氯化銨或硫酸鈉。
  11. 如請求項1之方法，其中步驟(b)中疏水性交互作用基質係選自苯基瓊脂糖凝膠(sepharose)、丁基瓊脂糖凝膠或辛基瓊脂糖凝膠。
  12. 如請求項11之方法，其中該疏水性交互作用基質係苯基瓊脂糖凝膠。
  13. 如請求項1之方法，其中該用於陰離子交換層析之管柱基質係選自DEAE瓊脂糖凝膠、Mono Q或Q瓊脂 糖凝膠XL。
  14. 如請求項13之方法，其中該管柱基質係Q瓊脂糖凝膠XL。
  15. 如請求項1之方法，其中步驟(c)中單株抗體的沖提係以流經及沖洗模式(flow-through-and-wash mode)進行。
  16. 如請求項1之方法，其依序包含下列步驟：a)細胞分離b)蛋白質A親和性層析c)低pH培養d)中和及重調節(reconditioning)e)疏水性交互作用層析f)超過濾透濾(Ultrafiltration-diafiltration)g)陰離子交換層析h)奈米過濾i)超過濾透濾j)微過濾。
  17. 如請求項16之方法，其中透濾介質係選自磷酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽或彼等之組合。
  18. 如請求項1至17中任一項之方法，其中該單株抗體的整體回收率係介於初始量的85%至90%。
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