CN111153993B - 抗TNF-α单克隆抗体的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及抗TNF‑α单克隆抗体的制备方法，包括亲和层析，病毒灭活，深层过滤，阴离子交换层析，阳离子交换层析等步骤。本发明通过在亲和层析淋洗过程中增加缓冲液电导率，以及在阳离子交换层析淋洗过程中改变缓冲液的pH，提高了产品的纯度，同时得到了较高的总回收率。

Description

抗TNF-α单克隆抗体的制备方法

技术领域

本发明属于蛋白质纯化领域，具体而言涉及一种抗TNF-α单克隆抗体的制备或纯化方法。

背景技术

肿瘤坏死因子α(Tumor Necrosis Factorα，TNF-α)是一种促炎细胞因子，主要由巨噬细胞分泌，能促进淋巴细胞的浸润，加速T细胞的活化，其在正常的免疫应答中发挥抗感染和抗损伤的作用。然而，长期高水平的TNF-α与多种自身免疫疾病和炎症性疾的发生密切相关，如类风湿性关节炎、牛皮癣、克罗恩氏病、强直性脊柱炎和溃疡性结肠炎。TNF-α单克隆抗体能特异性地结合TNF-α，竞争性地阻断TNF-α与其受体结合，阻止其对免疫反应的调控及其对炎症的诱导作用，具有靶向性强、毒副作用低、高效等特点，因此在临床医疗中发挥重要的作用。目前，已有多种TNF-α单克隆抗体药物被批准用于自身免疫和炎症性疾病的治疗，包括英夫利昔单抗(infliximab)、戈利木单抗(golimumab)、阿达木单抗(adalimumab)、赛妥珠单抗(certolizumab pegol)。

单克隆抗体药物通常是利用经基因工程改造的能产生目的蛋白的哺乳动物细胞表达，如CHO、BHK细胞等，以确保获得期望的折叠和糖基化，所述基因工程包括将目的基因导入到该细胞系中。哺乳动物细胞培养过程中添加包含氨基酸、盐和生长因子等多种成分的培养基，宿主细胞自身产生的宿主蛋白(Host Cell Protein，HCP)和核酸等，导致细胞培养产物成分复杂；且单克隆抗体药物的分子量大、结构复杂，给制造工艺带来较大的困难。但为了确保抗体药物对人体的安全性，必须去除生产过程累积的污染物，保证抗体药物达到较高的纯度。抗体药物制造的下游工艺较复杂，任何不完善都可能造成极大的损失，因此建立有效的下游纯化工艺来增加单克隆抗体的产率和纯度是非常必要的。目前下游工艺常用的纯化手段包括亲和层析、阳离子交换层析、阴离子交换层析和疏水层析等，虽然生产中常采用这些层析方法，但是层析的具体条件、参数、填料选择的差异会产生完全不同的结果。

亲和层析作为单克隆抗体层析分离的重要手段，通常用来捕获细胞培养液中的产品。由于亲和层析材料可特异性吸附抗体，当抗体载量合适时，细胞培养液经过亲和层析后的产品往往可以达到较高的单体纯度，同时还能保证较高的回收率。如果能在亲和层析步骤中尽可能多的除去HCP和核酸等污染物，将会减轻后续色谱层析和深层过滤的压力，进而降低抗体的生产成本。

阳离子交换层析一般用于抗体的精纯，其主要作用是去除聚合物高分子量杂质，同时也能进一步去除HCP和核酸，提高单克隆抗体的纯度。本领域常规的做法是低浓度盐上样后选择适合浓度的盐竞争结合阳离子交换材料，从而将抗体洗脱下来，达到分离目的。对于抗体或抗体药物的分离而言，不仅需要尽可能多的降低HCP、核酸和聚合物高分子量杂质等的含量，还需要对电荷异构体进行分离。然而，常规的阳离子交换层析对于与目的蛋白电荷差异较小的酸碱性类似物的分离效果较差。为了解决上述问题，需要开发新的抗体纯化方法，提高抗体的纯度和质量。

发明内容

一方面本发明的目的包括提供一种可以提高单克隆抗体制品纯度的抗体纯化工艺。

另一方面，本发明的目的还在于提供一种纯化蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)细胞培养液深层过滤；

(b)亲和层析；

(c)病毒灭活；

(d)二次深层过滤；

(e)阴离子交换层析；

(f)阳离子交换层析；

(g)病毒过滤和/或超滤。

在一些具体实施方案中，所述(a)-(g)各步骤是依次进行的。

在一些实施方案中，亲和层析可以采用蛋白A亲和层析填料。在一些具体实施方案中，亲和层析包括但不限于消毒、平衡、上样、淋洗三次、洗脱等步骤。在一些具体实施方案中，亲和层析的淋洗步骤包括淋洗缓冲液电导率增加。例如，可以先用含150mM氯化钠的50mM Tris-乙酸缓冲液进行冲洗，再用含1M氯化钠的50mM乙酸钠-乙酸缓冲液进行淋洗，最后用50mM的乙酸钠-乙酸缓冲液进行淋洗。在一些具体实施方案中，亲和层析采用低pH缓冲液对抗体进行洗脱，例如采用pH＝3-4的缓冲液进行洗脱，优选用pH＝3.5的洗脱缓冲液进行洗脱。

在一些实施方案中，亲和层析采用Protein A亲和层析填料，其步骤包括：①平衡，采用含150mM氯化钠的50mM Tris-乙酸缓冲液进行平衡，pH＝7.4；②上样；③淋洗1，第一淋洗液采用含150mM氯化钠和50mM Tris-乙酸缓冲液，pH＝7.4；④淋洗2，第二淋洗液采用含1M氯化钠的50mM乙酸钠-乙酸缓冲液，pH＝5.0；⑤淋洗3，第三淋洗液采用50mM乙酸钠-乙酸缓冲液，pH＝5.0；⑥洗脱，洗脱液采用50mM乙酸钠-乙酸缓冲液，pH＝3.5。

在一些实施方案中，将亲和层析的洗脱液进行低pH病毒灭活。在一个具体实施方案中，可以通过柠檬酸或Tris溶液将样品pH值调节为约3.0-4.0，18-26℃条件下静置2-4小时来实现病毒灭活。

在一些实施方案中，将经过上述病毒灭活的溶液进行二次深层过滤。在一些具体实施方案中，二次深层过滤前需要将样品的pH值调节为约5.6。

在一些实施方案中，阴离子交换层析可以采用常规或商业化的各种填料，例如采用POROS 50HQ阴离子填料。在一些具体实施方案中，阴离子交换层析步骤包括但不限于预平衡、平衡、上样、平衡、再生、平衡、保存，其中预平衡液可选自含0.5-2.5M氯化钠的10-100mM乙酸钠-乙酸缓冲液，优选含1M氯化钠的50mM乙酸钠-乙酸缓冲液，平衡液可选自10-100mM乙酸钠-乙酸缓冲液，优选50mM的乙酸钠-乙酸缓冲液。

在一些实施方案中，阳离子交换层析可以采用常规填料或商业化的填料，例如采用POROS XS阳离子填料。在一些具体实施方案中，阳离子交换层析步骤包括但不限于预平衡、平衡、上样、淋洗、洗脱等。在一些具体实施方案中，所述淋洗包括1-3次淋洗，例如1次淋洗，2次淋洗，或3次淋洗，优选为3次淋洗。在一些具体实施方案中，阳离子层析的淋洗步骤包括淋洗缓冲液pH的改变，如pH上升或下降。在一些具体实施方案中，层析柱平衡后将产品加载到阳离子交换材料中，所述组合物处于第一pH，用平衡缓冲液(又称第一淋洗缓冲液)进行第一次淋洗(淋洗1)，再用pH高于所述第一pH的具有第二pH值的第二淋洗缓冲液进行第二次淋洗(淋洗2)，再用pH低于所述第二pH的具有第三pH值的第三淋洗缓冲液进行第三次淋洗(淋洗3)，最后用电导率大于所述第一淋洗缓冲液、第二淋洗缓冲液、和第三淋洗缓冲液的电导率的洗脱液冲洗层析柱。

在一些实施方案中，所述阳离子交换层析的第二pH比第一pH值至少高约1.5以上。在一些具体实施方案中，所述第二pH比第一pH值高至少约1.5，至少约1.6，至少约1.7，至少约1.8，至少约1.9，至少约2.0，至少约2.1，至少约2.2，至少约2.3，至少约2.4，至少约2.5，至少约2.6，至少约2.7，至少约2.8，至少约2.9，至少约3.0，至少约3.1，至少约3.2，至少约3.3，至少约3.4，至少约3.5，至少约3.6，至少约3.7，至少约3.8，至少约3.9，或至少约4.0以上。在本发明的一些方案中，所述第二pH比第一pH值至少高约1.5以上。在一些具体实施方案中，所述阳离子交换层析的第二次淋洗的pH比平衡，上样和/或第一次淋洗的pH高至少约1.5，至少约1.6，至少约1.7，至少约1.8，至少约1.9，至少约2.0，至少约2.1，至少约2.2，至少约2.3，至少约2.4，至少约2.5，至少约2.6，至少约2.7，至少约2.8，至少约2.9，至少约3.0，至少约3.1，至少约3.2，至少约3.3，至少约3.4，至少约3.5，至少约3.6，至少约3.7，至少约3.8，至少约3.9，或至少约4.0以上。

在一些实施方案中，所述阳离子交换层析的第三pH比第二pH值至少低约2.0或更多。在一些具体实施方案中，所述阳离子交换层析的第三pH比第二pH值低至少约2.0，至少约2.1，至少约2.2，至少约2.3，至少约2.4，至少约2.5，至少约2.6，至少约2.7，至少约2.8，至少约2.9，至少约3.0，至少约3.1，至少约3.2，至少约3.3，至少约3.4，至少约3.5，至少约3.6，至少约3.7，至少约3.8，至少约3.9，至少约4.0，至少约4.1，至少约4.2，至少约4.3，至少约4.4，或至少约4.5，或更多。在本发明的一些方案中，所述第三pH比第二pH值至少低约2.0以上。在一些具体实施方案中，所述阳离子交换层析的第三次淋洗的pH比第二次淋洗的pH低至少约2.0，至少约2.1，至少约2.2，至少约2.3，至少约2.4，至少约2.5，至少约2.6，至少约2.7，至少约2.8，至少约2.9，至少约3.0，至少约3.1，至少约3.2，至少约3.3，至少约3.4，至少约3.5，至少约3.6，至少约3.7，至少约3.8，至少约3.9，至少约4.0，至少约4.1，至少约4.2，至少约4.3，至少约4.4，或至少约4.5，或更多。

在一些方案中，阳离子交换层析的平衡、上样、第一淋洗缓冲液的pH相同或不同。

在一些具体实施方案中，平衡缓冲液、上样缓冲液和/或第一淋洗缓冲液采用50mM乙酸钠-乙酸缓冲液。在一些具体实施方案中，平衡缓冲液、上样缓冲液和/或第一淋洗缓冲液pH为4-7，优选为5-6，例如是5.0，5.1，5.2，5.3，5.4，5.5，5.6，5.7，5.8，5.9，或6.0。

在一些具体实施方案中，第二淋洗缓冲液中的盐是磷酸钾盐。在一些具体实施方案中，第二淋洗缓冲液的pH可以为6.5-9.0，优选7.0-8.5，更优选为7.5-8.5，例如为7.5，7.6，7.7，7.8，7.9，8.0，8.1，8.2，8.3，8.4或8.5。在一些具体实施方案中，第二淋洗缓冲液采用20mM磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液。

在一些具体实施方案中，第三淋洗缓冲液采用50mM乙酸钠-乙酸缓冲液。在一些具体实施方案中，第三淋洗缓冲液pH为4-7，优选为4.5-5.5，例如是4.5，4.6，4.7，4.8，4.9，5.0，5.1，5.2，5.3，5.4，或5.5。

在一些具体实施方案中，采用高电导率缓冲液对抗体进行洗脱，优选洗脱缓冲液为含0.3M氯化钠的50mM乙酸钠-乙酸缓冲液。在一些具体实施方案中，洗脱液的pH为4-7，优选为4.5-5.5，例如是4.5，4.6，4.7，4.8，4.9，5.0，5.1，5.2，5.3，5.4，或5.5。

在本文中，阳离子层析中的洗脱缓冲液具有相对较高的电导率，使得期望抗体产物自阳离子交换材料洗脱。优选的是，洗脱缓冲液的电导率大于所述平衡缓冲液、第一淋洗缓冲液、第二淋洗缓冲液、和第三淋洗缓冲液的电导率。

在一些具体实施方案中，对阳离子交换层析洗脱液进行病毒过滤和/或超滤，病毒过滤优选纳滤。

在一些具体的实施方案中，本发明制备的单克隆抗体酸性变体小于15％，优选小于13％，更优选的小于11％。

在一些具体的实施方案中，本发明制备的单克隆抗体的单体含量大于99.0％，更优选地大于99.5％。

本发明还提供一种蛋白纯化的整体工艺，能保证所述蛋白的总回收率为70％或更高，所述方法步骤如下：

(a)对细胞培养液进行深层过滤，收集滤液；

(b)对(a)收集的滤液进行亲和层析；

(c)对(b)所得的样品进行病毒灭活，并对病毒灭活后的样品进行深层过滤；

(d)对(c)所得的样品进行阴离子交换层析；

(e)对(d)所得的样品进行阳离子交换层析；

(f)对(e)所得的样品进行病毒过滤和/或超滤。

在一些具体的实施方案中，本发明制备的单克隆抗体最终的总回收率为70％或更高。

在一些具体的实施方案中，所述蛋白是单克隆抗体，可选地，是结合人TNF-α的单克隆抗体，包括但不限于阿达木单抗，英夫利昔单抗，戈利木单抗，赛妥珠单抗等。

在一些具体的实施方案中，所述蛋白是单克隆抗体，可选地，是人IgG1型抗体。

在溶液中，电流通过离子运输来流动，所以溶液的电导率可以通过改变其中的离子浓度来改变。例如，可以改变溶液中缓冲剂的浓度和/或盐(例如氯化钠、乙酸钠、或氯化钾)的浓度来实现期望的电导率。优选的是，更改各种缓冲液的盐浓度来实现期望的电导率。

在一些具体实施方案中，所述的细胞培养液来自哺乳动物细胞的培养液，例如CHO细胞的培养液。

在又一个方面，本发明提供了药物组合物的制备工艺，所述工艺包括采用本发明提供的纯化方法对蛋白质进行纯化。

本发明的方法至少具有如下有益效果：采用在亲和层析淋洗过程中增加缓冲液电导率，在阳离子交换层析淋洗过程中改变或大幅改变缓冲液的pH，提高了单克隆抗体的纯度；同时整个制备方法使单克隆抗体能达到70％或更高的总回收率。

术语解释

除非另行指明，本发明所用的技术和科学术语的含义等同于本领域普通技术人员的普遍理解。对于本发明一个术语存在多个定义的情况，除非另行指明，应采用本节所用定义。

“治疗”指治疗性处理和预防性或防范性措施二者。需要治疗的受试者包括早就患有病症的受试者以及要预防病症的受试者。

“自身免疫疾病和炎症性疾病”中自身免疫疾病是指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病，包括但不限于类风湿性关节炎、牛皮癣等；而自身炎症性疾病是由于自身免疫失调而引起全身性炎性反应，包括但不限于痛风和克罗恩氏病等。

“抗体”以最广泛的含义使用，并且包括各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体，多克隆抗体，多特异性抗体(例如双特异性抗体)，融合蛋白，免疫缀合物和任何本领域已知的抗体片段，只要它们可以表现出期望的抗原结合活性。

“基因工程改造”包括但不限于利用分子生物学方法获得目的基因片段、构建目的基因表达载体、将目的基因导入到细胞系，使该细胞系能长期稳定表达目的蛋白。

“折叠和糖基化”中的折叠是指一条结构松散的多肽链通过相互作用力折叠成具有天然空间结构的蛋白质分子的过程；糖基化是指在酶的作用下，将糖和蛋白质上的氨基酸残基形成糖苷键的过程。正确折叠和糖基化对蛋白的生物学功能十分重要。

“宿主蛋白(HCP)”是指来自于生产表达抗体的细胞系(例如CHO细胞)中的蛋白成分，包括但不限于细胞系分泌的蛋白、细胞凋亡、代谢产生的结构蛋白。HCP对抗体药物的安全存在风险，需要对其进行严格控制和检测。

“污染物”指与期望的抗体产物不同的物质。污染物包括但不限于：宿主细胞物质，宿主细胞蛋白；核酸；期望抗体的变体，片段，聚集物或衍生物；其它多肽；内毒素；病毒污染物；细胞培养基成分。

“高分子量杂质”是指分子量大于期望的抗体产物的杂质的总称。

“电荷异构体”是指抗体经过糖基化、脱酰胺基作用、氧化、异构化等直接或间接地引起抗体分子所带电荷发生改变的异构体。这些异构体一般分为酸性异构体或碱性异构体。采用弱阳离子交换色谱法(CEX)对电荷异构体进行分析时，酸峰(酸性异构体)早于主峰洗脱出来，碱峰(碱性异构体)晚于主峰洗脱出来。

“载量”在本文中指加载到层析柱上的组合物的含量。其中，加载要纯化的组合物之前对层析柱进行预平衡和平衡，去除层析柱中残留的杂质。

“淋洗”表示将溶液应用于层析材料以从层析材料中除去非特异性结合的多肽和非多肽化合物，尤其是除去宿主细胞蛋白、宿主细胞DNA和聚合物高分子量杂质等成分。术语“淋洗”通常不包括从层析材料上大量洗脱结合的抗体。

“洗脱缓冲液”用于洗脱结合在固相的目的抗体。

“增加电导率”是指增加水溶液在两个电极之间传导电流的能力。

“病毒灭活”包括使混合物中所含的病毒失去功能，或者将病毒从待纯化的混合物中除去。该病毒可发源于抗体生产、下游加工步骤或制造环境。使病毒失去功能或除去病毒的方法包括热灭活、pH灭活、化学灭活剂等。

除特别声明外，本发明中的“约”是指在所给定的具体数值范围±5％范围内波动，优选在±2％范围内波动，更优选在±1％范围内波动。例如pH值为约5.5表示pH为5.5±5％，优选pH为5.5±2％，更优选pH为5.5±1％。

附图说明

图1TNF-α单克隆抗体的CE-SDS电泳图，包括CE-SDS非还原电泳图(图1a)和CE-SDS还原电泳图(图1b)

图2CEX分析TNF-α单克隆抗体的电荷异质性色谱图

图3SEC分析TNF-α单克隆抗体色谱图

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步的描述，然而本发明中这些实施例仅用于阐明而不限制本发明的范围。同样，本发明不限于本文描述的任何具体优选的实施方案。本领域技术人员应该理解，对本发明技术特征所作的等同替换，或相应的改进，仍属于本发明的保护范围之内。除特别说明的以外，以下实施例采用的试剂均为市售产品，溶液的配制可以采用本领域常规技术。

实施例1抗体生产的上游工艺

为了表达本发明的抗体或抗体部分，将编码部分或全部抗体的DNA克隆到表达载体中，再将表达载体转染到宿主细胞中，使得基因被转录和翻译。“转染”意在涵盖多种常用于将外源DNA导入到原核或真核宿主细胞中的技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE葡聚糖转染等。本发明的抗体可以在真核细胞中表达，优选哺乳动物细胞，最优选CHO细胞作为宿主细胞。在一个实施案例中，使用常规培养工艺进行种子细胞传代扩增培养，种子细胞培养至细胞密度达到3.0～5.5×10⁶cells/mL时，接种至含有培养基的初级细胞反应器中培养。当细胞密度达到2.0-4.0×10⁶cells/mL时转接到另一细胞反应器中。培养参数，温度：36-37℃，优选36.5℃，转速：26-30rpm，pH：6.9±0.2，溶氧(pO₂)：40％。当细胞培养至第5天时，将培养温度降低至33℃，其它培养条件不变；当细胞培养至第8天时，将培养温度降低至31℃，其它培养条件不变，直至细胞培养14天结束，此时细胞活率低于80％。

实施例2电荷异构体含量的测定

弱阳离子交换色谱(Weak Cation Exchange Chromatography，CEX)是根据待分析物所带电荷数的差异进行分离，能够分离单克隆抗体中的电荷异构体。使样品带上正电荷，吸附在色谱柱上，采用合适盐浓度和/或pH梯度进行洗脱，各电荷异构体组分依次被洗出，通过紫外检测。再通过峰面积归一法测定样品中酸性峰含量和赖氨酸变体含量。照高效液相色谱法试验，采用弱阳离子色谱法测定，用初始比例流动相平衡色谱柱，直至基线平稳，流动相A：10mM磷酸氢二钠，pH7.5，流动相B：10mM磷酸氢二钠，500mM氯化钠，pH＝5.5。各具体参数见下表1：

表1弱阳离子交换色谱液相分析参数

流速	1-1.3mL/min
		柱温	25-30℃
自动进样器温控	2-8℃
		上样体积	100-130μL
UV波长	280nm
		运行时间	40-45min

实施例3聚合物和降解物片段含量的测定

采用分子排阻色谱(Size Exclusion Chromatography，SEC)分析蛋白聚合物高分子量杂质和降解物片段低分子量杂质的含量，该方法是根据待分析物中各组分的分子量差异进行分离。样品进入色谱柱中，小分子量物质进入凝胶孔中，滞留时间较长；大分子量物质不能进入凝胶孔中，会被较早洗脱下来，各组分按照分子量大到小的顺序依次被洗出，通过紫外检测。再通过峰面积归一法确定样品中免疫球蛋白单体、聚合物高分子量杂质和降解物低分子量杂质片段的含量。照高效液相色谱法试验，采用分子排阻色谱法测定，用流动相平衡色谱柱，直至基线平衡，流动相：50mM磷酸盐，300mM氯化钠，pH＝7.0±0.1。各具体参数见下表2：

表2分子排阻色谱液相分析参数

流速	1.0-1.1mL/min
		柱温	25-30℃
自动进样器温控	2-8℃
		上样体积	10μL
UV波长	280nm
		梯度类型	等度
运行时间	20-25min

实施例4抗TNF-α人源化单克隆抗体的分离纯化

以下列步骤分离纯化抗TNF-α人源化单克隆抗体，其中亲和层析的淋洗步骤包括淋洗缓冲液电导率增加。例如，可以先用含150mM氯化钠的50mM Tris-乙酸缓冲液进行冲洗，随后采用含1M氯化钠的50mM乙酸钠-乙酸缓冲液进行淋洗，再采用50mM乙酸钠-乙酸缓冲液进行淋洗。其中阳离子层析淋洗过程包括缓冲液pH的改变，层析柱平衡后将包含抗体的样品加载到阳离子交换材料上，所述组合物处于第一pH，用平衡缓冲液(又称第一淋洗缓冲液)进行第一次淋洗(淋洗1)，随后用pH高于所述第一pH至少2.0的第二淋洗缓冲液进行第二次淋洗(淋洗2)，再用pH低于所述第二淋洗缓冲液至少2.5的第三淋洗缓冲液进行第三次淋洗(淋洗3)。具体方法包括：

(a)深层过滤：收集细胞培养液进行深层过滤，再收集滤液；

(b)亲和层析：采用Protein A亲和层析填料，其步骤包括：①平衡，采用含150mM氯化钠的50mM Tris-乙酸缓冲液进行平衡，pH＝7.4；②上样；③淋洗1，第一淋洗液采用含150mM氯化钠的50mM Tris-乙酸缓冲液，pH＝7.4；④淋洗2，第二淋洗液采用含1M氯化钠的50mM乙酸钠-乙酸缓冲液，pH＝5.0；⑤淋洗3，第三淋洗液采用50mM乙酸钠-乙酸缓冲液，pH＝5.0；⑥洗脱，洗脱液采用50mM乙酸钠-乙酸缓冲液，pH＝3.5；

(c)病毒灭活：通过柠檬酸或Tris溶液将上述洗脱样品的pH值调节为3.5±0.2，18-26℃条件下静置2-4小时进行病毒灭活；

(d)二次深层过滤：将上述病毒灭活后的样品pH值调节为约5.6，再进行二次深层过滤，收集滤液；

(e)阴离子交换层析：采用POROS 50HQ阴离子填料，其步骤包括预平衡、平衡、上样、平衡、再生、平衡、保存，其中预平衡液：含1M氯化钠的50mM乙酸钠-乙酸缓冲液，pH＝5.0，平衡液：50mM乙酸钠-乙酸缓冲液，pH＝5.7；

(f)阳离子交换层析：采用POROS XS阳离子料，其步骤包括：①预平衡，预平衡液采用含1M氯化钠的50mM乙酸钠-乙酸缓冲液，pH＝5.0；②平衡和上样，平衡液采用50mM乙酸钠-乙酸缓冲液，pH＝5.5；③淋洗1，第一淋洗液采用50mM乙酸钠-乙酸缓冲液，pH＝5.5；④淋洗2，第二淋洗液采用20mM磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液，pH＝7.9；⑤淋洗3，第三淋洗液采用50mM乙酸钠-乙酸缓冲液，pH＝5.0；⑥洗脱，洗脱液含0.3M氯化钠的50mM乙酸钠-乙酸缓冲液，pH＝5.0；

(g)病毒过滤和/或超滤：采用纳滤的方法除病毒，之后将样品进行超滤换液，得到包含单克隆抗体的组合物。

采用十二烷基硫酸钠毛细管电泳(CE-SDS)的检测方法，在还原和非还原的条件下，根据分子量大小不同导致迁移速度不同，来检测抗体产品的纯度。附图1为本发明方法工艺纯化后TNF-α人源化单克隆抗体的CE-SDS电泳图谱。

计算总回收率：总回收率(％)＝获得原液蛋白量/细胞收获液蛋白量*100％

表3示出了两次分离纯化试验后，TNF-α人源化单抗的CEX-HPLC和SEC-HPLC的检测结果。

表3 TNF-α人源化单克隆抗体的分离纯化结果

结果显示，采用在亲和层析淋洗过程中增加缓冲液电导率，和/或在阳离子交换层析淋洗过程中大幅改变缓冲液的pH，极大降低了电荷异构体的含量(见图2)，减少聚合物高分子量杂质和降解物低分子量杂质片段的含量(见图3)，提高单克隆抗体的纯度。同时整个制备方法使单克隆抗体能达到70％或更高的总回收率。

根据本发明所公开的内容，虽然根据优选实施方案对本发明的组合物和方法进行了描述，但对本领域技术人员而言，在不背离本发明的概念、精神和范围的情况下，可对在此所述的组合物和/或方法以及所述方法的步骤或步骤的顺序进行改变。

本文所引用的所有文献的公开内容通过引用结合于此，引用程度为，他们提供示例性的、程序上和其他的细节补充本文所述内容。

Claims (2)

1.一种纯化蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)亲和层析，所述亲和层析的淋洗步骤包括先用pH 7.4的含150mM氯化钠的50mMTris-乙酸缓冲液进行淋洗，再用pH 5.0的含1M氯化钠的50mM乙酸钠-乙酸缓冲液进行淋洗，最后用pH 5.0的50mM的乙酸钠-乙酸缓冲液进行淋洗，淋洗后用pH 3.5的50mM乙酸钠-乙酸缓冲液进行洗脱；

(b)调节亲和层析洗脱液的pH值至3.0-4.0，进行病毒灭活；

(c)深层过滤；

(d)阴离子交换层析，所述阴离子交换层析的平衡液为pH 5.7的50mM乙酸钠-乙酸缓冲液；

(e)阳离子交换层析，所述阳离子交换层析的淋洗步骤包括先用第一淋洗缓冲液进行第一次淋洗，再用第二淋洗缓冲液进行第二次淋洗，最后用第三淋洗缓冲液进行第三次淋洗，其中，所述第一淋洗缓冲液为pH 5.5的50mM乙酸钠-乙酸缓冲液，所述第二淋洗缓冲液为pH 7.9的20mM磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液，所述第三淋洗缓冲液为pH 5.0的50mM乙酸钠-乙酸缓冲液，淋洗后用pH 5.0的含0.3M氯化钠的50mM乙酸钠-乙酸缓冲液进行洗脱；

所述蛋白为阿达木单抗。

2.药物组合物的制备工艺，所述工艺包括采用权利要求1所述的方法对蛋白进行纯化。