CN118725127A - 一种抗pcsk9单克隆抗体的分离纯化方法 - Google Patents
一种抗pcsk9单克隆抗体的分离纯化方法 Download PDFInfo
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Abstract
本申请属于化学药物技术领域，涉及一种抗PCSK9单克隆抗体的分离纯化方法，将抗体A的细胞培养液过滤后，得到所述抗体A的粗液；然后依次经过亲和层析、疏水层析、反相层析和阳离子层析处理后，可以去除抗体A中的杂质，满足药典要求，获得高纯度和高收率的抗体A。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗PCSK9单克隆抗体的分离纯化方法。
背景技术
前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)是一种前蛋白转化酶，属于分泌的枯草杆菌酶家族的蛋白酶K亚族。证据显示，PCSK9促进低密度脂蛋白受体(LDLR)的降解从而增加血浆中LDL胆固醇含量，而LDLR介导肝内的LDL胞吞过程，后者是从循环系统清除LDL的主要途径。
抗PCSK9单克隆抗体，是全人源单克隆抗体，属于IgG4亚型抗体，含有完整的两条轻链和重链，分子量约为148.3KD。它可选择性的结合PCSK9，阻断其与低密度脂蛋白受体(LDLR)的相互作用，增加LDLR的循环利用。从而使肝细胞表面LDLR的水平升高。高含量的LDLR可以和血浆中的LDL结合，然后将其转运至溶酶体降解，由此达到降低LDL水平的目的，同时也能降低其它一些脂蛋白的水平。
高纯度的抗PCSK9单克隆抗体可减少用药不良反应，提高储存稳定性。抗PCSK9单克隆抗体CHO细胞培养液含有较多杂蛋白、宿主蛋白及细胞色素等其它杂质，纯度较低。因此，开发高纯度的抗PCSK9单克隆抗体的纯化工艺具有较高的应用意义。
发明内容
鉴于现有技术存在的问题，本申请提供一种抗PCSK9单克隆抗体的分离纯化方法，可以获得高纯度的抗PCSK9单克隆抗体。
本发明提供一种抗PCSK9单克隆抗体的分离纯化方法，具体包括以下步骤：
一种PCSK9单克隆抗体的分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)过滤，将抗体A的细胞培养液过滤后，得到所述抗体A的粗液；
(2)亲和层析；将所述抗体A的粗液经亲和层析处理后得到抗体A的澄清液；
(3)疏水层析；将经过步骤(2)处理的所述抗体A采用疏水层析处理；
(4)反相层析；将经过步骤(3)处理的所述抗体A采用反相层析处理；以及
(5)阳离子层析；将经过步骤(4)处理的所述抗体A经过阳离子层析处理，去除抗体A中的杂质，以获得高纯度的抗体A。
作为本发明的一种优选技术方案，所述抗体A选自抗体18.156.8、Evolocumab、Alirocumab、recaticimab或tafolecimab。
作为本发明的一种优选技术方案，所述亲和层析包括以下步骤：
a.采用平衡缓冲液平衡填料填充后的亲和层析柱；
b.上样：将步骤(1)获得的抗体A的粗液上样到所述步骤a平衡后的层析柱中，上样载量为小于或等于50mg/ml，样品保留时间为9-27min，用所述步骤a的平衡缓冲液冲洗去除未结合物；
c.洗脱：用洗脱收集缓冲液洗脱目的蛋白；
d.收集步骤c处理后的目的蛋白，并采用收集液调节该目的蛋白的pH。
作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤a中平衡缓冲液选自PBS、MES、NaAC中的至少一种，优选PBS。
作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤a中平衡缓冲液的浓度为30mmol/L-80mmol/L，pH6.0-7.0，优选50mmol/L、60mmol/L和70mmol/L，pH6.5±0.2。
作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤c中洗脱收集缓冲液选自Gly-HCL、NaAC的至少一种，优选Gly-HCL。
作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤c中洗脱缓冲液的浓度为40mmol/L-70mmol/L，pH2.5-4.5，优选50mmol/L、60mmol/L，pH3.0±0.2。
作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤d中收集液选自Tris-HCL、PBS、MES、NaAC的至少一种，优选Tris-HCL、PBS。例如，采用Tris-HCL或PBS将目的蛋白的pH调节至6.5±0.2。
作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤d中收集液的浓度选自0.1-3mmol/L，优选1mmol/L、1.5mmol/L，pH为9.0±0.2。
作为本发明的一种优选技术方案，所述疏水层析包括以下步骤：
a.平衡：使用平衡缓冲液平衡疏水层析填料；
b.上样：将上述步骤(2)制备的抗体A样品上样到经所述步骤a平衡的疏水层析柱中，其中，上样载量为10-60mg/ml，样品保留时间为9-27min，用步骤a的平衡缓冲液冲洗去除未结合物，线性洗脱流速为100cm/h-300cm/h。
作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤a的平衡缓冲液选自Tris-HCL、PBS、NaAC中的至少一种，优选Tris-HCL。
作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤a的平衡缓冲液浓度选自10mmol/L-70mmol/L，优选30mmol/L，PH6.0-8.0，优选pH6.5±0.2。
作为本发明的一种优选技术方案，所述反相层析包括以下步骤：
a.平衡：使用平衡缓冲液平衡反相层析填料；
b.上样：将上述步骤(3)制备的抗体A样品上样到经所述步骤a平衡的反相层析柱中，其中，上样载量为5-30mg/ml，样品保留时间为9-18min，用步骤a的平衡缓冲液冲洗去除未结合物，线性洗脱流速为100cm/h-200cm/h；
c.洗脱：用洗脱缓冲液洗脱目的蛋白抗体A。
作为本发明的一种优选技术方案，所述反相层析中平衡缓冲液选自乙腈，所述乙腈浓度选自10％-13％，所述洗脱缓冲液选自乙腈，所述乙腈浓度选自25％-30％。
作为本发明的一种优选技术方案，所述阳离子层析包括以下步骤：
a.平衡：使用平衡缓冲液平衡阳离子层析填料；
b.上样：将上述步骤(4)的抗体A上样，上样载量为10-50mg/ml，保证样品与填料接触时间为9-27min，并用步骤a所述的平衡缓冲液冲洗去除未结合物；
c.洗脱：用洗脱缓冲液洗脱步骤b处理后的抗体A。
作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤a的平衡缓冲液选自氯化钠和Tris-HCL、NaAC、PBS、MES中的至少一种，优选氯化钠和Tris-HCL、PBS。
作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤a的平衡缓冲液浓度为10mmol/L-100mmol/L，优选50mmol/L、60mmol/L；所述氯化钠的浓度为0.2-0.5mol/L，优选0.3mol/L，pH5.0-8.0，优选pH6.5±0.2。
作为本发明的一种优选技术方案，所述亲和层析的填料选自AT ProteinADiamond plus、NMab TM ProteinA或MabSelect，优选AT ProteinA Diamond plus；所述疏水层析的填料选自Diamond Phenyl(HS)、Capto Phenyl或Uni HR Phenyl-80L，优选Diamond Phenyl(HS)；所述反相层析的填料选自Best Poly 15RPC、Source 15RPC或UniPS，优选Best Poly15RPC；所述阳离子层析的填料选自UniGel-80SP、SP Sepharose FF或SPBestarose FF，优选UniGel-80SP。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及有益效果：
1、提供了一种抗PCSK9单克隆抗体的分离纯化方法，通过采用亲和层析、疏水层析、反相层析和阳离子层析法进行纯化，不仅可以获得高纯度和高收率的目的蛋白，而且可以将乙腈残留量以及杂质残留量控制在安全范围内；
2、提供了一种抗PCSK9单克隆抗体的分离纯化方法，通过对各层析法的各层析平衡缓冲液和洗脱液筛选，分离纯化得到的目的蛋白总收率高且具有良好的生物学活性；
3、提供了一种抗PCSK9单克隆抗体的分离纯化方法，方法适用性强，具有良好的重复性和稳定性，可用于抗PCSK9单克隆抗体规模化纯化工艺中。
附图说明
图1为亲和层析平衡缓冲液的筛选结果；
图2为亲和层析平衡缓冲液浓度的筛选结果；
图3为亲和层平衡缓冲液pH的筛选结果；
图4为亲和层洗脱收集缓冲液pH的筛选结果；
图5为亲和层洗脱收集缓冲液pH的筛选结果；
图6为亲和层洗脱收集缓冲液pH的筛选结果；
图7为疏水层析平衡缓冲液的筛选结果；
图8为疏水层析平衡缓冲液浓度的筛选结果；
图9为疏水层析平衡缓冲液pH的筛选结果；
图10为反向层析平衡缓冲液浓度的筛选结果；
图11为反向层析洗脱缓冲液浓度的筛选结果；
图12为采用实施例12所述的纯化方法的结果；
图13为采用实施例12所述的纯化方法的抗体纯度及乙腈残留量；
图14为采用对比例1所述的纯化方法的抗体纯度及乙腈残留量；
图15为采用对比例2所述的纯化方法的结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请作进一步详细的描述，但本申请的实施方式不限于此。
下述实施例中抗PCSK9单克隆抗体(以下简称抗体A)的制备采用专利文献CN201710816808.0中所述方法，或者将该专利文献中的所有内容通过援引的方式全部引入到本申请中。抗体A选自专利文献CN201710816808.0中的抗体18.156.8所对应的序列。
实施例1亲和层析平衡缓冲液的筛选
本实施例说明步骤a亲和层析平衡缓冲液不同种类对纯抗体A收率的影响。在纯化其它条件相同的情况下(线性洗脱流速为100cm/h-300cm/h，柱高15cm±5cm，样品层析保留时间9-27min，动态载量为小于50mg/ml，平衡缓冲液浓度均为50mM，pH6.5，洗脱缓冲液选用50mM Gly-HCL，pH3.0)，平衡缓冲液种类分别选用：Tris-HCL、PBS、MES、NaAC。抗体A纯化收率结果见图1。结果表明，平衡缓冲液为PBS、MES和NaAC时，抗体A纯化收率较高，优选PBS。
实施例2亲和层析平衡缓冲液浓度的筛选
本实施例说明步骤a亲和层析平衡缓冲液不同浓度对纯化抗体A收率的影响。在纯化其它条件相同的情况下(线性洗脱流速为100cm/h-300cm/h，柱高15cm±5cm，样品层析保留时间9-27min，动态载量为小于50mg/ml，平衡缓冲液种类选用PBS，pH6.5，洗脱缓冲液选用50mMGly-HCL，pH3.0)，平衡缓冲液浓度分别选用：10mM、30mM、50mM、70mM、100mM。抗体A纯化收率结果见图2。结果表明，平衡缓冲液浓度采用30-70mM时，抗体A纯化收率较高，优选50mM。
实施例3亲和层平衡缓冲液pH的筛选
本实施例说明步骤a亲和层析前、后平衡缓冲液不同pH对纯化抗体A收率的影响。在纯化其它条件相同的情况下(线性洗脱流速为100cm/h-300cm/h，柱高15cm±5cm，样品层析保留时间9-27min，动态载量为小于50mg/ml，前、后平衡缓冲液种类选用PBS，浓度50mM，洗脱缓冲液选用50mM Gly-HCL，pH3.0)，前、后平衡缓冲液pH分别选用：5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0。抗体A纯化收率结果见图3。结果表明，前、后平衡缓冲液pH采用6.0-7.0时，抗体A纯化收率较高，优选pH为6.5。
实施例4亲和层洗脱收集缓冲液pH的筛选
本实施例说明步骤a亲和层析洗脱收集缓冲液不同种类对纯化抗体A收率的影响。在纯化其它条件相同的情况下(线性洗脱流速为100cm/h-300cm/h，柱高15cm±5cm，样品层析保留时间9-27min，动态载量为小于50mg/ml，平衡缓冲液种类选用PBS，浓度50mM，pH6.5，洗脱收集缓冲液浓度均选用50mM，pH均选用3.0)，洗脱收集缓冲液种类分别选用：Gly-HCL、柠檬酸盐、NaAC。抗体A纯化收率结果见图4。结果表明，洗脱收集缓冲液种类选用Gly-HCL和NaAC时，抗体A纯化收率较高，优选Gly-HCL。
实施例5亲和层洗脱收集缓冲液浓度的筛选
本实施例说明步骤a亲和层析洗脱收集缓冲液不同浓度对纯化抗体A收率的影响。在纯化其它条件相同的情况下(线性洗脱流速为100cm/h-300cm/h，柱高15cm±5cm，样品层析保留时间9-27min，动态载量为小于50mg/ml，平衡缓冲液种类选用PBS，浓度50mM，pH6.5，洗脱缓冲液种类选用NaAC，pH均选用3.0)，洗脱收集缓冲液浓度分别选用：10mM、30mM、50mM、70mM、100mM。抗体A纯化收率结果见图5。结果表明，洗脱收集缓冲液浓度采用40-70mM时，抗体A纯化收率较高，优选50mM。
实施例6亲和层洗脱收集缓冲液pH的筛选
本实施例说明步骤a亲和层析洗脱收集缓冲液不同pH对纯化抗体A收率的影响。在纯化其它条件相同的情况下(线性洗脱流速为100cm/h-300cm/h，柱高15cm±5cm，样品层析保留时间9-27min，动态载量为小于50mg/ml，平衡缓冲液种类选用PBS，浓度50mM，pH6.5，洗脱缓冲液种类选用Gly-HCL，浓度50mM)，洗脱收集缓冲液pH分别选用：2.5、2.7、3.0、3.3、3.6、4.0、4.3、4.5。抗体A纯化收率结果见图6。结果表明，洗脱收集缓冲液pH采用2.5-4.0时，抗体A纯化收率较高，优选pH为3.0。
实施例7疏水层析平衡缓冲液的筛选
本实施例说明步骤b疏水层析平衡缓冲液不同种类对纯化抗体A收率及纯度的影响。在纯化其它条件相同的情况下(疏水层析步骤及参数参见表2)，疏水层析步骤中：线性洗脱流速为100cm/h-300cm/h，柱高15cm±5cm，样品层析保留时间9-27min，动态载量为10-60mg/ml，平衡缓冲液浓度均为30mM，pH6.5，平衡缓冲液种类分别选用：Tris-HCL、PBS、MES、NaAC。抗体A纯化收率及纯度结果见图7。结果表明，平衡缓冲液采用Tris-HCL、PBS时，抗体A纯化收率及纯度较高，优选Tris-HCL。
实施例8疏水层析平衡缓冲液浓度的筛选
本实施例说明步骤b疏水层析平衡缓冲液不同浓度对纯化抗体A收率的影响。在纯化其它条件相同的情况下(亲和层析参数见表2)，疏水层析中线性洗脱流速为100cm/h-300cm/h，柱高15cm±5cm，样品层析保留时间9-27min，动态载量为10-60mg/ml，平衡缓冲液种类选用Tris-HCL，pH6.5)，平衡缓冲液浓度分别选用：10mM、30mM、50mM、70mM、100mM。抗体A纯化收率及纯度结果见图8。结果表明，平衡缓冲液浓度采用10-70mM时，抗体A纯化收率及纯度较高，优选平衡缓冲液浓度为30mM。
实施例9疏水层析平衡缓冲液pH的筛选
本实施例说明步骤b疏水层析平衡缓冲液不同pH对纯化抗体A收率及纯度的影响。
在纯化其它条件相同的情况下(亲和层析参数见下表1)，疏水层析步骤：线性洗脱流速为100cm/h-300cm/h，柱高15cm±5cm，样品层析保留时间9-27min，动态载量为10-60mg/ml，平衡缓冲液种类选用Tris-HCL，浓度30mM)，平衡缓冲液pH分别选用：5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0。抗体A纯化收率结果见图9。结果表明，平衡缓冲液pH采用6.0-7.0时，抗体A纯化收率及纯度较高，优选平衡缓冲液pH为6.5。
实施例10反向层析平衡缓冲液浓度的筛选
本实施例说明步骤c反相层析平衡缓冲液不同乙腈浓度对纯化抗体A收率及纯度的影响。
在纯化其它条件相同的情况下(亲和层析参数见下表1，疏水层析参数见下表2)，反相层析步骤：线性洗脱流速为100cm/h-200cm/h，柱高15cm±5cm，样品层析保留时间9-18min，动态载量为5-30mg/ml，洗脱收集缓冲液采用30％乙腈水溶液)，平衡缓冲液分别选用：5％乙腈水溶液、8％乙腈水溶液、11％乙腈水溶液、13％乙腈水溶液15％乙腈水溶液。抗体A纯化收率及纯度结果见图10。结果表明，平衡缓冲液采用10-15％％乙腈水溶液，抗体A纯度较高，平衡缓冲液采用10％-13％的乙腈水溶液时，抗体A的收率和纯度较高，优选乙腈水溶液浓度为13％。
实施例11反向层析洗脱缓冲液浓度的筛选
本实施例说明步骤c反相层析洗脱收集缓冲液不同乙腈浓度对纯化抗体A收率及纯度的影响。
在纯化其它条件相同的情况下(亲和层析参数见表下1，疏水层析参数见下表2，阳离子层析参数见下表3)，反相层析步骤：线性洗脱流速为1 00cm/h-200cm/h，柱高15cm±5cm，样品层析保留时间9-18min，动态载量为5-30mg/ml，前、后平衡缓冲液采用11％乙腈水溶液，洗脱收集缓冲液分别选用：20％乙腈水溶液、23％乙腈水溶液、26％乙腈水溶液、28％乙腈水溶液30％乙腈水溶液。抗体A纯化收率及纯度结果见图11。结果表明，洗脱收集缓冲液采用25-30％乙腈水溶液，抗体A收率较高，优选乙腈水溶液浓度为26％。
实施例12抗体A的纯化方法
步骤(1)：过滤
抗体A的CHO细胞培养液经离心过滤后，得到抗体A的粗液，作为纯化原液，其中，离心过滤采用0.22μm滤膜过滤，离心操作的条件为：4000-8000g，7-12min，2～8℃。或者，抗体A的CHO细胞培养液通过Millipore公司的D0HC与B1HC两级串联方式进行深层过滤和0.2μm滤芯过滤后，得到抗体A的粗液，作为纯化原液。
步骤(2)：亲和层析
将上述步骤(1)获得的纯化原液进行亲和层析的粗提纯，亲和层析的步骤如下：
a.平衡缓冲液平衡填料填充后的亲和层析柱；
b.上样：将步骤(1)获得的纯化原液上样到上述步骤a平衡后的层析柱中，柱高为15cm±5cm，上样载量为小于或等于50mg/ml，样品保留时间为9-27min，用所述步骤a的平衡缓冲液冲洗去除未结合物；
c.洗脱：用洗脱收集缓冲液洗脱目的蛋白；
d.收集步骤c处理后的目的蛋白，并采用收集液调节该目的蛋白的pH至6.5±0.2。
亲和层析各步骤所涉及的参数和/或条件如表1所示。
表1为亲和层析所涉及的步骤参数和/或条件
步骤(3)：疏水层析
a.平衡：使用“30mmol/LTris-HCL，pH为6.5±0.2”的平衡缓冲液平衡疏水层析填料Diamond Phenyl(HS)；
b.上样：将上述步骤(2)制备的抗体A样品上样到经上述步骤a平衡的疏水层析柱中，其中，柱高为15cm±5cm，上样载量为10-60mg/ml，样品保留时间为9-27min，用步骤a的平衡缓冲液冲洗、收集未结合抗体A，线性洗脱流速为100cm/h-300cm/h。
疏水层析各步骤所涉及的参数和/或条件如表2所示。
表2为疏水层析所涉及的步骤参数和/或条件
步骤(4)：反相层析
a.平衡：使用“11％乙腈水溶液”的平衡缓冲液平衡反相层析填料Best Poly15RPC；
b.上样：将上述步骤(3)制备的抗体A样品上样到经上述步骤a平衡的反相层析柱中，其中，柱高为15cm±5cm，上样载量为5-30mg/ml，样品保留时间为9-18min，用步骤a的平衡缓冲液冲洗去除未结合物，线性洗脱流速为100cm/h-200cm/h。
c.洗脱：用洗脱缓冲液“26％乙腈水溶液”洗脱目的蛋白抗体A。
反相层析各步骤所涉及的参数和/或条件如表3所示。
表3为反相层析所涉及的步骤参数和/或条件
步骤(5)：阳离子层析
将上述步骤(4)制备的抗体A样品进行阳离子层析纯化，其中阳离子层析的具体步骤如下：
a.平衡：使用平衡缓冲液“50mmol/L PBS，pH6.5±0.2”平衡阳离子层析填料UniGel-80SP；
b.上样：将上述步骤(4)的抗体A上样，上样载量为10-50mg/ml，保证样品与填料接触时间为9-27min，并用步骤a所述的平衡缓冲液冲洗去除未结合物；
c.洗脱：用洗脱缓冲液“50mmol/L PBS和0.3mol/L氯化钠，pH6.5±0.2”洗脱步骤b处理后的抗体A。
阳离子层析各步骤所涉及的参数和/或条件如表4所示。
表4为阳离子层析所涉及的步骤参数和/或条件
参见图11-13，采用上述步骤(1)-(5)的方法纯化抗体A的粗液，可以得到97％高纯度抗体A和90％左右的收率A。并且，乙腈的残留量只有0.003％，并且，杂质残留量均低于1％，远远低于药典要求标准。
对比例1抗体A的纯化方法
本对比例1与实施例1的区别之处在于：本实施例没有阳离子层析步骤，当采用本实施例的方法分离纯化抗体A时，虽然可以得到不低于97％高纯度抗体A，但是，乙腈残留量为26％，该方法含有大量乙腈残留，具体见图14。
对比例2抗体A的纯化方法
本对比例2与实施例1的区别之处在于：本实施例没有反相层析步骤，当采用本实施例的方法分离纯化抗体A时，只能得到88％纯度的抗体A，并且，宿主蛋白杂质残留量为6.21％，杂质含量高于1％，不满足药典规定的要求，具体见图15。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (11)
1.一种PCSK9单克隆抗体的分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)过滤，将抗体A的细胞培养液过滤后，得到所述抗体A的粗液；
(2)亲和层析；将所述抗体A的粗液经所述亲和层析处理后得到抗体A的澄清液；
(3)疏水层析；将经过步骤(2)处理的所述抗体A采用疏水层析处理；
(4)反相层析；将经过步骤(3)处理的所述抗体A采用反相层析处理；
(5)阳离子层析；将经过步骤(4)处理的所述抗体A经过阳离子层析处理，去除抗体A中的杂质，以获得高纯度的抗体A。
2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述抗体A选自抗体18.156.8、Evolocumab、Alirocumab、recaticimab或tafolecimab。
3.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述亲和层析包括以下步骤：
a.采用平衡缓冲液平衡填料填充后的亲和层析柱；
b.上样：将步骤(1)获得的抗体A的粗液上样到所述步骤a平衡后的层析柱中，上样载量为小于或等于50mg/ml，样品保留时间为9-27min，用所述步骤a的平衡缓冲液冲洗去除未结合物；
c.洗脱：用洗脱收集缓冲液洗脱目的蛋白；
d.收集步骤c处理后的目的蛋白，并采用收集液调节该目的蛋白的pH。
4.根据权利要求3所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤a中平衡缓冲液选自PBS、MES、NaAC中的至少一种，优选PBS；
所述平衡缓冲液的浓度为30mmol/L-80mmol/L，pH6.0-7.0，优选50mmol/L、60mmol/L和70mmol/L，pH6.5±0.2；
所述步骤c中洗脱收集缓冲液选自Gly-HCL、NaAC的至少一种，优选Gly-HCL；所述洗脱缓冲液的浓度为40mmol/L-70mmol/L，pH2.5-4.5，优选50mmol/L、60mmol/L，pH3.0±0.2；
所述步骤d中收集液选自Tris-HCL、PBS、MES、NaAC的至少一种，优选Tris-HCL、PBS；
所述收集液的浓度选自0.1-3mmol/L，优选1mmol/L、1.5mmol/L，pH为9.0±0.2。
5.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述疏水层析包括以下步骤：
a.平衡：使用平衡缓冲液平衡疏水层析填料；
b.上样：将上述步骤(2)制备的抗体A样品上样到经所述步骤a平衡的疏水层析柱中，其中，上样载量为10-60mg/ml，样品保留时间为9-27min，用步骤a的平衡缓冲液冲洗、收集未结合的抗体A，线性洗脱流速为100cm/h-300cm/h。
6.根据权利要求5所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤a的平衡缓冲液选自Tris-HCL、PBS、NaAC中的至少一种，优选Tris-HCL；
所述平衡缓冲液浓度选自10mmol/L-70mmol/L，优选30mmol/L，pH6.0-8.0，优选pH6.5±0.2。
7.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述反相层析包括以下步骤：
a.平衡：使用平衡缓冲液平衡反相层析填料；
b.上样：将上述步骤(3)制备的抗体A样品上样到经所述步骤a平衡的反相层析柱中，其中，上样载量为5-30mg/ml，样品保留时间为9-18min，用步骤a的平衡缓冲液冲洗去除未结合物，线性洗脱流速为100cm/h-200cm/h；
c.洗脱：用洗脱缓冲液洗脱目的蛋白抗体A。
8.根据权利要求7所述的纯化方法，其特征在于，所述反相层析中平衡缓冲液选自乙腈，所述乙腈浓度选自10％-13％，所述洗脱缓冲液选自乙腈，所述乙腈浓度选自25％-30％。
9.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述阳离子层析包括以下步骤：
a.平衡：使用平衡缓冲液平衡阳离子层析填料；
b.上样：将上述步骤(4)的抗体A上样，上样载量为10-50mg/ml，保证样品与填料接触时间为9-27min，并用步骤a所述的平衡缓冲液冲洗去除未结合物；
c.洗脱：用洗脱缓冲液洗脱步骤b处理后的抗体A。
10.根据权利要求9所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤a的平衡缓冲液选自氯化钠和Tris-HCL、NaAC、PBS、MES中的至少一种，优选氯化钠和Tris-HCL、PBS；
所述平衡缓冲液浓度为10mmol/L-100mmol/L，优选50mmol/L、60mmol/L；所述氯化钠的浓度为0.2-0.5mol/L，优选0.3mol/L，pH5.0-8.0，优选pH6.5±0.2。
11.根据权利要求1-10任一项所述的纯化方法，其特征在于，所述亲和层析的填料选自ATProteinADiamondplus、NMab TM ProteinA或MabSelect，优选ATProteinADiamond plus；所述疏水层析的填料选自Diamond Phenyl(HS)、Capto Phenyl或Uni HR Phenyl-80L，优选Diamond Phenyl(HS)；所述反相层析的填料选自Best Poly 15RPC、Source 15RPC或UniPS，优选Best Polyl5RPC；所述阳离子层析的填料选自UniGel-80SP、SPSepharose FF或SPBestarose FF，优选UniGel-80SP。
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