CN108101987A - 一种重组抗TNF-α全人源单克隆抗体的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种重组抗TNF‑α全人源单克隆抗体的纯化方法，包括对抗体进行阳离子交换色谱洗脱，其过程具体包括：平衡上样后，首先采用平衡缓冲液1第一次淋洗，接着采用平衡缓冲液2第二次淋洗，接着采用平衡缓冲液2和平衡缓冲液3的混合液第三次淋洗，最后进行洗脱获得纯化抗体；其中，平衡缓冲液1为磷酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液，平衡缓冲液2为磷酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液，平衡缓冲液3为磷酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液。本发明降低了重组抗TNF‑α全人源单克隆抗体中的酸性组分含量，并且提高了重组抗TNF‑α全人源单克隆抗体的纯度。
Description
技术领域
本发明涉及抗体纯化技术领域，尤其涉及一种重组抗TNF-α全人源单克隆抗体的纯化方法。
背景技术
TNF-α是一种促炎细胞因子，在自身免疫性疾病发病机制中起重要作用，类风湿性关节炎(RA)、幼年特发性关节炎(JIA)、银屑病关节炎(PsA)和强直性脊柱炎(AS)患者关节滑液中均发现TNF-α水平增高，斑块型银屑病(PPs)患者体内也发现TNF-α水平增高，所有这些都证明TNF-α参与了诸多疾病过程，成了疾病治疗的重要靶标，开发特异靶向抗体药物成了一个研究热点，目前已经获美国FDA批准上市的TNF-α靶向抗体有全人源的阿达木单抗(Adalimumab)、新型戈利木单抗(golimumab)、聚乙二醇化抗体片段塞妥珠单抗(Certolizumab)等。
重组抗TNF-α全人源单克隆抗体是全人源的IgG1类免疫球蛋白，由整合抗TNF-α全人源单克隆抗体基因的CHO(中国仓鼠卵巢细胞)培养获得。由于IgG1类抗体可以特异性地和protein A结合，因此可以通过亲和层析捕获。但是，在细胞表达过程中，会有很多因素会影响电荷变异体的形成，如：重链C末端赖氨酸的截除、N末端焦谷氨酸环化、天冬酰胺、谷氨酰胺残基的脱氨基作用以及不同的糖基化修饰、氧化等。电荷变异体，特别是酸性电荷变异体会引起人体的免疫原性，已经成为单克隆抗体药物工艺中关键质量属性之一。由于这些电荷变异体表面带电荷分部不均一，可通过离子层析来去除。但是，由于不同的酸性变异体有着相似的理化性质，单一的淋洗方式对变异体去除效果不显著，很难满足正常生产需求。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种重组抗TNF-α全人源单克隆抗体的纯化方法，本发明降低了重组抗TNF-α全人源单克隆抗体中的酸性组分含量，并且提高了重组抗TNF-α全人源单克隆抗体的纯度。
本发明提出的一种重组抗TNF-α全人源单克隆抗体的纯化方法，首先将整合了TNF-α克隆抗体基因的CHO细胞为表达系统培养细胞液，接着将细胞液经深层过滤去除细胞器以及细胞碎片，最后将过滤后的细胞液经过Protein A亲和层析后上样于平衡后的阳离子层析柱中；其中，所述层析柱的填料为磺酸基(-SO3H)阳离子交换层析介质，上样细胞液中重组抗TNF-α全人源单克隆抗体的浓度为6.88mg/mL，填料实际载量为15mg/mL；平衡上样后，首先采用平衡缓冲液1第一次淋洗，接着采用平衡缓冲液2第二次淋洗，接着采用平衡缓冲液2和平衡缓冲液3的混合液第三次淋洗，最后进行洗脱获得纯化抗体；其中，平衡缓冲液1为磷酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液，平衡缓冲液2为磷酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液，平衡缓冲液3为磷酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液。
优选地，第一次淋洗中，平衡缓冲液1中磷酸根离子或醋酸根离子的浓度为20-40mmol/L。
优选地，第一次淋洗中，平衡缓冲液1的pH值为4.8-5.2。
优选地，第一次淋洗中，平衡缓冲液1中还含有氯化钠。
优选地，所述氯化钠的浓度为30-70mmol/L。
优选地，第二次淋洗中，平衡缓冲液2中磷酸根离子或醋酸根离子的浓度为30-70mmol/L。
优选地，第二次淋洗中，平衡缓冲液2的pH值为5.8-6.6。
优选地，第三次淋洗中，平衡缓冲液2中磷酸根离子或醋酸根离子的浓度为30-70mmol/L。
优选地，第三次淋洗中，平衡缓冲液2的pH值为5.8-6.6。
优选地，第三次淋洗中，平衡缓冲液3中磷酸根离子或醋酸根离子的浓度为30-70mmol/L。
优选地，第三次淋洗中，平衡缓冲液3的pH值为6.8-7.6。
优选地，第三次淋洗中，平衡缓冲液2与平衡缓冲液3的体积比为3-7：2-3。
优选地，第一次淋洗的淋洗体积不少于3个柱体积。
优选地，第二次淋洗的淋洗体积不少于3个柱体积。
优选地，第三次淋洗采用等度洗脱的方式淋洗。
优选地，第三次淋洗采用等度洗脱的方式淋洗中，洗脱体积为5-9个柱体积。
优选地，采用平衡缓冲液3进行洗脱获得纯化抗体。
优选地，在采用平衡缓冲液3进行洗脱的过程中，平衡缓冲液3中磷酸根离子或醋酸根离子的浓度为30-70mmol/L。
优选地，在采用平衡缓冲液3进行洗脱的过程中，平衡缓冲液3的pH值为6.8-7.6。
优选地，洗脱的起点为采用平衡缓冲液2和平衡缓冲液3的混合液淋洗结束后。
优选地，洗脱的终点为紫外检测器检测值达到10-40mAU/m。
本发明在洗脱的过程中先采用平衡缓冲液1第一次淋洗，接着采用平衡缓冲液2第二次淋洗，最后采用平衡缓冲液2和平衡缓冲液3的混合液第三次淋洗，进行第三次淋洗后再进行洗脱收集抗体溶液，显著降低了重组抗TNF-α全人源单克隆抗体中的酸性组分含量，并且提高了重组抗TNF-α全人源单克隆抗体的纯度。
附图说明
图1为本发明实施例7的UV监测图谱。
图2为本发明试验例1的UV监测图谱。
具体实施方式
下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
实施例1
一种重组抗TNF-α全人源单克隆抗体的纯化方法，包括对抗体进行阳离子交换色谱洗脱，其过程具体包括：平衡上样后，首先采用平衡缓冲液1第一次淋洗，接着采用平衡缓冲液2第二次淋洗，接着采用平衡缓冲液2和平衡缓冲液3的混合液第三次淋洗，最后进行洗脱获得纯化抗体；其中，平衡缓冲液1为磷酸盐缓冲液，平衡缓冲液2为磷酸盐缓冲液，平衡缓冲液3为醋酸盐缓冲液。
实施例2
一种重组抗TNF-α全人源单克隆抗体的纯化方法，包括对抗体进行阳离子交换色谱洗脱，其过程具体包括：平衡上样后，首先采用平衡缓冲液1第一次淋洗，接着采用平衡缓冲液2第二次淋洗，接着采用平衡缓冲液2和平衡缓冲液3的混合液第三次淋洗，最后进行洗脱获得纯化抗体；其中，平衡缓冲液1为醋酸盐缓冲液，平衡缓冲液2为醋酸盐缓冲液，平衡缓冲液3为醋酸盐缓冲液；
其中，第一次淋洗中，平衡缓冲液1中醋酸根离子的浓度为20mmol/L；
第一次淋洗中，平衡缓冲液1的pH值为4.8；
第一次淋洗中，平衡缓冲液1中还含有氯化钠；
所述氯化钠的浓度为30mmol/L；
第二次淋洗中，平衡缓冲液2中醋酸根离子的浓度为30mmol/L；
第二次淋洗中，平衡缓冲液2的pH值为5.8；
第三次淋洗采用等度洗脱的方式淋洗；
第三次淋洗采用等度洗脱的方式淋洗中，洗脱体积为5个柱体积；
第三次淋洗中，平衡缓冲液2中醋酸根离子的浓度为30mmol/L；
第三次淋洗中，平衡缓冲液2的pH值为5.8；
第三次淋洗中，平衡缓冲液3中醋酸根离子的浓度为30mmol/L；
第三次淋洗中，平衡缓冲液3的pH值为6.8；
第三次淋洗中，平衡缓冲液2与平衡缓冲液3的体积比为3：2；
第一次淋洗和第二次淋洗的淋洗体积均为3个柱体积；
采用平衡缓冲液3进行洗脱获得纯化抗体，其中，平衡缓冲液3的醋酸根离子的浓度为30mmol/L，pH值为6.8；
洗脱的起点为采用平衡缓冲液2和平衡缓冲液3的混合液淋洗结束后；
洗脱的终点为紫外检测器检测值达到10mAU/m。
实施例3
一种重组抗TNF-α全人源单克隆抗体的纯化方法，包括对抗体进行阳离子交换色谱洗脱，其过程具体包括：平衡上样后，首先采用平衡缓冲液1第一次淋洗，接着采用平衡缓冲液2第二次淋洗，接着采用平衡缓冲液2和平衡缓冲液3的混合液第三次淋洗，最后进行洗脱获得纯化抗体；其中，平衡缓冲液1为醋酸盐缓冲液，平衡缓冲液2为醋酸盐缓冲液，平衡缓冲液3为醋酸盐缓冲液；
其中，第一次淋洗中，平衡缓冲液1中醋酸根离子的浓度为30mmol/L；
第一次淋洗中，平衡缓冲液1的pH值为5.0；
第一次淋洗中，平衡缓冲液1中还含有氯化钠；
所述氯化钠的浓度为50mmol/L；
第二次淋洗中，平衡缓冲液2中醋酸根离子的浓度为50mmol/L；
第二次淋洗中，平衡缓冲液2的pH值为6.2；
第三次淋洗采用等度洗脱的方式淋洗；
第三次淋洗采用等度洗脱的方式淋洗中，洗脱体积为5个柱体积；
第三次淋洗中，平衡缓冲液2中醋酸根离子的浓度为50mmol/L；
第三次淋洗中，平衡缓冲液2的pH值为6.2；
第三次淋洗中，平衡缓冲液3中醋酸根离子的浓度为50mmol/L；
第三次淋洗中，平衡缓冲液3的pH值为7.2；
第三次淋洗中，平衡缓冲液2与平衡缓冲液3的体积比为13：7；
第一次淋洗和第二次淋洗的淋洗体积均为3个柱体积；
采用平衡缓冲液3进行洗脱获得纯化抗体，其中，平衡缓冲液3的醋酸根离子的浓度为50mmol/L，pH值为7.2；
洗脱的起点为采用平衡缓冲液2和平衡缓冲液3的混合液淋洗结束后；
洗脱的终点为紫外检测器检测值达到25mAU/m。
实施例4
一种重组抗TNF-α全人源单克隆抗体的纯化方法，包括对抗体进行阳离子交换色谱洗脱，其过程具体包括：平衡上样后，首先采用平衡缓冲液1第一次淋洗，接着采用平衡缓冲液2第二次淋洗，接着采用平衡缓冲液2和平衡缓冲液3的混合液第三次淋洗，最后进行洗脱获得纯化抗体；其中，平衡缓冲液1为醋酸盐缓冲液，平衡缓冲液2为醋酸盐缓冲液，平衡缓冲液3为醋酸盐缓冲液；
其中，第一次淋洗中，平衡缓冲液1中醋酸根离子的浓度为40mmol/L；
第一次淋洗中，平衡缓冲液1的pH值为5.2；
第一次淋洗中，平衡缓冲液1中还含有氯化钠；
所述氯化钠的浓度为70mmol/L；
第二次淋洗中，平衡缓冲液2中醋酸根离子的浓度为70mmol/L；
第二次淋洗中，平衡缓冲液2的pH值为6.6；
第三次淋洗采用等度洗脱的方式淋洗；
第三次淋洗采用等度洗脱的方式淋洗中，洗脱体积为5个柱体积；
第三次淋洗中，平衡缓冲液2中醋酸根离子的浓度为70mmol/L；
第三次淋洗中，平衡缓冲液2的pH值为6.6；
第三次淋洗中，平衡缓冲液3中醋酸根离子的浓度为70mmol/L；
第三次淋洗中，平衡缓冲液3的pH值为7.6；
第三次淋洗中，平衡缓冲液2与平衡缓冲液3的体积比为7：3；
第一次淋洗和第二次淋洗的淋洗体积均为3个柱体积；
采用平衡缓冲液3进行洗脱获得纯化抗体，其中，平衡缓冲液3的醋酸根离子的浓度为70mmol/L，pH值为7.6；
洗脱的起点为采用平衡缓冲液2和平衡缓冲液3的混合液淋洗结束后；
洗脱的终点为紫外检测器检测值达到40mAU/m。
实施例5
一种重组抗TNF-α全人源单克隆抗体的纯化方法，包括对抗体进行阳离子交换色谱洗脱，其过程具体包括：平衡上样后，首先采用平衡缓冲液1第一次淋洗，接着采用平衡缓冲液2第二次淋洗，接着采用平衡缓冲液2和平衡缓冲液3的混合液第三次淋洗，最后进行洗脱获得纯化抗体；其中，平衡缓冲液1为磷酸盐缓冲液，平衡缓冲液2为磷酸盐缓冲液，平衡缓冲液3为磷酸盐缓冲液；
其中，第一次淋洗中，平衡缓冲液1中磷酸根离子的浓度为20mmol/L；
第一次淋洗中，平衡缓冲液1的pH值为5.0；
第一次淋洗中，平衡缓冲液1中还含有氯化钠；
所述氯化钠的浓度为50mmol/L；
第二次淋洗中，平衡缓冲液2中磷酸根离子的浓度为50mmol/L；
第二次淋洗中，平衡缓冲液2的pH值为6.2；
第三次淋洗采用等度洗脱的方式淋洗；
第三次淋洗采用等度洗脱的方式淋洗中，洗脱体积为5个柱体积；
第三次淋洗中，平衡缓冲液2中磷酸根离子的浓度为50mmol/L；
第三次淋洗中，平衡缓冲液2的pH值为6.2；
第三次淋洗中，平衡缓冲液3中磷酸根离子的浓度为50mmol/L；
第三次淋洗中，平衡缓冲液3的pH值为7.6；
第三次淋洗中，平衡缓冲液2与平衡缓冲液3的体积比为13：7；
第一次淋洗和第二次淋洗的淋洗体积为3个柱体积；
采用平衡缓冲液3进行洗脱获得纯化抗体，其中，平衡缓冲液3磷酸根离子的浓度为50mmol/L，pH值为7.6；
洗脱的起点为采用平衡缓冲液2和平衡缓冲液3的混合液淋洗结束后；
洗脱的终点为紫外检测器检测值达到25mAU/m。
实施例6
一种重组抗TNF-α全人源单克隆抗体的纯化方法，包括对抗体进行阳离子交换色谱洗脱，其过程具体包括：平衡上样后，首先采用平衡缓冲液1第一次淋洗，接着采用平衡缓冲液2第二次淋洗，接着采用平衡缓冲液2和平衡缓冲液3的混合液第三次淋洗，最后进行洗脱获得纯化抗体；其中，平衡缓冲液1为磷酸盐缓冲液，平衡缓冲液2为磷酸盐缓冲液，平衡缓冲液3为磷酸盐缓冲液；
其中，第一次淋洗中，平衡缓冲液1中磷酸根离子的浓度为20mmol/L；
第一次淋洗中，平衡缓冲液1的pH值为5.0；
第一次淋洗中，平衡缓冲液1中还含有氯化钠；
所述氯化钠的浓度为50mmol/L；
第二次淋洗中，平衡缓冲液2中磷酸根离子的浓度为50mmol/L；
第二次淋洗中，平衡缓冲液2的pH值为6.2；
第三次淋洗采用等度洗脱的方式淋洗；
第三次淋洗采用等度洗脱的方式淋洗中，洗脱体积为7个柱体积；
第三次淋洗中，平衡缓冲液2中磷酸根离子的浓度为50mmol/L；
第三次淋洗中，平衡缓冲液2的pH值为6.2；
第三次淋洗中，平衡缓冲液3中磷酸根离子的浓度为50mmol/L；
第三次淋洗中，平衡缓冲液3的pH值为7.6；
第三次淋洗中，平衡缓冲液2与平衡缓冲液3的体积比为13：7；
第一次淋洗和第二次淋洗的淋洗体积均为3个柱体积；
采用平衡缓冲液3进行洗脱获得纯化抗体，其中，平衡缓冲液3磷酸根离子的浓度为50mmol/L，pH值为7.6；
洗脱的起点为采用平衡缓冲液2和平衡缓冲液3的混合液淋洗结束后；
洗脱的终点为紫外检测器检测值达到25mAU/m。
实施例7
一种重组抗TNF-α全人源单克隆抗体的纯化方法，包括对抗体进行阳离子交换色谱洗脱，其过程具体包括：平衡上样后，首先采用平衡缓冲液1第一次淋洗，接着采用平衡缓冲液2第二次淋洗，接着采用平衡缓冲液2和平衡缓冲液3的混合液第三次淋洗，最后进行洗脱获得纯化抗体；其中，平衡缓冲液1为磷酸盐缓冲液，平衡缓冲液2为磷酸盐缓冲液，平衡缓冲液3为磷酸盐缓冲液；
其中，第一次淋洗中，平衡缓冲液1中磷酸根离子的浓度为20mmol/L；
第一次淋洗中，平衡缓冲液1的pH值为5.0；
第一次淋洗中，平衡缓冲液1中还含有氯化钠；
所述氯化钠的浓度为50mmol/L；
第二次淋洗中，平衡缓冲液2中磷酸根离子的浓度为50mmol/L；
第二次淋洗中，平衡缓冲液2的pH值为6.2；
第三次淋洗采用等度洗脱的方式淋洗；
第三次淋洗采用等度洗脱的方式淋洗中，洗脱体积为9个柱体积；
第三次淋洗中，平衡缓冲液2中磷酸根离子的浓度为50mmol/L；
第三次淋洗中，平衡缓冲液2的pH值为6.2；
第三次淋洗中，平衡缓冲液3中磷酸根离子的浓度为50mmol/L；
第三次淋洗中，平衡缓冲液3的pH值为7.6；
第三次淋洗中，平衡缓冲液2与平衡缓冲液3的体积比为13：7；
第一次淋洗和第二次淋洗的淋洗体积均为3个柱体积；
采用平衡缓冲液3进行洗脱获得纯化抗体，其中，平衡缓冲液3磷酸根离子的浓度为50mmol/L，pH值为7.6；
洗脱的起点为采用平衡缓冲液2和平衡缓冲液3的混合液淋洗结束后；
洗脱的终点为紫外检测器检测值达到25mAU/m；其中，得到的UV监测图谱参照图1。
试验例1
在对抗体进行阳离子交换色谱洗脱中，平衡上样后，先采用平衡缓冲液1淋洗，过柱至流出液紫外回归基线走平且淋洗体积为3个柱体积，接着采用平衡缓冲液3直接洗脱获得纯化抗体；其中，平衡缓冲液1和平衡缓冲液3均为醋酸盐缓冲液；
其中，所述平衡缓冲液1中醋酸根离子的浓度为20mmol/L；
所述平衡缓冲液1的pH值为4.8；
所述平衡缓冲液1中还含有氯化钠；
所述氯化钠的浓度为30mmol/L；
所述平衡缓冲液1淋洗的体积为3个柱体积；
所述平衡缓冲液3中醋酸根离子的浓度为50mmol/L；
所述平衡缓冲液3的pH值为7.6；
洗脱的起点为紫外检测器检测值达到10mAU/mm；
洗脱的终点为紫外检测器检测值达到10mAU/m；其中，得到的UV监测图谱参照图2。
对实施例2-7和试验例1分别进行IEX-UPLC检测，按峰面积归一化法分别计算酸峰、碱峰、主峰面积比例，检测结果如下表所示：
对比上表中实施例2、3、4与试验例1可知三步淋洗步骤相对于普通的一步淋洗可以更有效地去除酸性异质体和提高目的蛋白的含量。
对比上表中实施例5、6、7可知适当地增加第三次淋洗时的柱体积可以有效去除酸性变异体和增加目的蛋白纯度。
由上表可知实施例7为最优选的条件，可以使目的蛋白纯度提高21.11％。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种重组抗TNF-α全人源单克隆抗体的纯化方法，其特征在于，包括对抗体进行阳离子交换色谱洗脱，其过程具体包括：平衡上样后，首先采用平衡缓冲液1第一次淋洗，接着采用平衡缓冲液2第二次淋洗，接着采用平衡缓冲液2和平衡缓冲液3的混合液第三次淋洗，最后进行洗脱获得纯化抗体；其中，平衡缓冲液1为磷酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液，平衡缓冲液2为磷酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液，平衡缓冲液3为磷酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液。
2.根据权利要求1所述重组抗TNF-α全人源单克隆抗体的纯化方法，其特征在于，第一次淋洗中，平衡缓冲液1中磷酸根离子或醋酸根离子的浓度为20-40mmol/L；优选地，第一次淋洗中，平衡缓冲液1的pH值为4.8-5.2。
3.根据权利要求1或2所述重组抗TNF-α全人源单克隆抗体的纯化方法，其特征在于，第一次淋洗中，平衡缓冲液1中还含有氯化钠；优选地，所述氯化钠的浓度为30-70mmol/L。
4.根据权利要求1-3任一项所述重组抗TNF-α全人源单克隆抗体的纯化方法，其特征在于，第二次淋洗中，平衡缓冲液2中磷酸根离子或醋酸根离子的浓度为30-70mmol/L；优选地，第二次淋洗中，平衡缓冲液2的pH值为5.8-6.6。
5.根据权利要求1-4任一项所述重组抗TNF-α全人源单克隆抗体的纯化方法，其特征在于，第三次淋洗中，平衡缓冲液2中磷酸根离子或醋酸根离子的浓度为30-70mmol/L；优选地，第三次淋洗中，平衡缓冲液2的pH值为5.8-6.6；优选地，第三次淋洗中，平衡缓冲液3中磷酸根离子或醋酸根离子的浓度为30-70mmol/L；优选地，第三次淋洗中，平衡缓冲液3的pH值为6.8-7.6。
6.根据权利要求1-5任一项所述重组抗TNF-α全人源单克隆抗体的纯化方法，其特征在于，第三次淋洗中，平衡缓冲液2与平衡缓冲液3的体积比为3-7：2-3。
7.根据权利要求1-6任一项所述重组抗TNF-α全人源单克隆抗体的纯化方法，其特征在于，第一次淋洗的淋洗体积不少于3个柱体积；优选地，第二次淋洗的淋洗体积不少于3个柱体积。
8.根据权利要求1-7任一项所述重组抗TNF-α全人源单克隆抗体的纯化方法，其特征在于，第三次淋洗采用等度洗脱的方式淋洗；优选地，第三次淋洗采用等度洗脱的方式淋洗中，洗脱体积为5-9个柱体积。
9.根据权利要求1-8任一项所述重组抗TNF-α全人源单克隆抗体的纯化方法，其特征在于，采用平衡缓冲液3进行洗脱获得纯化抗体；优选地，在采用平衡缓冲液3进行洗脱的过程中，平衡缓冲液3中磷酸根离子或醋酸根离子的浓度为30-70mmol/L；优选地，在采用平衡缓冲液3进行洗脱的过程中，平衡缓冲液3的pH值为6.8-7.6。
10.根据权利要求1-9任一项所述重组抗TNF-α全人源单克隆抗体的纯化方法，其特征在于，洗脱的起点为采用平衡缓冲液2和平衡缓冲液3的混合液淋洗结束后；优选地，洗脱的终点为紫外检测器检测值达到10-40mAU/m。
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