CN109503704A - 一种重组人铁蛋白分离纯化方法 - Google Patents
一种重组人铁蛋白分离纯化方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109503704A CN109503704A CN201811622011.8A CN201811622011A CN109503704A CN 109503704 A CN109503704 A CN 109503704A CN 201811622011 A CN201811622011 A CN 201811622011A CN 109503704 A CN109503704 A CN 109503704A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- buffer
- chromatographic column
- elution buffer
- bestarose
- purification
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 66
- 238000000746 purification Methods 0.000 title claims abstract description 34
- 238000000926 separation method Methods 0.000 title claims abstract description 34
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 title claims abstract description 33
- 238000001814 protein method Methods 0.000 title claims abstract description 29
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 claims abstract description 60
- 238000008416 Ferritin Methods 0.000 claims abstract description 47
- 102000008857 Ferritin Human genes 0.000 claims abstract description 47
- 108050000784 Ferritin Proteins 0.000 claims abstract description 47
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 45
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims abstract description 24
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims abstract description 20
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 claims abstract description 16
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims abstract description 15
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 12
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 claims abstract description 9
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 5
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims abstract description 4
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 96
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 40
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 28
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 claims description 27
- 229910003460 diamond Inorganic materials 0.000 claims description 24
- 239000010432 diamond Substances 0.000 claims description 24
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 21
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 20
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 claims description 19
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims description 17
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 claims description 16
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims description 15
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 14
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 13
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims description 12
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 9
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 8
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 claims description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 7
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 6
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 claims description 4
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000013622 capto Q Substances 0.000 claims description 4
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 claims description 4
- 239000012619 Butyl Sepharose® Substances 0.000 claims description 2
- 239000012564 Q sepharose fast flow resin Substances 0.000 claims description 2
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000012618 butyl sepharose high performance Substances 0.000 claims description 2
- 235000012489 doughnuts Nutrition 0.000 claims description 2
- 230000005611 electricity Effects 0.000 claims 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 19
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 19
- 238000011084 recovery Methods 0.000 abstract description 11
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 abstract 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 abstract 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 21
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 5
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 5
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 2
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- IYLLULUTZPKQBW-UHFFFAOYSA-N Acrinol Chemical compound CC(O)C(O)=O.C1=C(N)C=CC2=C(N)C3=CC(OCC)=CC=C3N=C21 IYLLULUTZPKQBW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000007832 Na2SO4 Substances 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- VEQOALNAAJBPNY-UHFFFAOYSA-N antipyrine Chemical compound CN1C(C)=CC(=O)N1C1=CC=CC=C1 VEQOALNAAJBPNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000002059 diagnostic imaging Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000002539 nanocarrier Substances 0.000 description 1
- 229960005222 phenazone Drugs 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- JBJWASZNUJCEKT-UHFFFAOYSA-M sodium;hydroxide;hydrate Chemical compound O.[OH-].[Na+] JBJWASZNUJCEKT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开了一种重组人铁蛋白分离纯化方法，包括以下步骤：发酵后的大肠杆菌菌液离心后获得菌泥，菌泥溶解于缓冲液后进行加热、离心或过滤处理，得滤液；利用阴离子层析对步骤1)得到的滤液进行分离，收集含目的蛋白的洗脱缓冲液；利用阳离子层析对步骤2)得到含目的蛋白的洗脱缓冲液进行二次分离，收集含目的蛋白的洗脱缓冲液；利用疏水层析对步骤3)得到的含目的铁蛋白的洗脱缓冲液进行三次分离，收集含目的蛋白的洗脱缓冲液。本发明具有操作简便，目的蛋白回收率高，纯度高等优点。
Description
【技术领域】
本发明涉及蛋白质分离纯化的技术领域，特别是一种重组人铁蛋白分离纯化方法的技术领域。
【背景技术】
铁蛋白(Ferritin)广泛存在于各种生物体内，由24个亚基自发组成，笼状蛋白复合体结构，是一种天然的高分子生物材料。其在生物体内具有储存铁元素、抗氧化等功能，但作为一种天然的高分子材料，也可做为纳米载体广泛用于药物输送、医学成像等，同时铁蛋白可以与在肿瘤细胞内高效表达的转铁蛋白受体结合用于肿瘤的诊断与治疗。铁蛋白可用转基因技术在大肠杆菌内得到高效表达，然后进行菌体细胞破碎实现蛋白的分离纯化。传统的铁蛋白分离纯化方法大多采用沉淀法，包括乙醇沉淀、利凡诺沉淀和硫酸铵沉淀，但采用沉淀法制得的铁蛋白相对纯度和回收率都较低，后逐渐采用层析法取代沉淀法，通过离子交换层析和疏水层析等层析方式对铁蛋白进行分离纯化。但现有的一些层析法存在回收率低，每步层析都需要进行脱盐稀释操作较为繁琐不利于大规模生产，铁蛋白的纯度还不能达到医疗用品的级别。
【发明内容】
本发明的目的就是解决现有技术中的问题，提出一种重组人铁蛋白分离纯化方法，能够使铁蛋白分离纯化方法操作简便可适合大规模生产，蛋白回收率高，纯度高。
为实现上述目的，本发明提出了一种重组人铁蛋白分离纯化方法，包括以下步骤：
1)发酵后的大肠杆菌菌液离心后获得菌泥，菌泥溶解于缓冲液后进行加热、离心或过滤处理，得滤液；
2)利用阴离子层析对步骤1)得到的滤液进行分离，收集含铁蛋白的洗脱缓冲液；
3)利用阳离子层析对步骤2)得到含铁蛋白的洗脱缓冲液进行二次分离，收集含铁蛋白的洗脱缓冲液；
4)利用疏水层析对步骤3)得到的含铁蛋白的洗脱缓冲液进行三次分离，收集含铁蛋白的洗脱缓冲液。
作为优选，所述步骤1)中溶解菌泥的缓冲液为5-100mM PB或Tris pH7.0，所述步骤1)中加热的温度范围和时间分别为70-75℃、5-15min，所述步骤1)中过滤处理采用0.22um中空纤维或滤膜过滤处理方式。
作为优选，所述步骤2)具体为：取装有阴离子层析介质的层析柱，用0.5MNaOH处理层析柱，之后用结合缓冲液平衡层析柱后上样，再用清洗缓冲液清洗杂质，用洗脱缓冲液进行洗脱，收集含铁蛋白的洗脱缓冲液，用0.5M NaOH清洗结合能力比较强的杂质，用10mMNaOH保存层析柱。
作为优选，所述步骤2)中阴离子层析介质为Q Bestarose High Performance、QSepharose High Performance、DEAE Bestarose High Performance、DEAE SepharoseHigh Performance、SOURCE Q、Q Bestarose Fast Flow、Q Sepharose Fast Flow、DEAEBestarose Fast Flow、DEAE Sepharose Fast Flow、Q Bestarose Big Beads、Qsepharose Big Beads、Q Bestarose Big Beads、Q sepharose Big Beads、Diamond Q、Capto Q、Diamond Q mustang、Capto Q mustang、Capto DEAE、Diamond DEAE或DiamondDEAE mustang中的一种；所述步骤2)中结合缓冲液为5-100mM PB或Tris pH7.0；所述步骤2)中清洗缓冲液为5-100mM PB或MES pH6.0或5-100mM PB或Tris 0.1M NaCl pH7.0中的一种；所述步骤2)中洗脱缓冲液为5-100mM NaAC pH4.5或5-100mMPB 0.25MNaCl pH7.0；所述步骤2)中结合缓冲液平衡层析柱至流出液的PH和电导均与结合缓冲液的PH和电导保持一致。
作为优选，所述步骤3)具体为；取装有阳离子层析介质的层析柱，用0.5MNaOH处理层析柱，之后用结合缓冲液平衡层析柱后上样，再用洗脱缓冲液进行洗脱，收集含铁蛋白的洗脱缓冲液，用0.5M NaOH清洗结合能力比较强的杂质，用10mM NaOH保存层析柱。
作为优选，所述步骤3)中阳离子层析介质为SP Bestarose High Performance、SPSepharose High Performance、Diamond MMC、Capto MMC、Diamond MMC mustang、CaptoMMC impres、SP Bestarose Fast Flow、SP Sepharose Fast Flow、Capto SP impres、Diamond SP mustang、CM Bestarose Fast Flow或CM Sepharose Fast Flow中的一种；所述步骤3)中结合缓冲液为5-100mM NaAc pH5.0或5-100mM NaAc 0.2M NaCl pH5.0；所述步骤3)中洗脱缓冲液为5-100mM PB 0.01M NaCl pH6.0或5-100mM PB pH6.0；所述步骤3)中结合缓冲液平衡层析柱至流出液的PH和电导均与结合缓冲液的PH和电导保持一致。
作为优选，所述步骤4)具体为；取装有疏水层析介质的层析柱，用0.5M NaOH处理层析柱，之后用结合缓冲液平衡层析柱后上样，再用洗脱缓冲液进行洗脱，收集含铁蛋白的洗脱缓冲液，用纯水洗脱杂质，用0.5M NaOH清洗层析柱，用10mM NaOH保存层析柱。
作为优选，所述步骤4)中疏水层析介质为Butyl Bestarose High Performance、Butyl Sepharose High Performance、Diamond Butyl mustang、Capto Butyl impres、Butyl Bestarose Fast Flow、Phenyl Sepharose Fast Flow HS、Phenyl Sepharose FastFlow LS、Phenyl Bestarose Fast Flow HS、Phenyl Bestarose Fast Flow LS、ButylSepharose Fast Flow、Diamond butyl、Capto butyl、Capto Phenyl HS、Capto Phenylimpres、Diamond Phenyl mustang 或Diamond Phenyl中的一种；所述步骤4)中结合缓冲液为5-100mM PB或Tris0.8-2M Na2SO4pH7.0、5-100mM PB或Tris 1.5-3M NaCl pH7.0、5-100mM PB或Tris 0.8-2.5M(NH4)2SO4pH7.0或5-100mM PB或Tris 0.8-2M K2HPO4pH7.0中的一种；所述步骤4)中洗脱缓冲液为5-100mM PB或Tris 0.2-0.5M Na2SO4pH7.0、5-100mM PB或Tris 0.8-1.2M NaCl pH7.0、5-100mM PB或Tris 0.4-0.8M(NH4)2SO4pH7.0、5-100mM PB或Tris 0.4-0.8M K2HPO4pH7.0中的一种；所述步骤4)中结合缓冲液平衡层析柱至流出液的PH和电导均与结合缓冲液的PH和电导保持一致。
作为优选，所述步骤1)、步骤2)、步骤3)和步骤4)均需进行蛋白指标检测。
作为优选，所述蛋白指标指标检测采用凝胶过滤检测和离子色谱检测方式。
本发明的有益效果：本发明采用阴离子层析、阳离子层析和疏水层析三步层析方式制得的铁蛋白纯度和回收率高，纯度≥97％，可达到医疗用品级别，每步层析间不需要进行繁琐的脱盐稀释操作，方法操作简便，适合大规模生产，通过采用凝胶过滤检测和离子色谱检测对每步层析洗脱样品进行检测，增加铁蛋白分离纯化方法的可靠性。
本发明的特征及优点将通过实施例结合附图进行详细说明。
【附图说明】
图1是本发明一种重组人铁蛋白分离纯化方法的实施例1的步骤1)过程的凝胶过滤检测图；
图2是本发明一种重组人铁蛋白分离纯化方法的实施例1的步骤2)阴离子层析处理过程凝胶过滤检测图；
图3是本发明一种重组人铁蛋白分离纯化方法的实施例1的步骤3)阳离子层析处理过程凝胶过滤检测图；
图4是本发明一种重组人铁蛋白分离纯化方法的实施例1的步骤4)疏水层析处理过程凝胶过滤检测图；
图5是本发明一种重组人铁蛋白分离纯化方法的实施例2的步骤1)过程凝胶过滤检测图；
图6是本发明一种重组人铁蛋白分离纯化方法的实施例2的步骤2)阴离子层析处理过程凝胶过滤检测图；
图7是本发明一种重组人铁蛋白分离纯化方法的实施例2的步骤3)阳离子层析处理过程凝胶过滤检测图；
图8是本发明一种重组人铁蛋白分离纯化方法的实施例2的步骤4)疏水层析处理过程凝胶过滤检测图；
图9是本发明一种重组人铁蛋白分离纯化方法的三步层析处理前滤液样品的离子检测图；
图10是本发明一种重组人铁蛋白分离纯化方法的三步层析处理后样品的离子检测图；
图11是本发明一种重组人铁蛋白分离纯化方法的空白离子检测对照图。
【具体实施方式】
实施例1，本发明一种重组人铁蛋白分离纯化方法，包括以下步骤：
1)将10g大肠杆菌发酵液离心后得到菌泥，菌泥按质量体积比为1:10加入20mM PBpH7.0,搅匀后,800bar环境下高压匀浆破碎两遍，加热至72℃并恒定加热5min,12000g离心作用下离心处理10min，之后去上清，用0.22um滤膜过滤，得到滤液，对滤液进行凝胶过滤检测和离子色谱检测；
2)阴离子层析处理：取30ml阴离子层析介质Q Bestarose High Performance，装到BXK16/20层析柱中，以下层析过程均在AKTA蛋白纯化仪上进行，用0.5M NaOH处理阴离子层析介质，再用120ml结合缓冲液50mM PBpH7.0平衡层析柱至与基线持平位置，取100ml的按步骤1)得到的滤液调PH至7.0，上样，用100ml清洗缓冲液25mM PB pH6.0清洗杂质，用100ml洗脱缓冲液50mM PB 0.25M NaCl pH7.0洗脱目的铁蛋白并收集含铁蛋白的洗脱缓冲液，用40ml 25mM PB 1M NaCl pH7.0清洗杂质,之后用40ml 0.5M NaOH清洗柱子，洗去未洗脱的结合杂蛋白，用10mM NaOH平衡保存层析柱，对含铁蛋白的洗脱缓冲液进行凝胶过滤检测和离子色谱检测，该步阴离子层析得到含铁蛋白的洗脱缓冲液中目的蛋白纯度为97％，回收率为76.8％，载量为30mg/ml；
3)阳离子层析处理：取适量阳离子层析介质SP Bestarose High Performance装入BXK16/20，柱床高度为11.3cm，用40ml 0.5M NaOH处理层析柱,用结合缓冲液50mM NaAcpH5.0平衡层析柱，取按步骤2)得到的含铁蛋白的洗脱缓冲液样品145ml，调pH至5.0，上样，用结合缓冲液清洗，用60ml洗脱缓冲液20mM PB 0.01MNaCl pH6.0洗脱目的蛋白，用3CV纯水洗脱杂质后用3CV NaOH清洗柱子，10mM NaOH保存层析柱，对含铁蛋白的洗脱缓冲液进行凝胶过滤检测和离子色谱检测，该步阳离子层析得到含铁蛋白的洗脱缓冲液中目的蛋白纯度为97.7％，回收率为99.3％，载量为10mg/ml；
4)疏水层析处理：取适量疏水层析介质Butyl Bestarose High Performance装入BXK16/20，柱床高度为11cm，用40ml 0.5M NaOH处理层析柱,用结合缓冲液20mM PB 1.0MNa2SO4pH7.0平衡层析柱，取按步骤3)得到的含铁蛋白的洗脱缓冲液样品10ml，样品加Na2SO4调电导至与结合缓冲液的电导相同，调pH7.0，上样，用结合缓冲液清洗，用洗脱缓冲液20mM PB 0.5M Na2SO4pH7.0洗脱目的蛋白，用60ml纯水洗脱杂质后用60ml NaOH清洗柱子，10mM NaOH保存层析柱，对含铁蛋白的洗脱缓冲液进行凝胶过滤检测和离子色谱检测，该步疏水层析得到含铁蛋白的洗脱缓冲液中目的蛋白纯度为98.7％，回收率为68.2％，载量为20mg/ml；
步骤1)参阅图1可获得滤液样品凝胶过滤检测目的蛋白出峰时间为27.89min；
步骤2)参阅图2可获得采用阴离子层析介质Q Bestarose High Performance的洗脱缓冲液样品凝胶过滤检测目的蛋白出峰时间为27.92min；
步骤3)参阅图3可获得采用阳离子层析介质SP Bestarose High Performance的洗脱缓冲液样品凝胶过滤检测目的蛋白出峰时间为27.85min；
步骤4)参阅图4可获得采用疏水层析介质Butyl Bestarose High Performance的洗脱缓冲液样品凝胶过滤检测目的蛋白出峰时间为27.96min。
实施例2，本发明一种重组人铁蛋白分离纯化方法，包括以下步骤：
1)将10g大肠杆菌发酵液离心后得到菌泥，菌泥按质量体积比为1:10加入20mM PBpH7.0,搅匀后,800bar环境下高压匀浆破碎两遍，加热至72℃并恒定加热5min,12000g离心作用下离心处理10min，之后去上清，用0.22um滤膜过滤，得到滤液，对滤液进行凝胶过滤检测和离子色谱检测；
2)阴离子层析处理：取40ml阴离子层析介质DEAE Bestarose High Performance，装到BXK16/20层析柱中，以下层析过程均在AKTA蛋白纯化仪上进行，用0.5M NaOH处理阴离子层析介质，再用120ml结合缓冲液50mM PB pH7.0平衡层析柱至与基线持平位置，取100ml的按步骤1)得到的滤液调PH至7.0，上样，用100ml清洗缓冲液50mM PB 0.1M NaCl pH7.0清洗杂质，用120ml洗脱缓冲液50mM PB 0.25M NaCl pH7.0洗脱目的铁蛋白并收集含铁蛋白的洗脱缓冲液，用40ml的50mM PB 1M NaCl pH7.0清洗杂质,之后用40ml 0.5MNaOH清洗柱子，洗去未洗脱的结合蛋白，用10mM NaOH平衡保存层析柱，对含铁蛋白的洗脱缓冲液进行凝胶过滤检测和离子色谱检测，该步阴离子层析得到含铁蛋白的洗脱缓冲液中目的蛋白纯度为76.48％，回收率为80％，载量为30mg/ml；
3)阳离子层析处理：取适量阳离子层析介质Diamond MMC mustang装入BXK16/20，柱床高度为13cm，用40ml 0.5M NaOH处理层析柱,用结合缓冲液20mMNaAc 0.2M NaClpH5.0平衡层析柱，取按步骤2)得到的含铁蛋白的洗脱缓冲液样品145ml，样品用纯水稀释至和结合缓冲液电导相同，调PH至7.0，上样，用结合缓冲液清洗，用40ml洗脱缓冲液20mMPB pH6.0洗脱目的蛋白，用40ml的NaOH清洗柱子，10mM NaOH保存层析柱，对含铁蛋白的洗脱缓冲液进行凝胶过滤检测和离子色谱检测，该步阳离子层析得到含铁蛋白的洗脱缓冲液中目的蛋白纯度为94％，回收率为88.6％，载量为20mg/ml；
4)疏水层析处理：取适量疏水层析介质Phenyl Bestarose Fast Flow HS装入BXK16/20，柱床高度为10.5cm，用40ml 0.5M NaOH处理层析柱,用结合缓冲液20mM PB 2MNaCl pH7.0平衡层析柱，取按步骤3)得到的含铁蛋白的洗脱缓冲液样品10ml，样品加NaCl调电导至与结合缓冲液的电导相同，调pH7.0，上样，用结合缓冲液清洗，用洗脱缓冲液20mMPB 1M NaCl pH7.0洗脱目的蛋白，用60ml纯水洗脱杂质后用60ml NaOH清洗柱子，10mMNaOH保存层析柱，对含铁蛋白的洗脱缓冲液进行凝胶过滤检测和离子色谱检测，该步疏水层析得到含铁蛋白的洗脱缓冲液中目的蛋白纯度为98.47％，回收率为61％，载量为17.76mg/ml；
步骤1)参阅图5可获得滤液样品凝胶过滤检测目的蛋白出峰时间为27.89min；
步骤2)参阅图6可获得采用阴离子层析介质DEAE Bestarose HighPerformance的洗脱缓冲液样品凝胶过滤检测目的蛋白出峰时间为27.86min；
步骤3)参阅图7可获得采用阳离子层析介质Diamond MMC mustang的洗脱缓冲液样品凝胶过滤检测目的蛋白出峰时间为27.91min；
步骤4)参阅图8可获得采用疏水层析介质Phenyl Bestarose Fast Flow HS的洗脱缓冲液样品凝胶过滤检测目的蛋白出峰时间为28.04min。
本发明一种重组人铁蛋白分离纯化方法，本发明采用阴离子层析、阳离子层析和疏水层析三步层析方式制得的铁蛋白纯度和回收率高，参阅图9至11，离子检测图中主峰变大，杂峰越来越小，纯度≥97％，可达到医疗用品级别，每步层析间不需要进行繁琐的脱盐稀释操作，方法操作简便，适合大规模生产，通过采用凝胶过滤检测和离子色谱检测对每步层析洗脱样品进行检测，增加铁蛋白分离纯化方法的可靠性。
上述实施例是对本发明的说明，不是对本发明的限定，任何对本发明简单变换后的方案均属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种重组人铁蛋白分离纯化方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)发酵后的大肠杆菌菌液离心后获得菌泥，菌泥溶解于缓冲液后进行加热、离心或过滤处理，得滤液；
2)利用阴离子层析对步骤1)得到的滤液进行分离，收集含铁蛋白的洗脱缓冲液；
3)利用阳离子层析对步骤2)得到含铁蛋白的洗脱缓冲液进行二次分离，收集含铁蛋白的洗脱缓冲液；
4)利用疏水层析对步骤3)得到的含铁蛋白的洗脱缓冲液进行三次分离，收集含铁蛋白的洗脱缓冲液。
2.如权利要求1所述的重组人铁蛋白分离纯化方法，其特征在于：所述步骤1)中溶解菌泥的缓冲液为5-100mM PB或Tris pH7.0，所述步骤1)中加热的温度范围和时间分别为70-75℃、5-15min，所述步骤1)中过滤处理采用0.22um中空纤维或滤膜过滤处理方式。
3.如权利要求1所述的重组人铁蛋白分离纯化方法，其特征在于：所述步骤2)具体为：取装有阴离子层析介质的层析柱，用0.5M NaOH处理层析柱，之后用结合缓冲液平衡层析柱后上样，再用清洗缓冲液清洗杂质，用洗脱缓冲液进行洗脱，收集含铁蛋白的洗脱缓冲液，用0.5M NaOH清洗结合能力比较强的杂质，用10mM NaOH保存层析柱。
4.如权利要求3所述的重组人铁蛋白分离纯化方法，其特征在于：所述步骤2)中阴离子层析介质为Q Bestarose High Performance、Q Sepharose High Performance、DEAEBestarose High Performance、DEAE Sepharose High Performance、SOURCE Q、QBestarose Fast Flow、Q Sepharose Fast Flow、DEAE Bestarose Fast Flow、DEAESepharose Fast Flow、Q Bestarose Big Beads、Q sepharose Big Beads、Q BestaroseBig Beads、Q sepharose Big Beads、Diamond Q、Capto Q、Diamond Q mustang、Capto Qmustang、Capto DEAE、Diamond DEAE或Diamond DEAE mustang中的一种；
所述步骤2)中结合缓冲液为5-100mM PB或Tris pH7.0；
所述步骤2)中清洗缓冲液为5-100mM PB或MES pH6.0或5-100mM PB或Tris 0.1M NaClpH7.0中的一种；
所述步骤2)中洗脱缓冲液为5-100mM NaAC pH4.5或5-100mMPB 0.25M NaCl pH7.0；
所述步骤2)中结合缓冲液平衡层析柱至流出液的PH和电导均与结合缓冲液的PH和电导保持一致。
5.如权利要求1所述的重组人铁蛋白分离纯化方法，其特征在于：所述步骤3)具体为；取装有阳离子层析介质的层析柱，用0.5M NaOH处理层析柱，之后用结合缓冲液平衡层析柱后上样，洗脱缓冲液进行洗脱，收集含铁蛋白的洗脱缓冲液，用0.5M NaOH清洗结合能力比较强的杂质，用10mM NaOH保存层析柱。
6.如权利要求5所述的重组人铁蛋白分离纯化方法，其特征在于：所述步骤3)中阳离子层析介质为SP Bestarose High Performance、SP Sepharose High Performance、DiamondMMC、Capto MMC、Diamond MMC mustang、Capto MMC impres、SP Bestarose Fast Flow、SPSepharose Fast Flow、Capto SP impres、Diamond SP mustang、CM Bestarose Fast Flow或CM Sepharose Fast Flow中的一种；
所述步骤3)中结合缓冲液为5-100mM NaAc pH5.0或5-100mM NaAc 0.2M NaCl pH5.0；
所述步骤3)中洗脱缓冲液为5-100mM PB 0.01M NaCl pH6.0或5-100mM PB pH6.0；
所述步骤3)中结合缓冲液平衡层析柱至流出液的PH和电导均与结合缓冲液的PH和电导保持一致。
7.如权利要求1中所述的重组人铁蛋白分离纯化方法，其特征在于：所述步骤4)具体为；取装有疏水层析介质的层析柱，用0.5M NaOH处理层析柱，之后用结合缓冲液平衡层析柱后上样，再用洗脱缓冲液进行洗脱，收集含铁蛋白的洗脱缓冲液，用纯水洗脱杂质，用0.5M NaOH清洗层析柱，用10mM NaOH保存层析柱。
8.如权利要求7中所述的重组人铁蛋白分离纯化方法，其特征在于：所述步骤4)中疏水层析介质为Butyl Bestarose High Performance、Butyl Sepharose High Performance、Diamond Butyl mustang、Capto Butyl impres、Butyl Bestarose Fast Flow、PhenylSepharose Fast Flow HS、Phenyl Sepharose Fast Flow LS、Phenyl Bestarose FastFlow HS、Phenyl Bestarose Fast Flow LS、Butyl Sepharose Fast Flow、Diamondbutyl、Capto butyl、Capto Phenyl HS、Capto Phenyl impres、Diamond Phenyl mustang或Diamond Phenyl中的一种；
所述步骤4)中结合缓冲液为5-100mM PB或Tris 0.8-2M Na2SO4pH7.0、5-100mM PB或Tris 1.5-3M NaCl pH7.0、5-100mM PB或Tris 0.8-2.5M(NH4)2SO4pH7.0或5-100mM PB或Tris 0.8-2M K2HPO4pH7.0中的一种；
所述步骤4)中洗脱缓冲液为5-100mM PB或Tris 0.2-0.5M Na2SO4pH7.0、5-100mM PB或Tris 0.8-1.2M NaCl pH7.0、5-100mM PB或Tris 0.4-0.8M(NH4)2SO4pH7.0、5-100mM PB或Tris 0.4-0.8M K2HPO4pH7.0中的一种。
所述步骤4)中结合缓冲液平衡层析柱至流出液的PH和电导均与结合缓冲液的PH和电导保持一致。
9.如权利要求1所述的重组人铁蛋白分离纯化方法，其特征在于：所述步骤1)、步骤2)、步骤3)和步骤4)均需进行蛋白指标检测。
10.如权利要求1所述的重组人铁蛋白分离纯化方法，其特征在于：所述蛋白指标指标检测采用凝胶过滤检测和离子色谱检测方式。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201811622011.8A CN109503704A (zh) | 2018-12-28 | 2018-12-28 | 一种重组人铁蛋白分离纯化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201811622011.8A CN109503704A (zh) | 2018-12-28 | 2018-12-28 | 一种重组人铁蛋白分离纯化方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN109503704A true CN109503704A (zh) | 2019-03-22 |
Family
ID=65756534
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201811622011.8A Pending CN109503704A (zh) | 2018-12-28 | 2018-12-28 | 一种重组人铁蛋白分离纯化方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN109503704A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110759986A (zh) * | 2019-10-18 | 2020-02-07 | 大连工业大学 | 一种可逆自组装蛋白的高效制备方法 |
| CN111875696A (zh) * | 2020-08-17 | 2020-11-03 | 郑州伊美诺生物技术有限公司 | 一种纯化Ferr的方法 |
| CN112646045A (zh) * | 2021-01-06 | 2021-04-13 | 海默斯（重庆）医学生物技术有限公司 | 一种重组角蛋白分离纯化方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20020092089A (ko) * | 2001-06-02 | 2002-12-11 | 한국생명공학연구원 | 인간 훼리틴 유전자의 발현벡터, 이를 포함하는 대장균형질전환체 및 상기 형질전환체를 이용한 인간 훼리틴단백질의 제조방법 |
| KR20040007892A (ko) * | 2002-07-11 | 2004-01-28 | 주식회사 바이오프로젠 | 재조합 인간 훼리틴 단백질 및 그 제조방법 |
| CN102127166A (zh) * | 2010-01-14 | 2011-07-20 | 中国科学院地质与地球物理研究所 | 一种从生物组织或工程菌中分离纯化铁蛋白的方法 |
| CN107033237A (zh) * | 2017-05-11 | 2017-08-11 | 深圳市卫光生物制品股份有限公司 | 一种人血浆载脂蛋白a‑i的分离纯化方法 |
-
2018
- 2018-12-28 CN CN201811622011.8A patent/CN109503704A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20020092089A (ko) * | 2001-06-02 | 2002-12-11 | 한국생명공학연구원 | 인간 훼리틴 유전자의 발현벡터, 이를 포함하는 대장균형질전환체 및 상기 형질전환체를 이용한 인간 훼리틴단백질의 제조방법 |
| KR20040007892A (ko) * | 2002-07-11 | 2004-01-28 | 주식회사 바이오프로젠 | 재조합 인간 훼리틴 단백질 및 그 제조방법 |
| CN102127166A (zh) * | 2010-01-14 | 2011-07-20 | 中国科学院地质与地球物理研究所 | 一种从生物组织或工程菌中分离纯化铁蛋白的方法 |
| CN107033237A (zh) * | 2017-05-11 | 2017-08-11 | 深圳市卫光生物制品股份有限公司 | 一种人血浆载脂蛋白a‑i的分离纯化方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 李志鹏等: "铁蛋白Ferritin原核表达和纯化及纳米颗粒胞外自组装", 《畜牧兽医学报》 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110759986A (zh) * | 2019-10-18 | 2020-02-07 | 大连工业大学 | 一种可逆自组装蛋白的高效制备方法 |
| CN110759986B (zh) * | 2019-10-18 | 2023-01-31 | 大连工业大学 | 一种可逆自组装蛋白的高效制备方法 |
| CN111875696A (zh) * | 2020-08-17 | 2020-11-03 | 郑州伊美诺生物技术有限公司 | 一种纯化Ferr的方法 |
| CN112646045A (zh) * | 2021-01-06 | 2021-04-13 | 海默斯（重庆）医学生物技术有限公司 | 一种重组角蛋白分离纯化方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102977182B (zh) | 在蛋白质纯化过程中降低样品中的一种或多种杂质水平的方法 | |
| AU2014264697B2 (en) | Continuous multistep process for purifying antibodies | |
| CN109503704A (zh) | 一种重组人铁蛋白分离纯化方法 | |
| US20150065696A1 (en) | Apparatus and process for purification of proteins | |
| CN107383161A (zh) | 生物分子的纯化 | |
| JP7430012B2 (ja) | アダリムマブのｎｏｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ａ精製方法 | |
| CN109929027B (zh) | 采用线性洗脱步骤的重组融合蛋白纯化方法 | |
| JP2017060488A (ja) | 組み換え大腸菌からヒト顆粒球コロニー刺激因子を精製する方法 | |
| CN112409477B (zh) | IgM纯化方法 | |
| CN109641969A (zh) | 用于分开单克隆抗体的同种型的方法 | |
| CN107964044B (zh) | 从乳样中纯化抗cd20单克隆抗体的方法 | |
| CN104710527B (zh) | 一种生物制品的内毒素去除方法 | |
| CN109320611B (zh) | 一种人鼠嵌合单克隆抗体生物类似药的纯化方法 | |
| US20220267411A1 (en) | Refining method of ophthalmic protein pharmaceutical | |
| CN112898387B (zh) | 一种重组金黄色葡萄球菌疫苗抗原蛋白的纯化方法 | |
| CN109929038B (zh) | Vegf捕获剂融合蛋白的纯化方法 | |
| CN118459537A (zh) | 重组蛋白的纯化方法 | |
| CN103159824A (zh) | 一种全封闭管路化的蛋白质纯化系统及其在无菌无热原蛋白质药物制备上的应用 | |
| CN104109204A (zh) | 一种从水稻种子中分离纯化重组人乳铁蛋白的方法 | |
| JP7445332B2 (ja) | ベバシズマブ精製の最適化された方法 | |
| WO1995029187A1 (en) | Chromatographic process for the copurification of chondroitinase i and ii proteins | |
| CN106519029A (zh) | 一种Aβ寡聚体抗体的制备工艺 | |
| CN116375860A (zh) | 一种抗体的纯化方法 | |
| CN113480622A (zh) | 一种重组肺炎球菌溶血素制备及纯化的方法 | |
| CN111521813A (zh) | 绿色荧光蛋白融合蛋白免疫亲和柱的制备方法、免疫亲和柱及其运用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190322 |