CN107033237A - 一种人血浆载脂蛋白a‑i的分离纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人血浆载脂蛋白A‑I的分离纯化方法，包括以下步骤：1)将人血浆组分FIV‑1蛋白沉淀溶解于缓冲液中，过滤，得滤液；2)利用阴离子交换层析对步骤1)得到的滤液进行初步分离，收集含载脂蛋白A‑I的洗脱液；3)利用阳离子交换层析对步骤2)中的收集的载脂蛋白A‑I洗脱液进行二次分离，收集含载脂蛋白A‑I的洗脱液；4)利用疏水作用层析对步骤3)中的收集的洗脱液进行三次分离，收集含载脂蛋白A‑I的洗脱液。本方法步骤简单、安全性好、易规模化生产，得到的载脂蛋白A‑I纯度≥95％，每步层析回收率≥90％，解决了目前载脂蛋白制备方法中纯度和回收率低的问题。
Description
技术领域
本发明属于蛋白质分离纯化领域，尤其涉及一种载脂蛋白A-I的分离纯化方法。
背景技术
人血浆载脂蛋白A-I作为高密度脂蛋白的主要载脂蛋白成份，分子量为28kDa，由243个氨基酸组成，等电点5.6左右。高密度脂蛋白在血浆中浓度约为3g/L。高密度脂蛋白运载周围组织中的胆固醇，再转化为胆汁酸或直接通过胆汁从肠道排出，动脉造影证明高密度脂蛋白胆固醇含量与动脉管腔狭窄程度呈显著的负相关。所以高密度脂蛋白是一种抗动脉粥样硬化的血浆脂蛋白，是冠心病的保护因子。俗称“血管清道夫”。在胆固醇从外周逆向转运如肝脏降解或者循环的过程中，载脂蛋白A-I起着关键作用，是高密度脂蛋白具有抗动脉粥样硬化的主要作用机制承担者。所以载脂蛋白A-I具有很好的抗动脉粥样硬化应用潜力，尤其是在拥有庞大人口的中国，受动脉粥样硬化困扰的人们越来越多，载脂蛋白A-I将会有巨大的临床应用价值。
目前，国内外都没有载脂蛋白A-I产品上市，据了解国外大都也是处于临床前研究和临床研究阶段。载脂蛋白A-I的一般纯化方法有超速离心、溶剂萃取、有机溶剂沉淀法、传统的排阻层析法和电泳法等。现有的载脂蛋白A-I的制备方法存在以下缺点：(1)载脂蛋白A-I的纯度和回收率较低，有些方法步骤过于复杂，不能同时达到最优；(2)制备规模小，不适合工业化生产；(3)成本高，如超速离心法需要超速离心机贵重仪器；(4)溶剂萃取和有机溶剂沉淀法的安全性差，部分有机溶剂具有生理毒性，有的还易燃易爆，不利于安全生产。(5)层析过程中使用变性剂不易于血浆蛋白的综合利用，易造成其他有价值蛋白的失活。
因此，开发一种高效安全的载脂蛋白A-I分离纯化方法非常重要。
发明内容
一方面，本发明提供一种人血浆载脂蛋白A-I的分离纯化方法，主要经过阴离子交换层析、阳离子交换层析和疏水作用层析，分离纯化出高纯度高回收率的载脂蛋白A-I，大大提高了血浆的综合利用度，降低生产成本。本发明分离出的载脂蛋白A-I具有高纯度、高回收率、易规模化生产、操作方便安全的特点。
一种人血浆载脂蛋白A-I的分离纯化方法，具体包括以下步骤：
1)将人血浆组分FIV-1蛋白沉淀溶解于缓冲液中，过滤，得滤液；
2)利用阴离子交换层析对步骤1)得到的滤液进行初步分离，收集含载脂蛋白A-I的洗脱液；
3)利用阳离子交换层析对步骤2)中的收集的载脂蛋白A-I洗脱液进行二次分离，收集含载脂蛋白A-I的洗脱液；
4)利用疏水作用层析对步骤3)中的收集的洗脱液进行三次分离，收集含载脂蛋白A-I的洗脱液。
在上述技术方案中，FIV-1蛋白沉淀是采用低温乙醇-Cohn法分离血浆蛋白工艺产生的。采用低温乙醇-Cohn法分离血浆蛋白，可以沉淀产生组份Ι、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、V五种组份，即FΙ、FⅡ、FⅢ、FⅣ、FV，而FⅣ又可分为组分IV-1和IV-2，即FIV-1和FIV-2，是低温乙醇法不同步骤得到的产物表示。其中，FIV-1又分为FIV-1上清液和FIV-1沉淀，FIV-1上清液用来提取其他蛋白，FIV-1沉淀现在血液制品企业一般废弃，为了提高人血浆的综合利用度，本发明将FIV-1沉淀再用缓冲液溶解，用于载脂蛋白A-I的纯化。
作为对上述技术方案的进一步改进，步骤1)中所述的缓冲液的pH为7.0～9.0；
优选地，所述的缓冲液为pH 7.0～9.0，10～100mM的磷酸盐缓冲液或pH 7.0～9.0，10～100mM的Tris-HCl缓冲液。
作为对上述技术方案的进一步改进，步骤1)中所述溶解在20～45℃的温度下进行5～10h。
所述步骤2)具体为：取装有阴离子交换层析填料的色谱柱，用平衡缓冲液平衡所述色谱柱，上样，然后用洗脱液进行洗脱，收集含载脂蛋白A-I的洗脱液。优选地，上样之前还包括：将步骤1)得到的滤液的pH调至与平衡缓冲液相同的步骤。
作为对上述技术方案的进一步改进，步骤2)所述的阴离子交换层析填料为DEAESepharose High Performance、DEAE Sepharose Fast Flow、DEAE Macro-Prep、Toyopearyl DEAE-650M、Q Sepharose High Performance、Q Sepharose Fast Flow或Capto Q。
作为对上述技术方案的进一步改进，步骤2)所述的平衡缓冲液为pH 6.5～9.0，10～100mM的Tris-HCl缓冲液或pH 6.5～9.0，10～100mM的磷酸盐缓冲液；
洗脱以A液和B液为洗脱液进行线性梯度洗脱，其中，所述A液为平衡缓冲液，所述B液为含0.08～0.15M NaCl，pH 6.5～9.0，10～100mM的Tris-HCl缓冲液或含0.08～0.15MNaCl，pH 6.5～9.0，10～100mM的磷酸盐缓冲液。以A液和B液为洗脱液进行梯度洗脱可以提高分离效率，同时实现更佳的分离效果。
所述的步骤3)具体为：取装有阳离子交换层析填料的色谱柱，用平衡缓冲液平衡所述色谱柱，上样，然后用洗脱液进行洗脱，收集含载脂蛋白A-I的洗脱液。优选地，上样之前还包括：将步骤2)得到的洗脱液的pH调至与起始的平衡缓冲液相同的步骤。
作为对上述技术方案的进一步改进，步骤3)所述的阳离子交换层析填料为SPSepharose High Performance、SP Sepharose Fast Flow、CM Sepharose HighPerformance、CM Sepharose Fast Flow、Macro-Prep High S或Macro-Prep CM。
作为对上述技术方案的进一步改进，步骤3)所述的平衡缓冲液为pH 4.5～6.0，10～100mM的柠檬酸或pH 4.5～6.0，10～100mM的磷酸盐缓冲液；
洗脱以A液和B液为洗脱液进行线性梯度洗脱，其中，所述A液为平衡缓冲液，所述B液为含0.08～0.15M NaCl，pH 4.5～6.0，10～100mM的柠檬酸或含0.08～0.15M NaCl，pH4.5～6.0，10～100mM的磷酸盐缓冲液。
所述的步骤4)具体为：取装有疏水作用层析填料的色谱柱，用平衡缓冲液平衡所述色谱柱，上样，然后用洗脱液进行洗脱，收集含载脂蛋白A-I的洗脱液。优选地，上样之前还包括：将步骤3)得到的洗脱液的电导调至与起始的平衡缓冲液相同的步骤。
作为对上述技术方案的进一步改进，步骤4)所述的疏水作用层析填料为ButylSepharose High Performance、Phenyl Sepharose High Performance、Octyl SepharoseHigh Performance、Phenyl Sepharose Fast Flow、Octyl Sepharose Fast Flow或ButylSepharose Fast Flow。
作为对上述技术方案的进一步改进，步骤4)所述的平衡缓冲液为含0.1～1MNaCl，pH 7.0～9.0，10～100mM的Tris-HCl缓冲液或含0.1～1M NaCl，pH 7.0～9.0，10～100mM的磷酸盐缓冲液；
洗脱以A液和B液为洗脱液进行线性梯度洗脱，其中，所述A液为平衡缓冲液，所述B液为pH 7.0～9.0，10～100mM的Tris-HCl缓冲液或pH 7.0～9.0，10～100mM的磷酸盐缓冲液。
另一方面，本发明还提供了如以上所述的方法制得的人血浆载脂蛋白A-I。
相对于现有技术，本发明提供的载脂蛋白A-I的分离纯化方法，其有益技术效果为：
(1)本发明提供的载脂蛋白A-I的分离纯化方法制得的载脂蛋白A-I具有高纯度、高回收率、步骤简单、安全性好以及易规模化生产的特点。如果只进行阴离子交换层析和疏水作用层析，得到的A-I纯度只有85％，而本申请提供的制备方法，得到的A-I纯度≥95％，每步层析回收率≥90％，并不是所有蛋白质分离纯化加入阳离子层析能达到这种纯度提高效果，本申请解决了目前载脂蛋白A-I制备方法中纯度和回收率低的缺点。
(2)本发明提供的载脂蛋白A-I的分离纯化方法具有操作简单、成本低和安全性好等优点，避免使用了有毒的有机溶剂或变性剂。
(3)本发明中的层析方式为离子交换层析和疏水作用层析，具有易放大，且填料易得等优点。本发明依次采用阴离子交换层析、阳离子交换层析和疏水作用层析进行载脂蛋白A-I的分离纯化，三个层析步骤必不可少且顺序不可替换，方能得到纯度≥95％的载脂蛋白A-I。
附图说明
图1是本发明的人血浆载脂蛋白A-I分离纯化方法的基本流程示意图。
图2是本发明的载脂蛋白A-I分离纯化方法中阴离子交换步骤的层析图。
图3是本发明的载脂蛋白A-I分离纯化方法中阳离子交换步骤的层析图。
图4是本发明的载脂蛋白A-I分离纯化方法中疏水作用层析步骤的层析图。
图5是本发明的载脂蛋白A-I分离纯化过程的SDS-PAGE图，其中，1：Marker；2：FIV-1沉淀溶解液；3：第一步阴离子交换层析载脂蛋白A-I洗脱液；4：第二步阳离子交换层析载脂蛋白A-I洗脱液；5：第三步疏水作用层析载脂蛋白A-I洗脱液。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。
实施例1
1.FIV-1沉淀的溶解
称取1g FIV-1沉淀溶解于10ml 20mM pH 6.5的磷酸盐缓冲液中，充分混合，于摇床上室温溶解5h，溶解结束后，离心去除硅藻土，上清液用0.45μm针筒式滤膜过滤，取滤液备用。
2.阴离子交换层析
取35ml 20％乙醇保存的DEAE Sepharose High Performance凝胶，用水反复置换，去除乙醇，放置达到温度平衡后用XK16/20装柱，以下层析过程都在GEExplore100蛋白纯化仪上进行，装柱完成后，柱高为13.2cm，用1％丙酮测其柱效为4865N/m，测完柱效后，柱子用水平衡5个柱体积，再用起始平衡缓冲液20mM pH 7.0磷酸盐缓冲液平衡5个柱体积。将FIV-1沉淀溶解液的滤液15ml调pH至7.0，上样。洗脱以A液和B液为洗脱液进行线性梯度洗脱，A液为平衡缓冲液，B液为20mM pH 7.0磷酸盐缓冲液+0.1M NaCl，以100％A液运行10个柱体积到达100％B的线性梯度进行洗脱，，收集含载脂蛋白A-I的洗脱液。洗脱结束后，用5个柱体积的0.5M NaOH清洗柱子，洗去未洗脱的结合蛋白，再用5个柱体积的20％乙醇溶液平衡柱子保存。
此步阴离子交换层析得到的载脂蛋白洗脱液纯度为35％，回收率为98％。
3.阳离子交换层析
取30ml 20％乙醇保存的Macro-Prep High S凝胶，用水反复置换，去除乙醇，放置达到温度平衡后用XK16/20装柱。以下层析过程都在GEExplore 100蛋白纯化仪上进行，装柱完成后，柱高为12cm，用1％丙酮测其柱效为4102N/m。测完柱效后，柱子用水平衡5个柱体积，再用起始平衡缓冲液20mM pH 5.5柠檬酸缓冲液平衡5个柱体积，将阴离子交换层析得到的载脂蛋白洗脱液调pH至5.5，上样，上样量为15ml。洗脱以A液和B液为洗脱液进行线性梯度洗脱，A液为平衡缓冲液，B液为20mM pH 5.5柠檬酸缓冲液+0.1M NaCl，以100％A液运行10个柱体积到达100％B的线性梯度进行洗脱，收集载脂蛋白A-I的洗脱液。洗脱结束后，用5个柱体积的0.5M NaOH清洗柱子，洗去未洗脱的结合蛋白，再用5个柱体积的20％乙醇溶液平衡柱子保存。
此步阳离子交换层析得到的载脂蛋白A-I纯度为75％，回收率为91％。
4.疏水作用层析
取30ml 20％乙醇保存的Butyl Sepharose Fast Flow凝胶，用水反复置换，去除乙醇，放置达到温度平衡后用XK 16/20装柱。以下层析过程都在GEExplore 100蛋白纯化仪上进行。装柱完成后，柱高为12.2cm，用1％丙酮测其柱效为4306N/m。测完柱效后，柱子用水平衡5个柱体积，再用起始平衡缓冲液20mM pH 7.0Tris-HCl+0.1M NaCl平衡5个柱体积。将阳离子交换层析的载脂蛋白A-I洗脱液电导调至与平衡缓冲液相同，上样，上样量为15ml。洗脱以A液和B液为洗脱液进行线性梯度洗脱，A液为平衡缓冲液，B液为20mM pH7.0Tris-HCl缓冲液，以100％A液运行10个柱体积到达100％B的线性梯度进行洗脱，收集载脂蛋白A-I洗脱液。洗脱结束后，用5个柱体积的0.5M NaOH清洗柱子，洗去未洗脱的结合蛋白。再用5个柱体积的20％乙醇溶液平衡柱子保存。此步疏水作用层析得到的载脂蛋白A-I纯度为96％，回收率为98％。
实施例2
1.FIV-1沉淀的溶解
称取1g FIV-1沉淀溶解于10ml 20mM pH 7.0的磷酸盐缓冲液中，充分混合，于摇床上室温溶解5h，溶解结束后，离心去除硅藻土，上清液用0.45μm针筒式滤膜过滤，取滤液备用。
2.阴离子交换层析
取35ml 20％乙醇保存的DEAE Sepharose High Performance凝胶，用水反复置换，去除乙醇，放置达到温度平衡后用XK 16/20装柱，以下层析过程都在GEExplore100蛋白纯化仪上进行，装柱完成后，柱高为13.2cm，用1％丙酮测其柱效为4865N/m。测完柱效后，柱子用水平衡5个柱体积，再用起始平衡缓冲液20mM pH 8.0磷酸盐缓冲液平衡5个柱体积，将FIV-1沉淀溶解液的滤液15ml调pH至8.0，上样。洗脱以A液和B液为洗脱液进行线性梯度洗脱，A液为平衡缓冲液，B液为20mM pH 8.0磷酸盐缓冲液+0.1M NaCl，以100％A液运行10个柱体积到达100％B的线性梯度进行洗脱，收集含载脂蛋白A-I的洗脱液。洗脱结束后，用5个柱体积的0.5M NaOH清洗柱子，洗去未洗脱的结合蛋白，再用5个柱体积的20％乙醇溶液平衡柱子保存。
此步阴离子交换层析得到的载脂蛋白洗脱液纯度为30％，回收率为91％。
3.阳离子交换层析
取30ml 20％乙醇保存的Macro-Prep High S凝胶，用水反复置换，去除乙醇，放置达到温度平衡后用XK 16/20装柱。以下层析过程都在GEExplore 100蛋白纯化仪上进行。装柱完成后，柱高为12cm，用1％丙酮测其柱效为4102N/m。测完柱效后，柱子用水平衡5个柱体积，再用起始平衡缓冲液20mM pH 5.0柠檬酸缓冲液平衡5个柱体积。将阴离子交换层析得到的载脂蛋白洗脱液调pH至5.0，上样，上样量为15ml。洗脱以A液和B液为洗脱液进行线性梯度洗脱，A液为平衡缓冲液，B液为20mM pH 5.0柠檬酸缓冲液+0.1M NaCl，以100％A液运行10个柱体积到达100％B的线性梯度进行洗脱，收集载脂蛋白A-I的洗脱液。洗脱结束后，用5个柱体积的0.5M NaOH清洗柱子，洗去未洗脱的结合蛋白。再用5个柱体积的20％乙醇溶液平衡柱子保存。此步阳离子交换层析得到的载脂蛋白A-I纯度为72％，回收率为89％。
4.疏水作用层析
取30ml 20％乙醇保存的Butyl Sepharose Fast Flow凝胶，用水反复置换，去除乙醇，放置达到温度平衡后用XK 16/20装柱，以下层析过程都在GEExplore 100蛋白纯化仪上进行。装柱完成后，柱高为12.2cm，用1％丙酮测其柱效为4306N/m。测完柱效后，柱子用水平衡5个柱体积，再用起始平衡缓冲液20mM pH 7.0Tris-HCl+0.5M NaCl平衡5个柱体积。将阳离子交换层析的载脂蛋白A-I洗脱液电导调至与平衡缓冲液相同，上样，上样量为15ml。洗脱以A液和B液为洗脱液进行线性梯度洗脱，A液为平衡缓冲液，B液为20mM pH7.0Tris-HCl缓冲液，以100％A液运行10个柱体积到达100％B的线性梯度进行洗脱，收集载脂蛋白A-I洗脱液。洗脱结束后，用5个柱体积的0.5M NaOH清洗柱子，洗去未洗脱的结合蛋白，再用5个柱体积的20％乙醇溶液平衡柱子保存。
此步疏水作用层析得到的载脂蛋白A-I纯度为96％，回收率为93％。
实施例3
1.FIV-1沉淀的溶解
称取1g FIV-1沉淀溶解于10ml 20mM pH 8.0的磷酸盐缓冲液中，充分混合，于摇床上室温溶解5h，溶解结束后，离心去除硅藻土，上清液用0.45μm针筒式滤膜过滤，取滤液备用。
2.阴离子交换层析
取35ml 20％乙醇保存的DEAE Sepharose Fast Flow凝胶，用水反复置换，去除乙醇，放置达到温度平衡后用XK 16/20装柱，以下层析过程都在GEExplore 100蛋白纯化仪上进行，装柱完成后，柱高为13cm，用1％丙酮测其柱效为4671N/m，测完柱效后，柱子用水平衡5个柱体积，再用起始平衡缓冲液20mM pH 8.0Tris-HCl缓冲液平衡5个柱体积。将FIV-1沉淀溶解液的滤液15ml调pH至8.0，上样。洗脱以A液和B液为洗脱液进行线性梯度洗脱，A液为平衡缓冲液，B液为20mM pH 8.0Tris-HCl缓冲液+0.1M NaCl，以100％A液运行10个柱体积到达100％B的线性梯度进行洗脱，收集含载脂蛋白A-I的洗脱液。洗脱结束后，用5个柱体积的0.5M NaOH清洗柱子，洗去未洗脱的结合蛋白，再用5个柱体积的20％乙醇溶液平衡柱子保存。
此步阴离子交换层析得到的载脂蛋白洗脱液纯度为35％，回收率为98％。
3.阳离子交换层析
取30ml 20％乙醇保存的SP Sepharose Fast Flow凝胶，用水反复置换，去除乙醇，放置达到温度平衡后用XK 16/20装柱，以下层析过程都在GEExplore 100蛋白纯化仪上进行。装柱完成后，柱高为12.1cm，用1％丙酮测其柱效为4568N/m，测完柱效后，柱子用水平衡5个柱体积，再用起始平衡缓冲液20mM pH 5.5柠檬酸缓冲液平衡5个柱体积，将阴离子交换层析得到的载脂蛋白洗脱液调pH至5.5，上样，上样量为15ml。洗脱以A液和B液为洗脱液进行线性梯度洗脱，A液为平衡缓冲液，B液为20mM pH 5.5柠檬酸缓冲液+0.1MNaCl，以100％A液运行10个柱体积到达100％B的线性梯度进行洗脱，收集载脂蛋白A-I的洗脱液。洗脱结束后，用5个柱体积的0.5M NaOH清洗柱子，洗去未洗脱的结合蛋白，再用5个柱体积的20％乙醇溶液平衡柱子保存。
此步阳离子交换层析得到的载脂蛋白A-I纯度为62％，回收率为85％。
4.疏水作用层析
取30ml 20％乙醇保存的Butyl Sepharose Fast Flow凝胶，用水反复置换，去除乙醇，放置达到温度平衡后用XK 16/20装柱，以下层析过程都在GEExplore 100蛋白纯化仪上进行，装柱完成后，柱高为12.2cm，用1％丙酮测其柱效为4306N/m。测完柱效后，柱子用水平衡5个柱体积，再用起始平衡缓冲液20mM pH 7.0磷酸盐缓冲液+0.5M NaCl平衡5个柱体积，将阳离子交换层析的载脂蛋白A-I洗脱液电导调至与平衡缓冲液相同，上样，上样量为15ml。洗脱以A液和B液为洗脱液进行线性梯度洗脱，A液为平衡缓冲液，B液为20mMpH 7.0磷酸盐缓冲液，以100％A液运行10个柱体积到达100％B的线性梯度进行洗脱，收集载脂蛋白A-I洗脱液。洗脱结束后，用5个柱体积的0.5M NaOH清洗柱子，洗去未洗脱的结合蛋白，再用5个柱体积的20％乙醇溶液平衡柱子保存。
此步疏水作用层析得到的载脂蛋白A-I纯度为95％，回收率为96％。
实施例4
1.FIV-1沉淀的溶解
称取1g FIV-1沉淀溶解于10ml 20mM pH 8.0的磷酸盐缓冲液中，充分混合，于摇床上室温溶解5h，溶解结束后，离心去除硅藻土，上清液用0.45μm针筒式滤膜过滤，取滤液备用。
2.阴离子交换层析
取35ml 20％乙醇保存的DEAE Sepharose Fast Flow凝胶，用水反复置换，去除乙醇，放置达到温度平衡后用XK 16/20装柱，以下层析过程都在GEExplore 100蛋白纯化仪上进行，装柱完成后，柱高为13cm，用1％丙酮测其柱效为4671N/m，测完柱效后，柱子用水平衡5个柱体积，再用起始平衡缓冲液20mM pH 8.5Tris-HCl缓冲液平衡5个柱体积，将FIV-1沉淀溶解液的滤液50ml调pH至8.5，上样。洗脱以A液和B液为洗脱液进行线性梯度洗脱，A液为平衡缓冲液，B液为20mM pH 8.5Tris-HCl缓冲液+0.1M NaCl，以100％A液运行10个柱体积到达100％B的线性梯度进行洗脱，收集含载脂蛋白A-I的洗脱液。洗脱结束后，用5个柱体积的0.5M NaOH清洗柱子，洗去未洗脱的结合蛋白，再用5个柱体积的20％乙醇溶液平衡柱子保存。
此步阴离子交换层析得到的载脂蛋白洗脱液纯度为35％，回收率为98％。
3.阳离子交换层析
取30ml 20％乙醇保存的SP Sepharose Fast Flow凝胶，用水反复置换，去除乙醇，放置达到温度平衡后用XK 16/20装柱，以下层析过程都在GEExplore 100蛋白纯化仪上进行，装柱完成后，柱高为12.1cm，用1％丙酮测其柱效为4568N/m，测完柱效后，柱子用水平衡5个柱体积，再用起始平衡缓冲液50mM pH 5.5柠檬酸缓冲液平衡5个柱体积，将阴离子交换层析得到的载脂蛋白洗脱液调pH至5.5，上样，上样量为50ml。洗脱以A液和B液为洗脱液进行线性梯度洗脱，A液为平衡缓冲液，B液为50mM pH 5.5柠檬酸缓冲液+0.1MNaCl，以100％A液运行10个柱体积到达100％B的线性梯度进行洗脱，收集载脂蛋白A-I的洗脱液。洗脱结束后，用5个柱体积的0.5M NaOH清洗柱子，洗去未洗脱的结合蛋白，再用5个柱体积的20％乙醇溶液平衡柱子保存。
此步阳离子交换层析得到的载脂蛋白A-I纯度为78％，回收率为95％。
4.疏水作用层析
取30ml 20％乙醇保存的Octyl Sepharose High Performance凝胶，用水反复置换，去除乙醇，放置达到温度平衡后用XK 16/20装柱，以下层析过程都在GEExplore100蛋白纯化仪上进行，装柱完成后，柱高为12cm，用1％丙酮测其柱效为4519N/m，测完柱效后，柱子用水平衡5个柱体积，再用起始平衡缓冲液20mM pH 7.0磷酸盐缓冲液+0.5M NaCl平衡5个柱体积，将阳离子交换层析的载脂蛋白A-I洗脱液电导调至与平衡缓冲液相同，上样，上样量为15ml。洗脱以A液和B液为洗脱液进行线性梯度洗脱，A液为平衡缓冲液，B液为20mM pH 7.0磷酸盐缓冲液，以100％A液运行10个柱体积到达100％B的线性梯度进行洗脱，收集载脂蛋白A-I洗脱液。洗脱结束后，用5个柱体积的0.5M NaOH清洗柱子，洗去未洗脱的结合蛋白，再用5个柱体积的20％乙醇溶液平衡柱子保存。
此步疏水作用层析得到的载脂蛋白A-I纯度为96％，回收率为97％。
实施例5
1.FIV-1沉淀的溶解
称取1g FIV-1沉淀溶解于10ml 20mM pH 8.0的磷酸盐缓冲液中，充分混合，于摇床上室温溶解5h，溶解结束后，离心去除硅藻土，上清液用0.45μm针筒式滤膜过滤，取滤液备用。
2.阴离子交换层析
取35ml 20％乙醇保存的DEAE Sepharose Fast Flow凝胶，用水反复置换，去除乙醇，放置达到温度平衡后用XK 16/20装柱，以下层析过程都在GEExplore 100蛋白纯化仪上进行，装柱完成后，柱高为13cm，用1％丙酮测其柱效为4671N/m，测完柱效后，柱子用水平衡5个柱体积，再用起始平衡缓冲液20mM pH 8.5磷酸盐缓冲液平衡5个柱体积，将FIV-1沉淀溶解液的滤液50ml调pH至8.5，上样。洗脱以A液和B液为洗脱液进行线性梯度洗脱，A液为平衡缓冲液，B液为20mM pH 8.5磷酸盐缓冲液+0.1M NaCl，以100％A液运行10个柱体积到达100％B的线性梯度进行洗脱，收集含载脂蛋白A-I的洗脱液。洗脱结束后，用5个柱体积的0.5M NaOH清洗柱子，洗去未洗脱的结合蛋白，再用5个柱体积的20％乙醇溶液平衡柱子保存。
此步阴离子交换层析得到的载脂蛋白洗脱液纯度为38％，回收率为98％。
3.阳离子交换层析
取30ml 20％乙醇保存的SP Sepharose Fast Flow凝胶，用水反复置换，去除乙醇，放置达到温度平衡后用XK 16/20装柱，以下层析过程都在GEExplore 100蛋白纯化仪上进行。装柱完成后，柱高为12.1cm，用1％丙酮测其柱效为4568N/m，测完柱效后，柱子用水平衡5个柱体积，再用起始平衡缓冲液50mM pH 5.5磷酸盐缓冲液平衡5个柱体积，将阴离子交换层析得到的载脂蛋白洗脱液调pH至5.5，上样，上样量为50ml。洗脱以A液和B液为洗脱液进行线性梯度洗脱，A液为平衡缓冲液，B液为50mM pH 5.5磷酸盐缓冲液+0.1MNaCl，以100％A液运行10个柱体积到达100％B的线性梯度进行洗脱，收集载脂蛋白A-I的洗脱液。洗脱结束后，用5个柱体积的0.5M NaOH清洗柱子，洗去未洗脱的结合蛋白，再用5个柱体积的20％乙醇溶液平衡柱子保存。
此步阳离子交换层析得到的载脂蛋白A-I纯度为80％，回收率为95％。
4.疏水作用层析
取35ml 20％乙醇保存的Phenyl Sepharose Fast Flow凝胶，用水反复置换，去除乙醇，放置达到温度平衡后用XK 16/20装柱，以下层析过程都在GEExplore 100蛋白纯化仪上进行，装柱完成后，柱高为13cm，用1％丙酮测其柱效为5022N/m。测完柱效后，柱子用水平衡5个柱体积，再用起始平衡缓冲液20mM pH 8.0Tris-HCl缓冲液+1M NaCl平衡5个柱体积，将阳离子交换层析的载脂蛋白A-I洗脱液电导调至与平衡缓冲液相同，上样，上样量为15ml。洗脱以A液和B液为洗脱液进行线性梯度洗脱，A液为平衡缓冲液，B液为20mM pH8.0磷酸盐缓冲液，以100％A液运行10个柱体积到达100％B的线性梯度进行洗脱，收集载脂蛋白A-I洗脱液。洗脱结束后，用5个柱体积的0.5M NaOH清洗柱子，洗去未洗脱的结合蛋白，再用5个柱体积的20％乙醇溶液平衡柱子保存。
此步疏水作用层析得到的载脂蛋白A-I纯度为97％，回收率为97％。
对比例1
1.FIV-1沉淀的溶解
称取1g FIV-1沉淀溶解于10ml 20mM pH 8.0的磷酸盐缓冲液中，充分混合，于摇床上室温溶解5h，溶解结束后，离心去除硅藻土，上清液用0.45μm针筒式滤膜过滤，取滤液备用。
2.阴离子交换层析
取35ml 20％乙醇保存的DEAE Sepharose Fast Flow凝胶，用水反复置换，去除乙醇，放置达到温度平衡后用XK 16/20装柱。以下层析过程都在GEExplore 100蛋白纯化仪上进行。装柱完成后，柱高为13cm，用1％丙酮测其柱效为4671N/m。测完柱效后，柱子用水平衡5个柱体积，再用起始平衡缓冲液20mM pH 8.5磷酸盐缓冲液平衡5个柱体积。将FIV-1沉淀溶解液的滤液50ml调pH至8.5，上样。洗脱以A液和B液为洗脱液进行线性梯度洗脱，A液为平衡缓冲液，B液为20mM pH 8.5磷酸盐缓冲液+0.1M NaCl，以100％A液运行10个柱体积到达100％B的线性梯度进行洗脱，收集含载脂蛋白A-I的洗脱液。洗脱结束后，用5个柱体积的0.5M NaOH清洗柱子，洗去未洗脱的结合蛋白。再用5个柱体积的20％乙醇溶液平衡柱子保存。
此步阴离子交换层析得到的载脂蛋白洗脱液纯度为38％，回收率为98％。
3.疏水作用层析
取35ml 20％乙醇保存的Phenyl Sepharose Fast Flow凝胶，用水反复置换，去除乙醇，放置达到温度平衡后用XK 16/20装柱。以下层析过程都在GEExplore 100蛋白纯化仪上进行。装柱完成后，柱高为13cm，用1％丙酮测其柱效为5022N/m。测完柱效后，柱子用水平衡5个柱体积，再用起始平衡缓冲液20mM pH 8.0Tris-HCl缓冲液+1M NaCl平衡5个柱体积。将阴离子交换层析的载脂蛋白A-I洗脱液电导调至与平衡缓冲液相同，上样，上样量为15ml。洗脱以A液和B液为洗脱液进行线性梯度洗脱，A液为平衡缓冲液，B液为20mM pH8.0磷酸盐缓冲液，以100％A液运行10个柱体积到达100％B的线性梯度进行洗脱，收集载脂蛋白A-I洗脱液。洗脱结束后，用5个柱体积的0.5M NaOH清洗柱子，洗去未洗脱的结合蛋白。再用5个柱体积的20％乙醇溶液平衡柱子保存。
此步疏水作用层析得到的载脂蛋白A-I纯度为85％，回收率为90％。
从实施例5和对比例1的对比可知，本发明的方法在阴离子交换层析和疏水作用层析之间增加阳离子交换层析后，大大提高了载脂蛋白A-I的纯度和回收率。然而，阳离子交换层析的增加并不一定意味着纯度和回收率的提升，这绝非本领域技术人员容易想到的，为了提升载脂蛋白A-I的纯度和回收率，申请人做了大量的探索性试验，发现只有在阴离子交换层析、阳离子交换层析和疏水作用层析三个步骤顺次进行后，方能实现更佳的纯度和回收率，三次层析顺序的替换或某次层析步骤的缺失，均无法实现更高的载脂蛋白A-I的纯度和回收率。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受所述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种人血浆载脂蛋白A-I的分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将人血浆组分FIV-1蛋白沉淀溶解于缓冲液中，过滤，得滤液；
2)利用阴离子交换层析对步骤1)得到的滤液进行初步分离，收集含载脂蛋白A-I的洗脱液；
3)利用阳离子交换层析对步骤2)中的收集的载脂蛋白A-I洗脱液进行二次分离，收集含载脂蛋白A-I的洗脱液；
4)利用疏水作用层析对步骤3)中的收集的洗脱液进行三次分离，收集含载脂蛋白A-I的洗脱液。
2.如权利要求1所述的人血浆载脂蛋白A-I的分离纯化方法，其特征在于，步骤1)中所述的缓冲液的pH为7.0～9.0；
优选地，所述的缓冲液为pH 7.0～9.0，10～100mM的磷酸盐缓冲液或pH 7.0～9.0，10～100mM的Tris-HCl缓冲液。
3.如权利要求1所述的人血浆载脂蛋白A-I的分离纯化方法，其特征在于，所述溶解在20～45℃的温度下进行5～10h。
4.如权利要求1所述的人血浆载脂蛋白A-I的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤2)具体为：取装有阴离子交换层析填料的色谱柱，用平衡缓冲液平衡所述色谱柱，上样，然后用洗脱液进行洗脱，收集含载脂蛋白A-I的洗脱液。
5.如权利要求4所述的载脂蛋白A-I的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤2)中，阴离子交换层析填料为DEAE Sepharose High Performance、DEAE Sepharose Fast Flow、DEAEMacro-Prep、Toyopearyl DEAE-650M、Q Sepharose High Performance、Q Sepharose FastFlow或Capto Q；
平衡缓冲液为pH 6.5～9.0，10～100mM的Tris-HCl缓冲液或pH 6.5～9.0，10～100mM的磷酸盐缓冲液；
洗脱以A液和B液为洗脱液进行线性梯度洗脱，其中，所述A液为平衡缓冲液，所述B液为含0.08～0.15M NaCl，pH 6.5～9.0，10～100mM的Tris-HCl缓冲液或含0.08～0.15M NaCl，pH 6.5～9.0，10～100mM的磷酸盐缓冲液。
6.如权利要求1所述的人血浆载脂蛋白A-I的分离纯化方法，所述步骤3)具体为：取装有阳离子交换层析填料的色谱柱，用平衡缓冲液平衡所述色谱柱，上样，然后用洗脱液进行洗脱，收集含载脂蛋白A-I的洗脱液。
7.如权利要求6所述的人血浆载脂蛋白A-I的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤3)中，阳离子交换层析填料为SP Sepharose High Performance、SP Sepharose Fast Flow、CM Sepharose High Performance、CM Sepharose Fast Flow、Macro-Prep High S或Macro-Prep CM；
平衡缓冲液为pH 4.5～6.0，10～100mM的柠檬酸或pH 4.5～6.0，10～100mM的磷酸盐缓冲液；
洗脱以A液和B液为洗脱液进行线性梯度洗脱，其中，所述A液为平衡缓冲液，所述B液为含0.08～0.15M NaCl，pH 4.5～6.0，10～100mM的柠檬酸或含0.08～0.15M NaCl，pH 4.5～6.0，10～100mM的磷酸盐缓冲液。
8.如权利要求1所述的人血浆载脂蛋白A-I的分离纯化方法，所述步骤4)具体为：取装有疏水作用层析填料的色谱柱，用平衡缓冲液平衡所述色谱柱，上样，然后用洗脱液进行洗脱，收集含载脂蛋白A-I的洗脱液。
9.如权利要求8所述的人血浆载脂蛋白A-I的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤4)中，疏水作用层析填料为Butyl Sepharose High Performance、Phenyl Sepharose HighPerformance、Octyl Sepharose High Performance、Phenyl Sepharose Fast Flow、OctylSepharose Fast Flow或Butyl Sepharose Fast Flow；
平衡缓冲液为含0.1～1M NaCl，pH 7.0～9.0，10～100mM的Tris-HCl缓冲液或含0.1～1M NaCl，pH 7.0～9.0，10～100mM的磷酸盐缓冲液；
洗脱以A液和B液为洗脱液进行线性梯度洗脱，其中，所述A液为平衡缓冲液，所述B液为pH 7.0～9.0，10～100mM的Tris-HCl缓冲液或pH 7.0～9.0，10～100mM的磷酸盐缓冲液。
10.如权利要求1～9中任意一项所述的方法制得的人血浆载脂蛋白A-I。
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