CN109336969B - 一种抗体的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种抗体的纯化方法。一种抗体的纯化方法，包括蛋白A亲和层析步骤；所述蛋白A亲和层析的方法为：在上样之后和用洗脱液洗脱目标抗体之前，先用中间清洗缓冲液洗涤柱床；所述中间清洗缓冲液为：pH值为5‑6，电导率为20‑100mS/cm的缓冲液。本发明通过在蛋白A亲和层析过程中增加中间清洗的步骤提高了对HCP、DNA的去除能力，进而提高了阴离子交换层析去病毒的能力。
Description
技术领域
本发明涉及抗体纯化领域，尤其是涉及一种抗体的纯化方法。
背景技术
在制药工业中，有许多来源于生物技术的药物，人们对生物制药的兴趣也越发浓厚。低毒副作用、高特异性疗效、较长的半衰期和平台化的生产工艺技术等特点，使单抗在治疗生物制品领域处于领先地位，是最成功的一类生物制品。迄今，大部分的单抗都是由哺乳动物细胞表达的，这是由于是哺乳动物细胞可以完成复杂的糖基化修饰，而糖基化修饰可以增加蛋白的稳定性及溶解度，以达到较长的半衰期；而目前最常用的单抗表达系统为CHO细胞系，其产生的单抗药物的糖基化水平最接近人的IgG糖基化修饰。当治疗用蛋白由动物细胞系表达时，需要考虑来自于细胞系和培养基的病毒污染风险。为了确保产品的安全性以及符合法规的要求，应设计多步纯化步骤，不仅为了去除产品/工艺相关杂质，也为了去除/灭活病毒。典型的单抗纯化步骤包括固液分离、蛋白A亲和层析捕获、低pH值孵育病毒灭活、两步层析精纯，纳滤去病毒和超滤等步骤。
阴离子交换层析(AEX)是一种在抗体纯化中去除病毒普遍使用的工艺，其主要采用流穿操作模式。AEX去除病毒的机理是静电作用，料液的电导率值、杂质含量(如HCP、DNA)对病毒去除能力影响较大。降低料液的杂质含量以及采用合适的电导率可以提升AEX病毒清除能力。
在单抗提纯工艺中，阴离子交换层析去除病毒的上游处理步骤通常是蛋白A亲和层析。蛋白A亲和层析是在单抗纯化应用最广泛的初纯步骤，可以从复杂的细胞培养液中特异性捕获单抗。蛋白A亲和层析具备一定的HCP、DNA去除能力，因此蛋白A亲和层析对HCP、DNA的去除效果成为阴离子交换层析去除病毒能力的关键因素之一，然而常规蛋白A亲和层析工艺的病毒去除能力十分稳健，工艺参数的变化对其病毒去除能力没有实质的影响。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗体的纯化方法，该方法通过在蛋白A亲和层析过程中增加中间清洗的步骤提高了对HCP、DNA的去除能力。
为了解决以上技术问题，本发明提供了以下技术方案：
一种抗体的纯化方法，包括蛋白A亲和层析步骤；
所述蛋白A亲和层析的方法为：在上样之后和用洗脱液洗脱目标抗体之前，先用中间清洗缓冲液洗涤柱床；
所述中间清洗缓冲液为：pH值为5-6，电导率为20-100mS/cm的缓冲液。
以上方法利用：pH值为5-6，电导率为20-100mS/cm的缓冲液清洗样品，去除其中的HCP、DNA。相比无中间清洗步骤的层析工艺，本发明对HCP、DNA的去除率有显著改进，所得洗脱液中HCP含量低于1000ppm，残留DNA的含量低于100pg/mg。
本发明中，中间清洗缓冲液的pH值和电导率使去除HCP、DNA的关键参数，pH可采用5-6范围内的任意值，例如5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0等，电导率可采用20-100mS/cm范围内的任意值，例如20mS/cm、25mS/cm、30mS/cm、35mS/cm、40mS/cm、45mS/cm、50mS/cm、55mS/cm、60mS/cm、65mS/cm、70mS/cm、75mS/cm、80mS/cm、85mS/cm、90mS/cm、95mS/cm、100mS/cm等。
本发明在以上增加中间清洗的基础上，还可以进行以下改进：
优选地，所述中间清洗缓冲液为醋酸盐缓冲体系、磷酸盐缓冲体系或柠檬酸盐缓冲体系。
这些缓冲液不会引来外源性杂质，而且原料易得。
对于中间清洗缓冲液的浓度没有特定限定，例如50mM NaAc-HAc或1M NaAc-HAc等。
优选地，所述中间清洗缓冲液为用氯盐调整电导率的缓冲液，所述氯盐优选氯化钠。
当然，也可以采用其他溶解性好的盐调节电导率，且不仅限于加入一种盐，或者多种组合后加入。
优选地，所述目标抗体为中国仓鼠卵巢细胞表达的抗体。
优选地，所述蛋白A亲和层析的填料为MabSelect Sure、MabSelect LX、AmsphereA3或Praesto Jetted A50。
经考察，在以上填料的层析柱中增加中间清洗的步骤，可达到事半功倍的效果，对HCP、DNA的去除能力显著提高。
优选地，所述中间清洗缓冲液的pH值为5.5-6，优选5.5-5.8。
优选地，电导率为50-100mS/cm，优选50-80mS/cm。
优选地，所述蛋白A亲和层析的流程依次为：消毒、平衡液洗涤、上样、平衡液洗涤、所述中间清洗缓冲液洗涤、平衡液洗涤、所述洗脱液洗脱目标抗体。
优选地，所述平衡液为Tris-HCl+150～160mM NaCl、pH7.2～7.6的缓冲液，优选50～55mM Tris-HCl。
优选地，所述目标抗体为CHO细胞表达的单抗时，所述洗脱液为NaAc-HAc、pH3.0～3.8的缓冲液，优选50～55mM NaAc-HAc。
优选地，在所述蛋白A亲和层析之后还包括对收集的洗脱液进行阴离子交换层析：
依次消毒、平衡液洗涤、上样、平衡液洗涤。
优选地，所述阴离子交换层析时的平衡液为Tris-HCl、pH7.2～8.0的缓冲液。
优选地，所述阴离子交换层析的填料为POROS 50HQ、Q Sepharose FF、Capto Q或Eshmuno Q。
另外，若在以上所有方案的基础上进一步改进蛋白A亲和层析柱的填料、柱高以及流速等参数，还可以提高层析柱单柱多次循环纯化时的产量，即单位时间单位填料体积下的处理量，具体如下。
优选地，所述蛋白A亲和层析法纯化抗体的方法为循环利用以下蛋白A亲和层析柱纯化目标抗体：
填料为MabSelect LX、Amsphere A3或Praesto Jetted A50，填料的装柱高度为5～15cm，工艺运行线性流速为200～500cm/h。
以上方法为单柱多次循环的纯化工艺，主要通过选用载量高、传质能力好、运行流速快的蛋白A亲和填料，来提高蛋白A亲和填料的利用率；还通过降低柱高，提高线性流速，来缩短单次循环时间；最后通过单柱多次循环来实现蛋白A亲和层析的连续捕获工艺，既降低了介质成本，又提高了纯化效率。
另外，该方案的另一个优势是：无需增加额外工艺步骤即可提高单位时间单位填料体积的处理量，替代现有工艺的成本低，对抗体的生产链没有影响，且工艺稳健、可靠。
综上，与现有技术相比，本发明的以上工艺具有填料利用率高、单位时间单位填料体积的处理量高、成本低、工艺稳健可靠等优点。
本发明中，MabSelect LX、Amsphere A3、Praesto Jetted A50填料通常为固定的厂家，分别为GE Health Care公司、JSR公司和Purolite公司。
本发明中，填料的装柱高度在5～15cm范围内任意选择，例如5cm、5.5cm、6.0cm、6.5cm、7.0cm、7.5cm、8.0cm、8.5cm、9.0cm、9.5cm、10.0cm、10.5cm、11.0cm、11.5cm、12.0cm、12.5cm、13.0cm、14.0cm、14.5cm或15.0cm等，优选的范围有5～12cm，优选5～10cm，更优选6～10cm。
本发明中，工艺运行线性流速在200～500cm/h范围内任意选择，例如200cm/h、250cm/h、300cm/h、350cm/h、400cm/h、450cm/h或500cm/h等，优选的范围有300～500cm/h，更优选300～400cm/h。
本发明的纯化方法主要适用于抗体的纯化，尤其是单抗的纯化，尤其是中国仓鼠卵巢细胞表达的抗体。
综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：
(1)蛋白A亲和层析提纯抗体时增加中间清洗步骤，提高了对HCP、DNA的去除能力，并且相比传统层析有实质性提高，为阴离子交换层析去除病毒提供了有利先决条件；
(2)通过优化蛋白A亲和层析和阴离子交换层析中的其他工艺参数，进一步改善了纯化工艺对HCP、DNA的去除能力；
(3)在不增加额外工艺步骤的前提下，通过选用载量高、传质能力好、运行流速快的蛋白A亲和填料，来提高蛋白A亲和填料的利用率；还通过降低柱高，提高线性流速，来缩短单次循环时间；最后通过单柱多次循环来实现蛋白A亲和层析的连续捕获工艺，既降低了介质成本，又提高了纯化效率。
具体实施方式
下面将结合具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，但是本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
MabSelect SuRe LX，层析柱Vantage 11/250(Millipore)，直径1.1cm，柱高20cm，柱体积19.0mL，操作流速220cm/h。样品来源为CHO细胞表达的单抗(编号Mab1)。用3CV的0.2mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，再用5CV的平衡液(50mM Tris-HCl+150mM NaCl，pH7.4)平衡层析柱；将澄清后的细胞培养收获液(HCCF)上样到层析柱，上样载量为50g/L；用3CV的平衡液清洗柱床，用3CV的中间清洗缓冲液(50mM
NaAc-HAc+1M NaCl，pH5.5，电导率88.5mS/cm)洗涤柱床，再用3CV平衡液清洗柱床；再用3.5CV的洗脱液(50mM NaAc-HAc，pH3.5)洗脱，收集洗脱液；最后再用3CV的0.2mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，用3CV的平衡液平衡层析柱后，最后用3CV的保存液保存层析柱。洗脱液的HCP含量为900ppm，DNA残留量为85pg/mg。
POROS 50HQ，层析柱BenchMark 06/25(Omnifit)，直径0.66cm，柱高20cm，柱体积6.8mL，操作流速220cm/h。样品来源为上步亲和洗脱液，调整pH至7.5，并且经0.22μm滤膜过滤，X-MuLV的添加量为1％(v/v)。用3CV的0.5mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，再用3CV的平衡液(50mM Tris-HCl，pH7.5)平衡层析柱；将pH调整和澄清后的样品上样到层析柱，上样载量为100g/L；再用3CV的平衡液洗涤柱床，收集流穿液；最后再用再生溶液(50mM Tris-HCl+1M NaCl，pH7.5)对层析柱再生；用3CV的0.5mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，最后用3CV的保存液保存层析柱。该步骤对X-MuLV的清除能力可以达到5.1log10。
对比例1
MabSelect SuRe LX，层析柱Vantage 11/250(Millipore)，直径1.1cm，柱高20cm，柱体积19.0mL，操作流速220cm/h。样品来源为CHO细胞表达的单抗(编号Mab1)。用3CV的0.2mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，再用5CV的平衡液(50mM Tris-HCl+150mM NaCl，pH7.4)平衡层析柱；将澄清后的细胞培养收获液(HCCF)上样到层析柱，上样载量为50g/L；用3CV的平衡液清洗柱床；再用3.5CV的洗脱液(50mM NaAc-HAc，pH3.5)洗脱，收集洗脱液；最后再用3CV的0.2mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，用3CV的平衡液平衡层析柱后，最后用3CV的保存液保存层析柱。洗脱液的HCP含量为3600ppm，DNA残留量为400pg/mg。
POROS 50HQ，层析柱BenchMark 06/25(Omnifit)，直径0.66cm，柱高20cm，柱体积6.8mL，操作流速220cm/h。样品来源为上步亲和洗脱液，调整pH至7.5，并且经0.22μm滤膜过滤，X-MuLV的添加量为1％(v/v)。用3CV的0.5mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，再用3CV的平衡液(50mM Tris-HCl，pH7.5)平衡层析柱；将pH调整和澄清后的样品上样到层析柱，上样载量为100g/L；再用3CV的平衡液洗涤柱床，收集流穿液；最后再用再生溶液(50mM Tris-HCl+1M NaCl，pH7.5)对层析柱再生；用3CV的0.5mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，最后用3CV的保存液保存层析柱。该无亲和层析中间清洗步骤的清除能力除能力为4.0log10。
比较实施例1和对比例1，可看出：亲和中间清洗步骤可有效提高X-MuLV的清除能力。
实施例2
MabSelect SuRe，层析柱Vantage 11/250(Millipore)，直径1.1cm，柱高20cm，柱体积19.0ml，操作流速200cm/h。样品来源为CHO细胞表达的单抗(Mab2)。用3CV的0.1mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，再用5CV的平衡液(20mM Tris-HCl+1M NaCl，pH7.4)平衡层析柱；将澄清后的细胞培养收获液(HCCF)上样到层析柱，上样载量为30g/L；用3CV的平衡液清洗柱床，用3CV的中间清洗缓冲液(1M NaAc-HAc，pH5.8，电导率47.3mS/cm)洗涤柱床，再用3CV平衡液清洗柱床；再用3.5CV的洗脱液(100mM HAc，pH3.0)洗脱，收集洗脱液；最后再用3CV的0.1mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，用3CV的平衡液平衡层析柱后，最后用3CV的保存液保存层析柱。洗脱液的HCP含量为960ppm，DNA残留量为90pg/mg。
Q Sepharose FF，层析柱BenchMark 06/25(Omnifit)，直径0.66cm，柱高20cm，柱体积6.8ml，操作流速200cm/h。样品来源为上步亲和洗脱液，调整pH至8.0，并且经0.22μm滤膜过滤，MVM的添加量为1％(v/v)。用3CV的0.5mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，再用3CV的平衡液(50mM Tris-HCl，pH8.0)平衡层析柱；将pH调整和澄清后的样品上样到层析柱，上样载量为60g/L；再用3CV的平衡液洗涤柱床，收集流穿液；最后再用再生溶液(50mM Tris-HCl+1M NaCl，pH8.0)对层析柱再生；用3CV的0.5mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，最后用3CV的保存液保存层析柱。该步骤对MVM的清除能力可以达到4.5log10。
对比例2
MabSelect SuRe，层析柱Vantage 11/250(Millipore)，直径1.1cm，柱高20cm，柱体积19.0ml，操作流速200cm/h。样品来源为CHO细胞表达的单抗(Mab2)。用3CV的0.1mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，再用5CV的平衡液(20mM Tris-HCl+1M NaCl，pH7.4)平衡层析柱；将澄清后的细胞培养收获液(HCCF)上样到层析柱，上样载量为30g/L；用3CV的平衡液清洗柱床，再用3CV平衡液清洗柱床；再用3.5CV的洗脱液(100mM HAc，pH3.0)洗脱，收集洗脱液；最后再用3CV的0.1mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，用3CV的平衡液平衡层析柱后，最后用3CV的保存液保存层析柱。洗脱液的HCP含量为3710ppm，DNA残留量为524pg/mg。
Q Sepharose FF，层析柱BenchMark 06/25(Omnifit)，直径0.66cm，柱高20cm，柱体积6.8ml，操作流速200cm/h。样品来源为上步亲和洗脱液，调整pH至8.0，并且经0.22μm滤膜过滤，MVM的添加量为1％(v/v)。用3CV的0.5mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，再用3CV的平衡液(50mM Tris-HCl，pH8.0)平衡层析柱；将pH调整和澄清后的样品上样到层析柱，上样载量为60g/L；再用3CV的平衡液洗涤柱床，收集流穿液；最后再用再生溶液(50mM Tris-HCl+1M NaCl，pH8.0)对层析柱再生；用3CV的0.5mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，最后用3CV的保存液保存层析柱。无亲和层析中间清洗步骤的清除能力除能力为3.3log10。
比较实施例2和对比例2，可看出：亲和中间清洗步骤可有效提高MVM的清除能力。
实施例3
MabSelect SuRe LX，层析柱Vantage 11/250(Millipore)，直径1.1cm，柱高20cm，柱体积19.0ml，操作流速220cm/h。样品来源为CHO细胞表达的单抗(Mab1)。用3CV的0.2mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，再用5CV的平衡液(50mM Tris-HCl+150mM NaCl，pH7.4)平衡层析柱；将澄清后的细胞培养收获液(HCCF)上样到层析柱，上样载量为50g/L；用3CV的平衡液清洗柱床，用3CV的中间清洗缓冲液(50mM NaAc-HAc+1M NaCl，pH5.0，电导率91.3mS/cm)洗涤柱床，再用3CV平衡液清洗柱床；再用3.5CV的洗脱液(50mM NaAc-HAc，pH3.5)洗脱，收集洗脱液；最后再用3CV的0.2mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，用3CV的平衡液平衡层析柱后，最后用3CV的保存液保存层析柱。洗脱液的HCP含量为810ppm，DNA残留量为78pg/mg。
实施例4
MabSelect SuRe LX，层析柱Vantage 11/250(Millipore)，直径1.1cm，柱高20cm，柱体积19.0ml，操作流速220cm/h。样品来源为CHO细胞表达的单抗(Mab1)。用3CV的0.2mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，再用5CV的平衡液(50mM Tris-HCl+150mM NaCl，pH7.4)平衡层析柱；将澄清后的细胞培养收获液(HCCF)上样到层析柱，上样载量为50g/L；用3CV的平衡液清洗柱床，用3CV的中间清洗缓冲液(1M NaAc-HAc+NaCl，pH6.0，电导率85.1mS/cm)洗涤柱床，再用3CV平衡液清洗柱床；再用3.5CV的洗脱液(50mM NaAc-HAc，pH3.5)洗脱，收集洗脱液；最后再用3CV的0.2mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，用3CV的平衡液平衡层析柱后，最后用3CV的保存液保存层析柱。洗脱液的HCP含量为970ppm，DNA残留量为90pg/mg。
实施例5
MabSelect SuRe LX，层析柱Vantage 11/250(Millipore)，直径1.1cm，柱高20cm，柱体积19.0mL，操作流速220cm/h。样品来源为CHO细胞表达的单抗(编号Mab1)。用3CV的0.2mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，再用5CV的平衡液(50mM Tris-HCl+150mM NaCl，pH7.4)平衡层析柱；将澄清后的细胞培养收获液(HCCF)上样到层析柱，上样载量为50g/L；用3CV的平衡液清洗柱床，用3CV的中间清洗缓冲液(50mM NaAc-HAc+0.2M NaCl，pH5.5，电导率20mS/cm)洗涤柱床，再用3CV平衡液清洗柱床；再用3.5CV的洗脱液(50mM NaAc-HAc，pH3.5)洗脱，收集洗脱液；最后再用3CV的0.2mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，用3CV的平衡液平衡层析柱后，最后用3CV的保存液保存层析柱。洗脱液的HCP含量为990ppm，DNA残留量为98pg/mg。
实施例6
MabSelect SuRe LX，层析柱Vantage 11/250(Millipore)，直径1.1cm，柱高20cm，柱体积19.0mL，操作流速220cm/h。样品来源为CHO细胞表达的单抗(编号Mab1)。用3CV的0.2mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，再用5CV的平衡液(50mM Tris-HCl+150mM NaCl，pH7.4)平衡层析柱；将澄清后的细胞培养收获液(HCCF)上样到层析柱，上样载量为50g/L；用3CV的平衡液清洗柱床，用3CV的中间清洗缓冲液(50mM NaAc-HAc+1.2M NaCl，pH5.5，电导率100mS/cm)洗涤柱床，再用3CV平衡液清洗柱床；再用3.5CV的洗脱液(50mM NaAc-HAc，pH3.5)洗脱，收集洗脱液；最后再用3CV的0.2mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，用3CV的平衡液平衡层析柱后，最后用3CV的保存液保存层析柱。洗脱液的HCP含量为890ppm，DNA残留量为90pg/mg。
实施例7
Praesto Jetted A50，层析柱Vantage 11/250(Millipore)，直径1.1cm，柱高20cm，柱体积19.0ml，操作流速300cm/h。样品来源为CHO细胞表达的单抗(Mab1)。用3CV的0.2mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，再用5CV的平衡液(50mM Tris-HCl+150mM NaCl，pH7.4)平衡层析柱；将澄清后的细胞培养收获液(HCCF)上样到层析柱，上样载量为60g/L；用3CV的平衡液清洗柱床，用3CV的中间清洗缓冲液(1M NaAc-HAc+NaCl，pH5.5，电导率88.5mS/cm)洗涤柱床，再用3CV平衡液清洗柱床；再用3.5CV的洗脱液(50mM NaAc-HAc，pH3.5)洗脱，收集洗脱液；最后再用3CV的0.2mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，用3CV的平衡液平衡层析柱后，最后用3CV的保存液保存层析柱。洗脱液的HCP含量为980ppm，DNA残留量为97pg/mg。
实施例8
使用GE的
Pure 25层析系统，采用Praesto Jetted A50填料，层析柱Vantage 11/250(Millipore)，直径1.1cm，柱高6.5cm，柱体积6.2ml，操作流速200cm/h。样品来源为CHO细胞表达的单抗(Mab1)，目标蛋白浓度为3.5g/L，蛋白料液采用冰袋降温的方式与层析系统对接。用3CV的0.5mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，再用3CV的平衡液(50mMTris-HCl+150mM NaCl，pH7.4)平衡层析柱；将澄清后的细胞培养收获液(HCCF)上样到层析柱，上样载量为50g/L；用3CV的平衡液清洗柱床，用3CV的中间清洗缓冲液(50mM NaAc-HAc+1M NaCl，pH5.5)洗涤柱床，再用3CV平衡液清洗柱床；再用3.5CV的洗脱液(50mM NaAc-HAc，pH3.5)洗脱，收集洗脱液。最后用3CV的1mol/L的醋酸溶液对层析柱再生，用2CV的平衡液平衡层析柱后，进入下一个亲和层析循环；连续进行10个循环。当所有亲和层析循环结束后，最后再用3CV的0.5mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，用3CV的平衡液平衡层析柱后，最后用3CV的保存液保存层析柱。经测试，每个循环理论用时77分钟，实际用时90分钟(层析系统泵冲洗，会消耗额外时间)，15个小时处理目标蛋白3.1g，产量为：33.3g mAb/L resin/hr(每升填料，每小时可以处理33.3g单抗)。
而如果采用传统工艺(流程如对比例3)，每个循环需要耗时215分钟，产量为：9.8gmAb/L resin/hr(每升填料，每小时可以处理9.8g单抗)。并且传统工艺需要的填料体积会远远增加。单柱连续流层析优势明显。
对比例3
使用GE的
Pure 25层析系统，采用MabSelect Sure填料，层析柱Vantage11/250(Millipore)，直径1.1cm，柱高20.0cm，柱体积19.0ml，操作流速200cm/h。样品来源为CHO细胞表达的单抗(Mab1)，目标蛋白浓度为3.5g/L，蛋白料液采用冰袋降温的方式与层析系统对接。用3CV的0.5mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，再用3CV的平衡液(50mM Tris-HCl+150mM NaCl，pH7.4)平衡层析柱；将澄清后的细胞培养收获液(HCCF)上样到层析柱，上样载量为35g/L；用3CV的平衡液清洗柱床，用3CV的中间清洗缓冲液(50mM NaAc-HAc+1MNaCl，pH5.5)洗涤柱床，再用3CV平衡液清洗柱床；再用3.5CV的洗脱液(50mM NaAc-HAc，pH3.5)洗脱，收集洗脱液。最后用3CV的1mol/L的醋酸溶液对层析柱再生，用2CV的平衡液平衡层析柱后，进入下一个亲和层析循环；连续进行4个循环。当所有亲和层析循环结束后，最后再用3CV的0.5mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，用3CV的平衡液平衡层析柱后，最后用3CV的保存液保存层析柱。经测试，每个循环理论用时201分钟，实际用时215分钟(层析系统泵冲洗，会消耗额外时间)，14.3个小时处理目标蛋白2.66g，产量为：9.8g mAb/L resin/hr(每升填料，每小时可以处理9.8g单抗)。
实施例9
对实施例8进行工艺放大，使用PALL的一次性层析系统，采用Praesto Jetted A50填料，层析柱BPG140/50(GE)，直径14cm，柱高10cm，柱体积1.5L，操作流速300cm/h。样品来源为CHO细胞表达的单抗(Mab1)，目标蛋白浓度为3.5g/L，蛋白料液采用无菌对接方式与层析系统连接。用3CV的0.5mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，再用3CV的平衡液(50mM Tris-HCl+150mM NaCl，pH7.4)平衡层析柱；将澄清后的细胞培养收获液(HCCF)上样到层析柱，上样载量为60g/L；用3CV的平衡液清洗柱床，用3CV的中间清洗缓冲液(50mM NaAc-HAc+1MNaCl，pH5.5)洗涤柱床，再用3CV平衡液清洗柱床；再用3.5CV的洗脱液(50mM NaAc-HAc，pH3.5)洗脱，收集洗脱液。最后用3CV的1mol/L的醋酸溶液对层析柱再生，用2CV的平衡液平衡层析柱后，进入下一个亲和层析循环；连续进行10个循环。当所有亲和层析循环结束后，最后再用3CV的0.5mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，用3CV的平衡液平衡层析柱后，最后用3CV的保存液保存层析柱。经测试，每个循环理论用时77分钟，实际用时77分钟(层析系统无泵冲洗)，13个小时处理目标蛋白900g，产量为：46.1g mAb/L resin/hr(每升填料，每小时可以处理46.1g单抗)。500L的生物反应器，24小时就可完成亲和捕获，而只需要1.5L的填料。而如果采用传统工艺(即对比例4)，每个循环需要耗时215分钟，填料量为6.2L(BPG200/50)，也需要24小时以上。单柱连续流层析优势明显。
实施例10
使用GE的
Pure 25层析系统，采用Amsphere A3填料，层析柱Vantage 11/250(Millipore)，直径1.1cm，柱高10cm，柱体积9.5ml，操作流速300cm/h。样品来源为CHO细胞表达的单抗(Mab2)，目标蛋白浓度为3.5g/L，蛋白料液采用冰袋降温的方式与层析系统对接。用3CV的0.2mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，再用3CV的平衡液(50mM Tris-HCl+150mM NaCl，pH7.4)平衡层析柱；将澄清后的细胞培养收获液(HCCF)上样到层析柱，上样载量为50g/L；用3CV的平衡液清洗柱床，用3CV的中间清洗缓冲液(50mM NaAc-HAc+1M NaCl，pH5.5)洗涤柱床，再用3CV平衡液清洗柱床；再用3.5CV的洗脱液(50mM NaAc-HAc，pH3.5)洗脱，收集洗脱液。最后用3CV的1mol/L的醋酸溶液对层析柱再生，用2CV的平衡液平衡层析柱后，进入下一个亲和层析循环；连续进行10个循环。当所有亲和层析循环结束后，最后再用3CV的0.2mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，用3CV的平衡液平衡层析柱后，最后用3CV的保存液保存层析柱。经测试，每个循环理论用时77分钟，实际用时90分钟(层析系统泵冲洗，会消耗额外时间)，15个小时处理目标蛋白4.75g，产量为：33.3gmAb/L resin/hr(每升填料，每小时可以处理33.3g单抗)。
而如果采用传统工艺(见对比例4)，每个循环需要耗时215分钟，产量为：9.8gmAb/L resin/hr(每升填料，每小时可以处理9.8g单抗)。并且传统工艺需要的填料体积会远远增加。单柱连续流层析优势明显。
对比例4
使用GE的
Pure 25层析系统，采用Eshmuno A填料，层析柱Vantage 11/250(Millipore)，直径1.1cm，柱高20.0cm，柱体积19.0ml，操作流速200cm/h。样品来源为CHO细胞表达的单抗(Mab1)，目标蛋白浓度为3.5g/L，蛋白料液采用冰袋降温的方式与层析系统对接。用3CV的0.5mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，再用3CV的平衡液(50mM Tris-HCl+150mM NaCl，pH7.4)平衡层析柱；将澄清后的细胞培养收获液(HCCF)上样到层析柱，上样载量为35g/L；用3CV的平衡液清洗柱床，用3CV的中间清洗缓冲液(50mM NaAc-HAc+1M NaCl，pH5.5)洗涤柱床，再用3CV平衡液清洗柱床；再用3.5CV的洗脱液(50mM NaAc-HAc，pH3.5)洗脱，收集洗脱液。最后用3CV的1mol/L的醋酸溶液对层析柱再生，用2CV的平衡液平衡层析柱后，进入下一个亲和层析循环；连续进行4个循环。当所有亲和层析循环结束后，最后再用3CV的0.5mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，用3CV的平衡液平衡层析柱后，最后用3CV的保存液保存层析柱。经测试，每个循环理论用时201分钟，实际用时215分钟(层析系统泵冲洗，会消耗额外时间)，14.3个小时处理目标蛋白2.66g，产量为：9.8g mAb/L resin/hr(每升填料，每小时可以处理9.8g单抗)。
实施例11
对实施例10进行工艺放大，使用PALL的一次性层析系统，采用Amsphere A3填料，层析柱BPG140/50(GE)，直径14cm，柱高10cm，柱体积1.5L，操作流速300cm/h。样品来源为CHO细胞表达的单抗(Mab2)，目标蛋白浓度为3.5g/L，蛋白料液采用无菌对接方式与层析系统连接。用3CV的0.5mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，再用3CV的平衡液(50mM Tris-HCl+150mM NaCl，pH7.4)平衡层析柱；将澄清后的细胞培养收获液(HCCF)上样到层析柱，上样载量为50g/L；用3CV的平衡液清洗柱床，用3CV的中间清洗缓冲液(50mM NaAc-HAc+1M NaCl，pH5.5)洗涤柱床，再用3CV平衡液清洗柱床；再用3.5CV的洗脱液(50mM NaAc-HAc，pH3.5)洗脱，收集洗脱液。最后用3CV的1mol/L的醋酸溶液对层析柱再生，用2CV的平衡液平衡层析柱后，进入下一个亲和层析循环；连续进行10个循环。当所有亲和层析循环结束后，最后再用3CV的0.5mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，用3CV的平衡液平衡层析柱后，最后用3CV的保存液保存层析柱。经测试，每个循环理论用时77分钟，实际用时77分钟(层析系统无泵冲洗)，13个小时处理目标蛋白750g，产量为：38.4g mAb/L resin/hr(每升填料，每小时可以处理38.4g单抗)。500L的生物反应器，30小时就可完成亲和捕获，而只需要1.5L的填料。而如果采用传统工艺(见对比例4)，每个循环需要耗时215分钟，填料量为6.2L(BPG200/50)，也需要29小时。单柱连续流层析优势明显。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (3)
1.一种CHO细胞表达的单抗的纯化方法，其特征在于，包括蛋白A亲和层析步骤；所述蛋白A亲和层析包括以下步骤：
用3CV的0.2mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，再用5CV的平衡液平衡层析柱，所述平衡液为50mM Tris-HCl+150mM NaCl，pH为7.4；将澄清后的细胞培养收获液HCCF上样到所述层析柱，上样载量为50g/L；用3CV的所述平衡液清洗柱床，用3CV的中间清洗缓冲液洗涤柱床，所述中间清洗缓冲液为50mM NaAc-HAc+1M NaCl，pH为5.0，电导率为91.3mS/cm；再用3CV所述平衡液清洗柱床；再用3.5CV的洗脱液洗脱，收集洗脱液，所述洗脱液为50mM NaAc-HAc，所述洗脱液的pH为3.5；再用3CV的0.2mol/L的氢氧化钠溶液冲洗所述层析柱，用3CV的所述平衡液平衡所述层析柱后，用3CV的保存液保存层析柱；所述层析柱为：MabSelectSuRe LX，层析柱Vantage 11/250，直径1.1cm，柱高20cm，柱体积19.0mL，操作流速220cm/h；
在所述蛋白A亲和层析之后还包括对收集的洗脱液进行阴离子交换层析：依次消毒、阴离子交换层析平衡液洗涤、上样、阴离子交换层析平衡液洗涤。
2.根据权利要求1所述的CHO细胞表达的单抗的纯化方法，其特征在于，所述阴离子交换层析时的平衡液为Tris-HCl、pH7.2~8.0的缓冲液。
3.根据权利要求2所述的CHO细胞表达的单抗的纯化方法，其特征在于，所述阴离子交换层析的填料为POROS 50 HQ、Q Sepharose FF、Capto Q或Eshmuno Q。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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