CN102179237A

CN102179237A - 一种用于分离、提纯单克隆抗体和抗体球蛋白的亲和色谱填料及其制备方法

Info

Publication number: CN102179237A
Application number: CN 201010155469
Authority: CN
Inventors: 穆宁; 刘辉; 孙国威
Original assignee: WUXI GALAK-TECH Co Ltd
Current assignee: WUXI GALAK-TECH Co Ltd
Priority date: 2010-04-26
Filing date: 2010-04-26
Publication date: 2011-09-14

Abstract

本发明公开了一种用于分离、提纯单克隆抗体和抗体球蛋白的亲和色谱填料及其制备方法，该亲和色谱填料由单分散多孔微球固相载体和与其连接的蛋白A(Protein A)配基组成，其制备方法是利用蛋白A含氮基的氨基酸，将其键合到固相载体表面上，从而得到亲和色谱填料，具体包括接活化的空间臂、偶联配基及封闭残留活性基团三个步骤；同时本发明还公开了利用上述亲和色谱填料制备的亲和色谱柱，本发明的亲和色谱填料及利用其制备的亲和色谱柱可用于单克隆抗体药物的生产过程以及抗体球蛋白(IgG)的分离、纯化，具有较高的分离、纯化效率。

Description

一种用于分离、提纯单克隆抗体和抗体球蛋白的亲和色谱填料及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物分离纯化领域，具体地，涉及一种用于分离、提纯单克隆抗体和抗体球蛋白的亲和色谱填料及其制备方法。

背景技术

单克隆抗体(Monoclonal antibodies)是一类生物分子，其分子结构呈独特的Y形，有的含复杂的多糖结构，分子量为150～160kD左右。单克隆抗体可通过杂交瘤或基因工程法制备。抗体球蛋白(IgG)存在于人类和动物的体液中，并具有重要的生理功能。严格地讲，单克隆抗体属于一种特殊的抗体球蛋白，近二十年来，单克隆抗体药物发展迅猛，在治疗直肠癌、乳腺癌、淋巴癌、先天性风湿病和器官移植中产生的排异等病症中被广泛应用。

目前分离、提纯单克隆抗体和抗体球蛋白的最主要方法为液相色谱法。亲和、离子交换和凝胶过滤等液相色谱方法的组合在单克隆抗体和抗体球蛋白实验室规模和工业生产规模的制备中得到了广泛应用。

亲和色谱是液相色谱多种模式中的一种，多用于生物大分子的分离与纯化，其基本原理是生物大分子与配体间所具有的高度专一的高亲和力。亲和色谱的优点是其高度的选择性。在亲和色谱中，首先须将配基以共价键连接到不溶性固相载体(亦称基质)上，得到具有固定化配基的亲和色谱填料，将这种亲和色谱填料填充成亲和色谱柱。若将含有目标蛋白质的混合物加到柱上，则只有能与固定化配基表现出明显亲和作用的蛋白质被保留，其它不能识别固定化配基的组分则不受阻碍地流过色谱柱床。然后，改变溶剂的组成便可将目标蛋白质从固定化配基上解离和洗脱下来。

与其他的蛋白质分离方法比较，亲和色谱有许多突出的优点：亲和色谱几乎可应用于任何两种有特异相互作用的生物分子的分离；亲和色谱是选择性最高的色谱模式，在许多场合下，亲和色谱是纯化倍数最高的操作，可大大减少分离纯化过程的步骤和时间；其操作条件温和，有利于稳定蛋白质的结构和活性，提高蛋白质的活性回收率；尤其适于分离复杂生物体系中低浓度的蛋白质组份。

蛋白A(Protein A)是一种存在于Staphylococcus aureue细胞壁上的蛋白质，上世纪七十年代被分离出来[J.

，J.Movitg，I.B，Johansson，H.Hjelm，Eur.J.Biochem.30(1972)190]，而且被发现具有与抗体球蛋白的专一相互作用[J.J.Langone，Adv.Immunol.32(1982)157]。蛋白A通常在pH 3左右的条件下将抗体球蛋白释放出来，被释放出来的抗体球蛋白可能发生部分构象变化，但多数情况下，这种构象变化不影响其生物活性和功能[S.Lofdahl，B.Guss，M.Uhlen，L.Philipson，M.Lindberg，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80(1983)697]。由于蛋白A与单克隆抗体和抗体球蛋白之间具有高度专一性作用，以蛋白A作为亲和色谱配基的亲和色谱已经成为目前分离、提纯单克隆抗体和抗体球蛋白最重要的手段之一。目前，蛋白A亲和色谱已成为所有单克隆抗体药物工业规模生产线上系列化色谱分离、纯化流程的第一步。近20多年来，用基因工程法技术生产的蛋白A已取代了从S.aureus中提取的蛋白A。

从固相载体来看，早期的蛋白A亲和色谱填料是以多糖类软胶为固相载体的，该类材料亲水性好，非特定相互作用低，但缺点是质地很软，无法在高压下使用。虽然近期生产的多糖类软胶固相载体耐压性能有所改善，但与使用者的期望仍有差距。1978年，Ohlson等人 [S.Ohlson，L.Hansson，P.O.Larsson and K.Mosbach；FEBSLett.1978，93，5～9]提出了高效亲和色谱的概念，以小粒径高效基质取代了多糖结构的软胶基质，大大提高了亲和色谱的分离效率。由此可见，基质材料(固相载体)的改进在亲和色谱发展中起了至关重要的作用。此后，硬质固相载体如可控孔径玻璃、硅胶以及高分子聚合物相继问世，这些材料在高压下性能好于以软胶为基质的材料，在亲和色谱上已经得到广泛应用。但上述固相载体为非规则形状可控孔径玻璃、非单分散(粒径分布较宽)微球或单分散无孔微球等，限制了亲和色谱分离、提纯效率的进一步提高。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的上述缺陷，提出一种高效的用于分离、提纯单克隆抗体和抗体球蛋白的亲和色谱填料及其制备方法。

实现上述目的的技术方案如下：

一种用于分离、提纯单克隆抗体和抗体球蛋白的亲和色谱填料，由固相载体及与其以共价键连接的配基组成，所述配基为蛋白A，所述固相载体为单分散多孔微球，所谓单分散多孔微球是指粒度(直径)高度一致的多孔微球。此类单分散多孔微球具备了所有硬质固相载体共有的高强度特性，可以在高压、高流速条件下使用。

进一步地，所述单分散多孔微球的材料选自高分子聚合物、硅胶、碳化硅、氧化铝、氯化物和陶瓷微球中的任一种。

进一步地，所述单分散多孔微球的直径为1～300μm，孔径为10～3000nm。

进一步地，所述的单分散多孔微球表面经处理后含有一级醇官能团。

进一步地，所述的蛋白A为由基因工程手段获得。

上述用于分离、提纯单克隆抗体和抗体球蛋白的亲和色谱填料的制备方法，包括如下步骤：

(1)接活化的空间臂：取一份经处理后含有一级醇官能团的单分散多孔微球，加入0.1～10份，0.1～3.0mol/L的KOH和0.1～10份含环氧官能团化合物，于10℃～100℃振荡或搅拌反应1～72h，后产物经过滤、洗涤备用；

(2)偶联配基：取1份步骤(1)获得的产物，置于含0.1～10份蛋白A的PBS缓冲液，pH 6～7，于10℃～30℃下振荡或搅拌2～72h，后反应物经过滤、洗涤备用；

(3)封闭残留活性基团：取1份步骤(2)所得反应物，加入5～10份的0.05M HCl，在10℃～30℃下振荡或搅拌反应1～24h，终产物经过滤、洗涤后保存。

另外，本发明还公开了一种用于分离、提纯单克隆抗体和抗体球蛋白的亲和色谱填料制成的亲和色谱柱。

本发明的亲和色谱填料由单分散多孔微球固相载体和与其连接的蛋白A配基组成，由于单分散多孔微球直径高度一致，保证了很低的反向柱压。如直径30μm的单分散多孔微球填充的色谱柱，它所显现的反向压力与平均直径50μm具有高斯分布的非单分散多孔微球填充的色谱柱相似。

经典液相色谱谱带展宽理论认为主要影响谱带展宽的因素是色谱柱外和色谱柱内两大部分。对于引起色谱柱外谱带展宽的效应，色谱界多数人认为由6种因素即样品引起的方差σ² _S；进样阀引起的方差σ² _V；连接进样阀和柱子以及柱子和检测器的连接管引起的方差σ² _t；柱头引起的方差σ² _f；检测池形状和体积引起的方差σ² _d和电子线路与传感器响应时间引起的方差σ² _r。柱外谱带展宽效应是很难完全消除的，只能尽量地降低它们的影响。对于影响柱内谱带展宽效应(这里指填充型色谱柱)，一般认为，有4种主要因素，即多路径效应(multipath effect)；纵向扩散(longitudinal diffusion)；流动相中的传质阻力(the resistance to mass transfer in the mobile phase)以及固定相中的传质阻力(theresistance to mass transfer in the stationary phase)。以下公式给出了定量描述：

H_内＝H_M+H_L+H_RM+H_RL

式中H_内是指柱内效应对色谱峰理论塔板高度所做的贡献；H_M是多路径效应对理论塔板高度所贡献的份额；H_L是纵向扩散效应对理论塔板高度所贡献的份额；H_RM是流动相传质阻力对理论塔板高度所贡献的份额；H_RL是固定相传质阻力对理论塔板高度所贡献的份额。

单分散微球所填充的液相色谱柱对降低H_M有益。在填充色谱柱中，微球或粒状填料之间的间隙是流动相流通之通道。填料粒径、形状以及填充床紧密程度的不均一性，都会使填充柱产生多路径效应：

多路径效应对理论塔板高度的贡献为：

H_M＝2λd_p

式中λ为表征填料粒度不均一性的常数项，它与粒度分布有关，粒径分布越窄，即分布越均匀，则λ值越接近于1，反之则λ值越大。d_p为粒子或微球直径。显然，使用单分散微球所填充的色谱柱，较之于使用粒度分布宽或其他形状的颗粒所填充的色谱柱，可以有效地降低λ值。另外，使用直径小的微球或颗粒的填料也是减小H_M的一个方法。但是，粒径减小会造成填充柱反向压力升高，而过高的柱压会造成设备制造和操作上的困难。特别是大型生产用的色谱柱，承受压力的限度较低。在使用粒径分布宽的微球或颗粒时，小的微球或颗粒会嵌入大的微球或颗粒形成的间隙中，从而造成较高的柱压，而单分散微球的直径非常接近，使填充柱中微球之间的间隙大小一致，造成较低的柱压，可以推论，在同样柱压限度要求下，如使用单分散微球填料，可以选择粒径更小的微球，从而保证多路径效应对塔板高度的贡献降至最低。

即与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

通过采用单分散微球作为固相载体与蛋白A配基相结合，在同样柱压限度要求下，可以选择粒径更小的微球载体，从而保证多路径效应对塔板高度的贡献降至最低，以提高分离、纯化效率。

同时本发明的单分散微球为多孔形式，多孔形式的微球可以提高固相载体的比表面积，与单分散无孔微球相比，可使配基蛋白A的结合量及待分离物质的柱载量相应增加数倍至数十倍，大大提高制备和工业规模生产的效率。

下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为单分散多孔微球扫描电镜图；

图2A为过空白柱的人γ球蛋白的色谱图；

图2B为过本发明的亲和色谱柱的人γ球蛋白的色谱图；

图3为不同蛋白酶在亲和色谱柱上保留行为的比较图；

图4为用人γ球蛋白测定亲和色谱柱柱载量实验结果图；

图5为人血清溶液在亲和色谱柱上的亲和色谱图；

图6为SDS～PAGE分析结果图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明的用于分离、提纯单克隆抗体和抗体球蛋白的亲和色谱填料中所用的固相载体-单分散多孔微球的材料可选自高分子聚合物、硅胶、碳化硅、氧化铝、氯化物和陶瓷微球中的任一种，下面仅以优选的高分子聚合物为例进行说明。

实施例1

以高分子聚合物聚苯乙烯为固相载体、蛋白A为配基的亲和色谱填料及亲和色谱柱的制备：

1、选择均粒高交联度聚苯乙烯(PS～DVB)多孔高分子为固相载体。微球粒径约30μm，孔径一部分为10～130nm，另一部分为130～3000nm，其具有良好的机械强度和化学稳定性，表面经镀膜处理，富集一级醇官能团。该薄膜覆盖所有微球表面，不会被任何有机溶剂洗掉，并保证可在pH1～14范围内使用。取该微球10g，置于100mL三角磨口圆底烧瓶中，该烧瓶中间装有机械搅拌器，一侧口装有水冷凝管，另一侧装有50mL滴液漏斗。将60mL 3mol/L KOH溶液和10mL表氯醇，室温低速搅拌2h，将20mL表氯醇注入滴液漏斗中，保持低速搅拌下，缓慢滴加入反应烧瓶中。继续在搅拌下反应16h，过滤，用水洗涤，最后用丙酮洗涤3次，真空下烘干。

2、将50mg蛋白A置于100mL圆底烧瓶中，加入10mL pH 7.0PBS缓冲液，将烘干的固体载体加入，在摇床上室温振荡16h。抽吸过滤并用蒸馏水洗净。

3、经步骤2制备的单分散多孔微球(如图1所示)加入20mL 0.05MHCl。在摇床上室温振荡16h，抽滤并用蒸馏水洗净。置于10mL 20％乙醇/水溶液中保存。

4、取直径为4.6mm，长度为50mm不锈钢色谱空柱洗净备用。约0.6g以PS～DVB为载体、以蛋白A为配基的亲和色谱填料，悬浮于pH 7的20mMPBS缓冲液中，在15Mpa压力下以匀浆法装柱，制备出亲和色谱柱。以同法制备出空白亲和色谱柱。

上述制备的亲和色谱填料及亲和色谱柱可用于分离、提纯单克隆抗体和抗体球蛋白，下面仅以人γ球蛋白的分离为代表例进行说明。

实施例2

人γ球蛋白的分离：

1、人γ球蛋白在空白柱和亲和色谱柱上的色谱保留行为

将亲和色谱柱或空白柱连接于高效液相色谱仪上，样品为人γ球蛋白(Humanγ～Globulin)。流动相A液为20mM磷酸钾缓冲液(pH 7.5)+150mM NaCl，流动相B液为0.1M甘氨酸盐酸盐(pH 2.5)。将人γ球蛋白溶于流动相A，制成1.0mg/mL的γ球蛋白溶液，流速：1mL/min；梯度条件：0～10min A液，10～20min B液；20～30min A液，进样量20μL，检测波长254nm。如图2A所示，表明人γ球蛋白在空白柱上没有保留，如图2B所示，表明人γ球蛋白在亲和色谱柱上可保留且在流动相换为B液时被洗脱下来，说明键合的A蛋白配基与人γ球蛋白有专一作用。

2、不同蛋白质在亲和色谱柱上保留行为

将亲和色谱柱连接于高效液相色谱仪上，将细胞色素C(CytochromeC)、牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin)、核糖核酸酶A(Ribonuclease A)、溶菌酶(Lysozyme)、大豆胰蛋白酶抑制剂(TrypsinInhibitor from Soybean)和人γ球蛋白(Humanγ～Globulin)分别进样到亲和色谱柱上并在相同的洗脱条件下洗脱，观察其亲和色谱行为。蛋白浓度为1％(w/v)，进样量为20μL，其他色谱条件同步骤1。结果如图3所示，表明亲和色谱柱载上述不同类型的蛋白质中，只对人γ球蛋白显示了特异性的吸附，这对于从复杂的实际样品中分离纯化人γ球蛋白十分有利。

3、亲和色谱柱柱载量的测定

将亲和色谱柱连接于高效液相色谱仪上，样品溶液为人γ球蛋白(Humanγ～Globulin)，浓度为5％(w/v)。流动相同步骤1，实验流程如下：0～5min流动相A 0.2mL/min，5～70min样品溶液0.2mL/min，70～80min A液1mL/min，80～90min B液1mL/min，考察色谱柱的柱载量，结果如图4所示，通过计算得到柱载量为54mg/ml。

4、利用本发明的亲和色谱柱从人血清中分离人γ球蛋白

实验前取新鲜人血清，用流动相A液配制成5％(v/v)人血清溶液，流动相同步骤1。上样及洗脱流程如下：0～5min流动相A(0.2mL/min)，5～55min人血清溶液(0.2mL/min)，55～65min流动线A(1mL/min)，65～75min流动相B(1mL/min)。结果如图5所示，人血清中的人γ球蛋白在色谱柱上发生特异性吸附，而其他成分则不发生保留并被A液洗脱，最终人γ球蛋白在B液洗脱下得到富集。

5、亲和色谱纯化的人γ球蛋白的表征

收集步骤4中人γ球蛋白洗脱峰，进行SDS～PAGE分析，分析结果如图6所示，其中泳道1为标准分子量样品，泳道2为人γ球蛋白标准品，泳道3为人血清洗脱液，泳道4为上样人血清溶液。由图可知，过本发明亲和色谱柱的人血清洗脱液的条带与标准品条带一致，表明经本发明的亲和色谱柱提纯后的人血清中的人γ球蛋白具有较高的纯度。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种用于分离、提纯单克隆抗体和抗体球蛋白的亲和色谱填料，由固相载体及与其以共价键连接的配基组成，所述配基为蛋白A，其特征在于，所述固相载体为单分散多孔微球。

2.根据权利要求1所述的用于分离、提纯单克隆抗体和抗体球蛋白的亲和色谱填料，其特征在于，所述单分散多孔微球的材料选自高分子聚合物、硅胶、碳化硅、氧化铝、氯化物和陶瓷微球中的任一种。

3.根据权利要求1所述的用于分离、提纯单克隆抗体和抗体球蛋白的亲和色谱填料，其特征在于，所述单分散多孔微球的直径为1～300μm，孔径为10～3000nm。

4.根据权利要求1所述的用于分离、提纯单克隆抗体和抗体球蛋白的亲和色谱填料，其特征在于，所述的单分散多孔微球表面经处理后含有一级醇官能团。

5.根据权利要求1所述的用于分离、提纯单克隆抗体和抗体球蛋白的亲和色谱填料，其特征在于，所述的蛋白A为由基因工程手段获得。

6.根据权利要求1所述的用于分离、提纯单克隆抗体和抗体球蛋白的亲和色谱填料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)接活化的空间臂：取1份经处理后含有一级醇官能团的单分散多孔微球，加入0.1～10份，0.1～3.0mol/L的KOH和0.1～10份含环氧官能团化合物，于10℃～100℃振荡或搅拌反应1～72h后，产物经过滤、洗涤备用；

(2)偶联配基：取1份步骤(1)获得的产物，置于含0.1～10份蛋白A的PBS缓冲液，pH 6～7，于10℃～30℃下振荡或搅拌2～72h后，反应物经过滤、洗涤备用；

(3)封闭残全活性基团：取1份步骤(2)所得反应物，加入5～10份的0.05M HCl，在10℃～30℃下振荡或搅拌反应1～24h，产物经过滤、洗涤后保存。

7.一种用于分离、提纯单克隆抗体和抗体球蛋白的亲和色谱填料制成的亲和色谱柱。