TWI593707B - Ｃｄ３３抗體類及彼等於治療癌症之用途 - Google Patents

Description

CD33抗體類及彼等於治療癌症之用途 相關申請案的交互參照

本申請案為13/804,227(2013年3月14日提出申請)之延續案，並主張美國臨時申請案號61/649,110(2012年5月18日提出申請)之權益。

本發明係關於CD33抗體類及彼等於治療癌症之用途。

CD33是一個大小67kDa之質膜蛋白，其與唾液酸結合，且為唾液酸結合性免疫球蛋白相關性凝集素(SIGLEC)蛋白家族的成員之一。CD33已知可表現在骨髓細胞上。也有報告指出CD33表現在一些惡性細胞上。雖然以CD33為標靶已被用於治療癌症(如急性骨髓性白血病)，但是目前市面上並沒有有效的以CD33為標靶之療法。本發明解決這些及其他問題。

本發明提供與人CD33蛋白特異性結合之單株抗體，以及使用該等抗體治療表現該CD33蛋白之癌的方法。該等單株抗體在重鏈可變區包含SEQ ID NO：19、20及21之互補決定區(CDR)，在輕鏈可變區包含SEQ ID NO：22、23及24之CDR。在一些實施態樣中，至少一CDR具有保守性胺基酸取代。在一些實施態樣中，該分別源自SEQ ID NO：18及8之成熟重鏈可變區及成熟輕鏈可變區之CDR的任何差異係位於位置H60至H65。

該等單株抗體可為鼠抗體、嵌合性抗體或人化抗體。較佳之人化抗體係如此處揭示之h2H12抗體。

在一態樣中，本發明為一種在重鏈可變區包含SEQ ID NO：19、20及21之CDR及在輕鏈可變區包含SEQ ID NO：22、23及24之CDR，且另外具有與SEQ ID NO：18至少90%一致性之成熟重鏈可變區及與SEQ ID NO：8至少90%一致性之成熟輕鏈可變區的人化抗體。此外，下列重鏈胺基酸殘基維持如下：H48係由I佔據、位置H66係由K佔據、位置H67係由A佔據、位置H69係由L佔據、位置H71係由A佔據且位置H94係由S佔據；且下列輕鏈胺基酸殘基維持如下：L22係由N佔據、位置L46係由T佔據、位置L69係由Q佔據且位置L71係由Y佔據。在其他實施態樣中，該人化抗體在重鏈可變區包含SEQ ID NO：19、20及21之CDR及在輕鏈可變區包含SEQ ID NO：22、23及24之CDR，且另外具有與 SEQ ID NO：18至少95%一致性之成熟重鏈可變區及與SEQ ID NO：8至少95%一致性之成熟輕鏈可變區。

在另一實施態樣中，該人化2H12抗體具有與重鏈恆定區融合之成熟重鏈以及與輕鏈恆定區融合之成熟輕鏈。在其他實施態樣中，該重鏈恆定區係天然人恆定區之突變形式，且相較於該天然人恆定區具有減少之與Fcγ受體之結合。在另一實施態樣中，該重鏈恆定區係IgG1同型。示範性重鏈恆定區胺基酸序列包括SEQ ID NO：27及SEQ ID NO：29(在位置239之半胱胺酸經絲胺酸取代之重鏈恆定區(S239C))。示範性輕鏈恆定區胺基酸序列包括SEQ ID NO：25。

在一實施態樣中，該人化抗體包括具有SEQ ID NO：18之胺基酸序列的成熟重鏈可變區以及具有SEQ ID NO：8之胺基酸序列的成熟輕鏈可變區。

在一實施態樣中，該人化抗體係與細胞毒性劑或細胞靜止劑共軛。在其他實施態樣中，該人化抗體係與細胞毒性劑共軛。細胞毒性劑可為例如DNA次要凹槽結合劑。吡咯并[1,4]苯二氮(PBD)即為一DNA次要凹槽結合劑之細胞毒性劑的例子，其可與此處揭示之人化CD33抗體共軛。在一實施態樣中，該PBD係經由酶可切割連接子與該CD33抗體共軛。在另一實施態樣中，該細胞毒性劑具有下式： ，其中波浪 線代表連接該連接子之處。

在一實施態樣中，該人化抗體與人或長尾獼猴(cynomolgus monkey)之CD33的結合常數係0.5至2×10⁹M^-1。

在一態樣中，本發明提供治療罹患表現CD33的癌或有罹患表現CD33的癌風險之病患的方法，該方法藉由投予如此處所揭示之人化抗體CD33之有效配方至該病患。該表現CD33之癌包括急性骨髓樣白血病(AML)、骨髓發育不良性症候群(MDS)、急性前骨髓細胞白血病(APL)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性骨髓單球性白血病(CMML)、慢性骨髓增生性疾病、前B細胞急性淋巴胚細胞白血病(preB-ALL)、前T細胞急性淋巴胚細胞白血病(preT-ALL)、多發性骨髓瘤(MM)、肥胖細胞疾病及骨髓樣肉瘤。

在一態樣中，本發明提供一種包含人化或嵌合性抗體之醫藥組成物，該人化或嵌合抗體在重鏈可變區包含SEQ ID NO：19、20及21之互補決定區(CDR)，在輕鏈可變區包含SEQ ID NO：22、23及24之CDR。

在一態樣中，本發明提供一種人化抗體，其具有與HI(SEQ ID NO：18之胺基酸序列)至少90%一致性的成熟重鏈可變區以及與LG(SEQ ID NO：8之胺基 酸序列)至少90%一致性的成熟輕鏈可變區。在其他實施態樣中，該人化抗體具有與SEQ ID NO：18至少95%一致性的成熟重鏈可變區及與SEQ ID NO：8至少95%一致性的成熟輕鏈可變區。在另一實施態樣中，該重鏈可變區之位置H48、H66、H67、H69、H71及H94係由I、K、A、L、A及S佔據，且該輕鏈可變區之位置L22、L46、L69及L71係由N、T、Q及Y佔據。在一些實施態樣中，該分別源自SEQ ID NO：18及8之成熟重鏈可變區及成熟輕鏈可變區之CDR的任何差異係位於位置H60至H65。

在其他實施態樣中，該人化抗體具有與SEQ ID NO：18之CDR相同的成熟重鏈可變區之CDR及與SEQ ID NO：8之CDR相同的成熟輕鏈可變區之CDR。

在一實施態樣中，該人化抗體包括具有SEQ ID NO：18之胺基酸序列的成熟重鏈可變區以及具有SEQ ID NO：8之胺基酸序列的成熟輕鏈可變區。

在一實施態樣中，該人化抗體係與細胞毒性劑或細胞靜止劑共軛。在一實施態樣中，該人化抗體係與細胞毒性劑或細胞靜止劑共軛。在其他實施態樣中，該人化抗體係與細胞毒性劑共軛。細胞毒性劑可為例如DNA次要凹槽結合劑。吡咯并[1,4]苯二氮(PBD)即為一DNA次要凹槽結合劑之細胞毒性劑的例子，其可與此處揭示之人化CD33抗體共軛。在一實施態樣中，該PBD係經由酶可切割連接子與該CD33抗體共軛。在另一實施態樣中， 該細胞毒性劑具有下式：，其中波浪線代表連接該連接子之處。

在另一實施態樣中，該人化抗體與人或長尾獼猴(cynomolgus monkey)之CD33的結合常數係0.5至2×10⁹M^-1。

在另一實施態樣中，該人化抗體具有與重鏈恆定區融合之成熟重鏈以及與輕鏈恆定區融合之成熟輕鏈。在其他實施態樣中，該重鏈恆定區係天然人恆定區之突變形式，且相較於該天然人恆定區具有減少之與Fcγ受體之結合。在另一實施態樣中，該重鏈恆定區係IgG1同型。示範性重鏈恆定區胺基酸序列包括SEQ ID NO：27及SEQ ID NO：29(S239C)。示範性輕鏈恆定區胺基酸序列包括SEQ ID NO：25。

在其他態樣中，本發明提供一種編碼如此處所述之成熟重鏈或輕鏈可變區之任一者的核酸。編碼重鏈可變區之示範性核酸包括SEQ ID NO：39至47；編碼輕鏈可變區之示範性核酸包括SEQ ID NO：32至38。

在一態樣中，本發明提供治療罹患表現CD33的癌或有罹患表現CD33的癌風險之病患的方法，該方法藉由投予如此處所揭示之人化抗體CD33之有效配方至該 病患。該表現CD33之癌包括急性骨髓樣白血病(AML)、骨髓發育不良性症候群(MDS)、急性前骨髓細胞白血病(APL)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性骨髓單球性白血病(CMML)、慢性骨髓增生性疾病、前B細胞急性淋巴胚細胞白血病(preB-ALL)、前T細胞急性淋巴胚細胞白血病(preT-ALL)、多發性骨髓瘤(MM)、肥胖細胞疾病及骨髓樣肉瘤。

該人化抗體較佳係以醫藥上適合之組成物投予。在一些實施態樣中，該經投予之人化抗體係與細胞毒性劑或細胞靜止劑共軛。在一實施態樣中，該經投予之人化抗體係與細胞毒性劑或細胞靜止劑共軛。在其他實施態樣中，該經投予之人化抗體係與細胞毒性劑共軛。細胞毒性劑可為例如DNA次要凹槽結合劑。吡咯并[1,4]苯二氮(PBD)即為一DNA次要凹槽結合劑之細胞毒性劑的例子，其可與此處揭示之經投予之人化CD33抗體共軛。在一實施態樣中，該PBD係經由酶可切割連接子與該經投予之CD33抗體共軛。在另一實施態樣中，該細胞毒性劑具有下式： ，其中波浪 線代表連接該連接子之處。

圖1A及1B顯示該母體鼠單株抗體(稱為m2H12)與該人化2H12重鏈可變區(圖1A)及輕鏈可變區(圖1B)之胺基酸序列排比。

圖2顯示試管內細胞毒性試驗之結果，該試驗測試2H12衍生性抗體-藥物共軛物(ADC)對CD33陽性AML細胞系HL-60及HEL 92.1.7之活性。h2H12d係與SGD-1910共軛；m2H12及h2H12係與SGD-1269共軛。非結合性對照ADC(h00d-SGD-1910及h00-SGD-1269)係經測試作為抗原特異性之對照。MYLOTARG ®(吉妥珠單抗奧唑米星)為廣泛說明之抗CD33之抗體藥物共軛物，由抗CD33抗體hP67.6與細胞毒性藥物卡利奇黴素(calicheamicin)連接組成，其亦經測試。

定義

本發明提供特別是與人CD33蛋白特異性結合之單株抗體及其共軛物。該等抗體可用於治療及診斷表現CD33之癌及檢測CD33蛋白。

「經分離」之抗體係指自抗體之天然環境之成分識別及分離及/或回收之抗體及/或經重組產製之抗體。「經純化之抗體」為通常至少50% w/w不含在彼之產製或純化所產生之干擾蛋白質及其他汙染物之抗體，但不排除該單株抗體與多餘之醫藥上可接受之載劑或其他載具組合以利彼之使用之可能性。干擾蛋白及其他汙染物可 包括例如自細胞分離或重組產製抗體之該細胞的細胞成分。有時單株抗體為至少60%、70%、80%、90%、95或99% w/w不含源自產製或純化之干擾蛋白及汙染物。此處描述之抗體包括鼠抗體、嵌合抗體及人化抗體可以分離及/或純化形式提供。

此處所使用之用語「單株抗體」係指自實質上同源性之抗體群獲得之抗體，即組成該群之個別抗體係相同之抗體，除了可能少量存在之可能天然發生之突變以外。修飾語「單株」表示抗體係自實質上同源之抗體族群獲得之特徵，不應被視為需要藉由任何特定之方法產製該抗體。舉例來說，本發明所使用之單株抗體可能藉由最先由Kohler et al.(1975)Nature 256：495所述之雜交瘤方法製備，或可能藉由重組DNA方法製備(見例如美國專利第4816567號)。該等「單株抗體」也可能利用例如Clackson et al.(1991)Nature,352：624-628及Marks et al.(1991)J.Mol.Biol.,222：581-597所述之技術自噬菌體抗體庫分離，或可能藉由其他方法製備。此處所述之抗體係單株抗體。

單株抗體與彼之標靶抗原之特異性結合係指至少10⁶、10⁷、10⁸、10⁹或10¹⁰M^-1之親和性。特異性結合係可檢測地在強度上較高，且可與發生於至少一種非相關性標靶之非特異性結合區別。特異性結合可為特定官能基之間形成鍵結與或特定空間契合(例如鎖及鑰匙類型)之結果，然而非特異性結合通常是凡得瓦(van der Waals)力之結果。

抗體之基本結構單位為由子單位形成之四聚體。各四聚體包括二對相同之多肽鏈對，各對具有一條「輕鏈」(約25kDa)及一條「重鏈」(約50至70kDa)。各鏈之胺基端部分包括約100至110個或更多胺基酸之可變區，該可變區主要負責辨識抗原。此可變區在剛被表現時係與可切割之信號肽連接。不具有該信號肽之可變區有時被稱為成熟可變區。因此，舉例來說，輕鏈成熟可變區係指不具有輕鏈信號肽之輕鏈可變區。各鏈之羧基端部分定義主要負責效應功能之恆定區。

輕鏈被分成κ或λ。重鏈被分成γ、μ、α、δ或ε，且分別定義該抗體之同型為IgG、IgM、IgA、IgD及IgE。在輕鏈及重鏈中，可變區及恆定區係由約12或更多個胺基酸之「J」區連接，且重鏈亦包括約10或更多個胺基酸之「D」區。(一般見Fundamental Immunology,Paul,W.,ed.,2nd ed.Raven Press,N.Y.,1989,Ch.7，以參考方式整體納入以符合所有目的)。

各輕鏈/重鏈對之成熟可變區形成抗體結合位點。因此，完整抗體具有二個結合位點。除了雙官能性或雙特異性抗體之外，該二個結合位點係相同。該等鏈皆展現相同之一般結構，其中相對保守之架構區(FR)係由3個亦稱為互補決定區或CDR之超變異區連接。各對中之2條鏈的CDR係由該架構區排比，使其能與特定表位結合。從N端至C端，輕鏈及重鏈皆包含結構域FR1、 CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。分配胺基酸至各結構域係根據卡巴(Kabat,Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,MD,1987 and 1991)或柯西亞(Chothia & Lesk,J.Mol.Biol.196：901-917(1987)；Chothia et al.,Nature 342：878-883(1989))之定義。卡巴亦提供廣泛使用之編號慣例(卡巴編號)，其中在不同重鏈之間或不同輕鏈之間的對應殘基係經分配相同編號。

用語「抗體」包括完整抗體及彼等之結合片段。通常，抗體片段會與彼等所起源之完整抗體競爭與標靶之特異性結合，包括分開重鏈、輕鏈Fab、Fab'、F(ab')₂、F(ab)c、雙價抗體、Dab、奈米抗體及Fv。片段可藉由重組DNA技術或藉由酶或化學分離完整免疫球蛋白加以產製。用語「抗體」亦包括雙價抗體(同型二聚體Fv片段)或迷你抗體(V_L-V_H-C_H3)、雙特異性抗體或該類似物。雙特異性或雙官能性抗體係具有二個不同重鏈/輕鏈對及二個不同結合位點之人工雜交抗體(見例如Songsivilai and Lachmann,Clin.Exp.Immunol.,79：315-321(1990)；Kostelny et al.,J.Immunol.,148：1547-53(1992))。

用語「抗體」包括抗體本身(裸抗體)或與細胞毒性劑或細胞靜止劑共軛之抗體。

用語「表位」係指在抗原上與抗體結合之位點。表位可自連續胺基酸或藉由一或多個蛋白質之三級摺 疊並列之非連續胺基酸形成。自連續胺基酸形成之表位在暴露於變性溶劑時通常仍被保留，然而藉由三級摺疊形成之表位通常在變性溶劑處理後消失。表位通常包括至少3個及更常地至少5或8至10個呈獨特空間構形之胺基酸。測定表位之空間構形之方法包括例如x光結晶學及二維核磁共振。見例如Epitope Mapping Protocols,in Methods in Molecular Biology,Vol.66,Glenn.E.Morris,Ed.(1996)。

辨識相同或重疊表位之抗體可在簡單之顯示一抗體與另一抗體競爭與標靶抗原結合之能力的免疫試驗中識別。抗體之表位亦可藉由與彼之抗原結合之抗體的X光結晶學定義以識別接觸殘基。或者，若抗原中會減少或消除一抗體之結合的所有胺基酸突變，也會減少或消除另一抗體之結合，則該二個抗體具有相同表位。若減少或消除一抗體之結合的一些胺基酸突變減少或消除另一抗體之結合，則該二個抗體具有重疊之表位。

抗體之間的競爭係由試驗測定，其中受測抗體抑制參考抗體與共同抗原之特異性結合(見例如Junghans et al.,Cancer Res.50：1495,1990)。在競爭結合試驗中，若多餘的受測抗體(例如至少2x、5x、10x、20x或100x)抑制該參考抗體至少50%、但較佳75%、90%或99%之結合，則該受測抗體與參考抗體競爭。由競爭試驗所識別之抗體(競爭性抗體)包括與參考抗體之相同表位結合之抗體及與該參考抗體所結合之表位夠近之鄰近表位結合而發 生空間位阻之抗體。本發明包含與h2H12抗體競爭與人CD33蛋白結合之抗體。

2H12抗體是一種與人CD33蛋白特異性結合之抗體，其包含三個重鏈互補決定區(CDR)：重鏈CDR1(例如SEQ ID NO：19或與SEQ ID NO：19實質上相同之序列)、重鏈CDR2(例如SEQ ID NO：20或與SEQ ID NO：20實質上相同之序列)及重鏈CDR3(例如SEQ ID NO：21或與SEQ ID NO：21實質上相同之序列)；及三個輕鏈CDR：輕鏈CDR1(例如SEQ ID NO：22或與SEQ ID NO：22實質上相同之序列)、輕鏈CDR2(例如SEQ ID NO：23或與SEQ ID NO：23實質上相同之序列)及輕鏈CDR3(例如SEQ ID NO：24或與SEQ ID NO：24實質上相同之序列)。2H12抗體包括鼠2H12(m2H12)抗體及源自該鼠2H12抗體之嵌合性或人化抗體。

用語「病患」包括人及其他接受預防性或治療性治療之哺乳動物個體。

為了要定義胺基酸之取代為保守性或非保守性，將胺基酸依下列分組：第一組(疏水性側鏈)：甲硫胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸；第二組(中性親水性側鏈)：半胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸；第三組(酸性側鏈)：天冬胺酸、麩胺酸；第四組(鹼性側鏈)：天冬醯胺酸、麩醯胺酸、組胺酸、離胺酸、精胺酸；第五組(影響鏈方向之殘基)：甘胺酸、脯胺酸；及 第六組(芳香族側鏈)：色胺酸、酪胺酸、苯丙胺酸。保守性取代涉及在同一組當中不同胺基酸之間的取代。非保守性取代包括用這些分組中之一組的成員交換另一組的成員。

序列一致性百分比係由經卡巴編號慣例最佳排比之抗體序列測定。在排比後，若主題抗體區(例如重鏈或輕鏈之整個成熟可變區)係與參考抗體之該相同區域比較，則該主題及參考抗體區之間的序列一致性百分比係將該主題及參考抗體區二者當中由相同胺基酸佔據之位置數目除以該二區之排比位置之總數(缺口不予計算)，並乘以100以換算成百分比。

「包含」一或多個列舉元件之組成物或方法可能包括未經特別列舉出之其他元件。舉例來說，包含抗體之組成物可能僅包含該抗體或包含該抗體與其他成分之組合。

指定一範圍之數值包括在該範圍內或定義該範圍之所有整數。

抗體效應功能係指由免疫球蛋白(Ig)之Fc結構域所貢獻之功能。該等功能可為例如抗體依賴性細胞性細胞毒性、抗體依賴性細胞性吞噬作用或補體依賴性細胞毒性。該等功能可由例如Fc效應結構域與具有吞噬細胞活性或溶解活性之免疫細胞上的Fc受體結合引起，或由Fc效應結構域與補體系統之成分結合引起。通常，由該Fc結合細胞或補體成分所媒介之效應導致該CD33標 靶細胞之抑制及/或刪除。抗體之Fc區可吸引Fc受體(FcR)表現細胞，使這些細胞與被抗體包覆之標靶細胞連接。表現IgG之表面FcR包括FcγRIII(CD16)、FcγRII(CD32)及FcγRIII(CD64)的細胞可作為效應細胞以摧毀被IgG包覆之細胞。該等效應細胞包括單核球、巨噬細胞、自然殺手(NK)細胞、嗜中性球及嗜酸性球。IgG與FcγR之結合活化抗體依賴性細胞性細胞毒性(ADCC)或抗體依賴性細胞性吞噬作用(ADCP)。ADCC係由CD16⁺效應細胞經由分泌膜孔形成蛋白及蛋白酶所媒介，然而吞噬作用係由CD32⁺及CD64⁺效應細胞所媒介(見Fundamental Immunology,4^th ed.,Paul ed.,Lippincott-Raven,N.Y.,1997,Chapters 3,17 and 30；Uchida et al.,2004,J.Exp.Med.199：1659-69；Akewanlop et al.,2001,Cancer Res.61：4061-65；Watanabe et al.,1999,Breast Cancer Res.Treat.53：199-207)。除了ADCC及ADCP之外，與細胞結合之抗體的Fc區亦可活化補體經典途徑以誘發補體依賴性細胞毒性(CDC)。當抗體與抗原結合時，補體系統之C1q與該抗體之Fc區結合。C1q與和細胞結合之抗體的結合可誘發涉及C4和C2之蛋白水解活化以產生C3轉換酶之事件級聯。藉由C3轉換酶將C3切割成C3b使終末補體成份包括C5b、C6、C7、C8及C9得以被活化。這些蛋白質一起在該被抗體包覆之細胞上形成膜攻擊複合體孔。這些孔擾亂細胞膜之完整性並殺死該標靶細胞(見Immunobiology,6^th ed., Janeway et al.,Garland Science,N.Y.,2005,Chapter 2)。

用語「抗體依賴性細胞性細胞毒性」或ADCC係一種用於誘導細胞死亡之機轉，該機轉取決於被抗體包覆之標靶細胞與具有溶解活性之免疫細胞(亦稱為效應細胞)的交互作用。該等效應細胞包括自然殺手細胞、單核球/巨噬細胞及嗜中性球。該等效應細胞與和標靶細胞經由彼等之抗原結合部位結合之Ig的Fc效應結構域連接。被抗體包覆之標靶細胞因為效應細胞之活性而死亡。

用語「抗體依賴性細胞性吞噬作用」或ADCP係指被抗體包覆之細胞被與Ig之Fc效應結構域結合之吞噬細胞性免疫細胞(例如巨噬細胞、嗜中性球及樹突細胞)內化(不論整體或部分)之過程。

用語「補體依賴性細胞毒性」或CDC係指一種誘導細胞死亡之機轉，其中與標靶結合之抗體的Fc效應結構域活化一系列酶反應以在該標靶細胞膜上形成孔。通常，抗原抗體複合物諸如該些在被抗體包覆之標靶細胞上之抗原抗體複合物與補體成份C1q結合並活化之，該經活化之C1q接著活化補體級聯以導致標靶細胞死亡。補體之活化亦可導致補體成份在該標靶細胞表面上沉積，此藉由與白血球上之補體受體(例如CR3)結合以利ADCC。

「細胞毒性效應」係指除盡、消除及/或殺死標靶細胞。「細胞毒性劑」係指對細胞具有細胞毒性效 應之劑。

細胞毒性劑可與抗體共軛或與抗體組合投予。

「細胞靜止效應」係指抑制細胞增生。「細胞靜止劑」係指對細胞具有細胞靜止效應之劑，藉以抑制特定細胞亞群之生長及/或擴張。細胞靜止劑可與抗體共軛或與抗體組合投予。

用語「醫藥上可接受」係指經美國聯邦或州政府管理機關核准或可核准，或經列示於美國藥典或其他公認藥典中以使用於動物及特別是人。用語「醫藥上可相容之成分」係指與抗CD33抗體一起被投予至個體之在醫藥上可接受之稀釋劑、佐劑、賦形劑、或載具。

用語「醫藥上可接受之鹽」係指抗CD33-1抗體或彼之共軛物或與抗CD33-1抗體一起投予之劑的醫藥上可接受之有機或無機鹽。示範性鹽類包括硫酸鹽、檸檬酸鹽、醋酸鹽、草酸鹽、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、酸式磷酸鹽、異菸鹼酸鹽、乳酸鹽、柳酸鹽、酸性檸檬酸鹽、酒石酸鹽、油酸鹽、鞣酸鹽、泛酸鹽、二酒石酸鹽、抗壞血酸鹽、琥珀酸鹽、順丁烯二酸鹽、龍膽酸鹽、反丁烯二酸鹽、葡萄糖酸鹽、葡萄糖醛酸鹽、蔗糖酸鹽、甲酸鹽、苯甲酸鹽、麩胺酸鹽、甲烷磺酸鹽、乙磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽及雙羥萘酸鹽(即1,1’亞甲基雙-(2羥基3萘甲酸鹽))。醫藥上可接受之鹽可能涉及納入另一分子諸如乙酸離子、琥珀酸 離子或其他反離子。該反離子可為穩定母體化合物之電荷的任何有機或無機基團。另外，醫藥上可接受之鹽在彼之結構中可具有超過一個帶電原子。多帶電原子係該醫藥上可接受之鹽的一部分之例可具有多重反離子。因此，醫藥上可接受之鹽可具有一或多個帶電原子及/或一或多個反原子。

除非在上下文中清楚明示，用語「約」包含在所述數值之標準差之內的數值。

本發明之詳細說明 I. 通則

本發明提供與CD33特異性結合之單株抗體類。該等抗體可被用於治療及診斷各種癌及檢測CD33。

II. 標靶分子

除非另外說明，否則CD33係指人CD33。示範性人序列具有Swiss Prot編號P20138。P20138於此處為SEQ ID NO：55。P20138包括信號肽(胺基酸1至17)、具IgG樣結構域之細胞外結構域(胺基酸18至259)、跨膜結構域(胺基酸260至282)及細胞質結構域(胺基酸283至364)。

除非上下文另外清楚說明，提及CD33至少指的是該蛋白質之胞外結構域及通常是指不含可切割信號肽(P20138之胺基酸1-17)之完整蛋白質。

III. 本發明之抗體 A. 結合專一性及功能特性

本發明提供鼠抗體(m2H12)及源自m2H12之嵌合性或人化抗體。選擇鼠抗體是因為其可與人CD33蛋白及長尾獼猴(cynomolgus)CD33蛋白結合。長尾獼猴CD33胺基酸序列為SEQ ID NO：56及57。

鼠m2H12抗體之人化或嵌合性形式對人CD33之親和性(即Ka)可高於m2H12抗體之該親和性，或較其增加或減少五倍或二倍之內。一種測量抗體對其標靶抗原之親和性之方法係測定抗體的表觀解離常數。本發明包含與人CD33之間的表觀解離常數實質上與鼠2H12之該解離常數相同(例如在實驗誤差內)的抗體(例如鼠2H12抗體之嵌合性及人化形式)，以及解離常數低於或高於鼠抗體2H12解離常數的抗體。在一些實施態樣中，本發明之抗體(例如嵌合性、人化及人形式之鼠2H12抗體)與人CD33之間的表觀解離常數為鼠2H12抗體之該表觀解離常數的0.1至10倍之內，或較佳地0.1至5倍之內、0.1至2倍之內或甚至0.5至2倍之內。在一些態樣中，該等抗體與人CD33之間的表觀解離常數(Kd)較佳地為0.1nM至50nM，甚至更佳地為0.1nM至25nM，甚至更佳為0.1nM至10nM、0.5nM至5nM、或0.5nM至2.5nM。人化或嵌合性m2H12抗體和彼等所源自之鼠m2H12抗體一樣，與天然形式及/或CHO細胞重 組表現之人CD33特異性結合。人化或嵌合性m2H12抗體與相同表位結合及/或與m2H12競爭與人CD33之結合。在一些實施態樣中，人化或嵌合性m2H12抗體亦與CD33之猴同源物結合，因此允許在非人靈長動物進行臨床前試驗。

較佳之抗體(例如人化或嵌合性m2H12抗體)在癌性細胞之增殖培養、在動物模型或臨床試驗中抑制癌(例如細胞生長、轉移及/或對生物之致死性)。動物模型可藉由將CD33表現性人腫瘤細胞系或原發性病患腫瘤細胞植入適當之免疫缺陷鼠品系中形成，例如無胸腺裸鼠、NSG或SCID小鼠。這些腫瘤細胞系可藉由皮下注射為實質腫瘤或藉由靜脈注射為散播型腫瘤於免疫缺陷鼠宿主建立。一旦在宿主體內建立後，這些腫瘤模型可被用於評估該抗CD33抗體或彼等之共軛形式之治療療效，如實施例中所述。

B. 抗體

人化抗體係經遺傳工程化之抗體，其中源自非人「捐贈者」抗體之CDR被植入人「接受者」抗體序列(見例如Queen,US 5,530,101及5,585,089；Winter,US 5,225,539；Carter,US 6,407,213；Adair,US 5,859,205；及Foote,US 6,881,557)。該接受者抗體序列可為例如成熟人抗體序列、該等序列之組合物、人抗體序列之共同序列或種系區序列。重鏈較佳之接受者序列為種 系V_H外顯子V_H1-18及J外顯子(J_H)(外顯子J_H-6)。以輕鏈來說，較佳之接受者序列為外顯子V_L1-16 J外顯子J κ-4。因此，人化抗體係具有完全或實質上源自非人捐贈者抗體之一些或所有CDR及(若存在的話)完全或實質上源自人抗體序列之可變區架構序列及恆定區之抗體。類似地，人化重鏈具有至少一、二及通常所有三個完全或實質上源自捐贈者抗體重鏈之CDR，及(若存在的話)實質上源自人重鏈可變區架構及恆定區序列之重鏈可變區架構序列及重鏈恆定區。類似地，人化輕鏈具有至少一、二及通常所有三個完全或實質上源自捐贈者抗體輕鏈之CDR，及(若存在的話)實質上源自人輕鏈可變區架構及恆定區序列之輕鏈可變區架構序列及輕鏈恆定區。除了奈米抗體及dAb之外，人化抗體包含人化重鏈及人化輕鏈。當個別CDR之間的對應殘基(如卡巴定義)具有至少60%、85%、90%、95%或100%之一致性時，人化或人抗體中之CDR係實質上源自非人抗體中之對應CDR或實質上與非人抗體中之對應CDR相同。在一些實施態樣中，當各CDR中的保守性胺基酸取代不超過3個時，人化抗體或人抗體中之CDR係實質上源自非人抗體中之對應CDR或實質上與非人抗體中之對應CDR相同。抗體鏈之可變區架構序列或抗體鏈之恆定區係分別實質上源自人可變區架構序列或人恆定區，當彼等之由卡巴定義之對應殘基具有至少70%、80%、85%、90%、95%或100%之一致性。在本發明之一些人化抗體中，該抗體之重鏈可變架構 區具有至少一個鼠2H12回復突變。

雖然人化抗體通常獲得源自鼠抗體之所有六個CDR(較佳地如卡巴定義)，但它們也可以獲得少於全部源自鼠抗體之CDR(例如至少3、4或5個CDR)(例如Pascalis et al.,J.Immunol.169：3076,2002；Vajdos et al.,Journal of Molecular Biology,320：415-428,2002；Iwahashi et al.,Mol.Immunol.36：1079-1091,1999；Tamura et al,Journal of Immunology,164：1432-1441,2000)。

源自人可變區架構殘基之某些胺基酸可根據彼等對CDR構形及/或與抗原結合之可能影響經選擇加以取代。該等可能影響係藉由模型化、檢查在特定位置之胺基酸的特徵、或經驗性觀察特定胺基酸之取代或突變形成之效應加以調查。

舉例來說，當鼠可變區架構殘基與經選擇之人可變區架構殘基之間的胺基酸不同時，若合理地預期該胺基酸具有下列情形，則該人架構胺基酸可利用源自該鼠抗體之相等架構胺基酸加以取代：(1)非共價地與抗原直接結合；(2)比鄰CDR區；(3)以其他方式與CDR區交互作用(例如位於CDR區之約6Å以內)；或(4)媒介該重鏈與輕鏈之間的交互作用。

本發明提供人化形式之小鼠m2H12抗體，其 包括九個示範性人化重鏈成熟可變區(HA至HI)及七個示範性人化輕鏈成熟可變區(LA至LG)。具有最強結合力(EC50最低者)之這些鏈的排列組合係HCLA、HCLE、HCLG、HILA、HILE及HILG。在這些排列組合中，HILG(亦稱為h2H12)係較佳因為其具有最強結合力。

本發明提供2H12抗體，其中該重鏈可變區具有與HA(SEQ ID NO：10)至少90%一致性，且該輕鏈可變區具有與LA(SEQ ID NO：2)至少90%一致性。在一些態樣中，該抗體係人化抗體且在重鏈可變架構區具有至少一個鼠2H12回復突變。在其他態樣中，該抗體係人化抗體且在輕鏈可變架構區具有至少一個鼠2H12回復突變。此外，本發明提供2H12抗體，其中該人化重鏈可變區顯示與SEQ ID NO：10至18至少90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性，且該人化輕鏈可變區顯示與SEQ ID NO：2至8至少90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性(及彼等之任何組合(即該抗體可包含該等重鏈可變區之任一者與該等輕鏈可變區之任一者之配對))。舉例來說，本發明提供抗體類，其中該重鏈可變區顯示與SEQ ID NO：10、11、12、13、14、15、16、17或18至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性，且該人化輕鏈可變區顯示與SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7或8至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在另一實施態樣中，本發明提 供抗體類，其中該重鏈可變區顯示與SEQ ID NO：10、11、12、13、14、15、16、17或18至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性，且該輕鏈可變區顯示與SEQ ID NO：2至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在另一實施態樣中，本發明提供抗體類，其中該重鏈可變區顯示與SEQ ID NO：10、11、12、13、14、15、16、17或18至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性，且該輕鏈可變區顯示與SEQ ID NO：3至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在另一實施態樣中，本發明提供抗體類，其中該重鏈可變區顯示與SEQ ID NO：10、11、12、13、14、15、16、17或18至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性，且該輕鏈可變區顯示與SEQ ID NO：4至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在另一實施態樣中，本發明提供抗體類，其中該重鏈可變區顯示與SEQ ID NO：10、11、12、13、14、15、16、17或18至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性，且該輕鏈可變區顯示與SEQ ID NO：5至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在另一實施態樣中，本發明提供抗體類，其中該重鏈可變區顯示與SEQ ID NO：10、11、12、13、14、15、16、17或18至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性，且該輕鏈可變區顯示與SEQ ID NO：6至少 90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在另一實施態樣中，本發明提供抗體類，其中該重鏈可變區顯示與SEQ ID NO：10、11、12、13、14、15、16、17或18至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性，且該輕鏈可變區顯示與SEQ ID NO：7至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在另一實施態樣中，本發明提供抗體類，其中該重鏈可變區顯示與SEQ ID NO：10、11、12、13、14、15、16、17或18至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性，且該輕鏈可變區顯示與SEQ ID NO：8至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。

在一些態樣中，該等抗體係人化抗體且在個別抗體中之一些或所有回復突變係經保留。在一些抗體中，位置H94係由S佔據。在一些抗體中，較佳地，位置H48、H66、H67、H69、H71及H94中之至少一者係由源自該鼠2H12抗體之對應位置的胺基酸佔據。可任意選擇地，在任何該抗體中，位置H48係由I佔據、位置H66係由K佔據、位置H67係由A佔據、位置H69係由L佔據、位置H71係由A佔據、位置H94係由S佔據。在其他實施態樣中，在該等抗體中，較佳地位置L22、L46、L69及L71之至少一者係由源自該鼠2H12抗體之對應位置的胺基酸佔據。可任意選擇地，在任何該抗體中，位置L22係由N佔據、位置L46係由T佔據、位置L69係由Q佔據且位置L71係由Y佔據。

較佳地，在任何上述抗體中，例如其中該重鏈可變區顯示與SEQ ID NO：10至18至少90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性且該輕鏈可變區顯示與SEQ ID NO：2至8至少90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之2H12人化抗體，該CDR區係與小鼠捐贈者抗體(即鼠2H12抗體(SEQ ID NO：19至24))之CDR區相同或實質上相同。該CDR區係由卡巴定義。本發明之抗體包括抗體HCLA、HCLE、HCLG、HILA、HILE及HILG。

本發明提供HILG人化抗體之變異體，其中該人化重鏈成熟可變區顯示與SEQ ID NO：18至少90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性，且該人化輕鏈成熟可變區顯示與SEQ ID NO：8至少90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。在一些該等抗體中，位置H94係由S佔據。較佳地，在該等抗體中，HILG中之一些或所有回復突變係經保留。換言之，重鏈位置H48、H66、H67、H69、H71及H94之至少1、2、3、4、5或較佳地所有6者係分別由I及K及A及L及A及S佔據。同樣地，輕鏈位置L22、L46、L69及L71之至少1、2、3或較佳地所有4者係分別由N及T及Q及Y佔據。該等人化抗體之CDR區係較佳地與HILG之CDR區實質上一致，這些區係與小鼠捐贈者抗體之該等區相同。該等CDR區可藉由任何習用定義(例如柯西亞(Chothia))定義，但較佳係由卡巴(Kabat)定義。在一實施態樣中， 該人化抗體包含重鏈，該重鏈包含SEQ ID NO：18之3個CDR及與SEQ ID NO：18之可變區架構具有至少95%一致性之可變區架構。在另一實施態樣中，該人化抗體包含輕鏈，該輕鏈包含SEQ ID NO：8之3個CDR及與SEQ ID NO：8之可變區架構具有至少95%一致性之可變區架構。在另一實施態樣中，該人化抗體包含重鏈及輕鏈，該重鏈包含SEQ ID NO：18之3個CDR及與SEQ ID NO：18之可變區架構具有至少95%一致性之可變區架構，且該輕鏈包含SEQ ID NO：8之3個CDR及與SEQ ID NO：8之可變區架構具有至少95%一致性之可變區架構。

就與示範性HILG人化抗體顯示任何差異之人化抗體而言，該額外差異之一種可能性係在該可變區架構中之額外的回復突變。在其他示範性人化重鏈或輕鏈成熟可變區中發生回復突變之任何或所有位置亦可發生回復突變(即1、2、3、4或所有5個在該重鏈中由N佔據之H38、由R佔據之H40、由K佔據之H73、由S佔據之H82A及由T佔據之H83，及1或2個在該輕鏈中由K佔據之L3及由I佔據之L20)。然而，該等額外之回復突變並非較佳，因為它們通常不改善親和性，且導入更多小鼠殘基可能導致增加免疫原性之風險。

另一可能之變異體係以源自人CDR序列之對應殘基取代小鼠抗體之CDR中之某些殘基，通常源自用於設計該示範性人化抗體之該人接受者序列之CDR。在一 些抗體中，只需要部分之CDR(也就是結合所需之CDR殘基之亞群，稱為SDR)以維持人化抗體之結合力。不與抗原接觸且不位於SDR中之CDR殘基(例如通常不需要在CDR H2中之殘基H60至H65)，可根據先前試驗自位於柯西亞超變異環以外之卡巴CDR區加以識別(Chothia,J.Mol.Biol.196：901,1987)，該識別藉由分子模型構建及/或經驗或如Gonzales et al.,Mol.Immunol.41：863(2004)所述。在該等人化抗體之其中一或多個捐贈者CDR殘基不存在之位置或其中完整之捐贈者CDR被遺漏之位置中，佔據該位置之胺基酸可為佔據該接受者抗體序列中之對應位置(卡巴編號)之胺基酸。在該等CDR中所包括之以接受者胺基酸取代捐贈者胺基酸之數目反映競爭考量之平衡。該等取代可能有利於減少人化抗體中之小鼠胺基酸之數量，因此減少可能之免疫原性。然而，取代亦可造成親和性之改變，因此較佳應避免顯著減少親和性。在CDR內經取代之位置及用於取代之胺基酸亦可憑經驗選擇。

雖然不偏好但可產生其他胺基酸取代，例如在不與CDR接觸之架構殘基中，或甚至在CDR內之一些可能的CDR接觸殘基胺基酸。通常在變異體人化序列中產生之取代相較於人化2H12抗體中該經取代之HILG胺基酸而言係保守性。較佳地，相對於HILG之取代(不論是否為保守性)對該人化單株抗體之結合親和性或效價(也就是彼與人CD33結合及抑制癌細胞生長之能力)不 具實質效應。

變異體通常與HILG(h2H12)之重鏈及輕鏈成熟可變區序列具有少量(例如在該輕鏈或重鏈成熟可變區或二者中通常不超過1、2、3、5或10個)取代、刪除或插入差異。

在一些實施態樣中，人化或嵌合抗體的CDR H2相較於重鏈HI之CDR H2具有最多1、2、3、4、5或6個取代、刪除或插入，且CDR H1、H3、L1、L2及L3相較於重鏈HI或輕鏈LG之對應CDR各具有最多1、2、3或4個取代、刪除或插入。在一些實施態樣中，本發明之人化或嵌合抗體在被識別為CDR之部分的胺基酸中具有一個或最多二個保守性胺基酸取代。較佳之胺基酸取代之實例包括下列。在輕鏈之CDR1中，R殘基可取代位置24之K；G、S或T可取代位置25之A；M可取代位置33之L；且T可取代位置34之S。在輕鏈之CDR2中，K殘基可取代位置53之R；M殘基可取代位置54之L；I殘基可取代位置55之V；且E殘基可取代位置56之D殘基。在重鏈之CDR2中，D殘基可取代位置61之E殘基；R殘基可取代位置62之K殘基；Y殘基可取代位置63之F殘基；R殘基可取代位置64之K殘基；且G殘基可取代位置65之A殘基。

在一些實施態樣中，本發明之人化抗體包含SEQ ID NO：18之成熟重鏈可變區，其具有如上所述之CDR序列中之一、二或三個保守性取代。在一些實施態樣 中，本發明之人化抗體包含SEQ ID NO：8之成熟輕鏈可變區，其具有如上所述之CDR序列中之一、二或三個保守性取代。

C. 恆定區之選擇

人化抗體之重鏈及輕鏈可變區可與至少一部份之人恆定區連接。恆定區之選擇部分取決於是否希望具備抗體依賴性細胞媒介性細胞毒性、抗體依賴性細胞性吞噬作用及/或補體依賴性細胞毒性。舉例來說，人同型IgG1及IgG3具有強烈之補體依賴性細胞毒性，人同型IgG2具有微弱之補體依賴性細胞毒性及人IgG4缺乏補體依賴性細胞毒性。人IgG1及IgG3相較於人IgG2及IgG4亦誘導更強之細胞媒介性效應功能。輕鏈恆定區可為λ或κ。抗體可被表現為含有二條輕鏈及二條重鏈之四聚體、分開之重鏈、分開之輕鏈、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、或其中重鏈及輕鏈可變區結構域係透過間隔子連接之單鏈抗體。

人恆定區顯示在不同個體間之同種異型(allotypic)變異及同型同種異型(isoallotypic)變異，也就是不同個體之恆定區的一或多個多形性位置可互有差異。同型同種異型(Isoallotype)與同種異型(allotype)的不同之處在於，辨識一同型同種異型之血清與一或多種其他同型(isotype)之非多形性區域結合。

在輕鏈及/或重鏈之胺基或羧基端的一或多 個胺基酸(諸如重鏈C端之離胺酸)可能在該等分子之一部分或全部當中被遺失或衍生化。可在恆定區產生取代以減少或增加效應功能，諸如補體媒介性細胞毒性或ADCC(見例如Winter et al.,US Patent No.5,624,821；Tso et al.,US Patent No.5,834,597；and Lazar et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103：4005,2006)，或延長在人體中之半衰期(見例如Hinton et al.,J.Biol.Chem.279：6213,2004)。

示範性取代包括將天然胺基酸取代成半胱胺酸殘基之胺基酸取代導入胺基酸位置234、235、237、239、267、298、299、326、330或332，較佳為人IgG1同型中之S239C突變(編號係根據EU指數(Kabat,Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,MD,1987 and 1991)；見US 20100158909，其納入此處之參考文獻)。額外之半胱胺酸殘基之存在允許鏈間雙硫鍵形成。該等鏈間雙硫鍵形成可造成空間位阻，藉此減少該Fc區-FcγR結合交互作用之親和性。被導入或靠近IgG恆定區之Fc區中的半胱胺酸殘基亦可作為與治療劑共軛之位點(即利用硫醇特定試劑共軛細胞毒性藥物諸如藥物之順丁烯二醯亞胺衍生物)。治療劑之存在可造成空間位阻，藉此進一步減少該Fc區-FcγR結合交互作用之親和性。其他在位置234、235、236及/或237中之任一者之取代減少對Fcγ受體之親和性，特別是FcγRI受體(見例如US 6,624,821、US 5,624,821)。

抗體之活體內半衰期亦可影響彼之效應功能。抗體之半衰期可被增加或減少以調整彼之治療活性。FcRn係結構類似MHC第一型抗原之受體，該MHC第一型抗原與β2-微球蛋白非共價結合。FcRn調節IgG之分解代謝及彼等在組織間之胞移作用(Ghetie and Ward,2000,Annu.Rev.Immunol.18：739-766；Ghetie and Ward,2002,Immunol.Res.25：97-113)。IgG-FcRn交互作用發生在pH 6.0(胞內囊泡之pH)但不發生於pH 7.4(血液之pH)；此交互作用使得IgG能被再循環回到循環中(Ghetie and Ward,2000,Ann.Rev.Immunol.18：739-766；Ghetie and Ward,2002,Immunol.Res.25：97-113)。人IgG1中與FcRn結合有關之區域已被定位(Shields et al.,2001,J.Biol.Chem.276：6591-604)。在人IgG1之位置Pro238、Thr256、Thr307、Gln311、Asp312、Glu380、Glu382或Asn434的丙胺酸取代增進FcRn之結合(Shields et al.,2001,J.Biol.Chem.276：6591-604)。發生這些取代之IgG1分子具有較長之血清半衰期。因此，這些經修飾之IgG1分子可能可以發揮彼等之效應功能，因而相較於未經修飾之IgG1能在較長之時間展現彼等之治療療效。其他用於增加與FcRn結合之示範性取代包括在位置250之Gln及/或在位置428之Leu。EU編號係用於恆定區之所有位置。

與該保守性Asn297共價連接之寡糖與IgG之 Fc區與FcγR結合之能力有關(Lund et al.,1996,J.Immunol.157：4963-69；Wright and Morrison,1997,Trends Biotechnol.15：26-31)。此糖化形式之IgG的工程化可顯著增進IgG媒介性ADCC。添加平分型N-乙醯葡萄糖胺修飾(Umana et al.,1999,Nat.Biotechnol.17：176-180；Davies et al.,2001,Biotech.Bioeng.74：288-94)至此糖化形式或自此糖化形式移除岩藻糖(Shields et al.,2002,J.Biol.Chem.277：26733-40；Shinkawa et al.,2003,J.Biol.Chem.278：6591-604；Niwa et al.,2004,Cancer Res.64：2127-33)係二種改善IgG Fc與FcγR之間的結合之IgG Fc工程化實例，藉此增進Ig媒介性ADCC活性。

系統性取代以溶劑暴露之人IgG1 Fc區之胺基酸產生具有經改變之FcγR結合親和性之IgG變異體(Shields et al.,2001,J.Biol.Chem.276：6591-604)。當與母體IgG1比較時，這些涉及在Thr256/Ser298、Ser298/Glu333、Ser298/Lys334或Ser298/Glu333/Lys334取代成Ala之變異體的亞群顯示對FcγR之結合親和性及ADCC活性增加(Shields et al.,2001,J.Biol.Chem.276：6591-604；Okazaki et al.,2004,J.Mol.Biol.336：1239-49)。

抗體之補體固定活性(C1q結合及CDC活性二者)可藉由Lys326及Glu333之取代而改善(Idusogie et al.,2001,J.Immunol.166：2571-2575)。在人IgG2主鏈上之相同取代可將與C1q結合不良且嚴重缺乏補體活化 活性之抗體同型轉換成可與C1q結合且能媒介CDC之抗體同型(Idusogie et al.,2001,J.Immunol.166：2571-75)。一些其他方法亦可被用於改善抗體之補體固定活性。舉例來說，將IgM之18個胺基酸羧基端尾片段植入IgG之羧基端大幅增強彼等之CDC活性。此甚至可在IgG4中觀察到，IgG4通常不具有可檢測之CDC活性(Smith et al.,1995,J.Immunol.154：2226-36)。同樣地，以Cys取代位於靠近IgG1重鏈之羧基端的Ser444誘發IgG1之尾對尾二聚化，其CDC活性比單體IgG1增加200倍(Shopes et al.,1992,J.Immunol.148：2918-22)。此外，對C1q具有特異性之雙特異性雙價抗體建構體亦授予CDC活性(Kontermann et al.,1997,Nat.Biotech.15：629-31)。

補體活性可藉由使重鏈之胺基酸殘基318、320及322中之至少一者突變成具有不同側鏈之殘基(諸如Ala)而被減少。以其他烷基取代之非離子性殘基(諸如Gly、Ile、Leu或Val)或芳香族非極性殘基(諸如Phe、Tyr、Trp及Pro)取代該三個殘基中之任一者亦減少或阻斷C1q結合。Ser、Thr、Cys及Met可被用於殘基320及322(但非318)以減少或阻斷C1q結合活性。以極性殘基取代該318(Glu)殘基可能調節但不會阻斷C1q結合活性。以Ala取代殘基297(Asn)導致去除溶解活性，但僅輕微減少(大約低三倍)對C1q之親和性。此改變破壞該糖基化位點及補體活化所需之碳水化合物之存 在。任何在此位點之其他取代亦破壞該糖基化位點。下列突變及彼等之任何組合亦減少C1q結合：D270A、K322A、P329A及P311S(見WO 06/036291)。

所謂的人恆定區包括具有任何天然同種異型或具有佔據天然同種異型之多形性位置的殘基之任何排列組合的恆定區。同樣地，最多1、2、5或10個突變可相對於天然人恆定區存在，諸如該些如上所述之可減少Fcγ受體結合或增加與FcRN結合者。

D. 重組抗體之表現

人化或嵌合抗體通常係由重組表現產製。重組多核苷酸建構體通常包括與抗體鏈之編碼序列可操作地連接之表現控制序列，包括天然連接或異源性啟動子區。較佳地，該表現控制序列係能轉形或轉染真核宿主細胞之載體中之真核啟動子系統。一旦該載體被納入適當宿主之後，該宿主被維持在適合高度表現該核苷酸序列之條件下，並收集及純化該交叉反應性抗體。

哺乳動物細胞係用於表現編碼免疫球蛋白或彼之片段之核苷酸區段的較佳宿主。見Winnacker,From Genes to Clones,(VCH Publishers,NY,1987)。一些可分泌完整異源性蛋白質之適當的宿主細胞系已在該領域中被發展，包括CHO細胞系(例如DG44)、各種COS細胞系、HeLa細胞、HEK293細胞、L細胞及非抗體產生性骨髓瘤(包括Sp2/0及NS0)。較佳地，該些細胞係非人 細胞。用於該等細胞之表現載體可包括表現控制序列，諸如複製起點、啟動子、增強子(Queen et al.,Immunol.Rev.89：49(1986))及必要處理資訊位點，諸如核糖體結合位點、RNA剪切位點、聚腺苷酸化位點及轉錄終止子序列。較佳之表現控制序列係源自內源性基因、巨細胞病毒、SV40、腺病毒、牛乳頭狀瘤病毒及該類似物之啟動子。見Co et al.,J.Immunol.148：1149(1992)。

抗CD33蛋白之人抗體可藉由下述之各種技術提供。用於產製人抗體之方法包括三源雜交瘤方法(Oestberg et al.,Hybridoma 2：361-367(1983)、Oestberg之美國專利第4,634,664號及Engleman等人之美國專利第4,634,666號)、使用基因轉殖小鼠包括人免疫球蛋白基因(見例如Lonberg et al.,WO93/12227(1993)；US 5,877,397,US 5,874,299,US 5,814,318,US 5,789,650,US 5,770,429,US 5,661,016,US 5,633,425,US 5,625,126,US 5,569,825,US 5,545,806,Nature 148,1547-1553(1994),Nature Biotechnology 14,826(1996),Kucherlapati,WO 91/10741(1991))及噬菌體展示方法(見例如Dower et al.,WO 91/17271及McCafferty et al.,WO 92/01047、US 5,877,218、US 5,871,907、US 5,858,657、US 5,837,242、US 5,733,743及US 5,565,332)。

在經表現後，抗體可根據該領域之標準程序 純化，包括HPLC純化、管柱層析、膠體電泳及該類似方法(一般見Scopes,Protein Purification(Springer-Verlag,NY,1982))。

IV. 核酸

本發明另提供編碼上述之人化重鏈及輕鏈之任一者之核酸。通常，該核酸亦編碼與該成熟重鏈及輕鏈融合之信號肽。核酸上之編碼序列可與調節序列可操作地連接以確保該編碼序列之表現，諸如啟動子、增強子、核糖體結合位點、轉錄終止信號及該類似序列。編碼重鏈及輕鏈之核酸可發生於經分離之形式或可被選殖至一或多個載體。該等核酸可藉由例如固相合成或重疊寡核苷酸之PCR加以合成。編碼重鏈及輕鏈之核酸可在例如表現載體內被接合成一個連續核酸，或可被各自分開選殖至自己的表現載體。

在一實施態樣中，本發明提供一種經分離之多核苷酸，其編碼包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列的抗體重鏈可變區。此經分離之多核苷酸可另編碼人IgG重鏈恆定區。IgG恆定區之同型為例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在一實施態樣中，該IgG恆定區之同型為IgG1。在另一實施態樣中，該經編碼之IgG1恆定區具有包含殘基239(根據卡巴編號系統)之取代即S239C之胺基酸序列。本發明亦提供一種包含該經分離之多核苷酸之表現載體，該經分離之多核苷酸編碼包含SEQ ID NO：18 之胺基酸序列的抗體重鏈可變區，還提供包含該表現載體之宿主細胞。在一些實施態樣中，該宿主細胞係哺乳動物宿主細胞例如CHO細胞。

在另一實施態樣中，本發明提供一種經分離之多核苷酸，其編碼包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的抗體輕鏈可變區。此經分離之多核苷酸可另編碼人IgG輕鏈恆定區。IgG輕鏈恆定區之同型為例如κ恆定區。本發明亦提供一種包含該經分離之多核苷酸之表現載體，該經分離之多核苷酸編碼包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的抗體輕鏈可變區，還提供包含該表現載體之宿主細胞。在一些實施態樣中，該宿主細胞係哺乳動物宿主細胞例如CHO細胞。

在另一實施態樣中，本發明提供經分離之一或多種多核苷酸，其編碼包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列之抗體重鏈可變區及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列之抗體輕鏈可變區，該重鏈可變結構域及該輕鏈可變結構域形成與人CD33特異性結合之抗體或抗原結合片段。本發明亦提供一種包含該經分離之一或多種多核苷酸之表現載體，該一或多種多核苷酸編碼包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列之抗體重鏈可變區及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列之抗體輕鏈可變區。本發明亦提供包含該一或多種表現載體之宿主細胞。該宿主細胞較佳為哺乳動物細胞，例如CHO細胞。

在另一實施態樣中，本發明提供第一及第二 載體，彼等包含編碼包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列之抗體重鏈可變區的多核苷酸，及編碼包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列之抗體輕鏈可變區的多核苷酸，該重鏈可變結構域及該輕鏈可變結構域形成與人CD33特異性結合之抗體或抗原結合片段。本發明提供包含該等載體之宿主細胞，較佳為哺乳動物宿主細胞，如CHO細胞。

V. 抗體藥物共軛物

抗CD33抗體可與細胞毒性基團共軛以形成抗體-藥物共軛物(ADC)。特別適合用於與抗體共軛之劑係細胞毒性劑(例如化學治療劑)、前藥轉換酶、放射性同位素、放射性化合物、或毒素(這些劑被統稱為治療劑或藥物)。舉例來說，抗CD33抗體可與細胞毒性劑諸如化學治療劑或毒素共軛(例如細胞靜止劑或殺細胞劑諸如相思豆毒素(abrin)、蓖麻毒蛋白(ricin)A、假單胞菌外毒素、或白喉毒素)。細胞毒性劑之可用類別實例包括例如DNA次要凹槽結合劑、DNA烷化劑及微管蛋白抑制劑。示範性細胞毒性劑包括例如耳抑素(auristatin)、喜樹鹼(camptothecin)、雙聯黴素(duocarmycin)、依扥泊苷(etoposide)、美坦素(maytansine)及類美坦素(maytansinoids)(如DM1及DM4)、紫杉烷(taxane)、苯二氮(如吡咯并[1,4]苯二氮(PBD)、吲哚啉苯二氮及噁唑啶苯二氮)及長春花生物鹼。用於共軛治療劑至蛋白質(特別是抗體)之技術係廣為周知。(見 例如Alley et al.,Current Opinion in Chemical Biology 2010 14：1-9；Senter,Cancer J.,2008,14(3)：154-169。)

治療劑(如細胞毒性劑)可以減少彼之活性之方式與抗體共軛，除非其自該抗體分離(例如藉由水解、抗體降解或切割劑)。該治療劑可經由連接子與該抗體附著。與連接子共軛之治療劑在此處亦稱為藥物連接子。該連接子之性質可具有廣泛差異。組成該連接子之成分係根據彼等之特性選擇，該等特性有部分可能由該共軛物將被遞送之位置的條件決定。

該治療劑可藉由可切割之連接子與該抗體連接，該可切割之連接子在該抗CD33表現性癌細胞之胞內環境中對切割具敏感性，但在胞外環境則基本上不敏感，因此該共軛物會在被抗CD33表現性癌細胞內化後(例如在核內體或例如藉由pH敏感性或蛋白酶敏感性在溶酶體環境或在微坑洞環境中)自該抗體被切割。該治療劑亦可經由非切割性連接子與該抗體附著。

如此處所示，該連接子可能包含可切割單位。在一些該等實施態樣中，可切割單位之結構及/或序列之選擇係根據其可被存在於該標靶位置(如標靶細胞)之酶作用切割。在其他實施態樣中，也可以使用可藉由pH改變(如不耐酸或鹼)、溫度改變或經放射(如不耐光)而被切割之可切割單位。

在一些實施態樣中，該可切割單位可能包含 一種胺基酸或胺基酸之連續序列。該胺基酸序列可能是酶之標靶受質。

在一些態樣中，該可切割單位係肽基單位且為至少二個胺基酸長。切割劑可包括組織蛋白酶B、組織蛋白酶D及纖維蛋白溶酶(見例如Dubowchik and Walker,1999,Pharm.Therapeutics 83：67-123)。最典型的是可藉由存在於抗CD33表現細胞中之酶切割的可切割單位，即酶可切割連接子。因此，該連接子可藉由胞內肽酶或蛋白酶切割，包括溶酶體或核內體蛋白酶。舉例來說，可被硫醇依賴性蛋白酶組織蛋白酶B(其高度表現於癌性組織中)切割之連接子可被使用(例如包含Phe-Leu或Val-Cit肽或Val-Ala肽之連接子)。

在一些實施態樣中，該連接子將包含可切割單位(如肽基單位)且該可切割單位將直接與該治療劑共軛。在其他實施態樣中，該可切割單位將經由其他功能單位(如自毀型間隔子單位或非自毀型間隔子單位)與治療劑共軛。非自毀型間隔子單位係指當可切割單位(例如胺基酸)自該抗體藥物共軛物切割之後，該間隔子單位之部分或全部仍與該藥物單位維持連接者。為了釋放該藥物，在標靶細胞內發生獨立之水解反應以自該藥物切割該間隔子。

以自毀型間隔子單位來說，該藥物不需額外之藥物水解步驟即可釋放。在一實施態樣中，該連接子包含可切割單位及自毀型基團，其中該可切割單位係藉由酶之作用切割，在該可切割單位切割之後，該自毀型基團釋放該治療 劑。在一些實施態樣中，該連接子之可切割單位之一端將與該治療劑直接或間接共軛，且另一端將與該抗體直接或間接共軛。在一些該等實施態樣中，該可切割單位之一端將與該治療劑直接或間接(例如經由自毀型或非自毀型間隔子單位)共軛且另一端將經由延伸單位與該抗體共軛。延伸單位連接抗體與其餘之藥物及/或藥物連接子。在一實施態樣中，該抗體與該其餘之藥物或藥物連接子之間的連接係經由順丁烯二醯亞胺基，例如經由順丁烯二醯亞胺基己醯基連接子。在一些實施態樣中，該抗體將經由二硫化物與該藥物連接，例如二硫化物連接之類美坦素共軛物SPDB-DM4及SPP-DM1。

抗體與連接子之間的連接可透過一些不同的途徑，例如經由硫醚鍵、經由二硫化物鍵、經由醯胺鍵或經由酯鍵。在一實施態樣中，抗CD33抗體與連接子之間的連接係於該抗體之半胱胺酸殘基的硫醇基與該連接子之順丁烯二醯亞胺基之間形成。在一些實施態樣中，該抗體之鏈間鍵在與該連接子之官能基反應之前被轉換成游離硫醇基。在一些實施態樣中，半胱胺酸殘基被導入抗體之重鏈或輕鏈並與連接子反應。在抗體重鏈或輕鏈中，藉由取代插入半胱胺酸之位置包括該些於美國申請案公開號2007-0092940及國際專利公開號WO2008070593，彼等各藉由參照方式整體納入此處以符合所有目的。

在一些實施態樣中，該抗體-藥物共軛物具有下式I： L-(LU-D)_p (I)

其中L係抗CD33抗體，LU係連接子單位且D為藥物單位(即治療劑)。下標p係1至20。該等共軛物包含與至少一藥物經由連接子共價連接之抗CD33抗體。該連接子單位之一端與抗體連接，另一端與藥物連接。

藥物裝載係由p表示，即每抗體連接之藥物分子數。藥物裝載可能為每抗體1至20個藥物單位(D)。技藝人士將了解在一些態樣中，該下標p將為1至20(即1至20之間的整數及非整數數值)。技藝人士將了解在一些態樣中，該下標p將為1至20之整數，且將代表在單一抗體上之藥物-連接子數目。在其他態樣中，p代表每抗體之藥物-連接子分子之平均數目，例如在一反應混合物或組成物(如醫藥組成物)中的每抗體藥物-連接子平均數目，且可為整數或非整數數值。因此，在一些態樣中，以組成物(如醫藥組成物)而言，p代表該組成物中抗體-藥物共軛物之平均藥物裝載，且p為1至20。

在一些實施態樣中，p為每抗體約1至約8個藥物。在一些實施態樣中，p係1。在一些實施態樣中，p係2。在一些實施態樣中，p為每抗體約2至約8個藥物。在一些實施態樣中，p為每抗體約2至約6、2至約5或2至約4個藥物。在一些實施態樣中，p係每抗體約2、約4、約6或約8個藥物。

由共軛反應得到之製劑中的每抗體單位之藥 物平均數目可由習用裝置諸如質譜儀、ELISA試驗、HIC及HPLC測定。該共軛物以p而言之定量分布亦可被測定。

示範性抗體-藥物共軛物包括以耳抑素(auristatin)為基底之抗體-藥物共軛物，即其中該藥物成分為耳抑素藥物之共軛物。耳抑素與微管蛋白結合，已經顯示可干擾微管動力學及核分裂和細胞分裂，且具有抗癌活性。通常該耳抑素基底之抗體-藥物共軛物包含在耳抑素藥物與抗CD33抗體之間的連接子。該耳抑素可於任何適合與連接子共軛之位置與該抗CD33抗體連接。該連接子可為例如可切割連接子(例如肽基連接子)或不可切割連接子(例如藉由降解該抗體所釋出之連接子)。該耳抑素可為耳抑素E或其衍生物。該耳抑素可為例如由耳抑素E和酮酸形成之酯。舉例來說，耳抑素E可分別與對乙醯基苯甲酸或苯甲醯基戊酸反應以產生AEB及AEVB。其他典型耳抑素包括MMAF(一甲基耳抑素F)及MMAE(一甲基耳抑素E)。示範性耳抑素之合成及結構係描述於美國專利公開號7,659,241、7,498,298、2009-0111756、2009-0018086及7,968,687號，各以參照方式整體納入此處以符合所有目的。

示範性以耳抑素為基底之抗體-藥物共軛物包括如下所示之vcMMAE、vcMMAF及mcMMAF抗體-藥物共軛物，其中Ab係此處所述之抗體，val-cit代表纈胺酸-瓜胺酸雙肽： 或彼等之醫藥上可接受之鹽。藥物裝載係由p表示，即每抗體之藥物-連接子分子數。根據上下文，p可代表每抗體之藥物-連接子分子之平均數，亦稱為平均藥物裝載。變數p係介於1至20，且較佳係1至8。在一些較佳之實施態樣中，當p代表平均藥物裝載時，p係介於約2至約5。在一些實施態樣中，p係約2、約3、約4、或約5。在一些態樣中，該抗體係經由半胱胺酸殘基之硫原子與該連接子共軛。在一些態樣中，該半胱胺酸殘基係經工程化至該抗體中之殘基。在其他態樣中，該半胱胺酸殘基係鏈間雙硫半胱胺酸殘基。

示範性抗體-藥物共軛物包括以PBD為基底之抗體-藥物共軛物，即其中該藥物成分為PBD藥物之抗體-藥物共軛物。

PBD具有下列一般結構：

它們在彼等之芳香族A環及吡咯并C環中之取代基的數量、種類及位置，及C環之飽和程度上有所不同。在B環中，位置N10至C11為亞胺(N=C)、甲醇胺(NH-CH(OH))或甲醇胺甲基醚(NH-CH(OMe))，其為負責烷化DNA之親電子中心。所有已知天然產物在手性C11a位置具有S構型，其提供自C環看向A環時呈向右旋轉。這給予它們適當之三維形狀，提供與B型態DNA之次要凹槽之等螺旋性，導致密切契合於結合位點。PBD在次要凹槽形成加成物之能力，讓它們得以干擾DNA處理，因此用來作為抗腫瘤劑。

藉由將二個PBD單位的的C8/C’-羥基官能基經由可彎折之伸烷基連接子連結在一起，可增強這些分子的生物活性。PBD二聚體被認為會形成諸如迴文式5’-Pu-GATC-Py-3’股間交聯之序列選擇性DNA病灶，其被認為是它們生物活性的主要原因。

在一些實施態樣中，以PBD為基底之抗體- 藥物共軛物包含與抗CD33抗體連接之PBD二聚體。形成該PBD二聚體之單體可相同或不同，即對稱或不對稱。該PBD二聚體可於任何適合與連接子共軛之位置與該抗CD33抗體連接。舉例來說，在一些實施態樣中，該PBD二聚體在C2位置將具有取代基，以提供用於連接該化合物至該抗CD33抗體之錨點。在可供選擇之實施態樣中，該PBD二聚體之N10位置將提供用於連接該化合物至該抗CD33抗體之錨點。

通常該PBD基底之抗體-藥物共軛物包含介於該PBD藥物與該抗CD33抗體之間的連接子。該連接子可能包含可切割單位(例如為酶之標靶受質的胺基酸或胺基酸之連續序列)或不可切割連接子(例如藉由降解該抗體釋出之連接子)。該連接子可進一步包含用於連接至該抗體之順丁烯二醯亞胺基，例如順丁烯二醯亞胺基己醯基。該連接子在一些實施態樣中，可能另外包含自毀型基團，例如對胺基苯甲醇(PAB)單位。

用來作為共軛物之示範性PBD係描述於國際申請案WO 2011/130613且如下所示，其中該波浪線表示連接至該連接子之位點： 或彼等之醫藥上可接受之鹽。示範性連接子如下所示，其中該波浪線表示連接至該藥物之位點且該抗體係經由順丁 烯二醯亞胺基連接。

示範性之以PBD為基底之抗體-藥物共軛物包括如下所示之抗體-藥物共軛物，其中Ab係此處所述之抗體： 或彼等之醫藥上可接受之鹽。藥物裝載係由p表示，即每抗體之藥物-連接子分子數。根據上下文，p可代表每抗體之藥物-連接子分子之平均數，亦稱為平均藥物裝載。變數p係介於1至20，且較佳係1至8。在一些較佳之實施態樣中，當p代表平均藥物裝載時，p係介於約2至約5。在一些實施態樣中，p係約2、約3、約4、或約5。在一些態樣中，該抗體係經由工程化至抗體中之半胱胺酸殘基的硫原子與該藥物連接子共軛。在一些態樣中，該半胱胺酸殘基被工程化至該抗體的位置239(IgG1)，該位置根據EU指數決定(Kabat,Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,MD,1987 and 1991)。

VI. 其他抗CD33抗體

除了上述人化形式之m2H12抗體之外，其他與CD33之胞外域結合之抗體可被用於本發明之一些方法，特別是癌之治療。這些抗體之嵌合或修飾形式可藉由下述之習用方法製備。

嵌合抗體係指其中非人抗體(例如小鼠)之輕鏈及重鏈的成熟可變區係與人輕鏈及重鏈恆定區組合之抗體。該等抗體實質上或完全保留該小鼠抗體之結合特異性，且具有大約三分之二的人序列。

經修飾之抗體係一種人化抗體之類型，其保留非人抗體之一些及通常所有的CDR及一些非人可變區架構殘基，但以來自人抗體序列之對應位置的殘基取代其他可能貢獻B-或T-細胞表位之可變區架構殘基，例如經暴露之殘基(Padlan,Mol.Immunol.28：489,1991)。結果係一種其中該CDR係完全或實質上源自非人抗體抗體且該非人抗體之可變區架構藉由取代以使其更加人樣。

任一抗體可藉由競爭性結合試驗(如實施例所述)或其他方式選擇，以具有和示範抗體(諸如m2H12)相同或重疊之表位特異性。較佳之抗體具有與該m2H12抗體相同之表位特異性。技藝人士能利用各種方法識別被抗體結合之表位。舉例來說，陣列式寡肽掃描或肽掃描分析利用來自標靶抗原之重疊及非重疊片段之寡肽序列庫，測試彼等與感興趣之抗體結合的能力。見例如Geysen et al.,PNAS 81：3998-4002(1984)。非線性表 位可利用例如CLIPS技術(陣列式寡肽技術之變型)識別。見例如Timmerman et al.,Open Vaccine J.2：56-67(2009)。抗原蛋白亦可經突變然後用於評估感興趣抗體之結合。可使用蛋白系統化定點突變形成，或製作突變庫以用於篩選抗體結合。突變庫可購自例如Integral Molecular。醯胺氫/氘交換質譜可被用於識別表位。受到關注之抗原被置於氘化水中並以氘標記。該蛋白接著以蛋白酶消化，所形成之肽片段經質譜分析處理。抗原亦可在抗體存在時檢測，肽片段之標示差異顯示抗體結合之區域。

VII. 治療性應用

源自鼠2H12抗體之抗體(例如嵌合性或人化抗體)，當單獨或作為彼之CD33抗體藥物共軛物時，可用於治療癌。一些該等癌顯示可檢測量之CD33，其係以蛋白質(例如藉由使用示範性抗體之一的免疫試驗)或mRNA之形式被測量。一些該等癌相較於該相同類型之非癌組織(較佳地源自該相同病患)顯示上升量之CD33。應受治療之癌細胞的示範性CD33之量係每細胞5000至150000 CD33分子，雖然更高或更低之量可被治療。可任意選擇地，癌之CD33之量係於實施治療前測量。

與CD33表現有關且應受治療之癌實例包括骨髓性疾病，諸如急性骨髓樣白血病(AML)、慢性骨髓樣白血病(CML)、其他骨髓增生性疾病(包括慢性骨髓單 球性白血病及慢性骨髓增生性疾病)、急性前骨髓細胞白血病(APL)、血小板性白血病、骨髓發育不良性症候群、前B細胞急性淋巴胚細胞白血病(preB-ALL)、前T細胞急性淋巴胚細胞白血病(preT-ALL)、多發性骨髓瘤(MM)、肥胖細胞疾病(包括肥胖細胞白血病及肥胖細胞肉瘤)、骨髓樣肉瘤、頑抗性貧血、白血病前期症候群、淋巴樣白血病或未分化性白血病。該治療亦可被應用至未接受過治療的病患、對習用治療(例如化學治療或MYLOTARG®(吉妥珠單抗奧唑米星))反應不佳之病患，或對該等治療有反應但又復發之病患。

源自鼠2H12抗體之CD33抗體(包括嵌合性抗體或人化抗體如h2H12抗體)可被用於治療表現CD33蛋白之癌。在一實施態樣中，源自鼠2H12抗體之人化抗體係用於治療罹患CD33陽性急性骨髓樣白血病(AML)之個體。在其他實施態樣中，該h2H12抗體係用於治療罹患CD33陽性AML之個體。在另一實施態樣中，源自鼠2H12抗體之人化抗體係用於治療罹患CD33陽性慢性骨髓樣白血病(CML)之個體。在其他實施態樣中，該h2H12抗體係用於治療罹患CD33陽性CML之個體。在另一實施態樣中，源自鼠2H12抗體之人化抗體係用於治療罹患CD33陽性慢性骨髓單球性白血病(CMML)之個體。在其他實施態樣中，該h2H12抗體係用於治療罹患CD33陽性慢性CMML之個體。在另一實施態樣中，源自鼠2H12抗體之人化抗體係用於治療罹患CD33陽性甲狀 腺白血病之個體。在其他實施態樣中，該h2H12抗體係用於治療罹患CD33陽性甲狀腺白血病之個體。在另一實施態樣中，源自鼠2H12抗體之人化抗體係用於治療罹患CD33陽性骨髓發育不良性症候群之個體。在其他實施態樣中，該h2H12抗體係用於治療罹患CD33陽性骨髓發育不良性症候群之個體。在另一實施態樣中，源自鼠2H12抗體之人化抗體係用於治療罹患CD33陽性骨髓增生性疾病之個體。在其他實施態樣中，該h2H12抗體係用於治療罹患CD33陽性骨髓增生性疾病之個體。在另一實施態樣中，源自鼠2H12抗體之人化抗體係用於治療罹患CD33陽性頑抗性貧血之個體。在其他實施態樣中，該h2H12抗體係用於治療罹患CD33陽性頑抗性貧血之個體。在另一實施態樣中，源自鼠2H12抗體之人化抗體係用於治療罹患CD33陽性白血病前期症候群之個體。在其他實施態樣中，該h2H12抗體係用於治療罹患CD33陽性白血病前期症候群之個體。在另一實施態樣中，源自鼠2H12抗體之人化抗體係用於治療罹患CD33陽性淋巴樣白血病之個體。在其他實施態樣中，該h2H12抗體係用於治療罹患CD33陽性淋巴樣白血病之個體。在另一實施態樣中，源自鼠2H12抗體之人化抗體係用於治療罹患CD33陽性未分化性白血病之個體。在其他實施態樣中，該h2H12抗體係用於治療罹患CD33陽性未分化性白血病之個體。在一實施態樣中，源自鼠2H12抗體之人化抗體係用於治療罹患CD33陽性前B細胞急性淋巴胚細胞白血病(pre B- ALL)之個體。在其他實施態樣中，該h2H12抗體係用於治療罹患CD33陽性pre B-ALL之個體。在一實施態樣中，源自鼠2H12抗體之人化抗體係用於治療罹患CD33陽性前T細胞急性淋巴胚細胞白血病(pre T-ALL)之個體。在其他實施態樣中，該h2H12抗體係用於治療罹患CD33陽性pre T-ALL之個體。在一實施態樣中，源自鼠2H12抗體之人化抗體係用於治療罹患CD33陽性多發性骨髓瘤(MM)之個體。在其他實施態樣中，該h2H12抗體係用於治療罹患CD33陽性MM之個體。在一實施態樣中，源自鼠2H12抗體之人化抗體係用於治療罹患CD33陽性肥胖細胞疾病包括肥胖細胞白血病及肥胖細胞肉瘤之個體。在其他實施態樣中，該h2H12抗體係用於治療罹患CD33陽性肥胖細胞疾病包括肥胖細胞白血病及肥胖細胞肉瘤之個體。

該CD33抗體可為例如未共軛或共軛抗體，例如CD33抗體藥物共軛物。在一些實施態樣中，該抗CD33抗體可為人化或嵌合性2H12抗體。在一些實施態樣中，該抗CD33抗體可為與鼠、人化或嵌合性2H12抗體競爭與CD33之特異性結合之抗體。

源自鼠2H12抗體之CD33抗體(包括嵌合性抗體或人化抗體如h2H12)可與治療劑共軛及用於治療罹患CD33陽性癌之個體。治療劑之實例於此處提供，包括活性治療劑(如耳抑素)及高度活性治療劑(如PBD)。與活性治療劑共軛之h2H12抗體，即h2H12抗體-藥物 共軛物(ADC)，可被用於治療罹患CD33陽性癌之個體。與耳抑素共軛之h2H12抗體可被用於治療罹患CD33陽性癌之個體。與高度活性治療劑共軛之h2H12抗體可被用於治療罹患CD33陽性癌之個體。與PBD共軛之h2H12抗體可被用於治療罹患CD33陽性癌之個體。

有些癌細胞在增加治療劑流出該癌細胞之蛋白的表現增加後，發展出對該治療劑的抗藥性。該等蛋白包括P-糖蛋白、多重藥物抗藥性相關性蛋白、肺抗藥性相關蛋白及乳癌抗藥性蛋白。檢測癌細胞對藥物之抗藥性可由該領域之技藝人士進行。檢測流出蛋白之抗體或試驗可購自例如Promega、Millipore、Abcam及Sigma-Aldrich。在一實施態樣中，源自鼠2H12抗體之抗體係用於治療罹患多重藥物抗藥性癌之個體，例如CD33陽性多重藥物抗藥性癌。在另一實施態樣中，源自鼠2H12抗體之人化抗體係用於治療罹患多重藥物抗藥性癌之個體，例如CD33陽性多重藥物抗藥性癌。在一實施態樣中，h2H12抗體係用於治療罹患多重藥物抗藥性癌之個體，例如CD33陽性多重藥物抗藥性癌。在其他實施態樣中，h2H12 ADC係用於治療罹患多重藥物抗藥性癌之個體，例如CD33陽性多重藥物抗藥性癌。在另一實施態樣中，與高度活性治療劑共軛之h2H12抗體係用於治療罹患多重藥物抗藥性癌之個體，例如CD33陽性多重藥物抗藥性癌。在另一實施態樣中，與PBD共軛之h2H12抗體係用於治療罹患多重藥物抗藥性癌之個體，例如CD33陽性多重藥物抗藥性癌。 在其他實施態樣中，與PBD共軛之h2H12抗體係用於治療罹患多重藥物抗藥性、CD33陽性急性骨髓樣白血病(AML)之個體。

源自鼠2H12抗體之人化或嵌合性抗體，當單獨或作為彼之藥物-共軛物時，係以有效配方投予，表示以延緩癌之發生、減少癌之嚴重性、抑制癌之進一步惡化及/或改善癌之至少一種徵候或症狀之劑量、投予途徑及投予頻率投予。若病患已經罹癌，該配方可指治療性有效配方。若該病患相較於一般大眾具有較高之罹癌風險但尚未出現症狀，則該配方可指預防性有效配方。在一些實例中，治療性或預防性療效可於個體病患中相對於歷史對照或相同病患之過去經驗比較觀察。在其他實例中，治療性或預防性療效可於治療病患族群相對於未經治療之對照病患族群的臨床前或臨床試驗中顯示。

單株抗體之示範性劑量係每公斤病患體重0.1mg至50mg、更典型為1mg/kg至30mg/kg、1mg/kg至20mg/kg、1mg/kg至15mg/kg、1mg/kg至12mg/kg、或1mg/kg至10mg/kg、或2mg/kg至30mg/kg、2mg/kg至20mg/kg、2mg/kg至15mg/kg、2mg/kg至12mg/kg、或2mg/kg至10mg/kg、或3mg/kg至30mg/kg、3mg/kg至20mg/kg、3mg/kg至15mg/kg、3mg/kg至12mg/kg、或3mg/kg至10mg/kg。彼等之活性單株抗體藥物共軛物(如耳抑素)之示範性劑量係每公斤個體體重1mg至7.5mg、或2mg至7.5mg、或3mg至 7.5mg，或每公斤體重0.1至20、或0.5至5mg(例如0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mg/kg)，或固定劑量10至1500或200至1500mg。彼等之高度活性單株抗體藥物共軛物(如PBD)之示範性劑量係每公斤個體體重1.0μg至1.0mg，或1.0μg至500.0μg。在一些方法中，病患係每二、三或四周投予該抗體或ADC。該劑量取決於投予頻率、病患狀態、對先前治療之反應(若有的話)、預防性或治療性之治療、或急性或慢性之疾病等其他因素。

投予可為非經腸、經靜脈、經口、皮下、動脈內、顱內、脊椎鞘內、腹膜內、局部、鼻內或肌肉內。投予亦可被直接集中至腫瘤內。藉由靜脈內或皮下投予至系統性循環內係為較佳。靜脈內投予可藉由例如在諸如30至90分鐘之期間輸注，或藉由單一推注注射。

投予頻率取決於抗體或抗體-藥物共軛物於循環中之半衰期、病患之狀況及投予途徑等其他因素。該頻率可為每天、每週、每月、每季或因應病患狀況之改變或該被治療之癌的進展而在不規則之間隔投予。示範性靜脈投予之頻率係在一連續治療療程中介於每週二次至每季一次，雖然更高或更低頻率之投藥亦為可能。其他示範性靜脈投予之頻率係在一連續治療療程中介於每週一次或每月一次，雖然更高或更低頻率之投藥亦為可能。以皮下投予而言，示範性投藥頻率係每天至每月一次，雖然更高或更低頻率之投藥亦為可能。

投予之劑量次數取決於該癌之特性(例如是否出現急性或慢性症狀)及疾病對治療之反應。以急性疾病或慢性疾病之急性惡化而言，投予1至10次通常足夠。有時單次推注劑量(可任意選擇地呈分開形式)即足以用於急性疾病或慢性疾病之急性惡化。治療可重複用於急性疾病或急性惡化之復發。以慢性疾病而言，抗體可於規律之間隔投予，例如每週、隔週、每月、每季、每六個月一次至少1、5或10年或病患終生。

用於非經腸投予之醫藥組成物係較佳地無菌、實質上等滲性且在GMP條件下製造。醫藥組成物可以單位劑量形式提供(即用於單次投予之劑量)。醫藥組成物可利用一或多種生理上可接受之載劑、稀釋劑、賦形劑或助劑調製。該調製劑取決於所選擇之投予途徑。以注射而言，抗體可被調製於水性溶液，較佳地生理上可相容之緩衝液，諸如漢氏(Hanks’s)溶液、林格氏(Ringer’s)液或生理鹽水或醋酸緩衝液(以減少注射部位之不適)。該溶液可包含調製劑諸如懸浮劑、穩定劑及/或分散劑。選擇性地，抗體可呈凍乾形式以供使用前與適當載具例如無致熱原之無菌水構成。抗體於液體調製劑中之濃度可為例如.01至10mg/ml，諸如1.0mg/ml。

本發明之抗體治療可與化學療法、放射線、幹細胞治療、手術及其他能有效對抗該被治療之疾病的治療組合。其他可與抗CD33之人化抗體一起投予之劑的有用類別，包括例如與癌性細胞上表現之其他受體結合之抗 體、抗微管蛋白劑(例如耳抑素)、DNA次要凹槽結合劑(如PBD)、DNA複製抑制劑、烷化劑(例如鉑複合物諸如順鉑(cisplatin)、單(鉑)、二(鉑)及三核鉑複合物及卡鉑(carboplatin))、蒽環類(anthracycline)、抗生素、抗葉酸劑、抗代謝物、化學療法致敏劑、雙聯黴素(duocarmycin)、依扥泊苷(etoposide)、氟化嘧啶、離子載體、萊克西托素(lexitropsin)、亞硝基尿素、普拉汀諾(platinol)、預先形成化合物、嘌呤抗代謝物、嘌呤黴素(puromycin)、放射線致敏劑、類固醇、紫杉烷、拓撲異構酶抑制劑、長春花生物鹼及該類似物。

源自鼠2H12抗體之抗體(例如嵌合抗體、人化抗體或h2H12抗體)之治療，可任意選擇地與上述其他劑或配方之任一者，以單獨或抗體藥物共軛物之形式組合，其相較於給予相同治療(例如化學治療)但不與單獨或抗體藥物共軛物形式之源自鼠2H12抗體之抗體組合時，可增加罹癌(例如ALL、CML、CMML)病患特別是復發或頑固性病患之無疾病進展中位存活期或整體存活期至少30%或40%，但較佳地50%、60%至70%或甚至100%或更久。此外或選擇性地，包括以單獨或作為抗體藥物共軛物形式之源自鼠2H12抗體之抗體的治療(例如標準化學治療)，相較於相同治療(例如化學治療)但不包括該源自鼠2H12抗體之抗體，可增加腫瘤病患至少30%或40%但較佳地50%、60%至70%或甚至100%之完全 反應率、部分反應率或客觀反應率(完全+部分)。

通常，在臨床試驗中(例如第二、二/三或三期試驗)，前述以標準治療加上源自鼠2H12抗體之抗體治療病患之無疾病進展中位存活期及/或反應率之增加，相較於單獨接受標準治療(或加上安慰劑)之對照組病患係具有統計顯著性，例如p=0.05或0.01或甚至0.001。完全及部分反應率係由經常用於癌之臨床試驗中的客觀標準決定，例如由美國國家癌症研究所及/或食品藥物管理局列示或接受之標準。

VIII. 其他應用

此處揭示之抗CD33抗體可在臨床診斷、臨床治療或研究中被用於檢測CD33。癌之CD33的表現提供該癌可由本發明之抗體治療之跡象。該等抗體亦可被販售作為實驗室研究之研究試劑，以檢測帶有CD33之細胞及彼等對各種刺激之反應。在該等用途中，單株抗體可以螢光分子、自旋標記分子、酶或放射性同位素標示，且可以含有實施CD33檢測所需之所有試劑的套組形式提供。此處所描述之抗體，m2h12及彼等之嵌合性或人化形式(例如h2H12)可被用於檢測CD33蛋白質表現及決定癌是否可利用CD33抗體藥物共軛物治療。舉例來說，鼠2H12及彼之嵌合性或人化版本例如h2H12可被用於檢測CD33在淋巴細胞、淋巴胚細胞、單核球、骨髓單核球或其他CD33表現細胞上之表現。該等抗體亦可被用於純化CD33 蛋白，例如在親和性層析中。

本發明之任何特徵、步驟、元件、實施態樣或態樣可與任何其他者組合使用除非特別說明不可如此。雖然本發明已由說明和示例之方式詳加描述以求清晰認識，但顯而易見的是某些改變及修飾可在該隨附之權利要求的範圍內實施。

實施例 I. 抗CD33抗體之產製 材料

在下列實施例中描述之細胞系係維持於培養狀態，根據美國菌種保存中心(American Type Culture Collection,ATCC)(Manassas,VA)或德國布朗斯威克德國微生物菌種保藏中心(DSMZ)(Braunschweig,Germany)所指明之條件。初代AML細胞被維持於含有20%經熱失活之FBS的Iscove’s改良Dulbecco’s培養基(IMDM)，添加各25ng/ml之顆粒球-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、顆粒球集落刺激因(G-CSF)、介白素-3(IL-3)及幹細胞因子(SCF)。細胞培養試劑得自Invitrogen Corp(Carlsbad,CA)，細胞介素係購自PeproTech(Rocky Hill,NJ)。

方法 飽和結合試驗

十萬個CD33陽性細胞(經轉染以表現人或長尾獼猴CD33之HL-60、HEL 92.1.7及HEK-293F細胞)被轉移至96孔盤。經AlexaFluor-647標示之CD33單株抗體以50nM至0.85pM之濃度添加，細胞於冰上培養30分鐘。藉由離心使細胞成團，以PBS+1% BSA溶液清洗3次後，重懸於125μL之PBS+1% BSA。以流式細胞儀分析螢光，利用飽和螢光信號之百分比測定結合百分比，接著計算表觀Kd。

競爭結合試驗

十萬個CD33陽性細胞被轉移至96孔盤，在冰上與1nM經AlexaFluor-647標示之m2H12以及濃度增加(0.03nM至600nM)之未經標示之雜合、人化或嵌合性2H12單株抗體培養1小時。細胞經離心、以PBS清洗3次，並重懸於125μL之PBS+1% BSA溶液。以流式細胞儀分析螢光，利用飽和螢光信號之百分比測定經標示之2H12單株抗體之結合百分比。將資料擬合至斜率不同之S形劑量反應曲線以外推EC50。

細胞毒性試驗

AML細胞系或初代AML細胞經CD33特異性mAb及抗體藥物共軛物(ADC)於37℃處理96小時。一些實驗包含非抗原結合性ADC作為陰性對照。細胞系之細胞存活性係根據廠商說明利用CelltiterGlo(Promega Corporation,Madison,WI)測量。使細胞與CelltiterGlo試劑在室溫下培養25分鐘，在Fusion HT螢光孔盤讀取儀(Perkin Elmer,Waltham,MA)上測量發光。以初代AML細胞而言，存活性係由流式細胞分析測量，使用Annexin V及碘化丙啶染色。結果以IC50報告，此為相較於經載具處理之細胞(對照=100%)要產生存活性減少50%所需之化合物的濃度。

抗體藥物共軛物之產製

CD33抗體之抗體藥物共軛物係如US20050238649及WO2011/130613所述製備，使用如此處所述之抗CD33抗體。藥物連接子SGD-1269(mcMMAF)係於US20050238649中描述，藥物連接子SGD-1910係於WO2011/130613中描述。IgG1 mAb之半胱胺酸突變物之製備係大致於US20100158909中描述。藥物連接子SGD-1269係與抗CD33抗體h2H12經由鏈間雙硫鍵之半胱胺酸殘基的硫醇基共軛，平均藥物負載係每抗體約4個藥物。藥物連接子SGD-1910與抗CD33抗體係經由被導入該抗體之IgG1鏈之位置239的半胱胺酸殘基之硫醇基共軛，平均藥物負載係每抗體約2個藥物。位置239為半胱胺酸之抗體帶有EC命名，例如h2H12EC或h00EC。

活體內活性試驗 散播型AML模型

CB-17/IcrHsd-PrkdcSCID(SCID)小鼠經尾靜脈接種5x10⁶ HL-60腫瘤細胞。在腫瘤接種後一天，小鼠(n=8/組)不予治療或每四天經腹腔內投予一次共二次的CD33 mAb及ADC或非結合性對照mAb及ADC。Mylotarg係每七天經腹腔內投予一次共二次，在此Mylotarg敏感性AML模型中作為陽性對照。當小鼠體重減輕20%，或出現散播性疾病之徵象如中樞神經系統症狀包括腦腫脹及/或後肢麻痺，或形成明顯散播型腫瘤團塊時，安樂死該小鼠。

皮下AML模型

SCID小鼠係經5x10⁶ HL-60或TF1-α AML腫瘤細胞皮下接種。腫瘤生長以卡尺測量監測，平均腫瘤體積利用公式(0.5×[長×寬²])計算。當平均腫瘤體積達到約100mm³時，小鼠(n=6-7/組)不予治療或以單一劑量之CD33 ADC或非結合性對照ADC經腹腔內投予。在HL-60模型中，小鼠在投予治療性抗體之前約四小時先經人IVIg治療(單次腹腔注射10mg/kg)，以減少測試ADC與AML細胞上之Fc受體之交互作用。腫瘤體積到達約1000mm³時安樂死小鼠。所有動物試驗係根據獲得實驗動物管理評鑑及認證協會認可之機構中的實驗動物照顧及使用委員會所核准之程序實施。

結果 1. 鼠CD33 mAb之產製

拮抗人CD33抗原之抗體係於Balb/c小鼠體內藉由以重組人CD33-Fc融合蛋白免疫產製。鼠mAb 2H12(m2H12)係根據對人CD33及長尾獼猴CD33之結合親和性選擇，以允許在非人靈長動物進行臨床前測試。

2. 設計及測試人化抗體

人化抗體係源自鼠2H12抗體。製作在不同位置納入回復突變之九條人化重鏈(HA至HI)及七條人化輕鏈(LA至LG)。見圖1A、B之序列排比及表1至4。

人化重鏈及輕鏈分別與嵌合性輕鏈及重鏈(由鼠可變區及人恆定區組成之嵌合鏈)配對。測試該CD33 mAb之人化/嵌合性雜合變異體與HEL 92.1.7 AML細胞表面表現之人CD33之結合(表5)。選擇重鏈HC 及HI用於後續試驗。表現代表人化重鏈HC及HI與人化輕鏈LA、LE及LG之排列組合的人化抗體，並測定彼等與表現人或長尾獼猴(cyno)CD33之細胞的結合(表6)。HILG抗體(2H12 HILG)被選為與鼠CD33 mAb m2H12之結合特性最相近的人化抗體。HILG抗體被稱為h2H12抗體(人2H12抗體)。測定m2H12、h2H12及IgG1重鏈中具有S239C突變(EU編號)之h2H12(稱為h2H12EC，代表工程化半胱胺酸)，對於在二個AML細胞系中表現為內源性蛋白，或在HEK293F細胞系中表現為重組蛋白之人CD33的K_D。也測定這些抗體對於在HEK293F細胞系中表現為重組蛋白之cyno CD33的K_D(表7)。

h2H12 ADC之活體外抗腫瘤活性

h2H12抗體-藥物共軛物之細胞毒性活性利用二種藥物連接子系統測試，SGD-1269(耳抑素藥物-連接子)及SGD-1910(吡咯并苯二氮二聚體藥物-連接子)。細胞毒性試驗在二種CD33陽性AML細胞系HL-60及HEL 92.1.7進行，使用非共軛抗體h2H12-ADC及不與CD33結合之對照ADC。如圖2所示，h2H12及h2H12EC(亦稱為h2H12d)非共軛抗體對兩種細胞系皆無毒性。同樣地，非結合性對照ADC(h00EC-SGD-1910及h00-SGD-1269)也不具細胞毒性。相反地，h2H12EC-SGD-1910對HL-60(IC50~1.6ng/mL)及HEL 92.1.7(IC50~12.9ng/mL)具細胞毒性。h2H12EC-SGD-1910對HL-60細胞的活性類似Mylotarg(其為一種廣泛描述之抗CD33抗體藥物共軛物)，對HEL 92.1.7(多重藥物抗 藥性(MDR)細胞系)的活性則高於無作用之Mylotarg。m2H12-SGD-1269及h2H12-SGD-1269對HL-60細胞有活性(IC50分別為1.3ng/mL及5.3ng/mL)，對HEL 92.1.7的活性較低(圖2)。在分開試驗中，另外測試h2H12-SGD-1269及h2H12EC-SGD-1910對其他CD33陽性AML細胞系之活性。如表8所示，h2H12-SGD-1269對7個AML細胞系中之4個有活性(對有反應細胞系之平均IC50為72.8mg/mL)，h2H12EC-SGD-1910對7個測試AML細胞系中之7個皆具有效活性(平均IC50為20.4ng/mL)。h2H12EC-SGD-1910比Mylotarg更有效，Mylotarg對8個CD33陽性AML細胞系中之3個有效。ADC對非AML來源且不表現CD33之三個細胞系不具活性(表8)。整體來說，這些資料顯示h2H12及h2H12EC抗體藥物共軛物選擇性地以CD33陽性細胞為標靶且展現對這些細胞的細胞毒性活性。

h2H12 ADC之活體內抗腫瘤活性

h2H12-SGD-1269之活性係於動物模型中測試，其中HL-60 AML細胞系被導入SCID小鼠以誘發散播型疾病。小鼠在隔天根據表9所述之劑量及計畫，接受下列處理：h2H12抗體、非特異性IVIg陰性對照抗體、h2H12-SGD-1269、非結合性對照ADC(hBU12-SGD-1269)或Mylotarg。經HL-60接種之小鼠的中位數存活期，自未處理或人IVIg處理組的22天，增加至接受h2H12(3mg/kg)的29天(p=0.007)，及分別接受1或3mg/kg h2H12-SGD-1269的41天(p=0.001)及52天(p<0.001)(表9)。h2H12EC-SGD-1269延長小鼠之存活至類似投予h2H12-SGD-1269之小鼠(中位數存活期分別為50及52天)。Mylotarg在此MDR陰性模型也具有 活性；超過50%之經Mylotarg處理之小鼠存活至試驗結束之第99天。經非共軛抗體h2H12或非結合性對照ADC(hBU12-SGD-1269)處理之小鼠的存活，相較於未處理之對照小鼠延長6至7天，但遠不及經CD33標靶性ADC處理之小鼠。

h2H12EC-SGD-1910的活性係於二個皮下AML異種移植模型HL-60及TF1-α中測試。對HL-60模型及TF1-α腫瘤模型之荷瘤(~100mm³)SCID小鼠分別投予如表10及表11所述之h2H12EC-SGD-1910或非結合性對照ADC(h00EC-SGD-1910)。h2H12EC-SGD-1910之治療相較於未處理及非結合性對照ADC處理小鼠顯著減少腫瘤生長，以腫瘤生長至四倍體積之中位數時間測量(表10及及11)。CD33標靶性ADC的抗腫瘤活性為劑量依賴性。以HL-60腫瘤而言，單一劑量之0.1mg/kg在6隻 處理小鼠中的6隻導致完全且持久之腫瘤緩解。較低劑量之0.03mg/kg在6隻處理小鼠中的1隻導致完全緩解，且相較於未處理小鼠及以非結合性對照ADC(h00d-SGD-1910)類似處理之小鼠，將腫瘤生長至四倍的時間自15天延長至20天。以MDR陽性TF1-α腫瘤模型(表11)而言，單一劑量之0.3mg/kg h2H12EC-SGC-1910在7隻處理小鼠中的5隻導致完全且持久之腫瘤緩解。在試驗結束的第117天尚未達到腫瘤生長至四倍的中位數天數。相反地，經非結合性對照ADC(h00EC-SGD-1910)類似處理的小鼠，其腫瘤體積在27天生長至四倍。類似地，投予0.1mg/kg或0.03mg/kg h2H12EC-SGD-1910的小鼠，相較於未處理或h00EC-SGD-1910處理小鼠，其腫瘤生長至四倍之中位數時間顯著較長(p=0.0001)。Mylotarg在TF1-α腫瘤模型並不具活性；經Mylotarg處理之小鼠的腫瘤生長與未處理小鼠並無不同。整體來說，這些資料顯示h2H12-ADC在AML異種移植模型中的抗腫瘤活性為劑量依賴性，且顯著高於非標靶性ADC。

SEQ ID NO：1，鼠2H12輕鏈

SEQ ID NO：2,2H12 LA

SEQ ID NO：3,2H12 LB

SEQ ID NO：4,2H12 LC

SEQ ID NO：5,2H12 LD

SEQ ID NO：6,2H12 LE

SEQ ID NO：7,2H12 LF

SEQ ID NO：8,2H12 LG

SEQ ID NO：9，鼠2H12重鏈

SEQ ID NO：10 2H12 HA

SEQ ID NO：11 2H12 HB

SEQ ID NO：12 2H12 HC

SEQ ID NO：13 2H12 HD

SEQ ID NO：14 2H12 HE

SEQ ID NO：15 2H12 HF

SEQ ID NO：16 2H12 HG

SEQ ID NO：17 2H12 HH

SEQ ID NO：18 2H12 HI

SEQ ID NO：19 2H12重鏈CDR1

SEQ ID NO：20 2H12重鏈CDR2

SEQ ID NO：21 2H12重鏈CDR3

SEQ ID NO：22 2H12輕鏈CDR1

SEQ ID NO：23 2H12輕鏈CDR2

SEQ ID NO：24 2H12輕鏈CDR3

SEQ ID NO：25<輕鏈恆定區；PRT/1；智人(homo sapiens)>

SEQ ID NO：26<CH1-CH3；PRT/1；智人(homo sapiens)>

SEQ ID NO：27<重鏈CH1-CH3(無c端K)；PRT/1；智人(homo sapiens)>

SEQ ID NO：28<S239C重鏈CH1-CH3；PRT/1；智人(homo sapiens)>

SEQ ID NO：29<S239C重鏈CH1-CH3(無c端K)；PRT/1；智人(homo sapiens)>

SEQ ID NO：30<h2H12 mAb輕鏈前導序列>

SEQ ID NO：31<h2H12 mAb重鏈前導序列>

SEQ ID NO：32>2H12 LA

SEQ ID NO：33>2H12 LB

SEQ ID NO：34>2H12 LC

SEQ ID NO：35>2H12 LD

SEQ ID NO：36>2H12 LE

SEQ ID NO：37>2H12 LF

SEQ ID NO：88>2H12 LG

SEQ ID NO：39>2H12 HA

SEQ ID NO：40>2H12 HB

SEQ ID NO：41>2H12 HC

SEQ ID NO：42>2H12 HD

SEQ ID NO：43>2H12 HE

SEQ ID NO：44>2H12 HF

SEQ ID NO：45>2H12 HG

SEQ ID NO：46>2H12 HH

SEQ ID NO：47>2H12 HI

SEQ ID NO：48<輕鏈恆定區；DNA；智人(homo sapiens)>

SEQ ID NO：49<CH1-CH3；DNA；智人(homo sapiens)>

SEQ ID NO：50<CH1-CH3(無c端K)；DNA；智人(homo sapiens)>

SEQ ID NO：51<S239C CH1-CH3；DNA；人工>

SEQ ID NO：52<S239C CH1-CH3(無c端K)；DNA；人工>

SEQ ID NO：53<h2H12 mAb輕鏈前導序列>

SEQ ID NO：54<h2H12 mAb重鏈前導序列>

SEQ ID NO：55 P20138 CD33蛋白；智人(homo sapiens)

SEQ ID NO：56 CD33蛋白，長尾獼猴(cynomolgus)

SEQ ID NO：57 CD33蛋白，長尾獼猴(cynomolgus)

序列表

<110> 西雅圖遺傳學股份有限公司(Seattle Genetics,Inc.)

<120> CD33抗體類及彼等於治療癌症之用途

<140> TW 102117539

<141> 2013-05-17

<150> US 61/649,110

<151> 2012-05-18

<160> 57

<170> FastSEQ Windows版本4.0

<210> 1

<211> 107

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 1

<210> 2

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成性

<400> 2

<210> 3

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成性

<400> 3

<210> 4

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成性

<400> 4

<210> 5

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成性

<400> 5

<210> 6

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<223> 合成性

<220>

<400> 6

<210> 7

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成性

<400> 7

<210> 8

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成性

<400> 8

<210> 9

<211> 117

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 9

<210> 10

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成性

<400> 10

<210> 11

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成性

<400> 11

<210> 12

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<223> 合成性

<220>

<400> 12

<210> 13

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成性

<400> 13

<210> 14

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成性

<400> 14

<210> 15

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成性

<400> 15

<210> 16

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成性

<400> 16

<210> 17

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成性

<400> 17

<210> 18

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成性

<400> 18

<210> 19

<211> 5

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 19

<210> 20

<211> 17

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 20

<210> 21

<211> 8

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 21

<210> 22

<211> 11

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 22

<210> 23

<211> 7

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 23

<210> 24

<211> 9

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 24

<210> 25

<211> 106

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 25

<210> 26

<211> 330

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 26

<210> 27

<211> 329

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 27

<210> 28

<211> 330

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成性

<400> 28

<210> 29

<211> 329

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成性

<400> 29

<210> 30

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成性

<400> 30

<210> 31

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成性

<400> 31

<210> 32

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成性

<400> 32

<210> 33

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成性

<400> 33

<210> 34

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成性

<400> 34

<210> 35

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成性

<400> 35

<210> 36

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成性

<400> 36

<210> 37

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成性

<400> 37

<210> 38

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成性

<400> 38

<210> 39

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成性

<400> 39

<210> 40

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成性

<400> 40

<210> 41

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成性

<400> 41

<210> 42

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成性

<400> 42

<210> 43

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成性

<400> 43

<210> 44

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成性

<400> 44

<210> 45

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成性

<400> 45

<210> 46

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成性

<400> 46

<210> 47

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成性

<400> 47

<210> 48

<211> 318

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 48

<210> 49

<211> 990

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 49

<210> 50

<211> 987

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 50

<210> 51

<211> 990

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成性

<400> 51

<210> 52

<211> 987

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成性

<400> 52

<210> 53

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成性

<400> 53

<210> 54

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成性

<400> 54

<210> 55

<211> 364

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 55

<210> 56

<211> 359

<212> PRT

<213> 長尾獼猴(Macaca fascicularis)

<400> 56

<210> 57

<211> 359

<212> PRT

<213> 長尾獼猴(Macaca fascicularis)

<400> 57

Claims (20)

1. 一種與人CD33蛋白特異性結合之經分離之抗體，其中該抗體包含三個重鏈互補決定區(CDR)及三個輕鏈CDR：由SEQ ID NO：19組成之重鏈CDR1、由SEQ ID NO：20組成之重鏈CDR2及由SEQ ID NO：21組成之重鏈CDR3；及由SEQ ID NO：22組成之輕鏈CDR1、由SEQ ID NO：23組成之輕鏈CDR2及由SEQ ID NO：24組成之輕鏈CDR3。
2. 如申請專利範圍第1項之抗體，其中該抗體係選自鼠抗體、嵌合性抗體及人化抗體。
3. 如申請專利範圍第2項之抗體，其中該抗體係人化抗體。
4. 如申請專利範圍第3項之抗體，其包含成熟重鏈可變區及成熟輕鏈可變區，其中該成熟重鏈可變區具有同SEQ ID NO：18之胺基酸序列且該成熟輕鏈可變區具有同SEQ ID NO：8之胺基酸序列。
5. 如申請專利範圍第4項之抗體，其中該成熟重鏈可變區係與重鏈恆定區融合且該成熟輕鏈可變區係與輕鏈恆定區融合。
6. 如申請專利範圍第5項之抗體，其中該重鏈恆定區係天然人恆定區之突變形式，該突變形式之天然人恆定區相較於該天然人恆定區具有減少之與Fcγ受體之結合。
7. 如申請專利範圍第6項之抗體，其中該重鏈恆定區係IgG1同型。
8. 如申請專利範圍第5項之抗體，其中該重鏈恆定區具有包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列且該輕鏈恆定區具有包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列。
9. 如申請專利範圍第5項之抗體，其中該重鏈恆定區具有包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列(S239C)且該輕鏈恆定區具有包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列。
10. 如申請專利範圍第1至9項中任一項之抗體，其中該抗體係與細胞毒性劑或細胞靜止劑共軛。
11. 如申請專利範圍第10項之抗體，其中該抗體係與細胞毒性劑共軛。
12. 如申請專利範圍第11項之抗體，其中該細胞毒性劑係經由酶可切割連接子與該抗體共軛。
13. 如申請專利範圍第11項之抗體，其中該細胞毒性劑係DNA次要凹槽結合劑。
14. 如申請專利範圍第11項之抗體，其中該細胞毒性劑具有下式
15. 如申請專利範圍第1項之抗體，其與人或長尾獼猴(cynomolgus monkey)之CD33的結合常數係0.5至2 x 10⁹M^-1。
16. 一種如申請專利範圍第1至15項中任一項之抗體於製備供治療罹癌或有罹癌風險之病患的藥物之用途， 該癌表現CD33。
17. 如申請專利範圍第16項之用途，其中該癌係急性骨髓樣白血病(AML)、骨髓發育不良性症候群(MDS)、急性前骨髓細胞白血病(APL)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性骨髓單球性白血病(CMML)、慢性骨髓增生性疾病、前B細胞急性淋巴胚細胞白血病(preB-ALL)、前T細胞急性淋巴胚細胞白血病(preT-ALL)、多發性骨髓瘤(MM)、肥胖細胞疾病或骨髓樣肉瘤。
18. 一種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第1至15項中任一項之抗體。
19. 如申請專利範圍第18項之醫藥組成物，其中該抗體包含成熟重鏈可變區及成熟輕鏈可變區，其中該成熟重鏈可變區具有同SEQ ID NO：18之胺基酸序列且該成熟輕鏈可變區具有同SEQ ID NO：8之胺基酸序列，其中該重鏈恆定區具有包含SEQ ID NO：27或29之胺基酸序列且該輕鏈恆定區具有包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列，且其中該抗體係與具有下式之細胞毒性劑共軛：
20. 一種核酸，其編碼如申請專利範圍第1至15項中任一項之抗體所定義之成熟重鏈可變區及/或成熟輕鏈可變區。