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CN104936617A - Cd33抗体及其在治疗癌症中的用途 - Google Patents

Cd33抗体及其在治疗癌症中的用途 Download PDF

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CN104936617A CN201380026079.9A CN201380026079A CN104936617A CN 104936617 A CN104936617 A CN 104936617A CN 201380026079 A CN201380026079 A CN 201380026079A CN 104936617 A CN104936617 A CN 104936617A
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Abstract

本发明提供了与CD33特异性结合的鼠科动物抗体、嵌合抗体和人源化抗体。所述抗体用于治疗和诊断各种癌症，也用于检测CD33。所述单克隆抗体包括在重链可变区中的SEQ NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21的互补性决定区(CDRs)以及在轻链可变区中的SEQ NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24的CDRs。

Description

CD33抗体及其在治疗癌症中的用途
交叉申请案的交互参照
本申请是US13/804,227(2013年3月14日提出申请)的延续申请，并且主张美国临时申请号为61/649,110(2012年5月18日提出申请)的优先权。
背景技术
CD33是67kDa的质膜蛋白，其与唾液酸结合并且是唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素蛋白(sialic acid-binding Ig-related lectin，SIGLEC)家族中的一员。CD33已知在骨髓细胞中表达。CD33在大量的恶性细胞中的表达也已有报道。虽然CD33已被定位用于癌症(如急性髓性白血病)的治疗，但目前市场上没有有效的CD33靶向治疗方法。本发明解决这些和其他问题。
发明内容
此处提供了与人类CD33蛋白特异性结合的单克隆抗体及使用单克隆抗体治疗癌症(表达CD33蛋白)的方法。单克隆抗体包含SEQ ID NOs:19,20和21在重链可变区的互补性决定区(CDRs)和SEQ ID NOs:22,23和24在轻链可变区的CDRs。在一些实施例中，至少一个CDR具有一个保守的氨基酸取代(conserved amino acid substitution)。在一些实施例中，分别源自SEQ ID NOS:18和SEQ ID NOS:8的成熟重链可变区的CDRs和成熟轻链可变区的CDRs的任何差异位于位点H60-H65。单克隆抗体可以是鼠科动物抗体、嵌合抗体或人源化抗体。优选的人源化抗体是h2H12抗体，如此处所公开。一方面，本发明是人源化抗体，其包括在重链可变区的SEQ ID NOs:19,20和21的CDRs以及在轻链可变区的SEQ ID NOs:22,23和24的CDRs并且另外具有一个成熟重链可变区和一个成熟轻链可变区，其中所述成熟重链可变区与SEQ ID NO:18具有至少90％的一致性，所述成熟轻链可变区与SEQ ID NO:8具有至少90％的一致性。此外，所述重链的以下氨基酸残基被保持：位点H48被I取代，位点H66被K取代，位点H67被A取代，位点H69被L取代，位点H71被A取代，H94被S取代；并且所述轻链的以下氨基酸残基被保持：L22被N取代，L46被T取代，L69被Q取代，L71被Y取代。在进一步的实施例中，所述人源化抗体包括在重链可变区的SEQ ID NOs:19,20和21的CDRs以及在轻链可变区的SEQ IDNOs:22,23和24的CDRs并且另外具有一个成熟重链可变区和一个成熟轻链可变区，其中所述成熟重链可变区与SEQ ID NO:18具有至少95％的一致性，所述成熟轻链可变区与SEQ ID NO:8具有至少95％的一致性。
在另一个实施例中，所述人源化2H12抗体具有成熟重链和成熟轻链，所述成熟重链与重链恒定区融合，且所述成熟轻链与轻链恒定区融合。在进一步的实施例中，所述重链恒定区是天然人恒定区的突变形式，且相比于所述天然人恒定区，所述天然人恒定区的突变形式与Fcγ受体的结合减少。在另一个实施例中，所述重链恒定区是IgG1同种型。示例性的重链恒定区氨基酸序列包括SEQID NO:27和SEQ ID NO:29，其为位点239的半胱氨酸被丝氨酸取代(S239C)的重链恒定区。示例性的轻链恒定区氨基酸序列包括SEQ ID NO:25。
在一个实施例中，所述人源化抗体包括成熟重链可变区和成熟轻链可变区，所述成熟重链可变区具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列，且所述成熟轻链可变区具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
在一个实施例中，所述人源化抗体与细胞毒性剂(cytotoxic agent)或细胞抑制剂(cytostatic agent，也称细胞静止素)共轭。在更进一步的实施例中，所述人源化抗体与细胞毒性剂共轭。细胞毒性剂可以是，如DNA小沟结合剂。吡咯[1,4]苯二氮(PBD)是细胞毒性剂的一个例子，它是与此处公开的所述人源化CD33抗体共轭的DNA小沟结合剂。在一个实施例中，PBD与CD33抗体通过可酶切连接子共轭。在另一个实施例中，细胞毒性剂具有分子式：
其中波浪线显示了连接子的连接位点。
在一个实施例中，所述人源化抗体与人或食蟹猴的CD33的结合常数为0.5x109M-1至2x 109M-1。
一方面，本发明提供了治疗患有癌症(表达CD33)或有患癌风险的病患的方法，即通过向患者施用此处公开的人源化抗体CD33的有效给药方案。CD33表达癌症(CD33-expressing cancers)包括急性髓性白血病(AML)，骨髓增生异常综合征(MDS)，急性早幼粒细胞白血病(APL)，慢性髓细胞性白血病(CML)，慢性粒单核细胞白血病(CMML)，慢性骨髓增生性疾病，前体B细胞急性淋巴细胞白血病(preB-ALL)，前体T细胞急性淋巴细胞白血病(preT-ALL)，多发性骨髓瘤(MM)，肥大细胞病和骨髓肉瘤。一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含人源化或嵌合抗体，该人源化或嵌合抗体包含在重链可变区的SEQ IDNOs:19,20和21的互补性决定区(CDRs)和在轻链可变区的NOs:22,23和24的CDRs。
一方面，本发明提供了一种人源化抗体，其具有成熟重链可变区和成熟轻链可变区，所述成熟重链可变区与HI(具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列)具有至少90％的一致性，所述成熟轻链可变区与LG(SEQ ID NO:8的氨基酸序列)具有至少90％的一致性。在另一个实施例中，所述人源化抗体具有成熟重链可变区和成熟轻链可变区，所述成熟重链可变区与SEQ ID NO:18具有至少95％的一致性，所述成熟轻链可变区与SEQ ID NO:8具有至少95％的一致性。在另一个实施例中，所述重链可变区的位点H48,H66,H67,H69,H71和H94由I,K,A,L,A和S占据，且所述成熟轻链可变区的位点L22,L46,L69和L71由N,T,Q和Y占据。在一些实施例中，分别源自SEQ ID NOS:18和SEQ ID NOS:8的成熟重链可变区的CDRs和成熟轻链可变区的CDRs的任意区别位于位点H60-H65。
在另一个实施例中，所述人源化抗体具有所述成熟重链可变区的CDRs和所述成熟轻链可变区的CDRs，所述成熟重链可变区的CDRs与SEQ ID NO:18的CDRs一致，所述成熟轻链可变区的CDRs与SEQ ID NO:8的CDRs一致。在一个实施例中，所述人源化抗体包括具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的成熟重链可变区和具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的成熟轻链可变区。
在一个实施例中，人源化抗体与细胞毒性剂或细胞抑制剂共轭。在一个实施例中，人源化抗体与细胞毒性剂或细胞抑制剂共轭。在更进一步的实施例中，所述人源化抗体与细胞毒性剂共轭。细胞毒性剂可以是，如DNA小沟结合剂。吡咯[1,4]苯二氮(PBD)是细胞毒性剂的一个例子，它是与此处公开的所述人源化CD33抗体共轭的DNA小沟结合剂。在一个实施例中，PBD与所述CD33抗体通过可酶切连接子共轭。在另一个实施例中，细胞毒性剂具有分子式：
其中波浪线显示了连接子的连接位点。
在另一个实施例中，所述人源化抗体与人或食蟹猴的CD33的结合常数为0.5x 109M-1至2x 109M-1。
在另一个实施例中，所述人源化抗体具有成熟重链和成熟轻链，所述成熟重链与重链恒定区融合，且所述成熟轻链与轻链恒定区融合。在进一步的实施例中，所述重链恒定区是天然人恒定区的突变形式，且相比于所述天然人恒定区，所述天然人恒定区的突变形式与Fcγ受体的结合减少。在另一个实施例中，所述重链恒定区是IgG1同种型。示例性的重链恒定区氨基酸序列包括SEQ IDNO:27和SEQ ID NO:29(S239C)。示例性的轻链恒定区氨基酸序列包括SEQ IDNO:25。
另一方面，本发明提供了编码此处描述的任意成熟重链可变区或轻链可变区的核酸。编码重链可变区的示例性的核酸包括SEQ ID NOs:39-47；编码轻链可变区的示例性的核酸包括SEQ ID NOs:32-38。
一方面，本发明提供了治疗患有癌症(表达CD33)或有患癌风险的病患的方法，即通过向患者施用此处公开的人源化抗体CD33的有效给药方案。CD33表达癌症(CD33-expressing cancers)包括急性髓性白血病(AML)，骨髓增生异常综合征(MDS)，急性早幼粒细胞白血病(APL)，慢性髓细胞性白血病(CML)，慢性粒单核细胞白血病(CMML)，慢性骨髓增生性疾病，前体B细胞急性淋巴细胞白血病(preB-ALL)，前体T细胞急性淋巴细胞白血病(preT-ALL)，多发性骨髓瘤(MM)，肥大细胞病和骨髓肉瘤。所述人源化抗体优选地以药学上合适的组合物被施用。在一些实施例中，所述施用的人源化抗体与细胞毒性剂或细胞抑制剂共轭。在一个实施例中，施用的人源化抗体与细胞毒性剂或细胞抑制剂共轭。在更进一步的实施例中，所述施用的人源化抗体与细胞毒性剂共轭。细胞毒性剂可以是，如DNA小沟结合剂。吡咯[1,4]苯二氮(PBD)是细胞毒性剂的一个例子，它是与此处公开的人源化CD33抗体共轭的DNA小沟结合剂。在一个实施例中，PBD与施用的CD33抗体通过可酶切连接子共轭。在另一个实施例中，细胞毒性剂具有分子式：
其中波浪线显示了连接子的连接位点。
附图说明
图1A和1B显示了母体鼠科动物单克隆抗体(指m2H12)与人源化2H12重链可变区(图1A)和轻链可变区(图1B)的氨基酸序列的对比。
图2显示了测试2H12源抗体-药物共轭物(ADC)对抗CD33阳性AML细胞系HL-60和HEL 92.1.7的活性的活体外(in vitro)细胞毒性试验的结果。h2H12d与SGD-1910共轭；m2H12和h2H12与SGD-1269共轭。测试非结合对照ADC(h00d-SGD-1910和h00-SGD-1269)作为抗原特异性的对照。MYLOTARG(吉妥珠单抗奥唑米星(gemtuzumab ozogamicn))是一个被很好地描述了的CD33定向(CD33-directed)抗体药物共轭物并进行了测试，其包含抗-CD33抗体hP67.6，hP67.6连接在细胞毒性药物卡奇霉素上。
定义
本发明提供了，特别是特异性地结合于人CD33蛋白及其共轭物上的单克隆抗体。所述抗体可用于治疗和诊断表达CD33的癌症，也用于检测CD33蛋白。
“分离”的抗体是指已被识别并且从其天然环境的组分中分离和/或回收的抗体，和/或重组产生的抗体。“纯化的抗体”通常具有至少50％w/w的纯度，其不含源自其制备或纯化过程中的干扰蛋白质及其它污染物，但不排除该单克隆抗体与额外的制药上可接受的载体(carrier)或其他媒介(vehicle)组合以利于其使用的可能性。干扰蛋白质及其它污染物可以包括，例如，细胞(抗体从其中分离或重组生产)的细胞成分。有时单克隆抗体具有至少60％,70％,80％,90％,95或99％w/w不含源自其制备或纯化过程中的干扰蛋白质及其它污染物的纯度。此处描述的抗体，包括以分离/或纯化形式提供的鼠科动物抗体、嵌合抗体和人源化抗体。
此处使用的术语“单克隆抗体”是指从实质上同种的抗体群中得到的抗体，即包含所述抗体群的独立抗体(individual antibodies)是一致的，除了可能天然发生的突变(可少量的存在)。修饰词“单克隆”表明了抗体是从实质上同种的抗体群得到的抗体的特征，并且不应被解释为需要通过任何特殊方法生产抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过杂交瘤细胞方法(首次被Kohler et al.(1975)Nature 256:495描述)制备，或通过重组DNA方法制备(参见，例如，专利号为4816567的美国专利)。例如，“单克隆抗体”也可使用在Clackson et al.(1991)Nature,352:624-628和Marks et al.(1991)J.Mol.Biol.,222:581-597中描述的技术从噬菌体抗体库中分离或可通过其他方法制备。此处描述的抗体是单克隆抗体。
单克隆抗体与其靶标抗原的特异性结合是指至少106,107,108,109或1010M-1的亲和性。相比于与至少一种不相关靶标的非特异性结合，特异性结合可在一个更高的数量级上被检测出，并且可与所述的非特异性结合区分。特异性结合可以是特定官能团之间形成键或特定空间契合(例如锁和钥匙类型)的结果，然而非特异性结合是范德华力(van der Waals forces)的结果。
基本的抗体单位是亚基的四聚体。每个四聚体包括两对相同的多肽链，每一对多肽链具有一条“轻链”(约25千道尔顿)及一条“重链”(约50至70千道尔顿)。每条链的末端包括约100-110个或更多氨基酸的可变区，该可变区主要负责识别抗原。此可变区在刚被表达时与一个可切割的信号肽(cleavable signalpeptide)连接。不具有该信号肽的可变区有时被称为成熟可变区。因此，举例来说，轻链成熟可变区是指不具有轻链信号肽的轻链可变区。每一个条链的羧基末端部分定义了主要负责效应功能的恒定区。
轻链被分类为κ或λ。重链被分类为γ、μ、α、δ、ε，并定义对应抗体的同种型(isotype)分别为IgG,IgM,IgA,IgD和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过一个约12或12个以上的氨基酸的“J”区连接，同时重链也包括一个约10个或更多个氨基酸“D”区(一般见Fundamental Immunology(Paul,W.,ed.,2nd ed.Raven Press,N.Y.,1989,Ch.7，以参考方式整体纳入以符合所有目的)。
每个轻/重链对的成熟可变区可形成抗体的结合位点。因此，一个完整的抗体具有2个结合位点。除双功能抗体或双特异性抗体外，所述两个结合位点是相同的。所述的链都表现出相同的通用结构或相对保守的骨架区(FR)，其通过3个高变区连接，所述的高变区也叫互补决定区或CDRs。源自每个轻/重链对的两条链的CDRs是由框架区对准，以结合到特定的抗原表位。从N-末端至C-末端，轻链和重链均包括结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。每个结构域的氨基酸分配与Kabat《免疫学重要的蛋白质的序列》(Sequences of Proteins of Immunological Interest)(国立卫生研究院,Bethesda,MD,1987和1991)中的定义或Chothia&Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)；Chothia等,Nature 342:878-883(1989)的定义是一致的。Kabat还提供了一种广泛使用的编号惯例(Kabat编号)，其中，不同重链之间或不同轻链之间的相应残基被分配了相同的编号。
术语“抗体”包括完整的抗体和其所结合的片段。通常情况下，片段与产生它们的完整的抗体竞争结合特定的靶标，包括单独的重链和轻链Fab、Fab'、F(ab')2、F(ab)c、Dabs、纳米体和Fv。片段可以产生自重组DNA技术，或完整的免疫球蛋白的酶分离或化学分离。术语“抗体”还包括双特异性抗体(同型二聚体Fv片段)或迷你抗体(minibody)(VL-VH-CH3)、双特异性抗体或类似物。双特异性抗体或双功能抗体是具有两个不同的重/轻链对和两个不同结合位点的人工杂交抗体。(参见，例如,Songsivilai and Lachmann,Clin.Exp.Immunol.,79:315-321(1990)；Kostelny et al.,J.Immunol.,148:1547-53(1992))。
术语“抗体”包括抗体本身(裸抗体)或与细胞毒性药物或细胞抑制性药物共轭的(conjugated)抗体。
术语“抗原表位”是指位于抗原上的能与抗体结合的位点。抗原表位可由一个或多个蛋白三级折叠的并列的连续的氨基酸或不连续的氨基酸形成。由连续氨基酸形成的抗原表位通常暴露于变性剂后不受影响，而由三级折叠形成的抗原表位通常经变性剂处理后消失。抗原表位的独特空间构象中通常包括至少为3个，更通常为5个或8-10个氨基酸。抗原表位的空间构象的测定方法包括，例如，x-射线结晶学和二维核磁共振，参见，例如Epitope Mapping Protocols,inMethods in Molecular Biology,Vol.66,Glenn E.Morris,Ed.(1996)。
识别相同或重叠抗原表位的抗体可被简单的免疫分析法鉴定，该免疫分析法显示一个抗体相对于另一个抗体竞争结合靶抗原的能力。抗体的对应抗原表位也可以是确定的结合于抗原的抗体的X-射线晶体学(以鉴定接触残基)。或者，如果可减少或消除一种抗体结合的抗原所有氨基酸突变类型也可减少或消除另一种抗体的结合，则这两种抗体具有相同的抗原表位。如果可减少或消除一种抗体结合的抗原某些氨基酸突变类型也可减少或消除另一种抗体的结合，则这两种抗体具有重叠的抗原表位。抗体间的竞争由试验分析来确定，其中被测的抗体抑制参照抗体与共有抗原的特异结合(见，如Junghans等,Cancer Res.50:1495,1990)。在竞争性结合试验分析中，若过量的被测试抗体(例如，至少2x、5x、10x、20x或100x)抑制至少50％，但优选为75％、90％或99％参照抗体的结合，则被测试抗体与参照抗体竞争。由竞争法确定的抗体(竞争性抗体)包括与参照抗体具有相同结合抗原表位的抗体，及与毗邻抗原表位(由于空间位阻发生，该毗邻抗原表位充分接近与参照抗体结合的抗原表位)结合的抗体。与h2H12竞争以结合人CD33蛋白的抗体包括在本公开中。
A2H12抗体是一种与人CD33蛋白特异性结合的抗体，并且包括三个重链互补性决定区(hCDRs):重链CDR1，例如SEQ ID NO:19或实质上与SEQ IDNO:19一致的序列；重链CDR2，例如SEQ ID NO:20或实质上与SEQ ID NO:20一致的序列，和重链CDR3，例如SEQ ID NO:21或实质上与SEQ ID NO:21一致的序列；所述抗体还包括三个轻链CDRs:轻链CDR1，例如SEQ ID NO:22或实质上与SEQ ID NO:22一致的序列；轻链CDR2，例如SEQ ID NO:23或实质上与SEQ ID NO:23一致的序列；和轻链CDR3，例如SEQ ID NO:24或实质上与SEQ ID NO:24一致的序列。2H12抗体包括鼠科动物2H12(m2H12)抗体和衍生自鼠科2H12抗体的嵌合或人源化抗体。
术语“患者”包括接受预防或治疗处理的人类和其他哺乳动物测试体。
为了对氨基酸替换的保守性和非保守性进行分类，氨基酸分组如下：组I(疏水性侧链)：甲硫氨酸、丙氨酸、缬氨酸亮，氨酸、异亮氨酸；组II(中性亲水性侧链)：半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸；组III(酸性侧链)：天冬氨酸、谷氨酸；组IV(基本侧链)：天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、赖氨酸、精氨酸；组V(影响链定位的残基)：甘氨酸、脯氨酸；组VI(芳香侧链)：色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸。保守的替换涉及同一类氨基酸之间的替换，非保守替换由以下情况构成，即一类氨基酸的成员被另一类氨基酸的成员替换。
序列一致性百分率根据Kabat编号法则对抗体序列进行最大比对。如果受试抗体区域(如一条轻链或一条重链的完整的成熟可变区)与一个参照抗体的相同序列比对，比对后，受试抗体与参照抗体相同序列百分率为受试抗体与参照抗体中占据相同位置的氨基酸数量除以两个区域的比对位置的总数，缺口不算在内，乘以100以转换成百分率。
“包括”一个或多个例举元素的组合物或方法还囊括其它没有特别例举的元素。例如，一个包括抗体的组合物，该组合物可以仅含有该抗体，也可与其它成分相结合。
一个范围的数值的指定包括在该范围内的所有整数或定义该范围的所有整数。
抗体效应功能(antibody effector function)是指由免疫球蛋白(Ig)的Fc结构域所贡献的功能。这样的功能可为例如抗体依赖性细胞性细胞毒性、抗体依赖性细胞吞噬作用或补体依赖性细胞毒性。所述功能可由例如Fc效应器结构域与Fc受体结合而引起(所述Fc受体位于具有吞噬细胞活性或细胞溶解活性的免疫细胞上)，或由Fc效应器结构域与补体系统的成分结合引起。通常，由该Fc结合的细胞或补体成分所介导的效应导致该LIV-1标靶的细胞的抑制和/或消除。抗体的Fc区可吸引(recruit)表达Fc受体(FcR)的细胞，使这些细胞与被抗体包覆之标靶细胞并置(juxtapose)。表达IgG的表面FcR(包括FcγRIII(CD16)、FcγRII(CD32)及FcγRIII(CD64))的细胞可作为效应细胞以摧毁被IgG包覆的细胞。所述的效应细胞包括单核细胞、巨噬细胞、自然杀手(NK)细胞、中性粒细胞及嗜酸性粒细胞。IgG与FcγR的结合活化了抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)或抗体依赖性细胞性吞噬作用(ADCP)。ADCC是由CD16+效应细胞经由分泌膜孔形成蛋白及蛋白酶所介导，然而吞噬作用是由CD32+及CD64+效应细胞所介导(见Fundamental Immunology,4th ed.,Paul ed.,Lippincott-Raven,N.Y.,1997,Chapters 3,17and 30；Uchida et al.,2004,J.Exp.Med.199:1659-69；Akewanlop et al.,2001,Cancer Res.61:4061-65；Watanabe et al.,1999,BreastCancer Res.Treat.53:199-207)。除了ADCC及ADCP之外，与细胞结合的抗体的Fc区亦可活化补体经典途径以诱发补体依赖性细胞毒性(CDC)。当抗体与抗原结合时，补体系统的C1q与所述抗体的Fc区结合。C1q与和细胞结合的抗体的结合可诱发级联事件，该事件涉及C4和C2的蛋白水解活化作用以产生C3转化酶。由C3转化酶将C3裂解(cleavage)成C3b使得包括C5b、C6、C7、C8和C9的终末补体成份被活化。这些蛋白质一起在所述被抗体包覆的细胞上形成膜攻击复合体孔。这些孔扰乱了细胞膜的完整性并杀死该靶细胞(见Immunobiology,6th ed.,Janeway et al.,Garland Science,N.Y.,2005,Chapter 2)。
术语“抗体依赖性细胞性细胞毒性”(antibody-dependent cellularcytotoxicity)，或ADCC，是一种用于诱导细胞死亡的机制，该机制取决于被抗体包覆的靶细胞与具有促细胞溶解活性的(lytic activity)免疫细胞(亦称为效应细胞)的交互作用。该等效应细胞包括自然杀手细胞、单核细胞/巨噬细胞及中性粒球。所述效应细胞与和Ig的Fc效应器结构域(Ig与靶细胞结合)的依附是通过它们的抗原结合部位(antigen-combining sites)。被抗体包覆的靶细胞因为效应细胞的活性而死亡。
术语“抗体依赖性细胞性吞噬作用”或ADCP，是指：通过与Ig的Fc效应器结构域结合的吞噬细胞性免疫细胞(例如巨噬細胞、中性粒细胞和树突細胞)，被抗体包覆的细胞被内在化(不论整体或部分)的过程。
术语“补体依赖性细胞毒性”或CDC是指一种诱导细胞死亡的机制，其中与标靶结合的抗体的Fc效应结构域(effector domain(s))活化一系列酶反应以在该标靶细胞膜上形成孔。通常，抗原抗体复合物(诸如被抗体包覆的靶细胞)结合并活化补体成份C1q，转而激活所述补体成分级联反应(complement cascade)，进而导致靶细胞死亡。补体的活化也可导致补体成份在该靶细胞表面上沉积，而这有利于ADCC，其通过将补体受体(例如CR3)结合于白血球上。
“细胞毒性效应”是指除尽(depletion)、消除(elimination)及/或杀死标靶细胞。“细胞毒性剂”是指对细胞具有细胞毒性效应的药剂。细胞毒性剂可与抗体共轭(conjugated)或与抗体联合给药(administered)。
“细胞静止(抑制)效应”(cytostatic effect)指抑制细胞增殖。“细胞抑制剂”(cytostatic agent)指对细胞具有细胞静止(抑制)效应的药剂，从而抑制特定细胞亚群(specific subset of cells)的生长(growth)及/或扩张(expansion)。细胞抑制剂可与抗体共轭或与抗体联合给药(administered)。
术语“医药上可接受的”(pharmaceutically acceptable)指经美国联邦或州政府管理机关核准或可核准的，或经列示于美国药典或其他公认药典中以使用于动物及特别是人。术语“医药上可相容的成分”(pharmaceutically compatibleingredient)指施用于病患的抗CD33-1抗体在医药上可接受得稀释剂、佐剂、赋形剂或载体。
“医药上可接受的盐”指抗CD33-1抗体、抗CD33-1抗体的共轭物或与抗CD33-1抗体一起给药的药剂的医药上可接受的有机或无机盐。示范性盐类包括硫酸盐、柠檬酸盐、醋酸盐、草酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、异烟碱酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酸性柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、鞣酸盐、泛酸盐、二酒石酸盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、顺丁烯二酸盐、龙胆酸盐(gentisinate)、反丁烯二酸盐、葡萄糖酸盐、葡萄糖醛酸盐、蔗糖酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐及双羟萘酸盐(即1,1’亚甲基双-(2羟基3萘甲酸盐))。医药上可接受的盐可能涉及纳入另一分子诸如乙酸离子、琥珀酸离子或其他反离子(counterion)。该反离子可为稳定母体化合物上电荷的任何有机或无机基团。另外，医药上可接受的盐在其结构中可具有超过一个带电原子。例如医药上可接受的盐的一部分是多电荷的原子，其可具有多个反荷离子。因此，医药上可接受的盐可具有一个或多个带电原子和/或一个或多个反离子。
除非在上下文中另有清楚的说明，术语“约”包括在所述数值的标准差之内的数值。
详细说明
I.通则
本发明提供与CD33特异性结合的单克隆抗体。所述抗体可被用于治疗及诊断各种癌症及检测CD33。
II.靶分子
除非另外说明，否则CD33指人CD33。示范性的人序列具有Swiss Prot编号(Swiss Prot accession number)P20138。在此处，P20138被包括作为SEQ IDNO:55。P20138包括一个信号肽,氨基酸1-17；一个具有IgG样结构域的胞外结构域，氨基酸18-259；一个跨膜结构域，氨基酸260-282；以及一个胞质域，氨基酸283-364。
除非上下文另外清楚说明，CD33指所述蛋白的至少一个胞外结构域且通常指完整蛋白，而非可切割(cleavable)的信号肽(P20138的氨基酸1-17)。
Ⅲ.本发明的抗体
A.结合特异性及功能特性
本发明提供了一种鼠科动物抗体，m2H12，和源自于m2H12的嵌合抗体或人源化抗体。鼠科动物抗体被选择是因其与人CD33蛋白和食蟹猴CD33蛋白的结合能力。食蟹猴CD33的氨基酸序列被提供为SEQ ID NOs:56和57。
人源化或嵌合形式的鼠科动物m2H12抗体(即Ka)的亲和性比人源化或嵌合形式的m2H12的亲和性大，或在鼠科动物m2H12抗体对人CD33蛋白的亲和性的5倍或2倍之内(即多于或少于)。测定抗体对靶标抗原的亲和性的一个方法是通过测定抗体的表观解离常数。本发明包括具有实质上与鼠科动物2H12相同(在试验误差之内)的表观解离常数的抗体(如嵌合或人源化形式的鼠科动物2H12抗体)，也包括具有低于或高于鼠科动物2H12抗体对人CD33的解离常数的解离常数的抗体。在一些实施例中，对于人CD33蛋白，本发明的抗体(如，嵌合、人源化或人形式的鼠科动物2H12抗体)具有的表观解离常数为鼠科动物2H12抗体对人CD33蛋白的表观解离常数的0.1至10倍范围内，或优选为0.1至5倍、0.1至2倍或0.5至2倍范围内。在一些方面，所述抗体对人CD33蛋白的表观解离常数(Kd)优选为在0.1nM至50nM的范围内，甚至更优选为在0.1nM至25nM的范围内，甚至优选为0.1nM至10nM、0.5nM至5nM或0.5nM至2.5nM的范围内。人源化或嵌合的m2H12抗体特异性地与天然形式和/或重组表达的人CD33蛋白结合，所述重组表达是由CHO细胞表达(同源自CHO细胞的鼠科动物m2H12抗体)。对于与人CD33蛋白的结合，人源化或嵌合m2H12抗体与m2H12结合于相同的抗原表位和/或彼此竞争结合。在一些实施例中，人源化或嵌合的m2H12抗体也与CD33的同源物(cyno-homolog of CD33)结合，因此允许在非人灵长动物中进行临床前试验。
优选的抗体(如人源化或嵌合的m2H12抗体)抑制了癌症(如，细胞生长，有机体的转移和/或致死)，如在培养、动物模型或临床试验中的癌细胞增殖。动物模型可由以下方式形成：将表达CD33的人肿瘤细胞系(cell lines)或原发性患者的肿瘤细胞移植入适当的免疫缺陷的啮齿动物品系(strains)中，如无胸腺裸鼠，NSG或SCID鼠。这些肿瘤细胞系可被建立于免疫缺陷的啮齿动物宿主中，其作为实体瘤(通过皮下注射)或作为散播瘤(通过静脉注射)。一旦在宿主体内建立，这些肿瘤模型可被用于评估所述抗-CD33抗体或其共轭形式的治疗疗效，正如实施例中所述。
B.抗体
人源化抗体是经基因工程改造的抗体，其中源自非人“供体”抗体的CDRs被嫁接(grafted into)于人“受体”抗体序列(见例如Queen,US 5,530,101and5,585,089；Winter,US 5,225,539；Cart er,US 6,407,213；Adair,US 5,859,205；andFoote,US 6,881,557)。受体的抗体序列可为，例如，成熟人抗体序列、所述序列的组合物、人抗体序列的共有序列(consensus sequence)或种系区域序列(germline region sequence)。优选的用于重链的受体序列是种系(germline)VH的外显子VH1-18，对于铰链区(JH)，则为外显子JH-6。对于轻链，优选的受体序列是外显子VL1-16，对于铰链区(J)，则为J-4。因此，人源化抗体是这样一种抗体，其具有完全或实质上源自非人供体抗体的部分或全部CDRs，和完全或实质上源自人抗体序列的可变区框架序列及恒定区(若存在的话)。类似地，人源化重链具有至少一个、两个或通常所有三个完全或实质上源自供体抗体重链的CDR，和实质上源自于人重链可变区框架及恒定区序列的重链可变区框架序列及重链恒定区(若存在的话)。类似地，人源化轻链具有至少一个、两个或通常所有三个完全或实质上源自供体抗体轻链的CDR，和实质上源自于人轻链可变区框架及恒定区序列的轻链可变区框架序列及轻链恒定区(若存在的话)。不同于奈米抗体(nanobodies)和dAbs，人源化抗体包括人源化重链和人源化轻链。当人源化或人抗体的CDR与非人抗体的对应CDR之间的对应残基(如Kabat定义)具有60％,85％,90％,95％或100％的一致性时，该人源化或人抗体的CDR则实质源自或实质等同于非人抗体的对应CDR。在一些实施例中，当每个CDR具有不超过3个保守氨基酸取代时，人源化抗体或人抗体中的CDR实质源自或实质等同于非人抗体中的对应CDR。当抗体链的可变区框架序列或抗体链的恒定区与由Kabat定义的对应残基具有至少70％,80％,85％,90％,95％或100％的一致性时，则其实质分别源自于人可变区框架序列或人恒定区。在本发明的一些人源化抗体中，抗体的重链可变框架区具有至少一个鼠2H12回复突变。
虽然人源化抗体通常纳入6个源自鼠科动物抗体的CDRs(优选地，由Kabat定义)，其也可由少于所有源自鼠科动物抗体的CDR(例如，至少3、4或5)制备(例如，Pascalis et al.,J.Immunol.169:3076,2002；Vajdos et al.,Journal ofMolecular Biology,320:415-428,2002；Iwahashi et al.,Mol.Immunol.36:1079-1091,1999；Tamura et al,Journal of Immunology,164:1432-1441,2000)。
源自人可变区框架残基的某些氨基酸可根据其对CDR构象和/或与抗原结合的可能影响经选择加以取代。所述可能影响的研究可通过以下方式实现：建模、检查在特定位置的氨基酸的特征，或经验性观察特定氨基酸的取代或突变的影响。
例如，当鼠科动物可变区框架残基与经选择的人可变区框架残基之间的氨基酸不同时，该人框架氨基酸可利用源自鼠科动物抗体的相等框架氨基酸加以取代，若能合理地预期该氨基酸：
(1)非共价地与抗原直接结合；
(2)毗邻CDR区；
(3)以其他方式与CDR区交互作用(如位于CDR区之约以内)；或
(4)介导该重链和轻链之间的交互作用。
本发明提供了鼠科动物m2H12抗体的人源化形式，其包括9个示范性的人源化重链成熟可变区(HA-HI)和7个示范性的人源化轻链成熟可变区(LA-LG)。具有最强结合力(最低EC50)的这些链的排列组合为HCLA,HCLE,HCLG,HILA,HILE和HILG。在这些排列组合中，优选HILG(又称为h2H12)，因为其具有最强的结合力。
本发明提供了2H12抗体，其中重链可变区显示与HA(SEQ ID NO:10)具有至少90％的一致性，且轻链可变区显示与LA(SEQ ID NO:2)具有至少90％的一致性。在一些方面，所述抗体是人源化抗体，且重链可变框架区具有至少一个鼠科动物2H12回复突变。在其他方面，所述抗体是人源化抗体，且轻链可变框架区具有至少一个鼠科动物2H12回复突变。另外地，本发明提供了2H12抗体，其中人源化重链可变区显示与SEQ ID NOS:10-18具有至少90％,95％,96％,97％,98％或99％的序列一致性，且人源化轻链可变区显示与SEQ ID NOS:2-8(或其任意组合(如抗体可以包含任何一个重链可变区搭配任何一个轻链可变区))具有至少90％,95％,96％,97％,98％或99％的序列一致性。例如，本发明提供了这样的抗体，其中重链可变区显示与SEQ ID NOS:10,11,12,13,14,15,16,17或18具有至少90％,95％,96％,97％,98％,99％或100％的序列一致性，且人源化轻链可变区显示与SEQ ID NOS:2,3,4,5,6,7或8具有至少90％,95％,96％,97％,98％,99％或100％的序列一致性。在另一个实施例中，本发明提供了这样的抗体，其中重链可变区显示与SEQ ID NOS:10,11,12,13,14,15,16,17或18具有至少90％,95％,96％,97％,98％,99％或100％的序列一致性，且轻链可变区显示与SEQ ID NO:2具有90％,95％,96％,97％,98％,99％或100％的序列一致性。在另一个实施例中，本发明提供了这样的抗体，其中重链可变区显示与SEQ ID NOS:10,11,12,13,14,15,16,17或18具有至少90％,95％,96％,97％,98％,99％或100％的序列一致性，且轻链可变区显示与EQ ID NO:3具有至少90％,95％,96％,97％,98％,99％或100％的序列一致性。在另一个实施例中，本发明提供了这样的抗体，其中重链可变区显示与SEQ ID NOS:10,11,12,13,14,15,16,17或18具有至少90％,95％,96％,97％,98％.99％或100％的序列一致性，且轻链可变区显示与SEQ ID NO:4具有至少90％,95％,96％,97％,98％,99％或100％的序列一致性。本发明提供了这样的抗体，其中重链可变区显示与SEQ ID NOS:10,11,12,13,14,15,16,17或18具有至少90％,95％,96％,97％,98％.99％或100％的序列一致性，且轻链可变区显示与SEQ IDNO:5具有至少90％,95％,96％,97％,98％,99％或100％的序列一致性。本发明提供了这样的抗体，其中重链可变区显示与SEQ ID NOS:10,11,12,13,14,15,16,17或18具有至少90％,95％,96％,97％,98％.99％或100％的序列一致性，且轻链可变区显示与SEQ ID NO:6具有至少90％,95％,96％,97％,98％,99％或100％的序列一致性。本发明提供了这样的抗体，其中重链可变区显示与SEQID NOS:10,11,12,13,14,15,16,17或18具有至少90％,95％,96％,97％,98％.99％或100％的序列一致性，且轻链可变区显示与SEQ ID NO:7具有至少90％,95％,96％,97％,98％,99％或100％的序列一致性。本发明提供了这样的抗体，其中重链可变区显示与SEQ ID NOS:10,11,12,13,14,15,16,17或18具有至少90％,95％,96％,97％,98％.99％或100％的序列一致性，且轻链可变区显示与SEQ ID NO:8具有至少90％,95％,96％,97％,98％,99％或100％的序列一致性。
在一些方面，这些抗体是人源化抗体且各抗体中的一些或所有回复突变是被保留的。在某些抗体中，位置H94被S占据。
在一些抗体中，位点H94被S占据。在一些抗体中，优选地，H48,H66,H67,H69,H71和H94中的至少一个位点被源自鼠科动物2H12抗体的相应位点的氨基酸占据。任选地，在任意的这种抗体中，位点H48被I占据；位点H66被K占据；位点H67被A占据；位点H69被L占据；位点H71被A占据；位点H94被S占据。在其他实施例的这种抗体中，优选地，L22,L46,L69和L71中的至少一个位点被源自鼠科动物2H12抗体的相应位点的氨基酸占据。任选地，在任意的这种抗体中，位点L22被N占据；位点L46被T占据；位点L69被Q占据；且位点L71被Y占据。
优选地，在以上所述的任意抗体中，如，2H12人源化抗体，其中所述重链可变区显示与SEQ ID NOS:10-18具有至少90％,95％,96％,97％,98％或99％的序列一致性，且所述轻链可变区显示与SEQ ID NOS:2-8具有至少90％,95％,96％,97％,98％或99％的序列一致性，2H12人源化抗体的CDR区与鼠科动物供体抗体(即鼠科动物2H12抗体(SEQ ID NOS:19-24))的CDR区是一致的或实质上是一致的。CDR区由Kabat定义。本发明的抗体包括抗体HCLA,HCLE,HCLG,HILA,HILE,和HILG。
本发明提供了HILG人源化抗体的变异体(variants)，在所述HILG人源化抗体中，人源化重链成熟可变区显示与SEQ ID NO:18具有至少90％,95％,96％,97％,98％或99％的一致性，且人源化轻链成熟可变区显示与SEQ ID NO:8具有至少90％,95％,96％,97％,98％或99％的序列一致性。在某些这种抗体中，位点H94被S占据。优选地，在这种抗体中，HILG中的一些或所有回复突变是被保留的。换句话说，至少1,2,3,4,5或优选地所有6个重链位点H48,H66,H67,H69,H71和H94分别被I和K和A和L和A和S占据。并且至少1,2,3或优选地所有4个轻链位点L22,L46,L69和L71分别被N和T和Q和Y占据。优选地，这种人源化抗体的CDR区与HILG的CDR区实质上一致，这些区与鼠科动物供体抗体的对应区相同。CDR区可通过任何常规定义(如柯西亚(Chothia))进行定义，但是优选地由卡巴(Kabat)定义。在一个实施例中，人源化抗体包含重链，该重链包含SEQ ID NO:18的三个CDRs和与SEQ IDNO:18的可变区框架具有至少95％一致性的可变区框架。在另一个实施例中，所述人源化抗体包含轻链，该轻链包含SEQ ID NO:8的三个CDRs和与SEQ IDNO:8的可变区框架具有至少95％一致性的可变区框架。在另一个实施例中，人源化抗体包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO:18的三个CDRs和与SEQID NO:18的可变区框架具有至少95％一致性的可变区框架，且所述轻链包含SEQ ID NO:8的三个CDRs和与SEQ ID NO:8的可变区框架具有至少95％一致性的可变区框架。
就与示范性HILG人源化抗体显示任何差异的人源化抗体而言，这种额外差异的一种可能性是在该可变区框架的额外的回复突变。在其他示范性人源化重链或轻链成熟可变区发生回复突变的任何或所有位点亦可发生回复突变(即，1,2,3,4或所有5个在该重链中由N占据的H38，由R占据的H40，由K占据的H73，由S占据的H82A，和由T占据的H83，及两个在该轻链中由K占据的L3和由I占据的L20。但是，这种额外的回复突变不被优选因为他们通常没有改善亲和性且引入了更多可能增加免疫原性风险的鼠科动物残基。
另一种可能的差异是以源自人CDRs序列的对应残基取代鼠科动物抗体的CDRs中的某些残基，通常源自用于设计示范性人源化抗体的人受体序列的CDRs。在一些抗体中，仅需所述CDRs的一部分(即结合所需的CDR残基亚群(subset)，称为SDRs)以维持人源化抗体的结合力。未接触抗原和不在SDRs中的CDR残基可基于以往研究，通过分子模型和/或经验或如Gonzales et al.,Mol.Immunol.41:863(2004)中所述的自位于柯西亚超变异环(Chothia hypervariableloops)(Chothia,J.Mol.Biol.196:901,1987)外侧的Kabat CDRs的区域识别(例如在CDR H2中，残基H60-H65通常不被需要)。在这种人源化抗体中的位点中，若其中一个或多个供体CDR残基缺失或整个供体CDR被遗漏，则占据该位点的氨基酸可为占据受体抗体序列中的对应位点(由Kabat编码)的氨基酸。在CDRs中，这种受体氨基酸取代供体氨基酸的数量反应了竞争平衡的考虑。这种取代可能有利于减少人源化抗体中的鼠科动物氨基酸的数量，且因此减少可能的免疫原性。但是，取代也可能导致亲和性的改变，而且优选地，亲和性的显著降低应当被避免。CDRs内的取代位点和用于取代的氨基酸也可以凭经验选择。
虽然并不是优选的，其他的氨基酸取代可能发生于例如不与CDRs接触的框架残基中或甚至在CDRs内一些潜在的CDR接触残基氨基酸中。关于经取代的HILG氨基酸(在人源化2H12抗体的情况下)，通常在变异体人源化序列中发生的取代是保守的。优选地，相对于HILG的取代(不论是否为保守性)在人源化单克隆抗体的结合亲和性或效价(即其与人CD33结合和抑制癌细胞生长的能力)上不具实质效应。
变异体通常与HILG(h2H12)的重链和轻链成熟可变区序列不同，变异体具有少量(例如，在该轻链或重链成熟可变区或两者中通常不超过1,2,3,5或10个)的取代、缺失或插入。
在一些实施例中，人源化或嵌合抗体具有CDR H2(相对于重链HI的CDRH2，最多具有1,2,3,4,5或6个取代、缺失或插入)和CDRs H1,H3,L1,L2和L3(相对于重链HI或轻链LG的对应CDR，每个最多具有1,2,3或4个取代、缺失或插入)。在一些实施例中，本发明的人源化或嵌合抗体在被识别为CDR的一部分的氨基酸中具有一个或至多两个保守氨基酸取代。优选的氨基酸取代的实例包括以下实例。在所述轻链的CDR1中，位点24的R残基可被K取代；位点25的G,S或T可被A取代；位点33的M可被L取代；且位点34的T可被S取代。在所述轻链的CDR2中，位点53的K残基可被R残基取代；位点54的M残基可被L残基取代；位点55的I残基可被V残基取代；且位点56的E残基可被D残基取代。在所述重链的CDR2中，位点61的D残基可被E残基取代；位点62的R残基可被K残基取代；位点63的Y残基可被F残基取代；位点64的R残基可被K残基取代；且位点65的G残基可被A残基取代。
在一些实施例中，本发明所述的人源化抗体包含SEQ ID NO:18的成熟重链可变区，在以上列出的CDR序列中具有一、二或三个保守取代。在一些实施例中，本发明所述的人源化抗体包含SEQ ID NO:8的成熟轻链可变区，在以上列出的CDR序列中具有一、二或三个保守取代。
C.选择恒定区
人源化抗体的重链和轻链可变区可与人恒定区的至少一部分连接。恒定区的选择部分取决于是否希望具备抗体依赖性细胞介导的细胞毒性、抗体依赖性细胞吞噬作用和/或补体依赖的细胞毒性。例如，人同型(isotopes)IgG1和IgG3具有强烈的补体依赖的细胞毒性，人同型IgG2具有微弱的补体依赖的细胞毒性，人IgG4缺乏补体依赖的细胞毒性。相比于人IgG2和IgG4，人IgG1和IgG3也引起更强的细胞介导性的效应功能。轻链恒定区可为λ或κ。抗体可被表达为包含两条轻链和两条重链的四聚体，表达为分离的重链、轻链，表达为Fab,Fab',F(ab')2和Fv，或表达为其中重链和轻链可变区通过间隔(spacer)连接的单个链抗体。
人恒定区在不同的个体间显示出异型(allotypic)变异和同种异型(isoallotypic)变异，也即不同个体的恒定区在一个或多个多态位点具有差异。同种异型(Isoallotypes)与异型(allotypes)之间的不同之处在于，识别一种同种异型(isoallotype)的血清与一种或多种其他同种型(isotypes)的非多态性区域结合。
所述轻链和/或重链的氨基端或羧基端的一个或多个氨基酸(如所述重链C端的赖氨酸)可能在分子的一部分或全部当中被遗失或衍生化。取代可能发生在恒定区以减少或增加效应功能，如补体介导性的细胞毒性或ADCC(见，例如Winter et al.,US Patent No.5,624,821；Tso et al.,US Patent No.5,834,597；和Lazar et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103:4005,2006)，或延长在人体中的半衰期(见，例如Hinton et al.,J.Biol.Chem.279:6213,2004)。
示例性取代包括将天然氨基酸取代成半胱氨酸的氨基酸取代，这种取代被引入于氨基酸位点234,235,237,239,267,298,299,326,330或332，优选地，在人IgG1同型中的S239C突变(编码是根据EU索引(Kabat,sequences of Proteinsof Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,MD,1987and1991))见US 20100158909，其以参考的形式在此引入)。额外的半胱氨酸的存在允许链间二硫键的形成。所述链间二硫键的形成可导致空间位阻，从而减少所述Fc区-FcγR结合交互作用的亲和性。被引入的或接近IgG恒定区的Fc区的半胱氨酸残基也可作为与治疗剂(即，使用巯基特定试剂如药物的马来酰亚胺衍生物来共轭细胞毒性药物)共轭的位点。治疗剂的存在导致空间位阻，从而进一步减少Fc区-FcγR结合交互作用的亲和性。其他在位点234,235,236和/或237中的任一位点的取代减少Fcγ受体(尤其是FcγRI受体)的亲和性(参见例如，US 6,624,821,US 5,624,821)。
抗体在活体内的半衰期也可影响其效应功能。抗体的半衰期可被增加或减少以调整其治疗活性。FcRn是一个结构上类似于MHC I类抗原(MHC Class Iantigen)的受体，该MHC I类抗原与β2-微球蛋白非共价结合。FcRn调节IgGs的分解代谢及其在组织间的转胞吞(transcytosis)作用(Ghetie and Ward,2000,Annu.Rev.Immunol.18:739-766；Ghetie and Ward,2002,Immunol.Res.25:97-113)。IgG-FcRn的交互作用发生在pH 6.0(胞内囊泡的pH)但不发生于pH 7.4(血液的pH)；这种交互作用能够使IgGs被反向循环(recycled back)至所述循环中(Ghetie and Ward,2000,Ann.Rev.Immunol.18:739-766；Ghetie andWard,2002,Immunol.Res.25:97-113)。人IgG1中与FcRn结合有关的区域已被定位(Shields et al.,2001,J.Biol.Chem.276:6591-604)。在人IgG1的位点Pro238,Thr256,Thr307,Gln311,Asp312,Glu380,Glu382或Asn434的丙氨酸取代增进了FcRn结合(Shields et al.,2001,J.Biol.Chem.276:6591-604)。具有这些取代的IgG1分子具有较长的血清半衰期。因此，这些经修饰的IgG1分子可能可以发挥其效应功能，因此相较于未经修饰的IgG1能在较长的时间内发挥其治疗疗效。其他用于增加与FcRn结合的示范性取代包括：在250的Gln和/或在位点428的Leu。EU编码用于恒定区的所有位点。
与保守性Asn297共价连接的寡糖与IgG的Fc区域FcγR结合的能力有关(Lund et al.,1996,J.Immunol.157:4963-69；Wright and Morrison,1997,TrendsBiotechnol.15:26-31)。IgG上的这个糖型(glycoform)的工程化(Engineering)可显著提高IgG介导的ADCC。向这种糖型中添加平分型N-乙酰葡萄糖胺修饰(Umana et al.,1999,Nat.Biotechnol.17:176-180；Davies et al.,2001,Biotech.Bioeng.74:288-94)或从这种糖型中出去岩藻糖(Shields et al.,2002,J.Biol.Chem.277:26733-40；Shinkawa et al.,2003,J.Biol.Chem.278:6591-604；Niwa et al.,2004,Cancer Res.64:2127-33)是两种改善IgG Fc与FcγR之间结合的IgG Fc工程化实例，从而增加Ig介导的ADCC活性。
系统性取代以溶剂暴露的人IgG1Fc区的氨基酸产生了IgG变异体，该变异体具有改变了的FcγR结合亲和性(Shields et al.,2001,J.Biol.Chem.276:6591-604)。当与母体IgG1比较时，这些涉及在Thr256/Ser298、Ser298/Glu333、Ser298/Lys334、或Ser298/Glu333/Lys334取代成Ala的变异体的亚群显示了对FcγR的结合亲和性及ADCC活性增加(Shields et al.,2001,J.Biol.Chem.276:6591-604；Okazaki et al.,2004,J.Mol.Biol.336:1239-49)。
抗体的补体固定活性(C1q结合及CDC活性二者)可由Lys326及Glu333的取代而改善(Idusogie et al.,2001,J.Immunol.166:2571-2575)。在人IgG2主链上的相同取代可将与C1q结合不良且严重缺乏补体活化活性的抗体同种型转换成可与C1q结合且能介导CDC的抗体同种型(Idusogie et al.,2001,J.Immunol.166:2571-75)。一些其他方法亦可被用于改善抗体的补体固定活性。举例来说，将IgM的18-氨基酸羧基端尾片段植入(graft)IgG的羧基端大幅增强了其CDC活性。这种现象甚至可在IgG4中观察到，IgG4通常不具有可检测到的CDC活性(Smith et al.,1995,J.Immunol.154:2226-36)。同样地，以Cys取代位于靠近IgG1重链的羧基端的Ser444诱发了IgG1的尾对尾(tail-to-tail)二聚化，其CDC活性比单体IgG1增加200倍(Shopes et al.,1992,J.Immunol.148:2918-22)。此外，对C1q具有特异性的双特异性双价抗体建构体(a bispecific diabody construct)也给予CDC活性(Kontermann et al.,1997,Nat.Biotech.15:629-31)。
补体活性可由以下突变减少，重链的氨基酸残基318、320及322中的至少一个突变成具有不同侧链的残基，如Ala。以其他烷基取代的非离子性残基(如Gly、Ile、Leu或Val)或芳香族非极性残基(如Phe、Tyr、Trp及Pro)取代所述三个残基中的任一个也可减少或阻断C1q结合。Ser、Thr、Cys及Met可被用于残基320及322(但非318)以减少或阻断C1q结合活性。以极性残基取代该318(Glu)残基可能调节但不会阻断C1q结合活性。以Ala取代残基297(Asn)导致去除促使细胞溶解的活性(removal of lytic activity)，但仅轻微减少(大约减少三倍)对C1q的亲和性。此改变破坏该糖基化位点及补体活化所需的碳水化合物的存在。任何在此位点的其他取代亦破坏该糖基化位点。下列突变及其任何组合亦减少C1q结合：D270A、K322A、P329A或P311S(见WO 06/036291)。
提及人恒定区，其包括具有任何天然同种异型(allotype)的恒定区，或具有占据天然同种异型的多态性位点的任何排列组合的残基的恒定区。同样地，相对于天然人恒定区，至多1、2、5或10个突变可存在，正如以上指出的可减少Fcgamma受体结合或增加与FcRN结合的类型。
D.重组抗体的表达
人源化或嵌合抗体通常由重组体表达而制备。重组多核苷酸建构体通常包括与抗体链编码序列可操作地连接的表达控制序列，包括天然关联的(naturally-associated)或异源性启动子区。较佳地，所述表达控制序列是能转化(transforming)或转染(transfecting)真核宿主细胞的载体中的真核启动子系统。一旦该载体被纳入适当宿主之后，该宿主被维持在适合高度表达该核苷酸序列、适合收集及纯化该交叉反应性抗体的条件下。
哺乳动物细胞是用于表达核酸片段(该核酸片段编码免疫球蛋白或其片段)的较佳宿主。见Winnacker,From Genes to Clones,(VCH Publishers,NY,1987)。一些可分泌完整异源性蛋白质的适当的宿主细胞系已在本领域中被开发，其包括CHO细胞系(例如DG44)、各种COS细胞系、HeLa细胞、HEK293细胞、L细胞及非抗体产生性骨髓瘤(包括Sp2/0及NS0)。优选地，该些细胞为非人细胞。用于这些细胞的表达载体可包括表达控制序列，如复制起点、启动子、增强子(Queen et al.,Immunol.Rev.89:49(1986))及必要的处理信息位点，如核糖体结合位点、RNA剪切位点、聚腺苷酸化位点及转录终止子序列。优选的表达控制序列是源自内源性基因、巨细胞病毒、SV40、腺病毒、牛乳头状瘤病毒及类似物的启动子，见Co et al.,J.Immunol.148:1149(1992)。
抗CD33蛋白的人抗体可通过下面所述的各种技术提供。生产人抗体的方法包括三体瘤方法(见：Oestberg et al.,Hybridoma 2:361-367(1983)和Engleman etal.,US Patent 4,634,666)、使用包含人免疫球蛋白基因的转基因鼠科动物(见例如，Lonberg et al.,WO93/12227(1993)；US 5,877,397,US 5,874,299,US 5,814,318,US 5,789,650,US 5,770,429,US 5,661,016,US 5,633,425,US 5,625,126,US5,569,825,US 5,545,806,Nature 148,1547-1553(1994),Nature Biotechnology 14,826(1996),Kucherlapati,WO 91/10741(1991))和噬菌体展示方法(见例如，Doweret al.,WO 91/17271and McCafferty et al.,WO 92/01047,US 5,877,218,US5,871,907,US 5,858,657,US 5,837,242,US 5,733,743and US 5,565,332)。
一旦表达，抗体可根据本领域的标准程序被纯化，包括HPLC纯化、柱层析、凝胶电泳及类似方法(一般见Scopes,Protein Purification(Springer-Verlag,NY,1982))。
IV.核酸
本发明另提供编码上述人源化重链及轻链的任一者的核酸。通常，该核酸也编码与该成熟重链及轻链融合的信号肽。核酸上的编码序列可与调节序列可操作地连接以确保该编码序列的表达，诸如启动子、增强子、核糖体结合位点、转录终止信号及该类似序列。编码重链及轻链的核酸可以分离的形式存在，也可以被克隆进一个或多个载体。所述核酸可由例如固相合成或重叠寡核苷酸的PCR加以合成。编码重链及轻链的核酸可在例如一个表达载体内被接合成一个连续核酸，或可被各自分开克隆进自己的表达载体。
在一个实施例中，该公开提供了一种分离的聚核苷酸(polynucleotide)，其编码包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的抗体重链可变区。该分离的聚核苷酸可进一步编码人IgG重链恒定区。所述IgG恒定区的同型(isotype)是，例如IgG1,IgG2,IgG3或IgG4。在一个实施例中，所述IgG恒定区的同型是IgG1。在另一个实施例中，经编码的IgG1恒定区具有包含残基239(根据Kabat编码系统，即S239C)被取代的氨基酸序列。本公开还提供了一种表达载体和进一步的宿主细胞，所述表达载体包含分离的聚核苷酸，所述聚核苷酸编码包含SEQID NO:18氨基酸序列的抗体重链可变区；所述宿主细胞包含所述表达载体。在一些实施例中，所述宿主细胞是哺乳动物宿主细胞，例如，CHO细胞。
在另一个实施例中，该公开提供了一种分离的聚核苷酸，其编码包含SEQ IDNO:8的氨基酸序列的抗体轻链可变区。该分离的聚核苷酸可进一步编码人IgG轻链恒定区。所述IgG轻链恒定区的同型(isotype)是，例如卡帕(kappa)恒定区。本公开还提供了一种表达载体和进一步的宿主细胞，所述表达载体包含分离的聚核苷酸，所述聚核苷酸编码包含SEQ ID NO:8氨基酸序列的抗体轻链可变区；所述宿主细胞包含所述表达载体。在一些实施例中，所述宿主细胞是哺乳动物宿主细胞，例如，CHO细胞。
在另一个实施例中，该公开提供了一种分离的聚核苷酸(isolatedpolynucleotide)或聚核苷酸，其编码包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的抗体重链可变区和包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的抗体轻链可变区，所述重链可变区和所述轻链可变区形成特异性地结合人CD33的抗体或抗原结合片段。本公开还提供了一种表达载体，其包含编码所述抗体重链可变区和所述抗体轻链可变区的分离的聚核苷酸或聚核苷酸，所述抗体重链可变区包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，所述抗体轻链可变区包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。一种包含所述表达载体(expression vector or vectors)的宿主细胞也被提供。宿主细胞优选为哺乳动物细胞，例如CHO细胞。
在另一个实施例中，该公开提供了第一载体和第二载体，其包含一个编码抗体重链可变区的聚核苷酸和一个编码抗体轻链可变区的聚核苷酸，所述抗体重链可变区包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，所述抗体轻链可变区包含SEQ IDNO:8的氨基酸序列，所述重链可变区和所述轻链可变区形成特异性地结合人CD33的抗体或抗原结合片段。宿主细胞包含提供的所述载体，优选地是哺乳动物的宿主细胞，如CHO细胞。
Ⅴ.抗体药物共轭物
抗-CD33抗体可与细胞毒性部分(cytotoxic moieties)共轭以形成抗体药物共轭物(ADCs)。特别适用于与抗体共轭的部分是细胞毒性剂(例如化疗药物)、前体药物转化酶、放射性同位素或化合物或毒素(这些部分被统称为治疗剂或药物)。例如，抗CD33抗体可与细胞毒性剂，如化疗药物或毒素(例如，细胞生长抑制剂或杀细胞剂(如相思豆毒蛋白(abrin)、蓖麻毒蛋白(ricin)A、假单胞菌外毒素或白喉毒素))共轭。细胞毒性剂的有用类别的实例包括，例如DNA小沟结合剂、DNA烷化剂和微管蛋白抑制剂。示例性的细胞毒性剂包括，例如阿里他汀(auristatins)、喜树碱(camptothecins)，多卡米星(duocarmycins)，依托泊甙(etoposides)、美坦(maytansines)与美登素(maytansinoids)(例如，DM1和DM4)、紫杉烷类(taxanes)，苯二氮类(benzodiazepines)(例如，吡咯[1,4]苯二氮杂卓类(PBDs)、吲哚啉苯并二氮杂卓类(indolino benzodiazepines)和恶唑苯二氮杂卓类(oxazolidinobenzodiazepines))和长春花生物碱(vinca alkaloids)。用于将治疗剂共轭到蛋白(尤其是抗体)的技术是众所周知的(见，例如Alley et al.,CurrentOpinion in Chemical Biology 201014:1-9；Senter,Cancer J.,2008,14(3):154-169.)。
所述治疗剂(例如细胞毒性剂)可以以减少其活性的方式与抗体共轭，除非它是从抗体上被分离的(例如，通过水解、抗体降解或切割剂)。这种治疗剂可通过连接子(linker)与抗体连接。与治疗剂共轭的连接子在此也被称为药物连接子。连接子的性质可广泛变化。组成连接子的成分基于其特性选择，可能部分取决于共轭物被输送到部位的条件。
所述治疗剂可通过可切割的连接子(cleavable linker)与所述抗体连接，该可切割的连接子在抗CD33表达(anti-CD33-expressing)的癌细胞的胞内环境中对切割(cleavage)具有敏感性，但在胞外环境则实质上不具敏感性，因此该共轭物会在抗CD33表达的癌细胞将其内化后(例如在核体(endosomal)内或例如借助pH敏感性或蛋白酶敏感性，在溶酶体环境或在胞膜窖(caveolear)环境中)从该抗体上被切割。如显示的，连接子可包含可切割单位(cleavable unit)。在一些这样的实施例中，可切割单位的结构和/或序列被选择，这样它在存在于目标位点(例如目标细胞)的酶的作用下是可切割的。在其他实施例中，也可使用这样的可切割单位，其在pH(例如对酸或碱不稳定的)、温度或辐射(例如对光不稳的)的改变下是可切割的(cleavable)。
在一些实施例中，可切割单位可包含一个氨基酸或连续的氨基酸序列。氨基酸序列可以是酶的目标底物。
在一些方面，可切割单位是肽单位并且为至少两个氨基酸长。切割剂可包括组织蛋白酶(cathepsins)B和D和纤溶酶(plasmin)(见，例如Dubowchikand Walker,1999,Pharm.Therapeutics 83:67-123)。最典型的是可被存在于抗CD33表达细胞中的酶所切割的可切割单位，即酶可切割连接子。从而连接子可被细胞内肽酶(intracellular peptidase)或蛋白酶切割，包括溶酶体或内体蛋白酶。例如，可被硫醇依赖的蛋白酶组织蛋白酶B(其在癌组织中高度表达)切割的连接子可被使用。(例如包含苯丙氨酸-亮氨酸肽或缬氨酸-瓜氨酸肽或缬氨酸-丙氨酸肽的连接子)。
在一些实施例中，连接子将包含可切割单位(例如肽单位)并且所述可切割单位将直接与治疗剂共轭。在其他实施例中，所述可切割单位可与治疗剂通过额外的功能单位共轭，例如，自毁型间隔区单位(self-immolative spacer unit)或非自毁型间隔区单位(non-self-immolative spacer unit)。非自毁型间隔区单位指：其中在可切割单位(例如氨基酸)从所述抗体药物共轭物上被切割后，所述间隔区单位的部分或全部仍与药物单位保持结合。为了释放药物，独立水解反应发生于目标细胞内以将间隔区从药物上切割下来。用自毁型间隔区单位时，药物的释放不需要药物的独立水解步骤。在一个实施例中，其中连接子包含可切割单位和自毁型基团(self immolative group)，所述可切割单位被酶的作用切割并且在可切割单位被切割后，自毁型基团释放治疗剂。在一些实施例中，连接子的可切割单位的一端将直接或间接与治疗剂共轭并且其另一端将直接或间接与所述抗体共轭。在一些这样的实施例中，可切割单位的一端将直接或间接(例如通过自毁型或非自毁型间隔区单位)与治疗剂共轭并且其另一端将直接或间接与所述抗体通过延伸器单位(stretcher unit)共轭。延伸器单位将所述抗体与所述药物和/或药物连接子的其余部分连接。在一个实施例中，所述抗体与所述药物和/或药物连接子的其余部分之间的连接是通过马来酰亚胺基团，例如通过马来酰亚胺己酰基连接子。在一些实施例中，所述抗体将通过二硫化物(disulfide)与所述药物连接，例如所述二硫化物连接的美登素共轭物SPDB-DM4和SPP-DM1。
所述抗体与所述连接子之间的连接可通过许多不同的路径，例如，通过硫醚键、通过二硫键、通过酰胺键或通过酯键。在一个实施例中，所述抗CD33抗体与所述连接子之间的连接形成于所述抗体的半胱氨酸残基的巯基和所述连接子的马来酰亚胺基之间。在一些实施例中，与所述连接子的功能基团反应前，所述抗体的链间键被转化为游离的巯基。在一些实施例中，半胱氨酸残基被引入抗体的重链或轻链并且与所述连接子反应。通过取代半胱氨酸在抗体重链或轻链的插入位点包括公开的美国申请第2007-0092940号和国际专利公开WO2008070593(两者均以参考的方式在此处并入全文以符合所有目的)中所述的位点。
在一些实施例中，所述抗体药物共轭物具有以下公式I：
L-(LU-D)p   (I)
其中，L是抗CD33抗体，LU是连接子单位且D是药物单位(即治疗剂)。下标p取值范围为1至20。这种共轭包含非共价地与至少一个药物通过连接子连接的抗CD33抗体。连接子单位的一端与所述抗体连接，且其另一端与所述药物连接。
载药量(Drug loading)由p表示，即每个抗体的药物分子的数量。载药量的范围可以为每抗体1至20个药物单位(D)。本领域技术人员会了解在一些方面，下标p的取值范围可为1至20(即，从1至20的整数和非整数值)。本领域技术人员会了解在一些方面，下标p可为从1至20的整数，并且将代表单个抗体上的药物-连接子的数量。在其他方面，p代表每个抗体上药物-连接子的平均数量，例如，在反应混合物或组合物(例如药物组合物)中的每个抗体上药物-连接子的平均数量，并且可为整数或非整数值。从而在一些方面，对于组合物(例如药物组合物)而言，p代表所述组合物中抗体-药物共轭物的平均载药量，并且p的取值范围为1至20。
在一些实施例中，p是从约1至约8药物/抗体(drugs per antibody)。在一些实施例中，p是1。在一些实施例中，p是2。在一些实施例中，p是从约2至约8药物/抗体。在一些实施例中，p是从约2至约6，2至约5或2至约4药物/抗体。在一些实施例中，p是约2、约6或约8药物/抗体。
从共轭反应的制备中，每抗体单位的药物平均数量可通过常规装置如质谱仪、ELISA分析、HIC和HPLC来表征。共轭物的数量分布(以p的方式)也可以确定。
示范性的抗体-药物共轭物包括基于阿里他汀(auristatin)的抗体-药物共轭物，即共轭物中，药物成分是阿里他汀药物。阿里他汀结合微管蛋白，已显示出可干扰微管动力学和核及细胞的分离，并且具有抗癌活性。基于阿里他汀的抗体-药物共轭物通常包含所述阿里他汀药物和所述抗CD33抗体之间的连接子。所述阿里他汀可在适于与连接子共轭的任意位点与抗CD33抗体结合。所述连接子可为，例如，可切割连接子(例如，肽基连接子)或非可切割连接子(例如，所述抗体降解释放的连接子)。所述阿里他汀可以是阿里他汀E或其衍生物。所述阿里他汀可为，例如，阿里他汀E与酮酸之间形成的酯。例如，阿里他汀E可与对乙酰苯甲酸(paraacetyl benzoic acid)或苯甲酰戊酸(benzoylvaleric acid)反应分别生成AEB和AEVB。其他典型的阿里他汀包括MMAF(单甲基阿里他汀F(monomethyl auristatin F))和MMAE(单甲基阿里他汀E(monomethyl auristatin E))。示例性的阿里他汀的合成和结构描述于U.S.公开号7,659,241,7,498,298,2009-0111756,2009-0018086和7,968,687(每个均以参考的方式在此处并入全文以符合所有目的)。
示例性的基于阿里他汀的抗体-药物共轭物包括以下所示的vcMMAE、vcMMAF和mcMMAF抗体-药物共轭物，其中Ab为此处所述的抗体且val-cit代表缬氨酸-瓜氨酸二肽：
或其药学上可接受的盐。载药量由p表示，即每抗体的药物-连接子的数量。根据上下文，p可表示每抗体的药物-连接子分子的平均数量，也称为平均载药量。变量p的取值范围为1至20并优选为1至8。在一些优选的实施例中，当p表示平均载药量时，p的取值范围为约2至约5。在一些实施例中，p为约2、约3、约4或约5。在一些方面，所述抗体通过半胱氨酸残基的硫原子与连接子共轭。在一些方面，所述半胱氨酸残基是这样的残基，其被工程化至抗体。在其他方面，所述半胱氨酸残基是链间二硫半胱氨酸残基(interchain disulfidecysteine residue)。
示范性的抗体-药物共轭物包括基于PBD的抗体-药物共轭物，即抗体-药物共轭物中，药物组分是PBD药物。
PBDs的一般结构为：
它们在取代的数量、类型和位点、其芳香A环和吡咯C环以及C环的饱和度上有差异。在B环上的N10-C11位点(其为负责烷化DNA的亲电中心)有一个亚胺(N＝C)、一个甲醇胺(NH-CH(OH))，或一个甲醇胺甲基醚(NH-CH(OMe))。所有已知的天然产物在手性C11a位点具有(S)-组态((S)-configuration)，当从C环看A环时，这为它们提供了右手扭曲(right-handedtwist)。这为它们与B-形DNA小沟同型螺旋(isohelicity)提供了合适的三维形状，导致紧密贴合在所述结合位点。PBDs在小沟形成加合物的能力使其能够干扰DNA的加工，因此将其用作抗肿瘤剂。
这些分子的生物活性可以通过将两个PBD单位通过其C8/C’-羟基官能团利用灵活的烯烃基连接子结合在一起增效。PBD二聚体被认为形成序列-选择性(sequence-selective)DNA损伤，如回文(palindromic)5’-Pu-GATC-Py-3’链间交联(其被认为主要负责它们的生物活性)。
在一些实施例中，基于PBD的抗体-药物共轭物包含一个与抗CD33抗体连接的PBD二聚体。形成PBD二聚体的单体可以是相同的或不同的，即对称的或非对称的。所述PBD二聚体可与抗CD33抗体在任何适于与连接子共轭的位点连接。例如，在一些实施例中，所述PBD二聚体将具有一个在C2位点的取代，其提供了用于连接所述化合物与所述抗CD33抗体的锚点(anchor)。在替代实施例中，所述PBD二聚体的位点N10将提供用于连接所述化合物与所述抗CD33抗体的锚点。
基于PBD的抗体-药物共轭物通常包含所述PBD药物和所述抗CD33抗体之间的连接子。所述连接子可包含可切割单位(例如氨基酸或连续的氨基酸序列，其为酶的目标底物)或非可切割连接子(例如，所述抗体降解释放的连接子)。所述连接子可进一步包含马来酰亚胺基团以连接在所述抗体上，例如马来酰亚胺己酰基。所述连接子可以，在一些实施例中，进一步包含自毁型基团，例如-氨基苄醇(PAB)单位。
用作共轭物的示范性的PBD描述于国际申请No.WO 2011/130613并且如下所示，其中波浪线显示与所述连接子的结合位点：
或其药学上可接受的盐。示范性的连接子如下所示，其中波浪线显示与所述药物的结合位点并且所述抗体通过所述马来酰亚胺基团连接。
示范性的基于PBDs的抗体-药物共轭物包括以下所示的抗体-药物共轭物，其中，Ab是此处所述的抗体：
或其药学上可接受的盐。所述载药量由p表示，即每抗体药物-连接子分子的数量。根据上下文，p可表示每抗体的药物-连接子分子的平均数量，也称为平均载药量。变量p的取值范围为1至20并优选为1至8。在一些优选的实施例中，当p表示平均载药量时，p的取值范围为约2至约5。在一些实施例中，p为约2、约3、约4或约5。在一些方面，所述抗体通过半胱氨酸残基(其被工程化至抗体)的硫原子与所述药物连接子共轭。在一些方面，所述半胱氨酸残基在位点239(IgG1)(由EU索引确定)被工程化至所述抗体(Kabat,sequencesof Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,MD,1987and 1991)。
Ⅵ其他与CD33结合的抗体
除了上述人源化形式的m2H12抗体之外，其他与CD33的胞外域结合的抗体可被用于本发明的一些方法，特别是癌症的治疗。一些抗LIV-1的鼠科动物抗体描述于US20080175839。这些抗体的嵌合的(chimeric)或饰面的(veneered)形式可由下述常用方法制备。
嵌合抗体是这样的抗体，其中非人抗体(例如鼠科动物)的轻链及重链的成熟可变区与人轻链及重链恒定区组合(combined)。该抗体实质上或完全保留该鼠科动物抗体的结合特异性，且具有大约三分之二的人序列。
饰面抗体(veneered antibody)是一种人源化抗体的类型，其保留非人抗体的一些及通常所有的CDR及一些非人可变区框架残基，但用源自人抗体序列对应位置的残基来取代其他可能贡献B-或T-细胞表位(例如暴露的残基)的可变区框架残基(Padlan,Mol.Immunol.28:489,1991)。结果是这样一种抗体，其CDR完全或实质上源自非人抗体，而该非人抗体的可变区框架由于所述取代而更似人。
任一抗体可由竞争性结合试验(如实例中所述的)或其他方式选择以具有和示范抗体(如m2H12抗体)相同或重叠的抗原表位特异性。优选的抗体与所述m2H12抗体具有相同的抗原表位特异性。那些技术人员能够使用各种方法识别抗体结合的抗原表位。例如，基于阵列的寡肽扫描或肽扫描分析使用源于重叠或非重叠的靶抗原片段的低聚肽序列库并测试其结合目标抗体的能力(见，例如Geysen et al.,PNAS 81:3998-4002(1984))。非线性抗原标远可使用例如CLIPSTM技术、各种基于阵列的寡肽扫描(见，例如Timmerman et al.,OpenVaccine J.2:56-67(2009))识别。所述抗原蛋白也可被诱变，然后用于评估被目标抗体的结合。蛋白质系统的定点诱变(protein systematic site-directedmutagenesis)可被使用或突变文库可被制备并用于筛选抗体的结合。突变文库可从例如Integral Molecular公司购买。酰胺氢/氘交换质谱可被用来识别抗原表位。目标抗原被放置在重水中并用氘核标记。然后用蛋白酶消化所述蛋白质，并将得到的肽片段进行质谱分析。所述抗原也在抗体存在时被评估并且肽片段的标记差异显示了抗体结合的区域。
Ⅶ.治疗应用
衍生于鼠科动物2H12抗体的抗体例如嵌合或人源化抗体(单独的或作为其CD33抗体药物共轭物)可被用于治疗癌症。一些这样的癌症显示可检测的量的CD33，其以蛋白质(例如使用示范性抗体之一的免疫试验)或mRNA的量被测量。相比于该相同类型的非癌组织(优选地源自相同患者)，一些这样的癌症显示增加量的CD33。应接受治疗的癌细胞其示范性CD33的量为每细胞5000至150000CD33分子，尽管更高或更低量也可被治疗。可任意选择地，癌症中的CD33的量在实施治疗前被测量。
与CD33表达相关且应接受治疗的癌症实例包括急性髓性白血病(AML)、慢性髓细胞性白血病(CML)、其他的骨髓增生性疾病包括慢性骨髓性白血病和慢性骨髓增生性疾病、急性早幼粒细胞白血病(APL)、血小板白血病、骨髓增生异常综合征、前体B细胞急性淋巴细胞白血病(preB-ALL)、前体T细胞急性淋巴细胞白血病(preT-ALL)、多发性骨髓瘤(MM)、肥大细胞病包括肥大细胞白血病和肥大细胞肉瘤、粒细胞肉瘤、难治性贫血、白血病前期综合征、淋巴性白血病、或未分化性白血病。所述治疗也可适用于初次接受治疗的病患、常规治疗难以治疗的病患(例如，)或在响应这种治疗后已经复发的病患。
衍生于鼠科动物2H12抗体的CD33抗体，包括嵌合抗体或人源化抗体(如h2H12抗体)可被用于治疗表达CD33蛋白的癌症。在一个实施例中，衍生于鼠科动物2H12抗体的人源化抗体被用于治疗CD33阳性急性髓性白血病(AML)的个体。在进一步的实施例中，所述h2H12抗体被用于治疗CD33阳性AML的个体。在另一个实施例中，衍生于鼠科动物2H12抗体的人源化抗体被用于治疗CD33阳性慢性髓细胞性白血病(CML)的个体。在进一步的实施例中，所述h2H12抗体被用于治疗CD33阳性CML的个体。在另一个实施例中，衍生于鼠科动物2H12抗体的人源化抗体被用于治疗CD33阳性慢性粒单核细胞白血病(CMML)的个体。在进一步的实施例中，所述h2H12抗体被用于治疗CD33阳性CMML的个体。在另一个实施例中，衍生于鼠科动物2H12抗体的人源化抗体被用于治疗CD33阳性甲状腺白血病(thyroid leukemia)的个体。在进一步的实施例中，所述h2H12抗体被用于治疗CD33阳性甲状腺白血病的个体。在另一个实施例中，衍生于鼠科动物2H12抗体的人源化抗体被用于治疗CD33阳性骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome)的个体。在进一步的实施例中，所述h2H12抗体被用于治疗CD33阳性骨髓增生异常综合征的个体。在另一个实施例中，衍生于鼠科动物2H12抗体的人源化抗体被用于治疗CD33阳性骨髓增生性疾病(myeloproliferative disorder)的个体。在进一步的实施例中，所述h2H12抗体被用于治疗CD33阳性骨髓增生性疾病的个体。在另一个实施例中，衍生于鼠科动物2H12抗体的人源化抗体被用于治疗CD33阳性难治性贫血(refractory anemia)的个体。在进一步的实施例中，所述h2H12抗体被用于治疗CD33阳性难治性贫血的个体。在另一个实施例中，衍生于鼠科动物2H12抗体的人源化抗体被用于治疗CD33阳性白血病前期综合征(preleukemiasyndrome)的个体。在进一步的实施例中，所述h2H12抗体被用于治疗CD33阳性白血病前期综合征的个体。在另一个实施例中，衍生于鼠科动物2H12抗体的人源化抗体被用于治疗CD33阳性淋巴性白血病(lymphoid leukemia)的个体。在进一步的实施例中，所述h2H12抗体被用于治疗CD33阳性淋巴性白血病的个体。在另一个实施例中，衍生于鼠科动物2H12抗体的人源化抗体被用于治疗CD33阳性未分化型白血病(undifferentiated leukemia)的个体。在进一步的实施例中，所述h2H12抗体被用于治疗CD33阳性未分化型白血病的个体。在一个实施例中，衍生于鼠科动物2H12抗体的人源化抗体被用于治疗CD33阳性前体B细胞急性淋巴细胞白血病(pre-B-ALL)的个体。在进一步的实施例中，所述h2H12抗体被用于治疗CD33阳性pre-B-ALL的个体。在一个实施例中，衍生于鼠科动物2H12抗体的人源化抗体被用于治疗CD33阳性前体T细胞急性淋巴细胞白血病(preT-ALL)的个体。在进一步的实施例中，所述h2H12抗体被用于治疗CD33阳性preT-ALL的个体。在一个实施例中，衍生于鼠科动物2H12抗体的人源化抗体被用于治疗CD33阳性多发性骨髓瘤(MM)的个体。在进一步的实施例中，所述h2H12抗体被用于治疗CD33阳性MM的个体。在一个实施例中，衍生于鼠科动物2H12抗体的人源化抗体被用于治疗CD33阳性包括肥大细胞白血病和肥大细胞肉瘤的肥大细胞病个体。在进一步的实施例中，所述h2H12抗体被用于治疗CD33阳性包括肥大细胞白血病和肥大细胞肉瘤的肥大细胞病个体。
所述CD33抗体可为例如，非共轭抗体或共轭抗体(例如CD33抗体药物共轭物)。在一些实施例中，所述抗CD33抗体可为人源化或嵌合2H12抗体。在一些实施例中，所述抗CD33抗体可为与特异性地结合CD33的鼠科动物、人源化或嵌合2H12抗体竞争的抗体。
衍生于鼠科动物2H12抗体的CD33抗体(包括嵌合抗体或人源化抗体(如h2H12))可与治疗剂共轭并用于治疗患有CD33阳性癌症的个体。治疗剂的实例在此被提供，包括活性治疗剂(例如阿里他汀(auristatins))和高活性治疗剂(例如PBDs)。与活性治疗剂共轭的h2H12抗体，即h2H12抗体-药物共轭物(ADC)可被用于治疗患有CD33阳性癌症的个体。与阿里他汀(auristatin)共轭的h2H12抗体可用于治疗患有CD33阳性癌症的个体。与高活性治疗剂共轭的h2H12抗体可用于治疗患有CD33阳性癌症的个体。与PBD共轭的h2H12抗体可用于治疗患有CD33阳性癌症的个体。
在蛋白质增加性地表达后一些癌细胞对治疗剂产生抗性，这增加了治疗剂向癌细胞外流出。这样的蛋白包括p-糖蛋白(P-glycoprotein)、多药耐药相关蛋白(multidrug resistance-associated protein)、肺耐药相关蛋白(lungresistance-related protein)和乳腺癌耐药蛋白(breast cancer resistance protein)。癌细胞中耐药性的检测可由本领域技术人员进行。检测流出蛋白的抗体或分析物(assays)购自例如Promega公司、Millipore公司、Abcam公司和Sigma-Aldrich公司。在一个实施例中，衍生于鼠科动物2H12抗体的抗体被用于治疗多药耐药性癌症(multi-drug resistant cancer)(例如CD33阳性多药耐药性癌症(CD33-positive multi-drug resistant cancer))的个体。在另一个实施例中，衍生于鼠科动物2H12抗体的人源化抗体被用于治疗多药耐药性癌症(例如CD33阳性多药耐药性癌症)的个体。在一个实施例中，h2H12抗体被用于治疗多药耐药性癌症(例如CD33阳性多药耐药性癌症)的个体。在进一步的实施例中，h2H12ADC被用于治疗多药耐药性癌症(例如CD33阳性多药耐药性癌症)的个体。在另一个实施例中，与高活性治疗剂共轭的h2H12抗体被用于治疗多药耐药性癌症(例如CD33阳性多药耐药性癌症)的个体。在另一个实施例中，与PBD共轭的h2H12抗体被用于治疗多药耐药性癌症(例如CD33阳性多药耐药性癌症)的个体。在进一步的实施例中，与PBD共轭的h2H12抗体被用于治疗CD33阳性粒细胞白血病(AML)。
衍生于鼠科动物2H12抗体的人源化或嵌合抗体(单独或其药物共轭物)以有效给药方案(in an effective regime)被施用，所述有效给药方案表示推迟癌症的发生、减少癌症的严重性、抑制癌症的进一步恶化、及/或改善癌的至少一种征候或症状(sign or symptom)的剂量、给药途径及给药频率。若病患已经遭受癌症，该方案可指治疗性有效方案。若该病患相比于一般大众具有较高的幻癌症风险但尚未出现症状，则该方案可指预防性有效方案。在一些实例中，治疗性或预防性的疗效可在一个个体患者上相比历史对照或过去经验(相同患者)而被观察。在其他实例中，治疗性或预防性的疗效可对经受治疗的患者群体在临床前或临床试验中证明(相比于未经治疗的对照群体)。
单克隆抗体的示范性剂量为0.1mg/kg至50mg/kg(每公斤病患体重)、更典型为1mg/kg至30mg/kg、1mg/kg至20mg/kg、1mg/kg至15mg/kg、1mg/kg至12mg/kg、或1mg/kg至10mg/kg、或2mg/kg至30mg/kg、2mg/kg至20mg/kg、2mg/kg至15mg/kg、2mg/kg至12mg/kg、或2mg/kg至10mg/kg、或3mg/kg至30mg/kg、3mg/kg至20mg/kg、3mg/kg至15mg/kg、3mg/kg至12mg/kg、或3mg/kg至10mg/kg。活性单克隆抗体或其抗体药物共轭物的示范性剂量为1mg/kg至7.5mg/kg,或2mg/kg至7.5mg/kg或3mg/kg至7.5mg/kg(每公斤个体体重)，或0.1-20,或0.5-5mg/kg(每公斤体重)(例如0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mg/kg)、或10至1500或200至1500mg的固定剂量。高活性单克隆抗体药物共轭物(例如PBDs)的示范性剂量为1.0μg/kg至1.0mg/kg或1.0μg/kg至500.0μg/kg(每公斤个体体重)。在一些方法中，所述病患被施用所述抗体或ADC每二、三或四周一次。该剂量取决于给药频率、病患状态、对先前治疗的反应(若有的话)、是预防性的还是治疗性的治疗、是急性的还是慢性的疾病等其他因素。
给药可为非经肠、经静脉、经口、皮下、动脉内、颅内、脊椎鞘内(intrathecal)、腹膜内、外用(topical)、鼻内或肌肉内。给药也可被直接集中至肿瘤内。由静脉内或皮下给药至系统性循环内是优选的。静脉内给药可由例如在30至90分钟期间输注或由单次快速浓注(single bolus injection)。
给药频率取决于所述抗体或抗体-药物共轭物在循环中之半衰期、病患的状况及给药途径等其他因素。该频率可为每天、每周、每月、每季或根据患者状况的改变或被治疗的癌症的进展而在不规则的间隔给药。示范性静脉给药的频率是在一个连续治疗疗程中介于每周二次至每季一次，虽然更高或更低频率的给药也是可能的。其他示范性静脉给药的频率是在一个连续治疗疗程中介于每周一次至每月一次，虽然更高或更低频率的给药也是可能的。以皮下给药而言，示范性给药频率是每天至每月一次，虽然更高或更低频率的给药也是可能的。
给药的剂量数(number of dosages administered)取决于所述癌症的特性(例如是否出现急性或慢性症状)及对于治疗的失调反应。以急性疾病或慢性疾病的急性发作而言，介于1至10个剂量通常足够。有时单次快速浓注(可任意选择地，以分开的形式)足以用于急性疾病或慢性疾病的急性发作。治疗可重复用于急性疾病或急性发作的复发。以慢性疾病而言，抗体可以规律的间隔给药，例如每周、隔周、每月、每季、每六个月一次至少1、5或10年或患者终生。用于非经肠给药的药物组合物优选地无菌、实质上等渗性，且在GMP条件下制造。药物组合物可以单位剂量形式提供(即用于单次给药的剂量)。药物组合物可利用一或多种生理上可接受的载剂、稀释剂、赋形剂或助剂被配方(be formulated)。所述剂型(formulation)取决于所选择的给药途径。以注射而言，抗体可被配方于水性溶液，优选地，生理上可相容的缓冲液，如汉氏(Hanks’s)溶液、林格氏(Ringer’s)液或生理盐水或醋酸缓冲液(以减少注射部位的不适)。所述溶液可包含配方剂(formulatory agents)诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。选择性地，抗体可呈冻干形式，以供其使用前与适当载体例如无菌的无热原水(sterilepyrogen-free water)构造。抗体于液体剂型中的浓度可为例如0.1至10mg/ml，如1.0mg/ml。
本发明的抗体治疗可与化学疗法、放射线、干细胞治疗、手术及其他能有效对抗该被治疗疾病的治疗组合使用。其他可与抗CD33人源化抗体一起被给药的药剂的有用类别包括：例如与癌性细胞上表达的其他受体结合的抗体、抗微管蛋白剂(例如auristatins)、DNA小沟结合剂(例如PBDs)、DNA复制抑制剂、烷基化剂(例如铂复合物，如顺铂(cisplatin)、单(铂)、二(铂)及三核铂复合物(tri-nuclear platinum complexes)及卡铂(carboplatin))、蒽环类(anthracycline)、抗生素、抗叶酸剂、抗代谢物、化学疗法致敏剂、双联霉素(duocarmycin)、依扥泊苷(etoposide)、氟化嘧啶、离子载体、莱克西托素(lexitropsin)、亚硝基尿素、普拉汀诺(platinol)、预先形成化合物(pre-forming compounds)、嘌呤抗代谢物、嘌呤霉素(puromycin)、放射致敏剂、类固醇、紫杉烷、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱及类似物。
使用衍生于鼠科动物2H12抗体的抗体(例如，嵌合抗体、人源化抗体或所述h2H12抗体)来治疗(任选地，与上述其他药剂或方案的任何一种单独组合或作为抗体药物共轭物)，相比较于给予相同治疗(例如化学治疗)却不给予衍生于鼠科动物2H12抗体的抗体(单独或作为抗体-药物共轭物)，可增加肿瘤(例如ALL、CML、CMML)患者特别是复发或顽固性患者的中位无进展存活期(median progression-free survival tine)或整体存活期(overall survival time)至少30％或40％，但优选地50％、60％至70％或甚至100％或更久。此外或选择性地，使用包括衍生于鼠科动物2H12抗体的抗体(单独或作为抗体-药物共轭物)来治疗(例如标准化学治疗)，相比较于不包括衍生于鼠科动物2H12抗体的抗体的相同治疗(例如化学治疗)，可增加至少30％或40％但优选地50％、60％至70％或甚至100％的肿瘤患者的完全反应率、部分反应率、或客观反应率(完全+部分)。
通常，在临床试验中(例如第II、II/III或III期试验)，前述使用标准治疗加上衍生于鼠科动物2H12抗体的抗体治疗的病患的中位无进展存活期和/或反应率的增加，相比较于单独接受标准治疗的对照组患者(或加上安慰剂)，在统计上是显著的，例如p＝0.05或0.01或甚至0.001。完全及部分反应率由惯用于癌症临床试验中的客观标准决定，例如由美国国家癌症研究所和/或食品药物管理局列示或接受的标准。
Ⅷ.其他应用
此处公开的所述抗CD33抗体可在临床诊断、临床治疗或研究中被用于检测CD33。在癌症中CD33的表达显示该癌症可由本发明的抗体来治疗。所述抗体亦可被出售作为实验室研究的研究试剂以检测带有CD33的细胞及其对各种刺激的反应。在所述用途中，单克隆抗体可以被荧光分子、自旋标记分子(spin-labeled molecules)、酶或放射性同位素标记，且可以试剂盒的形式提供(其还含有其他执行CD33分析所需的所有必要试剂)。
此处所描述的抗体，m2h12及其嵌合或人源化形式(例如h2H12)可被用于检测CD33蛋白质的表达及决定癌症是否可利用CD33ADCs治疗。举例来说，鼠科动物m2h12及其嵌合或人源化形式(例如h2H12)可被用于检测CD33蛋白质在淋巴细胞(lymphocytes)，淋巴母细胞(lymphoblasts)，单核细胞(monocytes)，髓单核细胞(myelomonocytes)或其他表达CD33的细胞中的表达。该抗体也可被用于纯化CD33，例如在亲和性层析中。
本发明的任何功能，步骤，元件，实施例可以结合任何其他使用，除非另有说明。虽然本发明已经通过图示和实施例描述了本发明的一些细节，以便于清楚和理解，很明显实施某些变化和某些修改也是在权利要求保护范围之内的。
实施例
抗CD33抗体的产生
材料
下列实施例中描述的细胞系维持于培养状态(maintained in culture)，根据美国菌种保存中心(American Type Culture Collection,ATCC)(马纳萨斯,VA)或德国布朗斯威克德国微生物菌种保藏中心(DMSZ)(布伦瑞尔，德国)所指明的条件。
原代AML细胞维持在伊思柯夫改良培养基(Iscove’s Modified Dulbecco’smedium，IMDM)中，IMDM包含20％热灭活的FBS，并用浓度均为25ng/ml的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage-colony-stimulatingfactor，GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(granulocyte-colony-stimulating factor，G-CSF)、白细胞介素-3(interleukin-3，IL-3)和干细胞因子(stem cell factor，SCF)补充。细胞培养试剂源自Invitrogen公司(卡尔斯巴德市，CA)且细胞因子购自PeproTech公司(洛杉矶，NJ)。
方法
饱和结合试验
将1×105个CD33阳性细胞(HL-60、HEL 92.1.7和HEK-293F细胞转染以表达人或猕猴的CD33)转移至96孔板中。经AlexaFluor-647标记的CD33单克隆抗体以50nM至0.85pM的浓度被加入并且所述细胞在冰上孵育30min。细胞经离心形成团块，以PBS+1％BSA溶液清洗三次并重悬浮于125μL PBS+1％BSA中。以流式细胞仪分析荧光，使用饱和荧光信号百分比来测定结合百分比(percent bound)，接着计算表观Kd。
竞争结合试验
将1×105个CD33阳性细胞转移至96孔板并用经1nM AlexaFluor-647标记的m2H12及渐增浓度(从0.03nM至600nM)的未经标记的混合、人源化或嵌合2H12单克隆抗体在冰上孵育1h。
离心细胞，以PBS清洗三次，并以125μL的PBS+1％BSA溶液重悬。以流式细胞仪分析荧光，使用饱和荧光信号百分比来测定被结合的带标记2H12单克隆抗体百分比。接着将该数据带入不同斜率的S形剂量反应曲线(sigmoidaldose-response curve)以推断出EC50。
细胞毒性试验
AML细胞系或原代AML细胞与CD33特异性单克隆抗体和抗体药物共轭物(ADC)于37℃中一起培养96小时。在一些试验中，非抗原结合性ADC被用来作为阴性对照。细胞系的细胞存活性(cell viability)使用CelltiterGlo(Promega公司,Madison,WI)根据制造商的说明来测定。细胞于室温下用CelltiterGlo试剂孵育25min并且荧光信号由Fusion HT荧光孔盘读取仪(珀金埃尔默(Perkin Elmer)公司，麻州瓦尔珊(Waltham,MA))上测量。对于原代AML细胞，存活性由流式细胞仪测定并使用膜联蛋白V(Annexin V)和碘化丙啶染色。
结果以IC50报告，即相比于经载体处理的细胞(对照＝100％)要产生存活性减少50％所需的化合物的浓度。
制备抗体药物共轭物
CD33抗体的抗体药物共轭物的制备如US20050238649和WO2011/130613中所述，使用此处描述的抗CD33抗体制备。药物连接子SGD-1269(mcMMAF)于US20050238649中描述并且药物连接子SGD-1910于WO2011/130613中描述。IgG1单克隆抗体的半胱氨酸突变体的制备通常于US20100158909中描述。所述药物连接子SGD-1269与所述抗CD33抗体h2H12通过链间二硫键的半胱氨酸残基的巯基(thiol group of a cysteine residue of an interchain disulfide bond)共轭且平均载药量为每抗体4个药物(4drugs per antibody)。所述药物连接子SGD-19109与所述抗CD33抗体h2H12通过半胱氨酸残基(在所述抗体的IgG1链的位点239被引入)的巯基共轭且所述平均载药量为约每抗体2个药物(2drugs per antibody)。239位点上是半胱氨酸的抗体携带指定EC，例如h2H12EC或h00EC。
活体内(In Vivo)活性试验
弥散性AML模型
CB-17/IcrHsd-PrkdcSCID(SCID)小鼠在尾静脉被静脉接种5x106HL-60肿瘤细胞。肿瘤接种后一天，小鼠(n＝8/组)不被处理或每四天一次进行腹膜内注射CD33单克隆抗体和ADC或非结合对照单克隆抗体和ADC共计两剂量(twodoses)。在这个吉妥珠单抗敏感的AML模型(Mylotarg-sensitive AML model)中，每七天一次进行腹膜内注射吉妥珠单抗(Mylotarg)共计两剂量被引入作为阳性对照。当体重损失≥20％或小鼠显示出信号：即弥散性疾病表现为中枢神经系统症状(包括颅骨的肿胀和/或后肢麻痹，或可触及的弥散性肿瘤块发展)时，动物被安乐死。
皮下AML模型
SCID小鼠被皮下植入5x106HL-60或TF1-αAML肿瘤细胞。肿瘤的生长用游标卡尺监测且平均肿瘤体积使用公式(0.5x[长度x宽度2])计算。当所述平均肿瘤体积到达约100mm3时，小鼠(n＝6-7/组)不被处理或腹膜内注射单剂量(single dose)CD33ADC或非结合对照ADC。对于HL-60模型，在施用治疗抗体之前，小鼠用人IVIg(单次腹膜内注射10mg/kg)处理约4小时，以最小化测试ADC与AML细胞上的Fc受体的相互作用。当肿瘤体积到达约1000mm3时安乐死小鼠。所有动物试验根据获得实验动物管理评鉴及认证协会认可的机构中的实验动物照顾及使用委员会所核准的程序实施。
结果
1.产生小鼠CD33单克隆抗体
直接对抗人CD33抗原的抗体产生于用重组人CD33-Fc融合蛋白免疫的Balb/c小鼠中。所述小鼠单克隆抗体2H12(m2H12)基于对人CD33和食蟹猴CD33的结合亲和性被选择，以允许在非人灵长类动物中进行临床前试验。
2.设计及测试人源化抗体
人源化抗体衍生于所述小鼠2H12抗体。9条人源化重链(HA-HI)和7条人源化轻链(LA-LG)被制备，在不同位点引入回复突变(见，图1A,B序列比对和表1-4)。
表1重链变异体(Heavy Chain Variants)中的人源化突变
表2轻链变异体(Light Chain Variants)中的人源化突变
VL变异体 VL外显子受体序列 供体框架残基
hVLA VL1-16 无
hVLB VL1-16 L3
hVLC VL1-16 L46
hVLD VL1-16 L69
hVLE VL1-16 L71
hVLF VL1-16 L20,L22
hVLG VL1-16 L22,L46,L69,L71
表32H12重链变异体的特异性突变
*小鼠残基
表42H12轻链变异体的特异性突变
*小鼠残基
人源化重链和轻链分别与嵌合轻链和重链(嵌合链由鼠科动物可变区和人恒定区组成)配对。该CD33单克隆抗体的人源化/嵌合混合变异体(hybridvariants)与人CD33(被表达于HEL 92.1.7AML细胞的表面)的结合被测试(表5)。重链HC和HI被选择以作进一步研究。人源化抗体是表达的代表性排列组合(人源化重链HC和HI和人源化轻链LA,LE和LG)并且其与表达人或食蟹猴(cyno)CD33细胞的结合被测定(表6)。HILG抗体(2H12HILG)被选作最接近鼠科动物CD33单克隆抗体m2H12的结合特性的人源化抗体。所述HILG抗体被称为h2H12抗体(人源化2H12抗体)。m2H12、h2H12和在所述IgG1重链有S239C突变(EU编码)的h2H12(称为h2H12EC，对于改造的半胱氨酸)对于人CD33(在两个AML细胞系中表达为内源性蛋白或在HEK293F细胞系中表达为重组蛋白)的KD被测定。这些抗体对猕猴CD33(在HEK293F细胞系中表达为重组蛋白)的KD也被测定(表7)。
表5对表达CD33的HEL9217AML细胞上的嵌合-人源化混合CD33单克隆抗体变异体的EC50结合测定
DNB,无结合；m,小鼠；cH,嵌合重链；cL,嵌合轻链
表6人CD33和猕猴CD33表达细胞上的人源化CD33单克隆抗体变异体的EC50结合测定
表7人源化CD33单克隆抗体对人和猕猴CD33表达细胞的亲和性测定
HL-60 HEL9217 HEK293F-人CD33 HEK293F-猕猴CD33
m2H12 0.144 0.170 ND 2.718
h2H12 0.208 0.161 0.958 1.218
h2H12EC 0.253 0.204 1.000 5.128
ND,未做。
h2H12ADC的活体外抗肿瘤活性
h2H12抗体-药物共轭物的细胞毒性活性(cytotoxic activiy)使用两个药物连接子系统，SGD-1269(阿里他汀药物连接子(auristatin drug-linker))和SGD-1910((吡咯苯二氮二聚体药物连接子(pyrrolobenzodiazapine dimerdrug-linker))来测定。使用非共轭抗体(h2H12-ADCs和不与CD33结合的对照ADCs)针对两个CD33阳性AML细胞系(HL-60和HEL 92.1.7)的细胞毒性分析被进行。如图2所示，h2H12和h2H12EC(也称为h2H12d)非共轭抗体对任一细胞系均无毒性活性。类似地，非结合对照ADCs(h00EC-SGD-1910和h00-SGD-1269)不具细胞毒性。相反，h2H12EC-SGD-1910对于HL-60(IC50～1.6ng/mL)和HEL 92.1.7(IC50～12.9ng/mL)具有细胞毒性。在HL-60细胞上，h2H12EC-SGD-1910的活性与吉妥珠单抗(一种被很好地描述了的抗CD33定向抗体药物共轭物)的活性类似并且当对抗HEL 92.1.7(一种多药抗药(MDR)细胞系)时更有效，而吉妥珠单抗对HEL 92.1.7是无效的。m2H12-SGD-1269和h2H12-SGD-1269对HL-60细胞(IC50分别为1.3ng/mL和5.3ng/mL)有毒性活性并且对HEL 92.1.7具有较小程度的毒性活性(图2)。在单独的试验中，h2H12-SGD-1269和h2H12EC-SGD-1910针对CD33阳性AML细胞系的扩展板(expanded panel)被进一步测试。如表8所示，h2H12-SGD-1269对7个AML细胞系(对响应细胞系的平均IC50为72.8mg/mL)中的4个具有活性，且h2H12EC-SGD-1910对7个AML细胞系(平均IC50，20.4ng/mL)中的7个均具有有效活性。h2H12EC-SGD-1910比吉妥珠单抗更有效，吉妥珠单抗对于8个CD33阳性AML细胞系中的3个具有活性。当ADCs针对非AML源且不表达CD33的3个细胞系测试时，未观察到活性(表8)。这些数据共同证明了所述h2H12和h2H12EC抗体药物共轭物选择性地靶向(target)CD33阳性细胞并对这些细胞显示出细胞毒性活性。
表8h2H12药物共轭物和吉妥珠单抗对AML细胞系的活体外活性
MDR,多药耐药性(multi-drug resistance)；+,染料外排>2倍以上背景；NT,未测试
h2H12ADC的活体内抗肿瘤活性
h2H12-SGD-1269的活性在模型(其中HL-60AML细胞系被引入SCID小鼠内以引发弥散性疾病)中被测定。第二天，用h2H12抗体、非特异性IVIg阴性对照体、h2H12-SGD-1269、非结合对照ADC(hBU12-SGD-1269)或吉妥珠单抗根据表9中所述的剂量和时间安排处理小鼠。HL-60接种小鼠的中位生存期(median survival)从未处理组或人IVIg处理组的22天增长至分别接受h2H12(3mg/kg)和1或3mg/kg h2H12-SGD-1269的组的29天(p＝0.007)、41天(p＝0.001)和52days(p<0.001)(表9)。h2H12EC-SGD-1269延长了生存期类似于注射h2H12-SGD-1269的小鼠的生存期延长(中位生存期分别为50天和52天)。吉妥珠单抗在这个MDR阴性模型中也是有效的，高于50％的吉妥珠单抗处理后的小鼠存活至该99天研究的最后。相比于未处理的对照小鼠，非共轭抗体h2H12或非结合对照ADC(hBU12-SGD-1269)处理后的小鼠的存活期被延长了6-7天，但相比于CD33靶向ADC(CD33-targeted ADC)处理后的小鼠，延长程度则低得多。
表9h2H12-SGD-1269药物共轭物在弥散性HL-60AML异种移植模型中的活性
剂量(mg/kg) 剂量时间 中位生存期(天) P值
未处理组 --- --- 22 ---
hIVIg 3 4天一次,2剂量 22 NS1
h2H12 3 4天一次,2剂量 29 0.0072
h2H12-SGD-1269 1 4天一次,2剂量 41 0.0013
h2H12-SGD-1269 3 4天一次,2剂量 52 <0.0013
h2H12EC-SGD-1269 3 4天一次,2剂量 50 <0.0013
hBU12-SGD-1269 3 4天一次,2剂量 28 <0.0012
吉妥珠单抗 3 7天一次,2剂量 NR <0.0012
1相对于未处理组测试
2相对于hIVIg组测试
3相对于hBU12-SGD-1269组测试(非结合对照ADC)
NS,不显著；NR,未达到；---,不适用；hIVIG,人体静脉注射免疫球蛋白；hBU12-SGD-1269,非结合对照ADC。
h2H12EC-SGD-1910的活性在两个皮下AML异种移植模型(HL-60和TF1-)中被测试。承受建立(～100mm3)肿瘤的SCID小鼠被注射h2H12EC-SGD-1910或非结合对照ADC(h00EC-SGD-1910)(如表10中所述的HL-60模型和表11中的TF1-肿瘤模型)。相比于未处理小鼠和非结合对照ADC处理小鼠，用h2H12EC-SGD-1910处理显著减少了肿瘤生长(通过测定肿瘤体积翻两番的中位时间)(表10和11)。观察到的CD33靶向ADC(CD33-targetedADC)的抗肿瘤活性具有剂量依赖性。对于HL-60肿瘤，0.1mg/kg的单剂量导致了6只处理小鼠中的6只的肿瘤完全和持久性消退。较低的剂量0.03mg/kg导致了6只处理小鼠中的1只完全消退，并且将肿瘤翻两番(tumor quadrupling)的时间延长至20天，相较于未处理小鼠和相似剂量的非结合对照ADC(h00d-SGD-1910)处理的小鼠的15天。在MDR阳性TF1-α肿瘤模型(表11)中，单剂量0.3mg/kg的h2H12EC-SGD-1910导致7只处理小鼠中的5只的肿瘤完全和持久性消退。肿瘤翻两番的中位期在117天的研究结束时尚未达到。相反，用非结合对照ADC(h00EC-SGD-1910)相似注射的小鼠中的肿瘤在27天体积已翻了两番。同样，相比于未处理小鼠或h00EC-SGD-1910处理的小鼠，注射0.1mg/kg或0.03mg/kg h2H12EC-SGD-1910的小鼠的肿瘤翻两番的中位期明显更长(p＝0.0001)。吉妥珠单抗在TF1-肿瘤模型中不具活性。吉妥珠单抗处理的小鼠的肿瘤生长相较于未处理小鼠没有差异。综上可知，数据证明h2H12-ADC显示在AML异种移植模型中的抗肿瘤活性具有剂量依赖性并且相较于非靶向ADC(non-targeted ADC)明显更高。
表10h2H12EC-SGD-1910药物共轭物在皮下HL-60AML异种移植模型中的活性
NS,不显著；NR,未达到；---,不适用；hIVIg,人体静脉注射免疫球蛋白(在注射ADC之前，施用4小时)；h00EC-SGD-1910,非结合对照ADC；DCR,持久性完全缓解(在50天的研究结束时没有可测量的肿瘤)
表11h2H12EC-SGD-1910药物共轭物在皮下TF1-AML异种移植模型中活性
NS,不显著；NR,未达到；---,不适用；h00EC-SGD-1910,非结合对照ADC；DCR,持久性完全缓解(在117天的研究结束时没有可测量的肿瘤)

Claims (50)

1.一种与人CD33蛋白特异性结合的分离的抗体，其中所述抗体包括三个重链互补性决定区(CDRs)：由SEQ ID NO:19组成的重链CDR1、由SEQ ID NO:20组成的重链CDR2和由SEQ ID NO:21组成的重链CDR3；所述抗体还包括三个轻链CDRs：由SEQ ID NO:22组成的轻链CDR1、由SEQ ID NO:23组成的轻链CDR2和由SEQ ID NO:24组成的轻链CDR3。
2.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体选自鼠科动物抗体、嵌合抗体和人源化抗体。
3.根据权利要求2所述的抗体，其中所述抗体是人源化2H12抗体。
4.根据权利要求3所述的人源化抗体，其中所述抗体包括成熟重链可变区和成熟轻链可变区，所述成熟重链可变区具有与SEQ ID NO:18至少90％一致性的氨基酸序列，且其中位点H48被I占据，位点H66被K占据，位点H67被A占据，位点H69被L占据，位点H71被A占据，位点H94被S占据，所述成熟轻链可变区具有与SEQ ID NO:8至少90％一致性的氨基酸序列，且其中位点L22被N占据，位点L46被T占据，位点L69被Q占据，位点L71被Y占据，所述位点由Kabat编码系统确定。
5.根据权利要求3所述的人源化抗体，其包括成熟重链可变区和成熟轻链可变区，所述成熟重链可变区具有与SEQ ID NO:18至少95％一致性的氨基酸序列，且所述成熟轻链可变区具有与SEQ ID NO:8至少95％一致性的氨基酸序列。
6.根据权利要求3所述的人源化抗体，其中所述成熟重链可变区与重链恒定区融合，且所述成熟轻链可变区与轻链恒定区融合。
7.根据权利要求3所述的人源化抗体，其中所述重链恒定区是天然人恒定区的突变形式，相比于所述天然人恒定区，所述天然人恒定区的突变形式与Fcγ受体的结合减少。
8.根据权利要求2所述的人源化抗体，其中所述重链恒定区是IgG1同种型。
9.根据权利要求3-6中任一项所述的人源化抗体，其中所述重链恒定区具有包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列，且所述轻链恒定区具有包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列。
10.根据权利要求3所述的人源化抗体，其中所述重链恒定区具有包含SEQID NO:29(S239C)的氨基酸序列，且所述轻链恒定区具有包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列。
11.根据权利要求3所述的人源化抗体，其中所述成熟重链可变区具有被指定为SEQ ID NO:18的氨基酸序列，且所述成熟轻链可变区具有被指定为SEQID NO:8的氨基酸序列。
12.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体与细胞毒性剂或细胞抑制剂共轭。
13.根据权利要求12所述的抗体，其中所述抗体与细胞毒性剂共轭。
14.根据权利要求13所述的抗体，其中所述细胞毒性剂与所述抗体通过可酶切连接子共轭。
15.根据权利要求13或14所述的抗体，其中所述细胞毒性剂是DNA小沟结合剂。
16.根据权利要求13-15中任一项所述的抗体，其中所述细胞毒性剂具有分子式：
17.根据权利要求1所述的抗体，其与人或食蟹猴的CD33的结合常数为0.5x109M-1至2x109M-1。
18.一种治疗患有表达CD33的癌症或有患表达CD33的癌症风险的病患的方法，包括向所述病患施用前述权利要求中任一项的人源化抗体的有效给药方案。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述癌症是急性髓细胞白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(MDS)、急性早幼粒细胞白血病(APL)、慢性髓性白血病(CML)、慢性粒单核细胞白血病(CMML)、慢性骨髓增生性疾病、前体B细胞急性淋巴细胞白血病(preB-ALL)、前体T细胞急性淋巴细胞白血病(preT-ALL)、多发性骨髓瘤(MM)、肥大细胞病或骨髓性肉瘤。
20.一种药物组合物，其包含权利要求1的人源化抗体或嵌合抗体。
21.一种人源化抗体，其包含成熟重链可变区和成熟轻链可变区，所述成熟重链可变区具有与HI(SEQ ID NO:18)至少90％一致性的氨基酸序列，所述成熟轻链可变区具有与LG(SEQ ID NO:8)至少90％一致性的氨基酸序列。
22.根据权利要求21所述的人源化抗体，其包含成熟重链可变区和成熟轻链可变区，所述成熟重链可变区具有与HI至少95％一致性的氨基酸序列，所述成熟轻链可变区具有与LG至少95％一致性的氨基酸序列。
23.根据权利要求21或22所述的人源化抗体，其中位点H94被S占据。
24.根据权利要求21或22所述的人源化抗体，其中位点H48、H66、H67、H69、H71和H94被I、K、A、L、A和S占据，且位点L22、L46、L69和L71被N、T、Q和Y占据。
25.根据权利要求21-24中任一项所述的人源化抗体，其中所述成熟重链可变区的可变区框架与SEQ ID NO:18的可变区框架之间的任何差异选自由以下类型构成的组：由I占据的位点H48、由K占据的位点H66、由A占据的位点H67、由L占据的位点H69、由A占据的位点H71、由S占据的位点H94；且成熟轻链可变区的可变区框架与SEQ ID NO:8的可变区框架之间的任何差异选自由以下类型构成的组：由N占据的位点L22、由T占据的位点L46、由Q占据的位点L69和由Y占据的位点L71。
26.根据权利要求21-25中任一项所述的人源化抗体，其中所述成熟重链可变区的3个CDRs是SEQ ID NO:18的3个CDRs，且所述成熟轻链可变区的3个CDRs是SEQ ID NO:8的3个CDRs。
27.根据权利要求21-26中任一项所述的人源化抗体，其中所述成熟重链可变区与重链恒定区融合，且所述成熟轻链可变区与轻链恒定区融合。
28.根据权利要求21-27中任一项所述的人源化抗体，其中所述重链恒定区是天然人恒定区的突变形式，相比于所述天然人恒定区，所述天然人恒定区的突变形式与Fcγ受体的结合减少。
29.根据权利要求21-28中任一项所述的人源化抗体，其中所述重链恒定区是IgG1同种型。
30.根据权利要求21-27或29中任一项所述的人源化抗体，其中所述重链恒定区具有包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列，且所述轻链恒定区具有包含SEQID NO:25的氨基酸序列。
31.根据权利要求21-27或29中任一项所述的人源化抗体，其中所述重链恒定区具有包含SEQ ID NO:29(S239C)的氨基酸序列，且所述轻链恒定区具有包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列。
32.根据权利要求21-31中任一项所述的人源化抗体，其中SEQ ID NO:18的成熟重链可变区的CDRs的任何差异位于位点H60-H65。
33.根据权利要求21-32中任一项所述的人源化抗体，其中所述成熟重链可变区具有包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，且所述成熟轻链可变区具有包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
34.根据权利要求21-33中任一项所述的人源化抗体，其中所述抗体与细胞毒性剂或细胞抑制剂共轭。
35.根据权利要求34所述的人源化抗体，其中所述抗体与细胞毒性剂共轭。
36.根据权利要求35所述的人源化抗体，其中所述细胞毒性剂与所述抗体通过可酶切连接子共轭。
37.根据权利要求35或36所述的人源化抗体，其中所述细胞毒性剂是DNA小沟结合剂。
38.根据权利要求34-37中任一项所述的人源化抗体，其中所述细胞毒性剂具有分子式：
39.一种人源化抗体，其包含成熟重链可变区和成熟轻链可变区，所述成熟重链可变区包含SEQ ID NO:18的3个CDRs，且其中位点H48、H66、H67、H69、H71和H94分别被I、K、A、L、A和S占据，所述成熟轻链可变区包含SEQ ID NO:8的3个CDRs，且其中位点L22、L46、L69和L71分别被N、T、Q和Y占据。
40.根据权利要求39所述的人源化抗体，其与人或食蟹猴的CD33的结合常数是0.5x109M-1至2x109M-1。
41.一种核酸，其编码权利要求1-17或权利要求21-40中任一项定义的成熟重链可变区和/或成熟轻链可变区。
42.一种治疗患有癌症或有患癌风险的病患的方法，包括向所述病患施用权利要求21-40中任一项所述人源化抗体的有效给药方案。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述癌症是急性髓细胞白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(MDS)、急性早幼粒细胞白血病(APL)、慢性髓性白血病(CML)、慢性粒单核细胞白血病(CMML)、慢性骨髓增生性疾病、前体B细胞急性淋巴细胞白血病(preB-ALL)、前体T细胞急性淋巴细胞白血病(preT-ALL)、多发性骨髓瘤(MM)、肥大细胞病或骨髓性肉瘤。
44.一种药物组合物，其包含前述权利要求中任一项的人源化抗体。
45.一种治疗患有急性髓细胞白血病(AML)或有患急性髓细胞白血病(AML)风险的病患的方法，包括向所述病患施用权利要求1-17,21-33或39-40中任一项所述人源化抗体的有效给药方案。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述抗体与细胞毒性剂或细胞抑制剂共轭。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述抗体与细胞毒性剂共轭。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述细胞毒性剂与所述抗体通过可酶切连接子共轭。
49.根据权利要求47或48所述的方法，其中所述细胞毒性剂是DNA小沟结合剂。
50.根据权利要求47-49中任一项所述的方法，其中所述细胞毒性剂具有分子式：
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