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KR102241478B1 - Ｃｄ33 항체 및 암을 치료하기 위한 이의 용도 - Google Patents

Ｃｄ33 항체 및 암을 치료하기 위한 이의 용도 Download PDF

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KR102241478B1
KR102241478B1 KR1020207010113A KR20207010113A KR102241478B1 KR 102241478 B1 KR102241478 B1 KR 102241478B1 KR 1020207010113 A KR1020207010113 A KR 1020207010113A KR 20207010113 A KR20207010113 A KR 20207010113A KR 102241478 B1 KR102241478 B1 KR 102241478B1
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모린 리안
장고 서스만
패트릭 버크
스코트 제프리
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씨젠 인크.
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Abstract

본 발명은 CD33에 특이적으로 결합하는 뮤린, 키메라, 및 인간화 항체를 제공한다. 상기 항체는 다양한 암의 치료 및 진단 뿐만 아니라 CD33을 검출하는데 유용하다.

Description

ＣＤ33 항체 및 암을 치료하기 위한 이의 용도{CD33 ANTIBODIES AND USE OF SAME TO TREAT CANCER}
관련 출원의 교차-참조
본 출원은 2013년 3월 14일 출원된 13/804,227호의 계속 출원이며, 2012년 5월 18일 출원된 미국 가특허출원 61/649,110호의 이익을 주장한다.
CD33은 시알산에 결합하는 67 kDa 형질막 단백질이고 단백질의 시알산-결합 Ig-관련 렉틴 (SIGLEC) 패밀리의 일원이다. CD33은 골수 세포 상에서 발현되는 것으로 알려져 있다. CD33 발현은 또한 다수의 악성 세포에 대해 보고되어 왔다. 비록 CD33이 급성 골수성 백혈병과 같은 암의 치료를 위해 표적화되었으나, 어떠한 효과적인 CD33-표적화 치료제도 현재 시판되지 않는다. 본 발명은 상기 및 그 밖의 문제들을 해소한다.
청구된 발명의 개요
인간 CD33 단백질에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 및 CD33 단백질을 발현시키는 암을 치료하기 위해 상기 항체를 이용하는 방법이 본원에서 제공된다. 모노클로날 항체는 중쇄 가변 영역에 SEQ ID NO: 19, 20 및 21의 상보성 결정 영역 (CDR) 및 경쇄 가변 영역에 SEQ ID NO:22, 23, 및 24의 CDR을 함유한다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 CDR은 보존된 아미노산 치환을 갖는다. 일부 구체예에서, 각각 SEQ ID NO: 18 및 8로부터의 성숙 중쇄 가변 영역 및 성숙 경쇄 가변 영역의 CDR에서의 임의의 차이는 위치 H60-H65에 존재한다.
모노클로날 항체는 뮤린 항체, 키메라 항체 또는 인간화 항체일 수 있다. 바람직한 인간화 항체는 본원에 기재된 h2H12 항체이다. 한 양태에서, 본 발명은 중쇄 가변 영역에 SEQ ID NO: 19, 20 및 21의 CDR 및 경쇄 가변 영역에 SEQ ID NO:22, 23, 및 24의 CDR을 포함하고 SEQ ID NO: 18과 적어도 90% 동일성을 지니는 성숙 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 8과 적어도 90% 동일성을 지니는 성숙 경쇄 영역을 추가로 지니는 인간화 항체이다. 추가로, 중쇄의 하기 아미노산 잔기는 유지된다: H48은 I에 의해 점유되고, 위치 H66은 K에 의해 점유되고, 위치 H67은 A에 의해 점유되고, 위치 H69는 L에 의해 점유되고, 위치 H71은 A에 의해 점유되고, 위치 H94는 S에 의해 점유된다; 경쇄의 하기 아미노산 잔기는 유지된다: L22는 N에 의해 점유되고, 위치 L46은 T에 의해 점유되고, 위치 L69는 Q에 의해 점유되고, 위치 L71은 Y에 의해 점유된다. 추가의 구체예에서, 인간화 항체는 중쇄 가변 영역에 SEQ ID NO: 19, 20 및 21의 CDR 및 경쇄 가변 영역에 SEQ ID NO:22, 23, 및 24의 CDR을 포함하고 SEQ ID NO: 18과 적어도 95% 동일성을 지니는 성숙 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 8과 적어도 95% 동일성을 지니는 성숙 경쇄 영역을 추가로 지닌다.
또 다른 구체예에서, 인간화 2H12 항체는 중쇄 불변 영역에 융합된 성숙 중쇄 및 경쇄 불변 영역에 융합된 성숙 경쇄를 지닌다. 추가의 구체예에서, 중쇄 불변 영역은 자연 인간 불변 영역의 돌연변이 형태이고 자연 인간 불변 영역에 비해 Feγ 수용체에 대해 감소된 결합능을 지닌다. 또 다른 구체예에서, 중쇄 불변 영역은 IgG1 아이소형을 지닌다. 예시적인 중쇄 불변 영역 아미노산 서열은 SEQ ID NO:27 및 SEQ ID NO:29를 포함하고, 중쇄 불변 영역은 위치 239에서 세린 대신 시스테인으로 치환된다 (S239C). 예시적인 경쇄 불변 영역 아미노산 서열은 SEQ ID NO:25를 포함한다.
한 구체예에서, 인간화 항체는 SEQ ID NO: 18의 아미노산 서열을 지니는 성숙 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 지니는 성숙 경쇄 가변 영역을 포함한다.
한 구체예에서, 인간화 항체는 세포독성제 또는 세포증식억제제에 컨쥬게이션된다. 추가의 구체예에서, 인간화 항체는 세포독성제에 컨쥬게이션된다. 세포독성제는, 예컨대 DNA 작은 홈 결합제일 수 있다. 피롤로[1,4]벤조디아제핀(PBD)은 본원에 기재된 인간화 CD33 항체에 컨쥬게이션될 수 있는 DNA 작은 홈 결합제인 세포독성제의 예이다. 한 구체예에서, PBD는 효소 분해가능한 링커를 통해 CD33 항체에 컨쥬게이션된다. 또 다른 구체예에서, 세포독성제는 하기 일반식을 갖는다:
Figure 112020036209062-pat00001
상기 식에서, 물결모양 선은 링커로의 부착 부위를 나타낸다.
한 구체예에서, 인간화 항체는 인간 또는 시노몰구스 원숭이 CD33에 대해 0.5 내지 2 x 109 M-1의 결합 상수를 지닌다.
한 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 유효 섭생의 인간화 항체 CD33을 환자에게 투여함에 의해, CD33을 발현시키는 암을 지니거나 지닐 위험이 있는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. CD33-발현 암은 급성 골수성 백혈병 (AML), 골수형성이상 증후군 (MDS), 급성 전골수세포 백혈병 (APL), 만성 골수성 백혈병 (CML), 만성 골수단핵구 백혈병 (CMML), 만성 골수증식성 질병, 전구물질 B-세포 급성 림프모구성 백혈병 (preB-ALL), 전구물질 T-세포 급성 림프모구성 백혈병 (preT-ALL), 다발성 골수종 (MM), 비만세포병, 및 골수성 육종을 포함한다. 한 양태에서, 본 발명은 중쇄 가변 영역에 SEQ ID NO: 19, 20 및 21의 상보성 결정 영역 (CDR) 및 경쇄 가변 영역에 SEQ ID NO:22, 23, 및 24의 CDR을 함유하는 인간화 또는 키메라 항체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
한 양태에서 본 발명은 HI, SEQ ID NO: 18의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 성숙 중쇄 가변 영역, 및 LG, SEQ ID NO:8의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 성숙 경쇄 가변 영역을 지니는 인간화 항체를 제공한다. 추가의 구체예에서, 인간화 항체는 SEQ ID NO: 18과 적어도 95% 동일한 성숙 중쇄 가변 영역, 및 SEQ ID NO: 8과 적어도 95% 동일한 성숙 경쇄 가변 영역을 지닌다. 또 다른 구체예에서, 중쇄 가변 영역의 위치 H48, H66, H67, H69, H71 및 H94는 I, K, A, L, A 및 S에 의해 점유되고, 경쇄 가변 영역의 위치 L22, L46, L69 및 L71은 N, T, Q 및 Y에 의해 점유된다. 일부 구체예에서, 각각 SEQ ID NO. 18 및 8로부터의 성숙 중쇄 가변 영역 및 성숙 경쇄 가변 영역의 CDR에서의 임의의 차이는 위치 H60-H65에 존재한다.
추가의 구체예에서, 인간화 항체는 SEQ ID NO: 18과 동일한 성숙 중쇄 가변 영역의 CDR 및 SEQ ID NO: 8과 동일한 성숙 경쇄 가변 영역의 CDR을 지닌다.
한 구체예에서, 인간화 항체는 SEQ ID NO: 18의 아미노산 서열을 지니는 성숙 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 지니는 성숙 경쇄 가변 영역을 포함한다.
한 구체예에서, 인간화 항체는 세포독성제 또는 세포증식억제제에 컨쥬게이션된다. 한 구체예에서, 인간화 항체는 세포독성제 또는 세포증식억제제에 컨쥬게이션된다. 추가의 구체예에서, 인간화 항체는 세포독성제에 컨쥬게이션된다. 세포독성제는, 예컨대 DNA 작은 홈 결합제일 수 있다. 피롤로[1,4]벤조디아제핀(PBD)은 본원에 기재된 인간화 CD33 항체에 컨쥬게이션될 수 있는 DNA 작은 홈 결합제인 세포독성제의 예이다. 한 구체예에서, PBD는 효소 분해가능한 링커를 통해 CD33 항체에 컨쥬게이션된다. 또 다른 구체예에서, 세포독성제는 하기 일반식을 갖는다:
Figure 112020036209062-pat00002
상기 식에서, 물결모양 선은 링커로의 부착 부위를 나타낸다.
또 다른 구체예에서, 인간화 항체는 인간 또는 시노몰구스 원숭이 CD33에 대해 0.5 내지 2 x 109 M-1의 결합 상수를 지닌다.
또 다른 구체예에서, 인간화 항체는 중쇄 불변 영역에 융합된 성숙 중쇄 및 경쇄 불변 영역에 융합된 성숙 경쇄를 지닌다. 추가의 구체예에서, 중쇄 불변 영역은 자연 인간 불변 영역의 돌연변이 형태이고 자연 인간 불변 영역에 비해 Feγ 수용체에 대해 감소된 결합능을 지닌다. 또 다른 구체예에서, 중쇄 불변 영역은 IgG1 아이소형을 지닌다. 예시적인 중쇄 불변 영역 아미노산 서열은 SEQ ID NO:27 및 SEQ ID NO:29 (S239C)를 포함한다. 예시적인 경쇄 불변 영역 아미노산 서열은 SEQ ID NO:25를 포함한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 성숙 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 중 어느 것을 엔코딩하는 핵산을 제공한다. 중쇄 가변 영역을 엔코딩하는 예시적인 핵산은 SEQ ID NO:39-47을 포함하고; 경쇄 가변 영역을 엔코딩하는 예시적인 핵산은 SEQ ID NO:32-38을 포함한다.
한 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 유효 섭생의 인간화 항체 CD33을 환자에게 투여함에 의해, CD33을 발현시키는 암을 지니거나 지닐 위험이 있는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. CD33-발현 암은 급성 골수성 백혈병 (AML), 골수형성이상 증후군 (MDS), 급성 전골수세포 백혈병 (APL), 만성 골수성 백혈병 (CML), 만성 골수단핵구 백혈병 (CMML), 만성 골수증식성 질병, 전구물질 B-세포 급성 림프모구성 백혈병 (preB-ALL), 전구물질 T-세포 급성 림프모구성 백혈병 (preT-ALL), 다발성 골수종 (MM), 비만세포병, 및 골수성 육종을 포함한다. 인간화 항체는 바람직하게는 약학적으로 적합한 조성물로 투여된다. 일부 구체예에서, 투여되는 인간화 항체는 세포독성제 또는 세포증식억제제에 컨쥬게이션된다. 한 구체예에서, 투여되는 인간화 항체는 세포독성제 또는 세포증식억제제에 컨쥬게이션된다. 추가의 구체예에서, 투여되는 인간화 항체는 세포독성제에 컨쥬게이션된다. 세포독성제는, 예컨대 DNA 작은 홈 결합제일 수 있다. 피롤로[1,4]벤조디아제핀(PBD)은 본원에 기재된 투여되는 인간화 CD33 항체에 컨쥬게이션될 수 있는 DNA 작은 홈 결합제인 세포독성제의 예이다. 한 구체예에서, PBD는 효소 분해가능한 링커를 통해 투여되는 CD33 항체에 컨쥬게이션된다. 또 다른 구체예에서, 세포독성제는 하기 일반식을 갖는다:
Figure 112020036209062-pat00003
상기 식에서, 물결모양 선은 링커로의 부착 부위를 나타낸다.
도면의 간단한 설명
도 1a 및 1b는 인간화 2H12 중쇄 (도 1a) 및 경쇄 가변 (도 1b) 영역을 지니는 부모 뮤린 mAb (m2H12로서 지칭됨)의 아미노산 서열의 정렬을 도시한다.
도 2는 CD33-양성 AML 세포주 HL-60 및 HEL 92.1.7에 대한 2H12-유래된 항체-약물 컨쥬게이트 (ADC)의 활성을 시험하는 시험관내 세포독성 검정의 결과를 도시한다. h2H12d는 SGD-1910에 컨쥬게이션되었고; m2H12 및 h2H12는 SGD-1269에 컨쥬게이션되었다. 비-결합 대조군 ADC (hOOd-SGD-1910 및 hOO-SGD-1269)를 항원 특이성의 대조군으로서 시험하였다. 마일로타그(MYLOTARG)®(겜투주맙 오조가마이신)은 세포독성 약물 칼리케아미신에 결합된 항-CD33 항체 hP67.6으로 구성된 널리 기재된 CD33-유도된 항체 약물 컨쥬게이트이고 이것 역시 시험되었다.
정의
본 발명은 특히 인간 CD33 단백질에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 및 이의 컨쥬게이트를 제공한다. 항체는 CD33-발현 암의 치료 및 진단 뿐만 아니라 CD33 단백질을 검출하는데 유용하다.
"분리된" 항체는 이의 자연 환경의 구성요소들로부터 동정되고 분리 및/또는 회수된 항체 및/또는 재조합에 의해 생성된 항체를 지칭한다. "정제된 항체"는 통상적으로 이의 생성 또는 정제로부터 발생하는 간섭 단백질 및 다른 오염물질로부터 적어도 50% w/w 순수하지만, 모노클로날 항체가 이의 사용을 돕기 위한 과량의 약학적으로 허용되는 담체(들) 또는 다른 비히클과 조합될 가능성을 배제하지는 않는 항체이다. 간섭 단백질 및 다른 오염물질은, 예를 들어 항체가 분리되거나 재조합에 의해 생성되는 세포의 세포 구성요소를 포함할 수 있다. 때때로, 모노클로날 항체는 생성 또는 정제로부터의 간섭 단백질 및 오염물질로부터 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95 또는 99% w/w 순수하다. 뮤린, 키메라, 및 인간화 항체를 포함하는 본원에 기재된 항체는 분리되고/거나 정제된 형태로 제공될 수 있다.
본원에서 이용되는 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하고, 즉 집단을 구성하는 개별적인 항체들은 미량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 수식어구인 "모노클로날"은 항체의 실질적으로 균질한 집단으로부터 수득되는 항체의 특성을 나타내며, 항체가 임의의 특정 방법에 의해 생성될 것을 요구하는 것으로 해석되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따라 이용되는 모노클로날 항체는 문헌[Kohler et al. (1975) Nature 256:495]에 최초로 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있다 (예를 들어, 미국특허 4816567호를 참조하라). "모노클로날 항체"는 또한, 예를 들어, 문헌[Clackson et al. (1991) Nature, 352:624-628 and Marks et al. (1991) J. Mol. Biol, 222:581-597]에 기재된 기법을 이용하여 파지 항체 라이브러리로부터 분리될 수 있거나, 다른 방법에 의해 제조될 수 있다. 본원에 기재된 항체는 모노클로날 항체이다.
모노클로날 항체의 이의 표적 항원에 대한 특이적 결합은 적어도 106, 107, 108, 109, 또는 1010 M-1의 친화성을 의미한다. 특이적 결합은 크기에 있어서 검출가능하게 더 높고, 적어도 하나의 관련되지 않은 표적에 대해 발생하는 비-특이적 결합과 구별가능하다. 특이적 결합은 특정 작용기 또는 특정 공간적 적합부(예를 들어, 자물쇠 및 열쇠 유형) 사이의 결합의 형성의 결과일 수 있는 반면, 비특이적 결합은 보통 반 데르 발스 힘의 결과이다.
기본 항체 구조 단위는 서브유닛의 테트라머이다. 각각의 테트라머는 폴리펩티드 사슬의 2개의 동일한 쌍을 포함하며, 각각의 쌍은 하나의 "경쇄"(약 25 kDa) 및 하나의 "중쇄"(약 50-70 kDa)를 갖는다. 각각의 사슬의 아미노-말단 부분은 주로 항원 인지를 담당하는 약 100 내지 110개 또는 그 초과의 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 이러한 가변 영역은 처음에는 분해가능한 신호 펩티드에 연결되어 발현된다. 신호 펩티드가 없는 가변 영역은 때때로 성숙 가변 영역으로 언급된다. 따라서, 예를 들어, 경쇄 성숙 가변 영역은 경쇄 신호 펩티드가 없는 경쇄 가변 영역을 의미한다. 각각의 사슬의 카르복시-말단 부분은 효과기 기능을 주로 담당하는 불변 영역을 규정한다.
경쇄는 카파 또는 람다로 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타, 또는 엡실론으로 분류되고, 항체의 아이소형은 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE로 각각 규정된다. 경쇄 및 중쇄 내에서, 가변 및 불변 영역은 약 12개 이상의 아미노산의 "J" 영역에 의해 연결되고, 중쇄는 또한 약 10개 이상의 아미노산의 "D" 영역을 포함한다(일반적으로, 모든 목적상 전체내용이 참조로 포함되는, Fundamental Immunology (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y., 1989, Ch. 7 참조)).
각각의 경쇄/중쇄 쌍의 성숙 가변 영역은 항체 결합 부위를 형성한다. 따라서, 온전한 항체는 2개의 결합 부위를 갖는다. 이기능성 또는 이특이적 항체를 제외하고는, 2개의 결합 부위는 동일하다. 사슬은 상보성 결정 영역 또는 CDR로도 언급되는 3개의 과가변 영역에 의해 연결된 비교적 보존된 프레임워크 영역(FR)의 동일한 일반적 구조를 모두 나타낸다. 각각의 쌍의 2개의 사슬로부터의 CDR은 프레임워크 영역에 의해 정렬되어 특이적 에피토프에 대한 결합을 가능케 한다. N-말단으로부터 C-말단 방향으로, 경쇄 및 중쇄 둘 모두는 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 각각의 도메인에 대한 아미노산의 지정은 케이뱃(Kabat)(Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 and 1991), 또는 초티아 및 레스크(Chothia & Lesk)(J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia et al., Nature 342:878-883 (1989))의 정의에 따른다. 케이뱃은 또한 다양한 중쇄 사이 또는 다양한 경쇄 사이의 상응하는 잔기가 동일 번호로 지정되는 널리 사용되는 넘버링 규칙(케이뱃 넘버링)을 제공한다.
용어 "항체"는 온전한 항체 및 이의 결합 단편을 포함한다. 통상적으로, 개별적 중쇄, 경쇄 Fab, Fab', F(ab')2, F(ab)c, 디아바디(diabody), Dab, 나노바디(nanobody), 및 Fv를 포함하는 항체 단편은 이들이 유래된 온전한 항체와 표적에 대한 특이적 결합에 대해 경쟁한다. 단편은 재조합 DNA 기술, 또는 온전한 면역글로불린의 효소적 또는 화학적 분리에 의해 생성될 수 있다. 용어 "항체"는 또한 디아바디(동종이합체 Fv 단편) 또는 미니바디(VL-VH-CH3), 이특이적 항체 등을 포함한다. 이특이적 또는 이기능성 항체는 2개의 상이한 중쇄/경쇄 쌍 및 2개의 상이한 결합 부위를 갖는 인공 하이브리드 항체이다(예를 들어, Songsivilai and Lachmann, Clin. Exp. Immunol., 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol., 148:1547-53 (1992) 참조). 용어 "항체"는 항체 단독(네이키드 항체) 또는 세포독성 또는 세포증식억제 약물에 컨쥬게이션된 항체를 포함한다.
용어 "에피토프"는 항체가 결합하는 항원 상의 부위를 나타낸다. 에피토프는 하나 이상의 단백질의 삼차 폴딩에 의해 병렬된 연속 아미노산 또는 불연속 아미노산으로부터 형성될 수 있다. 연속 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 통상적으로 변성 용매에 대한 노출시에 유지되는 반면, 삼차 폴딩에 의해 형성된 에피토프는 통상적으로 변성 용매를 이용한 처리시에 상실된다. 에피토프는 통상적으로 독특한 공간 형태의 적어도 3개, 더욱 일반적으로, 적어도 5개 또는 8-10개의 아미노산을 포함한다. 에피토프의 공간 형태를 결정하는 방법은, 예를 들어, x-선 결정학 및 이차원 핵 자기 공명을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Epitope Mapping Protocols, in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed. (1996)]을 참조하라.
동일 또는 중첩 에피토프를 인지하는 항체는 표적 항원에 대한 또 다른 항체의 결합과 경쟁하는 한 항체의 능력을 나타내는 간단한 면역검정으로 확인될 수 있다. 항체의 에피토프는 또한 접촉 잔기를 확인하기 위한 항체의 항원에 결합된 항체의 X-선 결정학에 의해 규정될 수 있다. 대안적으로, 2개의 항체는, 한 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 항원 내의 모든 아미노산 돌연변이가 다른 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 경우에 동일 에피토프를 갖는다. 2개의 항체는, 한 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 일부 아미노산 돌연변이가 다른 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 경우 중첩 에피토프를 갖는다.
항체 사이의 경쟁은 시험 중인 항체가 공통의 항원에 대한 참조 항체의 특이적 결합을 억제하는 검정에 의해 결정된다(예를 들어, Junghans et al., Cancer Res. 50:1495, 1990 참조). 과량의 시험 항체(예를 들어, 적어도 2x, 5x, 10x, 20x 또는 100x)가 경쟁 결합 검정으로 측정시 참조 항체의 결합을 적어도 50%, 바람직하게는 75%, 90% 또는 99% 억제하는 경우 시험 항체는 참조 항체와 경쟁한다. 경쟁 검정에 의해 확인된 항체(경쟁 항체)는 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체, 및 입체구조적 방해를 발생시키기에 참조 항체에 의해 결합된 에피토프에 충분히 인접한 인접 에피토프에 결합하는 항체를 포함한다. 인간 CD33 단백질과의 결합에 대해 h2H12 항체와 경쟁하는 항체가 본 설명에 포함된다.
2H12 항체는 인간 CD33 단백질에 특이적으로 결합하고, 3개의 중쇄 상보성 결정 영역(hCDR): 중쇄 CDR1, 예컨대, SEQ ID NO: 19 또는 SEQ ID NO: 19와 실질적으로 동일한 서열, 중쇄 CDR2, 예컨대, SEQ ID NO:20 또는 SEQ ID NO:20과 실질적으로 동일한 서열, 및 중쇄 CDR3, 예컨대, SEQ ID NO:21 또는 SEQ ID NO:21과 실질적으로 동일한 서열; 및 3개의 경쇄 CDR: 경쇄 CDR1, 예컨대, SEQ ID NO:22 또는 SEQ ID NO:22와 실질적으로 동일한 서열, 경쇄 CDR2, 예컨대, SEQ ID NO:23 또는 SEQ ID NO:23과 실질적으로 동일한 서열, 및 경쇄 CDR3, 예컨대, SEQ ID NO:24 또는 SEQ ID NO:24와 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 항체이다. 2H12 항체는 뮤린 2H12 (m2H12) 항체 및 뮤린 2H12 항체로부터 유래된 키메라 또는 인간화 항체를 포함한다.
용어 "환자"는 예방적 또는 치료적 치료를 받는 인간 및 다른 포유동물 피검체를 포함한다.
아미노산 치환을 보존성 또는 비보존성으로 분류하기 위해, 아미노산은 다음과 같이 그룹화된다: 그룹 I(소수성 측쇄): met, ala, val, leu, ile; 그룹 II(중성 친수성 측쇄): cys, ser, thr; 그룹 III(산성 측쇄): asp, glu; 그룹 IV(염기성 측쇄): asn, gln, his, lys, arg; 그룹 V(사슬 배향에 영향을 미치는 잔기): gly, pro; 및 그룹 VI(방향족 측쇄): trp, tyr, phe. 보존성 치환은 동일 부류 내의 아미노산 사이의 치환을 포함한다. 비-보존성 치환은 상기 부류 중 하나의 일원을 또 다른 부류의 일원으로 교환하는 것으로 구성된다.
서열 동일성의 백분율은 케이뱃 넘버링 규칙에 의해 최대로 정렬된 항체 서열을 이용하여 결정된다. 정렬 후, 주제 항체 영역(예를 들어, 중쇄 또는 경쇄의 전체 성숙 가변 영역)이 참조 항체의 동일 영역과 비교되는 경우, 주제 및 참조 항체 영역 사이의 서열 동일성 백분율은, 갭은 계수하지 않고, 백분율로 전환시키기 위해 100이 곱해진, 2개의 영역의 정렬된 위치의 전체 수에 의해 나누어진 주제 및 참조 항체 영역 둘 모두의 동일 아미노산에 의해 점유된 위치의 수이다.
하나 이상의 언급된 구성요소를 "포함하는" 조성물 또는 방법은 특별히 언급되지 않은 다른 구성요소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체를 포함하는 조성물은 항체를 단독으로 함유할 수 있거나 다른 성분과 함께 함유할 수 있다.
일정 범위의 값의 지정은 상기 범위 내 또는 상기 범위를 규정하는 모든 정수를 포함한다.
항체 효과기 기능은 Ig의 Fc 도메인(들)에 의해 제공되는 기능을 나타낸다. 이러한 기능은, 예를 들어, 항체-의존성 세포 세포독성, 항체-의존성 세포 포식작용 또는 보체-의존성 세포독성일 수 있다. 이러한 기능은, 예를 들어, 포식 또는 용해 활성과 함께 면역 세포 상의 Fc 수용체에 대한 Fc 효과기 도메인(들)의 결합, 또는 보체 시스템의 성분에 대한 Fc 효과기 도메인(들)의 결합에 의해 실행될 수 있다. 통상적으로, Fc-결합 세포 또는 보체 성분에 의해 매개되는 효과(들)은 CD33 표적화 세포의 억제 및/또는 고갈을 발생시킨다. 항체의 Fc 영역은 Fc 수용체(FcR)-발현 세포를 보충할 수 있고, 이들을 항체-코팅된 표적 세포와 병렬시킬 수 있다. FcγRIII(CD16), FcγRII(CD32) 및 FcγRIII(CD64)를 포함하는 IgG에 대한 표면 FcR을 발현하는 세포는 IgG-코팅된 세포의 파괴를 위한 효과기 세포로 작용할 수 있다. 상기 효과기 세포는 단핵구, 대식세포, 자연살(NK)세포, 호중구 및 호산구를 포함한다. IgG에 의한 FcγR의 연동은 항체-의존성 세포 세포독성(ADCC) 또는 항체-의존성 세포 포식작용(ADCP)을 활성화시킨다. ADCC는 막 포어(pore)-형성 단백질 및 프로테아제의 분비를 통해 CD16+ 효과기 세포에 의해 매개되는 한편, 포식작용은 CD32+ 및 CD64+ 효과기 세포에 의해 매개된다(Fundamental Immunology, 4th ed., Paul ed., Lippincott-Raven, N.Y., 1997, Chapters 3, 17 and 30; Uchida et al., 2004, J. Exp. Med. 199:1659-69; Akewanlop et al., 2001, Cancer Res. 61:4061-65; Watanabe et al., 1999, Breast Cancer Res. Treat. 53:199-207 참조). ADCC 및 ADCP에 더하여, 세포-결합된 항체의 Fc 영역은 또한 보체-의존성 세포독성(CDC)을 유도하는 보체 고전 경로를 활성화시킬 수 있다. 보체 시스템의 C1q는 항체가 항원과 복합체화되는 경우 항체의 Fc 영역에 결합한다. 세포-결합된 항체에 대한 C1q의 결합은 C4 및 C2의 단백질분해 활성화를 포함하는 사건의 캐스케이드를 개시시켜 C3 전환효소를 발생시킬 수 있다. C3 전환효소에 의한 C3의 C3b로의 분해는 C5b, C6, C7, C8 및 C9를 포함하는 말단 보체 성분의 활성화를 가능케 한다. 집합적으로, 이들 단백질은 항체-코팅된 세포 상에서 막-공격 복합체 포어를 형성시킨다. 이들 포어는 세포막 온전성을 파괴하고, 표적 세포를 사멸시킨다(Immunobiology, 6th ed., Janeway et al., Garland Science, N.Y., 2005, Chapter 2 참조).
용어 "항체-의존성 세포 세포독성" 또는 ADCC는 항체-코팅된 표적 세포와 용해 활성을 갖는 면역 세포(효과기 세포로도 언급됨)의 상호작용에 좌우되는 세포 사멸을 유도하는 메커니즘이다. 이러한 효과기 세포는 자연살세포, 단핵구/대식세포 및 호중구를 포함한다. 효과기 세포는 이들의 항원-결합 부위를 통해 표적 세포에 결합된 Ig의 Fc 효과기 도메인(들)에 부착된다. 항체-코팅된 표적 세포의 사멸은 효과기 세포 활성의 결과로서 발생한다.
용어 "항체-의존성 세포 포식작용" 또는 ADCP는 항체-코팅된 세포가 전체적 또는 부분적으로 Ig의 Fc 효과기 도메인(들)에 결합하는 포식 면역 세포(예를 들어, 대식세포, 호중구 및 수지상 세포)에 의해 내재화되는 과정을 나타낸다.
용어 "보체-의존성 세포독성" 또는 CDC는 표적-결합된 항체의 Fc 효과기 도메인(들)이 표적 세포 막 내의 구멍의 형성을 궁극적으로 발생시키는 일련의 효소적 반응을 활성화시키는, 세포 사멸을 유도하는 메커니즘을 나타낸다. 통상적으로, 항원-항체 복합체, 예를 들어, 항체-코팅된 표적 세포 상의 항원-항체 복합체는 보체 성분 C1q에 결합하고 이를 활성화시키고, 차례로 보체 캐스케이드를 활성화시켜 표적 세포 사멸을 발생시킨다. 보체의 활성화는 또한 백혈구 상의 보체 수용체(예를 들어, CR3)에 결합함으로써 ADCC를 촉진하는 표적 세포 표면 상의 보체 성분의 침착을 발생시킬 수 있다.
"세포독성 효과"는 표적 세포의 고갈, 제거 및/또는 사멸을 나타낸다. "세포독성 작용제"는 세포에 대해 세포독성 효과를 갖는 작용제를 나타낸다. 세포독성제는 항체에 컨쥬게이션되거나, 항체와 함께 투여될 수 있다.
"세포증식억제 효과"는 세포 증식의 억제를 나타낸다. "세포증식억제제"는 세포에 대해 세포증식억제 효과를 가짐으로써 세포의 특정 서브셋의 성장 및/또는 확장을 억제하는 작용제를 나타낸다. 세포증식억제제는 항체에 컨쥬게이션될 수 있거나, 항체와 함께 투여될 수 있다.
용어 "약학적으로 허용되는"은 연방 또는 주 정부의 관리 기관에 의해 승인되거나 승인가능하고, 동물, 더욱 특히 인간에서 사용하기 위한 미국 약전 또는 다른 일반적으로 승인된 약전에 나열된 것을 의미한다. 용어 "약학적으로 상용성인 성분"은 항-CD33 항체와 함께 피검체에게 투여되는 약학적으로 허용되는 희석제, 애쥬번트, 부형제, 또는 비히클을 나타낸다.
구 "약학적으로 허용되는 염"은 항-CD33-1 항체 또는 이의 컨쥬게이트 또는 항-CD33-1 항체와 함께 투여되는 작용제의 약학적으로 허용되는 유기 또는 무기 염을 나타낸다. 예시적 염은 설페이트, 시트레이트, 아세테이트, 옥살레이트, 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 니트레이트, 비설페이트, 포스페이트, 산 포스페이트, 이소니코티네이트, 락테이트, 살리실레이트, 산 시트레이트, 타르트레이트, 올레에이트, 탄네이트, 판토테네이트, 비타르트레이트, 아스코베이트, 석시네이트, 말레에이트, 겐티시네이트, 푸마레이트, 글루코네이트, 글루쿠로네이트, 사카레이트, 포르메이트, 벤조에이트, 글루타메이트, 메탄설포네이트, 에탄설포네이트, 벤젠설포네이트, p 톨루엔설포네이트, 및 파모에이트(즉, 1,1' 메틸렌 비스-(2 하이드록시 3 나프토에이트)) 염을 포함한다. 약학적으로 허용되는 염은 또 다른 분자, 예를 들어, 아세테이트 이온, 석시네이트 이온 또는 다른 반대이온의 포함을 수반할 수 있다. 반대이온은 모(parent) 화합물 상의 전하를 안정화시키는 임의의 유기 또는 무기 모이어티(moiety)일 수 있다. 또한, 약학적으로 허용되는 염은 이의 구조에서 하나 이상의 하전된 원자를 가질 수 있다. 다수의 하전된 원자가 약학적으로 허용되는 염의 일부인 예는 다수의 반대이온을 가질 수 있다. 그러므로, 약학적으로 허용되는 염은 하나 이상의 하전된 원자 및/또는 하나 이상의 반대이온을 가질 수 있다.
문맥으로부터 달리 명백하지 않은 한, 용어 "약"은 언급된 값의 표준편차 내의 값을 포함한다.
상세한 설명
I. 총론
본 발명은 CD33에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체를 제공한다. 항체는 다양한 암의 치료 및 진단 뿐만 아니라 CD33을 검출하는데 유용하다.
II. 표적 분자
달리 표시하지 않는 한, CD33은 인간 CD33을 의미한다. 예시적인 인간 서열은 지정된 Swiss Prot 수탁 번호 P20138이다. P20138은 본원에서 SEQ ID NO:55로 포함된다. P20138은 신호 펩티드, 아미노산 1-17; IgG-유사 도메인을 지닌 세포외 도메인, 아미노산 18-259; 막통과 도메인, 아미노산 260-282; 및 세포질 도메인, 아미노산 283-364를 포함한다.
문맥으로부터 달리 명백하지 않은 한, 참조 CD33은 적어도 단백질의 세포외 도메인 및 보통 분해가능한 신호 펩티드(P20138의 아미노산 1-17) 이외의 완전한 단백질을 의미한다.
III. 본 발명의 항체
A. 결합 특이성 및 기능적 특성
본 발명은 뮤린 항체, m2H12, 및 m2H12로부터 유래된 키메라 또는 인간화 항체를 제공한다. 뮤린 항체는 인간 CD33 단백질 및 시노몰구스 CD33 단백질 둘 모두에 결합하는 능력에 대해 선택되었다. 시노몰구스 CD33 아미노산 서열은 SEQ ID NO:56 및 57로서 제공된다.
뮤린 m2H12 항체의 인간화 또는 키메라 형태의 친화성(즉, Ka)은 m2H12 항체의 친화성보다 클 수 있거나, 인간 CD33에 대한 뮤린 항체 m2H12의 친화성의 5배 또는 2배 이내 (즉, 초과 또는 미만)이다. 항체의 이의 표적 항원에 대한 친화성을 측정하는 한 가지 방법은 항체의 겉보기 해리 상수를 측정함에 의해서이다. 본 발명은 뮤린 2H12와 본질적으로 동일한 겉보기 해리 상수를 지닌(즉, 실험 오차 내) 항체(예컨대, 마우스 2H12 항체의 키메라 및 인간화 형태) 뿐만 아니라 인간 CD33에 대해 뮤린 항체 2H12보다 낮거나 높은 해리 상수를 지닌 항체를 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 항체 (예컨대, 마우스 2H12 항체의 키메라, 인간화 및 인간 형태)는 인간 CD33에 대한 뮤린 2H12 항체의 겉보기 해리 상수보다 0.1 내지 10배 범위, 또는 바람직하게는 0.1 내지 5배, 0.1 내지 2배, 또는 심지어 0.5 내지 2배 범위의 겉보기 해리 상수를 지닌다. 일부 양태에서, 인간 CD33에 대한 항체의 겉보기 해리 상수(Kd)는 바람직하게는 0.1 nM 내지 50 nM의 범위 내, 더욱 더 바람직하게는 0.1 nM 내지 25 nM의 범위 내, 더욱 바람직하게는 0.1 nM 내지 10 nM, 0.5 nM 내지 5 nM, 또는 0.5 nM 내지 2.5 nM의 범위 내이다. 인간화 또는 키메라 m2H12 항체는 이들이 유래된 뮤린 m2H12 항체처럼 천연 형태 및/또는 CHO 세포로부터 재조합에 의해 발현된 인간 CD33에 특이적으로 결합한다.
인간화 또는 키메라 m2H12 항체는 동일한 에피토프에 결합하고/하거나 인간 CD33과의 결합에 대해 m2H12와 경쟁한다. 일부 구체예에서, 인간화 또는 키메라 m2H12 항체는 또한 CD33의 시노-동족체에 결합하므로, 비인간 영장류에서 전임상 시험을 허용한다.
바람직한 항체(예컨대, 인간화 또는 키메라 m2H12 항체)는 동물 모델 또는 임상 시험에서 배양 중인 증식하는 암성 세포에 대해서 관찰되는 바와 같이 암(예를 들어, 세포의 성장, 전이 및/또는 유기체에 대한 치사성)을 억제한다. 동물 모델은 CD33-발현 인간 종양 세포주 또는 원발성 환자 종양 세포를 적절한 면역결핍 설치류 계통, 예를 들어, 무흉선 누드 마우스, NSG 또는 SCID 마우스에 이식함으로써 형성될 수 있다. 이들 종양 세포주는 피하 주사에 의한 고형 종양 또는 정맥내 주사에 의한 파종 종양으로서 면역결핍 설치류 숙주에서 확립될 수 있다. 숙주 내에서 확립된 후, 이들 종양 모델은 실시예에 기재된 바와 같이 항-CD33 항체 또는 이의 컨쥬게이션된 형태의 치료 효능을 평가하는데 적용될 수 있다.
B. 항체
인간화 항체는 비-인간 "공여체" 항체로부터의 CDR이 인간 "수용체" 항체 서열에 이식된 유전학적으로 조작된 항체이다(예를 들어, Queen, US 5,530,101 and 5,585,089; Winter, US 5,225,539; Carter, US 6,407,213; Adair, US 5,859,205; and Foote, US 6,881,557 참조). 수용체 항체 서열은, 예를 들어, 성숙 인간 항체 서열, 상기 서열의 복합물, 인간 항체 서열의 컨센서스 서열, 또는 생식계열 영역 서열일 수 있다. 중쇄에 대한 바람직한 수용체 서열은 생식계열 VH 엑손 VH1-18 및 J 엑손(JH)의 경우, 엑손 JH-6이다. 경쇄에 대한 바람직한 수용체 서열은 엑손 VL1-16 J 엑손 Jκ-4이다. 따라서, 인간화 항체는 전적으로 또는 실질적으로 비-인간 공여체 항체로부터의 일부 또는 전부 CDR, 및 존재시 전적으로 또는 실질적으로 인간 항체 서열로부터의 가변 영역 프레임워크 서열 및 불변 영역을 갖는 항체이다. 유사하게, 인간화 중쇄는 전적으로 또는 실질적으로 공여체 항체 중쇄로부터의 적어도 1개, 2개 및 보통 3개 모두의 CDR, 및 존재시 실질적으로 인간 중쇄 가변 영역 프레임워크 및 불변 영역 서열로부터의 중쇄 가변 영역 프레임워크 서열 및 중쇄 불변 영역을 갖는다. 유사하게, 인간화 경쇄는 전적으로 또는 실질적으로 공여체 항체 경쇄로부터의 적어도 1개, 2개 및 보통 3개 모두의 CDR, 및 존재시 실질적으로 인간 경쇄 가변 영역 프레임워크 및 불변 영역 서열로부터의 경쇄 가변 영역 프레임워크 서열 및 경쇄 불변 영역을 갖는다. 나노바디 및 dAb와는 달리, 인간화 항체는 인간화 중쇄 및 인간화 경쇄를 포함한다. 인간화 또는 인간 항체의 CDR은 상응하는 잔기(케이뱃에 의해 규정된 바와 같음)의 적어도 60%, 85%, 90%, 95% 또는 100%가 각각의 CDR 사이에서 동일한 경우에 실질적으로 비-인간 항체의 상응하는 CDR로부터 유래되거나 상응하는 CDR과 실질적으로 동일하다. 일부 구체예에서, 인간화 항체 또는 인간 항체의 CDR은 각각의 CDR에서 3개 이하의 보존적 아미노산 치환이 있는 경우에 실질적으로 비-인간 항체의 상응하는 CDR로부터 유래되거나 상응하는 CDR과 실질적으로 동일하다. 항체 사슬의 가변 영역 프레임워크 서열 또는 항체 사슬의 불변 영역은 케이뱃에 의해 규정된 상응하는 잔기의 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%가 동일한 경우 실질적으로 인간 가변 영역 프레임워크 서열 또는 인간 불변 영역으로부터 각각 유래된다. 본 발명의 일부 인간화 항체에서, 항체의 중쇄 가변 프레임워크 영역에 적어도 하나의 뮤린 2H12 복귀돌연변이가 존재한다.
인간화 항체는 종종 마우스 항체로부터의 6개 모두의 CDR(바람직하게는, 케이뱃에 의해 규정된 바와 같음)을 포함하나, 이들은 또한 마우스 항체로부터의 6개 미만의 CDR(예를 들어, 적어도 3, 4 또는 5개의 CDR)로 이루어질 수 있다(예를 들어, Pascalis et al., J. Immunol. 169:3076, 2002; Vajdos et al., Journal of Molecular Biology, 320: 415-428, 2002; Iwahashi et al., Mol. Immunol. 36: 1079-1091, 1999; Tamura et al, Journal of Immunology, 164: 1432-1441, 2000).
인간 가변 영역 프레임워크 잔기로부터의 특정 아미노산은 CDR 형태 및/또는 항원에 대한 결합에 대한 이들의 가능한 영향을 기초로 하여 치환에 대해 선택될 수 있다. 상기 가능한 영향의 연구는 모델링, 특정 위치의 아미노산의 특징의 시험, 또는 특정 아미노산의 치환 또는 돌연변이유발의 효과의 경험적 관찰에 의해 이루어진다.
예를 들어, 아미노산이 뮤린 가변 영역 프레임워크 잔기와 선택된 인간 가변 영역 프레임워크 잔기 사이에서 상이한 경우, 인간 프레임워크 아미노산은, 아미노산이
(1) 항원에 직접 비공유적으로 결합하거나,
(2) CDR 영역에 인접하여 있거나,
(3) CDR 영역과 달리 상호작용(예를 들어, CDR 영역의 약 6Å 내에 존재함)하거나,
(4) 중쇄와 경쇄 사이의 상호작용을 매개하는 것으로 합리적으로 예상되는 경우에 마우스 항체로부터의 동등한 프레임워크 아미노산에 의해 치환될 수 있다.
본 발명은 9개의 예시된 인간화 중쇄 성숙 가변 영역(HA-HI) 및 7개의 예시된 인간화 경쇄 성숙 가변 영역(LA-LG)을 포함하는 마우스 m2H12 항체의 인간화 형태를 제공한다. 가장 강한 결합(가장 낮은 EC50)을 갖는 상기 사슬의 순열은 HCLA, HCLE, HCLG, HILA, HILE 및 HILG이다. 이들 순열 중, HILG (h2H12로도 공지됨)가 바람직한데, 이는 가장 강한 결합을 갖기 때문이다.
본 발명은 중쇄 가변 영역이 HA (SEQ ID NO: 10)와 적어도 90%의 동일성을 나타내고 경쇄 가변 영역이 LA (SEQ ID NO:2)와 적어도 90% 동일한 2H12 항체를 제공한다. 일부 양태에서, 항체는 인간화 항체이고 중쇄 가변 프레임워크 영역에 적어도 하나의 뮤린 2H12 복귀돌연변이가 존재한다. 다른 양태에서, 항체는 인간화 항체이고 경쇄 가변 프레임워크 영역에 적어도 하나의 뮤린 2H12 복귀돌연변이가 존재한다. 추가로, 본 발명은 인간화 중쇄 가변 영역이 SEQ ID NO: 10-18과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 나타내고 인간화 경쇄 가변 영역이 SEQ ID NO: 2-8과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 나타내는 2H12 항체를 제공한다 (및 이의 조합물 (즉, 항체는 경쇄 가변 영역 중 어느 하나와 페어링된 중쇄 가변 영역 중 어느 하나를 포함할 수 있다)). 예를 들어, 본 발명은 중쇄 가변 영역이 SEQ ID NO: 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 또는 18과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 나타내고 인간화 경쇄 가변 영역이 SEQ ID NO:2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 나타내는 항체를 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 중쇄 가변 영역이 SEQ ID NO: 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 또는 18과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 나타내고 경쇄 가변 영역이 SEQ ID NO:2와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 나타내는 항체를 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 중쇄 가변 영역이 SEQ ID NO: 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 또는 18과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 나타내고 경쇄 가변 영역이 SEQ ID NO:3과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 나타내는 항체를 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 중쇄 가변 영역이 SEQ ID NO: 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 또는 18과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%. 99% 또는 100% 서열 동일성을 나타내고 경쇄 가변 영역이 SEQ ID NO:4와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 나타내는 항체를 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 중쇄 가변 영역이 SEQ ID NO: 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 또는 18과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 나타내고 경쇄 가변 영역이 SEQ ID NO:5와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 나타내는 항체를 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 중쇄 가변 영역이 SEQ ID NO: 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 또는 18과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 나타내고 경쇄 가변 영역이 SEQ ID NO:6과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%. 99% 또는 100% 서열 동일성을 나타내는 항체를 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 중쇄 가변 영역이 SEQ ID NO: 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 또는 18과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 나타내고 경쇄 가변 영역이 SEQ ID NO:7과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%. 99% 또는 100% 서열 동일성을 나타내는 항체를 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 중쇄 가변 영역이 SEQ ID NO: 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 또는 18과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 나타내고 경쇄 가변 영역이 SEQ ID NO:8과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%. 99% 또는 100% 서열 동일성을 나타내는 항체를 제공한다.
일부 양태에서, 이러한 항체는 인간화 항체이고, 개개 항체의 복귀돌연변이의 일부 또는 전부가 유지된다. 몇몇 항체에서, 위치 H94는 S에 의해 점유된다. 일부 항체에서, 바람직하게는, 위치 H48, H66, H67, H69, H71, 및 H94 중 적어도 하나는 뮤린 2H12 항체의 상응하는 위치로부터의 아미노산에 의해 점유된다. 임의로, 어떠한 상기 항체에서, 위치 H48은 I에 의해 점유되고; 위치 H66은 K에 의해 점유되고; 위치 H67은 A에 의해 점유되고; 위치 H69는 L에 의해 점유되고; 위치 H71은 A에 의해 점유되고; 위치 H94는 S에 의해 점유된다. 상기 항체의 다른 구체예에서, 바람직하게는, 위치 L22, L46, L69, 및 L71 중 적어도 하나는 뮤린 2H12 항체의 상응하는 위치로부터의 아미노산에 의해 점유된다. 임의로, 어떠한 상기 항체에서, 위치 L22는 N에 의해 점유되고; 위치 L46은 T에 의해 점유되고; 위치 L69는 Q에 의해 점유되고; 위치 L71은 Y에 의해 점유된다.
바람직하게는, 상기 기재된 임의의 항체에서, 예컨대 중쇄 가변 영역이 SEQ ID NO: 10-18과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 나타내고 경쇄 가변 영역이 SEQ ID NO:2-8과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 나타내는 2H12 인간화 항체에서, CDR 영역은 마우스 공여체 항체, 즉 뮤린 2H12 항체의 CDR 영역 (SEQ ID NO: 19-24)과 동일하거나 실질적으로 동일하다. CDR 영역은 케이뱃에 의해 정의된 바와 같다. 본 발명의 항체는 항체 HCLA, HCLE, HCLG, HILA, HILE, 및 HILG를 포함한다.
본 발명은 인간화 중쇄 성숙 가변 영역이 SEQ ID NO:18과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 나타내고, 인간화 경쇄 성숙 가변 영역이 SEQ ID NO:8과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 나타내는 HILG 인간화 항체의 변이체를 제공한다. 그러한 일부 항체에서, 위치 H94는 S에 의해 점유된다. 바람직하게는, 상기 항체에서, HILG 내의 복귀돌연변이의 일부 또는 전부가 유지된다. 즉, 중쇄 위치 H48, H66, H67, H69, H71, 및 H94의 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 바람직하게는 6개 모두는 각각 I 및 K 및 A 및 L 및 A 및 S에 의해 점유된다. 또한 경쇄 위치 L22, L46, L69, 및 L71의 적어도 1개, 2개, 3개 또는 바람직하게는 4개 모두는 각각 N 및 T 및 Q 및 Y에 의해 점유된다. 상기 인간화 항체의 CDR 영역은 바람직하게는 HILG의 CDR 영역과 실질적으로 동일하고, 이는 마우스 공여체 항체의 CDR 영역과 동일하다. CDR 영역은 임의의 통상적인 정의(예를 들어, 초티아)에 의해 규정될 수 있으나, 바람직하게는 케이뱃에 의해 규정되는 바와 같다. 한 구체예에서, 인간화 항체는 SEQ ID NO:18의 3개의 CDR 및 SEQ ID NO:18의 가변 영역 프레임워크와 적어도 95%의 동일성을 갖는 가변 영역 프레임워크를 포함하는 중쇄를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 인간화 항체는 SEQ ID NO:8의 3개의 CDR 및 SEQ ID NO:8의 가변 영역 프레임워크와 적어도 95%의 동일성을 갖는 가변 영역 프레임워크를 포함하는 경쇄를 포함한다. 한 추가 구체예에서, 인간화 항체는 SEQ ID NO:18의 3개의 CDR 및 SEQ ID NO:18의 가변 영역 프레임워크와 적어도 95%의 동일성을 갖는 가변 영역 프레임워크를 포함하는 중쇄, 및 SEQ ID NO:8의 3개의 CDR 및 SEQ ID NO:8의 가변 영역 프레임워크와 적어도 95%의 동일성을 갖는 가변 영역 프레임워크를 포함하는 경쇄를 포함한다.
인간화 항체가 예시된 HILG 인간화 항체로부터 임의의 변화를 나타내는 한에 있어서, 상기 추가 변화에 대한 한 가능성은 가변 영역 프레임워크 내의 추가 복귀돌연변이이다. 다른 예시된 인간화 중쇄 또는 경쇄 성숙 가변 영역에서 복귀돌연변이된 위치들 중 임의의 위치 또는 모든 위치는 또한 다음과 같이 수행될 수 있다 (즉, 중쇄에서 H38 중 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개 모두는 N에 의해 점유되고, H40은 R에 의해 점유되고, H73은 K에 의해 점유되고, H82A는 S에 의해 점유되고, H83은 T에 의해 점유되고 경쇄에서 L3 중 하나 또는 둘 모두는 K에 의해 점유되고, L20은 I에 의해 점유된다). 그러나, 상기 추가 복귀돌연변이는 바람직하지 않은데, 그 이유는 이들이 일반적으로 친화성을 개선시키지 않고, 보다 많은 마우스 잔기를 도입시키는 것이 면역원성의 위험을 증가시킬 수 있기 때문이다.
또 다른 가능한 변화는 마우스 항체의 CDR 내의 특정 잔기를 인간 CDR 서열, 통상적으로 예시된 인간화 항체를 설계하는데 사용되는 인간 수용체 서열의 CDR로부터의 상응하는 잔기로 치환시키는 것이다. 일부 항체에서, CDR의 단지 일부, 즉, SDR로 언급되는 결합에 필요한 CDR 잔기의 서브셋이 인간화 항체에서의 결합을 유지시키는데 필요하다. 항원과 접촉하지 않고 SDR 내에 존재하지 않는 CDR 잔기는 초티아 과가변 루프 외부에 위치하는 케이뱃 CDR의 영역으로부터의 이전의 연구(예를 들어, CDR H2 내의 잔기 H60-H65는 종종 필요하지 않음)(Chothia, J. Mol. Biol. 196:901, 1987)를 기초로 하거나, 분자 모델링 및/또는 경험에 의해, 또는 문헌[Gonzales et al., Mol. Immunol. 41: 863 (2004)]에 기재된 바와 같이 확인될 수 있다. 이러한 인간화 항체에서, 하나 이상의 공여체 CDR 잔기가 부재하거나, 전체 공여체 CDR이 생략된 위치에서, 상기 위치를 점유하는 아미노산은 수용체 항체 서열 내의 상응하는 위치(케이뱃 넘버링에 의함)를 점유하는 아미노산일 수 있다. 포함시키려는 CDR 내의 공여체 아미노산에 대한 수용체의 상기 치환의 수는 경쟁 고려사항의 균형을 반영한다. 상기 치환은 인간화 항체 내의 마우스 아미노산의 수를 감소시키고, 결과적으로 잠재적 면역원성을 감소시키는데 있어서 잠재적으로 유리하다. 그러나, 치환은 또한 친화성의 변화를 야기시킬 수 있고, 친화성의 유의한 감소는 바람직하게는 회피된다. CDR 내의 치환을 위한 위치 및 치환시키려는 아미노산은 또한 경험적으로 선택될 수 있다.
바람직하지는 않지만, 다른 아미노산 치환은, 예를 들어, CDR과 접촉하지 않는 프레임워크 잔기, 또는 CDR 내의 일부 잠재적 CDR-접촉 잔기 아미노산에서도 이루어질 수 있다. 종종, 변이체 인간화 서열 내에서 이루어진 대체는 인간화 2H12 항체의 경우 대체된 HILG 아미노산과 관련하여 보존성이다. 바람직하게는, HILG에 관한 대체(보존성이거나 그렇지 않은 간에)는 인간화 mAb의 결합 친화성 또는 효능, 즉, 인간 CD33에 결합하고 암세포의 성장을 억제하는 이의 능력에 대해 실질적 효과를 갖지 않는다.
변이체는 통상적으로 적은 수(예를 들어, 통상적으로 경쇄 또는 중쇄 성숙 가변 영역 또는 둘 모두에서 1, 2, 3, 5 또는 10개 이하)의 대체, 결실 또는 삽입만큼 HILG (h2H12)의 중쇄 및 경쇄 성숙 가변 영역 서열과 상이하다.
일부 구체예에서, 인간화 또는 키메라 항체는 중쇄 HI의 CDR H2에 비해 최대 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 치환, 결실 또는 삽입을 지니는 CDR H2, 및 중쇄 HI 또는 경쇄 LG의 상응하는 CDR에 비해 최대 1개, 2개, 3개 또는 4개의 치환, 결실 또는 삽입을 각각 지니는 CDR H1, H3, L1, L2 및 L3을 지닌다. 일부 구체예에서, 본 발명의 인간화 또는 키메라 항체는 CDR의 일부로서 확인되는 아미노산(들)에서 하나 또는 많아야 2개의 보존된 아미노산 치환을 지닌다. 바람직한 아미노산 치환의 예는 하기를 포함한다. 경쇄의 CDR1에서, R 잔기는 위치 24에서 K로 치환될 수 있고; G, S, 또는 T는 위치 25에서 A로 치환될 수 있고; M은 위치 33에서 L로 치환될 수 있고; T는 위치 34에서 S로 치환될 수 있다. 경쇄의 CDR2에서, K 잔기는 위치 53에서 R 잔기로 치환될 수 있고; M 잔기는 위치 54에서 L 잔기로 치환될 수 있고; I 잔기는 위치 55에서 V 잔기로 치환될 수 있고; E 잔기는 위치 56에서 D 잔기로 치환될 수 있다. 중쇄의 CDR2에서, D 잔기는 위치 61에서 E 잔기로 치환될 수 있고; R 잔기는 위치 62에서 K 잔기로 치환될 수 있고; Y 잔기는 위치 63에서 F 잔기로 치환될 수 있고; R 잔기는 위치 64에서 K 잔기로 치환될 수 있고; G 잔기는 위치 65에서 A 잔기로 치환될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 인간화 항체는 상기 열거된 대로 CDR 서열에 1개, 2개 또는 3개의 보존적 치환을 지니는 SEQ ID NO: 18의 성숙 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 인간화 항체는 상기 열거된 대로 CDR 서열에 1개, 2개 또는 3개의 보존적 치환을 지니는 SEQ ID NO: 8의 성숙 경쇄 가변 영역을 포함한다.
C. 불변 영역의 선택
인간화 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 인간 불변 영역의 적어도 일부에 연결될 수 있다. 불변 영역의 선택은 항체-의존성 세포-매개 세포독성, 항체 의존성 세포 포식작용 및/또는 보체 의존성 세포독성이 요망되는지의 여부에 부분적으로 좌우된다. 예를 들어, 인간 아이소형 IgG1 및 IgG3은 강한 보체-의존성 세포독성을 갖고, 인간 아이소형 IgG2는 보체-의존성 세포독성이 약하고, 인간 IgG4는 보체-의존성 세포독성이 결핍되어 있다. 인간 IgG1 및 IgG3은 또한 인간 IgG2 및 IgG4보다 강한 세포 매개 효과기 기능을 유도한다. 경쇄 불변 영역은 람다 또는 카파일 수 있다. 항체는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 함유하는 테트라머, 개별적 중쇄, 경쇄, Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv, 또는 중쇄 및 경쇄 가변 도메인이 스페이서를 통해 연결된 단쇄 항체로 발현될 수 있다.
인간 불변 영역은 다양한 개체 사이에서 동종이형(allotypic) 변화 및 아이소동종이형(isoallotypic) 변화를 나타내며, 즉, 불변 영역은 하나 이상의 다형태 위치에서 다양한 개체에서 다양할 수 있다. 아이소동종이형은 아이소동종이형을 인지하는 혈청이 하나 이상의 다른 아이소형의 비-다형태 영역에 결합한다는 점에서 동종이형과 상이하다.
경쇄 및/또는 중쇄의 아미노 또는 카르복시 말단의 한개 또는 여러 개의 아미노산, 예를 들어, 중쇄의 C-말단 리신이 분자의 일부 또는 전부에서 손실되거나 유도될 수 있다. 보체-매개 세포독성 또는 ADCC와 같은 효과기 기능을 감소시키거나 증가(예를 들어, Winter et al., US Patent No. 5,624,821; Tso et al., US Patent No. 5,834,597; and Lazar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:4005, 2006 참조)시키거나, 인간에서 반감기를 연장(예를 들어, Hinton et al., J. Biol. Chem. 279:6213, 2004 참조)시키기 위해 불변 영역에서 치환이 이루어질 수 있다.
예시적인 치환은 아미노산 위치 234, 235, 237, 239, 267, 298, 299, 326, 330, 또는 332에 도입된 자연 아미노산의 시스테인 잔기로의 아미노산 치환, 바람직하게는 인간 IgG1 아이소형 내의 S239C 돌연변이를 포함한다(넘버링은 EU 지수에 따른다 (Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 and 1991); 본원에 참조로서 포함된 US 20100158909호를 참조하라). 추가 시스테인 잔기의 존재는 사슬간 디설파이드 결합 형성을 가능케 한다. 이러한 사슬간 디설파이드 결합 형성은 입체구조적 방해를 야기시킴으로써 Fc 영역-FcγR 결합 상호작용의 친화성을 감소시킬 수 있다. IgG 불변 영역의 Fc 영역 내에 도입되거나 이 부근에 도입된 시스테인 잔기(들)은 또한 치료제에 대한 컨쥬게이션(즉, 약물의 말레이미드 유도체와 같은 티올 특이적 시약을 이용한 세포독성 약물 커플링)을 위한 부위로 작용할 수 있다. 치료제의 존재는 입체구조적 방해를 야기시킴으로써 Fc 영역-FcγR 결합 상호작용의 친화성을 추가로 감소시킨다. 위치 234, 235, 236 및/또는 237 중 임의의 위치에서의 다른 치환은 Fcγ 수용체, 특히 FcγRI 수용체에 대한 친화성을 감소시킨다(예를 들어, US 6,624,821, US 5,624,821 참조).
항체의 생체내 반감기는 또한 이의 효과기 기능에 영향을 미칠 수 있다. 항체의 반감기는 이의 치료 활성을 변형시키기 위해 증가되거나 감소될 수 있다. FcRn은 β2-마이크로글로불린과 비공유적으로 결합하는 MHC 클래스 I 항원과 구조적으로 유사한 수용체이다. FcRn은 IgG의 이화작용 및 이의 조직을 가로지르는 트랜스사이토시스(transcytosis)를 조절한다(Ghetie and Ward, 2000, Annu. Rev. Immunol. 18:739-766; Ghetie and Ward, 2002, Immunol. Res. 25:97-113). IgG-FcRn 상호작용은 pH 6.0(세포내 소포의 pH)에서 발생하나, pH 7.4(혈액의 pH)에서는 발생하지 않으며, 이러한 상호작용은 IgG가 순환으로 다시 재순환되는 것을 가능케 한다(Ghetie and Ward, 2000, Ann. Rev. Immunol. 18:739-766; Ghetie and Ward, 2002, Immunol. Res. 25:97-113). FcRn 결합과 관련된 인간 IgG1 상의 영역이 맵핑되었다(Shields et al., 2001, J. Biol. Chem. 276:6591-604). 인간 IgG1의 위치 Pro238, Thr256, Thr307, Gln311, Asp312, Glu380, Glu382, 또는 Asn434에서의 알라닌 치환은 FcRn 결합을 향상시킨다(Shields et al., 2001, J. Biol. Chem. 276:6591-604). 상기 치환을 포함하는 IgG1 분자는 보다 긴 혈청 반감기를 갖는다. 결과로서, 이들 변형된 IgG1 분자는 이들의 효과기 기능을 수행할 수 있고, 그러므로 변형되지 않은 IgG1에 비해 장기간의 시간에 걸쳐 이들의 치료 효능을 발휘할 수 있다. FcRn에 대한 결합을 증가시키기 위한 다른 예시적 치환은 위치 250의 Gln 및/또는 위치 428의 Leu을 포함한다. 불변 영역 내의 모든 위치에 대해 EU 넘버링이 사용된다.
보존된 Asn297에 공유적으로 부착된 올리고당류는 FcγR에 결합하는 IgG의 Fc 영역의 능력과 관련된다(Lund et al., 1996, J. Immunol. 157:4963-69; Wright and Morrison, 1997, Trends Biotechnol. 15:26-31). IgG 상의 상기 단백당형(glycoform)의 조작은 IgG-매개 ADCC를 현저히 개선시킬 수 있다. 상기 단백당형으로의 이등분면 N-아세틸글루코사민 변형의 추가(Umana et al., 1999, Nat. Biotechnol. 17:176-180; Davies et al., 2001, Biotech. Bioeng. 74:288-94) 또는 상기 단백당형으로부터의 푸코스의 제거(Shields et al., 2002, J. Biol. Chem. 277:26733-40; Shinkawa et al., 2003, J. Biol. Chem. 278:6591-604; Niwa et al., 2004, Cancer Res. 64:2127-33)가 IgG Fc와 FcγR 사이의 결합을 개선시킴으로써 Ig-매개 ADCC 활성을 향상시키는 IgG Fc 조작의 두 예이다.
인간 IgG1 Fc 영역의 용매-노출된 아미노산의 체계적 치환이 변경된 FcγR 결합 친화성을 갖는 IgG 변이체를 생성시켰다(Shields et al., 2001, J. Biol. Chem. 276:6591-604). 부모 IgG1과 비교하는 경우, Thr256/Ser298, Ser298/Glu333, Ser298/Lys334, 또는 Ser298/Glu333/Lys334에서의 Ala으로의 치환을 포함하는 상기 변이체의 서브셋은 FcγR에 대한 결합 친화성 및 ADCC 활성 둘 모두가 증가된 것을 나타낸다(Shields et al., 2001, J. Biol. Chem. 276:6591-604; Okazaki et al., 2004, J. Mol. Biol. 336:1239-49).
항체의 보체 고정 활성(C1q 결합 및 CDC 활성 둘 모두)은 Lys326 및 Glu333에서의 치환에 의해 개선될 수 있다(Idusogie et al., 2001, J. Immunol. 166:2571-2575). 인간 IgG2 백본 상의 동일 치환은 C1q에 불충분하게 결합하고 보체 활성화 활성이 매우 불충분한 항체 아이소형을 C1q에 결합할 수 있고 CDC를 매개할 수 있는 항체 아이소형으로 전환시킬 수 있다(Idusogie et al., 2001, J. Immunol. 166:2571-75). 항체의 보체 고정 활성을 개선시키기 위해 여러 다른 방법이 또한 적용된다. 예를 들어, IgG의 카르복실-말단으로의 IgM의 18개 아미노산의 카르복실-말단 꼬리 단편의 이식은 이들의 CDC 활성을 크게 향상시킨다. 이는 보통 검출가능한 CDC 활성을 갖지 않는 IgG4를 이용해서도 관찰된다(Smith et al., 1995, J. Immunol. 154:2226-36). 또한, IgG1 중쇄의 카르복시-말단에 가깝게 위치된 Ser444를 Cys로 치환시키는 것은 모노머 IgG1에 비해 CDC 활성의 200배 증가를 갖는 IgG1의 꼬리-대-꼬리 이합체화를 유도하였다(Shopes et al., 1992, J. Immunol. 148:2918-22). 또한, C1q에 대한 특이성을 갖는 이특이적 디아바디 작제물이 또한 CDC 활성을 부여한다(Kontermann et al., 1997, Nat. Biotech. 15:629-31).
보체 활성은 중쇄의 아미노산 잔기 318, 320, 및 322 중 적어도 하나를 상이한 측쇄를 갖는 잔기, 예를 들어, Ala로 돌연변이화시킴으로써 감소될 수 있다. 상기 3개의 잔기 중 어느 하나 대신에 다른 알킬-치환된 비-이온성 잔기, 예를 들어, Gly, Ile, Leu, 또는 Val, 또는 상기 방향족 비-극성 잔기, 예를 들어, Phe, Tyr, Trp 및 Pro는 또한 C1q 결합을 감소시키거나 폐기시킨다. C1q 결합 활성을 감소시키거나 폐기시키기 위해 Ser, Thr, Cys, 및 Met가 잔기 320 및 322에서 사용될 수 있으나, 318에서는 사용될 수 없다. 극성 잔기에 의한 318(Glu) 잔기의 대체는 C1q 결합 활성을 변형시킬 수 있으나, 폐기시키지는 않는다. 잔기 297(Asn)을 Ala로 대체하는 것은 용해 활성의 제거를 발생시키나, C1q에 대한 친화성은 단지 약간 감소(약 3배 더 약함)시킨다. 이러한 변경은 당화 부위 및 보체 활성화에 필요한 탄수화물의 존재를 파괴한다. 이러한 부위에서의 임의의 다른 치환이 또한 당화 부위를 파괴한다. 하기 돌연변이 및 이의 임의의 조합이 또한 C1q 결합을 감소시킨다: D270A, K322A, P329A, 및 P311S(WO 06/036291 참조).
인간 불변 영역에 대한 언급은 임의의 자연 동종이형 또는 자연 동종이형 내의 다형태 위치를 점유하는 잔기의 임의의 순열을 갖는 불변 영역을 포함한다. 또한, Fc 감마 수용체 결합을 감소시키거나 FcRN에 대한 결합을 증가시키는 상기 표시된 것과 같은 1, 2, 5, 또는 10개 이하의 돌연변이가 자연 인간 불변 영역에 비해 존재할 수 있다.
D. 재조합 항체의 발현
인간화 또는 키메라 항체는 통상적으로 재조합 발현에 의해 생성된다. 재조합 폴리뉴클레오티드 작제물은 통상적으로 자연-결합된 프로모터 영역 또는 이종성 프로모터 영역을 포함하는, 항체 사슬의 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 발현 조절 서열을 포함한다. 바람직하게는, 발현 조절 서열은 진핵생물 숙주 세포를 형질전환시키거나 트랜스펙션시킬 수 있는 벡터 내의 진핵생물 프로모터 시스템이다. 벡터가 적절한 숙주 내에 통합된 후, 숙주는 뉴클레오티드 서열의 높은 수준의 발현, 및 교차 반응하는 항체의 수집 및 정제에 적합한 조건하에서 유지된다.
포유동물 세포는 면역글로불린 또는 이의 단편을 엔코딩하는 뉴클레오티드 세그먼트를 발현시키기에 바람직한 숙주이다. 문헌[Winnacker, From Genes to Clones, (VCH Publishers, NY, 1987)]을 참조하라. 온전한 이종성 단백질을 분비할 수 있는 다수의 적합한 숙주 세포주가 당 분야에서 개발되었으며, 이는 CHO 세포주(예를 들어, DG44), 다양한 COS 세포주, HeLa 세포, HEK293 세포, L 세포, 및 Sp2/0 및 NS0를 포함하는 비-항체-생성 골수종을 포함한다. 바람직하게는, 세포는 비인간 세포이다. 상기 세포에 대한 발현 벡터는 발현 조절 서열, 예를 들어, 복제 기점, 프로모터, 인핸서(Queen et al., Immunol. Rev. 89:49 (1986)), 및 필요한 처리 정보 부위, 예를 들어, 리보솜 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 아데닐중합체형성 부위, 및 전사 종료자 서열을 포함할 수 있다. 바람직한 발현 조절 서열은 내인성 유전자, 사이토메갈로바이러스, SV40, 아데노바이러스, 소 파필로마바이러스 등으로부터 유래된 프로모터이다. 예를 들어, 문헌[Co et al., J. Immunol. 148:1149 (1992)]을 참조하라.
CD33 단백질에 대한 인간 항체는 하기 기재된 다양한 기법에 의해 제공될 수 있다. 인간 항체를 생성하는 방법은 문헌[Oestberg et al., Hybridoma 2:361-367 (1983); Oestberg, U.S. Patent No. 4,634,664; 및 Engleman et al., US Patent 4,634,666]의 트리오마(trioma) 방법; 인간 면역글로불린 유전자를 포함하는 트랜스제닉 마우스의 사용(예를 들어, Lonberg et al., W093/12227 (1993); US 5,877,397, US 5,874,299, US 5,814,318, US 5,789,650, US 5,770,429, US 5,661,016, US 5,633,425, US 5,625,126, US 5,569,825, US 5,545,806, Nature 148, 1547-1553 (1994), Nature Biotechnology 14, 826 (1996), Kucherlapati, WO 91/10741 (1991) 참조), 및 파지 디스플레이 방법(예를 들어, Dower et al., WO 91/17271 및 McCafferty et al., WO 92/01047, US 5,877,218, US 5,871,907, US 5,858,657, US 5,837,242, US 5,733,743 및 US 5,565,332 참조)을 포함한다.
발현된 후, 항체는 HPLC 정제, 컬럼 크로마토그래피, 겔 전기영동 등을 포함하는 당 분야의 표준 절차에 따라 정제될 수 있다(일반적으로, Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, NY, 1982) 참조).
IV. 핵산
본 발명은 상기 기재된 인간화 중쇄 및 경쇄 중 임의의 인간화 중쇄 및 경쇄를 엔코딩하는 핵산을 추가로 제공한다. 통상적으로, 핵산은 또한 성숙 중쇄 및 경쇄에 융합된 신호 펩티드를 엔코딩한다. 핵산 상의 코딩 서열은 코딩 서열의 발현을 보장하기 위한 조절 서열, 예를 들어, 프로모터, 인핸서, 리보솜 결합 부위, 전사 종료 신호 등에 작동가능하게 연결될 수 있다. 중쇄 및 경쇄를 엔코딩하는 핵산은 분리된 형태로 발생할 수 있거나, 하나 이상의 벡터로 클로닝될 수 있다. 핵산은, 예를 들어, 고형 상태 합성 또는 중첩 올리고뉴클레오티드의 PCR에 의해 합성될 수 있다. 중쇄 및 경쇄를 엔코딩하는 핵산은, 예를 들어, 발현 벡터 내에서 하나의 연속적 핵산으로 연결될 수 있거나, 예를 들어, 이의 자신의 발현 벡터에 각각 클로닝되는 바와 같이 별개로 존재할 수 있다.
한 구체예에서, 본 기재는 SEQ ID NO: 18의 아미노산 서열을 포함하는 항체 중쇄 가변 영역을 엔코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 이러한 분리된 폴리뉴클레오티드는 인간 IgG 중쇄 불변 영역을 추가로 엔코딩할 수 있다. IgG 불변 영역의 아이소형은, 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4이다. 한 구체예에서, IgG 불변 영역의 아이소형은 IgG1이다. 또 다른 구체예에서, 엔코딩된 IgG1 불변 영역은 케이뱃 넘버링 시스템에 따라 잔기 239에 치환을 포함하는 아미노산 서열, 즉 S239C를 지닌다. 본 기재는 또한 SEQ ID NO: 18의 아미노산 서열을 포함하는 항체 중쇄 가변 영역을 엔코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공하고, 상기 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 추가로 제공한다. 일부 구체예에서, 숙주 세포는 포유동물 숙주 세포, 예컨대 CHO 세포이다.
또 다른 구체예에서, 본 기재는 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 포함하는 항체 경쇄 가변 영역을 엔코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 이러한 분리된 폴리뉴클레오티드는 인간 IgG 경쇄 불변 영역을 추가로 엔코딩할 수 있다. IgG 경쇄 불변 영역의 아이소형은, 예컨대 카파 불변 영역이다. 본 기재는 또한 또한 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 포함하는 항체 경쇄 가변 영역을 엔코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공하고, 상기 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 추가로 제공한다. 일부 구체예에서, 숙주 세포는 포유동물 숙주 세포, 예컨대 CHO 세포이다. 또 다른 구체예에서, 본 기재는 SEQ ID NO: 18의 아미노산 서열을 포함하는 항체 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 포함하는 항체 경쇄 가변 영역을 엔코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드들을 제공하고, 상기 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인은 인간 CD33에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편을 형성한다. 본 기재는 또한 SEQ ID NO: 18의 아미노산 서열을 포함하는 항체 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 포함하는 항체 경쇄 가변 영역을 엔코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드들을 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 발현 벡터 또는 벡터들을 포함하는 숙주 세포가 또한 제공된다. 숙주 세포는 바람직하게는 포유동물 세포, 예컨대 CHO 세포이다.
또 다른 구체예에서, 본 기재는 SEQ ID NO: 18의 아미노산 서열을 포함하는 항체 중쇄 가변 영역을 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 포함하는 항체 경쇄 가변 영역을 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제 1 및 제 2 벡터를 제공하고, 상기 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인은 인간 CD33에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편을 형성한다. 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공되며, 이는 바람직하게는 포유동물 숙주 세포, 예컨대 CHO 세포이다.
V. 항체 약물 컨쥬게이트
항-CD33 항체는 세포독성 모이어티에 컨쥬게이션되어 항체-약물 컨쥬게이트(ADC)를 형성할 수 있다. 항체에 대한 컨쥬게이션에 특히 적합한 모이어티는 세포독성제(예를 들어, 화학요법제), 프로드러그 전환 효소, 방사성 동위원소 또는 화합물, 또는 독소(이들 모이어티는 집합적으로 치료제 또는 약물로 언급됨)이다. 예를 들어, 항-CD33 항체는 세포독성제, 예를 들어, 화학요법제, 또는 독소(예를 들어, 세포증식억제제 또는 세포파괴제, 예를 들어, 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소, 또는 디프테리아 독소)에 컨쥬게이션될 수 있다. 유용한 부류의 세포독성제의 예는, 예를 들어, DNA 작은 홈 결합제, DNA 알킬화 작용제, 및 튜불린 억제제를 포함한다. 예시적인 세포독성제는, 예를 들어, 아우리스타틴(auristatin), 캄프토테신(camptothecin), 듀오카르마이신(duocarmycin), 에토포시드(etoposide), 마이탄신(maytansine) 및 마이탄시노이드(maytansinoid)(예컨대, DM1 및 DM4), 탁산(taxane), 벤조디아제핀(예컨대, 피롤로[1,4]벤조디아제핀(PBD), 인돌리노벤조디아제핀, 및 옥사졸리디노벤조디아제핀) 및 빈카 알칼로이드(vinca alkaloid)를 포함한다. 치료제를 단백질, 특히 항체에 컨쥬게이션시키는 기술은 널리 공지되어 있다 (예컨대, Alley et al., Current Opinion in Chemical Biology 2010 14: 1-9; Senter, Cancer J., 2008, 14(3): 154-169를 참조하라).
치료제 (예컨대, 세포독성제)는 이러한 치료제가 항체로부터 탈착되지 않는 한 (예를 들어, 가수분해, 항체 분해 또는 분해 작용제에 의함) 이의 활성을 감소시키는 방식으로 항체에 컨쥬게이션될 수 있다. 이러한 치료제는 링커를 통해 항체에 부착될 수 있다. 링커에 컨쥬게이션된 치료제는 또한 본원에서 약물 링커로 지칭된다. 링커의 특징은 광범하게 다양할 수 있다. 링커를 구성하는 구성요소는 컨쥬게이트가 전달되는 부위의 상태에 의해 일부 지시될 수 있는, 이들의 특성에 기반하여 선택된다.
이러한 치료제는 항-CD33-발현 암 세포의 세포내 환경에서 분해에 민감하지만, 세포외 환경에는 실질적으로 민감하지 않은 분해가능한 링커를 이용하여 항체에 부착되어, 컨쥬게이트는 항-CD33-발현 암 세포에 의해 내재화되는 경우 항체로부터 분해(예를 들어, 엔도솜 내, 또는, 예를 들어, 리소솜 환경 또는 카베올라(caveolea) 환경 내에서의 pH 민감성 또는 프로테아제 민감성에 의함)된다. 치료제는 또한 비-분해가능한 링커를 이용하여 항체에 부착될 수 있다. 지시에 따라, 링커는 분해가능한 단위를 포함할 수 있다. 그러한 일부 구체예에서, 분해가능한 단위의 구조 및/또는 서열은 표적 부위 (예컨대, 표적 세포)에 존재하는 효소의 작용에 의해 이것이 분해되도록 선택된다. 그 밖의 구체예에서, pH (예컨대, 산 또는 염기 불안정), 온도의 변화에 의해 또는 조사시에 (예컨대, 광불안정) 분해될 수 있는 분해가능한 단위가 또한 이용될 수 있다.
일부 구체예에서, 분해가능한 단위는 하나의 아미노산 또는 연속적인 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 아미노산 서열은 효소에 대한 표적 기질일 수 있다.
일부 양태에서, 분해가능한 단위는 펩티딜 단위이고 적어도 2개의 아미노산 길이이다. 분해제는 카텝신 B 및 D 및 플라스민을 포함할 수 있다(예를 들어, Dubowchik and Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123 참조). 가장 통상적인 것은 항-CD33 발현 세포에 존재하는 효소에 의해 분해될 수 있는 분해가능한 단위, 즉 효소 분해가능한 링커이다. 따라서, 링커는 리소솜 또는 엔도솜 프로테아제를 포함하는 세포내 펩티다제 또는 프로테아제 효소에 의해 분해될 수 있다. 예를 들어, 암성 조직에서 고도로 발현되는 티올-의존성 프로테아제 카텝신-B에 의해 분해가능한 링커가 사용될 수 있다(예를 들어, Phe-Leu 또는 Val-Cit 펩티드 또는 Val-Ala 펩티드를 포함하는 링커).
일부 구체예에서, 링커는 분해가능한 단위 (예컨대, 펩티딜 단위)을 포함할 것이고 분해가능한 단위는 치료제에 직접 컨쥬게이션될 것이다. 다른 구체예에서, 분해가능한 단위는 자가-희생(self-immolative) 스페이서 단위 또는 비-자가-희생 스페이서 단위와 같은 추가의 기능적인 단위를 통해 치료제에 컨쥬게이션될 것이다. 비-자가-희생 스페이서 단위는 스페이서 단위의 일부 또는 전부가 항체 약물 컨쥬게이트로부터의 분해가능한 단위 (예컨대, 아미노산)의 분해 후에 약물 단위에 결합된 채로 남아있는 것이다. 약물을 유리시키기 위해, 독립적 가수분해 반응은 스페이서 단위를 약물로부터 분해시키기 위해 표적 세포 내에서 발생한다.
자가-희생 스페이서 단위를 지니는 약물은 별도의 가수분해 단계를 위한 약물의 요구 없이 방출된다. 한 구체예에서, 링커가 분해가능한 단위 및 자가-희생 그룹을 포함할 때, 분해가능한 단위는 효소의 작용에 의해 분해될 수 있고, 분해가능한 단위의 분해 후에, 자가-희생 그룹(들)이 치료제를 방출시킨다. 일부 구체예에서, 링커의 분해가능한 단위는 한 단부에서 치료제에 직접 또는 간접적으로 컨쥬게이션될 것이고 다른 단부에서는 항체에 직접 또는 간접적으로 컨쥬게이션될 것이다. 그러한 일부 구체예에서, 분해가능한 단위는 한 단부에서 치료제에 직접 또는 간접적으로 (예컨대, 자가-희생 또는 비-자가-희생 스페이서 단위를 통해) 컨쥬게이션될 것이고 다른 단부에서는 스트레처 단위(stretcher unit)를 통해 항체에 컨쥬게이션될 것이다. 스트레처 단위는 항체를 약물 및/또는 약물 링커의 나머지에 연결시킨다. 한 구체예에서, 항체와 약물 또는 약물 링커의 나머지 간의 연결은 말레이미드 기를 통해서, 예를 들어 말레이미도카프로일 링커를 통해서이다. 일부 구체예에서, 항체는 디설파이드를 통해 약물에 연결될 것이고, 예를 들어 디설파이드 연결된 마이탄시노이드 컨쥬게이트 SPDB-DM4 및 SPP-DM1이다.
항체와 링커 간의 연결은 다수의 상이한 경로를 통해, 예컨대 티오에테르 결합을 통해, 디설파이드 결합을 통해, 아미드 결합을 통해, 또는 에스테르 결합을 통해서일 수 있다. 한 구체예에서, 항-CD33 항체와 링커 간의 연결은 항체의 시스테인 잔기의 티올기와 링커의 말레이미드 기 사이에 형성된다. 일부 구체예에서, 항체의 사슬간 결합은 링커의 작용기와 반응하기 전에 유리 티올기로 전환된다. 일부 구체예에서, 시스테인 잔기는 항체의 중쇄 또는 경쇄로 도입되고 링커와 반응한다.
항체 중쇄 또는 경쇄에서 치환에 의해 시스테인을 삽입하기 위한 위치는 미국 출원 공개 2007-0092940호 및 국제 특허 출원 WO2008070593호에 기재된 것들을 포함하고, 상기 특허들 각각은 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 포함된다.
일부 구체예에서, 항체-약물 컨쥬게이트는 하기 일반식 (I)을 갖는다:
L - (LU-D)p (I)
상기 식에서, L은 항-CD33 항체이고, LU는 링커 단위이고, D는 약물 단위이다 (즉, 치료제). 하첨자 p는 1 내지 20의 범위이다. 상기 컨쥬게이트는 링커를 통해 적어도 하나의 약물에 공유적으로 연결된 항-CD33 항체를 포함한다. 링커 단위는 한 단부에서 항체에 연결되고 다른 단부에서 약물에 연결된다.
약물 부하(loading)는 항체 당 약물 분자의 수인 p에 의해 표시된다. 약물 부하는 항체 당 1 내지 20의 약물 단위 (D)의 범위일 수 있다. 당업자는 일부 양태에서, 하첨자 p가 1 내지 20의 범위 (즉, 정수 및 정수가 아닌 값 둘 모두가 1 내지 20임)임을 이해할 것이다. 당업자는 일부 양태에서, 하첨자 p가 1 내지 20의 정수이고, 단일 항체 상에서 약물-링커의 수를 나타냄을 이해할 것이다. 다른 양태에서, p는 항체 당 약물-링커 분자의 평균 수를 나타내고, 예컨대 반응 혼합물 또는 조성물 (예컨대, 약학적 조성물)에서 항체 당 약물-링커의 수를 나타내며, 이는 정수이거나 정수가 아닌 값일 수 있다. 따라서, 일부 양태에서, 조성물 (예컨대, 약학적 조성물)의 경우, p는 조성물에서 항체-약물 컨쥬게이트의 평균 약물 부하를 나타내고, p는 1 내지 20의 범위이다.
일부 구체예에서, p는 항체 당 약 1 내지 약 8의 약물이다. 일부 구체예에서, p는 1이다. 일부 구체예에서, p는 2이다. 일부 구체예에서, p는 항체 당 약 2 내지 약 8의 약물이다. 일부 구체예에서, p는 항체 당 약 2 내지 약 6, 2 내지 약 5, 또는 2 내지 약 4의 약물이다. 일부 구체예에서, p는 항체 당 약 2, 약 4, 약 6 또는 약 8의 약물이다.
컨쥬게이션 반응으로부터의 제조물 내의 항체 단위 당 약물의 평균 수는 통상적인 수단, 예를 들어, 질량분석법, ELISA 검정, 및 HPLC에 의해 특성규명될 수 있다. p에 관해 컨쥬게이트의 정량적 분포 역시 결정될 수 있다.
예시적인 항체-약물 컨쥬게이트는 아우리스타틴 기반 항체-약물 컨쥬게이트, 즉, 약물 구성요소가 아우리스타틴 약물인 컨쥬게이트를 포함한다.
아우리스타틴은 튜불린에 결합하여, 미세 소관 역학과 핵 및 세포 분열을 방해하는 것으로 나타났고, 항암 활성을 지닌다. 전형적으로 아우리스타틴 기반 항체-약물 컨쥬게이트는 아우리스타틴 약물과 항-CD33 항체 사이에 링커를 포함한다. 아우리스타틴은 링커로의 컨쥬게이션에 적합한 임의의 위치에서 항-CD33 항체에 연결될 수 있다. 링커는, 예를 들어, 분해가능한 링커(예컨대, 펩티딜 링커) 또는 비-분해가능한 링커 (예컨대, 항체의 분해에 의해 방출되는 링커)일 수 있다. 아우리스타틴은 아우리스타틴 E 또는 이의 유도체일 수 있다. 아우리스타틴은, 예를 들어, 아우리스타틴 E와 케토산 간에 형성된 에스테르일 수 있다. 예를 들어, 아우리스타틴 E는 파라아세틸 벤조산 또는 벤조일발레르산과 반응하여 각각 AEB 및 AEVB를 생성할 수 있다. 그 밖의 통상적인 아우리스타틴은 MMAF (모노메틸 아우리스타틴 F), 및 MMAE (모노메틸 아우리스타틴 E)를 포함한다. 예시적인 아우리스타틴의 합성 및 구조는 각각의 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 포함되는 미국 공개 7,659,241, 7,498,298, 2009-0111756, 2009-0018086, 및 7,968,687에 기재되어 있다.
예시적인 아우리스타틴 기반 항체-약물 컨쥬게이트는 하기 도시된 vcMMAE, vcMMAF 및 mcMMAF 항체-약물 컨쥬게이트 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하고, 여기서 Ab는 본원에 기재된 항체이고 val-cit는 발린-시트룰린 디펩티드를 나타낸다:
Figure 112020036209062-pat00004
약물 부하(loading)는 항체 당 약물-링커 분자의 수인 p에 의해 표시된다. 문맥에 따라, p는 평균 약물 부하로도 언급되는 항체 당 약물-링커 분자의 평균 수를 나타낼 수 있다. 변수 P는 1 내지 20의 범위이고, 바람직하게는 1 내지 8이다. 일부 바람직한 구체예에서, p가 평균 약물 부하를 나타내는 경우, p는 약 2 내지 약 5의 범위이다. 일부 구체예에서, p는 약 2, 약 3, 약 4, 또는 약 5이다. 일부 구체예에서, 항체는 시스테인 잔기의 황 원자를 통해 링커에 컨쥬게이션된다. 일부 양태에서, 시스테인 잔기는 항체로 조작된 것이다. 다른 양태에서, 시스테인 잔기는 사슬간 디설파이드 시스테인 잔기이다.
예시적인 항체-약물 컨쥬게이트는 PBD 기반 항체-약물 컨쥬게이트; 즉 약물 구성요소가 PBD 약물인 항체-약물 컨쥬게이트를 포함한다.
PBD는 하기 일반식을 지닌다:
Figure 112020036209062-pat00005
이들은 치환기의 수, 유형 및 위치에 있어서, 이들의 방향족 A 고리와 피롤로 C 고리 둘 모두에 있어서, 그리고 C 고리의 포화 정도에 있어서 상이하다. B-고리에서, N10-C11 위치에 이민(N=C), 카르비놀아민(NH-CH(OH)), 또는 카르비놀아민 메틸 에테르(NH-CH(OMe))가 존재하는데, 이는 알킬화 DNA의 원인인 친전자성 중심이다. 알려진 모든 자연 생성물은 C 고리에서 A 고리를 향해 봤을 때 이들에 우회선(right-handed twist)을 제공하는 카이랄 C11a 위치에 (S)-배치를 갖는다. 이는 B-형 DNA의 작은 홈을 이용한 이소나선성(isohelicity)을 위해 이들에게 적합한 3차원 형상을 제공하여, 결합 부위에 스너그 핏(snug fit)을 발생시킨다. 작은 홈에서 부가물을 생성하는 PBD의 능력은 이들로 하여금 DNA 프로세싱을 방해하도록 하여, 이들의 항종양제로서의 용도를 가능케 한다.
이러한 분자의 생물학적 활성은 2개의 PBD 단위를 가요성 알킬렌 링커를 통해 이들의 C8/C'-하이드록실 작용기를 통해 함께 결합시킴에 의해 증강될 수 있다. PBD 이합체는 이들의 생물학적 활성의 주요 원인인 것으로 여겨지는 팔린드롬의 5'-Pu-GATC-Py-3' 가닥간 교차-결합과 같은 서열-선택적인 DNA 병변을 형성하는 것으로 고려된다.
일부 구체예에서, PBD 기반 항체-약물 컨쥬게이트는 항-CD33 항체에 연결된 PBD 이합체를 포함한다. PBD 이합체를 형성하는 단량체는 동일하거나 상이할 수 있고, 즉 대칭이거나 비대칭일 수 있다. PBD 이합체는 링커로의 컨쥬게이션에 적합한 임의의 위치에서 항-CD33 항체에 연결될 수 있다. 예를 들어, 일부 구체예에서, PBD 이합체는 화합물을 항-CD33 항체에 연결시키기 위한 앵커를 제공하는 C2 위치에 치환기를 지닐 것이다. 대안적인 구체예에서, PBD 이합체의 N10 위치는 화합물을 항-CD33 항체에 연결시키기 위한 앵커를 제공할 것이다.
전형적으로, PBD 기반 항체-약물 컨쥬게이트는 PBD 약물과 항-CD33 항체 사이에 링커를 포함한다. 링커는 분해가능한 단위 (예컨대, 효소에 대한 표적 기질인 아미노산 또는 연속적인 아미노산의 서열) 또는 비-분해가능한 링커 (예컨대, 항체의 분해에 의해 방출되는 링커)를 포함할 수 있다. 링커는 말레이미도카프로일과 같은, 항체로의 연결을 위한 말레이미드 기를 추가로 포함할 수 있다. 링커는, 일부 구체예에서, 자가-희생 그룹, 예컨대, 예를 들어, p-아미노벤질 알코올 (PAB) 단위를 추가로 포함할 수 있다.
컨쥬게이트로서 사용하기 위한 예시적인 PBD 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 국제 출원 WO 2011/130613호에 기재되어 있고, 하기와 같으며, 여기서 물결모양 선은 링커로의 부착 부위를 나타낸다:
Figure 112020036209062-pat00006
예시적인 링커는 하기와 같고, 여기서 물결모양 선은 약물로의 부착 부위를 나타내고, 항체는 말레이미드 기를 통해 연결된다.
Figure 112020036209062-pat00007
예시적인 PBD 기반 항체-약물 컨쥬게이트는 하기에 도시된 바와 같은 항체-약물 컨쥬게이트 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하고, 여기서 Ab는 본원에 기재된 항체이다:
Figure 112020036209062-pat00008
약물 부하는 항체 당 약물-링커 분자의 수인 p에 의해 표시된다. 문맥에 따라, p는 평균 약물 부하로도 언급되는 항체 당 약물-링커 분자의 평균 수를 나타낼 수 있다. 변수 p는 1 내지 20의 범위이고, 바람직하게는 1 내지 8이다. 일부 바람직한 구체예에서, p가 평균 약물 부하를 나타내는 경우, p는 약 2 내지 약 5의 범위이다. 일부 구체예에서, p는 약 2, 약 3, 약 4, 또는 약 5이다. 일부 양태에서, 항체는 항체로 조작된 시스테인 잔기의 황 원자를 통해 약물 링커에 컨쥬게이션된다. 일부 양태에서, 시스테인 잔기는 EU 지수에 의해 결정된 대로 위치 239에서 (IgG1) 항체로 조작된다 (Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 and 1991).
VI. CD33에 대한 다른 항체
상기 논의된 m2H12 항체의 인간화 형태 뿐만 아니라, CD33의 세포외 도메인에 결합하는 다른 항체가 본 발명의 방법의 일부, 특히, 암의 치료에 사용될 수 있다. 이들 항체의 키메라 또는 덧댐(veneered) 형태는 하기 요약되는 통상적 방법에 의해 제조될 수 있다.
키메라 항체는 비-인간 항체(예를 들어, 마우스)의 경쇄 및 중쇄의 성숙 가변 영역이 인간 경쇄 및 중쇄 불변 영역과 조합된 항체이다. 이러한 항체는 실질적으로 또는 전적으로 마우스 항체의 결합 특이성을 보유하며, 이는 인간 서열의 약 2/3이다.
덧댐 항체는 CDR의 일부 및 보통 전부 및 비-인간 항체의 비-인간 가변 영역 프레임워크 잔기의 일부를 보유하나, B-세포 또는 T-세포 에피토프에 기여할 수 있는 다른 가변 영역 프레임워크 잔기, 예를 들어, 노출된 잔기(Padlan, Mol. Immunol. 28:489, 1991)를 인간 항체 서열의 상응하는 위치로부터의 잔기로 대체한 인간화 항체의 한 유형이다. 결과는 CDR이 전적으로 또는 실질적으로 비-인간 항체로부터 유래되고, 비-인간 항체의 가변 영역 프레임워크가 치환에 의해 더욱 인간-유사하게 제조된 항체이다.
임의의 항체는 실시예 또는 달리 기재된 바와 같은 경쟁 결합 검정에 의해, m2H12 항체와 같은 표본 항체와 동일하거나 중첩되는 에피토프 특이성을 지니도록 선택될 수 있다. 바람직한 항체는 m2H12 항체와 동일한 에피토프 특이성을 지닌다. 당업자는 다양한 방법을 이용하여 항체에 의해 결합된 에피토프를 확인할 수 있다. 예를 들어, 어레이-기반 올리고펩티드 스캐닝 또는 pepscan 분석은 표적 항원의 중첩 및 비-중첩 세그먼트로부터의 올리고-펩티드 서열의 라이브러리를 이용하여 관심 항체에 결합하는 이들의 능력을 시험한다. 예컨대, 문헌[Geysen et al., PNAS 81:3998-4002 (1984)]을 참조하라. 비-선형 에피토프는 어레이-기반 올리고펩티드 스캐닝의 변형인 예컨대 CLIPS™ 기법을 이용하여 확인될 수 있다. 예컨대, 문헌[Timmerman et al., Open Vaccine J. 2:56-67 (2009)]을 참조하라. 항원 단백질은 또한 돌연변이를 일으킨 후에 관심 항체에 의한 결합을 평가하는데 이용될 수 있다. 단백질 체계적인 부위-지정 돌연변이유발을 이용할 수 있거나 돌연변이의 라이브러리를 제조하여 항체 결합에 대한 스크리닝에 이용할 수 있다. 돌연변이 라이브러리는 예컨대 Integral Molecular로부터 구입할 수 있다. 아미드 하이드로겐/중수소 교환 MS를 이용하여 에피토프를 확인할 수 있다. 관심 항원은 중수(deuterated water)에 놓여서 중양성자로 표지화된다. 그 후 단백질을 프로테아제로 분해시키고, 생성된 펩티드 단편을 질량분석법으로 처리한다. 항원은 또한 항체의 존재로 평가되며 펩티드 단편의 표지화에서의 차이는 항체 결합의 면적을 나타낸다.
VII. 치료 적용
단독이거나 CD33 항체 약물 컨쥬게이트로서의 뮤린 2H12 항체로부터 유래된 항체, 예컨대 키메라 또는 인간화 항체는 암을 치료하는데 사용될 수 있다. 일부 상기 암은 단백질(예를 들어, 예시된 항체 중 하나를 이용한 면역검정에 의함) 또는 mRNA 수준으로 측정되는 CD33의 검출가능한 수준을 나타낸다. 일부 상기 암은 바람직하게는 동일 환자로부터의 동일 유형의 비암성 조직에 비해 CD33의 상승된 수준을 나타낸다. 치료에 적용가능한 암세포에서의 CD33의 예시적 수준은 세포 당 5000-150000개의 CD33 분자이나, 더 높거나 낮은 수준이 치료될 수 있다. 임의로, 암에서의 CD33의 수준은 치료를 수행하기 전에 측정된다.
CD33 발현과 관련되고 치료에 적용가능한 암의 예는 골수성 질환, 예컨대 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 골수성 백혈병 (CML), 기타 골수증식성 질병, 예컨대 만성 골수단핵구 백혈병 및 만성 골수증식성 질병, 급성 전골수세포 백혈병 (APL), 혈소판 백혈병, 골수형성이상 증후군, 전구물질 B-세포 급성 림프모구성 백혈병 (preB-ALL), 전구물질 T-세포 급성 림프모구성 백혈병 (preT-ALL), 다발성 골수종 (MM), 비만세포병, 예컨대 비만세포 백혈병 및 비만세포 육종, 골수성 육종, 불응성 빈혈, 전백혈병 증후군, 림프모양 백혈병, 또는 미분화 백혈병을 포함한다. 또한 치료는 치료를 받은 적이 없는 환자, 기존의 치료 (예를 들면, 화학 요법 또는 마일로타그® (겜투주맙 오조가마이신)에 불응성인 환자, 또는 그러한 치료에 반응한 후에 재발한 환자에게 적용될 수 있다.
키메라 항체 또는 h2H12 항체와 같은 인간화 항체를 포함하는 뮤린 2H12 항체로부터 유래된 CD33 항체는 CD33 단백질을 발현시키는 암을 치료하는데 이용될 수 있다. 한 구체예에서, 뮤린 2H12 항체로부터 유래된 인간화 항체를 이용하여 CD33-양성 급성 골수성 백혈병 (AML)에 걸린 피검체를 치료한다. 추가의 구체예에서, h2H12 항체를 이용하여 CD33-양성 AML에 걸린 피검체를 치료한다. 또 다른 구체예에서, 뮤린 2H12 항체로부터 유래된 인간화 항체를 이용하여 CD33-양성 만성 골수성 백혈병 (CML)에 걸린 피검체를 치료한다. 추가의 구체예에서, h2H12 항체를 이용하여 CD33-양성 CML에 걸린 피검체를 치료한다. 또 다른 구체예에서, 뮤린 2H12 항체로부터 유래된 인간화 항체를 이용하여 CD33-양성 만성 골수단핵구 백혈병 (CMML)에 걸린 피검체를 치료한다. 추가의 구체예에서, h2H12 항체를 이용하여 CD33-양성 만성 CMML에 걸린 피검체를 치료한다. 또 다른 구체예에서, 뮤린 2H12 항체로부터 유래된 인간화 항체를 이용하여 CD33-양성 갑상샘 백혈병에 걸린 피검체를 치료한다. 추가의 구체예에서, h2H12 항체를 이용하여 CD33-양성 갑상샘 백혈병에 걸린 피검체를 치료한다. 또 다른 구체예에서, 뮤린 2H12 항체로부터 유래된 인간화 항체를 이용하여 CD33-양성 골수형성이상 증후군에 걸린 피검체를 치료한다. 추가의 구체예에서, h2H12 항체를 이용하여 CD33-양성 골수형성이상 증후군에 걸린 피검체를 치료한다. 또 다른 구체예에서, 뮤린 2H12 항체로부터 유래된 인간화 항체를 이용하여 CD33-양성 골수증식성 질병에 걸린 피검체를 치료한다. 추가의 구체예에서, h2H12 항체를 이용하여 CD33-양성 골수증식성 질병에 걸린 피검체를 치료한다. 또 다른 구체예에서, 뮤린 2H12 항체로부터 유래된 인간화 항체를 이용하여 CD33-양성 불응성 빈혈에 걸린 피검체를 치료한다. 추가의 구체예에서, h2H12 항체를 이용하여 CD33-양성 불응성 빈혈에 걸린 피검체를 치료한다. 또 다른 구체예에서, 뮤린 2H12 항체로부터 유래된 인간화 항체를 이용하여 CD33-양성 전백혈병 증후군에 걸린 피검체를 치료한다. 추가의 구체예에서, h2H12 항체를 이용하여 CD33-양성 전백혈병 증후군에 걸린 피검체를 치료한다. 또 다른 구체예에서, 뮤린 2H12 항체로부터 유래된 인간화 항체를 이용하여 CD33-양성 림프모양 백혈병에 걸린 피검체를 치료한다. 추가의 구체예에서, h2H12 항체를 이용하여 CD33-양성 림프모양 백혈병에 걸린 피검체를 치료한다. 또 다른 구체예에서, 뮤린 2H12 항체로부터 유래된 인간화 항체를 이용하여 CD33-양성 미분화 백혈병에 걸린 피검체를 치료한다. 추가의 구체예에서, h2H12 항체를 이용하여 CD33-양성 미분화 백혈병에 걸린 피검체를 치료한다. 한 구체예에서, 뮤린 2H12 항체로부터 유래된 인간화 항체를 이용하여 CD33-양성 전구물질 B-세포 급성 림프모구성 백혈병 (preB-ALL)에 걸린 피검체를 치료한다. 추가의 구체예에서, h2H12 항체를 이용하여 CD33-양성 pre-B-ALL에 걸린 피검체를 치료한다. 한 구체예에서, 뮤린 2H12 항체로부터 유래된 인간화 항체를 이용하여 CD33-양성 전구물질 T-세포 급성 림프모구성 백혈병 (preT-ALL)에 걸린 피검체를 치료한다. 추가의 구체예에서, h2H12 항체를 이용하여 CD33-양성 preT-ALL에 걸린 피검체를 치료한다. 한 구체예에서, 뮤린 2H12 항체로부터 유래된 인간화 항체를 이용하여 CD33-양성 다발성 골수종 (MM)에 걸린 피검체를 치료한다. 추가의 구체예에서, h2H12 항체를 이용하여 CD33-양성 MM에 걸린 피검체를 치료한다. 한 구체예에서, 뮤린 2H12 항체로부터 유래된 인간화 항체를 이용하여 비만세포 백혈병 및 비만세포 육종을 포함하는 CD33-양성 비만세포병에 걸린 피검체를 치료한다. 추가의 구체예에서, h2H12 항체를 이용하여 비만세포 백혈병 및 비만세포 육종을 포함하는 CD33-양성 비만세포병에 걸린 피검체를 치료한다.
CD33 항체는, 예를 들어, 컨쥬게이션되지 않거나 컨쥬게이션된 항체, 예컨대 CD33 항체 약물 컨쥬게이트일 수 있다. 일부 구체예에서, 항-CD33 항체는 인간화 또는 키메라 2H12 항체일 수 있다. 일부 구체예에서, 항-CD33 항체는 CD33과의 특이적 결합에 대해 뮤린, 인간화, 또는 키메라 2H12 항체와 경쟁하는 항체일 수 있다.
키메라 항체 또는 h2H12와 같은 인간화 항체를 포함하는 뮤린 2H12 항체로부터 유래된 CD33 항체는 치료제와 컨쥬게이션되어 CD33-양성 암을 지니는 피검체를 치료하는데 이용될 수 있다. 치료제의 예는 본원에서 제공되며, 활성 치료제, 예컨대, 아우리스타틴, 및 고도로 활성인 치료제, 예컨대 PBD를 포함한다. 활성 치료제에 컨쥬게이션된 h2H12 항체, 즉, h2H12 항체-약물 컨쥬게이트 (ADC)를 이용하여 CD33-양성 암을 지닌 피검체를 치료할 수 있다. 아우리스타틴에 컨쥬게이션된 h2H12 항체를 이용하여 CD33-양성 암을 지닌 피검체를 치료할 수 있다. 고도로 활성인 치료제에 컨쥬게이션된 h2H12 항체를 이용하여 CD33-양성 암을 지닌 피검체를 치료할 수 있다. PBD에 컨쥬게이션된 h2H12 항체를 이용하여 CD33-양성 암을 지닌 피검체를 치료할 수 있다.
일부 암 세포는 단백질의 증가된 발현이 암 세포 밖으로 치료제의 유출을 증가시킨 후에 치료제에 대한 내성을 발생시킨다. 그러한 단백질은 P-당단백질, 다중약물 내성-관련 단백질, 폐 내성-관련 단백질, 및 유방암 내성 단백질을 포함한다. 암 세포에서 약물 내성의 검출이 당업자에 의해 수행될 수 있다. 유출 단백질을 검출하는 항체 또는 검정은, 예컨대 Promega, Millipore, Abeam, 및 Sigma-Aldrich로부터 시판된다. 한 구체예에서, 뮤린 2H12 항체로부터 유래된 항체를 이용하여 다중약물 내성 암, 예컨대, CD33-양성 다중약물 내성 암을 지닌 피검체를 치료한다. 또 다른 구체예에서 뮤린 2H12 항체로부터 유래된 인간화 항체를 이용하여 다중약물 내성 암, 예컨대, CD33-양성 다중약물 내성 암을 지닌 피검체를 치료한다. 한 구체예에서, h2H12 항체를 이용하여 다중약물 내성 암, 예컨대, CD33-양성 다중약물 내성 암을 지닌 피검체를 치료한다. 추가의 구체예에서, h2H12 ADC를 이용하여 다중약물 내성 암, 예컨대, CD33-양성 다중약물 내성 암을 지닌 피검체를 치료한다. 또 다른 구체예에서, 고도로 활성인 치료제에 컨쥬게이션된 h2H12 항체를 이용하여 다중약물 내성 암, 예컨대, CD33-양성 다중약물 내성 암을 지닌 피검체를 치료한다. 또 다른 구체예에서, PBD에 컨쥬게이션된 h2H12 항체를 이용하여 다중약물 내성 암, 예컨대, CD33-양성 다중약물 내성 암을 지닌 피검체를 치료한다. 추가의 구체예에서, PBD에 컨쥬게이션된 h2H12 항체를 이용하여 다중약물 내성인 CD33-양성 급성 골수성 백혈병 (AML)에 걸린 피검체를 치료한다.
뮤린 2H12 항체로부터 유래된 인간화 또는 키메라 항체 단독 또는 이의 약물-컨쥬게이트는 암의 발병을 지연시키고/시키거나, 중증도를 감소시키고/시키거나, 추가 악화를 억제하고/하거나, 적어도 하나의 증후 또는 증상을 개선시키는, 투여량을 의미하는 유효 섭생, 투여 경로 및 투여 빈도로 투여된다. 환자가 이미 암에 걸린 경우, 섭생은 치료적 유효 섭생으로 언급될 수 있다. 환자가 일반 집단에 비해 암의 위험이 상승되어 있으나, 아직 증상을 경험하지 않은 경우, 섭생은 예방적 유효 섭생으로 언급될 수 있다. 일부 예에서, 치료적 또는 예방적 효능은 과거 대조군에 비해 개별적 환자에서 관찰될 수 있거나, 동일 환자에서의 과거 경험에서 관찰될 수 있다. 다른 예에서, 치료적 또는 예방적 효능은 비처리된 환자의 대조 집단에 비해 처리된 환자의 집단에서 전임상 또는 임상 시험에서 입증될 수 있다.
모노클로날 항체에 대한 예시적 투여량은 0.1 mg/kg(환자의 체중의 kg) 내지 50 mg/kg, 더욱 통상적으로 1 mg/kg 내지 30 mg/kg, 1 mg/kg 내지 20 mg/kg, 1 mg/kg 내지 15 mg/kg, 1 mg/kg 내지 12 mg/kg, 또는 1 mg/kg 내지 10 mg/kg 1, 또는 2 mg/kg 내지 30 mg/kg, 2 mg/kg 내지 20 mg/kg, 2 mg/kg 내지 15 mg/kg, 2 mg/kg 내지 12 mg/kg, 또는 2 mg/kg 내지 10 mg/kg, 또는 3 mg/kg 내지 30 mg/kg, 3 mg/kg 내지 20 mg/kg, 3 mg/kg 내지 15 mg/kg, 3 mg/kg 내지 12 mg/kg, 또는 3 mg/kg 내지 10 mg/kg이다. 아우리스타틴과 같은 이의 활성 모노클로날 항체 약물 컨쥬게이트에 대한 예시적 투여량은 고정된 투여량으로서 1 mg/kg(피검체의 체중의 kg) 내지 7.5 mg/kg, 또는 2 mg/kg 내지 7.5 mg/kg 또는 3 mg/kg 내지 7.5 mg/kg, 또는 0.1-20, 또는 0.5-5 mg/kg(체중)(예를 들어, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 mg/kg) 또는 10-1500 또는 200-1500 mg이다. PBD와 같은 이의 고도로 활성인 모노클로날 항체 약물 컨쥬게이트에 대한 예시적 투여량은 피검체의 체중 kg에 대하여 1.0 μg 내지 1.0 mg, 또는 1.0 μg 내지 500.0 μg이다. 일부 방법에서, 환자에게 이어서 2주, 3주 또는 4주 마다 항체 또는 ADC가 투여된다. 투여량은 다른 요인 중에서 투여 빈도, 환자의 상태 및 존재시, 처리 전 반응, 치료가 예방적 또는 치료적인지의 여부 및 장애가 급성 또는 만성인지의 여부에 좌우된다.
투여는 비경구, 정맥내, 경구, 피하, 동맥내, 두개내, 수막강내, 복막내, 국소, 비내 또는 근내 투여일 수 있다. 투여는 또한 종양에 직접 국소화될 수 있다. 정맥내 또는 피하 투여에 의한 전신 순환으로의 투여가 바람직하다. 정맥내 투여는, 예를 들어, 30-90분과 같은 기간에 걸친 주입 또는 단일 볼루스 주사에 의해 이루어질 수 있다.
투여 빈도는 다른 요인 중에서 순환 내에서의 항체 또는 항체-약물 컨쥬게이트의 반감기, 환자의 상태 및 투여 경로에 좌우된다. 빈도는 환자의 상태 또는 치료되는 암의 진행에서의 변화에 반응하여 매일, 매주, 매월, 연4회, 또는 비정기적 간격일 수 있다. 정맥내 투여에 대한 예시적 빈도는 연속적 치료 과정에 걸쳐 매주 2회 내지 연4회 사이이나, 더 빈번하거나 덜 빈번한 투여가 또한 가능하다. 정맥내 투여에 대한 다른 예시적 빈도는 연속적 치료 과정에 걸쳐 매주 1회 또는 매월 1회 사이이나, 더 빈번하거나 덜 빈번한 투여가 또한 가능하다. 피하 투여를 위해, 예시적 투여 빈도는 매일 내지 매월이나, 더 빈번하거나 덜 빈번한 투여가 또한 가능하다.
투여되는 투여량의 횟수는 암의 특성(예를 들어, 급성 또는 만성 증상을 나타내는지의 여부) 및 치료에 대한 장애의 반응에 좌우된다. 급성 장애 또는 만성 장애의 급성 악화에 대해, 1 내지 10회의 용량이 종종 충분하다. 때때로, 임의로 나누어진 형태의 단일 볼루스 용량이 급성 장애 또는 만성 장애의 급성 악화에 충분하다. 치료는 급성 장애 또는 급성 악화의 재발에 대해 반복될 수 있다. 만성 장애에 대해, 항체는 적어도 1, 5 또는 10년 동안, 또는 환자의 생애 동안 정기적 간격, 예를 들어, 매주, 격주, 매월, 연4회, 6개월 마다 투여될 수 있다. 비경구 투여를 위한 약학적 조성물은 바람직하게는 살균되어 있고, 실질적으로 등장성이고, GMP 조건하에서 제조된다. 약학적 조성물은 단위 투여 형태(즉, 단일 투여를 위한 투여량)로 제공될 수 있다. 약학적 조성물은 하나 이상의 생리학적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 보조제를 이용하여 제형화될 수 있다. 제형은 선택된 투여 경로에 좌우된다. 주사를 위해, 항체는 수용액, 바람직하게는 생리학적 상용성 완충액, 예를 들어, 행크액(Hank's solution), 링거액(Ringer's solution), 또는 생리학적 염수 또는 아세테이트 완충액(주사 부위에서의 불편함을 감소시키기 위함) 중에서 제형화될 수 있다. 용액은 제형화 작용제, 예를 들어, 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 항체는 사용 전에 적합한 비히클, 예를 들어, 멸균 발열원 비함유 물을 이용한 재구성을 위한 동결건조된 형태일 수 있다. 액체 제형 중의 항체의 농도는, 예를 들어, .01-10 mg/ml, 예를 들어, 1.0 mg/ml일 수 있다.
본 발명의 항체를 이용한 치료는 화학요법, 방사선, 줄기세포 치료, 수술, 치료되는 장애에 대해 효과적인 다른 치료와 조합될 수 있다. CD33에 대한 인간화 항체와 함께 투여될 수 있는 다른 작용제의 유용한 부류는, 예를 들어, 암성 세포에서 발현되는 다른 수용체에 대한 항체, 항튜불린 작용제(예를 들어, 아우리스타틴), DNA 작은 홈 결합제 (예컨대, PBD), DNA 복제 억제제, 알킬화 작용제(예를 들어, 백금 복합체, 예를 들어, 시스-플라틴, 모노(백금), 비스(백금) 및 3-핵 백금 복합체 및 카르보플라틴), 안트라사이클린, 항생제, 항폴린산제, 항대사물질, 화학요법 민감제, 듀오카르마이신, 에토포시드, 플루오르화된 피리미딘, 이온운반체, 렉시트롭신(lexitropsin), 니트로소우레아, 플라티놀, 예비-형성 화합물(pre-forming compound), 퓨린 항대사물, 퓨로마이신, 방사선 민감제, 스테로이드, 탁산, 국소이성화효소 억제제, 빈카 알칼로이드 등을 포함한다.
단독이거나 항체 약물 컨쥬게이트로서의 상기 기재된 다른 작용제 또는 섭생 중 임의의 작용제 또는 섭생과 임의로 조합된 뮤린 2H12 항체로부터 유래된 항체, 예컨대 키메라 항체, 인간화 항체, 또는 h2H12 항체를 이용한 처리는 뮤린 2H12 항체로부터 유래된 항체 단독 또는 항체-약물 컨쥬게이트가 없는 동일 처리(예를 들어, 화학요법)에 비해 특히 재발성이거나 불응성인 경우, 암(예를 들어, ALL, CML, CMML)을 갖는 환자의 중간 무진행 생존(median progression-free survival) 또는 전체 생존 기간을 적어도 30% 또는 40%, 바람직하게는 50%, 60% 내지 70% 또는 심지어 100% 또는 이보다 더 길게 증가시킬 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 뮤린 2H12 항체로부터 유래된 항체 단독 또는 항체-약물 컨쥬게이트를 포함하는 처리(예를 들어, 표준 화학요법)는 뮤린 2H12 항체로부터 유래된 항체가 없는 동일 처리(예를 들어, 화학요법)에 비해 종양을 갖는 환자의 완전 반응률, 부분 반응률, 또는 객관적 반응률(완전 + 부분)을 적어도 30% 또는 40%, 바람직하게는 50%, 60% 내지 70% 또는 심지어 100%만큼 증가시킬 수 있다.
통상적으로, 임상 시험(예를 들어, II상, II/III상 또는 III상 시험)에서, 표준 요법을 단독(또는 위약을 더함)으로 받은 환자의 대조군에 비해 표준 요법에 더한 뮤린 2H12 항체로부터 유래된 항체로 처리된 환자의 중간 무진행 생존률 및/또는 반응률에서의 상기 언급된 증가는, 예를 들어, p = 0.05 또는 0.01 또는 심지어 0.001 수준에서 통계적으로 유의하다. 완전 반응률 및 부분 반응률은, 예를 들어, 미국 국립암연구소(National Cancer Institute) 및/또는 미국 식품의약국(Food and Drug Administration)에 나열되어 있거나 이에 의해 허용되는 바와 같은 암에 대한 임상 시험에서 통상적으로 사용되는 객관적 기준에 의해 결정된다.
VIII. 기타 적용
본원에 기재된 항-CD33 항체는 임상 진단 또는 치료의 상황 또는 연구 시에 CD33을 검출하는데 사용될 수 있다. 암에서의 CD33의 발현은 암이 본 발명의 항체를 이용한 치료에 적용가능하다는 표시를 제공한다. 항체는 또한 CD33를 갖는 세포 및 다양한 자극에 대한 이들의 반응을 검출하는 실험실 연구를 위해 연구 시약으로 판매될 수 있다.
상기 용도에서, 모노클로날 항체는 형광 분자, 회전-표지된 분자(spin-labeled molecule), 효소 또는 방사성동위원소로 표지될 수 있고, CD33에 대한 검정을 수행하기 위한 모든 필요한 시약을 갖는 키트의 형태로 제공될 수 있다. 본원에 기재된 항체, m2hl2 및 이의 키메라 또는 인간화 형태, 예를 들어 h2H12는 CD33 단백질 발현을 검출하고 암이 CD33 ADC를 이용한 처리에 적용가능한지의 여부를 결정하는데 사용될 수 있다. 예로서, 뮤린 2H12 및 이의 키메라 또는 인간화 형태, 예컨대 h2H12는 림프구, 림프모구, 단핵구, 골수성단핵구 또는 그 밖의 CD33-발현 세포 상에서 CD33 발현을 검출하는데 사용될 수 있다. 항체는 또한, 예를 들어, 친화성 크로마토그래피에 의해 CD33 단백질을 정제하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 임의의 특징, 단계, 구성요소, 구체예, 또는 양태는 달리 명확히 표시하지 않는 한 임의의 다른 특징, 단계, 구성요소, 구체예, 또는 양태와 조합하여 사용될 수 있다. 본 발명은 명료함 및 이해의 목적을 위해 예시 및 실시예에 의해 다소 상세히 기재되나, 특정 변화 및 변형이 첨부된 청구항의 범위 내에서 실시될 수 있음이 명백할 것이다.
실시예
I. 항-CD33 항체의 생성
물질
하기 실시예에 기재되는 세포주를 미국 미생물 보존센터(American Type Culture Collection, ATCC)(Manassas, VA) 또는 독일 생물자원센터(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, (DMSZ))(Braunschweig, Germany)에 의해 상술된 조건에 따라 배양 상태로 유지시켰다. 일차 AML 세포를 각각 25 ng/ml의 과립구-대식세포-집락-자극 인자 (GM-CSF), 과립구-집락-자극 인자 (G-CSF), 인터루킨-3 (IL-3) 및 줄기 세포 인자 (SCF)가 보충된, 20% 열-불활성화 FBS를 함유하는 Iscove 변형된 둘베코 배지 (IMDM)에 유지시켰다. 세포 배양 시약을 Invitrogen Corp (Carlsbad, CA)으로부터 입수하였고, 사이토카인을 PeproTech (Rocky Hill, NJ)에서 구입하였다.
방법:
포화 결합 검정
십만 개의 CD33-양성 세포 (인간 또는 시노몰로구스 CD33을 발현하도록 트랜스펙션된 HL-60, HEL 92.1.7, 및 HEK-293F 세포)를 96-웰 플레이트로 옮겼다. AlexaFluor-647 표지된 CD33 mAb를 50 nM 내지 0.85 pM 범위의 농도로 첨가하고, 세포를 30분 동안 얼음 상에서 인큐베이션하였다. 세포를 원심분리에 의해 펠렛화시키고, PBS + 1% BSA 용액으로 3회 세척하고, 125 μL의 PBS + 1% BSA에 재현탁시켰다. 형광성을 흐름세포측정기를 이용하여 분석하고, 포화 형광 신호의 퍼센트를 이용하여 결합된 퍼센트를 결정하고, 이후 겉보기 Kd를 계산하였다.
경쟁 결합 검정
십만 개의 CD33-양성 세포를 96-웰 플레이트로 옮기고, 1 nM의 AlexaFluor-647 표지된 m2H12 및 증가하는 농도(0.03 nM로부터 600 nM)의 표지되지 않은 하이브리드, 인간화 또는 키메라 2H12 mAb와 함께 얼음 상에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 원심분리하고, PBS로 3회 세척하고, 125 μL의 PBS + 1% BSA 용액에 재현탁시켰다. 형광성을 흐름세포측정기를 이용하여 분석하고, 포화 형광 신호의 퍼센트를 이용하여 결합된 표지된 2H12 mAb 퍼센트를 결정하였다. 데이터를 가변 기울기를 갖는 S자 형 용량-반응 곡선에 적합화시킴으로써 EC50을 외삽(extrapolation)하였다.
세포독성 검정
AML 세포주 또는 일차 AML 세포를 96시간 동안 37℃에서 CD33-특이적 mAb 및 항체 약물 컨쥬게이트 (ADC)로 처리하였다. 일부 실험에서, 비-항원 결합 ADC를 음성 대조군으로 포함시켰다. 세포주에 대한 세포 생존력을 CelltiterGlo (Promega Corporation, Madison, WI)를 이용하여 제조사의 지시에 따라 측정하였다. 세포를 실온에서 CelltiterGlo 시약과 함께 25분 동안 인큐베이션하고, 발광을 Fusion HT 형광 플레이트 판독기 (Perkin Elmer, Waltham, MA) 상에서 측정하였다. 일차 AML 세포의 경우, 생존력은 흐름세포측정법에 의해 Annexin V 및 프로피듐 아이오다이드 염색을 이용하여 측정되었다. 결과를 비히클-처리된 세포(대조군 = 100%)에 비해 생존력에서 50% 감소를 발생시키는데 필요한 화합물의 농도인 IC50으로 보고하였다.
항체 약물 컨쥬게이트의 생성
CD33 항체의 항체 약물 컨쥬게이트를 US20050238649 및 WO2011/130613에 기재된 바와 같이 본원에 기재된 항-CD33 항체를 이용하여 제조하였다. 약물 링커 SGD-1269 (mcMMAF)는 US20050238649호에 기재되어 있고 약물 링커 SGD-1910은 WO2011/130613호에 기재되어 있다. IgG1 mAb의 시스테인 돌연변이체의 제조는 일반적으로 US20100158909호에 기재되어 있다. 약물-링커 SGD-1269는 사슬간 디설파이드 결합의 시스테인 잔기의 티올 기를 통해 항-CD33 항체 h2H12에 컨쥬게이션되었고, 평균 약물 부하는 항체 당 약 4의 약물이었다. 약물-링커 SGD-1910은 항체의 IgG1 사슬의 위치 239에 도입된 시스테인 잔기의 티올 기를 통해 항-CD33 항체에 컨쥬게이션되었고, 평균 약물 부하는 항체 당 약 2의 약물이었다. 239 위치에 시스테인을 지닌 항체는 명칭 EC를 지니며, 예컨대, h2H12EC 또는 hOOEC이다.
생체내 활성 연구
파종성 AML 모델
CB-17/IcrHsd-PrkdcSCID (SCID) 마우스에 5xl06개 HL-60 종양 세포를 꼬리 정맥에 정맥내 접종하였다. 종양 접종 1일 후에, 마우스 (n= 8/그룹)를 비처리하거나 총 2회 용량의 CD33 mAb 및 ADC 또는 비-결합 대조군 mAb 및 ADC를 4일마다 복막내 투여하였다. 7일마다 총 2회 용량으로 복막내 투여되는 마일로타그를 이러한 마일로타그-민감성 AML 모델의 양성 대조군으로 포함시켰다. 체중 손실이 ≥20%이거나, 마우스가 뇌 부종 및/또는 뒷다리 마비, 또는 촉진가능한 파종 종양 덩어리의 발생을 포함한 중추신경계 증상으로 증명된 파종성 질병의 징후를 나타내었을 때, 동물을 안락사시켰다.
피하 AML 모델
SCID 마우스에 5xl06개 HL-60 또는 TF1-α AML 종양 세포를 피하 접종하였다. 캘리퍼스를 이용하여 종양 성장을 모니터하였고, 하기 식(0.5 x [길이 x 폭2])을 이용하여 평균 종양 부피를 계산하였다. 평균 종양 부피가 약 100 mm3에 도달한 경우, 마우스 (n=6-7/그룹)를 비처리하거나 단일 용량의 CD33 ADC 또는 비-결합 대조군 ADC를 복막내 투여하였다. HL-60 모델의 경우, AML 세포에 대한 시험 ADC와 Fc 수용체의 상호작용을 최소화하기 위해, 치료용 항체를 투여하기 약 4시간 전에 마우스를 인간 IVIg (10 mg/kg의 단일 복막내 주사)로 처리하였다. 종양 부피가 약 1000 mm3에 도달했을 때, 마우스를 안락사시켰다. 모든 동물 절차를 국제실험동물관리평가인증협회(Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care)에 의해 인가된 시설 내에서 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)에 의해 승인된 프로토콜 하에서 수행하였다.
결과
1. 뮤린 CD33 mAb의 생성
인간 CD33 항원에 대해 유도된 항체는 재조합 인간 CD33-Fc 융합 단백질로의 면역화에 의해 Balb/c 마우스에서 생성되었다. 뮤린 mAb 2H12 (m2H12)는 비인간 영장류에서 전임상 시험을 가능케 하는 인간 CD33 및 시노몰로구스 CD33에 대한 결합 친화성에 기반하여 선택되었다.
2. 인간화 항체의 설계 및 시험
인간화 항체는 뮤린 2H12 항체로부터 유래되었다. 상이한 위치에 복귀돌연변이를 혼입시켜 9개의 인간화 중쇄 (HA-HI) 및 7개의 인간화 경쇄 (LA-LG)가 제조되었다. 도 1a, 1b 서열 정렬 및 표 1-4를 참조하라.
표 1 중쇄 변이체에서 인간화 돌연변이
Figure 112020036209062-pat00009
표 2 경쇄 변이체에서 인간화 돌연변이
Figure 112020036209062-pat00010
표 3 2H12 중쇄 변이체에서 특이적 돌연변이
Figure 112020036209062-pat00011
*마우스 잔기
표 4 2H12 경쇄 변이체에서 특이적 돌연변이
Figure 112020036209062-pat00012
*마우스 잔기
인간화 중쇄 및 경쇄를 키메라 경쇄 및 중쇄(키메라 사슬은 뮤린 가변 영역 및 인간 불변 영역으로 구성됨)와 각각 페어링시켰다. CD33 mAb의 인간화/키메라 하이브리드 변이체를 HEL 92.1.7 AML 세포의 표면 상에서 발현되는 인간 CD33과의 결합에 대해 시험하였다 (표 5). 중쇄 HC 및 HI를 추가 연구를 위해 선택하였다. 인간화 중쇄 HC 및 HI 및 인간화 경쇄 LA, LE 및 LG의 순열을 나타내는 인간화 항체가 발현되었고, 인간 또는 시노몰구스 (cyno) CD33을 발현시키는 세포와의 결합을 측정하였다 (표 6). HILG 항체 (2H12 HILG)를 뮤린 CD33 mAb m2H12의 결합 특성을 가장 밀접하게 모방하는 인간화 항체로서 선택하였다. HILG 항체를 h2H12 항체 (인간 2H12 항체)로서 지칭한다. IgG1 중쇄에 S239C 돌연변이 (EU 넘버링)를 지니는 m2H12, h2H12, 및 h2H12에 대한 KD (조작된 시스테인의 경우, h2H12EC로서 지칭됨)를 2개의 AML 세포주에서 내인성 단백질로서 발현되거나 HEK293F 세포주에서 재조합 단백질로서 발현되는 인간 CD33에 대해 결정하였다. 이러한 항체의 KD는 또한 HEK293F 세포주에서 재조합 단백질로서 발현되는 cyno CD33에 대해 결정되었다 (표 7).
표 5 CD33-발현 HEL9217 AML 세포 상에서 키메라-인간화 하이브리드 CD33 mAb 변이체에 대한 EC50 결합능 결정
Figure 112020036209062-pat00013
DNB, 결합하지 않음; m, 뮤린; cH, 키메라 중쇄; cL, 키메라 경쇄
표 6 인간 CD33 및 Cyno CD33-발현 세포 세포 상에서 인간화 CD33 mAb 변이체에 대한 EC50 결합능 결정
Figure 112020036209062-pat00014
표 7 인간 및 Cyno CD33-발현 세포에 대한 인간화 CD33 mAb의 친화성 측정
Figure 112020036209062-pat00015
ND, 수행되지 않음
h2H12 ADC의 시험관내 항-종양 활성
2개의 약물 링커 시스템인 SGD-1269 (아우리스타틴 약물-링커) 및 SGD-1910 (피롤로벤조디아제핀 이합체 약물-링커)을 이용하여 h2H12 항체-약물 컨쥬게이트의 세포독성 활성을 시험하였다. 세포독성 검정은 2개의 CD33-양성 AML 세포주 HL-60 및 HEL 92.1.7에 대해 컨쥬게이션되지 않은 항체 h2H12-ADC 및 CD33에 결합하지 않는 대조군 ADC를 이용하여 수행되었다. 도 2에 도시된 대로, h2H12 및 h2H12EC (h2H12d로도 지칭됨) 컨쥬게이션되지 않은 항체는 어느 세포주에 대해서도 활성이 없었다. 마찬가지로, 비-결합 대조군 ADC (hOOEC-SGD-1910 및 hOO-SGD-1269)는 세포독성이 아니었다. 대조적으로, h2H12EC-SGD-1910은 HL-60 (IC50 ~ 1.6 ng/mL) 및 HEL 92.1.7 (IC50 -12.9 ng/mL)에 대해 세포독성이었다. h2H12EC-SGD-1910의 활성은 HL-60 세포에 대해 널리 기재된 항-CD33 유도된 항체 약물 컨쥬게이트인 마일로타그의 활성과 유사하였고, 마일로타그가 효과가 없는 HEL 92.1.7 (다중약물 내성 (MDR) 세포주)에 대해 시험했을 때 더욱 효능이 있었다. m2H12-SGD-1269 및h2H12-SGD-1269는 HL-60 세포(각각 1.3 ng/mL 및 5.3 ng/mL의 IC50)에 대해 활성이었고 HEL 92.1.7에 대해서는 덜한 정도로 활성이었다 (도 2). 별도의 실험에서, h2H12-SGD-1269 및 h2H12EC-SGD-1910을 CD33-양성 AML 세포주의 확장된 패널에 대해 추가로 시험하였다. 표 8에 도시된 대로, h2H12-SGD-1269는 7개의 AML 세포주 중 4개에 대해 활성이었고 (반응성 세포주에 대한 평균 IC50, 72.8 mg/mL), h2H12EC-SGD-1910은 시험된 7개 AML 세포주 중 7개에 대해 강력한 활성이 있었다 (평균 IC50, 20.4 ng/mL). h2H12EC-SGD-1910은 8개의 CD33-양성 AML 세포주 중 3개에서 활성이며 마일로타그보다 더욱 효능 있었다. ADC를 AML 기원을 지니지 않고 CD33을 발현시키지 않는 3개의 세포주에 대해 시험했을 때 어떠한 활성도 관찰되지 않았다 (표 8). 총괄하여, 이러한 데이터는 h2H12 및 h2H12EC 항체 약물 컨쥬게이트가 CD33-양성 세포를 선택적으로 표적화하고 이러한 세포에 대해 세포독성 활성을 나타냄을 입증한다.
표 8 AML 세포주에 대한 h2H12 약물 컨쥬게이트 및 마일로타그의 시험관내 활성
Figure 112020036209062-pat00016
MDR, 다중약물 내성; +, 염료 유출 > 백그라운드의 2배 이상, NT, 시험되지 않음
h2H12 ADC의 생체내 항-종양 활성
파종성 질환을 개시하기 위해 HL-60 AML 세포주가 SCID 마우스에 도입된 모델에서 h2H12-SGD-1269의 활성을 시험하였다. 다음 날 마우스를 표 9에 기재된 용량 수준 및 스케쥴에 따라 h2H12 항체, 비-특이적 IVIg 음성 대조군 항체, h2H12-SGD-1269, 비-결합 대조군 ADC (hBU12-SGD-1269) 또는 마일로타그로 처리하였다. HL-60-접종된 마우스의 평균 생존은 비처리되거나 인간 IVIg-처리된 그룹에서의 22일로부터 h2H12 (3 mg/kg) 및 1 또는 3 mg/kg h2H12-SGD-1269를 각각 수용한 그룹에서 29일 (p=0.007), 41일 (p=0.001) 및 52일 (p< 0.001)까지 증가하였다 (표 9). h2H12EC-SGD-1269는 h2H12-SGD-1269가 투여된 마우스의 생존과 유사하게 생존을 연장시켰다 (각각 50 및 52일의 평균 생존). 마일로타그 역시 MDR-음성 모델에서 활성이었고; 50%가 넘는 마일로타그-처리된 마우스는 연구의 끝인 99일까지 생존하였다. 컨쥬게이션되지 않은 항체 h2H12 또는 비-결합 대조군 ADC (hBU12-SGD-1269)로 처리된 마우스의 생존은 비처리된 대조 마우스에 비해 6-7일 연장되었으나, 이는 CD33-표적화 ADC로 처리된 마우스보다 현저하게 덜한 정도였다.
표 9 파종성 HL-60 AML 이종이식편 모델에서 h2H12-SGD-1269 약물 컨쥬게이트의 활성
Figure 112020036209062-pat00017
1시험 대 비처리
2시험 대 hIVIg
3시험 대 hBU12-SGD-1269 (비-결합 대조군 ADC)
NS, 유의하지 않음; NR, 도달하지 못함; ---, 적용할 수 없음; hIVIG, 인간 정맥내 면역글로불린; hBU12-SGD-1269, 비-결합 대조군 ADC.
h2H12EC-SGD-1910의 활성을 2개의 피하 AML 이종이식편 모델 HL-60 및 TF1-α에서 시험하였다. 확립된 (~100mm3) 종양을 지닌 SCID 마우스에게 HL-60 모델의 경우 표 10에 기재된 대로 그리고 TF1-αtumor 모델의 경우 표 11에 기재된 대로 h2H12EC-SGD-1910 또는 비-결합 대조군 ADC (hOOEC-SGD-1910)를 투여하였다. h2H12EC-SGD-1910로의 처리는, 종양이 부피에 있어 4배가 되는 평균 시간에 의해 측정되는 바와 같이, 비처리 및 비-결합 대조군 ADC-처리된 마우스에 비해 종양 성장을 현저하게 감소시켰다 (표 10 및 11). CD33-표적화 ADC로 관찰된 항-종양 활성은 용량 의존적이었다. HL-60 종양의 경우, 단일 용량의 0.1 mg/kg은 6마리의 처리 마우스 중 6마리에서 완전하고 지속적인 종양 회귀를 발생시켰다. 저 용량의 0.03 mg/kg은 6마리의 처리 마우스 중 1마리에서 완전한 회귀를 발생시켰고, 종양이 4배가 되는데 걸리는 시간을 비처리된 마우스 및 유사하게 비-결합 대조군 ADC (hOOd-SGD-1910)가 투여된 마우스의 15일에 비해 20일까지 연장시켰다. MDR-양성 TF1-αtumor 모델 (표 11)에서, 단일 용량의 0.3 mg/kg h2H12EC-SGD-1910은 7마리의 처리 마우스 중 5마리에서 완전하고 지속적인 종양 회귀를 발생시켰다. 종양이 4배가 되는데 걸리는 평균 일수는 연구의 끝인 117일까지 도달하지 못했다. 대조적으로, 유사하게 비-결합 대조군 ADC (hOOEC-SGD-1910)가 투여된 마우스의 종양은 27일에 부피가 4배가 되었다. 마찬가지로, 0.1 mg/kg 또는 0.03 mg/kg h2H12EC-SGD-1910이 투여된 마우스에서 종양이 4배가 되는 평균 시간은 비처리 또는 hOOEC-SGD-1910 처리된 마우스보다 현저하게 길었다 (p=0.0001). 마일로타그는 TF1-α 종양 모델에서 활성이 없었고; 마일로타그-처리된 마우스의 종양 성장은 비처리 마우스와 다르지 않았다. 총괄해 보면, 상기 데이터는 h2H12-ADC가 AML 이종이식편 모델에서 용량-의존적이고 비-표적화 ADC보다 현저하게 큰 항-종양 활성을 나타냄을 입증한다.
표 10 피하 HL-60 AML 이종이식편 모델에서 h2H12EC-SGD-1910 약물 컨쥬게이트의 활성
Figure 112020036209062-pat00018
NS, 유의하지 않음; NR, 도달하지 못함; ---, 적용할 수 없음; hIVIg, 인간 정맥내 면역글로불린 (ADC를 투여하기 4시간 전에 투여됨); hOOEC-SGD-1910, 비-결합 대조군 ADC; DCR, 지속적이고 완전한 반응 (연구의 끝인 50일에 측정가능한 종양 없음)
표 11 피하 TF1-αAML 이종이식편 모델에서 h2H12EC-SGD-1910 약물 컨쥬게이트의 활성
Figure 112020036209062-pat00019
NS, 유의하지 않음; NR, 도달하지 못함; ---, 적용할 수 없음; hOOEC-SGD-1910, 비-결합 대조군 ADC; DCR, 지속적이고 완전한 반응 (연구의 끝인 117일에 측정가능한 종양 없음)
서열 목록
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SEQUENCE LISTING <110> Sutherland, May Kung Ryan, Maureen Sussman, Django Burke, Patrick Jeffrey, Scott <120> CD33 Antibodies and Use of Same to Treat Cancer <130> 057762/431172 <140> 13/804,227 <141> 2013-03-14 <150> 61/649,110 <151> 2012-05-18 <160> 57 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Ile Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr 20 25 30 Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr 65 70 75 80 Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 2 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 2 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 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caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300 aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720 ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacaca 960 cagaagagcc tctccctgtc tccgggt 987 <210> 51 <211> 990 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 51 gctagcacca agggcccatc tgtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60 ggcacagctg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ctgaacctgt gacagtgtcc 120 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300 aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360 ccgtgtgtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720 ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacaca 960 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 990 <210> 52 <211> 987 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 52 gctagcacca agggcccatc tgtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60 ggcacagctg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ctgaacctgt gacagtgtcc 120 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300 aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360 ccgtgtgtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720 ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacaca 960 cagaagagcc tctccctgtc tccgggt 987 <210> 53 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 53 atggacatga ggacccctgc tcagtttctt ggaatcttgt tgctctggtt tccaggtatc 60 aaatgt 66 <210> 54 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 54 atgggatgga gatggatctt tcttttcctc ctgtcgggaa ctgcaggtgt ccattgc 57 <210> 55 <211> 364 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55 Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Ala Gly Ala Leu Ala 1 5 10 15 Met Asp Pro Asn Phe Trp Leu Gln Val Gln Glu Ser Val Thr Val Gln 20 25 30 Glu Gly Leu Cys Val Leu Val Pro Cys Thr Phe Phe His Pro Ile Pro 35 40 45 Tyr Tyr Asp Lys Asn Ser Pro Val His Gly Tyr Trp Phe Arg Glu Gly 50 55 60 Ala Ile Ile Ser Arg Asp Ser Pro Val Ala Thr Asn Lys Leu Asp Gln 65 70 75 80 Glu Val Gln Glu Glu Thr Gln Gly Arg Phe Arg Leu Leu Gly Asp Pro 85 90 95 Ser Arg Asn Asn Cys Ser Leu Ser Ile Val Asp Ala Arg Arg Arg Asp 100 105 110 Asn Gly Ser Tyr Phe Phe Arg Met Glu Arg Gly Ser Thr Lys Tyr Ser 115 120 125 Tyr Lys Ser Pro Gln Leu Ser Val His Val Thr Asp Leu Thr His Arg 130 135 140 Pro Lys Ile Leu Ile Pro Gly Thr Leu Glu Pro Gly His Ser Lys Asn 145 150 155 160 Leu Thr Cys Ser Val Ser Trp Ala Cys Glu Gln Gly Thr Pro Pro Ile 165 170 175 Phe Ser Trp Leu Ser Ala Ala Pro Thr Ser Leu Gly Pro Arg Thr Thr 180 185 190 His Ser Ser Val Leu Ile Ile Thr Pro Arg Pro Gln Asp His Gly Thr 195 200 205 Asn Leu Thr Cys Gln Val Lys Phe Ala Gly Ala Gly Val Thr Thr Glu 210 215 220 Arg Thr Ile Gln Leu Asn Val Thr Tyr Val Pro Gln Asn Pro Thr Thr 225 230 235 240 Gly Ile Phe Pro Gly Asp Gly Ser Gly Lys Gln Glu Thr Arg Ala Gly 245 250 255 Val Val His Gly Ala Ile Gly Gly Ala Gly Val Thr Ala Leu Leu Ala 260 265 270 Leu Cys Leu Cys Leu Ile Phe Phe Ile Val Lys Thr His Arg Arg Lys 275 280 285 Ala Ala Arg Thr Ala Val Gly Arg Asn Asp Thr His Pro Thr Thr Gly 290 295 300 Ser Ala Ser Pro Lys His Gln Lys Lys Ser Lys Leu His Gly Pro Thr 305 310 315 320 Glu Thr Ser Ser Cys Ser Gly Ala Ala Pro Thr Val Glu Met Asp Glu 325 330 335 Glu Leu His Tyr Ala Ser Leu Asn Phe His Gly Met Asn Pro Ser Lys 340 345 350 Asp Thr Ser Thr Glu Tyr Ser Glu Val Arg Thr Gln 355 360 <210> 56 <211> 359 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 56 Met Pro Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Ala Gly Ala Leu Ala Met 1 5 10 15 Asp Pro Arg Val Arg Leu Glu Val Gln Glu Ser Val Thr Val Gln Glu 20 25 30 Gly Leu Cys Val Leu Val Pro Cys Thr Phe Phe His Pro Val Pro Tyr 35 40 45 His Thr Arg Asn Ser Pro Val His Gly Tyr Trp Phe Arg Glu Gly Ala 50 55 60 Ile Val Ser Leu Asp Ser Pro Val Ala Thr Asn Lys Leu Asp Gln Glu 65 70 75 80 Val Gln Glu Glu Thr Gln Gly Arg Phe Arg Leu Leu Gly Asp Pro Ser 85 90 95 Arg Asn Asn Cys Ser Leu Ser Ile Val Asp Ala Arg Arg Arg Asp Asn 100 105 110 Gly Ser Tyr Phe Phe Arg Met Glu Lys Gly Ser Thr Lys Tyr Ser Tyr 115 120 125 Lys Ser Thr Gln Leu Ser Val His Val Thr Asp Leu Thr His Arg Pro 130 135 140 Gln Ile Leu Ile Pro Gly Ala Leu Asp Pro Asp His Ser Lys Asn Leu 145 150 155 160 Thr Cys Ser Val Pro Trp Ala Cys Glu Gln Gly Thr Pro Pro Ile Phe 165 170 175 Ser Trp Met Ser Ala Ala Pro Thr Ser Leu Gly Leu Arg Thr Thr His 180 185 190 Ser Ser Val Leu Ile Ile Thr Pro Arg Pro Gln Asp His Gly Thr Asn 195 200 205 Leu Thr Cys Gln Val Lys Phe Pro Gly Ala Gly Val Thr Thr Glu Arg 210 215 220 Thr Ile Gln Leu Asn Val Ser Tyr Ala Ser Gln Asn Pro Arg Thr Asp 225 230 235 240 Ile Phe Leu Gly Asp Gly Ser Gly Lys Gln Gly Val Val Gln Gly Ala 245 250 255 Ile Gly Gly Ala Gly Val Thr Val Leu Leu Ala Leu Cys Leu Cys Leu 260 265 270 Ile Phe Phe Thr Val Lys Thr His Arg Arg Lys Ala Ala Arg Thr Ala 275 280 285 Val Gly Arg Ile Asp Thr His Pro Ala Thr Gly Pro Thr Ser Ser Lys 290 295 300 His Gln Lys Lys Ser Lys Leu His Gly Ala Thr Glu Thr Ser Gly Cys 305 310 315 320 Ser Gly Thr Thr Leu Thr Val Glu Met Asp Glu Glu Leu His Tyr Ala 325 330 335 Ser Leu Asn Phe His Gly Met Asn Pro Ser Glu Asp Thr Ser Thr Glu 340 345 350 Tyr Ser Glu Val Arg Thr Gln 355 <210> 57 <211> 359 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 57 Met Pro Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Ala Gly Ala Leu Ala Met 1 5 10 15 Asp Pro Arg Val Arg Leu Glu Val Gln Glu Ser Val Thr Val Gln Glu 20 25 30 Gly Leu Cys Val Leu Val Pro Cys Thr Phe Phe His Pro Val Pro Tyr 35 40 45 His Ala Arg Asn Ser Pro Val His Gly Tyr Trp Phe Arg Glu Gly Ala 50 55 60 Ile Val Ser Leu Asp Ser Pro Val Ala Thr Asn Lys Leu Asp Gln Glu 65 70 75 80 Val Arg Glu Glu Thr Gln Gly Arg Phe Arg Leu Leu Gly Asp Pro Ser 85 90 95 Arg Asn Asn Cys Ser Leu Ser Ile Val Asp Ala Arg Arg Arg Asp Asn 100 105 110 Gly Ser Tyr Phe Phe Arg Met Glu Lys Gly Ser Thr Lys Tyr Ser Tyr 115 120 125 Lys Ser Thr Gln Leu Ser Val His Val Thr Asp Leu Thr His Arg Pro 130 135 140 Gln Ile Leu Ile Pro Gly Ala Leu Asp Pro Asp His Ser Lys Asn Leu 145 150 155 160 Thr Cys Ser Val Pro Trp Ala Cys Glu Gln Gly Thr Pro Pro Ile Phe 165 170 175 Ser Trp Met Ser Ala Ala Pro Thr Ser Leu Gly Leu Arg Thr Thr His 180 185 190 Ser Ser Val Leu Ile Ile Thr Pro Arg Pro Gln Asp His Gly Thr Asn 195 200 205 Leu Thr Cys Gln Val Lys Phe Pro Gly Ala Gly Val Thr Thr Glu Arg 210 215 220 Thr Ile Gln Leu Asn Val Ser Tyr Ala Ser Gln Asn Pro Arg Thr Asp 225 230 235 240 Ile Phe Leu Gly Asp Gly Ser Gly Lys Gln Gly Val Val Gln Gly Ala 245 250 255 Ile Gly Gly Ala Gly Val Thr Val Leu Leu Ala Leu Cys Leu Cys Leu 260 265 270 Ile Phe Phe Thr Val Lys Thr His Arg Arg Lys Ala Ala Arg Thr Ala 275 280 285 Val Gly Arg Ile Asp Thr His Pro Ala Thr Gly Pro Thr Ser Ser Lys 290 295 300 His Gln Lys Lys Ser Lys Leu His Gly Ala Thr Glu Thr Ser Gly Cys 305 310 315 320 Ser Gly Thr Thr Leu Thr Val Glu Met Asp Glu Glu Leu His Tyr Ala 325 330 335 Ser Leu Asn Phe His Gly Met Asn Pro Ser Glu Asp Thr Ser Thr Glu 340 345 350 Tyr Ser Glu Val Arg Thr Gln 355

Claims (50)

  1. 하기 일반식 (I)을 갖는 항체-약물 컨쥬게이트:
    L - (LU-D)p (I)
    여기에서, L은 항체이고, LU는 링커 단위이며, D는 치료제이고, p는 항체 당 약물 분자의 평균 수이고 2 내지 8의 범위이며,
    여기에서, 항체는 인간 CD33 단백질에 특이적으로 결합하고, 항체는 3개의 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR): SEQ ID NO:19로 구성된 중쇄 CDR1, SEQ ID NO:20으로 구성된 중쇄 CDR2, SEQ ID NO:21로 구성된 중쇄 CDR3; 및 3개의 경쇄 CDR: SEQ ID NO:22로 구성된 경쇄 CDR1, SEQ ID NO:23으로 구성된 경쇄 CDR2, 및 SEQ ID NO:24로 구성된 경쇄 CDR3을 포함함.
  2. 제1항에 있어서, p가 4인, 항체-약물 컨쥬게이트.
  3. 제1항에 있어서, LU가 항체의 시스테인 잔기의 티올 기를 통해 항체에 컨쥬게이션되는, 항체-약물 컨쥬게이트.
  4. 제1항에 있어서, 치료제가 세포독성제인, 항체-약물 컨쥬게이트.
  5. 제1항에 있어서, 링커가 효소 분해가능한 링커인, 항체-약물 컨쥬게이트.
  6. 제5항에 있어서, 링커가 펩티딜 링커인, 항체-약물 컨쥬게이트.
  7. 제1항에 있어서, 링커가 비-분해가능한 링커인, 항체-약물 컨쥬게이트.
  8. 제4항에 있어서, 세포독성제가 DNA 작은 홈 결합제인, 항체-약물 컨쥬게이트.
  9. 제8항에 있어서, DNA 작은 홈 결합제가 피롤로[1,4]벤조디아제핀인, 항체-약물 컨쥬게이트.
  10. 제9항에 있어서, 피롤로[1,4]벤조디아제핀이 하기 식을 갖는, 항체-약물 컨쥬게이트:
    Figure 112020043887264-pat00033
    .
  11. 제1항에 있어서, 세포독성제가 아우리스타틴(auristatin)인, 항체-약물 컨쥬게이트.
  12. 제11항에 있어서, 아우리스타틴이 모노메틸 아우리스타틴 E 또는 F인, 항체-약물 컨쥬게이트.
  13. 제11항에 있어서, 하기 중 어느 하나의 식을 갖는 항체-약물 컨쥬게이트:
    Figure 112020043887264-pat00034

    Ab-vcMMAE
    Figure 112020043887264-pat00035

    Ab-vcMMAF, 및
    Figure 112020043887264-pat00036

    Ab-mcMMAF.
  14. 제1항에 있어서, 항체가 제1항의 CDR 조합을 포함하며, 항체가 CDR을 제외한 나머지 부분에서 SEQ ID NO: 18과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 지니는 성숙 중쇄 가변 영역으로서, 케이뱃 넘버링 시스템에 의해 결정되는 위치 H48이 I에 의해 점유되고, 위치 H66이 K에 의해 점유되며, 위치 H67이 A에 의해 점유되고, 위치 H69가 L에 의해 점유되며, 위치 H71이 A에 의해 점유되고, 위치 H94가 S에 의해 점유되는 성숙 중쇄 가변 영역, 및 CDR을 제외한 나머지 부분에서 SEQ ID NO: 8과 적어도 90% 동일한 성숙 경쇄 가변 영역으로서, 케이뱃 넘버링 시스템에 의해 결정되는 위치 L22가 N에 의해 점유되고, 위치 L46이 T에 의해 점유되며, 위치 L69가 Q에 의해 점유되고, 위치 L71이 Y에 의해 점유되는 성숙 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체-약물 컨쥬게이트.
  15. 제14항에 있어서, 항체가 제1항의 CDR 조합을 포함하고, 항체가 CDR을 제외한 나머지 부분에서 SEQ ID NO:18과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 지니는 성숙 중쇄 가변 영역 및 CDR을 제외한 나머지 부분에서 SEQ ID NO:8과 적어도 95% 동일한 성숙 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체-약물 컨쥬게이트.
  16. 제14항에 있어서, 성숙 중쇄 가변 영역이 중쇄 불변 영역에 융합되고 성숙 경쇄 가변 영역이 경쇄 불변 영역에 융합된, 항체-약물 컨쥬게이트.
  17. 제14항에 있어서, 중쇄 불변 영역이 자연 인간 불변 영역에 비해 Fcγ 수용체에 감소된 결합능을 갖는 자연 인간 불변 영역의 돌연변이 형태인, 항체-약물 컨쥬게이트.
  18. 제16항에 있어서, 중쇄 불변 영역이 IgG1 아이소형을 지니는, 항체-약물 컨쥬게이트.
  19. 제1항에 있어서, 중쇄 불변 영역이 SEQ ID NO:27을 포함하는 아미노산 서열을 지니고 경쇄 불변 영역이 SEQ ID NO:25를 포함하는 아미노산 서열을 지니는, 항체-약물 컨쥬게이트.
  20. 제1항에 있어서, 중쇄 불변 영역이 SEQ ID NO:29 (S239C)를 포함하는 아미노산 서열을 지니고 경쇄 불변 영역이 SEQ ID NO:25를 포함하는 아미노산 서열을 지니는, 항체-약물 컨쥬게이트.
  21. 제1항에 있어서, 성숙 중쇄 가변 영역이 SEQ ID NO:18로 지정된 아미노산 서열을 지니고 성숙 경쇄 가변 영역이 SEQ ID NO:8로 지정된 아미노산 서열을 지니는, 항체-약물 컨쥬게이트.
  22. 제1항에 있어서, SEQ ID NO:27 또는 29의 아미노산 서열을 지니는 중쇄 불변 영역에 연결되는 SEQ ID NO:18의 아미노산 서열을 지니는 성숙 중쇄 가변 영역, 및 SEQ ID NO:25의 아미노산 서열을 지니는 경쇄 불변 영역에 연결되는 SEQ ID NO:8의 아미노산 서열을 지니는 성숙 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체-약물 컨쥬게이트.
  23. 제13항에 있어서, SEQ ID NO:27 또는 29의 아미노산 서열을 지니는 중쇄 불변 영역에 연결되는 SEQ ID NO:18의 아미노산 서열을 지니는 성숙 중쇄 가변 영역, 및 SEQ ID NO:25의 아미노산 서열을 지니는 경쇄 불변 영역에 연결되는 SEQ ID NO:8의 아미노산 서열을 지니는 성숙 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체-약물 컨쥬게이트.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 약학적으로 허용되는 염으로서 반대이온을 추가로 포함하는, 항체-약물 컨쥬게이트.
  25. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 항체-약물 컨쥬게이트를 포함하는, 암을 지니거나 암의 위험이 있는 환자를 치료하기 위한 약학적 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 암이 급성 골수성 백혈병 (AML), 골수형성이상 증후군 (MDS), 급성 전골수세포 백혈병 (APL), 만성 골수성 백혈병 (CML), 만성 골수단핵구 백혈병 (CMML), 만성 골수증식성 질병, 전구물질 B-세포 급성 림프모구성 백혈병 (preB-ALL), 전구물질 T-세포 급성 림프모구성 백혈병 (preT-ALL), 다발성 골수종 (MM), 비만세포병, 또는 골수성 육종인, 약학적 조성물.
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